CN103468758B - 产生l-谷氨酸的微生物和产生l-谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生L-谷氨酸的微生物和产生L-谷氨酸的方法，具体涉及通过使用yggB基因修饰棒状杆菌型细菌因此产生L-谷氨酸的能力与未修饰的菌株相比得到增强，在培养基中培养该细菌以引起L-谷氨酸在培养基或细菌细胞中积累，并从所述培养基或细胞中收集L-谷氨酸。

Description

产生L-谷氨酸的微生物和产生L-谷氨酸的方法

本申请是申请日为2005年12月28日，申请号为200580045189.5（国际申请号为PCT/JP2005/024280），名称为“产生L-谷氨酸的微生物和产生L-谷氨酸的方法”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及产生L-谷氨酸的微生物和使用所述微生物产生L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸在食品工业中广泛使用，例如，在调味剂(seasoning)生产中作为原料。

相关技术简述

通常，通过使用具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌(coryneformbacterium)，例如属于短杆菌属(Brevibacterium)或棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌的发酵方法以工业规模生产L-谷氨酸。为此，已经使用从自然界分离的菌株或它们的人工突变体。

一般来说，棒状杆菌型细菌的野生型菌株在过量生物素存在时不产生L-谷氨酸。因此，通过棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸通常在生物素有限的条件下进行，或在培养基中加入表面活性剂或青霉素(Biosci.Biotech.Biochem.,1997,61(7),p1109-1112)。另一方面，将能够在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的突变型菌株用于L-谷氨酸生产。这些菌株包括表面活性剂-温度敏感菌株(WO99/02692)、青霉素敏感型菌株(JP-A-55-0124492)和溶菌酶敏感型菌株(WO00/14241)。然而，这些突变型菌株可常常显示脂肪酸或细胞壁合成减少，且在保持所述菌株充分生长的同时，使用这些菌株产生L-谷氨酸有一些困难。

同时，已使用遗传修饰的菌株在过量生物素存在下产生L-谷氨酸，在所述菌株中编码α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)的基因被破坏(WO95/34672)。然而，由于三羧酸循环(TCA cycle)被中途阻断，此α-KGDH基因缺陷型菌株生长缓慢，且难以获得产生L-谷氨酸所需的足够量的细胞。

棒状杆菌型细菌的yggB基因为大肠杆菌yggB基因的同源物(homolog)(FEMS Microbiol Lett.2003,218(2),p305-309,Mol Microbiol.2004,54(2),p420-438)，且已被报导是一种动力敏感通道(mechanosensitive channel)(EMBO J.1999,18(7):1730-7.)。然而，先前还未报导其对于产生L-谷氨酸的效果。

发明概要

本发明的一个目的是提供改进棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的新方法。

本发明的发明人进行广泛研究以达到这个目的，且发现可以通过增强野生型yggB基因的表达来改进棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。此外，在过量生物素存在下以及常规产生L-谷氨酸的条件下获得棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力得到改进的突变型yggB基因，并由此完成本发明。

本发明的一个目的是提供具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，其中通过使用yggB基因修饰所述棒状杆菌型细菌，以使所述菌株产生L-谷氨酸的能力与未修饰的菌株相比得到增强。

本发明的一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述yggB基因选自下组：

(a)DNA，其包含SEQ ID No:5的核苷酸1437至3035，

(b)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:5的核苷酸1437至3035的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力，

(c)DNA，其包含SEQ ID No:61的核苷酸507至2093，

(d)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:61的核苷酸507至2093的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力，

(e)DNA，其包含SEQ ID No:67的核苷酸403至2001，

(f)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:67的核苷酸403至2001的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力，

(g)DNA，其包含SEQ ID No:83的核苷酸501至2099，和

(h)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:83的核苷酸501至2099的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述yggB基因编码选自下组的蛋白质：

(A)包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:6、62、68、84和85，和

(B)包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:6、62、68、84和85，其中所述蛋白质中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或添加，且当将所述yggB基因引入所述棒状杆菌型细菌时，所述yggB基因增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被修饰，因而与未修饰的菌株相比，增强所述yggB基因的表达。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中通过增加所述yggB基因的拷贝数或修饰yggB基因的表达调控序列增强yggB基因的表达。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中通过引入突变型yggB基因来修饰所述棒状杆菌型细菌。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因在编码SEQ ID NO:6、68、84或85的氨基酸419-533或SEQ ID NO:62的氨基酸419-529的区域具有突变。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变为缺失所述区域。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变为将插入序列或转座子插入所述区域。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，所述突变导致所述区域中的脯氨酸被另一个氨基酸取代。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，所述突变导致SEQ ID NO:6、62、68、84或85的氨基酸序列中位置424的脯氨酸和/或位置437的脯氨酸被另一个氨基酸取代。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因在yggB蛋白质的跨膜编码区(transmembrane-coding region)具有突变。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述跨膜编码区选自下组：SEQ ID NO:6、62、68、84或85的氨基酸1-23、氨基酸25-47、氨基酸62-84、氨基酸86-108和氨基酸110-132。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中引入所述突变不引起移码。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，所述突变导致SEQ ID NO:6、62、68、84或85所示氨基酸序列中位置100的丙氨酸和/或位置111的丙氨酸被另一个氨基酸取代。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，所述突变导致在SEQ ID NO:6、62、68、84或85中位置14的亮氨酸和位置15的色氨酸之间插入至少一个氨基酸。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中通过引入所述突变型yggB基因增加所述菌株对L-谷氨酸类似物的抗性。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被进一步修饰以使抑制所述突变yggB基因功能的基因失活。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述抑制所述突变yggB基因功能的基因为symA基因，且其中所述symA基因选自下组：

(a)DNA，其包含SEQ ID No:86的核苷酸585至1121，

(b)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:86的核苷酸585至1121的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中所述DNA抑制棒状杆菌型细菌中所述突变型yggB基因的功能。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被进一步修饰因而减少α-酮戊二酸脱氢酶活性。

进一步的目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌是属于棒杆菌属或短杆菌属的细菌。

本发明的一个目的是提供用于产生L-谷氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养所述棒状杆菌型细菌以引起培养基或细胞中L-谷氨酸的积累，以及从培养基或细胞中收集L-谷氨酸。

本发明的一个目的是提供选自下组的突变型yggB基因：

(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的基因，

(b)编码与SEQ ID NO:8具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在含有过量生物素的条件下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(c)编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的基因，

(d)编码与SEQ ID NO:20具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在过量生物素存在下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(e)编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的基因，

(f)编码与SEQ ID NO:22具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在过量生物素存在下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(g)编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的基因，

(h)编码与SEQ ID NO:24具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在过量生物素存在下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(i)编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的基因，

(j)编码与SEQ ID NO:64具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在过量生物素存在下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(k)编码SEQ ID NO:70的氨基酸序列的基因，

(l)编码与SEQ ID NO:70具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在过量生物素存在下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(m)编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列的基因，

(n)编码与SEQ ID NO:74具有不少于80%同源性的蛋白质的基因,且在过量生物素存在下，将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能。

本发明的一个目的是提供用于产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，该方法包括将编码α-酮戊二酸脱氢酶的基因有缺陷的棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，以及选择能够在培养基中积累L-谷氨酸的菌株作为具有突变型yggB基因的菌株。

本发明的一个目的是提供用于产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，该方法包括将具有yggB基因的棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，在所述yggB基因中体外随机引入突变，以及选择能够在培养基中积累L-谷氨酸的菌株作为具有突变型yggB基因的菌株。

本发明的一个目的是提供用于产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，该方法包括将棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，所述棒状杆菌型细菌含有随机引入到染色体上的转座元件(transposableelement)，以及选择能够在培养基中积累L-谷氨酸的菌株作为具有突变型yggB基因的菌株。

本发明的一个目的是提供用于产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，该方法包括将棒状杆菌型细菌接种到含有L-谷氨酸类似物的培养基中，以及选择在所述培养基中生长的菌株。

本发明的一个目的是提供产生如上所述的棒状杆菌型细菌的方法，其中具有突变型yggB基因的菌株是如上所述的棒状杆菌型细菌。

本发明的一个目的是提供产生如上所述的棒状杆菌型细菌的方法，其中所述含有过量生物素的培养基是含有30μg/l或更多生物素的培养基。

本发明还涉及如下方面：

1.具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，其中所述的棒状杆菌型细菌通过使用yggB基因修饰，因此该菌株产生L-谷氨酸的能力与未修饰的菌株相比得到增强。

2.根据项1的棒状杆菌型细菌，其中所述的yggB基因选自下组：

(a)DNA，其包含SEQ ID No:5的核苷酸1437至3035，

(b)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:5的核苷酸1437至3035的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力，

(c)DNA，其包含SEQ ID No:61的核苷酸507至2093，

(d)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:61的核苷酸507至2093的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力，

(e)DNA，其包含SEQ ID No:67的核苷酸403至2001，

(f)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:67的核苷酸403至2001的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力，

(g)DNA，其包含SEQ ID No:83的核苷酸501至2099，和

(h)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:83的核苷酸501至2099的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中当将所述DNA引入所述棒状杆菌型细菌时，所述DNA增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。

3.根据项1的棒状杆菌型细菌，其中所述的yggB基因编码选自下组的蛋白质：

(a)包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:6、62、68、84和85，和

(b)包含选自下组的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:6、62、68、84和85，其中在所述蛋白质中取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸，并且当将其引入所述棒状杆菌型细菌时，所述yggB基因增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。

4.根据项1至3中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述的棒状杆菌型细菌被修饰因而与未修饰的菌株相比，所述yggB基因的表达增强。

5.根据项4的棒状杆菌型细菌，其中通过增加yggB基因的拷贝数或修饰yggB基因的表达调控序列增强所述yggB基因的表达。

6.根据项1的棒状杆菌型细菌，其中通过引入突变型yggB基因修饰所述棒状杆菌型细菌。

7.根据项6的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因在编码SEQ IDNO:6、68、84或85的氨基酸419-533，或SEQ ID NO:62的氨基酸419-529的区域中具有突变。

8.根据项7的棒状杆菌型细菌，其中所述突变是缺失所述区域。

9.根据项7的棒状杆菌型细菌，其中所述突变是将插入序列或转座子插入所述区域。

10.根据项7的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，其导致以另外的氨基酸置换在所述区域的脯氨酸。

11.根据项7的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，其导致以另外的氨基酸置换在SEQ ID NO:6、62、68、84或85中位置424的脯氨酸和/或位置437的脯氨酸。

12.根据项6的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因在yggB蛋白质的跨膜编码区具有突变。

13.根据项12的棒状杆菌型细菌，其中所述跨膜编码区选自下组：SEQID NO:6、62、68、84或85的氨基酸1-23、氨基酸25-47、氨基酸62-84、氨基酸86-108和氨基酸110-132。

14.根据项12的棒状杆菌型细菌，其中引入所述突变不引起移码。

15.根据项12的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，其导致用另外的氨基酸置换在SEQ ID NO:6、62、68、84或85中位置100的丙氨酸和/或位置111的丙氨酸。

16.根据项12的棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，其导致在SEQ ID NO:6、62、68、84或85中位置14的亮氨酸和位置15的色氨酸之间插入至少一个氨基酸。

17.根据项6至16中任一项的棒状杆菌型细菌，其中通过引入所述突变型yggB基因增加所述菌株对L-谷氨酸类似物的抗性。

18.根据项6至16中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被进一步修饰以使抑制所述突变yggB基因的功能的基因失活。

19.根据项18的棒状杆菌型细菌，其中抑制所述突变yggB基因功能的所述基因是symA基因，且其中所述symA基因选自下组：

(a)DNA，其包含SEQ ID No:86的核苷酸585至1121，和

(b)DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID NO:86的核苷酸585至1121的互补核苷酸序列，或由所述核苷酸制备的探针杂交，且其中所述DNA抑制棒状杆菌型细菌中所述突变型yggB基因的功能。

20.根据项1至19中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被进一步修饰因而减少α-酮戊二酸脱氢酶活性。

21.根据项1至20中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌属于棒杆菌属或短杆菌属。

22.产生L-谷氨酸的方法，其包括

在培养基中培养根据项1至21中任一项的棒状杆菌型细菌，以引起L-谷氨酸在培养基或细菌中的积累，以及

从培养基或细菌中收集L-谷氨酸。

23.突变型yggB基因，其选自下组：

(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的基因，

(b)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:8具有不少于80%同源性,且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(c)编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的基因，

(d)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:20具有不少于80%同源性，且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(e)编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的基因，

(f)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:22具有不少于80%同源性，且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(g)编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的基因，

(h)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:24具有不少于80%同源性，且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(i)编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的基因，

(j)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:64具有不少于80%同源性，且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(k)编码SEQ ID NO:70的氨基酸序列的基因，

(l)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:70具有不少于80%同源性，且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能，

(m)编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列的基因，

(n)编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO:74具有不少于80%同源性，且在过量生物素存在下，当将所述基因引入棒状杆菌型细菌时，该蛋白质具有增加棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能。

24.产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，其包括：

(a)将编码α-酮戊二酸脱氢酶的基因有缺陷的棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，和

(b)选择能够在培养基中引起L-谷氨酸积累的菌株。

25.产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，其包括：

(a)将具有yggB基因的棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，该yggB基因含有随机引入的体外突变，和

(b)选择能够在培养基中引起L-谷氨酸积累的菌株。

26.产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，其包括：

(a)将具有随机引入到染色体上的转座元件的棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，和

(b)选择能够在培养基中引起L-谷氨酸积累的菌株。

27.产生具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌的方法，其包括：

(a)将棒状杆菌型细菌接种到含有L-谷氨酸类似物的培养基中，和

(b)选择在含有L-谷氨酸类似物的培养基中生长的菌株。

28.产生棒状杆菌型细菌的方法，其包括：

(a)将编码α-酮戊二酸脱氢酶的基因有缺陷的棒状杆菌型细菌接种到含有过量生物素的培养基中，和

(b)选择能够在培养基中引起L-谷氨酸积累的菌株，其中所述菌株为项6至16中任一项的棒状杆菌型细菌。

29.根据项28的产生棒状杆菌型细菌的方法，其中所述培养基含有不少于30μg/l生物素。

附图说明

图1显示构建质粒pBS3的方法。

图2显示构建质粒pBS4S的方法。

图3显示构建质粒pBS4sucAint的方法。

图4为显示引入突变型yggB基因的菌株和对照菌株的L-谷氨酸积累的图。

图5显示yggB基因中的2A-1型突变。

图6为显示在CM-Dex平板培养基上引入突变型yggB基因的菌株对4-氟谷氨酸(4-fluoroglutamic acid)的抗性的照片。

图7显示对照菌株和引入突变型yggB基因的菌株在含有4-氟谷氨酸(4-FG)的液体培养基中的生长。

典型实施方案详述

在下文中，更加详细地说明本发明。

<1>本发明的棒状杆菌型细菌

本发明的棒状杆菌型细菌具有产生L-谷氨酸的能力，且使用yggB基因修饰，从而与未修饰的菌株相比，增强所述菌株产生L-谷氨酸的能力。

在本发明中，棒状杆菌型细菌的实例包括常规棒状杆菌型细菌，并还包括曾经被归类于短杆菌属，但目前归类于棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))，也包括与棒杆菌属细菌非常接近的短杆菌属细菌。这些棒状杆菌型细菌的实例包括如下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

所述棒状杆菌型细菌的具体实例如下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

烷醇棒杆菌ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020、TCC13032、ATCC13060

百合花棒杆菌ATCC15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

二歧短杆菌ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826,

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC14067,

黄色短杆菌AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

产氨短杆菌ATCC6871、ATCC6872

白色短杆菌ATCC15111

蜡状短杆菌ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box1549,Manassas,VA20108,United States of America)获得。即，给予每个菌株唯一的登记号，该登记号列于ATCC的目录中。可以使用这个登记号定购菌株。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，将AJ12340菌株于1989年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human Technology,Agency of Industrial Science andTechnology,Ministry of international Trade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent OrganismDepositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，地址：Tsukuba Central6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-5466,Japan)，并给予登录号FERM BP-1539。根据布达佩斯条约的规定，将AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并给予登录号FERM BP-2205。

本发明的棒状杆菌型细菌具有产生L-谷氨酸的能力。“产生L-谷氨酸的能力”的意思是当在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌时，引起培养基中积累足够量的L-谷氨酸的能力。产生L-谷氨酸的能力可以是亲本菌株的特性，本发明的棒状杆菌型细菌从该亲本菌株培育，因为大多数棒状杆菌型细菌的野生型菌株在下述的产生L-谷氨酸的条件下产生L-谷氨酸。然而，如下所述，可以通过突变、基因重组技术等赋予或增强产生L-谷氨酸的能力。此外，可以通过增强yggB基因的表达赋予产生L-谷氨酸的能力。

术语“增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力”的意思是本发明的棒状杆菌型细菌与未修饰的菌株相比，具有增强的产生L-谷氨酸的能力。未修饰的菌株的实例包括谷氨酸棒杆菌ATCC13032、13869、14067和栖糖蜜棒杆菌ATCC17965。未修饰的菌株还可包括以与野生型菌株相同的水平表达野生型yggB基因的菌株或其中未将突变引入yggB基因的编码区的菌株。

赋予产生L-谷氨酸的能力的方法的实例包括增强编码L-谷氨酸生物合成酶的基因的表达。参与L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶和葡糖磷酸异构酶。

可以用与下述增强yggB基因表达相同的方法实施这些基因表达的增强。

经过修饰而增强柠檬酸合酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、丙酮酸脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因表达的微生物的实例包括那些在WO00/18935和JP2000-232890A(EP1010755A)中公开的微生物。

用来赋予产生L-谷氨酸的能力的修饰包括减少或消除催化反应的酶的活性，所述反应用于合成除L-谷氨酸之外的化合物，并由L-谷氨酸生物合成途径分支。这类酶的实例包括异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、乙酰磷酸转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰甲酸转移酶、乳酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶。α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的菌株的实例包括以下菌株：

乳发酵短杆菌ΔS菌株(WO95/34672)

乳发酵短杆菌AJ12821菌株(FERM BP-4172;FR9401748)

黄色短杆菌AJ12822菌株(FERM BP-4173;FR9401748)

谷氨酸短杆菌(Brevibacterium glutamicum)AJ12823菌株(FERM BP-4174;FR9401748)

为了减少或消除如上所述的酶的活性，可将引起酶活性减少或丧失的突变或缺失引入染色体上所述酶的基因中。这可以通过，例如，破坏染色体上编码所述酶的基因，或通过修饰所述基因的表达控制序列如启动子和/或ShineDargarno(SD)序列来实现。另外，可以通过引入导致氨基酸取代的错义突变、产生终止密码子的无义突变、或在编码区添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或通过缺失一部分或全部基因来减少或消除这些酶的活性(Journal ofbiological Chemistry272:8611-8617(1997))。例如，可以通过构建编码突变酶的基因，其中该基因的编码区被缺失，并通过同源重组用所得基因取代染色体基因，或通过在这些基因中引入转座子或IS因子，来减少或缺失这些酶的活性。

例如，通过基因重组引入突变以减少或消除上述酶的活性可以如下进行。即，突变型基因是通过如下方法构建的：修饰目标基因的部分序列，因而不产生正常的酶，并使用所述突变型基因转化棒状杆菌型细菌以引起与染色体上目标基因的重组，并由此染色体上的目标基因可以被突变型基因取代。这种使用同源重组通过基因取代的基因破坏已经建立，并包括使用线性DNA的方法或使用含有温度敏感复制起点的质粒的方法(美国专利6,303,383或JP-A-05-007491)。用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(美国专利6303383)、pHSC4(法国专利公开号2667875,1992和JP5-7491A)等。在棒状杆菌型细菌中，这些质粒可以至少在25℃的温度自主复制，但不能在37℃的温度自主复制。根据布达佩斯条约的规定，将包含pHSC4的AJ12571菌株于1991年8月26日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心)，地址：Tsukuba Central6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken305-5466,Japan)，并给予登录号FERM BP-3524。

也可以通过使用在棒状杆菌型细菌中无法复制的质粒来实施使用上述同源重组通过基因取代的基因破坏。优选使用在棒状杆菌型细菌中无法复制并在埃希氏菌属(Escherichia)细菌中可以复制的质粒。这类质粒的实例包括pHSG299(Takara Bio)和pHSG399(Takara Bio)。

编码上述酶之一的染色体基因可以，例如，使用sacB通过同源重组用缺失型(deletion-type)基因取代(Schafer,A.et al.,Gene145(1994)69-73)。所述sacB基因编码果聚糖蔗糖酶(levan sucrase)并用于有效选择其中染色体目标基因被突变基因取代的菌株，且将载体部分从染色体消除(WO2005/113745,和WO2005/113744)。

起初，通过将缺失型(突变)基因、sacB基因和选择标记例如氯霉素抗性基因插入含有温度敏感复制起点的质粒中来制备重组质粒。然后将所述质粒引入棒状杆菌型细菌的宿主菌株。当果聚糖蔗糖酶在棒状杆菌型细菌中表达时，由蔗糖转化产生的果聚糖对于细菌是致死的，并因此所述细菌不能在含有蔗糖的培养基上生长。所以，通过在含有蔗糖的平板上的培养，可以选择菌株，其中在质粒中的突变基因和染色体基因之间发生取代，且质粒其它部分从细胞中消除。

sacB基因的实例包括以下：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subillus):sacB GenBank登录号X02730(SEQ IDNO:11)

淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliqufaciens):sacB GenBank登录号X52988

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)：sacB GenBank登录号L33402

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)：surB GenBank登录号U34874

Lactobacillus sanfranciscensis：frfA GenBank登录号AJ508391

Acetobacter xylinus：lsxA GenBank登录号AB034152

Gluconacetobacter diazotrophicus：lsdA GenBank登录号L41732

在温度敏感复制起点发挥功能的温度(例如25℃)培养转化菌株，以获得其中已引入质粒的菌株。然后，在温度敏感复制起点不能发挥功能的高温(例如34℃)培养所述转化体，以消除温度敏感质粒，并涂布到含有抗生素药物例如卡那霉素的平板培养基上。尽管其中消除所述质粒的菌株不能在含有这类抗生素药物的平板上生长，但其中染色体基因被突变基因取代的少数菌株可以生长并出现菌落。

在含有突变基因的重组DNA被整合到染色体DNA中的菌株内，所述重组DNA引起与原先存在于染色体上的基因的重组，且将染色体基因和突变基因的融合基因插入到染色体中，使得重组DNA的其它部分(载体区段、温度敏感复制起点和抗生素抗性标记)存在于融合基因之间。然后，为了在染色体DNA上只保留突变基因，将一个拷贝的基因与载体区段(包括所述温度敏感复制起点和抗生素抗性标记)一起从染色体DNA中消除。在这种情况下，天然基因被保留在染色体DNA上而突变体基因被从染色体DNA切除，或反之，突变体基因被保留在染色体DNA上而天然基因被从染色体DNA切除。在这两种情况下，当所述在温度敏感复制起点可以发挥功能的温度培养棒状杆菌型细菌时，被切除的DNA都被保留在棒状杆菌型细菌的细胞中。然后，通过在温度敏感复制起点不能发挥功能的温度培养棒状杆菌型细菌，将质粒上的基因同质粒一起被从细胞中消除。在使用sacB基因的情况下，通过在含有蔗糖的培养基中培养棒状杆菌型细菌可以有效地获得消除所述质粒的菌株。通过从消除质粒的菌株(plasmid-cured strain)中选择将突变引入目标基因的菌株可以获得目标基因被突变型或缺失型基因取代的菌株。

还可以通过筛选对于有机酸类似物、呼吸抑制因子或超氧化物产生物(superoxide generator)具有抗性的菌株，或通过筛选对细胞壁合成的抑制因子敏感的菌株来赋予产生L-谷氨酸的能力。这类方法的实例包括赋予对单氟乙酸的抗性(JP50-113209A)、赋予对腺嘌呤或胸腺嘧啶(thimine)的抗性(JP57-065198A)、赋予对丙二酸(malonic acid)的抗性(JP52-038088A)、减弱脲酶活性(JP52-038088A)、赋予对苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(naphtoquinone)的抗性(JP56-1889A)、赋予对HOQNO的抗性(JP56-140895A)、赋予对α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)的抗性(JP57-2689A)、赋予对胍(guanidine)的抗性(JP56-35981A)、赋予对道诺霉素(daunomicin)的抗性(JP58-158192A)，以及赋予对青霉素(penicillin)的敏感性(JP04-88994A)。

这类细菌的具体实例包括下列菌株:

黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632;JP50-113209A)

谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736;JP57-065198A)

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007;JP56-1889A)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020;JP56-1889A)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318;JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319;JP57-2689A)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472;JP56-140895A)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136;JP56-35981A)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004;JP04-88994A)

乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P5123JP56-048890A)

谷氨酸棒杆菌AJ11440（FERM P5137JP56-048890A）

乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P6402JP58-158192A)

可以通过使用yggB基因修饰上述具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，以进一步增强产生L-谷氨酸的能力，从而获得本发明所述棒状杆菌型细菌。或者，可以先进行使用yggB基因的修饰，然后是额外的修饰以赋予或增强产生L-谷氨酸的能力。

使用yggB基因的修饰包括，但不限于，增强棒状杆菌型细菌中yggB基因的表达和将突变引入棒状杆菌型细菌中的yggB基因。

<I>增强yggB基因的表达

yggB基因编码一类动力敏感通道(mechanosensitive channel)，其也被称作“mscS”(FEMS Microbiol Lett.2003Jan28;218(2):305-9)。

增强棒状杆菌型细菌中yggB基因的表达导致所述棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力与未修饰的菌株相比得到改进。即，当修饰棒状杆菌型细菌的菌株使得相对于未修饰的菌株，例如野生型菌株，yggB基因表达增加时，所述菌株与未修饰的菌株相比，引起更多L-谷氨酸的积累，或以更高的速率产生L-谷氨酸。优选增强yggB基因表达导致产生L-谷氨酸的量与未修饰的菌株相比，增加多于2%(每消耗糖的得率(yield per consumed sugar))，更优选多于4%，且还更优选多于6%。或者，除用于产生细菌细胞的碳之外，每碳(糖)的L-谷氨酸产量可以通过增强yggB基因的表达来增加。

尽管只要yggB基因的表达水平相对于yggB基因表达未增强的未修饰的菌株有所增加，yggB基因的表达水平可以是任何水平，但表达相对于未修饰的菌株优选增加不少于1.5倍，更优选不少于2倍，且还更优选不少于3倍。可以通过测量yggB基因的mRNA的量来测定yggB基因的表达水平。测定表达水平的方法包括Northern杂交和RT-PCR(Molecular cloning(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。可以用作对照的野生型棒状杆菌型细菌的实例包括谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869、ATCC13032、ATCC14067和栖糖蜜棒杆菌ATCC17965菌株。

所述使用yggB基因修饰的棒状杆菌型细菌的产生L-谷氨酸的能力可以在产生L-谷氨酸的条件和/或在过量生物素存在下与未修饰的菌株相比得到增强。本文中，“产生L-谷氨酸的条件”包括当在常规培养基中加入诱导L-谷氨酸产生的物质时，该常规培养基含有碳源、氮源、无机盐和如果需要的话，痕量有机营养物例如氨基酸和维生素，以及当这类常规培养基中抑制L-谷氨酸产生的物质的量被限制时。所述诱导L-谷氨酸产生的物质包括青霉素和包含饱和脂肪酸的表面活性剂，例如Tween40(商标)。抑制L-谷氨酸产生的物质包括生物素(Amino Acid Fermentation,Japan Scientific Societies Press1986)。培养基中青霉素的浓度优选不少于0.1U/ml，更优选不少于0.2U/ml，且还更优选不少于0.4U/ml。培养基中表面活性剂的浓度优选不少于0.5g/L，更优选不少于1g/L，且还优选不少于2g/L。在产生L-谷氨酸的条件下加入培养基中的生物素浓度优选少于15μg/L，更优选少于10μg/L，且还更优选少于5μg/L。产生L-谷氨酸的条件可以完全不包含生物素。

另一方面，含有过量生物素的条件可为含有不少于30μg/L，更优选不少于40μg/L，且还更优选不少于50μg/L生物素的条件。

棒状杆菌型细菌yggB基因的实例包括编码SEQ ID No:6的氨基酸序列的DNA、编码SEQ ID No:62的氨基酸序列的DNA、编码SEQ ID No:68的氨基酸序列的DNA和编码SEQ ID No:84的氨基酸序列的DNA。棒状杆菌型细菌yggB基因的具体实例包括SEQ ID No:5的核苷酸1437-3035、SEQ IDNo:61的核苷酸507-2093、SEQ ID No:67的核苷酸403-2001和SEQ ID No:83的核苷酸501-2099。SEQ ID No:83的核苷酸501-2099的核苷酸序列是谷氨酸棒杆ATCC13032的yggB基因，且对应于GenBank登录号NC_003450的基因组序列中的核苷酸编号1336092-1337693，并注册为NCgl1221(NP_600492.Reports small-conductance mechanosensitive channel...[gi:19552490])。SEQ ID No:5的核苷酸1437-3035的核苷酸序列是谷氨酸棒杆菌ATCC13869的yggB基因。SEQ ID No:61的核苷酸507-2093的核苷酸序列是谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)ATCC14067的yggB基因。SEQ ID No:67的核苷酸403-2001的核苷酸序列是栖糖蜜棒杆菌ATCC17965的yggB基因。此外，由于yggB基因的核苷酸序列可因种类和菌株而异，本发明所用的yggB基因可以是SEQ ID No:5的核苷酸1437-3035的核苷酸序列的变体。可以使用SEQ ID No:5的核苷酸1437-3035的核苷酸序列，例如，通过BLAST(//blast.genome.jp/)来搜索yggB基因的变体。yggB基因的变体包括使用SEQ ID NOS:75和76的引物通过PCR获得的基因。yggB基因可以是从其它微生物中衍生的基因，只要它能增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。yggB基因可以是如下所述的突变型yggB。本发明使用的yggB基因不限于编码具有SEQ ID NO:6、62、68或84所示氨基酸序列的蛋白质的基因，且还可以包括编码具有SEQ ID NO:6、62、68或84的氨基酸序列的蛋白质的基因，其中在一个或多个位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸，同时当所述基因被引入棒状杆菌型细菌时，保留使棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力增强的能力。尽管本文所指“几个”氨基酸残基的数目可以因三维结构中的位置和蛋白质氨基酸残基的种类而不同，可优选为2至20，更优选2至10，特别优选2至5。yggB基因优选编码与SEQ ID NO:6,62,68,84或85所示氨基酸序列具有不少于80%同源性，更优选不少于90%同源性，甚至更优选不少于95%同源性，且特别优选不少于97%同源性的蛋白，同时保留使棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力增强的能力。可以通过算法，包括Karlin and Altschul开发的BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))和Pearson开发的FASTA(Methods Enzymol.,183,63(1990))来测定氨基酸序列以及核苷酸序列之间的同源性。已基于算法开发了同源性搜索程序包括BLASTN和BLASTP(可在//www.ncbi.nlm.nih.gov获得)。

上述取代优选保守取代。在芳族氨基酸的情况下，保守取代包括phe、trp和tyr的相互取代。在疏水性氨基酸的情况下，保守取代包括leu、ile和val的相互取代。在极性氨基酸的情况下，保守取代包括gln和asn的相互取代。在碱性氨基酸的情况下，保守取代包括arg、lys和his的相互取代。在酸性氨基酸的情况下，保守取代是asp和glu的相互取代。在含羟基氨基酸的情况下，保守取代是ser和thr的相互取代。所述保守取代还包括：以Ser或Thr取代Ala，以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，以Asn、Glu或Gln取代Asp，以Ser或Ala取代Cys，以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，以Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，以Pro取代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val、Phe取代Leu，以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala取代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr和以Met、Ile或Leu取代Val。

特别地，在SEQ ID NO:6的氨基酸序列中，下列氨基酸可能被取代或缺失。棒状杆菌型细菌中保守的YggB蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:85，即共有序列。SEQ ID NO:85所示的Xaa残基可被取代或缺失。

位点48的Glu(优选被Arg取代)

位点275的Asp(优选被Ser取代)

位点298的Glu(优选被Ala取代)

位点343的Ala(优选被Val取代)

位点396的Phe(优选被Ile取代)

位点438的Ser(优选被Gly取代)

位点445的Val(优选被Ala取代)

位点454的Ala(优选被Val取代)

位点457的Pro(优选被Ser取代)

位点474的Ser(优选被Asp取代)

位点517的Val(优选缺失)

位点518的Glu(优选缺失)

位点519的Ala(优选缺失)

位点520的Pro(优选缺失)

上述yggB基因同源物可以通过修饰下列的核苷酸序列而获得：SEQ IDNo:5的核苷酸1437-3035、SEQ ID No:61的核苷酸507-2093、SEQ ID No:67的核苷酸403-2001或SEQ ID No:83的核苷酸501-2099，该修饰通过例如位点特异性突变，以在所编码蛋白的特异位点取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基。此外，这样的基因也可以通过常规已知的突变处理获得。突变处理的实例包括用羟胺体外处理具有下列的核苷酸序列的基因：SEQ IDNo:5的核苷酸1437-3035、SEQ ID No:61的核苷酸507-2093、SEQ ID No:67的核苷酸403-2001或SEQ ID No:83的核苷酸501-2099，以及用紫外线照射或在突变处理中通常采用的诱变剂，如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)(NTG)或EMS(乙基甲磺酸)处理微生物，例如含有所述基因的埃希氏菌属细菌。上述氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加、倒位(inversion)等突变也包括天然存在的突变，其起因于含有yggB基因(突变体或变体)的微生物的个体差异和种类差异。这些基因是否能够增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力可以通过以下方法确认，例如在野生型棒状杆菌型细菌中表达所述基因，并测定获得的棒状杆菌杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力相对于未修饰的菌株例如野生型菌株是否增强。

所述yggB基因也可以是DNA，其在严紧条件下能够与具有核苷酸序列的DNA，或可由任何所述核苷酸序列制备的探针杂交，所述核苷酸序列与以下核苷酸互补：SEQ ID No:5的核苷酸1437-3035、SEQ ID No:61的核苷酸507至2093、SEQ ID No:67的核苷酸403至2001、或SEQ ID No:83的核苷酸501至2099，且当yggB基因引入棒状杆菌型细菌时，其能够增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。

如本文使用的“严紧条件”是形成所谓的特异性杂合体(hybrid)，且不形成非特异性杂合体的条件。严紧条件的实例包括那些条件，在该条件下高度同源的DNA互相杂交，例如，不少于70%同源性，优选不少于80%同源性，更优选不少于90%同源性，特别优选不少于95%的同源性的DNA相互杂交，并且低于70%同源性的DNA不互相杂交，以及那些条件，在该条件下DNA在Southern杂交的通常洗涤的盐浓度相互杂交，即用1x SSC,0.1%SDS在60℃，优选0.1x SSC,0.1%SDS在60℃更优选0.1x SSC,0.1%SDS在68℃洗涤一次或优选2-3次。

也可以将yggB基因的互补部分序列用作探针。这样的探针可以以本领域技术人员熟知的方式，使用基于yggB基因的核苷酸序列设计的寡核苷酸通过PCR制备。当使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针时，杂交之后的洗涤条件可以举例为2x SSC,0.1%SDS，在50℃。可以使用SEQ ID No:75和76所示的寡核苷酸制备所述探针。

此外，所述yggB基因可以是如下的<II>至<IV>所描述的突变型yggB基因。

可以通过下列方法增强上述yggB基因的表达：通过采用以质粒转化或同源重组、接合(conjugation)、转换(transition)等增加yggB基因的拷贝数、修饰yggB基因的表达调控序列、扩增编码调控因子的基因，所述调控因子增加yggB基因的表达、或破坏或削弱编码调控因子的基因，所述调控因子减少yggB基因的表达。

例如，可以通过如下方法来制备重组DNA：将含有yggB基因的基因片段连接到可以在棒状杆菌型细菌中复制的载体，优选多拷贝载体，并将所得的载体引入产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌中。

也可以通过将多拷贝的yggB基因整合到微生物的染色体DNA中来增加yggB基因的拷贝数。为了将多拷贝的yggB基因整合到微生物的染色体DNA中，可以通过靶向以多拷贝存在于染色体DNA中的序列来进行同源重组。可以使用转座子末端的重复DNA和反向重复序列。或者，如JP2-109985A中公开的，也可能将yggB基因并入转座子，并且将其转移从而将所述基因的多拷贝整合到染色体DNA中。可以使用具有yggB基因部分序列的探针通过Southern杂交来确认yggB基因整合到染色体中。

以下，显示构建棒状杆菌型细菌的方法的实例，该棒状杆菌型细菌已被修饰因而提高了yggB基因的表达。此方法可以通过常规方法进行，例如那些在Molecular cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001中描述的方法。

首先，将yggB基因从棒状杆菌型细菌的染色体DNA克隆。可以从棒状杆菌型微生物通过例如Saito and Miura(参考H.Saito and K.Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963),Text for Bioengineering Experiments,Edited bythe Society for Bioscience and Bioengineering,Japan,pp.97-98,Baifukan,1992)的方法来制备所述染色体DNA。对于PCR，可以使用如SEQ ID NO:75和76所示的那些寡核苷酸作为引物。

然后，通过将扩增的yggB基因连接到可以在棒状杆菌型细菌中起作用的载体DNA来制备重组DNA。在大肠杆菌和棒状杆菌型细菌中能自主复制的载体优选用于质粒构建。在棒状杆菌型细菌中能自主复制的载体的实例包括pAM330(JP58-67699A)、pHM1519(JP58-77895A)、pVK7(US2003-0175912)、和pSFK6(JP2000-262288A)、pCRY30(JP3-210184A)、pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、pCRY3KX(JP2-72876A和美国专利5,185,262)、pCRY2和pCRY3(JP1-191686)和pAJ655、pAJ611、pAJ1844(JP58-192900A)、pCG1(JP57-134500A)、pCG2(JP58-35197)、pCG4、pCG11(S57-183799)。在大肠杆菌中能自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可从Takara Bio获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可从Nippon Gene获得)、pTrc99A(Amann et al.,Gene69:301-315(1988)等等。

为了通过将yggB基因连接到任何上述载体来制备重组DNA，将所述载体和含有yggB基因的片段用限制酶消化并且通常通过使用连接酶例如T4DNA连接酶来相互连接。

将如上制备的重组质粒通过常规转化方法引入宿主棒状杆菌型细菌中。转化方法的实例包括用氯化钙处理受体细胞以增加DNA的通透性，其已被报导用于大肠杆菌K-12(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))，从处于生长期的细胞制备感受态细胞，然后用DNA转化，其已被报导于枯草芽孢杆菌(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153(1977))等等。除这些方法之外，可以使用将重组DNA引入到原生质体-样或原生质球-样(protoplast-or spheroplast-like)受体细胞中，其已被报导可应用于枯草芽孢杆菌、放线菌类(actinomytetes)和酵母(Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.Genet.,168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,.A.Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Sci.USA,75,1929(1978))。另外，也可以通过电脉冲方法进行微生物的转化(JP2-207791A)。

也可以通过将多拷贝的所述基因整合到棒状杆菌型细菌的染色体DNA中来增加yggB基因的拷贝数。为了将多拷贝的yggB基因整合到棒状杆菌型细菌的染色体DNA中，可以通过靶向以多拷贝存在于染色体DNA上的序列来进行同源重组。可以使用转座子末端的重复DNA和反向重复序列作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。或者，如EP0332488B和Vertes,A.A.,Asai,Y.,Inui,M.,Kobayashi,M.,Kurusu,Y.and Yukawa,H.:Mol.Gen.Genet.,245,397-405(1994)中所公开的，也可能将yggB基因并入转座子中，并将其转移从而将多拷贝的yggB基因整合到染色体DNA中。

此外，也可以通过使用Mu噬菌体(EP0332488B)或接合方法(Biotechnology(N Y).1991Jan;9(1):84-7)将yggB基因并入宿主染色体中。此外，还可通过使用下述的人工转座子来增加yggB基因的拷贝数。

此外，可以通过将yggB基因插入到具有在宿主棒状杆菌型细菌中不能复制的复制起点的质粒中，或插入到具有在宿主棒状杆菌型细菌中不能复制的复制起点并且具有通过接合(conjugation)转移的能力的质粒中，将yggB基因在染色体上扩增。这样的质粒的实例包括pSUP301(Simo et al.,Bio/Technology1,784-791(1983))、pK18mob和pK19mob(Schaefer et al.,Gene145,69-73(1994))、pGEM-T(Promega corporation,Madison,WI,USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)Journal of Biological Chemisty269:32678-84;US-A5487993)、pCR(R)Blunt(Invitrogen,Groningen,Netherlands;Bernard et al.,Journal of Molecular Biology,234:534-541(1993))、pEM1(Schrumpf et al.,1991,Journal of Bacteriology173:4510-4516)和pBGS8(Spratt et al.,1986,Gene,41:337-342)。通过接合或转化将含有yggB基因的质粒转移到棒状杆菌型细菌中。例如，可以通过Schaefer等(Applied and Environmental Microbiology60,756-759(1994))描述的方法进行通过接合的基因转移。例如，可以通过Theirbach等(Applied Microbiology and Biotechnology29,356-362(1988)),Dunican和Shivinan(Bio/Technology7,1067-1070(1989))和Tauch等(FEMSMicrobiological Letters123,343-347(1994))描述的方法进行通过转化的基因转移。

也可以通过如下方法实现增强yggB基因的表达：用更强的表达调控序列取代染色体DNA上或质粒上的表达调控序列，包括yggB基因的启动子；修饰涉及调控yggB基因表达的元件，例如操纵子和/或抑制子；或将强终止子融合到yggB基因的终止密码子的下游(Hamilton等;Journal ofBacterology171:4617-4622)。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、PL启动子、PS2启动子(Appl Environ Microbiol.2003Jan;69(1):358-66;MolMicrobiol.1993Jul;9(1):97-109;WO93/03158)等为强启动子。在Goldstein等(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annul.Rev.,1995,1,105-128)中公开了评估启动子强度的方法和强启动子的实例。而且，也可以将几个核苷酸取代引入到yggB基因的启动子区中，以使启动子更强(WO00/18935)。例如，可以用“TTGACA”或“TTGCCA”取代“-35区”，或可以用“TATAAT”或“TATAAC”取代“-10区”。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子之间的间隔序列，尤其是正好在起始密码子上游的几个核苷酸，对翻译效率具有巨大的影响。因此，可以修饰这个序列。yggB基因的“表达调控序列”的意思是影响yggB基因表达量的区域，且它们的实例包括yggB基因的上游区。适合于修饰以增强yggB基因表达的上游区包括yggB基因的翻译起始密码子上游的区域(例如，SEQ ID NO:5的核苷酸1436上游的区域)，并且其优选实例包括翻译起始密码子的上游至少500bp的区域，并且其更优选的实例包括翻译起始密码子的上游至少300bp的区域。

也可以通过例如使用如上所述的温度敏感质粒实现表达调控序列的取代。

可以将修饰表达调控序列与增加yggB基因的拷贝数组合。

<II>引入突变型yggB基因

使用yggB基因的修饰可以将突变型yggB基因引入到棒状杆菌型细菌中。引入突变型yggB基因包括将突变引入到染色体yggB基因中、引入包含突变型yggB基因的质粒和用突变型yggB基因取代染色体yggB基因。

在本发明中，“突变型yggB基因”的意思是在yggB基因编码区包含突变的yggB基因，这使得当其被引入到棒状杆菌型细菌中时，在过量生物素存在下所述yggB基因增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力。突变型yggB基因可以是当其被引入到棒状杆菌型细菌中时，在产生L-谷氨酸的条件下，以及在过量生物素存在下，增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸能力的基因。

术语“在过量生物素存在下增强了棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力”的意思是，当在含有生物素的培养基中培养本发明所述的棒状杆菌型细菌时，其中生物素的浓度为棒状杆菌型细菌的未修饰的菌株基本上不能产生L-谷氨酸的浓度，例如，在含有不少于30μg/L生物素的培养基中，所述菌株与未修饰的菌株相比引起培养基中更多L-谷氨酸的积累，或所述菌株与未修饰的菌株相比以更高速率(rate)产生L-谷氨酸。

以下，描述本发明获得突变型yggB基因的方法和引入突变型yggB基因的方法的实施例。然而本发明获得突变型yggB基因的方法和引入突变型yggB基因的方法不限于这些实施例。

(II-1)利用odhA基因缺陷(odhA gene-deficient)菌株的方法

本发明的发明人已发现，可以通过使用odhA(sucA)基因破坏的菌株有效地获得突变型yggB基因，其中编码α-酮戊二酸脱氢酶的E1o亚基的基因被破坏。

在本发明中，α-酮戊二酸脱氢酶(α-KDGH)活性的意思是催化α-酮戊二酸(2-酮戊二酸(2-oxoglutaric acid))的氧化脱羧以产生琥珀酰CoA的活性。所述反应被三类酶催化，即，α-酮戊二酸脱氢酶(E1o EC1.2.4.2)、二氢硫辛酰胺-S-琥珀酰转移酶(dihydrolipoamide-S-succinyltransferase)(E2o)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。α-酮戊二酸脱氢酶也被称为酮戊二酸脱氢酶(琥珀酰转移酶)或2-酮戊二酸脱氢酶。所述α-KGDH活性可以通过Shiio等(Isamu Shiio and KyokoUjigawa-Takeda,Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980)的方法测定。

已鉴定编码棒状杆菌型细菌的α-酮戊二酸脱氢酶(odhA)E1o亚基的基因的核苷酸序列(Microbiology142,3347-3354,(1996),GenBank登录号D84102)。SEQ ID NO:43的核苷酸443-4213显示了odhA基因的核苷酸序列，并且SEQID NO:44显示了odhA基因的氨基酸序列。

例如，通过使用上述sacB基因的方法可以获得odhA基因破坏的菌株。首先，使用基于odhA基因的核苷酸序列设计的引物，例如SEQ ID NOS:1和2所示的那些，并将棒状杆菌型细菌如ATCCC13869菌株的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增odhA基因的内部序列(internal sequence)。将odhA基因的内部片段插入到质粒中以构建用于odhA基因破坏的质粒。所述用于基因破坏的质粒包括用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒(JP-A-05-00791)，以及pBS3，其为包含如实施例1中所述的sacB基因的自杀载体。

通过电脉冲方法将所得质粒引入菌株中，该菌株不能在过量生物素存在下引起L-谷氨酸积累，例如，野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869、ATCC13032菌株(JP-A-2-207791)。获得单交换重组体，其中发生了质粒上的突变型odhA基因和染色体odhA基因之间的同源重组。当使用温度敏感质粒时，在质粒不能复制的温度获得单交换重组体。例如，可以通过使用SEQ ID NOS:3和4的寡核苷酸来确定菌株是否为单交换重组体。

在含有糖的培养基中分离由此获得的odhA基因破坏的菌株。在分离的过程中，将自发突变以高频率引入染色体yggB基因中。然后，通过在含有过量生物素的培养基中培养菌株来评估所分离的菌株产生L-谷氨酸的能力。例如，将候选菌株接种到20ml培养基(30g/l葡萄糖、15g/l硫酸铵、1g/lKH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、300μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(总氮)，用KOH调节至pH8.0:于115℃高压灭菌10分钟)中，然后加入1g热灭菌的碳酸钙，并且摇动培养所述菌株。在糖被完全消耗之后，测定积累的L-谷氨酸的量。选择产生L-谷氨酸的菌株，例如，那些产生不少于50%(每糖得率(yield persugar))L-谷氨酸的菌株，并且测定所选菌株的yggB基因的核苷酸序列以获得将突变引入yggB基因的菌株。

为了构建只携带突变型yggB基因的菌株，优选用野生型odhA基因取代染色体上被质粒破坏的odhA基因。odhA基因缺陷的菌株在无糖培养基中生长相当缓慢。然而，当odhA基因回复为野生型基因时，所述菌株可在无糖培养基，例如CM2B培养基(10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl、10μg/l生物素、20g/l琼脂，用KOH调节至pH7.0)中良好生长。因此，将所述odhA基因破坏的菌株涂布到CM2B平板上以选择生长改善的菌株。将由此出现的生长改善的菌株在CM2B平板上纯化，并且根据剩余载体的缺失，可以通过测试菌株对抗生素的敏感性来评估菌株是否具有野生型odhA基因。此外，可测定所述odhA基因的核苷酸序列。

或者，可从odhA-yggB双突变菌株克隆突变型yggB基因，并且引入到野生型菌株中。例如，可以通过使用双突变菌株的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS:9和10中所示的引物进行PCR来扩增突变型yggB基因。将扩增的产物插入到用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒，如pHSC4(JP-A-05-007491)或实施例1中所述的自杀载体pBS3中，以用突变型yggB基因取代染色体上的野生型yggB基因。可以通过测定染色体上yggB基因的核苷酸序列来确定突变是否已引入染色体上的yggB基因中。

(II-2)使用转座元件的方法

还可通过使用棒状杆菌型细菌中的转座元件来筛选具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌。转座元件可包括插入序列(IS)和人工转座子。突变yggB基因可以是具有偶然插入到编码区的IS和/或转座子的基因，或通过使用人工转座子人工获得的基因。例如，可基于对l-谷氨酸类似物的敏感性的减少来选择其中插入转座元件的菌株。作为L-谷氨酸类似物，可以使用4-氟谷氨酸(4-fluoroglutamic acid)。此外，可通过用含有抗生素抗性基因的人工转座子随机选择抗生素抗性菌株，并通过PCR确定所述抗生素抗性菌株的yggB基因的长度来选择其中插入转座元件的菌株。

还可以使用JP-A-09-070291中所述方法，以将IS引入棒状杆菌型细菌中。可使用人工转座子，其包括夹在IS两侧的反向重复序列(IR)之间的标记基因和转座酶的结构基因。在此情况下，转座酶的结构基因可以与标记基因和IS一起存在于相同质粒中，或可以在不同的质粒上。或者，可以使用转座子的功能，该转座子存在于宿主棒状杆菌型细菌的染色体上。编码源自棒状杆菌型细菌的转座酶的基因的实例按照GenBank登录号显示。

使用合适的载体，例如在棒状杆菌型细菌中可复制的质粒可以将IS或人工转座子引入棒状杆菌型细菌中。所述质粒的具体实例包括pHM1519 (Agric.Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984))、pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))和通过对这些进行修饰以携带药物抗性基因而获得的质粒。此外，为了有效地扩增染色体上的IS或人工转座子，优选使用如上面(1)所述的具有温度敏感复制起点的质粒(参见JP-A-5-7491)。用于此筛选的亲本菌株优选是在过量生物素存在下不能引起L-谷氨酸积累的菌株，例如，ATCC13869菌株，其为谷氨酸棒杆菌的野生型菌株。

作为将携带IS或人工转座子的质粒引入棒状杆菌型细菌的方法，可以使用常规使用的方法，例如原生质体法(Gene,39,281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))等。

将温度敏感质粒上携带的IS或人工转座子引入棒状杆菌型细菌中，可以通过如下进行：用质粒转化棒状杆菌型细菌；在25℃培养转化体，在该温度所述质粒可以复制，以将IS或人工转座子扩增至每个细胞几十至几百个拷贝，以使IS或人工转座子能够引入染色体中；然后在34℃培养细胞以去除额外的质粒。或者，可以使用仅有IS或人工转座子的DNA片段或不能在棒状杆菌型细菌中复制的质粒载体(例如，在大肠杆菌中可复制的质粒载体)，以将IS或人工转座子引入棒状杆菌型细菌的染色体中(JP-A-7-107976,Vertes,A.A.,Asai,Y.,Inui,M.,Kobayashi,M.,Kurusu,Y.and Yukawa,H.:Mol.Gen.Genet.,245,397-405(1994))。

将在染色体上具有IS或人工转座子的菌株在含有过量生物素的培养基中培养，以选择引起L-谷氨酸积累的菌株。通过测定此菌株染色体上的yggB基因的核苷酸序列，可以获得具有突变型yggB基因的棒状杆菌型细菌。

(II-3)体外将突变随机引入至yggB基因中的方法

此外，可以通过如下方法获得突变型yggB基因：体外将突变随机引入至yggB基因中，将突变的基因引入棒状杆菌型细菌中，并且筛选在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的菌株，作为存在突变型yggB基因的结果。对于筛选有用的亲本菌株优选是在过量生物素存在下不能引起L-谷氨酸积累的菌株，例如，谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株、ATCC13032菌株、ATCC14067菌株和栖糖蜜棒杆菌ATCC17965菌株。

为了筛选突变型yggB基因，优选使用yggB缺陷的菌株。可以通过与使用sacB基因的上述方法相类似的方法来构建yggB基因破坏的菌株。例如，使用SEQ ID NOS:39和40所示的引物和谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备yggB基因的N-末端片段。类似地，使用SEQ ID NOS:41和42的合成DNAs作为引物进行PCR以制备C-末端片段。SEQ ID NOS:40和41是彼此互补的。随后，使用等摩尔量N-末端片段和C-末端片段的混合物作为模板，和SEQ ID NOS:39和42的合成DNAs作为引物进行PCR以制备片段，其中yggB基因的内部序列被缺失。

将所得PCR片段插入到用于基因破坏的质粒，例如，携带果聚糖蔗糖酶基因的pBS4S。将所得质粒引入到棒状杆菌型细菌，例如谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的染色体中，以构建yggB基因破坏的菌株。

然后，例如，可以如下进行yggB基因的体外诱变。首先，将yggB基因克隆到可以在棒状杆菌型细菌中复制的质粒中。将约10μg所得的携带yggB基因的质粒溶解于含有诱变剂(mutagen)的缓冲液中，例如，含有400mM羟胺和1mM EDTA(pH6.0)的500mM磷酸盐缓冲液，并在75℃加热60至90分钟以将突变引入到yggB基因中。诱变之后，将质粒用SUPREC-02(TakaraBio INC.)等脱盐，然后将其引入ATCC13869ΔyggB菌株中，并在含有抗生素的培养基中筛选转化体。作为对照，将没有诱变的携带yggB基因的质粒引入到ATCC13869ΔyggB菌株中，将出现的转化体接种到含有过量生物素的培养基上并且摇动培养，然后测定积累的L-谷氨酸的浓度。在培养引入了携带野生型yggB基因的质粒的菌株的培养基中，L-谷氨酸基本不积累；然而在培养引入了携带突变型yggB基因的质粒的菌株的培养基中，积累了显著量的L-谷氨酸。可以通过从所述菌株提取质粒，并测定yggB基因的核苷酸序列来确定菌株是否携带突变型yggB基因。

或者，可以通过如易错PCR、DNA改组(DNA shuffling)和StEP-PCR(FirthAE,Patrick WM;Bioinformatics.2005Jun2;Statistics of protein libraryconstruction)的方法将突变人工引入到yggB基因中，从而获得突变型yggB基因。

除上述的方法外，将突变引入到染色体上yggB基因中的方法包括以下方法：用X光或紫外光照射或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理棒状杆菌型细菌，并选择在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的菌株。可通过测定染色体上yggB基因的核苷酸序列来确定是否已将突变型yggB基因引入。

(II-4)筛选L-谷氨酸类似物抗性菌株的方法

可以通过如下获得突变型yggB基因：在含有L-谷氨酸类似物的培养基中培养具有野生型yggB基因的棒状杆菌型细菌，并选择在所述培养基中可以生长的L-谷氨酸类似物抗性菌株。在此方法中使用的亲本菌株优选上述棒状杆菌型细菌的野生型菌株，并且可以是具有野生型yggB基因的任何菌株，包括具有包含野生型yggB基因的质粒的菌株。

如本文所用的“L-谷氨酸类似物”包括γ-甲基L-谷氨酸(γ-methylL-glutamate)、α-甲基谷氨酸、β-羟基谷氨酸、甲硫氨酸磺基肟(methioninesulfoximine)、谷氨酸-γ-单氧肟酸(glutamicacid-γ-monohydroxamate)、2-氨基-4-膦酰丁酸、γ-单乙基L-谷氨酸、二甲基L-谷氨酸、二-叔-丁基L-谷氨酸(di-t-butyl L-glutamic acid)、单氟谷氨酸、二乙基L-谷氨酸、D-谷氨酸和4-氟谷氨酸，并且在它们之中，优选使用4-氟谷氨酸。例如，L-谷氨酸类似物抗性菌株可以如下获得。即，将棒状杆菌型细菌接种到含有L-谷氨酸类似物的基本培养基上，并且收集在24-48小时之后出现的菌落。添加到培养基的L-谷氨酸类似物的浓度优选这样的浓度，在该浓度具有未突变yggB基因的菌株不能生长而具有突变yggB基因的菌株能够生长。具体地，4-氟谷氨酸的浓度是1.25mM或更高，优选2.5mM或更高，并且更优选5mM或更高。例如，如本文所用的“L-谷氨酸类似物抗性菌株”的意思是，当在含有4-氟谷氨酸的基本培养基中培养所述菌株时，其中野生型菌株的活细胞计数(能够形成菌落的细胞数)被抑制到不多于当缺乏4-氟谷氨酸时的1/100，所述菌株显示的生长是缺乏4-氟谷氨酸时培养的菌株的1/10或更多。

将所得L-谷氨酸类似物抗性菌株接种到含有过量生物素的液体培养基中并且摇动培养，随后测量在培养基中积累的L-谷氨酸的浓度。尽管具有野生型yggB基因的菌株几乎不积累L-谷氨酸，但一些L-谷氨酸类似物抗性菌株积累显著量的L-谷氨酸。将yggB基因从这样的菌株扩增，并测定其核苷酸序列，并且由此可获得新的突变型yggB基因。

(III)突变型yggB基因

以下，描述突变型yggB基因的具体实例。然而，本发明的突变型yggB基因不限于这些基因。

通过上述方法获得的突变型yggB基因没有具体限制，只要当将其引入棒状杆菌型细菌中时，所述突变型yggB基因具有使棒状杆菌型细菌在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的能力增强的功能。

(III-1)yggB基因C-末端区的突变

将此突变引入到编码SEQ ID NO:6,68,84或85的氨基酸419-533，或SEQ ID NO:62的氨基酸419-529的区域中。例如，在SEQ ID NO:5中，此区域对应于由核苷酸2692至3035组成的区。只要将此突变引入到所述区域中，此突变可以是任何类型，并且包括点突变和插入人工序列。其中，引入插入序列(IS)或人工转座子的突变是优选的。所述突变可以引起氨基酸取代(错义突变)、移码或终止密码子(无义突变)，作为点突变、插入IS或转座子的结果。

(III-1-1)插入转座元件的突变(2A-1型突变)

在C-末端区中的突变的实例包括，在紧接着SEQ ID NO:5位置2691的“G”处插入转座元件例如插入序列(IS)。具有此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:7，并且由所述基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8。插入到SEQ ID NO:7的核苷酸序列中的IS与IS1207(GenBank登录号X96962)和IS719(GenBank登录号E12759)具有高同源性。在SEQ ID NO:8的氨基酸序列中，用较短的IS衍生序列取代在Ygg蛋白(SEQ ID NO:6)的位置419含有Val和其后的C-末端区。将此类型的突变命名为2A-1型突变，其包括在SEQ ID NOS:6,62,68,84和85的氨基酸序列中改变或缺失C-末端区的突变。

此外，2A-1型突变还包括其它突变，所述其它突变将其它IS或转座子引入到与2A-1型突变相同的位点。插入IS或转座子的位置可以是任何位置，只要其位于上述区域之内。优选将IS插入到转座酶可以容易地识别它的位置，或插入到IS易于插入的热点(hot spot)。

(III-1-2)导致用另外的氨基酸取代脯氨酸的突变(66型和22型突变)

此外，在C-末端区的突变的实例还包括，导致用另外的氨基酸取代C-末端区中的脯氨酸的突变。在下列位置的脯氨酸可以用SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的其它氨基酸取代。

在位置424的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的424)

在位置437的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的437)

在位置453的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的453)

在位置457的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的457)

在位置462的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的462)

在位置469的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的469)

在位置484的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的484)

在位置489的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的489)

在位置497的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的497)

在位置515的Pro(SEQ ID NO:62,68,84,85中的515)

在位置529的Pro(SEQ ID NO:68,84,85中的529，SEQ ID NO:62中的525)

在位置533的Pro(SEQ ID NO:68,84,85中的533，SEQ ID NO:62中的529)

认为YggB蛋白的C-末端区中的脯氨酸残基在YggB蛋白三维结构的保持中扮演重要角色(Protein Eng.2002Jan;15(1):29-33,J Biol Chem.1991Dec25;266(36):24287-94.)。

尤其，用另外的氨基酸取代SEQ ID NO:6,62,68,84或85中位置424的脯氨酸和/或在位置437的脯氨酸是优选的。

所述另外的氨基酸的实例包括Ala,Arg,Asp,Asn,Cys,Glu,Gln,Gly,His,Ile,Met,Leu,Lys,Phe,Ser,Trp,Tyr,Val和Thr。由于另外的氨基酸取代在位置424的脯氨酸，所以疏水氨基酸例如Ala,Gly,Val,Leu和Ile是优选的，并且具有支链的氨基酸例如Leu,Val和Ile是更优选的。用Leu取代在位置424的脯氨酸的突变的实例包括在SEQ ID NO:67中用“T”取代位置1673的“C”的突变。具有此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:69中，并且由该基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:70中。

作为取代在位置437的脯氨酸的其它氨基酸，含有羟基的氨基酸例如Thr,Ser,Tyr是优选的，并且具有Ser的氨基酸是更优选的。用Ser取代在位置437的Pro的突变的实例包括在SEQ ID NO:5中用“T”取代位置2745的“C”的突变。而且，此突变可以伴随以在SEQ ID NO:5中用“T”取代位置3060的“C”的突变。具有此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:73，并且由该基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:74。

(III-2)yggB基因的跨膜区中的突变

推测由yggB基因编码的YggB蛋白具有五个跨膜区。在SEQ ID NOs:6,62,68,84和85所示的野生型YggB蛋白的氨基酸序列中，所述跨膜区对应于氨基酸1至23(第一跨膜区)、氨基酸25至47(第二跨膜区)、氨基酸62至84(第三跨膜区)、氨基酸86至108(第四跨膜区)和氨基酸110至132(第五跨膜区)。在SEQ ID NO:5中，编码这些区域的核苷酸分别对应于核苷酸1437至1505、核苷酸1509至1577、核苷酸1620至1688、核苷酸1692至1760和核苷酸1764至1832。此类型的突变优选引入到这些区域中。此类突变优选将一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加、插入或倒位引入到这些区域中，而不引起移码突变和翻译终止。在这些突变当中，在上述区域中导致氨基酸取代的错义突变是优选的。将被取代、缺失、添加、插入或倒位的“几个”氨基酸的数目是指2至20，优选2至10，更优选2至5，并且还更优选2或3。导致插入和缺失一个或几个氨基酸而无移码的突变也是优选的，并且更优选插入或缺失3,6,9,12,15,18或21个核苷酸，还更优选缺失或插入3,6或9个核苷酸，并且更加优选缺失或插入3个核苷酸。

跨膜区中的突变的具体实例包括下列：

(III-2-1)第一跨膜区中的突变(A1型突变)

此类型突变包括突变，其将一个或多个氨基酸引入SEQ ID NOs:6,62,68,84和85所示的氨基酸序列中在位置14的亮氨酸和在位置15的色氨酸之间，并且更具体地包括突变，其将三个氨基酸，例如，Cys-Ser-Leu，引入在位置14的Leu和在位置15的色氨酸之间。此突变包括紧接着SEQ ID NO:5的野生型yggB基因中在位置1480的G插入TTCATTGTG。具有此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:19，并且由该基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:20。

(III-2-2)第4跨膜区中的突变(19型突变)

此类型的突变包括在SEQ ID NOs:6,62,68,84和85所示的氨基酸序列中用另外的氨基酸取代在位置100的Ala。另外的氨基酸的实例包括Arg,Asp,Asn,Cys,Glu,Gln,Gly,His,Ile,Met,Leu,Lys,Phe,Pro,Ser,Trp,Tyr,Val和Thr。在这些之中，含有羟基的氨基酸例如Thr,Ser和Tyr是优选的，并且苏氨酸是更优选的。用Thr取代在位置100的Ala的突变包括用“A”取代SEQ IDNO:5在位置1734的“G”的突变。

具有此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:21，并且由该基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:22。

(III-2-3)第5跨膜区中的突变(L30型突变、8型突变)

此类突变包括在示于SEQ ID NOs:6,62,68,84和85的氨基酸序列中用在另外的氨基酸取代在位置111的Ala的突变。另外的氨基酸的实例包括Arg,Asp,Asn,Cys,Glu,Gln,Gly,His,Ile,Met,Leu,Lys,Phe,Pro,Ser,Trp,Tyr,Val和Thr。在这些之中，含有支链的氨基酸例如Val、Ile和Leu，和含有羟基的氨基酸例如Thr、Ser和Tyr是优选的，并且Val或Thr是优选的。此类型的突变包括在SEQ ID NO:5的核苷酸序列中用“T”取代在位置1768的“C”的突变(L30型突变)，和在SEQ ID NO:61的核苷酸序列中用“A”取代在位置837的“G”的突变(8型突变)。具有L30型突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:23，并且由此基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:24。具有8型突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQID NO:63，并且由此基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ IDNO:64。

(IV)突变型yggB基因的同等物(equivalent)

本发明中所用的“突变型yggB基因”可以是功能上等效的基因，其基本上与上述“突变型yggB基因”同源，例如，包含核苷酸序列的突变型基因，所述核苷酸序列在严紧条件下能够与至少一个选自下组核苷酸序列的互补核苷酸序列及由这些核苷酸制备的探针杂交：SEQ ID NO:7的核苷酸1437至2705、SEQ ID NO:19的核苷酸1437至3044、SEQ ID NO:21的核苷酸1437至3035、SEQ ID NO:63的核苷酸507至2093、SEQ ID NO:69的核苷酸403至2001和SEQ ID NO:23的核苷酸1437至3035、SEQ ID NO:73的核苷酸548至2146，只要所述基因具有在过量生物素存在下使棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力增强的功能。

本文所用的“严紧条件”是这样的条件，在该条件下形成所谓的特异杂合体，而不形成非特异杂合体。严紧条件的实例包括这样的条件，在该条件下具有高同源性的DNA相互杂交，例如具有不少于70%，优选不少于80%，更优选不少于90%，特别优选不少于95%的同源性的DNA相互杂交，而具有低于70%的同源性的DNA不相互杂交，和这样的条件，在该条件下DNA在Southern杂交的常规洗涤的盐浓度相互杂交，即，在1x SSC,0.1%SDS在60℃，优选0.1x SSC,0.1%SDS在60℃，更优选0.1x SSC,0.1%SDS在68℃洗涤一次或优选2-3次。

本发明所用的突变型yggB基因包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有SEQ ID NOs:8,20,22,24,64,70或74的氨基酸序列，其中在如上所述的特定(specific)氨基酸之外的一个或多个位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸，同时保留在过量生物素存在下增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能。尽管本文涉及的“几个”氨基酸残基的数目可以依据蛋白质氨基酸残基的三维结构或类型而改变，但其可以优选为2至20，更优选2至10，特别优选2至5。

yggB基因优选编码蛋白，其具有上述特定的氨基酸取代或缺失，并且与SEQ ID NOs:8,20,22或24,64,70或74所示的氨基酸序列具有不少于70%，更优选不少于80%，还更优选不少于90%，特别优选不少于95%的同源性，同时保留在过量生物素存在下增强棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸的能力的功能。上述取代优选是保守取代(中性突变(neutral mutation))。在芳族氨基酸的情况下，保守取代包括phe,trp和tyr的相互取代。在疏水性氨基酸的情况下，保守取代包括leu,ile和val的相互取代。在极性氨基酸的情况下，保守取代包括gln和asn的相互取代。在碱性氨基酸的情况下，保守取代包括arg,lys和his的相互取代。在酸性氨基酸的情况下，保守取代为asp和glu的相互取代。在含有羟基的氨基酸的情况下，保守取代包括ser和thr的相互取代。所述保守取代还包括：用ser或thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr和用Met、Ile或Leu取代Val。如上所述，显示为Xaa的氨基酸在SEQ ID NO:85的氨基酸序列中可以被取代。

尤其，在SEQ ID NO:8,20,22,24,64,70或74的氨基酸序列中可以取代或缺失下列氨基酸。

在位置48的Glu(优选被Arg取代)

在位置275的Asp(优选被Ser取代)

在位置298的Glu(优选被Ala取代)

在位置343的Ala(优选被Val取代)

在位置396的Phe(优选被Ile取代)

在位置438的Ser(优选被Gly取代)

在位置445的Val(优选被Ala取代)

在位置454的Ala(优选被Val取代)

在位置457的Pro(优选被Ser取代)

在位置474的Ser(优选被Asp取代)

在位置517的Val(优选缺失)

在位置518的Glu(优选缺失)

在位置519的Ala(优选缺失)

在位置520的Pro(优选缺失)

(V)将上述突变型yggB基因引入到棒状杆菌型细菌中的方法

可通过常规方法获得具有上述特异性突变的突变型yggB基因，所述常规方法包括定点诱变(site-directed mutagenesis)技术。定点诱变技术包括重叠延伸PCR(overlap extension PCR)方法，其使用具有突变的PCR引物扩增突变基因(Urban,A.,Neukirchen,S.and Jaeger,K.E.,A rapid and efficient method forsite-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR.Nucleic AcidsRes,25,2227-8.(1997))。

可以通过将上述突变型yggB基因引入棒状杆菌型细菌中来获得具有上述突变型yggB基因的本发明的棒状杆菌型细菌。可以用突变型yggB基因取代染色体上的野生型yggB基因。可以将突变型yggB基因引入其中野生型yggB基因被破坏的棒状杆菌型细菌。另外，如在单交换重组体的情况下，突变型yggB基因可与野生型yggB基因在棒状杆菌型细菌中共存。例如，可以通过使用，例如，含有编码上述果聚糖蔗糖酶的sacB基因的温度敏感质粒进行染色体上yggB基因的取代。此外，为了将突变型yggB基因引入棒状杆菌型细菌中，可以使用载体，例如在棒状杆菌型细菌中可复制的质粒或转座子，其包含突变型yggB基因。

为了将突变型yggB基因引入棒状杆菌型细菌的染色体DNA中，还可以通过靶向以多拷贝存在于染色体DNA上的序列来进行同源重组。这样的序列的实例包括存在于转座元件末端上的反向重复序列和重复DNA。突变型yggB基因可以单拷贝或多拷贝存在于棒状杆菌型细菌中。可通过PCR、Southern杂交等确认将突变型yggB基因引入棒状杆菌型细菌。

此外，突变型yggB基因可受到源自其它基因的强启动子控制，如WO00/18935中所述。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、PS2启动子等被称为强启动子。还可以将核苷酸取代引入到突变型yggB基因的启动子区，以增强突变型yggB基因的表达。可通过使用，例如，温度敏感质粒来进行表达调控序列的取代。

(VI)L-谷氨酸类似物抗性

此外，本发明的棒状杆菌型细菌可以具有增加的对L-谷氨酸类似物的抗性，作为引入本发明的突变型yggB基因的结果。如本文所用的“L-谷氨酸类似物”包括γ-甲基L-谷氨酸、α-甲基谷氨酸、β-羟基谷氨酸、甲硫氨酸磺基肟、谷氨酸-γ-单氧肟酸、2-氨基-4-膦酰丁酸、γ-单乙基L-谷氨酸、二甲基L-谷氨酸、二-叔-丁基L-谷氨酸、单氟谷氨酸、二乙基L-谷氨酸、D-谷氨酸和4-氟谷氨酸。例如，通过以下事实来确认对L-谷氨酸类似物的抗性的增加：当将本发明的菌株在含有一定浓度的4-氟谷氨酸的基本培养基中培养时，在所述浓度下亲本菌株的活细胞计数(能够形成菌落的细胞数)与在缺乏4-氟谷氨酸的条件下培养时相比被抑制到不多于1/100，菌株与在缺乏4-氟谷氨酸的条件下培养时显示1/10或更多的生长。具体地，优选所述菌株具有对1.25mM或更多，优选2.5mM或更多，并且更优选5mM或更多的4-氟谷氨酸的抗性。

(VII)进一步修饰以使抑制突变型yggB基因功能的基因失活

可以进一步修饰本发明的棒状杆菌型细菌以使抑制突变型yggB基因功能的基因失活。所述“抑制突变型yggB基因功能的基因”的意思是，通过在菌株中扩增该基因来抑制引入突变型yggB基因的菌株产生L-谷氨酸。这样的基因的实例包括symA基因(yggB突变抑制基因(suppressor of yggBmutation))。将symA基因显示为谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的基因组序列(Genbank登录号NC_003450)的核苷酸编号2051306-2051845，并且登记为NCgl1867(NP_601149.hypothetical prot...[gi:19553147])。谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株的symA基因示于SEQ ID NO:86的核苷酸585-1121。symA基因可以是DNA，其能够在严紧条件下与SEQ ID No:86的核苷酸585-1121的互补核苷酸序列或由所述核苷酸制备的探针杂交，只要该DNA抑制所述突变型yggB基因在棒状杆菌型细菌中的功能。

可通过以下方法进行基因失活：破坏该基因、缺失该基因或修饰它以减少该基因的表达。可以使用与用于减少酶活性的上述方法相似的方法将symA基因失活。

(VIII)进一步修饰以减少α-酮戊二酸脱氢酶活性

在本发明中，除使用yggB基因的修饰之外，优选修饰棒状杆菌型细菌，以将α-酮戊二酸脱氢酶(在下文中，称作“α-KGDH”)的活性减少。所述“将α-KGDH活性减少”的意思是，α-KGDH活性与野生型菌株或未修饰菌株，例如亲本菌株相比减少。可根据Shiio等的方法(Isamu Shiio and KyokoUjigawa-Takeda,Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980)测量α-KGDH活性。尽管α-KGDH活性与未修饰菌株例如野生型菌株或亲本菌株相比减少是足够的，优选将α-KGDH活性减少至相对于野生型或未修饰菌株的约1/2倍或更少，优选约1/4倍或更少，并且更优选约1/10或更少。本发明的棒状杆菌型细菌可不具有可检测的α-KGDH活性。

能够以与上述相似的方法构建其中α-KGDH活性减少的棒状杆菌型细菌。

例如，可以通过以下方法减少α-KGDH活性：引入编码α-KGDH复合体的Elo亚基的基因，该α-KGDH复合体在硫胺素焦磷酸(thiamine pyrophosphate)结合区(该区由SEQ ID NO:43的核苷酸2498至2584编码(SEQ ID NO:44的686Gly-714Asp))中具有突变。

α-KGDH活性减少的菌株的实例包括乳发酵短杆菌ΔS菌株(WO95/34672)和乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172)菌株(JP-A-06-237779)。当使用携带突变型yggB基因并且具有减少的α-KGDH活性的棒状杆菌型细菌时，可以先减少α-KGDH活性或先引入突变型yggB基因。

<2>产生L-谷氨酸的方法

可通过以下方法产生L-谷氨酸：在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌以引起L-谷氨酸在培养基中和/或在细菌细胞中的积累，并且从培养基和/或细菌细胞中收集L-谷氨酸。在本发明的产生方法中，优选通过例如，在25-40℃将本发明的棒状杆菌型细菌培养8至120小时来产生L-谷氨酸。

培养基可以是普通培养基，其含有碳源、氮源、无机盐和任选的有机微量营养物如氨基酸和维生素。可使用合成培养基或天然培养基。可使用任何种类的碳源和氮源，只要它们能够被所培养的菌株利用。

糖类例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜可以用作碳源。另外，有机酸例如乙酸和柠檬酸，和醇例如乙醇也可以单独或组合使用作为碳源。氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸盐等可以用作氮源。氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含有胨的物质、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母提取物和大豆蛋白分解物可以以少量用作有机营养物。当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌株时，最好加入这样的必需营养物。磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等可以用作无机盐。

可以根据待培养的菌株以合适的量添加表面活性剂如Tween40、青霉素或生物素。例如，可以在过量生物素存在下培养具有突变型yggB基因的菌株，尽管也可以将这样的菌株在含有表面活性剂或青霉素的L-谷氨酸条件(L-glutamic condition)下，或当生物素有限时培养。

优选地，通过控制发酵温度和将培养基的pH调节至3-9来进行需氧培养。当在培养期间pH减少时，通过添加碱如碳酸钙或氨气来中和培养基。约10至约120小时的培养导致培养基中可观量的L-谷氨酸的积累。

此外，可以通过使用液体培养基来进行培养，将该液体培养基调节至产生的L-谷氨酸结晶并析出的条件。L-谷氨酸结晶的条件包括pH5.0至4.0，优选pH4.5至4.0，更优选pH4.3至4.0，特别优选pH4.0(EP1233069,EP1233070)。

在培养完成后，可以通过常规方法从培养基收集L-谷氨酸。例如，可以通过从培养基去除细菌细胞和浓缩L-谷氨酸，或通过使用离子交换层析来收集L-谷氨酸。当培养在L-谷氨酸结晶和析出的条件下进行时，例如，可通过离心或过滤来收集结晶的L-谷氨酸。在此情况下，还可以在溶解的L-谷氨酸结晶之后收集溶解于培养基中的L-谷氨酸。

实施例

在下文中，将通过参考以下非限制性实施例具体地说明本发明。

实施例1

<构建携带sacB基因的用于基因破坏的载体>

(1-1)构建pBS3

通过使用WO2005/113745和WO2005/113744中的方法进行携带sacB基因的基因破坏载体(gene disruption vector)的构建。使用枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS:13和14的寡核苷酸作为引物，通过PCR获得sacB基因(SEQ ID NO:11)。使用LA taq(由TaKaRa制造)如下进行PCR：在94℃贮热5分钟的一个循环；和94℃变性30秒、49℃退火30秒和72℃延伸2分钟的25个循环。将所得PCR产物通过常规方法纯化，然后用BglII和BamHI消化和平端化。将所述片段插入已用AvaII消化和平端化的pHSG299中。将所得DNA用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(由TAKARA BIO INC.制造)。然后，将转化的细菌细胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素(在下文中，缩写为“Km”)的LB琼脂培养基上，并且温育一夜。其后，分离单菌落作为转化体。从所得转化体中提取质粒，并且将具有目标PCR产物的插入物的质粒命名为pBS3。图1显示构建pBS3的方法。

(1-2)构建pBS4S

使用不引起氨基酸取代的交换PCR通过核苷酸取代来修饰pBS3上卡那霉素抗性基因中的SmaI识别位点，以使pBS3不被SmaI核酸内切酶(endnuclease)切断。首先，使用pBS3作为模板和SEQ ID NOS:15和16的合成DNA作为引物进行PCR，从而获得卡那霉素抗性基因的N-末端片段。另一方面，为了获得卡那霉素抗性基因的C-末端片段，使用pBS3作为模板和SEQ ID NOS:17和18的合成DNA作为引物进行PCR。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下进行PCR：在98℃贮热5分钟的一个循环；和98℃变性10秒、57℃退火30秒和72℃延伸1分钟的25个循环，以获得目标PCR产物。SEQ ID NOS:16和17是彼此部分互补的，并且不含有SmaI识别位点。然后，为了获得没有SmaI识别位点的突变卡那霉素抗性基因的全长片段，将上述N-末端和C-末端基因产物以基本上等摩尔量混合在一起。使用所述基因产物作为模板和SEQ ID NOS:15和18的合成DNA作为引物进行PCR，以获得SmaI位点修饰的卡那霉素抗性基因片段。使用PyrobestDNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下进行PCR：在98℃贮热5分钟的一个循环；和98℃变性10秒、57℃退火30秒和72℃延伸1.5分钟的25个循环，从而获得目标PCR产物。

将所述PCR产物通过常规方法纯化，然后用BanII消化，然后插入到上述pBS3的BanII识别位点中。将所得质粒用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(可从Takara Bio获得)。即，将转化的细菌细胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，并且温育一夜。其后，选择出现的菌落作为转化体。从所得转化体分离质粒，并且将具有目标PCR产物插入物的质粒命名为pBS4S。图2显示构建pBS4S的方法。

实施例2

<从谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株构建odhA基因破坏的菌株>

已鉴定了odhA基因的核苷酸序列，所述odhA基因编码棒状杆菌型细菌的α-酮戊二酸脱氢酶(Microbiology142,3347-3354,(1996),GenBank登录号D84102)。基于odhA基因的核苷酸序列，设计SEQ ID NOS:1和2所述的引物，并且使用所述引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以扩增odhA基因的内部序列。用BamHI完全消化扩增的PCR片段并将其插入到实施例1构建的pBS4S的BamHI位点，由此获得质粒pBS4SΔsucAint(图3)。

通过电脉冲方法(JP-A-02-207791)将pBS4SΔsucAint引入谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中，并且将转化的细菌细胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/l葡萄糖、10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物和20g/l琼脂，用NaOH调节至pH7.5：在120℃高压灭菌20分钟)上。在31.5℃培养之后，使用提取自出现的菌株的每个染色体进行PCR，以确认这些菌株是单交换重组体(single cross-over recombinant)，其中将pBS4SΔsucAint通过同源重组并入染色体。将引物用于PCR，所述每个引物具有对于pBS4S质粒特异的序列(SEQ ID NO:3)和与染色体序列互补的序列(SEQ ID NO:4)。因为pBS4S的序列不存在于非重组菌株，所以从非重组菌株扩增不出任何片段，而从单交换重组体扩增单一片段。

将如此获得的单交换重组体命名为2A-1菌株。将野生型13869菌株和2A-1菌株接种到20ml摇瓶培养基(30g/l葡萄糖、15g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/lVB1(维生素B1)、300μg/l生物素和0.48g/l大豆水解物(T-N:总氮)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，随后添加1g热灭菌的碳酸钙，并且将每个菌株在31.5℃摇动培养。在糖被完全消耗之后，测定培养基中积累的L-谷氨酸的浓度。结果示于表1(OD620是稀释至101倍的培养液在620nm的浊度，并表示细胞量，并且Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量)。发现2A-1菌株在过量生物素存在下产生L-谷氨酸，而亲本菌株ATTCC13869根本不产生L-谷氨酸。

<表1由对照和2A-1菌株产生的L-谷氨酸的量>

实施例3

<从2A-1菌株构建odhA基因回复体菌株(gene-revertant strain)>

在2A-1菌株中，染色体上的odhA基因被pBS4SΔsucAint破坏。通过从此菌株的染色体消除(curing)该质粒，可将odhA基因回复到野生型。尽管odhA基因破坏的菌株在不含糖的培养基中生长非常缓慢，但其中odhA基因回复到野生型的odhA基因回复体菌株，在不含糖的培养基例如CM2B(10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl、10μg/l生物素、20g/l琼脂，用KOH调节至pH7.0)中生长良好。为了获得这样的回复体菌株，将2A-1菌株涂布到CM2B琼脂培养基以选择生长改善的菌株。将出现的生长改善的菌株命名为2A-1R，将其在CM2B琼脂培养基上分离，并且检查所述2A-1R菌株的卡那霉素敏感性。结果发现所有选择的菌株是卡那霉素敏感和蔗糖抗性的。由于pBS4SΔsucAint含有卡那霉素抗性基因和编码果聚糖蔗糖酶(levan sucrase)的sacB基因，所以含有pBS4SΔsucAint的菌株呈现卡那霉素抗性和蔗糖敏感性，而其中pBS4SΔsucAint被去除的菌株呈现卡那霉素敏感性和蔗糖抗性。因此，认为在2A-1R菌株中的odhA基因回复到野生型。测定odhA基因的核苷酸序列证实所述菌株具有野生型odhA基因。

通过与实施例2中所述相同的方法确定2A-1R菌株在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的能力。结果示于表2(OD620是稀释至101倍的培养液在620nm的浊度，并表示细胞量，并且Glu(g/L)显示积累的L-谷氨酸的量)。尽管2A-1R菌株的L-谷氨酸积累与2A-1菌株相比稍微减少，但在过量生物素存在下2A-1R菌株产生的L-谷氨酸量比野生型ATCC13869菌株高得多(表2)。另外，当在糖被完全消耗后继续摇动培养时，观察2A-1R菌株中L-谷氨酸的分解，其证明在此菌株中的odhA基因已经回复到野生型(图4)。

<表2对照菌株、odhA基因破坏的菌株和odhA基因回复体菌株的L-谷氨酸产生>

实施例4

<分离涉及通过2A-1R菌株产生L-谷氨酸的基因>

在CM2B琼脂培养基上，2A-1R菌株能够以与野生型菌株ATCC13869基本上相同的速率(rate)形成菌落。然而，在基本平板培养基(20g/l葡萄糖、2.64g/l硫酸铵、0.5g/l KH₂PO₄、0.5g/l K₂HPO₄、0.25g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/lFeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·7H₂O、0.01g/l CaCl₂、0.02mg/l CuSO₄、40g/lMOPS、30mg/l原儿茶酸、200μg/l VB₁·Hu、300μg/l生物素、20g/l琼脂，用NaOH调节至pH6.7)上，2A-1R与野生型ATCC13869菌株相比显示显著减少的菌落形成率(colony-forming rate)。因此，发现基因，其能够恢复2A-1R菌株在基本培养基中的生长。

将ATCC13869菌株的染色体DNA用Sau3AI部分消化，并且连接到已用BamHI消化的穿梭载体pVK9。将所得质粒用乙醇沉淀，并且用于通过电脉冲方法转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TAKARA BIO INC.)。pVK9是穿梭载体，其通过以下方法获得：平端化pHSG299(TAKARA BIO INC.)的AvaII位点，并且在此插入片段，所述片段包含在棒状杆菌型细菌中能自主复制的序列，该序列用BamHI和KpnI从pHK4(JP-A-05-007491)切出。将转化的细胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl、20g/l琼脂，用NaOH调节至pH7.0)上，并且在37℃培养一夜。在其后的一天，将所有出现的菌落从平板中用铂环收集，并且提取质粒以构建ATCC13869菌株的质粒文库。将该质粒文库通过电脉冲方法转化到实施例3获得的2A-1R菌株，并且将转化的细胞施加于含有25μg/ml卡那霉素的基本琼脂培养基。选择显示增加的菌落形成率的菌株。通过从所选择的显示增加的菌落形成率的菌株提取质粒，发现具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的片段插入到pVK9的BamHI位点中。将所得质粒命名为pL5k。

将插入到pL5k中的核苷酸序列与已经公开的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列(登录号NC_003450)相比，显示pL5k仅含有编码SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的一个ORF。

使用在因特网上可以获得的程序“SOSUI”(sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html，在2004/10/07)预测ORF是否编码膜蛋白。使用“SOSUI”的ORF的分析结果说明在此氨基酸序列中存在五个跨膜区。在SEQ ID NO:6的氨基酸序列中，所述跨膜区对应于以下的区：氨基酸1-23、氨基酸25-47、氨基酸62-84、氨基酸86-108和氨基酸110-132。编码这些区的DNA序列对应于SEQ ID NO:5的核苷酸1437-1505、核苷酸1509-1577、核苷酸1620-1688、核苷酸1692-1760和核苷酸1764-1832。这些区的每个氨基酸序列示于SEQ ID NOS:25-29和表3。

<表3由插入的基因编码的蛋白的预测跨膜区>

进一步搜索文献显示，所述ORF被命名为YggB(NCgl1221)(FEMSMicrobiology letters218(2003)305-309)。

实施例5

<鉴定引入到2A-1R菌株的yggB基因中的突变>

yggB基因能够恢复2A-1R菌株在基本培养基中的生长，这说明2A-1R菌株的yggB基因具有某些突变的可能性。因此，测定2A-1R菌株的yggB基因的核苷酸序列。结果显示在2A-1R菌株中，IS被插入到野生型yggB基因的C-末端区(图5)。源自2A-1R菌株的突变型yggB基因的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:7中，并且相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8中。

这说明以下可能性，2A-1R菌株在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的能力归因于yggB基因中的突变。应该注意此突变不仅存在于2A-1R菌株中，还存在于2A-1菌株中。推测此突变作为阻遏物突变(suppressor mutation)发生，以在odhA基因被破坏时，稳定地从细胞分泌L-谷氨酸。将插入IS的突变命名为2A-1型突变。

实施例6

<构建具有2A-1型突变yggB基因的菌株和评估产生L-谷氨酸的能力>

(6-1)将2A-1型突变引入到野生型菌株中和评估产生L-谷氨酸的能力(单交换重组体)

使用2A-1菌株的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS:9和10中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以扩增具有2A-1型突变的yggB基因片段。将扩增产物用SacI处理并且插入到实施例1获得的pBS3的SacI位点，由此获得含有2A-1型突变yggB基因的质粒(pBS3yggB2A)。

将所得pBS3yggB2A通过电脉冲方法引入到谷氨酸棒杆菌ATCC13869中，并且将转化的细胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基上。将在31.5℃培养之后出现的菌株通过PCR评估，以确定它们是单交换重组体，其中将pBS3yggB2A通过同源重组并入染色体中。将所得单交换重组体命名为13869-2A。在这个菌株中，野生型yggB基因和突变型yggB基因两者都存在和表达。

所得的引入了突变型yggB基因的菌株13869-2A在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的能力通过实施例2所述方法评估。结果示于表4(OD620是稀释101倍的培养液在620nm的浊度，表示细胞量，并且Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量)。13869-2A菌株在过量生物素存在下产生L-谷氨酸，而野生型ATCC13869菌株不能产生L-谷氨酸。这显示yggB基因中的突变能够提高在过量生物素存在下的L-谷氨酸产生。

<表4对照菌株、2A-1R菌株和引入突变型yggB基因的菌株的L-谷氨酸积累量>

(6-2)将2A-1型突变yggB基因引入野生型菌株和评估产生L-谷氨酸的能力(双交换重组体)

为了构建仅具有突变型yggB基因的菌株，将13869-2A菌株在CM-Dex液体培养基中培养一夜，将所得培养物涂布到S10琼脂培养基(100g/l蔗糖、10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/lFeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物、20g/l琼脂，用NaOH调节至pH7.5：在120℃高压灭菌20分钟)上，并且在31.5℃培养。在出现的菌落中，将对卡那霉素显示敏感性的菌株在CM2B琼脂培养基上分离。从所述菌株制备染色体DNA。然后，使用SEQ ID NOS:9和10中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以确定所述菌株仅具有突变型yggB基因。将含有其中插入IS-样(IS-like)序列的突变型yggB基因的菌株命名为13869-2A-7。

所得13869-2A-7菌株在过量生物素存在下产生L-谷氨酸的能力通过实施例2中所述的方法评估。结果示于表5(OD620是稀释至101倍的培养液在620nm的浊度，表示细胞量，并且Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量)。13869-2A-7菌株产生等同于或高于2A-1R菌株的L-谷氨酸，这证实了棒状杆菌型细菌在过量生物素存在下产生L-谷氨酸是由yggB基因中的突变引起的。

<表5对照菌株、2A-1R菌株和引入突变型yggB基因的菌株产生L-谷氨酸的量>

实施例7

<构建引入A1型突变yggB基因的菌株和评估产生L-谷氨酸的能力>

作为使用上述产生L-谷氨酸的odhA基因破坏的菌株(ΔsucA菌株)筛选的结果，除了上述2A-1突变，鉴定yggB基因上的五种突变。在下文中，将这些突变命名为A1型突变、19型突变、L30型突变、8型突变和66型突变。将具有A1型突变、19型突变和L30型突变中每一个的突变型yggB基因引入到ATCC13869菌株的染色体中，并且评估每个突变的效果。将具有8型突变的突变型yggB基因引入到ATCC14067菌株的染色体中，并且评估突变的效果。将具有66型突变的突变型yggB基因引入到栖糖蜜棒杆菌ATCC17965的染色体中，并且评估突变的效果。

A1型突变是在邻接(next to)野生型yggB基因(谷氨酸棒杆菌的野生型基因示于SEQ ID NO:5的核苷酸1437-3035中)的位置1480的“G”插入“TTCATTGTG”的突变，并导致在SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的位置14的Leu和位置15的Trp之间插入CysSerLeu。其中引入此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:19中，并且由此基因编码的突变型YggB的氨基酸序列示于SEQ ID NO:20中。

A1型突变基因能够如下获得。通过使用SEQ ID NOS:30和31中所示的合成DNA作为引物，和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备N-末端片段。类似地，通过使用SEQ ID NOS:32和33中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以制备C-末端片段。随后，通过使用N-末端片段和C-末端片段的等摩尔混合物作为模板和SEQ ID NOS:9和34中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以扩增A1型突变yggB基因的部分片段。将所得突变型yggB基因片段用SacI处理，并且插入到pBS4S的SacI位点中，以获得用于引入此类型突变的质粒。将如此获得的pBS4yggBA1以与实施例6所述相同的方法引入到ATCC13869菌株的染色体中，然后仅将质粒部分从染色体消除。测定所得卡那霉素敏感菌株的yggB基因的核苷酸序列，并且选择具有A1型突变yggB基因的菌株。将引入A1型突变yggB基因的菌株命名为ATCC13869-A1菌株。

将ATCC13869-A1菌株和对照ATCC13869菌株以与实施例2中相同的方式培养。在完成培养之后，通过已知方法测量培养基中已积累的L-谷氨酸的量。发现引入A1型突变yggB基因的菌株与对照菌株相比，在过量生物素存在下以更大的量产生L-谷氨酸。

<表6对照菌株和引入突变型(A1型)yggB基因的菌株产生L-谷氨酸的量>

实施例8

<构建引入19型突变yggB基因的菌株和评估产生L-谷氨酸的能力>

19型突变是用“A”取代在野生型yggB基因(谷氨酸棒杆菌的野生型基因示于SEQ ID NO:5的核苷酸1437-3035中)位置1734的“G”的突变，并导致在SEQ ID NO:6的氨基酸序列中用Thr取代在位置100的Ala。具有此类型突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:21中，并且由此基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:22中。

以与实施例7中相同的方式，构建引入19型突变yggB基因的菌株。具体地，通过使用SEQ ID NO:30和35中所示的合成DNA作为引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备N-末端片段。类似地，通过使用SEQ ID NO:33和36中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以制备C-末端片段。随后，通过使用N-末端片段和C-末端片段的等摩尔量混合物作为模板和SEQ ID NO:9和34中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以扩增19型突变yggB基因的部分片段。将所得yggB片段用SacI处理，并且插入到pBS4S的SacI位点中，以获得用于引入此突变的质粒。将由此获得的pBS4yggB19以和实施例6中所述相同的方式引入到ATCC13869菌株的染色体中，然后将载体部分从染色体消除。测定所得卡那霉素敏感菌株的yggB基因的核苷酸序列，并且选择具有19型yggB基因的菌株。将19型突变菌株命名为ATCC13869-19菌株。

将ATCC13869-19菌株和对照ATCC13869菌株以和实施例2中相同的方式培养。在完成培养之后，通过常规方法测量培养液中积累的L-谷氨酸量。发现引入19型突变yggB基因的菌株与对照菌株相比，在过量生物素存在下以更大的量产生L-谷氨酸。

<表7对照菌株和引入突变型(19型)yggB基因的菌株产生L-谷氨酸的量>

实施例9

<构建引入L30型突变yggB基因的菌株和评估产生L-谷氨酸的能力>

L30型突变是用“T”取代在野生型yggB基因(谷氨酸棒杆菌的野生型基因示于SEQ ID NO:5)的位置1768的“C”的突变，并导致用Val在SEQ ID NO:6所示氨基酸序列中取代位置111的Ala。具有此类型突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:23，并且由此基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:24。

以和实施例7中相同的方法，构建引入L30型突变yggB基因的菌株。具体地，通过使用SEQ ID NO:30和37中所示的合成DNA作为引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备N-末端片段。类似地，通过使用SEQ ID NOS:34和38中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以制备C-末端片段。随后，通过使用N-末端片段和C-末端片段的等摩尔混合物作为模板和SEQ ID NOS:9和34中所示的合成DNA作为引物进行PCR，以扩增L30型突变yggB基因的部分片段。将所得yggB片段用SacI处理，并且插入到pBS4S的SacI位点，以获得用于引入此类型突变的质粒。将由此获得的pBS4yggB-L以与实施例6中所述相同的方式引入到ATCC13869菌株的染色体中，然后将载体部分从染色体消除。测定所得卡那霉素敏感菌株的yggB基因的核苷酸序列，并且选择具有L30型突变yggB基因的菌株。将引入L30型突变yggB基因的菌株命名为ATCC13869-L30菌株。

将ATCC13869-L30菌株和对照ATCC13869菌株以与实施例2中相同的方式培养。在完成培养之后，通过常规方法测量在培养液中积累的L-谷氨酸的量。结果示于表8(OD620是稀释至101倍的培养液在620nm的浊度，表示细胞量，并且Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量)。具有L30型突变yggB基因的ATCC13869-L30菌株与亲本ATCC13869菌株相比引起较大量L-谷氨酸的积累。

<表8对照菌株和引入L30型突变yggB基因的菌株产生L-谷氨酸的量>

实施例10

在产生L-谷氨酸的条件下评估引入突变型yggB基因的菌株

棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸是由添加表面活性剂例如Tween40或通过限制生物素的浓度诱导的。因此，将ATCC13869菌株和ATCC13869-19菌株分别在含有Tween40的条件下和含有限量的生物素的条件下培养。

将各个菌株接种到20ml种子培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/lKH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，然后在31.5℃摇动培养。将在糖的完全消耗之后获得的培养液在后续的主培养(main culture)中用作种子培养液。

对于含有Tween40的培养，将2ml种子培养液接种到20ml主要培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/lFeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，接着在31.5℃摇动培养。当稀释101倍的培养液的OD620达到0.2时，加入Tween40至终浓度5g/L，并且继续培养。

对于含有有限生物素的培养，将1ml种子培养液接种到20ml主培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/lFeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，接着在31.5℃摇动培养。在这些培养条件下，计算生物素的终浓度为大约2.9μg/L。

在40小时培养之后，对于添加Tween40的培养和生物素有限的(biotin-limited)培养测定培养基中积累的L-谷氨酸的量。结果示于表9。发现ATCC13869-19菌株在产生L-谷氨酸的条件下以多于对照菌株的量产生L-谷氨酸。

<表9对照菌株和引入19型突变yggB基因的菌株在产生L-谷氨酸的条件下产生L-谷氨酸的量>

将野生型ATCC13869菌株、yggB突变菌株ATCC13869-19、ATCC13869-A1、ATCC13869-L30，和具有包含野生型yggB基因的质粒的菌株(ATCC13869/pL5k-1)，和具有对照质粒的菌株(ATCC13869/pVK9)与Tween40一起培养。将这些菌株中的每个在CM-Dex平板培养基上培养过夜，并且将从平板的1/6面积收集的细胞接种到20ml摇瓶培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素和0.48g/l大豆水解物(T-N:总氮)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后添加1g热灭菌的碳酸钙，并且将每个所述菌株在31.5℃摇动培养。在5小时培养之后，添加Tween40至终浓度1g/L，并且继续培养。表10显示24小时之后的细胞量(OD620)和培养基中积累的L-谷氨酸量。发现ATCC13869-19菌株、ATCC13869-A1菌株、ATCC13869-L30菌株和具有包含野生型yggB基因的质粒的菌株在产生L-谷氨酸的条件下具有增强的产生L-谷氨酸的能力。

<表10>

实施例11

<构建引入8型突变yggB基因的菌株和评估产生L-谷氨酸的能力>

8型突变是用“A”取代SEQ ID NO:61的位置837的“G”的突变，并导致在SEQ ID NO:62的氨基酸序列中用Thr取代位置111的Ala。具有此类型突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:63的核苷酸507-2093，并且由此基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:64。

以与实施例7中相同的方式，构建引入8型突变yggB基因的菌株。具体地，通过使用SEQ ID NO:30和65所示的合成DNA作为引物和黄色短杆菌ATCC14067菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备N-末端片段。类似地，通过使用SEQ ID NOS:34和66所示的合成DNA作为引物进行PCR，以制备C-末端片段。随后，通过使用N-末端片段和C-末端片段的等摩尔混合物作为模板和SEQ ID NOS:9和34所示的合成DNA作为引物进行PCR，以扩增8型突变yggB基因的部分片段。将所得yggB基因片段用SacI处理，并且插入到pBS4S的SacI位点，以获得用于引入此类型突变的质粒。将由此获得的pBS4yggB8以与实施例6中所述相同的方式引入ATCC14067菌株的染色体中，然后将载体部分从染色体消除。测定所得卡那霉素敏感菌株的yggB基因的核苷酸序列，并且选择具有8型突变yggB基因的菌株。将引入8型突变yggB基因的菌株命名为ATCC14067-yggB8菌株。

实施例12

<构建引入66型突变yggB基因的菌株和评估产生L-谷氨酸的能力>

66型突变是用“T”取代SEQ ID NO:67的位置1673的“C”的突变，并且导致在SEQ ID NO:68的氨基酸序列中用Leu取代在位置424的Pro。具有此类型突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:69，并且由此基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:70。

以与实施例7中相同的方式，构建引入66型突变yggB基因的菌株。具体地，通过使用SEQ ID NO:30和71所示的合成DNA作为引物和栖蜜糖棒杆菌ATCC17965菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备N-末端片段。类似地，通过使用SEQ ID NOS:34和72所示的合成DNA作为引物进行PCR，以制备C-末端片段。随后，通过使用N-末端片段和C-末端片段的等摩尔混合物作为模板和SEQ ID NOS:9和34所示的合成DNA作为引物进行PCR，以扩增66型突变yggB基因的部分片段。将所得yggB片段用SacI处理，并且插入到pBS4S的SacI位点，以获得用于引入此类型突变的质粒。将由此获得的pBS4yggB66以与实施例6中所述相同的方式引入ATCC17965菌株的染色体中，然后将载体部分从染色体消除。测定所得卡那霉素敏感菌株的yggB基因的核苷酸序列，并且选择具有66型突变yggB基因的菌株。将引入66型突变yggB基因的菌株命名为ATCC17965-yggB66菌株。

实施例13

<通过体外突变筛选突变型yggB基因>

突变型yggB基因可以通过以下方法获得：体外将随机突变引入到野生型yggB基因，用引入突变的yggB基因转化棒状杆菌型细菌，并且选择在过量生物素存在下不添加表面活性剂或青霉素的情况下能够产生L-谷氨酸的突变菌株。

(13-1)构建yggB基因破坏的菌株

为了进行突变型yggB基因的筛选，首先构建yggB基因破坏的菌株。通过使用SEQ ID NOS:39和40所示合成DNA作为引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以制备N-末端片段。类似地，通过使用SEQID NOS:41和42所示的合成DNA作为引物进行PCR以制备C-末端片段。SEQ ID NOS:40和SEQ ID NOS:41是彼此互补的。随后，通过使用N-末端片段和C-末端片段的等摩尔混合物作为模板和SEQ ID NOS:39和42所示的合成DNA作为引物进行PCR，以获得含有将ORF缺失的yggB基因的片段。

将所得PCR片段用SacI处理，并且插入到pBS4S的SacI位点中，以获得对于破坏yggB基因有用的质粒。将由此获得的pBS4ΔyggB以和实施例6中所述相同的方式引入到ATCC13869菌株的染色体中，并且将载体部分从染色体消除。通过使用所得的卡那霉素敏感菌株的染色体DNA作为模板和SEQID NOS:39和42的合成DNA作为引物进行PCR，以确认将yggB基因破坏。将所得yggB破坏的菌株命名为ATCC13869ΔyggB菌株。

(13-2)体外筛选突变型yggB基因

yggB基因的诱变如下进行。首先，将上述pL5k质粒用XhoI和SalI处理，并自身连接以去除yggB基因之外的区，并且因此获得质粒pL5kXS。SalI识别位点不存于与SEQ ID NO:5的核苷酸序列上，但是存在于pBS3的多克隆位点上。将约10μg所得pL5kXS溶解于含有400mM羟胺和1mM EDTA(pH6.0)的500mM磷酸盐缓冲液中，并且在75℃加热30-90分钟以引入突变。将诱变处理之后的质粒使用SUPREC-02(由TAKARA BIO INC.制造)脱盐，然后通过实施例6所述的方法引入到ATCC13869ΔyggB菌株中。将转化的细胞在含有25μg/ml卡那霉素的CM2B培养基上筛选。作为对照，将没有诱变处理的pL5kXS引入到ATCC13869ΔyggB菌株中。将出现的转化体接种到2ml液体CM2BGU2培养基(实施例3中所述的CM2B培养基，其进一步含有10g/l葡萄糖和15g/l尿素)中，并且在31.5℃摇动培养5小时，随后测定培养液中积累的L-谷氨酸的浓度。

表11显示菌株在CM2BGU2培养基上的培养结果，该菌株通过用突变的pL5kXS转化ATCC13869ΔyggB菌株获得。在用60或90分钟突变的质粒(60,or90-minute mutated plasmid)转化的转化体中，获得引起积累多于1g/L L-谷氨酸的三个菌株。起始培养基中含有的L-谷氨酸的量是0.16g/L，并且由对照ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(没有诱变处理)菌株积累的L-谷氨酸的量是0.31g/L。

表12显示在CM2BGU培养基上培养转化体的结果，所述转化体通过用突变的pL5kXS转化ATCC13869ΔyggB菌株获得，该培养基具有和上述CM2BGU2培养基相同的组成，只是尿素的浓度是1.5g/L。在用90分钟突变质粒转化的转化体中，获得引起积累多于1g/L L-氨基酸的一个克隆。

<表11.用突变质粒转化的菌株的L-谷氨酸产生量>

<表12.用突变质粒转化的菌株的L-谷氨酸产生量>

从用60分钟的突变质粒转化的菌株中提取质粒，该菌株产生表11所示的多于1g/L的L-谷氨酸，并且将所得质粒命名为pL5kXSm-22。还从用60分钟突变的质粒转化的菌株中提取质粒，该菌株产生表12所示的多于0.9g/L的L-谷氨酸，并且将所得质粒命名为pL5kXSm-27。用所述质粒转化ATCC13869菌株，并且将所得菌株分别命名为ATCC13869ΔyggB/pL5kXS和ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27，ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22。将这些菌株在实施例2中所述的条件下培养，并且分析4小时培养之后的L-谷氨酸积累。表13显示三个独立实验的平均值。发现ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27菌株和ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22菌株产生的L-谷氨酸显著多于引入非突变质粒的菌株。这些结果证明，本发明的突变型yggB基因可以通过体外随机诱变获得。pL5kXSm-22中含有的yggB基因的核苷酸序列分别示于SEQ IDNOS:73和75中。pL5kXSm-22质粒具有突变，其在SEQ ID NO:5中用“T”取代在位置2745的“C”，并且导致用Ser取代SEQ ID NO:6在位置437的Pro。而且，此突变伴随在SEQ ID NO:5中用T取代位置3060的“C”的突变(22型突变)。具有此突变的突变型yggB基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:73，并且由该基因编码的突变型YggB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:74。

<表13.用包含突变yggB基因的质粒转化的菌株的L-谷氨酸产生量>

(13-3)将突变型yggB基因引入到棒状杆菌型细菌中和评估L-谷氨酸产生

将(13-2)中获得的突变型yggB基因引入到棒状杆菌型细菌中。引入该基因的方法如下。

将每个突变型yggB基因通过实施例6中所述的方法引入到pBS4S中，并且将所得的质粒用于获得菌株，该菌株中用突变型yggB基因取代染色体上的野生型yggB基因。以与实施例2中相同的方式培养其中引入突变型yggB基因的菌株和对照ATCC13869菌株。在完成培养之后，通过已知方法测量培养基中积累的L-谷氨酸的量，以确认引入所述突变型yggB基因使L-谷氨酸积累增加。在此方法中，可获得具有突变型yggB基因的菌株，其具有增加的产生L-谷氨酸的能力。

实施例14

<评估具有突变型yggB基因的菌株的L-谷氨酸类似物抗性>

(14-1)评估在固体培养基上对4-氟谷氨酸的抗性

预测由于突变型yggB基因的引入具有增强的产生L-谷氨酸的能力的菌株将对于L-谷氨酸类似物具有降低的敏感性(增加的抗性)。因此，如下分析所述菌株对于4-氟谷氨酸的敏感性。

将用NaOH调节至pH6.7并且已过滤灭菌的4-氟谷氨酸溶液添加到实施例4所述的基本培养基，使得4-氟谷氨酸的终浓度是7.5mM。将每个ATCC13869菌株、ATCC13869-L30菌株和ATCC13869-A1菌株涂布到CM-Dex平板上，并且培养过夜。然后，从平板收集细胞，用灭菌的0.85%NaCl溶液洗涤，并且稀释至图6中所述的细胞浓度，点到含有4-氟谷氨酸的平板和不含4-氟谷氨酸的对照平板上，在31.5℃培养。每个菌株的生长时程示于图6。尽管在不存在4-氟谷氨酸时野生型ATCC13869生长快于引入突变型yggB基因的菌株，但在4-氟谷氨酸存在下引入突变型yggB基因的菌株生长快于野生型ATCC13869菌株。

(14-2)评估在液体培养基中对4-氟谷氨酸的抗性

将4-氟谷氨酸添加到具有与实施例4所述相同的组成但不含琼脂的基本液体培养基中，分别达到1.25Mm、2.5mM、5mM、10mM和20mM的终浓度。将每个ATCC13869菌株、ATCC13869ΔyggB菌株、ATCC13869-L30菌株和ATCC13869-A1菌株涂布到CM-Dex平板上，并且在31.5℃培养过夜。然后，收集细胞，并且在用灭菌的0.85%NaCl溶液洗涤之后，将细胞接种到液体培养基中，并且在31.5℃摇动培养。当不含4-氟谷氨酸培养的每个菌株的OD660达到1.0时，终止培养，并且将所得培养物溶液适当地稀释，涂布到CM-Dex平板上过夜。计算出现的菌落的数目，并且指定作为活细胞数。图7显示在将不含4-氟谷氨酸的培养物的细胞数设定为1时，在每个4-氟谷氨酸浓度的相对细胞数。发现ATCC13869-A1菌株和ATCC13869-L30菌株对于4-氟谷氨酸具有降低的敏感性。

这些结果还显示，可以使用L-谷氨酸类似物例如4-氟谷氨酸通过筛选获得具有突变型yggB基因的菌株。

实施例15

<构建yggB基因和odhA基因双突变菌株>

通过将突变型odhA基因引入到上述ATCC13869-L30菌株中来制备yggB基因和odhA基因双突变菌株。

首先，将每个表14所示的突变引入到ATCC13869-L30菌株的染色体上编码α-KGDH的E1o亚基的odhA基因中。在表14中，显示在每个突变型odhA基因中对应于SEQ ID NO:43的核苷酸2528-2562的区域的核苷酸序列。在表15中，显示在由突变型odhA基因编码的每个氨基酸序列中，对应于SEQID NO:44的氨基酸696-707的区域的氨基酸序列。

能够如下获得L30sucA8菌株，其中引入了具有SEQ ID NO:45的核苷酸序列的odhA基因。使用SEQ ID NOS:53和54的引物通过PCR制备突变odhA基因片段。将所得片段用BamHI消化，并且连接到质粒pKF19m的BamHI位点，该质粒pKF19m与Mutan-Super Express Km(Takara Bio)连接。然后，使用具有磷酸化的5’-端的SEQ ID NO:55的引物和Mutan-Super Express Km的选择引物进行PCR，并且将所得PCR产物用于转化sup0-大肠杆菌菌株，例如MV1184菌株，以获得含有突变odhA片段的质粒。将此片段插入到pBS4S质粒中，并且将所得质粒用于转化ATCC13869-L30菌株，以由此获得将所述质粒并入其染色体的菌株。然后，从这些菌株中选择对于蔗糖具有抗性并且对于卡那霉素敏感的菌株。测定所选菌株的odhA基因的核苷酸序列，并且将通过odhA基因中移码突变使α-KGDH功能缺陷的菌株选择作为ATCC13869-L30sucA8(odhA8)菌株。

使用ATCC13869-L30菌株通过类似的方法可获得其它odhA突变菌株。

可通过如上所述的类似的方法获得sucA801菌株，其中引入具有SEQ IDNO:47的核苷酸序列的突变odhA基因，在所述方法中使用具有磷酸化5’端的SEQ ID NO:56的引物代替SEQ ID NO:55的引物。

可通过如上所述的类似的方法获得sucA805菌株，其中引入具有SEQ IDNO:49核苷酸序列的突变odhA基因，在所述方法中使用具有磷酸化5’端的SEQ ID NO:57的引物代替SEQ ID NO:55的引物。

可通过如上所述的类似的方法获得sucA77菌株，其中引入具有SEQ IDNO:51核苷酸序列的突变odhA基因，在所述方法中使用具有磷酸化5’端的SEQ ID NO:58的引物代替SEQ ID NO:55的引物。

L30sucA8菌株不具有细胞内α-KGDH，因为sucA8突变是移码突变，其引起α-KGDH蛋白的未成熟截断(immature truncation)。另一方面，sucA801菌株、sucA805菌株和sucA77菌株具有减少的但还有一些α-KGDH活性，因为这些突变不是移码突变，并且不引起α-KGDH蛋白的未成熟截断。

表14：odhA突变基因的部分核苷酸序列

菌株	odhA基因的核苷酸序列
		ATCC13869-L30	CTG GCT AAG CTG CGT GGC TAC GAC GTC GGA GGC ACC
L30sucA8	CTG GCT AAG CTG CGT C GAC GTC GGA GGC ACC
		L30sucA801	CTG GCT AAG CTG CGT CTC GAC GTC GGA GGC ACC
L30sucA805	CTG GCT AAA AGC TGC GTC GAC GTC GGA GGC ACC
		L30sucA77	CTG GCT ATA AGC TGC GTC GAC GTC GGA GGC ACC

表15：odhA突变体的氨基酸序列

<使用yggB基因和odhA基因双突变菌株产生L-谷氨酸>

通过将所得ygg基因和odhA基因双突变菌株培养在Sakaguchi烧瓶中来评估这些菌株的L-谷氨酸生产力。将表14中列出的每个菌株在CM-Dex琼脂培养基上在31.5℃培养过夜，然后将1/6所述培养物转移到20ml培养基中，该培养基含有60g/l葡萄糖、22.5g/l(NH₄)₂SO₄、1g/l KH₂PO₄、0.4g/lMgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、0.48g/l大豆蛋白水解物和300μg/l生物素(用KOH调节至pH8.0)，添加CaCO₃，并且在31.5℃以115rpm搅拌培养。19小时培养之后积累的L-谷氨酸的量示于表16。sucA801、sucA805和sucA77菌株显示比携带野生型odhA基因的ATCC13869-L30菌株和携带具有移码突变的odhA基因的sucA8菌株更高的L-谷氨酸生产力。这些结果显示，通过将突变引入到odhA基因的硫胺素焦磷酸结合区的近端(proximate)来调控α-KGDH活性，从而有效地产生L-谷氨酸。

表16：odhA突变菌株的L-谷氨酸产生

菌株	L-谷氨酸(g/L)
		ATCC13869-L30	4.9
L30sucA8	19.8
		L30sucA801	22.1
L30sucA805	23.8
		L30sucA77	21.6

实施例16

<破坏ATCC14067yggB8菌株中的odhA基因>

分别在ATCC14067菌株和ATCC14067yggB8菌株中破坏odhA，并且培养所得菌株。首先，构建用于破坏odhA基因的质粒。使用SEQ ID NOS:77和78所示的合成寡核苷酸作为引物和ATCC14067菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以扩增包含(covering)odhA基因N末端区的片段。使用SEQID NOS:79和80的合成寡核苷酸作为引物和ATCC14067菌株的染色体DNA作为模板进行另一个PCR，以扩增包含odhA基因C末端区的片段。随后，使用所述N末端片段和C末端片段的等摩尔量混合物作为模板和SEQ IDNOS:81和82的合成DNA作为引物进行PCR，以制备片段，其中缺失了odhA基因的内部序列。用BamHI消化所得的PCR产物，并将其插入到实施例1构建的pBS4S中，以获得质粒pBSΔsucA47。

用pBSΔsucA47以与实施例6中所述相同的方式转化ATCC14067菌株和实施例11的ATCC14067yggB8，以将缺失型odhA基因引入到染色体中，并且仅去除载体部分。使用SEQ ID NOS:77和80的引物通过PCR从卡那霉素敏感菌株中选择其中odhA基因被破坏的菌株。将由此获得的菌株分别命名为ATCC14067ΔodhA菌株和ATCC14067ΔodhA yggB8菌株。

表17显示根据实施例3所述方法培养ATCC14067ΔodhA菌株和ATCC14067ΔodhA yggB8菌株的结果。发现8型突变yggB基因的引入增强了odhA基因被破坏的菌株的产生L-谷氨酸的能力。

<表17.odhA基因被破坏的菌株和破坏odhA并引入8型突变yggB基因的菌株的L-谷氨酸产生>

实施例17

<破坏yggB突变菌株中的symA基因>

在2A-1R菌株中破坏symA基因，该菌株在实施例3中构建并且具有插入到yggB基因中的IS，与2A-1R菌株相比培养所得菌株。来自ATCC13869菌株的symA基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:86，并且氨基酸序列示于SEQ ID NO:87。首先，构建用于破坏symA基因的目的的质粒。使用SEQ IDNOS:88和89所示的合成寡核苷酸作为引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，以扩增包含symA基因N末端区的片段。使用SEQID NOS:90和91所示的合成寡核苷酸作为引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行另一个PCR，以扩增包含symA基因C末端区的片段。随后，使用所述N末端片段和C末片段的等摩尔量混合物作为模板和SEQ IDNOS:88和91的合成DNA作为引物进行PCR，以制备片段，其中缺失了SymA基因的内部序列。将所得PCR产物用BamHI消化，并且插入到实施例1构建的pBS4S中，以获得质粒pBSΔ1867。

用pBSΔ1867以与实施例6中所述相同的方式转化2A-1R菌株，以将缺失型SymA基因引入到染色体中，并且仅去除载体部分。使用SEQ ID NOS:88和91的引物通过PCR从卡那霉素敏感菌株中选择其中SymA基因被破坏的菌株。将由此所得菌株命名为2A-1RΔSymA菌株。

表18显示根据实施例3中所述的方法培养2A-1RΔSymA菌株和2A-1R菌株的结果。发现SymA基因的缺失进一步增强了引入突变型yggB基因的菌株的产生L-谷氨酸的能力。

<表18.2A-1R菌株和symA基因被破坏的2A-1R菌株的L-谷氨酸产生>

	OD620(×51)	Glu(g/L)
			2A-1R	0.846	12.4
2A-1RΔsymA	0.709	15.8

实施例18

<构建扩增了野生型yggB基因的菌株>

将含有棒状杆菌型细菌的野生型yggB基因的pL5k用于将野生型yggB基因引入到棒状杆菌型细菌中。也可通过使用SEQ ID Nos:59和60的引物和ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，用BamHI消化所扩增的产物，并且将所得片段插入到pVK9的BamHI位点中，来构建具有与pL5k相似结构的质粒。pVK9是穿梭质粒，其通过以下方法获得：将pHSG299(Takara Bio)的AvaII位点平端化，并且在其中插入涉及在棒状杆菌型细菌中自主复制的片段，该片段从pHK4(JP-A-05-007491)用BamHI和KpnI切出。

通过电脉冲方法(JP-A-2-207791)用pL5k转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株。将转化的细胞涂布到CM2B平板培养基(10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl、20g/l琼脂，用KOH调节至pH7.0)上，并且在31.5℃培养一夜。在第二天，将出现的菌落在含有25μg/ml卡那霉素的CM2B平板培养基上纯化，以获得扩增了野生型yggB基因的菌株。通过常规方法从转化体提取质粒，以确定将目标质粒引入。将由此获得的扩增了野生型yggB基因的菌株命名为ATCC13869/pL5k。以与上述相同的方式构建引入pVK9的ATCC13869/pVK9作为对照菌株。

实施例19

<评估扩增了野生型yggB基因的菌株>

(2-1)在生物素有限的培养条件下评估

从扩增了野生型yggB基因的菌株和实施例17中构建的对照菌株中各分离三个克隆，并且将每个克隆接种到20ml的种子培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/lMnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，然后在31.5℃摇动培养。在完全消耗糖之后，将2ml培养物接种到20ml不含生物素的主要培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/lKH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄.7H₂O、0.01g/l FeSO₄.7H₂O、0.01g/l MnSO₄.4-5H₂O、200μg/l VB1、0.48g/l大豆水解产物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高温灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，接着在31.5℃摇动培养。在完全消耗糖之后，测定培养基中的L-谷氨酸浓度。结果，发现扩增了野生型yggB基因的菌株(ATCC13869/pL5k)引起比引入载体的菌株更多的L-谷氨酸积累。(在表19中，OD620是稀释至101倍的培养液在620nm的浊度，并表示细胞量，而GH(g/L)表示已积累的L-谷氨酸的量)。

表19.在生物素有限条件下积累的L-谷氨酸的量

(2-2)在添加表面活性剂的条件下评估

将以上(2-1)中使用的相同克隆接种到20ml种子培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/lMnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，然后在31.5℃摇动培养。在完全消耗糖之后，将2ml培养物接种到20ml的主培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/lMgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，然后在31.5℃摇动培养。从开始培养2小时之后，加入Tween40至终浓度5g/L，并且继续培养。在完全消耗糖之后，测定培养基中的L-谷氨酸浓度。结果，发现扩增了野生型yggB基因的菌株(ATCC13869/pL5k)引起比引入载体的菌株更多的L-谷氨酸积累。

表20在添加表面活性剂的条件下积累的L-谷氨酸的量

(OD620是稀释101倍的培养液在620nm的浊度，并表示细胞量，而GH表示已积累的L-谷氨酸的量。)

(2-3)在添加青霉素G的条件下评估

将以上(2-1)中使用的相同克隆接种到20ml的种子培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，然后在31.5℃摇动培养。在完全消耗糖之后，将2ml培养物接种到20ml的主培养基(80g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/lMgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l VB1、60μg/l生物素、0.48g/l大豆水解物(T-N)，用KOH调节至pH8.0：在115℃高压灭菌10分钟)中，然后将1g灭菌的碳酸钙加入其中，然后在31.5℃摇动培养。在培养2小时之后，加入青霉素G至终浓度0.5U/ml，并且继续培养。在完全消耗糖之后，测定培养基中的L-谷氨酸浓度。结果，发现扩增了野生型yggB基因的菌株(ATCC13869/pL5k)引起比引入载体的菌株更多的L-谷氨酸积累(表21)。

表21在添加青霉素G的条件下积累的L-谷氨酸的量

(OD620是稀释101倍的培养液在620nm的浊度，并表示细胞量，而GH表示已积累的L-谷氨酸的量。)

工业适用性

根据本发明，使用yggB基因来修饰菌株，从而通过使用所述修饰的菌株来有效地产生L-谷氨酸。

尽管已参照本发明的例示性实施方案详细描述了本发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明范围的前提下，能够进行各种改变，和使用等价物(equivalents)。每篇前述的文献通过引用全部并入本文。

Claims (2)

1.产生L-谷氨酸的方法，其包括

在培养基中培养棒状杆菌型细菌，以引起L-谷氨酸在培养基或细菌中的积累，所述棒状杆菌型细菌选自谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌，所述棒状杆菌型细菌具有产生L-谷氨酸的能力；以及

从培养基或细菌中收集L-谷氨酸，其中通过引入突变型yggB基因来修饰所述棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因具有突变，所述突变导致SEQ ID NO:6、62、或84中位置100的丙氨酸被苏氨酸取代，和/或SEQ ID NO:6、62、或84中位置111的丙氨酸被缬氨酸或苏氨酸取代。

2.产生L-谷氨酸的方法，其包括

在培养基中培养棒状杆菌型细菌，以引起L-谷氨酸在培养基或细菌中的积累，所述棒状杆菌型细菌选自谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌，所述棒状杆菌型细菌具有产生L-谷氨酸的能力；以及

从培养基或细菌中收集L-谷氨酸，其中通过引入突变型yggB基因来修饰所述棒状杆菌型细菌，其中所述突变型yggB基因选自下组：

(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的基因，

(c)编码SEQ ID NO:20的氨基酸序列的基因，

(e)编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的基因，

(g)编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列的基因，

(i)编码SEQ ID NO:64的氨基酸序列的基因，和

(m)编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列的基因。