DK175477B1 - Fremgangsmåde til integration af et gen eller en DNA-sekvens i en bakteries chromosom eller episom samt bakterie frembragt ved fremgangsmåden - Google Patents

Description

DK 175477 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til amplifikation og stabilisering af kopiantallet af udvalgte gener i en mikroorganisme.

5 Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af eksempler, hvori sekvensen, der koder for et enzym, β-galactosi-dase, og generne, som koder for tre enzymer, der griber ind i biosyntesen af L-threonin, overføres til det indre af en mikroorganismes chromosom.

10

Disse gener har vist sig at være fikseret på stabil måde i chromosomet. De resulterende mikroorganismestammer er således bedre i stand til dels at producere tilsvarende enzymer og dels at producere aminosyren L-threonin, end 15 tilfældet er med de oprindelige mikroorganismestammer.

Bakterierne er i stand til at syntetisere nyttige aktive bestanddele, såsom enzymer og aminosyrer. En produktion ved fermentering indebærer komplicerede biokemiske pro-20 cesser, som kontrolleres af et større antal gener og gen-produkter. Fermenteringsprodukterne opnås i relativt beskedne udbytter. For at forbedre denne produktion ved fermentering har det. vist. sig . nyttigt at forøge kfipi-antallet af de gener, som indgår i processerne, på en 25 sådan måde, at antallet af sådanne kopier kan kontrolleres og stabiliseres i mikroorganismens chromosomer eller episomer.

Der er i litteraturen beskrevet adskillige videnskabe-30 lige metoder, ifølge hvilke antallet af kopier af et gen kan forøges i en mikroorganisme, især ved hjælp af cirkulære plasmid-vektorer. Ikke desto mindre er antallet af kopier, som opnås ved disse metoder, i høj grad variabelt og afhænger af den anvendte vektor, længden af 35 det udvalgte gen og de bestemte fysiologiske egenskaber hos mikroorganismen. Der er ingen af de fra litteraturen

I DK 175477 B1 I

I 2 i

I kendte metoder, der angår amplifikation af et gen indtil I

I et på forhånd bestemt niveau, hvorved man undgår et I

I overflødigt overskud af kopier, og hvor man samtidigt I

I opnår en stabil fiksering af de opnåede kopier i I

I 5 chromosomet. ' I

Der findes flere patenter og andre skrifter, hvori det I

I foreslås at anvende transposoner som vektorer i bakteri- I

I er eller andre organismer, især US-patentskrift nr. I

I 10 4 670 388, og EP-offentliggørelsesskrifterne 0 200 .708 I

I og nr. 0 091 723 samt ' I

I - GENE, Vol. 42 (1986), side 185-192, I

I - THE EMBO JOURNAL, Vol. 4, nr. 4, 1985, side 891-898, I

I og I

I 15 - BIOTECHNOLOGY, Vol. 4, nr. 5, maj 1986, side 446-449, I

New York, USA. I

I Imidlertid er der ingen af disse dokumenter, der beskri- I

I ver en fremgangsmåde, som gør det muligt at opnå en sta- I

I 20 bil integration af en bestemt DNA-sekvens med et vel- I

I defineret kopiantal. I

Det er .et formål ..med den foreliggende, opfindelse at»an- I

I give en fremgangsmåde, hvormed man kan amplifikere og på I

I 25 stabil måde fiksere kopier af udvalgte gener i en mikro- I

organisme med større fleksibilitet og højere sikkerhed I

I end det hidtil har været muligt. Dette formål såvel som I

andre formål med opfindelsen, som beskrives nærmere I

I nedenfor, opnås ved, at man f.eks. bibringer bakterien I

I 30 Escherichia coli et element, som kan transponeres til et I

I bredt spektrum af værtsorganismer afledt af phagen Mu, I I

I og hvori generne fra transponeringen enten ikke kan ud- I

I trykkes eller er udslettet. En sådan transposon er en I

I "afvæbnet" transposon. Under bestemte reversible gene- I

I 35 tiske betingelser, som er lette at reproducere for orga- I

I nismer af samme slægt eller af en anden slægt, kan denne I

DK 175477 B1 3 transposon og generne, som kan være introduceret deri ved genteknologi, være beregnet til at multiplicere sig selv i det indre af mikroorganismens chromosom. .Når disse bestemte genetiske betingelser ophæves, forbliver 5 de forskellige transposon-kopier fikseret på stabil måde I i det indre af chromosomet.

I Opfindelsen angår en fremgangsmåde til integration af et I udvalgt gen eller en på forhånd bestemt DNA-sekvens (i I 10 det indre af en bakterie) i en DNA-sekvens, såsom, et I chromosom eller et episom, og fremgangsmåden ifølge *op- I findelsen er ejendommelig ved, at man I (a) kloner det udvalgte gen eller den udvalgte DNA- I 15 sekvens i det indre af en "afvæbnet” transposon, men I uden for de essentielle dele af denne transposon, I hvorefter man ...--- I (b) integrerer transposonen i DNA-sekvensen i det indre I 20 af bakterien.

I Nærmere bestemt udnyttes fremgangsmåden ifølge opfind- I . elsen til at forøge antallet af kopier af udvalgte g^jier I med det formål at opnå et på forhånd fastlagt kopiantal.

I 25 I dette tilfælde er fremgangsmåden ifølge opfindelsen en I fremgangsmåde til integration af et på forhånd fastlagt I antal kopier af et udvalgt gen eller en bestemt DNA- I sekvens i en DNA-sekvens såsom en bakteries chromosom I eller episom, og denne fremgangsmåde er ejendommelig I 30 ved, at man I {a) kloner det udvalgte gen eller den udvalgte DNA- I sekvens i det indre af en transposon, men uden for de essentielle dele af denne transposon, som er I 35 "afvæbnet", I DK 175477 B1 (b) integrerer transposonen i en DNA-sekvens, såsom bak- teriens chromosom eller episom, og | (c) komplementerer den “afvæbnede" transposon på en 5 sådan måde, at den kan tranponeres flere gange, idet komplementer i ngen bringes til ophør efter et på for- hånd bestemt antal transponeringer.

Ifølge opfindelsen kan man anvende en hvilken som helst 10 transposon, som transponeres på et hvilket som helst sted i det indre af det bakterielle DNA.

Ved “transposoner" forstås i nærværende beskrivelse også "virkelige transposoner", såsom phager, der er i stand 15 til at transponere.

De foretrukne transposoner er Tn3, Tn5, Tn7, TnlO,

Tn903, TnHoHo, IS 1, 10, IS 50 og phagerne Mudl og

Mudll. Man foretrækker især phagerne Mudl og Mudll.

I Udnyttelsen af "afvæbnede” transposoner, som er transpo- I soner, der er ude af stand til at transponere af sig I .selv, gør det. muligt.at opnå en stabil .integration.^Jil I en sådan udnyttelse indeholder de anvendte transposoner I 25 ikke nogen gener, der koder på transposase, eller også er disse gener ikke aktive i den pågældende bakterie.

Især foretrækker man en transposon, som er uden indhold af gener, der koder for transposaser, men det er også I muligt at anvende en transposon, i hvilken transposaser- I 30 ne, som er aktive ved transponeringen, er hæmmede eller I inaktive under normale betingelser.

I Ifølge opfindelsen kan man anvende en hvilken som helst bakterie, hvori de ovenfor beskrevne transposoner kan 35 transponere.

DK 175477 ΒΊ I

De foretrukne bakterier er medlemmer af familien H

Enterobacteriacese for eksempel Escherichia coli, Citro- I

bacter freundii/ Erwinia herbicola eller E. chryaan- I

themi, Salmonella thyphimurium, Shigella sonneii,

5 Enterobacter cloacae eller Serratia marcescens, eller de I

er medlemmer af familien Rhizobiaceal, såsom Agrobacte- I

rium tumefaciens, eller af familien Pseudomonas, såsom I

Pseudomonas putida. I

10 Ved et udvalgt gen forstår man et gen, som normalt ikke I

er tilstede i den pågældende transposon, eller som i-kke er tilstede i værtsbakterien.

Som udvalgt gen kan man anvende et klonet gen eller et 15 hybrid-gen, et gen-segment eller et gen, der er frem stillet ved syntese. Genet kan udtrykkes i værtsbakterien og kan være af animalsk, vegetabilsk eller mikrobiel oprindelse. Der kan indsættes flere gener i transposonen.

20

Det valgte gen kan være under kontrol af en promotor, som også befinder sig i transposonens indre, og som sikrer, udtrykkelsen .af. genet i den. pågældende bakterie.

I 25 De klonede gener indføres ved hjælp af ’kendte gen- I teknologiske processer eller ved hjælp af den nedenfor I beskrevne procedure. 1 I Plasmidet, som indeholder transposonen, isoleres fra I 35 bakterien og spaltes med passende restriktionsenzymer.

I De udvalgte gener udvindes ligeledes fra værtsorganismen

For at lette proceduren kan det bedre betale sig at gå I 30 ud fra et plasmid, som indeholder den "afvæbnede" trans- I poson. Afvæbningen af transposonen sker ved udslettelse I eller mutation.

I DK 175477 B1

I 6 I

og oprenses efter spaltning ved hjælp af restriktions- enzymer. For at kunne udvælge transponeringsbeting- eiserne er det en fordel, at man foretager kloningen· af et markør-gen såsom et gen med resistens over for et 5 antibiotikum (f.eks. npt) eller et andet "reporter"-gen (f.eks. lacZ) samtidigt med, at man kloner de indførte gener. Således evaluerer man antallet af transponeringer H ved at bestemme udtrykkeisen af markør-genet. Denne ud- trykkelse af markør-genet kan bestemmes ud fra resis- 10 tensen over for et antibiotikum, når markør-genet er.ret gen, der fremkalder antibiotikum-resistens. UdtrykkeTsen af markør-genet kan også bestemmes ud fra farvningen af en substituent i de tilfælde, hvor markør-genet koder H for en enzymatisk aktivitet, som kan evalueres ved hjælp H 15 af en kolorimetrisk test. De forskellige fragmenter rekombineres ved ligering in vitro og transformeres i en passende receptiv bakterie.. Transformanterne udvælges, hvorefter de analyseres med henblik på at bestemme, hvorvidt konstruktionen er passende. Den resulterende 20 sammensatte “afvæbnede1' transposon kan placeres i andre organismestammer ved transformation eller transduktion.

De konventionelle genteknologiske metoder, som kan an- vendes, er beskrevet· i "Molecular cloning, a laboratory H manual" (Maniatis et al.. Cold Spring Harbor Laboratory, 25 New York, 1986). 2 2 Når fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes til at I forøge kopiantallet af det valgte gen, bliver integra- I tionen af et bestemt antal kopier af det valgte gen i 30 transposonen, som er ude af stand til at transponere, I komplementeret (under den ovenfor beskrevne procedure, I som gør brug af en "afvæbnet" transposon, og efter integrationen) på en sådan måde, at transponeringen kan foregå flere gange. Komplementeringen bliver slutteligt I 35 afbrudt efter et bestemt antal transponeringer.

DK 175477 B1 I

Η

Den ovennævnte komplementer ing kan gennemføres på for- I

skellige måder. Hvis transposonen reelt er "afvæbnet", hvilket vil sige at den ikke indeholder transposase, .kan

denne sidstnævnte introduceres i værtscellen ved hjælp I

5 af et plasmid eller en phag, der koder for den pågæld- I

ende transposase. I

Hvis udtrykkeisen af transposaserne undertrykkes, er det I

muligt at inaktivere repressoren. Hvis der er tale om en I

10 varmefølsom repressor, vil en forøgelse af temperaturen I

føre til udtrykkelse af transposaserne. ~ I

Når den fremstillede transposon først er indført i det I

modtagende DNA, kan den amplifikeres ved transponering I

15 på genomet gennem inaktivering af den repressor, som

I fører til udtrykkelse af transposase-generne. I

I Transposonen, hvori transposase-generne mangler, kan I

I amplifikeres ved introduktion af et plasmid eller en I

I 20 phag, som indeholder trans-virksomme transposase-gener. I

I Når komplementer ingen effektueres ved introduktion af et I ekstra chromosomalt- element,..såsom-et plasmid eller-især I en phag, kan denne komplementering effektueres samtidigt I 25 med integrationstrinnet. 1 I 35

De amplifikerede transposoner forbliver på stabil form i I bakteriens DNA under sædvanlige dyrkningsbetingelser.

I Man foretrækker at anvende en "afvæbnet" transposon for I 30 at stabilisere de udvalgte gener. Et hvilket som helst I DNA i en bakteriecelle kan være målet for transpone- I ringen. Især foretrækker man DNA'er, som forbliver i I stabil tilstand i bakteriecellen, såsom chromosomer I eller stabile plasmider.

I DK 175477 B1

Ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen er den anvendte "afvæbnede" transposon MudII1734 (Castilho I et al., J. Bact., lj>8, 488, 1984), som er tilstede som ufuldstændig prophag i en E. coli-stamme (POII1734), der 5 forinden er lysogeniseret af en mutant phag Mucts. Denne stamme, som er dyrket ved lav temperatur, opvarmes kort- varigt, hvorefter det resulterende lysat anvendes til H transduktion med en passende receptiv stamme. Bakterier- ne, som er passende resistente over for antibiotiket, og 10 som ikke producerer Mucts-phager, indeholder kun trans- posonen i deres chromosom.

Transposonen MudII1734 indføres i et plasmid, hvorefter det indre af transposonen kan modificeres som beskrevet H 15 i det foregående.

Plasmidet, som indeholder modificeret Mud, transformeres til Mucts i en lysogenisk stamme. Phag-lysatet opnås efter temperaturforøgelse. Man udnytter phag-lysatet til 20 translation af det modificerede Mud på chromosomet af en bestemt bakterie.

Til amplifikation af det modificerede. Mud transformeres stammen, der på sit chromosom bærer den ufuldstændige I 25 transposon, med et plasmid, som indeholder de to trans- posase-gener, dvs. generne A og B, eller også inficeres I stammen med phagen Mu.

I Når der er tale om amplifikation ved hjælp af et plas- 30 mid, opretholdes plasmidet, som indeholder generne A og B, i bakterien gennem udnyttelse af en udvælgelse (resistens over for et antibiotikum). De bakterier, som vokser i nærværelse af dette antibiotikum, og som sam- I tidig syntetiserer produktet af et gen, som er lokalise- I 35 ret i transposonen, i store mængder, bliver derefter ud- I valgt. De bakterier som udtrykker de to phenotyper, kan 9 DK 175477 B1 indholde flere supplerende kopier af transposonen på deres chromosom.

De bakterier, som har mistet plasmidet, eller som ikke 5 er lysogeniseret til en phag, kan opnås ad naturlig vej.

Bestemmelsen af transposonens kopiantal kan foretages ved udvælgelse af de ovenfor beskrevne bakterier på I grundlag af udtrykkelsesniveauet for et markør-gen i I 10 transposonen.

I Antallet af kopier af transposonen, som indeholder et I gen for resistens over for et antibiotikum, kan bestem- I mes ud fra bakteriens resistens over for antibiotiket.

I 15 I Antallet af kopier af transposonen, som inkluderer lac- I operon'et, kan bestemmes på basis af en farvning af I bakteriekolonierne efter nedbrydning af et substrat så- I som X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-B-D-galactosid).

I 20 I Antallet af kopier af transposonen kan bestemmes ved I anvendelse af "Southern blotting" og DNA-DNA- I hybridiseringsteknikker.med passende sonder.

I 25 De udvalgte gener, som er amplifikeret ved hjælp af I transposonen, forbliver i stabil tilstand i det omfang, I hvor transposase-generne enten ikke er tilstede eller I inaktive i den pågældende bakteriestamme.

I 30 Til dette formål foretrækker man også at introducere mu- I tationer af DNA polymerase I eller 3', 5'-exonulease I eller en mutation, som mangler HU, i værtsbakterien I efter amplifikationen.

I 35 Et vigtigt aspekt ved den foreliggende opfindelse er, at I de opnåede stammer er særdeles stabile. Den afvæbnede I DK 175477 B1 transposon kan hverken transponere yderligere eller blive udslettet af nogen effektiv mekanisme. Efter dyrk- ning i talrige generationer under selektivt tryk optager de afvæbnede transposoner stadig den sanune position i 5 chromosomet.

Desuden kan man ikke påvise nogen overføring af den af- H væbnede transposon under co-dyrkningsforsøg.

10 Opfindelsen angår endvidere den ovennævnte bakterie, i sig selv, som kan opnås ved fremgangsmåden ifølge -op- H findelsen, og opfindelsen angår også en fremgangsmåde

H til fremstilling af et heterologt gen-produkt, ved hvil- I

H ken fremgangsmåde man dyrker bakterien ifølge opfind- 15 elsen i et passende dyrkningsmedium og udvinder det dannede produkt.

Selv om det valgte gen kan kode for et peptid eller et protein, som har terapeutisk eller industriel anvende- 20 lighed, drejer én af opfindelsens udførelsesformer sig om fremstilling af metabolitter ved udnyttelse af bak- terien opnået ved den ovenfor omtalte fremgangsmåde, idet man udnytter en "afvæbnet" transposon, som iQde- holder ét eller flere gener, eventuelt alle de gener, I 25 som kræves til biosyntese af metabolitterne.

Blandt de gener, som er af industriel interesse, kan man I nævne de gener, som koder for biosyntesen af aminosyrer, I især threonin, eller for biosyntesen af vitaminer såsom I 30 biotin. Imidlertid kan amplifikationen af udtrykkeisen af visse enzymer også muliggøre en total over-udtryk-kelse af visse metabolitter, eksempelvis af generne for asd og aspA, således som det er vist i de følgende eksempler.

35

DK 175477 B1 I

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særdelses poly- I

valent og kan anvendes til amplifikation af DNA-sekven- I

ser af enhver type. I

5 Den således opnåede bakterie, som er i stand til at pro- I

ducere et eller flere enzymer, en eller flere aminosyrer I

eller andre ønskede produkter, kan dyrkes ved metoder, I

som i det væsentlige er velkendte. Man anvender sædvan- I

lige dyrkningsmedier, som indeholder kilder for carbon,

10 nitrogen, uorganiske ioner og om nødvendigt organiske I

mikronæringsstoffer, såsom aminosyrer og vitaminer. "Som I

bekvem carbon-kilde kan man anvende glycose, saccharose, I

lactose, et stivelseshydrolysat indeholdende sådanne I

I sukkerarter, valle og melasse. Blandt nitrogen-kilderne I

I 15 fortrækker man ammoniak og ammoniumsalte. Dyrkningen I

I gennemføres under aerobe betingelser ved kontrolleret I

I pH-værdi og temperatur, indtil cellerne i praksis er op- I

I hørt med at at producere det ønskede produkt. I

I 20 Til en given produktion, hvor der eksempelvis skal frem- I

I stilles en aminosyre eller et protein, fortrækker man I

I som værtsorganisme at anvende en stamme, som i forvejen I

I producerer produktet,, som.man ønsker at fremstille. I

I 25 Den foreliggende opfindelses karakteristika og fordele I illustreres nærmere ved de følgende eksempler, hvori der I også henvises til tegningen, hvor I fig. 1 er et skematisk restriktionskort over transposon I 30 MudII1734 for et bredt spektrum af værtsorganismer; I fig. 2 er en skematisk gengivelse af konstruktionen af I plasmiderne pBR322 (MudII168l) og pPR30 samt deres re- striktionskort; I 35 I DK 175477 B1 I 12

fig. 3 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt af I

en "biof'-hybridiseringsteknik anvendt på: I

DNA fra en stamme, hvori transposonens kopiantal er ble- I

5 vet forøget (bane f) og I

I DNA fra 5 stammer isoleret efter 170 generationer (bane I

a - e) (sonden er pCE1134; DNA'et er digereret med I

I EcoRI); I

I 10 I

fig. 4 er en skematisk gengivelse af konstruktionen*af I

plasmid pCE1134 og det tilhørende restriktionskort; I

fig. 5 er en skematisk gengivelse af konstruktione af I

15 plasmid pAM9 og det tilhørende restiktionskort; I

fig. 6 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt af I

I "biof'-hybr idisering af DNA fra stammerne AJ11332, I

I EL1001, EL1002 og EL1003 angivet ved de respektive baner I

20 A-D (sonden er et lille EcoRI-fragment af pAM9, og stam- I

I mernes DNA er digereret med EcoRI); I

I fig. 7 er en skematisk„gengivelse af - konstruktionen af I

I pEVll, pMCl og pMC23; I

I 25 I

I fig. 8 viser analyser af MudAM9 transponeret ved DNA- I

I DNA-hybridiseringsteknik (Southern) i stammerne AJ11332, I

I EL1008 og EL1009; I

30 fig. 9 angiver resultaterne af elektroforese efterfulgt I

I af ''blof'-hybr idiser ing af DNA fra stammerne AJ11332, I

EL1001, EL1004, EL1006, EL1003, EL1005 og EL1007 angivet I

ved de respektive baner A-G (sonden svarer til plasmidet I

pRCIOO digereret med restriktionsenzymet Hindlll); I

35 I

DK 175477 B1 I

13 I

fig. 10 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt I

af "blot"-hybridisering af DNA fra stammerne E. chry- I

santhemi 384551, EL3003 og EL3007 angivet ved hhv. bane I

A, bane B og bane C (den anvendte sonde er EcoRI- I

5 Hindlll-fragmentet af plasmid pAM9); I

fig. 11 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt I

af "blof'-hybr idisering af DNA fra stammerne E. chry- I

santhemi 384551, EL3004 og EL 3008 angivet ved de 10 respektive baner A-C (den anvendte sonde er Sall-BamHI-fragmentet af plasmid pAM9; I fig. 12 viser konstruktionen af plasmid pAMll-som inde- I holder asd-genet og threonin-operon'et; I 15 I fig. 13-16 viser resultaterne af elektroforese efter- I fulgt af "blot"-hybridisering af DNA fra stammerne EL1016, EL1012 og EL1013 angivet ved de respektive vaner I A-C.

I 20 I Med hensyn til fig. 13 er det chromosomale DNA digereret I med Sall og hybridiseret med EcoRI-Hindlll-fragmentet, I der indeholder, generne nptll, thrA,. .thrB og thrC'af I pAM9 som sonde.

I 25 I Med hensyn til fig. 14 er det chromosomale DNA digereret I med EcoRI og hybridiseret med EcoRI-HindlIl-fragmentet, I der indeholder generne nptll, thrA, thrB og thrC', af pAM9 som sonde.

I 30 I Med hensyn til fig. 15 er det chromosomale DNA digereret I med Sall og hybridiseret med BamHI-fragmentet, som I indeholder asd-genet, af pAMll som sonde.

I 35 Med hensyn til fig. 16 er det chromosomale DNA digereret I med EcoRI og hybridiseret med BamHI-fragmentet, der I DK 175477 B1

indeholder asd-genet, af pAMll som sonde. I

Fig. 17 viser kloningen af asp-A-genet i en ufuldstændig I

phag;

Is fig. 18 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt

I af "blot"-hybridisering af DNA fra stammerne MC4100, I

I EL1010 og EL1011 angivet ved de respektive baner A-C I

(sonden er et plasmid indeholdende genet aspA, hvor I

I 10 DNA'et er digereret med Sall); fig. 19 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt af "blot"-hybridisering af DNA fra stammerne EL1016,

EL1014 og EL1015 angivet ved de respektive baner A-C

I 15 (sonden er Salll-BamHI-fragmentet, som indeholder

threonin-operon'et af plasmid pAM9, og DNA'et er digere- I

I ret med enzymet Hindlll) og fig. 20 viser resultaterne af elektroforese efterfulgt I 20 af "blof’-hybridisering af DNA fra stammerne EL1016, EL1017, ELl017-a, EL1071-b, EL1017-C og EL1017-d angivet I ved de respektive baner A-F (sonden er EcoRI-Hindlll-

I fragmentet» der indeholder generne nptll, thrA, thrB-og I

thrC' af plasmid pAM9).

25 I Eksempel 1; Fremstilling af et enzym med g- I galactosidase-aktivitet ved amplifikation af den kodende I region, som er ansvarlig for produktionen» ved I fermentering af g-galactosidase I 30 I Fremstilling af en stamme, som sit chromosom indeholder I en ekstra kopi af β-galactosidase-genet klonet i det I indre af en "afvæbnet" transposon I 35 Stammen E. coli POII1734 : F-, araD139, ara : (Mucts 3, I Δ (lac)X74, galCJ, galK, rpsL (SmR), (MudII1734) DK 175477 B1 15 indeholdende MudII1734 (Pig. 1) (Castilho et al., J.

Bacteriol., 158, 488, 1984) blev dyrket i 2 ml LB-medium i 2 timer ved 30 °C, hvorefter den blev udsat for. et varmechok ved 45 °C i 15 minutter. Derefter foretog man 5 en dyrkning ved 37 °C i 2 timer, hvilket førte til et phag-lysat. For at opnå en opløsning af phagen blev lysatet blandet med nogle dråber chloroform og derefter centrifugeret. Supernatanten blev anvendt som phag-opløsning til at inficere bakteriestammen.

10 __

Stammen E. coli MC4100 : F-araD139, A(argF-lac), ΟΓ69, psL150, relAl, flb5301, ptsF25, deoCl (Casabadan, 1975), som beskrevet af Castilho et al. (1984), blev dyrket natten over i LB-medium. Derefter tilsatte man CaCl2 og 15 MgSC>4 indtil en slutkoncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Man blandede 200 μΐ af denne kultur med opløsningen af phagen beskrevet ovenfor, og blandingen fik lov at I henstå ved omgivelsestemperatur i 15 minutter. Efter I tilsætning af 2 ml LB-medium og inkubation i 2 timer ved I 20 30 °C blev cellesuspensionen udsået i skåle med LB- I medium indholdende 20 ug/ml kanamycin (Km) og 10 mM X- I gal. Der inkuberedes i 24 timer ved 30 °C med henblik på I udvælgelse af transduktanter. ' — I 25 Man identificerer de kolonier, som ikke producerer I Mucts, efter verifikation ved udspredning af kopierne på I en E.coli-stamme, som er følsom over for Mu, og man I isolerer en stamme benævnt MC4100 <MudII1734). Denne I stamme producerer ikke β-galactosidase, hvilket ses af I 30 koloniernes hvide farve i dyrkningsskåle indeholdende I LB-medium suppleret med X-gal, som er en substans, der I skifter fra farveløs til blå farve, når den hydrolyseres I til β-galactosidase.

I 35 DNA'et udvindes og spaltes med restriktionsenzymet I EcoRI, hvorefter de opnåede fragmenter separeres på en I DK 175477 B1 I 16 gel og absorberes på nitrocellulose. Efter hybridisering med DNA'et fra den markerede transposon er der to syn-

lige bånd på det opnåede autoradiogram, hvilket indike- I

rer tilstedeværelse af en kopi af transposonen i 5 mikroorganismestammen.

Kloning af transposase-generne A og B fra Mu-phagen på et roultikopi-plasmid

H 10 DNA'et udvundet fra plasmidet pAB8155, som indeholder I

den "afvæbnede" phag MudII1681, spaltes med restrik- tionsenzymerne EcoRI og EcoRV. Fragmentet på 8,3 kb, som indeholder transposase-generne A og B, oprenses ved elektroforese på en gel og klones ind i den cirkulære 15 vektor pUC19, som er lineariseret med Smal og EcoRI. Det rekonstituerede plasmid transformeres i en passende

receptiv bakterie. De kolonier, som er resistente over I

for antibiotika, udvælges, hvorefter man påviser, at de I indeholder plasmidet pPR30 (fig. 2).

I 20 I MC4100 (MudII1734) transformeres med pPR30 efter be- I handling af cellerne med calciumchlorid (Mandel og Higa,

I J. Mol. Biol., 53, 159, 1970). Efter.2 timer ved 30 le i I

I kontakt med LB-medium bliver cellerne udsået i skåle I

I 25 indeholdende 20 pg/ml Km, 25 ug/ml ampicillin (Ap) og 10 I ug/ml X-gal. Man inkuberer ved 30 °C i 48 timer, hvor- I under man ser, at der kommer blåfarvede kolonier til I syne med varierende farveintensitet. Disse kolonier op- renses i det samme medium, hvorefter man foretager en 30 udvælgelse.

I Det totale DNA ekstraheres fra de uafhængige kolonier og I digereres med EcoRI, hvorefter det underkastes elektro- I forese og overføres til en membran af nylon. Efter I 35 hybridisering med DNA fra den radiomærkede transposon I kan man påvise adskillige bånd på autoradiogrammet,

DK 175477 B1 I

17 I

hvilket er et tegn på. -amplif ikation af transposonen.

Plasmidet pPR30 elimineres fra disse stammer ved flere

successive overføringer til LB-medium uden Ap. I

5 Stammen AMI er blevet særligt omhyggeligt undersøgt: I

efter at DNA'et var blevet isoleret, digereret med EcoRI I

og underkastet elektroforese, blev DNA-fragmenterne I

overført til en nylonmembran. Man kunne iagttage 4 hybridiseringsbånd på fig. 3 (bånd f), når man som sonde I 10 anvendte radiomærket pCE1134. Disse 4 hybridiserinjges I bånd svarer til to indføringer af MudII1734.

I Stabilitet af kopiantallet af MudII1734 I 15 Stammen AMI : MC4100 (MudII1734), som har to kopier af I MudII1734 på sit chromosom, dyrkes gennem 170 gene- I rationer på et medium af flydende LB uden indhold af Km.

I Derefter måles antallet af kopier af MudII1734 på I chromosomet ved DNA-DNA-hybridisering (fig. 3 bånd a-e).

I 20 Antallet af kopier i denne stamme forblev konstant, og I der kunne ikke påvises nogen ændringer i restriktions- I skemaet, hvilket er en indikation af en høj indførings- I stabilitet. — I 25 Produktion af β-galactosidase I Den således opnåede mikroorganismestamme er i stand til I at producere β-galactosidase. Stammerne MC4100 I (MudII1734) og AMI producerer hhv. 7 x 10-1 og 10 30 nmol/mn/mg protein med β-galactosidase-aktivitet.

Eksempel 2: Produktion af L-threonin ved amplifikation I af generne, som er ansvarlige for L-threonin-produk- tionen, ved fermentering I 35 I DK 175477 B1

Konstruktion af plasmid pCE1134

Mikroorganismestammen POII1734 (Castilho et al., J.

Bacteriol., 158, 488, 1984) transformeres med pCElOO

5 (2,1 kb, CmR, Fig. 4) efter behandling af cellerne med calciumchlorid (Mandel A. og Higa M., J. Mol. Biol., 53, (1970)).

H Transformanterne udvælges i dyrkningsskåle med LB-medium H 10 indeholdende 25 ug/ml chloramphenicol (Cm) efter 24 timers inkubation ved 30 °C. Transformanten POI11734/pCElOO dyrkes i 2 timer ved 30 °C i 3 ml LB- H medium, hvorefter den udsættes for et varroechok i 15 I minutter ved 45 °C. Efter dyrkning ved 37 °C i 2 timer 15 opnås et phag-lysat. For at opnå en opløsning af denne phag blander man lysatet med nogle dråber chloroform, hvorefter man centrifugerer blandingen. Supernatanten benævnes "opløsning af phag I". 1 20 E. coli M8820 (Mu) (Castilho et al., J. Bacteriol., 158, I 488, 1984) dyrkes natten over på et LB-medium, hvortil man har sat calciumchlor id og magnesiumsulfat til en I slutkoncentration . på hhv.. 1 mM og 2,5 mM.· 200 μΐ- af I denne kultur blandes med opløsningen af phag I, og 25 opløsningen hensættes ved omgivelsestemperatur i 15 I minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB-medium og inku- I bation i 2 timer ved 30 °C bliver denne cellesuspension I udsået i dyrkningsskåle med LB-medium indeholdende 20 pg/ml Km og 25 ug/ml Cm. Herefter inkuberes ved 30 °C i 30 24 timer. Man høster 20 kloner, som er kommet til syne i dyrkningsskålene, hvorefter man foretager en ekstraktion af plasmiderne ved mini-præparationsmetoden (Birnboim og Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513, 1979). En analyse af restriktionskortet viste, at samtlige kloner indeholdt 35 et plasmid, hvori MudII1734 var blevet indført. Et af disse plasmider blev benævnt pCE1134 (fig. 4).

DK 175477 B1 19

Konstruktion af MudAM9 omfattende et Thr-operon

Plasmid pCE1134 spaltes fuldstændigt af restriktionsenzymerne BamHI og Sall i denne rækkefølge. Man isolerer 5 det DNA-fragment, hvori lac-operon'et mangler, ved agarose-gel elektrofurese, hvorefter man udvinder DNA-fragmentet fra gelen.

Plasmidet pAJ294 (Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 47, 10 2329, 1983) spaltes fuldstændigt af restriktionsenzym erne BamHI og Sall. Efter agarose-gel elektrofurese b'li-ver DNA-fragmentet, som indeholder thr-operon1 et, udvundet fra gelen. Man blander de to udvundne DNA-fragmenter, hvorefter man foretager en ligering ved 10 °C i 16 15 timer ved hjælp af T4 DNA ligase, ATP og dithiothreitol.

Efter transformation af mutantstammen thrB med ligeringsblandingen udvælges transformanterne på et minimal-medium indeholdende 25 ug/ml Cm og intet threo-nin. Plasmidet udvindes fra én af transformanterne og 20 viser sig at indeholde Mud med npt-genet og thr-operon’ et (pAM9, fig. 5).

Transponering-af MudAM9 på chromosomalt DNA — 25 E. coli-stammen JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985)) (Mucts) transformeres med pAM9 efter behandling med calciumchlorid. Transformanterne udvælges i skåle med LB-medium indeholdende 20 pg/ml Km og 25 pg/ml Cm efter inkubation ved 30 °C i 24 timer. Plas-30 miderne udvindes fra 20 uafhængige kolonier og viser sig at være plasmid pAM9. Man dyrker JM109 (Mucts)/pAM9 ved 30 °C i 2 timer efter at have foretaget en thermisk chokbehandling ved 45 °C i 15 minutter. Kulturen holdes ved 37 °C i 2 timer. Derefter blandes kulturen med nogle 35 dråber chloroform, og blandingen far lov at henstå ved omgivelsestemperatur i 15 minutter. Man opnår en opløs-

I DK 175477 B1 I

I 20 I

ning benævnt "opløsning af phag II" efter 10 minutters I

I centrifugering med 5000 omdrejninger per minut. I

Til kulturen af JM109 (Mucts), som har henstaet natten I

5 over ved 30 °C på LB-medium, sætter man CaCl2 og MgSOø I

I indtil en slutkoncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Man I

I blander 200 μΐ af denne opløsning med opløsningen af I

I phag II og lader blandingen henstå ved omgivelses- I

I temperatur i 15 minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB- I

10 medium foretager man en inkubation ved 30 °C i 2 timer, I

hvorefter man udplader den resulterende suspension ' på I

LB-medium indeholdende 20 pg/ml Km. Efter inkubation ved I

I 30 °C i 24 timer høster man 100 kolonier, hvis sensibi- I

I litet over for Cm efterprøves. Det viser sig, at 95% af I

15 kolonierne er følsomme over for Cm, og disse viser sig I

I at være JM109 (Mucts) (MudAM9). I

I Efter dyrkning af JM109 (Mucts) (MudAM9) ved 30 °C i 2 I

I timer på LB-medium udsættes kulturen for et varmechok I

H 20 ved 45 °C i 15 minutter, og denne behandling efterfølges I

I af en inkubation i 2 timer ved 37 °C. Der tilsættes I

derefter nogle dråber chloroform, og den resulterende I

blanding centrifugeres med- 5000 omdrejninger per minwtt i I

10 minutter. Den resulterende supernatant er en "opløs- I

25 ning af phag III". I

Til E. coli-stammen AJ11332 (Shiio et al., Agric. Biol. I

Chem., 33, 1152, 1969), som har været dyrket natten I

over, sættes CaCl2 og MgS04 indtil en slutkoncentration I

30 på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Man blander 200 μΐ af denne op- I

løsning med opløsningen af phag III, hvorefter man lader I

den resulterende blanding henstå ved omgivelses- I

temperatur i 15 minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB- I

medium fortsættes inkubationen ved 30 °C i 2 timer.

35 Cellesuspensionen udplades i skåle med LB-medium indeholdende 20 Mg/ml Km, hvorefter der foretages en inku- DK 175477 B1 21 bation ved 30 °C L 24 timer. Der høstes 100 kolonier, hvis lysering testes ved 45 °C tillige med deres sensibilitet over for phagen Mu. Det viser sig, at 85% af kolonierne ikke undergår lysering og er Mu-følsomme.

5 En af disse stammer benævnes EL1001.

Amplifikation af MudAM9 på chromosomalt DNA og valg af kopiantal 10 (i) amplifikation af MudAM9 ved hjælp af pPR30:

Man transformerer stammen EL1001 med plasmid pPR30. Transformanterne udvælges i dyrkningsskåle med Γ.n-medium indeholdende 25 pg/ml Ap og en variabel mængde Km og/eller neomycin (Nm).

15 (ii) ampi ifikation ved hjælp af Mucts-lysat:

Stammen EL1001 inficeres med et Mucts-lysat som beskrevet ovenfor, hvorefter den inficerede stamme ud-plades i dyrkningsskåle med LB-medium, der indeholder 20 variable mængder Km.

Klonerne, som opnås ud fra pPR30 i tilfældet (i)» og klonerne, som opnås ud fra Mu i tilfældet (ii), udvæiges med henblik på at frembringe et stabilt antal kopier af 25 MudAM9.

Efter inkubation ved 30 °C i 48 timer høster man koloni erne og måler antallet af MudAM9-kopier på det chromo-somale DNA ved den ovenfor beskrevne hybridiserings- 30 metode.

Man har især studeret stammerne EL1002 og EL1003.

Man udvinder DNA fra stammerne AJ11332, EL1001, EL1002

35 og EL1003. Efter digestion med restriktionsenzymet EcoRI

underkaster man DNA'et en elektroforese og overfører -----— -

I DK 175477 B1 I

I 22 I

I DNA'et til en nylonmembran. Derefter hybridiseres DNA’et I

| med små fragmenter af radiomærket pMA9 digereret med I

I EcoRI. Resultaterne er vist på tegningens £ig. 6. Band- I

ene A, B, C og D svarer til hhv. AJ11332, EL1001, EL1002 I

I 5 og EL1003. Bogstavet a svarer til vildtypen af thr- I

I operon'et, bogstavet b svarer til et ikke identificeret I

I bånd, som man ser på båndene B, C og D. Tallene svarer I

I til specifikke bånd af MudAM9. Ifølge disse resultater I

I indeholder stammerne EL1001, EL1002 og EL1003 hhv. I

I 10 (mindst) 1,4 og 10 kopier af MudAM9. I

I Relationen imellem antallet af kopier af MudAM9 i I

| mikroorganismestammen og koncentrationen af de antibio- I

I tika, over for hvilke stammen er resistent, er opsumme- I

I 15 ret i den efterfølgende tabel I: I

I Tabel I I

I Relation mellem antallet af kopier af MudAM9 I

I 20 og resistensen over for antibiotika I

I Antal af kopier af MudAM9 Resistens Sensibilitet I

lo 20 ug/ml Km I

I 25 1 200 pg/ml Km 250 pg/ml I

I Km og Nm I

I 2 (eller flere) 250 ug/ml I

I Km og Nm I

I 30 Fremstilling af L-threonin I

I De stammer, som indeholder amplifikeret MudAM9, an- I

I bringes i skåle med frisk LB-medium i 24 timer ved 30 I

I °c, hvorefter de indpodes i 20 ml af det nedenfor be- I

I 35 skrevne produktionsmedium. I

DK 175477 B1 23

Sammensætning af produktionsmedium

Glucose: 30 g/1, (NH4)2S04 : 10 g/1, KH2P04 : 1 g/1,

MgS04*7H20 : 1 g/1,FeS04*7H20 : 10 mg/1, MnS04‘4-6H20 : 5 10 mg/1, L-Met : 0,1 g/1, L-Ile : 0,1 g/1, L-Pro : 0,45 g/1, ARN : 2 g/1, Thiamin-HCl : 1 mg/1 og CaCC>3 : 40 g/1 (pH : 7,0).

Kulturen omrystes ved 30 °C i 72 timer. Mængden af 10 threonin i mediet målet ved hjælp af et aminosy_re-analyseapparat. Resultaterne er sammenfattet i den efterfølgende tabel II.

Tabel II 15

Produktion af L-threonin ved hjælp af stammer indeholdende MudAM9

Stamme Estimering af kopiantallet af MudAM9 L-Th (g/1) 20 AJ11332 0 3 EL1001 1 (eller flere) 3,3 EL1002 4 (eller flere) - 8,9 EL1003 10 (eller flere) 12 25

Stabilitet og produktivitet med hensyn til L-threonin

Stammen EL1002, som indeholder 4 kopier af MudAM9, bliver flere gange successivt overført til dyrkningsskåle 30 med LB-medium, som ikke indeholder antibiotika, og efter hver overføring tester man produktiviteten mht. L-threonin. Til dette formål anvender man den ovenfor beskrevne metode. Resulaterne er sammenfattet i den efterfølgende tabel III.

35 I DK 175477 B1 I 24

I Tabel III

Stabilitet af produktionen af L-thceonin I efter gentagne overføringer til LB-medium uden I 5 antibiotika af stammen EL1002 I Antal overføringer 0 2 4 6 8 10 I Produktion af L-Thr 8,5 8,6 8,5 8,8 8,8 8,9 I 10 Den efterfølgende tabel IV viser den specifikke akti_vi- I tet af enzymerne til biosyntesen af L-Thr ved hjælp'af stammer, der indeholder MudAM9.

I Tabel IV

H 15

Produktion i stor målestok af enzymer til biosyntese I af L-threonin ved hjælp af AJ11332 (mudAM9) I Stamme Specifikke aktiviteter (*)

I 20 AKI HDHI

I AJ11332 2,5 4,8 I EL1001 4,0 10,1— I EL1002 12,5 25,0 25 EL1003 22,5 37,4

I (*) de specifikke aktiviteter er angivet i nmol/min/mg I

protein

I 30 Eksempel 3: Amplif ikation af Mud med et plasmid I

I indeholdende thermoinducerbare transposaser I

I Konstruktion af et plasmid, der indeholder thermo- I

I inducerbare transposaser I

I 35 DK 175477 B1 25

Mikroorganismestammen POII1681 : M8820 (Mucts) (MudII1681) (Castilho et al., J., Bacteriol., 158, 488 (1984)) transformeres efter behandling af bakterierne CaCl2 (Mandel M. og Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 5 (1970)) med plasmidet pEVll (Fig. 7). Efter 24 timers inkubation ved 30 °C bliver transformanterne udvalgt i dyrkningsskåle med LB-medium indeholdende 20 pg/ml Ap og 20 ug/ml Km. En af transformanterne, POII1681/pEVll, dyrkes i 2 timer ved 30 °C i 3 ml LB-medium. Kulturen 10 underkastes derefter et varmechok ved 45 °C i 15 minutter efterfulgt af 2 timers dyrkning ved 37 °C. Man tilsætter nogle dråber chloroform, og efter centrifu gering med 5000 omdrejninger per minut i 10 minutter opnår man en phag-opløsning. Man frembringer en overnats-15 kultur af stammen E. Coli : M8820 (Mu) Castilho et al., J., Bacteriol., 158, 488, (1984)) i LB-medium. Til denne kultur sættes CaCl2 og MgSC>4 indtil en slutkoncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Til 200 μΐ af denne kultur sætter man 50 μΐ af phag-opløsningen, hvorefter man lader 20 den resulterende suspension henstå ved omgivelses temperatur i 15 minutter.

Efter tilsætning, af 2 ml LB-medium og omrystning i 2 timer ved 30 °C bliver bakteriesuspensionen udsået i 25 skåle med LB-medium indeholdende 20 pg/ml Ap og 20 pg/ml Km, og der inkuberes i 24 timer ved 30 °C. Herved opnås fem kolonier, hvis plasmid-DNA udvindes ved minipræparationsmetoden (Birnboim og Doly, Nucleic Acid Res.

7, 1513 (1979)). Efter analyse af restriktionskortet 30 viser klonerne sig at indeholde en indføring af

Mudlll681 i plasmidet pEVll. Et af plasmiderne benævnes pMCl (fig. 7).

Plasmidet pMCl digereres med restriktionsenzymerne BamHI 35 og Bglll, hvorefter det ligeres med pRCIOO (se eksempel 2) skåret med restriktionsenzymet BamHI. Stammen MC1060 I DK 175477 B1 I 26

I transformeres med ligeringsblandingen. Transformanterne I

I udvælges i dyrkningsskåle med LB-medium indeholdende 25 I

I ug/ml Cm og 20 ug/ml Ap. Plasmiderne fra 30 trans- I

I formenter bliver udvundet og analyseret. Et af disse I

I 5 plasmider benævnes pMC23 (fig. 7). I

I Amplifikation af den ufuldstændige phag MudAM9 med I

I plasmidet pMC23 I

I 10 Mikroorganismestammen EL1001, som indeholder den ufuld- I

H stændige phag MudAM9 (se eksempel 2), bliver efter I

behandling med CaCl2 (eksempel 2) transformeret med I

I plasmidet pMC23. Transformanterne udvælges i skåle med I

LB-medium, som indeholder 20 ug/ml Ap og 25 μg/ml Cm, I

15 efter en inkubation ved 30 °C i 24 timer. I

Transformanten EL1001/pMC23 dyrkes i LB-medium, som I

I indeholder 20 ug/ml AP og 25 ug/ml Cm, i 2 timer ved 30 I

°C. Man udsætter 1 ml af denne kultur for et varmechok i I

20 15 minutter ved 45 °C, hvorefter man tilsætter 1 ml LB- I

medium. Der inkuberes i 2 timer ved 30 °C. I

Denne bakterie suspension bliver udsået i dyrkningsskåle I med LB-medium indeholdende 400 ug/ml af hver af forbind- I 25 eiserne Nm og Km. Der inkuberes i 48 timer ved 30 °C.

Denne behandling fører til 50 kloner, som testes mht.

I deres Cm-sensibilitet og deres produktion af L-Thr (eksempel 2). Blandt disse kloner er 501 Cm-følsomme, I mens 60% producerer mere L-threonin end værtsorganismen.

I 30

Der kan således udvælges adskillige kloner, hvis antal af MudAM9-kopier måles ved DNA-DNA-hybridiseringsteknik (Southern, 1975, J. Mol. Biol., £8 503). De chromosomale DNA’er digereres med restriktionsenzymet Hindlll. Efter 35 elektroforese bliver disse DNA'er absorberet på en nylonmembran, hvorefter de hybridiseres med Sall-BamHI- DK 175477 B1 27 fragmentet (mærket ved sulfonering), som indeholder threonin-operon'et, af plasmidet pAM9 som sonde.

Resultaterne mht. produktion af L-threonin og antal 5 MudAM9-kopier er angivet i tabel V og fig. 8. Banerne A, B og C svarer til de respektive organismestammer AJ11332, EL1008 og EL1009.

På banen A ser man båndet "o" svarende til threonin-10 operon'et. På banen B er der mindst seks synlige bånd, nemlig båndet "o" og fem bånd, som er nummereret 1-5,' og som svarer til (mindst) fem kopier af MudAM9. På banen C ser man, ud over båndet "o", tre bånd nummereret 1-3, som svarer til mindst tre kopier af MudAM9.

15

Tabel V

Antal kopier af MudAM9 og produktion af L-threonin i stammerne EL1008 og EL1009 20

Stamme Antal kopier L-Thr(g/1) EL1008 5 7 - EL1009 3 5 25

Eksempel 4: Amplifikation af to forskellige

ufuldstændige phaqer på en mikroorganismestammes chromosomale DMA

30 Fremstilling af et lysat indeholdende MudIIPR13

Efter dyrkning af mikroorganismestammen MC4100 (Mucts) (MudIIPR13) (P. Ratet et al., Gene, 63, 41-52, 1988) i LB-medium i 2 timer ved 30 °C gennemfører man en ther-35 misk chokbehandling ved 45 °C i 15 minutter efterfulgt af en inkubation ved 37 °C i 2 timer. Man tilsætter I DK 175477 B1

I 28 I

nogle dråber chloroform, hvorefter man centrifugerer i I

10 minutter med 5000 omdrejninger per minut. Herved op- I

I når man lysatet af phagen VI. I

5 Transponering af MudIIPR13 på det chromosomale DNA I

H Til en overnatskultur af mikroorganismestammen EL10Q1 I

I sættes CaCl2 og MgS04, indtil slutkoncentrationerne er I

H hhv. 1 mM og 2,5 mM. Man sætter 50 μΐ af opløsningen af I

I 10 phagen VI til 200 μΐ af kulturen af EL1001, hvorefter I

man anbringer den resulterende suspension ved I

omgivelsestemperatur i 15 minutter. Efter tilsætning af I

I 2 ml LB-medium omrystes suspensionen ved 30 °C i 2 I

I timer. Derefter bliver bakterierne udsået på LB-medium I

I 15 indeholdende 25 ug/ml Cm og 25 ug/ml Km. Efter en I

inkubation ved 30 °C i 24 timer bliver 50 kolonier om- I

plantet og derefter testet mht. såvel deres lysering ved I

I 45 °C som deres sensibilitet overfor phagen Mu. Det I

I viser sig, at 80% af de undersøgte kolonier er følsomme I

I 20 over for Mu, og at de ikke lyserer ved 45 °C. En af I

I stammerne, EL1001 (MudIIPR13), benævnes EL1004. I

I Stammen. EL1003 behandles på samme måde. En af EL1043- I

I stammerne (MuDIIPR13) benævnes EL1005. I

25

I Amplifikation af MudIIPR13 i stammerne EL1004 og EL1005 I

I Stammen EL1004 inficeres af et Mucts-lysat fremstillet I

ud fra stammen JM109 (Mucts) ved metoden beskrevet i I

I 30 eksempel 2. Derefter bliver bakteriesuspensionen udsået I

I i skåle med LB-medium indeholdende 20 ug/ml Km og 400 I

I ug/ml Cm. Efter inkubation i 48 timer ved 30 °C bliver I

50 kolonier isoleret og derefter testet mht. deres I

lysering ved 45 °C og deres sensibilitet over for phagen I

I 35 Mu. Det viser sig, at 84% af klonerne er følsomme over I for Mu, og at de ikke lyserer ved 45 °C. En af disse DK 175477 B1 29 kloner benævnes EL1006.

Stammen EL1005 behandles på samme måde, hvorved man opnår klonen EL1007.

5

Man udvinder det chromosomale DNA fra stammerne AJ11332, EL1001, EL1003, EL1004, EL1005, EL1006 og EL1007.

Efter digestion af det chromosomale DNA med 10 restriktionsenzymet EcoRI foretager man en DNA-DNA-hybridisering ved Southern-metoden (eksempel 3). Sonden svarer til plasmidet pRCIOO digereret med Hindlll og mærket ved sulfonering. På fig. 9 svarer banerne A, B, C, D, E, F og G til stammerne AJ11332, EL1001, EL1004, 15 EL1006, EL1003, EL1005 og EL1007 i denne rækkefølge.

De opnåede bånd i banerne A, B og E svarer til en hybri-disering imellem sonden pRCIOO og stammernes chromosomale DNA. Disse bånd er også til stede i alle de 20 andre baner, og de er således ikke specifikke for

MudIIPR13. I banerne C, D, F og G markerer tallene 1-4 de bånd, som udviser en specificitet mht. hybridisering med MudIIPR13. Hvert bånd svarer til en indføring- af MudIIPR13. I de samme baner svarer båndet "o" til et 25 internt bånd i MudIIPR13. Ifølge disse resultater indeholder stammerne EL1004 og EL1005 hver én indføring af MudIIPR13. Stammerne EL1006 og EL1007 indeholder hhv. mindst 4 og mindst 3 indføringer af MudIIPRl3. 1

Eksempel 5: integration og ampi ifikation af ufuldstændige phaqer i en stamme af Erwinia Chrysanthemi

Fremstilling af lysater af MudII1734 og MudAM9 35 Man fremstiller to phag-lysater, der indeholder

MudII1734 og MudAM9, ud fra mikroorganismestammerne: I DK 175477 B1

I 30 I

POII1734 (Castilho et al., J. Bacteriol., 158, 488 I

I (1984)) og JM109 (Mucts) (MudAM9) eksempel 2) ved I

metoden beskrevet i eksempel 2.

5 Transponering af Mud-phager på chromosomalt DNA fra

Erwinia Chrysanthemi

Man anvender stammen E. chrysanthemi 384551 (M.

H Chippaux, CNRS, Marseille) som receptiv mikro- 10 organismestamme. Transduktionen (eksempel 2) gennemføres ved hjælp af 2 lysater (eksempel 2). De kolonier, som er i stand til at vokse på et medium, der indeholder 20

Mg/ml Km, isoleres, hvorefter de testes mht. deres lyse- I ring ved 45 °C og mht. deres sensibilitet over for 15 phagen Mu. Det viser sig, at 70% af de transduktanter, I der opnås efter infektion med lysaterne MudII1734 og I MudAM9, er følsomme over for Mu-phager, mens 80% af de I opnåede transduktanter ikke lysereres ved 45 °C. Man I udvælger en klon fra hver transduktion: I 20 I EL3003 : E. chrysanthemi (MudII1734) E13004 : E. chrysanthemi (MudAM9) I Amplifikationen af Mud-phager i stammerne EL3003 og I 25 EL3004 gennemføres ved hjælp af et lysat af stammen I JM109 (Mucts) som beskrevet i eksempel 2. Udvælgelsen af I stammer, som indeholder amplifikeret Mud, gennemføres på et LB-medium, der indeholder 400 Mg/ml af hvert af I stofferne Km og Nm.

I 30 I Man omplanter 50 resistente kolonier, som man derefter I tester mht. deres sensibilitet over for phagen Mu. På I denne måde opnår man stammerne EL3007 og EL3008, som er følsomme over for Mu-phager.

I 35 DK 175477 B1 31

Antal Mud-kopier på det chromosomale DNA hos de to stammer

Det chromosomale DNA udvindes ved den samme teknik som 5 for E. coli (eksempel 1) med den undtagelse, at man behandler med natriumdodecylsulfat (SDS) i stedet for sarcosyl. Man foretager en molekylær analyse af disse DNA'er ifølge Southern-metoden (eksempel 3). DNA'et digereres ved hjælp af restriktionsenzymet EcoRI. De 10 anvendte sonder er specifikke for de ufuldstændige phager og er mærket ved sulfonering:

For MudII1734: EcoRI-Hindlll-fragmentet af plasmid pAM9 svarende til den venstre del af den ufuldstændige phag.

15

For MudAM9: Sall-BamHI-fragmentet af plasmid pAM9 svarende til threonin-operon’et af E. coli.

Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel VI og 20 figurerne 10 og 11.

På fig. 10 svarer banerne A, B og C til de respektive stammer E. chrysanthemi 384551,.EL3003 og-EL3007. — 25 I banerne B og C er der hhv. et og tre synlige bånd svarende til en specificitet af hybridiseringen med MudII1734. Ifølge disse resultater besidder stammerne EL3003 og EL3007 hhv. en og tre indføringer (eller flere) af MudII1734.

30 På fig. 11 svarer banerne A, B og C til de respektive stammer E. chrysanthemi 384551, EL3004 og EL3008.

I banen A svarer fragmentet "b" til en hybridisering 35 imellem sonden og det chromosomale DNA af stammen 384551. Dette fragment genfindes i alle de øvrige baner.

I DK 175477 B1 I

I 32 i

I I banerne B og C viser tallene, som svarer til båndene, I

I en specificitet af hybridiseringen med MudAM9. To af I

I båndene svarer til en indføring af MudAM9. I

5 Ifølge disse resultater indeholder stammerne EL3004 og I

I EL3008 hhv. mindst 1 og mindst 4 indføringer af MudAM9. I

I Tabel VI I

I 10 Antal kopier af Mud i stammer af E. chrysanthemi _ I

I Stamme Antal kopier I

I EL3003 1 I

I 15 EL3004 1 I

I EL3007 3 {eller flere) I

I EL3008 4 (eller flere) I

I Eksempel 6; Amplifikation af en ufuldstændig phag i I

20 overstørrelse . I

I Konstruktion af MudAMll omfattende threonin-operon’et og I

I asd-genet. _ I

I 25 Plasmidet pAM9 (se eksempel 2), som indeholder den I

I ufuldstændige phag MudAM9, spaltes fuldstændigt af I

I restriktionsenzymet BamHI (et enkelt spaltningsted), I

I hvorved plasmidet pAM9 bliver lineariseret. I

30 Plasmidet pAD20 (Haziza et al., EMBO, J., 1982, 3, 379- - I

I 384) spaltes fuldstændigt af restriktionsenzymet BamHI. I

I Efter elektroforese udvindes det fragment, som inde- I

I holder asd-genet, fra gelen. I

I 35 De to DNA-fragmenter blandes, hvorefter man foretager en I

I ligering ved 22 °C i i time ved hjælp af T4 DNA ligase, I

DK 175477 B1 33 ATP og dithiothreitol. Efter transformation af en mutantstamme Asd”:JCP203 (C. PRINTZ, personlig kommunikation) med ligeringsblandingen udvælges transformanterne på et komplet medium, der indeholder 25 ug/ml Cm 5 og 20 ug/ml Km. Et plasmid udvundet af disse trans-formanter viser sig at indeholde den ufuldstændige phag MudAMll, der indeholder genet nptll, threonin-operon'et og genet asd. Dette plasmid, benævnt pAMll, er vist på fig. 12.

10

Transponering af MudAMll på chromosomale DNA'er

Stammen JM109 (Mucts)/pAMll opnås ved, at man transformerer stammen E. coli JM109 (Mucts) (se eksempel 2) 15 ved hjælp af plasmidet pAMll.

Stammen JM109 (Mucts)/pAMll dyrkes ved 30 °C i 2 timer.

Efter et varmechok ved 45 °C i 15 minutter holdes kulturene ved 37 °C i 2 timer. Derefter sætter man nogle 20 dråber chloroform til cellekulturene og lader disse henstå ved omgivelsestemperatur i 15 minutter. Man opnår en phag II-AMll-opløsning efter 10 minutters centrifugering med. 5000 omdrejninger, per .minut. - - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Til en kultur JM109 (Mucts), som har henstået natten 2 over ved 30 °C i LB-medium, sættes CaCl2 og MgSC>4 indtil 3 en slutkoncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Man blander 4 50 μ1 af phag II-AMll-opløsningen med 200 μΐ af denne 5 kultur og lader blandingen henstå ved omgivelses- 6 temperatur i 15 minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB- 7 medium omrystes blandingen i 2 timer ved 30 °C, hvor 8 efter man udsår bakteriesuspensionen i skåle med LB- 9 medium indeholdende 20 pg/ml Km. Efter inkubation ved 30 10 °C i 24 timer høster man 100 kolonier, hvis sensibilitet 11 over for Cm man derefter verificerer. Det viser sig, at 85% af kolonieren er Cm-følsomme. En af klonerne benæv- I DK 175477 B1 I 34 H nes JM109 (Mucts) (MudAMll).

Efter dyrkning af stanunen JM109 (Mucts) (MudAMll) i 2

timer ved 30 °C i LB-mediura foretager man en thermisk I

I 5 chokbehandling ved 45 °C i 15 minutter. Efter 2 timers I

H inkubation ved 37 °C tilsætter man nogle dråber I

chloroform og centrifugerer blandingen i 10 minutter med

5000 omdrejninger per minut. Den herved opnåede super- I

I natant er en phag III-AMll-opløsning.

I 10

Stammen AJ11332 (X+,Pro~) transduceres med en phag PI I

dyrket på en stamme Pro+. Man udvælger en stamme AJ11332 I

I (X + , Pro+). Den i denne stamme indeholdte phag λ I

elimineres derefter (C. MOREL, personlig kommunikation).

15 Den således opnåede stamme, AJ11332 (X~, Pro+), benævnes

I EL1016. Til stammen E. coli EL1016, dyrket natten over I

H ved 37 °C på LB-medium, sætter man CaCl2 og MgS04 indtil I

en slutkoncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Man blander I

50 μΐ af phag III-AMll-opløsningen med 200 μΐ af denne I

20 kultur og lader blandingen henstå ved omgivelses- I

I temperatur i 15 minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB- I

medium omrystes blandingen i 2 timer ved 30 °C. Derefter I

bliver bakteriesuspensionen udsået i. dyrkningsskåle jned

LB-medium, der indeholder 20 ug/ml Km, og der inkuberes I

I 25 i 24 timer ved 30 °C. Man udvælger én af Mu-klonerne, I

I nemlig EL1012.

I Amplifikation af MudAMll på chromosomalt DNA og I

I udvælgelse af kopiantal I

I 30

I Amplifikationen foregår ved infektion af stammen EL1012 I

I med et lysat af Mucts-phager opnået som beskrevet oven- I

I for. Bakterierne bliver udsået i dyrkningsskåle med LB- I

I medium, som indeholder variable mængder Km og Nm (250 - I

I 35 1200 ug/ml).

DK 175477 B1 35

De udvalgte transduktanter indeholder et stabilt antal kopier af MudAMll.

Man studerer især stammen EL1013.

5

Antallet af MudAMll-kopier på det chromosomale DNA bedømmes ved DNA-DNA-hybridiseringsmetoden (Southern) beskrevet i eksempel 3.

10 Man udvinder chromosomalt DNA fra stammerne EL1016, EL1012 og EL1013. Efter digestion med restriktionsenzymerne Sall eller EcoRI udsætter man disse DNA*er for en elektroforese, hvorefter de absorberes på en nylonmembran (se eksempel 3). Derefter hybridiseres de med et 15 markeret (ved sulfonering) DNA-fragment som sonde (figurerne 13, 14, 15 og 16). Banerne A, B og C svarer til hhv. EL1016, EL1012 og EL1013.

Bogstavet "a" svarer til vildtypen af threonin-operon'et 20 eller asd-genet. Bogstavet "p" svarer til partielle digestioner af DNA'et. Tallene svarer til de bånd, som markerer en specificitet af hybridiseringen med MudAMll.

Med hensyn til fig. 13 digereres de chromosomale DNA'er 25 med Sall, hvorefter de hybridiseres med fragmentet EcoRI-Hindlll af pAM9, som indeholder generne nptll, thrA, thrB og thrC’, som sonde.

I dette tilfælde er der to bånd, som svarer til en 30 indføring af MudAMll.

I banen A ser man kun båndet "a", som svarer til det oprindelige threonin-operon. 1 I banen B ser man tre bånd, nemlig “a", "1" og "2”, som svarer til en indføring af MudAMll.

I DK 175477 B1 I 36 I I banen C ser man ni bånd, nemlig "a" og "l" til "8", som svarer til (mindst) 4 indføringer af MudAMll.

I Med hensyn til fig. 14 digereres de chromosomale DNA'er I 5 med EcoRI og hybridiseres med EcoRI-HindIII-fragmentet af pAM9, der indeholder generne nptli, thrA, thrB og thrC*, som sonde. Et af båndene svarer til en enkelt indføring af MudAMll.

10 I banen A ser man kun båndet "a”, som svarer til threonin-operon'et. Båndet "p" svarer til en partiel digestion.

I banen B ser man to bånd, nemlig "a" og "1", som svarer H 15 til en indføring af MudAMll. Båndet "p" svarer til en partiel digestion.

I I banen C ser man seks bånd, nemlig Ma" og "1" til "5", I der svarer til (mindst) 5 indføringer af MudAMll.

I 20

I Med hensyn til fig. 15 digereres det chromosomale DNA

H med Sall, hvorefter det hybridiseres med BamHI- I fragmentet af pAMll, der indeholder asd-genet, ,som I sonde. Et af båndene svarer således til en indføring af I 25 MudAMll.

I I banen A ser man kun båndet "a”, som svarer til asd- I genet.

I 30 I banen B er man to band, nemlig "a” og "1", som svarer I til en indføring af MudAMll.

I I banen C ser man fem bånd, nemlig "a" og "1" til "4", I som svarer til (mindst) 4 indføringer af MudAMll.

I 35 DK 175477 B1 37

Med hensyn til fig. 16 digereres det chromosomale DNA med EcoRI og hybridiseres med BamHI-fragmentet af pAMll, der indeholder asd-genet, som sonde. Et af båndene svarer til en indføring af MudAMll.

5 I banen A ser man kun båndet "a" svarende til asd-genet.

I banen B ser man to bånd, nemlig "a" og ”1", som svarer til en indføring af MudAMll.

10 I banen C ser man seks bånd, nemlig "a" og "1" til ”5", som svarer til (mindst) 5 indføringer af MudAMll.

Ifølge disse resultater indeholder stammerne EL1012 og 15 EL1013 hhv. en og fem kopier (eller derover) af MudAMll.

Tabel VII

Relation imellem antallet af MudAMll-kopier i stammerne 20 og koncentrationerne af de antibiotika, over for hvilke stammerne er resistente

Antal MudAMll-kopier Resistens Sensibilitet 25 0 20 μς/ml Km 1 200 yg/ml 250 pg/ml

Nm og Km Nm og Km 5 (eller derover) 250 pg/ml 1200 pg/ml

Nm og Km Nm og Km 30

De stammer, som indeholder amplifikeret MudAMll, omplantes i skåle med LB-medium og henstår i 24 timer ved 30 °C, hvorefter de podes ind i 20 ml produktionsmedium (eksempel 2). Dyrkningen foregår ved 30 °C i 72 timer.

35 Mængden af L-threonin i mediet måles ved hjælp af en aminosyreanalysator. Resultaterne fremgår af den efter- I DK 175477 B1

I 38 I

I følgende tabel: I

I Tabel VIII I

I 5 Produktion af L-threonin ved hjælp af stammerne I

I EL1012 og EL1013 indeholdende den ufuldstændige I

I phaq MudAMll I

Estimering af antallet I

I 10 Stamme af kopier af MudAMll L-Thr (q/1) I

I EL1016 0 3,0 I

I EL1012 1 5,3 I

I EL1013 5 (eller derover) 10,2 I

I 15 I

I En dosering af aktiviteten af aspartokinase-I (AK-I) I

I foregår ved metoden beskrevet af Truffa-Bachi, P, & I

I Cohen, G-N., Methods in Enzymology, 1970, 17, 694-702. I

I 20 Aktiviteten af asparaginat-semialdehyd-dehydrogenase I

I (ASA) måles ved metoden beskrevet af Hegeman, G-D., I

I Cohen, G-N. og Margan, R., Methods in Enzymology, 1970, I

I 17, 708-713. . , I

I 25 Resultaterne fremgår af den følgende tabel. I

I 30 I

I 35 I

DK 175477 B1 39

Tabel IX

Specifikke aktiviteter af L-threonin-biosyntese-enzymerne fra stammer indeholdende MudAMll 5

Specifikke aktiviteter Stamme pmol/min/mg protein

AK-I ASA

10 EL1016 4,9 0,32 EL1012 4,0 0,54 EL1013 21,1 1,14 15 Eksempel 7: Amplifikation af aspA-genet fra E. coli med henblik på produktion af l-asparaginat-ammoniak-lyase

Konstruktion af MudAB9 omfattende aspA-genet, der koder for L-asparaginat-ammoniak-lyase fra E. coli 20

Plasmidet pGS94 (Guest et al., J. Gen. Microbiol.

(1984), 130, 1271-1278), som indeholder genet aspA, spaltes fuldstændigt, af restriktionsenzymerne Clal^og Sall. Fragmentet på 3,4 kb indeholder genet aspA.

25

Plasmidet pPC3 (som opstår ved inversion af fragmentet PstI af plasmidet pPR3; GENE, vol. 42, (1986) side 185-192), som indeholder den ufuldstændige phag MudPC3, spaltes fuldstændigt af restriktionsenzymerne Clal og 30 Sall. Fragmentet på 5,3 kb indeholder den ufuldstændige phag, hvori man ønsker at klone genet aspA.

De to spaltede plasmider blandes, hvorefter man foretager en ligering i 1 time ved 22 °C ved hjælp af T4-DNA 35 ligase, ATP og dithiothreitol. Efter transformation (eksempel 2) af stammen MC1060 med ligeringsblandingen I DK 175477 B1

I 40 I

bliver transformanterne udvalgt på LB-medium indehold- I

I ende 20 gg/ml Ap og 25 gg/ml Cm. I

I Man omplanter 27 transformanter på LB-medium, der inde- I

5 holder 20 gg/ml Km. Der tilbageholdes 17 kloner, som er I

følsomme over for dette antibiotikum. I

I Man foretager doseringer med L-asparaginat-ammoniak- I

I lyase-aktivitet på ekstracellulaere ekstrakter af kul- I

10 turer af disse kloner ifølge metoden beskrevet af I

I Spencer et al., J. Gen. Microbiol. (1976), 92, 73-82. I

I Kun klonen 9 har en AspA-aktivitet, som ligger over den I

I aktivitet, der fremkaldes af det chromosomale gen fra I

I stammen MC1060. I

I 15 I

I Plasmid DNA'et af denne klon udvindes ved teknikken I

I beskrevet af Birboim og Doly, hvorefter det spaltes ved I

I hjælp af restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll. Sam- I

I tidigt hermed spaltes DNA'et fra de to forældre- I

I 20 plasmider ved hjælp af de samme restriktionsenzymer. En I

I analyse af restriktionsprofilerne viser, at klonen 9 I

I svarer til kloning af det fragment, der indehodler aspA- I

I genet, ind i den ufuldstændige -phag MudPC3. Den -nye I

ufuldstændige phag benævnes MudAB9, og plasmidet, som I

I 25 bærer den, benævnes pAB9 (fig. 17). I

Transponering af MudAB9 på chromosomale DNA'er I

I Stammen JM109 (Mucts)/pAB9 opnås ved transformation af I

I 30 E. coli-stammen JM109 (Mucts) (eksempel 2) med plasmidet I

I pAB9. I

I Man dyrker stammen JM109 (Mucts)/pAB9 i 2 timer ved 30 I

I °C. Efter en thermisk chokbehandling ved 45 °C i 15 I

I 35 minutter bliver kulturen holdt ved 37 °C i 2 timer. I

I Derefter tilsættes nogle dråber kloroform. Efter 10 I

DK 175477 B1 41 minutters centrifugering med 5000 omdrejninger per minut opnår man et phag II-AB9-lysat.

Stammen JM109 (Mucts) dyrkes natten over ved 30 °C i LB-5 medium. Man tilsætter CaCl2 og MgSC>4 indtil en koncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Til 200 μΐ af denne kultur sættes 50 ul af phag II-AB9-lysatet. Efter 15 minutters adsorption ved omgivelsestemperatur tilsættes 2 ml LB-medium, hvorefter glassene omrystes ved 30 °C i 10 2 timer. Den resulterende suspension bliver derefter udsået i skåle med LB-medium indeholdende 25 pg/ml Cm.

Skålene anbringes i et varmeskab ved 30 °C i 24 timer.

Man høster 100 kolonier, hvis sensibilitet over for am-15 picillin man derefter verificerer. På denne måde opnås stammen JM109 (Mucts) (MudAB9). Man opnår et lysat af phag III-AB9 ud fra denne stamme, således som det er beskrevet i det foregående.

20 Til stammen E. coli MC4100, som er dyrket natten over ved 37 °C på LB-medium, sætter man CaCl2 og MgSC>4 indtil en koncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Opløsningen af • phag III-AB9 blandes med 200 yl af denne kultur,-og blandingen får lov at henstå ved omgivelsestemperatur i 25 15 minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB-medium fort sætter man inkubationen ved 30 °C i 2 timer. Cellesuspensionen bliver udsået i en skål med LB-medium indeholdende 25 ug/ml Cm. Derefter anbringes skålen i et varmeskab ved 30 °C i 24 timer. Man udvælger en enkelt 30 Mu-følsom klon, nemlig EL1010.

Amplifikation af MudAB9 på chromosomalt DMA; bestemmelse af kopiantal 1

Amplifikationen foregår ved infektion af stammen EL1010 med et Mucts-lysat opnået som beskrevet i det foregåen-

I DK 175477 B1 I

I 42 I

I de. Bakterierne udplades i skåle med LB-medium indehold- I

I ende 500 ug/ml Cm. I

I De udvalgte transduktanter indeholder et stabilt antal I

I 5 kopier af MudAB9. I

I Efter inkubation ved 30 °C i 48 timer indhøstes de I

I resistente kolonier, og man bestemmer antallet af kopier I

I af den ufuldstændige phag MudAB9 ved DNA-DNA-hybri- I

I 10 diseringsmetoden (Southern) (eksempel 3). I

I Man studerer især stammerne EL1010 og EL1011. DNA'et ud- I

I vindes fra stammerne MC4100, EL1010 og EL1011. Efter I

I digestion med restriktionsenzymet Sall underkaster man I

I 15 DNA'et en elektroforese, hvorefter man absorberer DNA'et I

I på en nylonmembran. Derefter hybridiseres DNA'et med et I

I plasmid, som er mærket ved sulfonering, og som indehol- I

I der genet aspA. I

I 20 På tegningens fig. 18 svarer banerne A, B og C I

I til hhv. MC4100, EL1010 og EL1011. Bogstavet "a" svarer I

I til vildtypen af genet aspA. I

I I banen A ser man kun båndet "a", som svarer til genet I

25 aspA. I

I I banen B ser man to bånd, nemlig "a'', som svarer til I

I genet aspA, og "Γ1, som svarer til en indføring af I

I MudAB9. I

I 30 I

I I banen C kan man se (mindst) fem bånd, nemlig båndet I

I *'a" og båndene "1" til "4", som svarer til (mindst) 4 I

I indføringer af MudAB9. I 1 DK 175477 B1 43

Tabel X

Relation imellem antallet af MudAB9-kopier i stammerne og disses specifikke L-asparaginat-ammoniak-lyase-5 aktivitet

Stamme Antal kopier af MudAB9 Specifik aktivitet Δ DO/mn/mg prot.

10 MC 4100 0 0,33 EL1010 1 0,60 EL1011 4 (eller derover) 2,04

Eksempel 8: Fler indføringer under samme etape af 15 lysogeniseringen

Man frembringer et lysat af phager ud fra stammen JM109 (Mucts) (MudAM9) som beskrevet i eksempel 2.

20 Til en overnatskultur af stammen E. coli EL1016 (eksempel 6) sætter man CaCl2 og MgSC>4 indtil en slut-koncentration på hhv. 1 mM og 2,5 mM. Til 200 μΐ af denne kultur sætter man derefter. 50 μΐ af phag III-AM9-opløsningen (eksempel 2). Den resulterende suspension 25 hensættes ved oragivelsestemperatur i 15 minutter.

Efter tilsætning af 2 ml LB-medium foretager man en inkubation ved 30 °C i 2 timer. Bakteriesuspensionen udplades i skåle med LB-medium, der indeholder 250 μg/ml 30 af hver af forbindelserne Km og Nm. Der inkuberes i 24 timer ved 30 °C. To af de fremkomne kolonier testes med hensyn til deres lysering ved 45 °C og med hensyn til deres sensibilitet over for phagen Mu. Disse to kloner lyserer ikke, og de er Mu-følsomme. De benævnes hhv.

35 EL1014 og EL1015.

I DK 175477 B1 I

Η

I 44 I

I Man gennemfører en test af produktionen af L-threonin I

B som beskrevet i eksempel 2. Antallet af kopier af MudAM9 I

B måles ved Southern-metoden til DNA-DNA-hybridisering I

(eksempel 3). Det chromosomale DNA digereres med I

I 5 restriktionsenzymet Hindlll. Efter elektroforese absor- I

B beres DNA'et på en nylonmembran, hvorefter det hybri- I

B diseres med Sall-BamHI-fragmentet (mærket ved sulfone- I

I ring) af plasmid pAM9, som indeholder threonin- I

I operon'et. Resultaterne, som angår L-threonin-produk- I

B 10 tionen og antallet af MudAM9-kopier, er angivet i tabel I

XI og på fig. 19. I

B På fig. 19 svarer banerne A, B, og C til hhv. EL1016, I

B EL1014 og EL1015. Bogstavet "o" svarer til vildtypen af I

I 15 threonin-operon'et. Hvert af de øvrige bånd svarer til I

I en MudAM9-indføring. I

I I banen A observerer man kun båndet "o”, som svarer til I

B threonin-operon'et. I banen B observerer man tre yder- I

B 20 ligere bånd, som er nummereret 1-3, og som svarer til I

B mindst tre indføringer af MudAM9. I banen C er der to I

B yderligere bånd, som svarer til mindst to indføringer af I

B MudAM9. , I

I 25 Tabel XI I

I Antal kopier og produktion af L-threonin I

I Stamme Antal kopier Produktion af L-Thr (q/1) I

I 30

I EL1014 3 6,2 I

I EL1015 2 5,3

I Eksempel 9: Stabilitet af lokaliseringen og af antallet I

I 35 af ufuldstændige phager under fermenteringen I

DK 175477 B1 45

Stammen EL1003 (X+, Pro~) transduceres ved hjælp af en phag PI dyrket på en stamme Pro+. Man udvælger en stamme EL1003 (X + , Pro+). Phagen X, som er indeholdt i denne stamme, bliver derefter elimineret (C. Morel, personlig 5 kommunikation). Den således opnåede stamme, EL1003 (X-/

Pro+), benævnes EL1017.

Stammen EL1017, som (mindst) indeholder 10 kopier af MudAM9, er blevet testet før og efter fermenteringen med 10 henblik på at bestemme stabiliteten af MudAM9 i løbet af denne etape.

Stammen EL0117 bliver udsået i en fermenteringsbeholder indeholdende 1,5 8, fermenteringsmedium (mediets bestand-15 dele er angivet i eksempel 2). Fermenteringen foregår i 48 timer ved en passende temperatur. Efter fermenteringen isolerer man klonerne, hvorefter 4 kloner underkastes særlige studier: EL1017-a, EL1017-b, EL1017-C og EL1017-d.

20

Moderstammen EL1017 samt klonerne EL1017-a, EL1017-b, EL1017-C og EL1017-d analyseres ved Southern-teknikken til DNA-DNA-hybridisering.(eksempel.3), som gør det muligt at definere lokaliseringen og antallet af ufuld-25 stændige phager i de undersøgte kloner.

Det chromosomale DNA fra stammerne EL1016 (eksempel 6), EL1017, EL1017-a, EL1017-b, EL1017-C og EL1017-d udvindes og digereres med restriktionsenzymet Hindlll.

30

Efter en elektroforese absorberes de chromosomale DNA'er på en nylonmembran og hybridiseres med det markerede EcoRI-HindIII-fragment (markeret ved sulfonering) af plasmidet pAM9 (fig. 1)» som indeholder generne nptll, 35 thrA, thrB og thrC'. Resultatet af DNA-DNA-hybridise-ringen er vist på fig. 20.

46 I

DK 175477 B1 I

Banerne A, B, C, D, E og F svarer til hhv. EL1016, I

EL1017, E11071-a, E11017-b, EL1017-C og E11017-d. I

Bogstavet "a" svarer til vildtypen af threonin-

5 operon'et. I

De tilsvarende tal på båndene markerer specificiteten af H

hybridiseringen med MudAM9. Et band skarer til en indfø- I

ring af MUDAM9.

Bane A: kun båndet "a", som svarer til threonin- H

operon'et, er synligt. H

Banerne B, C, D, E og F: mindst 10 bånd er synlige, idet 15 båndet "a" og ni andre bånd nummereret ”1-9" svarer til

(mindst) 9 indføringer af MudAM9. I

Ifølge disse resultater kan hybridiseringsprofilerne for H

forældrestammen og for de kloner, der er opnået ved fer- H

20 raentering, sammenlignes. Dette viser stabiliteten af de

ufuldstændige phager, som indføres i chromosomerne af de H

bakterier, der anvendes ved fermenteringen.

De følgende stammer er deponeret hos la Collection

25 Nationale de Cultures de Microorganismes de 1'Institut I

Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux, Paris (15eme) den 25. I

januar 1988: I

- Escherichia coli K12 POII1681 under nummeret 1-727 I

30 - Escherichia coli K12 POII1734 - - 1-728

- Escherichia coli K12 EL1001 - - 1-729 I

- Escherichia coli K12 EL1002 - - 1-730

- Escherichia coli K12 EL1003 - - 1-731. I

Claims (29)

1. Fremgangsmåde til integration af et udvalgt gen eller en på forhånd bestemt DNA-sekvens i en DNA-sekvens, såsom en bakteries chromosom eller episom, kende- 5 tegnet ved, at man (a) kloner det valgte gen eller den valgte DNA-sekvens i det indre af en transposon på overfladen af transposo-nens essentielle dele, hvorefter man 10 (b) integrerer den "afvæbnede" transposon i DNA-sekven-sen, såsom bakteriens chromosom eller episom.

2. Fremgangsmåde til integration af et bestemt antal ko-15 pier af et udvalgt gen eller en bestemt DNA-sekvens i en DNA-sekvens, såsom en bakteries chromosom eller episom, kendetegnet ved, at man (a) kloner det valgte gen eller den valgte DNA-sekvens i 20 det indre af en transposon på overfladen af transposo- nens essentielle dele, ..idet transposonen-er ''afvæbnet-"; _ | (b) integrerer transposonen i DNA-sekvensen, såsom bakteriens chromosom eller episom, og 25 (c) komplementerer den "afvæbnede" transposon på en sådan måde, at man kan foretage flere transponeringer, hvorefter man afslutter komplementeringen efter et på forhånd bestemt antal transponeringer. 30

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at transposonen ikke er i stand til at transponere. 35

48 I DK 175477 B1 I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3,kendete g- H net ved, at transposonen er uden indhold af transposa- H se. I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4,kendetegnet . ved, at transposonen ikke indeholder gener, som koder 5 for dens transposaser. I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3,kendete g- H net ved, at udtrykkeisen af transposaserne undertryk- H kes i transposonen. H

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, k e η - I detegnet ved, at transposonen indføres i et plas- I mid, og at den introduceres i bakterien ved transfor- I mation med plasmidet. I

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, k e η - H detegnet ved, at transposonen er indeholdt i en H bakteriophag, og at den introduceres i bakterien ved I transduktion med denne bakteriophag.

9. Fremgangsmåde ifølge..ethvert af kravene 1-8, k e o - I detegnet ved, at man integrerer en anden "afvæbnet" transposon, hvori der er klonet et andet I udvalgt gen eller en anden bestemt DNA-sekvens, som man I 25 komplementerer for at opnå et bestemt antal transpone- I ringer. I

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9,kendetegnet H ved, at man komplementerer transposonen ved transforma- I 30 tion af bakterien med et plasmid, som udtrykker trans- I posaser, eller ved transduktion med bakteriophagen. I

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at man aktiverer transposonen efter inaktivering af I

35 I DK 175477 B1 den repressor, som fører til udtrykkelse af transpo-sasernes gener.

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-11, kendetegnet ved, at det valgte gen er under kontrol af en promotor, som også befinder sig i transposonens 5 indre, og som styrer udtrykkeisen af genet i bakterien.

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-12, kendetegnet ved, at transposonen er valgt blandt Tn3, Tn5, Tn7, TnlO, Tn903, TnHoHo, IS 1, IS 10, IS 50 10 og phagerne Mudl og Mudll.

14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-13, kendetegnet ved, at bakterien tilhører en af familierne Enterobacteriaceal, Rhiiobiaceal eller

15 Pseudomonas.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at bakterien er valgt blandt Escherichia coli, Citrobacter freundii, Erwinia herbicola, Erwinia 20 chrysanthemi, Salmonella thyphimurium, Shigella sonneii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Agrobacterium tumefaciens og Pseudomonas putida.

16. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-15, k e n- 25 detegnet ved, at transposonen også koder for et markør-gen.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at markør-genet er et gen, som bibringer resistens 30 over for et antibiotikum, som udtrykkes i bakterien. 1 35 Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 9-17, kendetegnet ved, at antallet af transponeringer evalueres ved bestemmelse af udtrykkeisen af markør-genet. I DK 175477 B1 I I 50 I

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet I I ved, at udtrykkeisen af markør-genet bestemmes ved I I resistensen over for et antibiotikum, når markør-genet I I er et gen, som bibringer resistens over for et anti- I I biotikum. I I 5 20. Fremgangsmåde ifølge krav 18,kendetegnet .1 I ved, at udtrykkeisen af markør-genet bestemmes på grund- I I lag af farvning af en substituent, når markør-genet, I såsom lac-operon'et, er et gen, hvis produkt kan vi- I I sualiseres ved hjælp af en farvende markør. I I 10 I

21. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-20, k e η- I detegnet ved, at det valgte gen og dets aktive I I promotor i værtsbakterien klones i det indre af en phag I I Mud, som er uden indhold af gener for transposaserne, i I 15 et område, der ikke er essentielt for transposonen, at I I transposonen integreres i det indre af et chromosom i en I I kompatibel værtsbakterie, at transposonen kompleraenteres I ved transformation af værtscellen med et plasmid, der I I koder for transposaserne, eller ved infektion med phagen I I 20 Mu, og at de naturlige stammer (uden plasmid) eller phag I I Mu) udvælges efter et bestemt antal transponeringer. .

22. Bakteriestamme, kendetegnet ved, at den er I I opnået ved en fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1- I I 25 21. I

23. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-21, k e η- I I detegnet ved, at de valgte gener er ét eller I I flere gener, som indgår i biosyntesevejen for L- I I 30 threonin. I

24. Bakterie ifølge krav 22, som producerer threonin i I I store mængder, kendetegnet ved, at den i sit I I chromosom indeholder flere kopier af en transposon, som I I 35 I DK 175477 B1 i sit indre indeholder de gener, der indgår i biosyntesen af L-threonin, eller dele af disse gener.

25. Bakterie ifølge krav 24, kendetegnet ved, at den er en E. coli-bakterie.

26. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-21, k e n- detegnet ved, at det udvalgte gen koder for et peptid eller et protein.

27. Fremgangsmåde til fremstilling af produkter af ud-10 valgte gener, kendetegnet ved, at man dyrker en bakterie ifølge ethvert af'kravene 22, 24 og 25 i et passende dyrkningsmedium, hvorefter man udvinder de dannede produkter.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 21 eller 26, kende tegnet ved, at man fremstiller et peptid eller et protein ved dyrkning i et passende medium og udvinding af det dannede produkt. 20 25 1 35