BRPI0519410B1 - método para produzir ácido l-glutâmico - Google Patents

Abstract

BACTÉRIA CORINEFORME, MÉTODOS PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO E UMA BACTÉRIA CORINEFORME, E, GENE yggB TIPO MUTANTE. A bactéria corineforme que é modificada por uso de um gene yggB de modo que a capacidade de produção de ácido L-glutâmico é melhorada como comparada com uma cepa não modificada é cultivada em um meio para causar acúmulo de ácido L-glutâmico no meio ou nas células bacterianas, e ácido L-glutâmico é coletado do meio ou das células.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um microorganismo produtor de ácido L-glutâmico e a um método para produzir ácido L-glutâmico usando o microorganismo. Ácido L-glutâmico é amplamente usado na indústria alimentícia, por exemplo, como uma matéria prima na produção de temperos.

Breve Descrição da Arte Relacionada

[0002] Ácido L-glutâmico tem sido convencionalmente produzido em uma escala industrial por métodos de fermentação usando bactérias corineformes que tem capacidade de produção de ácido L-glutâmico, como bactérias pertencendo ao gênero Brevibacterium ou Corynebacterium. Para este fim, cepas isoladas da natureza, ou seus mutantes artificiais tem sido usadas.

[0003] Geralmente, cepas tipo selvagem de bactérias corineformes não produzem ácido L-glutâmico quando biotina em excesso está presente. Assim, a produção de ácido L-glutâmico por bactérias corineformes é tipicamente realizada sob condições limitadas em biotina ou um tensoativo a ou penicilina é adicionado a um meio de cultura (Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(7), p1109-1112). Por outro lado, cepas mutantes que podem produzir ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso são usadas para a produção de ácido L-glutâmico. Estas cepas incluem a cepa sensível à temperatura - tensoativo (WO99/02692), uma cepa sensível à penicilina (JP- A-55-0124492), e uma cepa sensível a lisozima (WO00/14241). No entanto, estas cepas mutantes com freqüência mostram uma diminuição em ácido graxo ou síntese de parede celular, e se nota alguma dificuldade na produção de L-glutâmico usando estas cepas enquanto mantendo crescimento suficiente das cepas.

[0004] Entretanto, uma cepa geneticamente modificada cepa em que um gene codificando ácido a-cetoglutárico desidrogenase (α-KGDH) é rompido tem sido usada para produzir ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso (WO95/34672). No entanto, estas cepas deficientes em gene α-KGDH crescem lentamente porque o ciclo TCA é bloqueado na metade do caminho, e é difícil obter uma quantidade suficiente de células requeridas para a produção de ácido L-glutâmico.

[0005] O gene yggB de bactérias corineformes é um homologo do gene yggB de Escherichia coli (FEMS Microbiol Lett. 2003, 218(2), p305- 309, Mol Microbiol. 2004, 54(2), p420-438), e foi relatado como sendo um tipo de canal mecano-sensível (EMBO J. 1999, 18(7):1730-7.). No entanto, seu efeito sobre a produção de ácido L-glutâmico não foi previamente relatado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Um objeto da presente invenção é prover um novo método para melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme.

[0007] Os inventores da presente invenção fizerem estudos extensivos para alcançar este objeto, e verificaram que a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme pode ser melhorada por aumento da expressão do gene yggB tipo selvagem. Além disso, genes yggB tipo mutante que melhoram a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso assim como em condições normais de produção de ácido L-glutâmico foram obtidos, e assim realizaram a presente invenção.

[0008] É um objeto da presente invenção prover uma bactéria corineforme tendo capacidade de produção de ácido L-glutâmico, em que referida bactéria corineforme é modificada por uso de um gene yggB de modo que capacidade de produção de ácido L-glutâmico da cepa é melhorada como comparado com uma cepa não modificada.

[0009] É um objeto da presente invenção prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB é selecionado dentre o grupo consistindo de: (a) um DNA compreendendo nucleotídeos 1437 a 3035 de SEQ ID No: 5, (b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência nucleotídica complementar aos nucleotídeos 1437 a 3035 de SEQ ID No: 5 ou uma sonda preparada a partir dos nucleotídeos sob condições estringentes, e em que referido DNA aumenta a capacidade de produção de ácido L- glutâmico de uma bactéria corineforme quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme, (c) um DNA compreendendo nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID No: 61, (d) um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência nucleotídica complementar aos nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID No: 61 ou uma sonda preparada a partir dos nucleotídeos sob condições estringentes, e em que referido DNA aumenta a capacidade de produção de ácido L- glutâmico de uma bactéria corineforme quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme, (e) um DNA compreendendo nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID No: 67, (f) um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência nucleotídica complementar aos nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID No: 67 ou uma sonda preparada a partir dos nucleotídeos sob condições estringentes, e em que referido DNA aumenta a capacidade de produção de ácido L- glutâmico de uma bactéria corineforme quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme, (g) um DNA compreendendo nucleotídeos 501 a 2099 de SEQ ID No: 83, e (h) um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência nucleotídica complementar aos nucleotídeos 501 a 2099 de SEQ ID No: 83 ou uma sonda preparada a partir dos nucleotídeos sob condições estringentes, e em que referido DNA aumenta a capacidade de produção de ácido L- glutâmico de uma bactéria corineforme quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme.

[00010] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB codifica uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de: (A) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 e 85, e (B) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 e 85, pelo que um ou vários aminoácidos na referida proteína são substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados, e referido gene yggB aumenta a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme.

[00011] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida bactéria corineforme é modificada de modo a melhorar expressão do gene yggB como comparado com uma cepa não modificada.

[00012] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que expressão do gene yggB é melhorada por aumento do número de cópias do gene yggB ou modificação de uma sequência de regulação da expressão do gene yggB.

[00013] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida bactéria corineforme é modificada por introdução de um gene yggB tipo mutante.

[00014] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB tipo mutante tem uma mutação em uma região codificando aminoácidos 419-533 de SEQ ID NO: 6, 68, 84 ou 85, ou aminoácidos 419-529 de SEQ ID NO: 62.

[00015] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida mutação é deleção de referida região.

[00016] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida mutação é inserção de uma sequência de inserção ou transposon dentro da região.

[00017] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB tipo mutante tem uma mutação que resulta em substituição da prolina na referida região com outro aminoácido.

[00018] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB tipo mutante tem uma mutação que resulta em substituição da prolina na posição 424 e/ou a prolina na posição 437 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 ou 85 com outro aminoácido.

[00019] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB tipo mutante tem uma mutação na região de codificação de transmembrana da proteína yggB.

[00020] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida região de codificação de transmembrana é selecionada dentre o grupo consistindo de aminoácidos 1-23, aminoácidos 25-47, aminoácidos 62-84, aminoácidos 86-108, e aminoácidos 110-132 de SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 ou 85.

[00021] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida mutação é introduzida sem causar a mudança de fase.

[00022] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB tipo mutante tem uma mutação que resulta em substituição da alanina na posição 100 e/ou a alanina na posição 111 na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 ou 85 com outro aminoácido.

[00023] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene yggB tipo mutante tem uma mutação que resulta em inserção de pelo menos um aminoácido entre leucina na posição 14 e triptofano na posição 15 em SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 ou 85.

[00024] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que resistência a análogos de ácido L-glutâmico de referida cepa é aumentada por introdução do gene yggB tipo mutante.

[00025] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida bactéria corineforme é ainda modificada para inativar um gene que suprime uma função do referido gene yggB mutante.

[00026] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referido gene que suprime uma função do referido gene yggB mutante é um gene symA e em que referido gene symA é selecionado dentre o grupo consistindo de: (a) um DNA compreendendo nucleotídeos 585 a 1121 de SEQ ID No: 86, (b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência nucleotídica complementar a nucleotídeos 585 a 1121 de SEQ ID No: 86, ou uma sonda preparada a partir de referidos nucleotídeos sob condições estringentes, e em que referido DNA suprime uma função de referido gene yggB tipo mutante em uma bactéria corineforme.

[00027] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida bactéria corineforme é ainda modificada de modo a diminuir a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase.

[00028] É um outro objeto prover a bactéria corineforme como descrita acima, em que referida bactéria corineforme é uma bactéria pertencendo ao gênero Corynebacterium ou o gênero Brevibacterium.

[00029] É um objeto da presente invenção prover um método para produzir ácido L-glutâmico compreendendo cultivar a bactéria corineforme como descrito em um meio de modo a causar acúmulo de ácido L-glutâmico no meio ou células, e coletar ácido L-glutâmico do meio ou as células.

[00030] É um objeto da presente invenção prover um gene yggB tipo mutante selecionado dentre o grupo consistindo de: (a) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, (b) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 8, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme sob condição contendo biotina em excesso quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme, (c) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, (d) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 20, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando referido gene é introduzido na bactéria corineforme, (e) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, (f) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 22, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando referido gene é introduzido em uma bactéria corineforme, (g) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24,(h) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 24, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando referido gene é introduzido na bactéria corineforme, (i) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (j) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 64, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando referido gene é introduzido na bactéria corineforme, (k) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, (l) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 70, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme, (m) um gene codificando sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, (n) um gene codificando uma proteína tendo uma homologia de não menos que 80% para SEQ ID NO: 74, e tendo uma função para aumentar capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando referido gene é introduzido na bactéria corineforme.

[00031] É um objeto da presente invenção prover um método para produzir uma bactéria corineforme tendo um gene yggB tipo mutante, compreendendo inocular uma bactéria corineforme que é deficiente em um gene codificando α-cetoglutarato desidrogenase em um meio contendo biotina em excesso, e selecionar uma cepa que é capaz de acumular ácido L- glutâmico no meio como uma cepa tendo um gene yggB tipo mutante.

[00032] É um objeto da presente invenção prover um método para produzir uma bactéria corineforme tendo um gene yggB tipo mutante, compreendendo inocular uma bactéria corineforme introduzida com um gene yggB em que mutação é introduzida aleatoriamente in vitro em um meio contendo biotina em excesso, e selecionar uma cepa que é capaz de acumular ácido L-glutâmico no meio como uma cepa tendo um gene yggB tipo mutante.

[00033] É um objeto da presente invenção prover um método para produzir uma bactéria corineforme tendo um gene yggB tipo mutante, compreendendo inocular uma bactéria corineforme introduzida com um elemento transposável aleatoriamente em um cromossomo em um meio contendo biotina em excesso, e selecionar uma cepa que é capaz de acumular ácido L-glutâmico no meio como uma cepa tendo um gene yggB tipo mutante.

[00034] É um objeto da presente invenção prover um método para produzir uma bactéria corineforme tendo um gene yggB tipo mutante, compreendendo inocular uma bactéria corineforme em um meio contendo análogos de ácido L-glutâmico, e selecionar uma cepa que cresce no referido meio.

[00035] É um objeto da presente invenção prover o método para produzir uma bactéria corineforme como descrita acima, em que a cepa tendo o gene yggB tipo mutante é uma bactéria corineforme, como descrito acima.

[00036] É um objeto da presente invenção prover o método de produzir uma bactéria corineforme como descrita acima, em que o meio contendo biotina em excesso é um meio contendo 30 μg/l ou mais de biotina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00037] Fig. 1 mostra o procedimento para construir plasmídeo pBS3.

[00038] Fig. 2 mostra o procedimento para construir plasmídeo pBS4S.

[00039] Fig. 3 mostra o procedimento para construir plasmídeo pBS4sucAint.

[00040] Fig.4 é um gráfico mostrando o acúmulo de ácido L-glutâmico pelo cepa introduzida no gene yggB tipo mutante e a cepa de controle.

[00041] Fig. 5 mostra a mutação tipo 2A-1 no gene yggB.

[00042] Fig. 6 é a fotografia que mostra a resistência da cepa introduzida nos genes yggB tipo mutante de um ácido 4-fluoroglutâmico em meio de placa CM-Dex.

[00043] Fig.7 mostra crescimento da cepa de controle e a cepa introduzida nos genes yggB tipo mutante em um meio líquido contendo ácido 4-fluoroglutâmico (4-FG).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLARES

[00044] Abaixo, a presente invenção é explicada em maiores detalhes. <1>Bactéria corineforme da presente invenção

[00045] A bactéria corineforme da presente invenção tem a capacidade de produção de ácido L-glutâmico, e é modificada usando um gene yggB de modo que a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da cepa é melhorada como comparada com uma cepa não modificada.

[00046] Na presente invenção, exemplos de bactéria corineforme incluem bactérias corineformes convencionais, e também incluem bactérias que foram classificadas dentro do gênero Brevibacterium, mas são atualmente classificadas dentro do gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)), assim como as bactérias Brevibacterium que estão muito próximas das bactérias Corynebacterium. Exemplos desta bactéria corineforme incluem os seguintes: Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum

[00047] Seguir: Exemplos específicos das bactérias corineformes são como a seguir: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511 Corynebacterium callunae ATCC15991 Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060 Corynebacterium lilium ATCC15990 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC13868 Brevibacterium divaricatum ATCC14020 Brevibacterium flavum ATCC13826, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC14068 Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869 Brevibacterium roseum ATCC13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872 Brevibacterium album ATCC15111 Brevibacterium cerinum ATCC15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354

[00048] Estas cepas são disponíveis do American Type Culture Collection (ATCC, Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). Isto é, cada cepa recebe um número de registro único que é listado no catálogo do ATCC. Cepas podem ser ordenadas usando este número de registro. A cepa AJ12340 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology a Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japan) em 27 de outubro de 1989 sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-1539. A cepa AJ12418 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry em 5 de Janeiro de 1989 sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-2205.

[00049] A bactéria corineforme da presente invenção tem a capacidade de produção de ácido L-glutâmico. "Capacidade de produção de ácido L- glutâmico"significa uma capacidade para causar acúmulo de uma quantidade suficiente de ácido L-glutâmico em um meio quando a bactéria corineforme da presente invenção é cultivada no meio. Capacidade de produção de ácido L-glutâmico pode ser uma propriedade de uma cepa parental da qual a bactéria corineforme da presente invenção é criada, porque a maior parte das cepas de tipo selvagem de bactéria corineforme produz ácido L-glutâmico sob condições de produção de ácido L-glutâmico como descrito abaixo. Mesmo assim, capacidade de produção de ácido L-glutâmico pode ser conferida ou melhorada por uma mutação, técnica de recombinação de genes, etc. como mencionado abaixo. Além disso, a capacidade de produção de ácido L- glutâmico pode ser conferida por melhora da expressão do gene yggB.

[00050] A expressão "capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme é melhorada” significa que uma bactéria corineforme da presente invenção tem uma capacidade melhorada para produzir ácido L- glutâmico comparado a uma cepa não modificada. Exemplos de cepas não modificadas incluem Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 13869, 14067, e Corynebacterium melassecola ATCC 17965. A cepa não modificada também pode incluir uma que expressa o gene yggB de tipo selvagem ao mesmo nível que as cepas de tipo selvagem ou uma em que a mutação não é introduzida dentro da região de codificação de um gene yggB.

[00051] Um exemplo de um método para conferir capacidade de produção de ácido L-glutâmico inclui melhorar a expressão de um gene codificando uma enzima biossintética de ácido L-glutâmico. Exemplos das enzimas envolvidas em biossíntese de ácido L-glutâmico incluem glutamato desidrogenase, glutamine sintetase, glutamato sintetase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato cinase, fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato cinase, gliceraldesídeo-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, fructose bisfosfato aldolase, fosfofructocinase, e glicose fosfato isomerase.

[00052] A melhora da expressão destes genes pode ser realizada do mesmo modo que a melhora da expressão do gene yggB descrito abaixo.

[00053] Exemplos de microorganismos que foram modificados de modo que a expressão do gene de citrato sintase, gene de isocitrato desidrogenase, gene de piruvato desidrogenase, e/ou gene de glutamato desidrogenase é/ são melhorada (s), incluem os microorganismos descritos em WO00/18935 e JP2000-232890A (EP1010755A).

[00054] A modificação para conferir capacidade de produção de ácido L-glutâmico inclui diminuir ou eliminar uma atividade de uma enzima que catalisa a reação para a síntese de um composto diferente de ácido L- glutâmico, e a ramificação de uma via biossintética de L-glutâmico. Exemplos destas enzimas incluem isocitrato liase, α-cetoglutarato desidrogenase, acetil fosfato transferase, acetato cinase, acetohidroxi acido sintase, acetolactato sintase, acetil formato transferase, lactato desidrogenase, e glutamato decarboxilase. Exemplos de cepas em que atividade α-cetoglutarato desidrogenase é diminuída incluem as seguintes cepas: Brevibacterium lactofermentum cepa ΔS (WO95/34672) Brevibacterium lactofermentum cepa AJ12821 (FERM BP- 4172; FR9401748) Brevibacterium flavum cepa AJ12822 (FERM BP-4173; FR9401748) Brevibacterium glutamicum cepa AJ12823 (FERM BP-4174; FR9401748)

[00055] Para diminuir ou eliminar a atividade das enzimas como descrito acima, a mutação ou deleção que causa a diminuição ou perda da atividade das enzimas pode ser introduzida dentro dos genes das enzimas no cromossomo. Isto pode ser obtido, por exemplo, rompendo o gene codificando a enzima no cromossomo, ou por modificação de uma sequência de controle de expressão como um promotor e/ou sequência do gene Shine Dargarno (SD). Além disso, as atividades destas enzimas podem ser diminuídas ou eliminadas por introdução de uma mutação sentido errado que causa uma substituição de aminoácido, uma mutação não sentido que gera um códon de parada, ou uma mutação de mudança de fase que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos em uma região de codificação, ou por deleção de uma porção ou o gene completo (Journal of biological Chemistry 272:8611- 8617 (1997)). Por exemplo, atividades destas enzimas podem ser diminuídas ou eliminadas por construção de um gene codificando uma enzima mutante, em que sua região de codificação é deletada e substituindo um gene cromossômico com o gene resultante por recombinação homóloga, ou por introdução de um transposon ou um fator IS nestes genes.

[00056] Por exemplo, introdução de mutações para diminuir ou eliminar a atividade das enzimas acima descritas por recombinação de genes pode ser realizada como a seguir. Isto é, um gene de tipo mutante é construído por modificação de uma sequência parcial de um gene de marcação de modo que uma enzima normal não é produzida, e o gene tipo mutante é usado para transformar uma bactéria corineforme para causar recombinação com o gene alvo em um cromossomo, e assim, um gene alvo em um cromossomo pode ser substituído com o gene tipo mutante. Esta ruptura de genes por substituição de genes usando recombinação homóloga já é estabelecida, e inclui um método que emprega DNA linear ou um método que emprega um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura (patente US 6,303,383, ou JP-A-05-007491). Exemplos de plasmídeos sensíveis a temperatura para bactérias corineformes incluem p48K e pSFKT2 (Patente US 6303383), pHSC4 (Publicação acessível ao público de patente FR No. 2667875, 1992 e JP5-7491A), e outros. Em bactérias corineformes, estes plasmídeos podem ser autonomamente replicados pelo menos a uma temperatura de 25°C, mas não podem ser autonomamente replicados a uma temperatura de 37°C. pHSC4 abrigando a cepa AJ12571 foi depositado no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology a Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japan) em 26 de agosto de 1991 sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-3524.

[00057] A ruptura de gene por substituição de genes usando a acima mencionada recombinação homóloga também pode ser realizada por uso de um plasmídeo que não é replicável em bactérias corineformes. Um plasmídeo que não é replicável em bactérias corineformes e é replicável em bactérias Escherichiaé preferivelmente usado. Exemplos deste plasmídeo incluem pHSG299 (Takara Bio) e pHSG399 (Takara Bio).

[00058] Um gene cromossômico codificando uma das acima mencionadas enzimas pode ser substituído com gene de tipo deleção, por exemplo, por recombinação homóloga usando sacB (Schafer, A. et al., Gene 145 (1994) 69-73). O gene sacB codifica levan sucrase e é usado para efetivamente selecionar cepas em que um alvo de gene cromossômico é substituído por um gene mutante, e uma porção de vetor é curada a partir do cromossomo (WO2005/113745, e WO2005/113744).

[00059] Primeiro, um plasmídeo recombinante é preparado por inserção em um gene de tipo de deleção (mutante), um gene sacB, e um marcador de seleção como gene resistente a cloranfenicol em um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura. O plasmídeo é então introduzido em uma cepa hospedeira de bactéria corineforme. Quando levan sucrase é expressado em bactéria corineforme, levan gerado pela conversão de sacarose é letal para a bactéria, e, assim, a bactéria não pode crescer em meio contendo sacarose. Assim, ao cultivar em uma placa contendo sacarose, as cepas em que a substituição ocorre entre o gene mutante no plasmídeo e um gene cromossômico, e que as outras porções do plasmídeo são curadas a partir da célula, podem ser selecionados.

[00060] Exemplos do gene sacB incluem os seguintes: Bacillus subillus: sacB Acesso GenBank No. X02730 (SEQ ID NO: 11) Bacillus amyloliqufaciens : sacB Acesso GenBank Número X52988 Zymomonas mobilis:sacB Acesso GenBank Número L33402 Bacillus stearothermophilus:surB Acesso GenBank Número U34874 Lactobacillus sanfranciscensis:frfA Acesso GenBank Número AJ508391 Acetobacter xylinus : IsxA Acesso GenBank Número AB034152 Gluconacetobacter diazotrophicus:lsdA Acesso GenBank No. L41732

[00061] A cepa transformante é cultivada a uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura funciona (por exemplo 25oC), para obter a cepa em que o plasmídeo foi introduzido. Então, o transformante é cultivado a uma temperatura elevada em que a origem de replicação sensível a temperatura não funciona (por exemplo 34 oC) para curar o plasmídeo sensível a temperatura, e espalhado em um meio de placa meio contendo uma droga antibiótica como canamicina. Apesar das cepas das quais o plasmídeo é curado não poderem crescer em uma placa contendo esta droga antibiótica, algumas cepas em que o gene cromossômico é substituído com o gene mutante podem crescer e aparecer como colônias.

[00062] Em uma cepa em que o DNA recombinante contendo o gene mutante é integrado dentro do DNA cromossômico, o DNA recombinante recombina com o gene que originalmente existia no cromossomo, e os genes de fusão do gene cromossômico e do gene mutante são inseridos dentro da cromossomo de modo que as outras porções do DNA recombinante (segmento de vetor, origem de replicação sensível a temperatura e marcador de resistência a antibiótico) estão presentes entre os genes de fusão. Então, a fim de deixar somente o gene mutante no DNA cromossômico, uma cópia do gene é eliminada junto com o segmento do vetor (incluindo a origem de replicação sensível a temperatura e o marcador de resistência a antibiótico) do DNA cromossômico. Neste caso, o gene nativo é deixado no DNA cromossômico e o gene mutante é excisado do DNA cromossômico, ou ao contrário, o gene mutante é deixado no DNA cromossômico e o gene nativo é excisado do cromossomo DNA. Em ambos os casos, o DNA excisado é mantido em células de bactéria corineforme quando a bactéria corineforme é cultivada a uma temperatura na origem de replicação sensível a temperatura pode funcionar. Então, um gene no plasmídeo é curado das células junto com o plasmídeo por cultivo da bactéria corineforme a uma temperatura em a origem de replicação sensível a temperatura não pode funcionar. No caso de usar um gene sacB, cepas das quais o plasmídeo é curado podem ser efetivamente obtidas por cultivo da bactéria corineforme em um meio contendo sacarose. Cepas em que um gene alvo é substituído com um gene tipo mutante ou tipo de deleção pode ser obtido por seleção de cepas em que a mutação é introduzida dentro de um gene alvo a partir das cepas curadas em plasmídeo.

[00063] A capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser afetada por triagem para uma cepa resistente a análogos de ácido orgânico, inibidores respiratórios ou geradores de superóxido, ou por triagem para uma cepa sensível a inibidores de síntese de parede celular. Exemplos destes métodos incluem conferir resistência a monofluoroacetato (JP50-113209A), conferir resistência a adenina ou timina (JP57-065198A), conferir resistência a ácido malonico (JP52-038088A), atenuar a atividade urease ((JP52- 038088A), conferir resistência a benzopirona ou naftoquinona (JP56-1889A), conferir resistência a HOQNO (JP56-140895A), conferir resistência a ácido a-cetomalônico (JP57-2689A), conferir resistência a guanidina (JP56- 35981A), conferir resistência a daunomicina (JP58-158192A), e conferir sensibilidade a penicilina (JP04-88994A).

[00064] Exemplos específicos destas bactérias incluem as seguintes cepas: Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632; JP50- 113209A) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; JP57- 065198A) Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; JP56- 1889A) Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; JP56- 1889A) Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; JP57- 2689A) Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; JP57- 2689A) Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM P-5472; JP56- 140895A) Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM P-5136; JP56- 35981A) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; JP04- 88994A) Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P5123 JP56- 048890A) Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P5137 JP56- 048890A) Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P6402 JP58- 158192A)

[00065] A bactéria corineforme da presente invenção pode ser obtida por modificação da bactéria corineforme acima descrita tendo a capacidade de produção de ácido L-glutâmico usando um gene yggB de modo que a capacidade de produção de ácido L-glutâmico é ainda melhorada. Alternativamente, modificação usando um gene yggB pode ser realizada primeiro, seguido por modificação adicional para conferir ou melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico.

[00066] Modificação usando um gene yggB inclui, mas não é limitada à melhora da expressão de um gene yggB em uma bactéria corineforme e introdução da mutação em um gene yggB em uma bactéria corineforme. <I> Melhora da expressão de um gene yggB

[00067] Um gene yggB codifica um tipo de canal mecano-sensível (mechanosensitive channel, também conhecido como mechanosensitive ion channel ou strech-gated ion channels), que é também referido como "mscS" (FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9).

[00068] Melhora expressão de um gene yggB em bactéria corineforme leva ao aperfeiçoamento da capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme como comparado com uma cepa não modificada. Isto é, quando a cepa de bactéria corineforme que foi modificada de modo que a expressão do gene yggB é aumentada com relação a uma cepa não modificada, como a cepa tipo selvagem, a cepa causa acúmulo de mais ácido L-glutâmico, ou produz ácido L-glutâmico em uma taxa maior, do que a cepa não modificada. Prefere-se que a melhora da expressão de um gene yggB leva a um aumento em uma quantidade de ácido L-glutâmico produzido por mais do que 2% (rendimento por açúcar consumido), mais preferivelmente mais do que 4%, e ainda mais preferivelmente mais do que 6%, como comparado com uma cepa não modificada. Alternativamente, o rendimento de ácido L- glutâmico per carbono (açúcar), diferente de carbono usado para geração de células bacterianas, pode ser aumentado por aumento da expressão de um gene yggB.

[00069] Apesar do nível de expressão de um gene yggB poder ser em qualquer nível desde que aumentado com relação a uma cepa não modificada em que expressão do gene yggB não é melhorada, expressão é preferivelmente aumentada não menos que 1,5 vezes, mais preferivelmente não menos que 2 vezes, e ainda mais preferivelmente não menos que 3 vezes com relação a uma cepa não modificada. O nível de expressão do gene yggB pode ser determinado por medida da quantidade de mRNA do gene yggB. Métodos de determinação do nível de expressão incluem hibridização Northern e RT-PCR (Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)). Um exemplo de uma bactéria corineforme de tipo selvagem que pode ser usada como um controle Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, ATCC13032, ATCC14067 e C. melassecola cepa ATCC 17965.

[00070] A capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme que foi modificada usando um gene yggB pode ser melhorada como comparado com uma cepa não modificada ou sob condições de produção de ácido L-glutâmico e/ou na presença de biotina em excesso. Aqui, o “condições produtoras de ácido L-glutâmico” incluem quando a substância que induz a produção de ácido L-glutâmico é adicionada a um meio convencional que contém uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, sais inorgânicos, e uma quantidade de traço de materiais orgânicos, como aminoácidos e vitaminas, se necessário, e quando a quantidade de uma substância que inibe a produção de ácido L-glutâmico é limitada em tal meio convencional. As substâncias que induzem a produção de ácido L-glutâmico incluem penicilina e tensoativos contendo ácido graxo saturado, como Tween 40 (Marca registrada). A substância que inibe a produção de ácido L- glutâmico inclui biotina (Amino acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press 1986). A concentração de penicilina no meio é preferivelmente não menos que 0,1 U/ml, mais preferivelmente não menos que 0,2 U/ml, e ainda mais preferivelmente não menos que 0,4 U/ml. A concentração de tensoativos no meio é preferivelmente não menos que 0,5 g/L, mais preferivelmente não menos que 1 g/L, e ainda mais preferivelmente não menos que 2 g/L. A concentração de biotina adicionada a um meio sob condições de produção de ácido L-glutâmico é preferivelmente menor que 15 μg/L, mais preferivelmente menor que 10 μg/L, e ainda mais preferivelmente menor que 5 μg/L. As condições de produção de ácido L-glutâmico podem não conter biotina de todo.

[00071] Por outro lado, as condições contendo biotina em excesso- podem ser condições contendo não menos que 30 μg/L biotina, mais preferivelmente não menos que 40 μg/L, e ainda mais preferivelmente não menos que 50 μg/L.

[00072] Exemplos de um gene yggB de bactérias corineformes incluem um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 6, um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 62, um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 68, e um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 84. Exemplos específicos de um gene yggB de bactérias corineformes incluem nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID No: 5, nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID No: 61, nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID No: 67, e nucleotídeos 501 a 2099 de SEQ ID No: 83. A sequência nucleotídica de nucleotídeos 501-2099 de SEQ ID No: 83 é o gene yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, e corresponde a números de nucleotídeo 1336092-1337693 na sequência de genoma de Acesso GenBank No. NC_003450, e é registrado como NCgl 1221 (NP_600492. Reports small-conductance mechanosensitive channel...[gi:19552490]). A sequência nucleotídica de nucleotídeos 1437- 3035 de SEQ ID No: 5 é o gene yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC13869. A sequência nucleotídica de nucleotídeos 507-2093 de SEQ ID No: 61 é o gene yggB de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) ATCC14067. A sequência nucleotídica de nucleotídeos 403-2001 de SEQ ID No: 67 é o gene yggB de Corynebacterium melassecola ATCC17965. Além disso, porque a sequência nucleotídica de um gene yggB pode diferir dependendo da espécies e cepas, o gene yggB usado na presente invenção pode ser uma variante de uma sequência nucleotídica de nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID No: 5. Uma variante do gene yggB pode ser pesquisada usando a sequência nucleotídica de nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID No: 5, por exemplo, por BLAST (//blast.genome.jp/). Uma variante do gene yggB inclui um gene obtido por PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 75 e 76. um gene yggB podem ser um gene derivado de outros microorganismos desde que seja capaz de aumentar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactérias corineformes. Um gene yggB pode ser yggB tipo mutante, como descrito abaixo.O gene yggB usado na presente invenção não é limitado a um gene codificando uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, 62, 68, ou 84, e também pode incluir um gene codificando uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 62, 68, ou 84, assim um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados em uma ou mais posições, enquanto retendo a possibilidade de melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme quando o gene é introduzido na bactéria corineforme. Apesar do número de “vários” resíduos de aminoácidos referidos aqui pode diferir dependendo das posições na estrutura tri-dimensional ou tipos de resíduos de aminoácidos da proteína, eles podem ser preferivelmente 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10, particularmente preferivelmente 2 a 5. O gene yggB preferivelmente codifica uma proteína que é não menos que 80% homóloga, mais preferivelmente não menos que 90% homóloga, ainda mais preferivelmente não menos que 95% homóloga, e particularmente preferivelmente não menos que 97% homóloga, para uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 ou 85, enquanto mantendo a capacidade de melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme. Homologia entre sequência de aminoácidos assim como sequências nucleotídicas pode ser determinada por algoritmos incluindo BLAST desenvolvido por Karlin e Altschul (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)) e FASTA desenvolvido por Pearson (Metod Enzymol., 183, 63 (1990)). Os programas de busca de homologia incluindo BLASTN e BLASTP foram desenvolvidos com base no algoritmo (disponível a //www.ncbi.nlm.nih.gov).

[00073] A substituição acima mencionada é preferivelmente uma substituição conservativa. No caso de aminoácidos aromáticos, substituições conservativas incluem substituições de phe, trp, e tyr entre si. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, as substituições conservativas incluem substituições de leu, ile, e val entre si. No caso de aminoácidos polares, substituições conservativas incluem substituições de gln e asn entre si. No caso de aminoácidos básicos, substituições conservativas incluem substituições de arg, lys, e his entre si. No caso de aminoácidos ácidos, substituições conservativas são substituições de asp e glu entre si. No caso de aminoácidos contendo grupo hidroxila, substituições conservativas são substituições de ser e thr entre si. As substituições conservativas também incluem: substituição de Ser ou Thr para Ala, substituição de Gln, His, ou Lys para Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His, ou Asp para Asn, substituição de Asn, Glu, ou Gln para Asp, substituição de Ser ou Ala para Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg para Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys, ou Asp para Glu, substituição de Pro para Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr para His, substituição de Leu, Met, Val, ou Phe para Ile, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe para Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His, ou Arg para Lys, substituição de Ile, Leu, Val, ou Phe para Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu para Phe, substituição de Thr ou Ala para Ser, substituição de Ser ou Ala para Thr, substituição de Phe ou Tyr para Trp, substituição de His, Phe, ou Trp para Tyr e substituição de Met, Ile, ou Leu para Val.

[00074] Especialmente, os seguintes aminoácidos podem ser substituídos ou deletados na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. A sequência de aminoácidos do gene YggB que é conservada dentre as bactérias corineformes é mostrada em SEQ ID NO: 85, isto é, uma sequência de consenso. O resíduo Xaa mostrado em SEQ ID NO: 85 pode ser substituído ou deletado. Glu na posição 48 (preferivelmente substituído por Arg) Asp na posição 275 (preferivelmente substituído por Ser) Glu na posição 298 (preferivelmente substituído por Ala) Ala na posição 343 (preferivelmente substituído por Val) Phe na posição 396 (preferivelmente substituído por Ile) Ser na posição 438 (preferivelmente substituído por Gly) Val na posição 445 (preferivelmente substituído por Ala) Ala na posição 454 (preferivelmente substituído por Val) Pro na posição 457 (preferivelmente substituído por Ser) Ser na posição 474 (preferivelmente substituído por Asp) Val na posição 517 (preferivelmente deletado) Glu na posição 518 (preferivelmente deletado) Ala na posição 519 (preferivelmente deletado) Pro na posição 520 (preferivelmente deletado)

[00075] O homólogo do gene yggB acima descrito ode ser obtido por modificação de uma sequência nucleotídica de nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID No: 5, nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID No: 61, nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID No: 67, ou nucleotídeos 501 a 2099 de SEQ ID No: 83 por, por exemplo, mutagenes específica de sítio, de modo que substituição, deleção, inserção, ou adição de um resíduo de aminoácido ou resíduos ocorrem em um sítio especificado na proteína codificada. Além disso, este tal gene pode ser também obtido por um tratamento de mutação convencionalmente conhecido. Exemplos do tratamento de mutação incluem tratar um gene tendo a sequência nucleotídica de nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID No: 5, nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID No: 61, nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID No: 67, ou nucleotídeos 501 a 2099 de SEQ ID No: 83 in vitro com hidroxilamina, e tratar um microorganismo, por exemplo, uma bactéria de Escherichia, abrigando o gene com irradiação de raios- ultravioletas ou um agente de mutagênese tipicamente usado em tratamento de mutação, como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou EMS (metanossulfonato de etila). A mutação para a substituição, deleção, inserção, adição, inversão, ou outros de resíduo de aminoácidos descrito acima também inclui a mutação de ocorrência natural surgindo de diferenças individuais e diferenças em espécies de microorganismos abrigando o gene yggB (mutante ou variante). O fato destes genes serem capazes de melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme pode ser confirmado por, por exemplo, expressão do genes em uma bactéria corineforme de tipo selvagem e determinando se a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da obtida bactéria corineforme foi melhorada com relação a uma cepa não modificada, como a cepa tipo selvagem.

[00076] O gene yggB também pode ser um DNA que é capaz de hibridizar com um DNA tendo a sequência nucleotídica complementar aos nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID No: 5, nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID No: 61, nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID No: 67, ou nucleotídeos 501 a 2099 de SEQ ID No: 83, ou uma sonda que pode ser preparada a partir de qualquer uma destas sequências nucleotídicas sob condições estringentes e é capaz de melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme.

[00077] “Condições estringentes” como usado aqui são condições sob as quais um assim chamado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Exemplos de condições estringentes incluem as em que os DNAs altamente homólogos hibridizam um com o outro, por exemplo, DNAs não menos que 70% homólogos, preferivelmente não menos que 80% homólogos, mais preferivelmente não menos que 90% homólogos, especialmente preferivelmente não menos que 95% homólogos, hibridizam um no outro, e DNAs menores do que 70% homólogos não hibridizam um no outro, e os sob os quais DNAs hibridizam uns nos outros em uma concentração de sal com lavagem típica de hibridização Southern, isto é, lavagem uma vez ou preferivelmente 2-3 vezes com 1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68°C.

[00078] Uma sequência parcial complementar do gene yggB também pode ser usada como uma sonda. Esta sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos que são designados com base em uma sequência nucleotídica do gene yggB em um modo bem conhecido do versado. Quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado como uma sonda, as condições de lavagem após hibridização podem ser exemplificadas como 2 x SSC, 0,1% SDS a 50°C. Os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID No: 75 e 76 podem ser usados para preparar referida sonda.

[00079] Além disso, o gene yggB podem ser um gene yggB tipo mutante como descrito em <II> a <IV> abaixo.

[00080] Melhora da expressão do gene yggB acima-descrito pode ser atingida por aumento do número de cópias do gene yggB, modificação de uma sequência regulatório de expressão do gene yggB, amplificação de um gene codificando um fator regulatório que aumenta a expressão do gene yggB, ou ruptura ou atenuação de um gene codificando um fator regulatório que reduz a expressão do gene yggB, por uso de transformação com um plasmídeo ou recombinação homóloga, conjugação, transição, ou outros.

[00081] Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado por ligação um fragmento de gene contendo o gene yggB em um vetor, preferivelmente um vetor de múltiplas cópias, que pode replicar em bactéria corineforme, e introduzir o resultante vetor em uma bactéria corineforme produzindo ácido L-glutâmico.

[00082] O número de cópias do gene yggB também pode ser aumentado por integração de cópias múltiplas do gene yggB em um DNA cromossômico de um microorganismo. A fim de integrar cópias múltiplas do gene yggB em um DNA cromossômico de um microorganismo, recombinação homóloga pode ser realizada por marcação de uma sequência que existe em cópias múltiplas do DNA cromossômico. DNA repetitivo e repetições invertidas em uma extremidade de um transposon podem ser usadas. Alternativamente, como descrito em JP2-109985A, também é possível incorporar o gene yggB em um transposon, e transferi-lo de modo que cópias múltiplas do gene são integradas dentro do DNA cromossômico. Integração do gene yggB dentro da cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern usando uma sonda tendo de uma sequência parcial do gene yggB.

[00083] Abaixo, um exemplo de um método para construir uma bactéria corineforme que foi modificada de modo que a expressão do gene yggB é melhorado é mostrado. Este método pode ser realizado por métodos convencionais como os descritos em Molecular cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001.

[00084] Primeiro, o gene yggB é clonado a partir do DNA cromossômico de uma bactéria corineforme. O DNA cromossômico pode ser preparado a partir de um microorganismo corineforme, por, por exemplo, o método de Saito e Miura (fazer referência a H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Editado por Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan, 1992). Para PCR, oligonucleotídeos como os mostrados em SEQ ID NO: 75 e 76 podem ser usados como iniciadores.

[00085] Então, um DNA recombinante é preparado por ligação do gene yggB amplificado a um vetor DNA que pode funcionar em bactéria corineforme. Vetores que são autonomamente replicáveis em Escherichia coli e bactéria corineforme são preferivelmente usados para construção de plasmídeos. Exemplos de vetores que são autonomamente replicáveis em bactérias corineformes incluem pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58- 77895A), pVK7 (US2003-0175912), e pSFK6 (JP2000-262288A), pCRY30 (JP3-210184A), pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, pCRY3KX (JP2-72876A e patente US 5,185,262), pCRY2, e pCRY3 (JP1- 191686), e pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP58-192900A), pCG1 (JP57- 134500A), pCG2 (JP58-35197), pCG4, pCG11 (S57-183799). Exemplos de vetores autonomamente replicáveis em Escherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG e pACYC são disponíveis de Takara Bio), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW é disponíveis de Nippon Gene), pTrc99A (Amann et al., Gene 69:301- 315(1988), e outros.

[00086] A fim de preparar um DNA recombinante por ligação do gene yggB em qualquer um dos vetores acima mencionados, o vetor e um fragmento contendo o gene yggB são digeridos com enzimas de restrição e ligados uns nos outros, geralmente por uso de uma ligase como a T4 DNA ligase.

[00087] O plasmídeo recombinante como preparado acima é introduzido dentro da bactéria corineforme hospedeira por um método convencional de transformação. Exemplos de métodos de transformação incluem o tratamento de células recipientes com cloreto de cálcio, de modo a aumentar permeabilidade do DNA, que foi registrado para Escherichia coli K- 12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), preparação de células competentes a partir de células que estão no estágio de crescimento, seguido por transformação com DNA, que foi relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)), e assim em diante. Além destes métodos, a introdução de um DNA recombinante em células recipientes de protoplastos ou esferoplastos, que foi relatada como sendo aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetes, e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)), podem ser empregados. Além disso, transformação de microorganismos também pode ser realizada por método pulso elétrico (JP2-207791A).

[00088] O número de cópias de um gene yggB também pode ser aumentado por integração de cópias múltiplas do gene em um DNA cromossômico de uma bactéria corineforme. A fim de integrar as cópias múltiplas de um gene yggB em um DNA cromossômico de uma bactéria corineforme, recombinação homóloga pode ser realizada por marcação de uma sequência que existe em cópias múltiplas em um DNA cromossômico. DNA repetitivo e repetições invertidas no final de um transposon podem ser usados como uma sequência que existe em cópias múltiplas em um DNA cromossômico. Alternativamente, como descrito em EP0332488B e Vertes, A.A., Asai, Y., Inui, M., Kobayashi, M., Kurusu,Y. e Yukawa, H.:Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994), é também possível incorporar um gene yggB em um transposon, e transferi-lo de modo que cópias múltiplas do gene yggB são integradas dentro do DNA cromossômico.

[00089] Além disso, um gene yggB também pode ser incorporado em um cromossomo hospedeiro por uso de fago Mu (EP0332488B) ou método de conjugação (Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84 -7). Além disso, o número de cópias do gene yggG também pode ser aumentado por uso do transposon artificial descrito abaixo.

[00090] Além disso, gene yggB pode ser amplificado em um cromossomo por inserção do gene yggB em um plasmídeo que tem uma origem de replicação não capaz de replicar em uma bactéria corineforme hospedeira ou em um plasmídeo que tem uma origem de replicação não capaz de replicar em uma bactéria corineforme hospedeira e tem a capacidade de transferência por conjugação. Exemplos deste plasmídeo incluem pSUP301 (Simo et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob e pK19mob (Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporação, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994) Journal of Biological Chemisty 269: 32678-84; US-A 5487993), pCR(R)Blunt (Invitrogen, Groningen, Neterlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al.,1991, Journal de bacteriology 173: 4510-4516), e pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene, 41:337-342). Um plasmídeo contendo um gene yggB é transferido em uma bactéria corineforme por conjugação ou transformação. A transferência de genes por conjugação pode ser realizada, por exemplo, por um método descrito em Schaefer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). A transferência de genes por transformação pode ser realizada, por exemplo, por um método descrito em Theirbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican e Shivinan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)), e Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343- 347 (1994)).

[00091] Melhora da expressão de um gene yggB também pode ser atingida por substituição de uma sequência regulatória de expressão, incluindo um promotor do gene yggB, em um DNA cromossômico ou em um plasmídeo, com um mais forte, por modificação de um elemento envolvido em regulação da expressão do gene yggB como um operador e/ou um repressor, ou por fusão de um terminador forte a jusante do códon de parada do gene yggB (Hamilton et al.; Journal of bacterology171:4617-4622). Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor PL, promotor PS2 (Appl Environ Microbiol. 2003 Jan;69(1):358-66; Mol Microbiol. 1993 Jul;9(1):97-109; WO93/03158), e assim em diante são conhecidos como promotores fortes. Um método para avaliar a potência de promotores e exemplos de promotores fortes são descritos em Goldstein et al. (Prokaryotic promotors in biotechnology. Biotechnol. Annul. Rev., 1995, 1, 105-128). Além disso, também é possível introduzir várias substituições de nucleotídeos dentro da região de promotor para o gene yggB de modo que o promotor fique mais forte (WO00/18935). Por exemplo, a “ região - 35” pode ser substituída com “TTGACA” ou “TTGCCA”, ou a “ região -10 região” pode ser substituída com “TATAAT” ou “TATAAC”. Além disso, sabe-se que uma sequência de espaçador entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e códon de iniciação de tradução, especialmente, vários nucleotídeos logo a montante do codon de iniciação, tem uma grande influencia sobre e eficácia de tradução. Assim, estas sequência pode ser modificada. “Sequência regulatória de expressão” do gene yggB significa uma região que influencia a quantidade de expressão do gene yggB, e um seu exemplo inclui uma região a montante do gene yggB. A região a montante apropriada para a modificação de modo a melhorar a expressão do gene yggB inclui a região a montante do códon de iniciação de tradução do gene yggB (por exemplo, a região a montante do nucleotídeo 1436 de SEQ ID NO: 5), e um exemplo preferível do mesmo inclui a região pelo menos 500bp a montante do códon de iniciação de tradução, e um seu exemplo mais preferível e inclui a região pelo menos 300bp a montante do códon de iniciação de tradução.

[00092] A substituição de uma sequência regulatória de sequência também pode ser atingida por, por exemplo, usando um plasmídeo sensível a temperatura como descrito acima.

[00093] Modificação da sequência regulatória de expressão pode ser combinada com aumento do número de cópias do gene yggB. <II>Introdução de um gene yggB tipo mutante

[00094] A modificação usando o gene yggB pode ser introduzindo-se um gene yggB tipo mutante em uma bactéria corineforme. Introdução de um gene yggB tipo mutante inclui introduzir uma mutação em um gene cromossômico yggB, introduzir um plasmídeo compreendendo um gene yggB tipo mutante, e substituir um gene cromossômico yggB com um gene yggB tipo mutante.

[00095] Na presente invenção, o “gene yggB tipo mutante” significa um gene yggB compreendendo uma mutação em sua região de codificação que permite ao gene yggB melhorar capacidade de produção de ácido L- glutâmico de uma bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme. Um gene yggB tipo mutante podem ser um gene que melhora a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme sob condições de produção de ácido L- glutâmico assim como na presença de biotina em excesso, quando ele é introduzido em uma bactéria corineforme.

[00096] A expressão "capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme na presença de biotina em excesso é melhorada” significa que, quando a bactéria corineforme da presente invenção é cultivada em um meio contendo biotina a uma concentração em que a cepa não modificada de bactéria corineforme não pode substancialmente produzir ácido L-glutâmico, por exemplo, em um meio contendo não menos que 30 μg/L of biotina, a cepa causa acúmulo de mais ácido L-glutâmico no meio do que a cepa não modificada, ou a cepa produz ácido L-glutâmico em taxas maiores do que a da cepa não modificada.

[00097] Abaixo, exemplos do método de obtenção do gene yggB tipo mutante da presente invenção e o método de introduzir o gene yggB tipo mutante são descritos. No entanto, o método de obter o gene yggB tipo mutante da presente invenção e o método de introduzir o gene yggB tipo mutante não são limitados a estes exemplos. (II-1) Método de utilizar cepas deficientes em gene odhA

[00098] Os inventores da presente invenção verificaram que um gene yggB tipo mutante pode ser efetivamente obtido por uso de uma cepa rompida em gene odhA (sucA) em que um gene codificando a subunidade de E1o de α-cetoglutarato desidrogenase é rompida.

[00099] Na presente invenção, atividade α-cetoglutarato desidrogenase (α-KDGH) significa uma atividade para catalisar a descarboxilação oxidante de ácido a-cetoglutárico ácido (ácido 2-oxoglutárico) para gerar succinil- CoA. A reação é catalisada por três tipos de enzimas, isto é, α-cetoglutarato desidrogenase (E1o EC1.2.4.2), dihidrolipoamida-S-succiniltransferase (E2o), e dihidrolipoamida desidrogenase (E3). α-cetoglutarato desidrogenase é também chamada oxoglutarato desidrogenase (succinil-transferase) ou 2- oxoglutarato desidrogenase. A atividade de α-KGDH pode ser medida pelo método de Shiio et al. (Isamu Shiio e Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980).

[000100] A sequência nucleotídica do gene codificando a subunidade E1o de α-cetoglutarato desidrogenase (odhA) de bactéria corineforme já foi identificada (Microbiology 142, 3347-3354, (1996), GenBank No. acesso D84102). A sequência nucleotídica do gene odhA é mostrada em nucleotídeos 443-4213 de SEQ ID NO: 43 e a sequência de aminoácidos de gene odhA é mostrada em SEQ ID NO: 44.

[000101] A cepa rompida em gene odhA pode ser obtida, por exemplo, por um método usando o gene sacB acima mencionado. Primeiro, a sequência interna do gene odhA é amplificada por PCR usando iniciadores projetados com base em uma sequência nucleotídica do gene odhA, como a mostrada em SEQ ID NOS: 1 e 2, e um DNA cromossômico de bactéria corineforme como cepa ATCCC13869 como um gabarito. O fragmento interno do gene odhA é inserido em um plasmídeo para construir um plasmídeo para ruptura do gene odhA. Os plasmídeos usados para ruptura de genes incluem plasmídeo sensível a temperatura para bactérias corineformes (JP-A-05-00791), e pBS3, que é vetor suicida que compreende um gene sacB como descrito no Exemplo 1.

[000102] O obtido plasmídeo é introduzido em uma cepa que não pode causar acúmulo de ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso, por exemplo, a cepa tipo selvagem C. glutamicum ATCC13869, ATCC13032, pelo método de pulso elétrico (JP-A-2-207791). Um recombinante de cruzamento único é obtido em que a recombinação homóloga entre o gene odhA tipo mutante no plasmídeo e o gene cromossômico odhA tinha ocorrido. Quando se usa o plasmídeo sensível à temperatura, um recombinante cruzado único é obtido a uma temperatura em que os plasmídeos não podem replicar. Se a cepa for um recombinante cruzado único ou não puder ser confirmada, por exemplo, por uso de oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 3 e 4.

[000103] A assim obtida cepa rompida em gene odhA é isolada em um meio contendo açúcar. No processo de isolamento, uma espontânea mutação é introduzida dentro de um gene cromossômico yggB em uma freqüência alta. Então, a capacidade da cepa isolada para produzir ácido L-glutâmico é avaliada por cultivo da cepa em um meio contendo biotina em excesso. Por exemplo, a cepa candidato é inoculada em 20 ml de meio de cultura (30 g/l glicose, 15 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgS(')-7l l.-('), 0,01 g/l FeSO:^7H;O, 0,01 g/l MnSOU-5IH), 200 μg/l vitamina B1, 300 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisados de soja (total nitrogênio), ajustado a pH 8,0 com K)H: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), seguido por adição de 1 g de carbonato de cálcio esterilizado por calor, e a cepa é cultivada com agitação. Após o açúcar ser completamente consumido, a quantidade de ácido L- glutâmico acumulado é medida. Cepas que produzem ácido L-glutâmico, por exemplo, as que produzem não menos que 50% (rendimento por açúcar) de ácido L-glutâmico são selecionadas, e a sequência nucleotídica do gene yggB das cepas selecionadas é determinada para obter a cepa em que a mutação é introduzida dentro de um gene yggB.

[000104] Para construir a cepa transportando somente o gene yggB tipo mutante, prefere-se substituir o gene odhA no cromossomo rompido pelo plasmídeo com um gene odhA tipo selvagem. Cepas deficientes no gene odhA crescem consideravelmente mais lento em um meio sem açúcar. No entanto, quando o gene odhA reverte para o gene tipo selvagem, a cepa pode crescer bem em um meio sem açúcar, por exemplo, meio CM2B (10 g/l polipeptona, 10 g/l extrato de levedura, 5 g/l NaCl, 10 μg/l biotina, 20 g/l agar, ajustado a pH 7,0 com K)H). Assim, a cepa rompida no gene odhA é espalhada sobre uma placa CM2B para selecionar cepas melhoradas no crescimento. As cepas que assim pareceram melhoradas no crescimento são purificadas sobre a placa CM2B, e se a cepa tem o gene odhA tipo selvagem pode ser estimado por teste da sensibilidade da cepa a antibióticos com base em ausência de vetores restantes. Além disso, a sequência nucleotídica do gene odhA pode ser determinada.

[000105] Alternativamente, o gene yggB tipo mutante pode ser clonado a partir da cepa mutante dupla odhA-yggB, e introduzida em uma cepa tipo selvagem. Por exemplo, o gene yggB tipo mutante pode ser amplificado por realização de PCR usando o DNA cromossômico da cepa mutante dupla como um gabarito e os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 10. O produto amplificado é inserido em um plasmídeo sensível a temperatura para bactérias corineformes, como pHSC4 (JP-A-05-007491), ou pBS3, um vetor suicida descrito em Exemplo 1 para substituir um gene yggB tipo selvagem em um cromossomo com o gene yggB tipo mutante. Se uma mutação é introduzida dentro do yggB no cromossomo pode ser confirmado por determinação da sequência nucleotídica do gene yggB no cromossomo. (II-2) Método de utilização de um elemento transposável

[000106] As bactérias corineformes tendo um gene yggB tipo mutante também pode ser triadas pelo uso de um elemento transposável em bactérias corineformes. O elemento transposável pode incluir uma sequência de inserção (IS) e transposon artificial. O gene yggB mutante podem ser um gene tendo um IS e/ou transposon inseridos por acidente dentro da região de codificação, ou um gene obtido artificialmente por uso do transposon artificial. A cepa em que um elemento transposável é inserido pode ser selecionada, por exemplo, com base em uma diminuição em sensibilidade para análogos de ácido L-glutâmico. Como um análogo de ácido L-glutâmico, ácido 4-fluoroglutâmico pode ser usado. Além disso, a cepa em que um elemento transposável é inserido pode ser selecionada por seleção aleatoriamente de cepas resistentes a antibióticos com um transposon artificial contendo gene resistente a antibióticos, e confirmando um comprimento de um gene yggB das cepas resistentes a antibióticos por PCR.

[000107] O método descrito em JP-A-09-070291 pode ser usado para introduzir o IS em bactérias corineformes. Um transposon artificial que inclui um gene estrutural de um transposase e um gene marcador ensanduichado entre repetições invertidas(IR) em ambos os lados do IS pode ser usado. Neste caso, o gene estrutural de um transposase pode estar presente junto com o gene marcador e IS no mesmo plasmídeo ou pode ser em um plasmídeo separado. Alternativamente, a função do transposon que está presente no cromossomo da bactéria corineforme hospedeira pode ser utilizada. Exemplos de genes codificando uma transposase derivada de bactéria corineforme são mostrados pelos números de Acesso GenBank. 1. NCgl0179 Cgl0182; transposase 2. NCgl0235 Cgl0238; transposase putativa 3. NCgl0348 Cgl0355; transposase putativa 4. NCgl0688 Cgl0718; transposase putativa 5. NCgl0919 Cgl0959; transposase 6. NCgl0993 Cgl1037; transposase 7. NCgl1021 Cgl1066; transposase 8. NCgl1464 Cgl1521; transposase putativa 9. NCgl1496 Cgl1557; transposase 10. NCgl1662 Cgl1733; transposase putativa 11. NCgl1664 Cgl1734; transposase 12. NCgl2131 Cgl2212; transposase 13. NCgl2284 Cgl2367; transposase 14. NCgl2392 Cgl2479; transposase putativa 15. NCgl2418 Cgl2504; transposase putativa 16. NCgl2420 Cgl2506; transposase putativa 17. NCgl2460 Cgl2548; transposase prevista 18. NCgl2542 Cgl2631; transposase prevista 19. NCgl2665 Cgl2761; transposase putativa 20. NCgl2748 Cgl2845; transposase putativa 21. NCgl2850 Cgl2951; transposase prevista

[000108] O IS ou transposon artificial pode ser introduzido nas bactérias corineformes usando um vetor apropriado, por exemplo, um plasmídeo replicável em bactérias corineformes. Exemplos específicos do plasmídeo incluem pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), e plasmídeos obtidos por modificação dos mesmos para transportar um gene resistente a droga. Além disso, para efetivamente amplificar o IS ou transposon artificial no cromossomo, um plasmídeo tendo a origem de replicação sensível a temperatura como descrito em acima (1) é preferivelmente usado (ver JP-A-5- 7491). A cepa parental usada para esta triagem é preferivelmente a cepa que não pode causar acúmulo de ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso, por exemplo, a cepa ATCC13869, que é a cepa tipo selvagem de C. glutamicum.

[000109] Como o método de introdução do plasmídeo transportando o IS ou transposon artificial em bactérias corineformes, métodos convencionalmente usados, como o método protoplasto (Gene, 39, 281-286 (1985)), método de eletroporação (Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)), e outros podem ser usados.

[000110] Introdução do IS ou transposon artificial transportado no plasmídeo sensível à temperatura em bactérias corineformes pode ser realizada por transformação das bactérias corineformes com o plasmídeo, cultivo dos transformantes a 25°C em que os plasmídeos podem replicar para amplificar o IS ou transposon artificial em várias dezenas a várias centenas de cópias por célula para permitir a introdução do IS ou transposon artificial dentro do cromossomo, e então cultivar as células a 34°C para remover os plasmídeos em excesso. Alternativamente, um fragmento de DNA de somente IS ou transposon artificial ou um vetor plasmídeo que não pode replicar em bactérias corineformes (por exemplo, vetor plasmídeo replicável em Escherichia coli) pode ser usado par introduzir o IS ou transposon artificial dentro da cromossomo das bactérias corineformes (JP-A-7-107976, Vertes, A.A., Asai, Y., Inui, M., Kobayashi, M., Kurusu, Y. e Yukawa, H.: Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)).

[000111] A cepa que tem o IS ou transposon artificial no cromossomo é cultivada em um meio contendo biotina em excesso de modo para selecionar a cepa que causa acúmulo de ácido L-glutâmico. Por determinação de uma sequência nucleotídica do gene yggB no cromossomo desta cepa, uma bactéria corineforme tendo um gene yggB tipo mutante pode ser obtida. (II-3) Método de aleatoriamente introduzir uma mutação dentro de um gene yggB in vitro

[000112] Além disso, o gene yggB tipo mutante pode ser obtido por aleatoriamente introduzindo uma mutação dentro de um gene yggB in vitro, introduzindo o gene mudado em bactéria corineforme, e triagem para cepas que produzem ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso como um resultado da presença do gene yggB tipo mutante. A cepa parental utilizável para triagem é preferivelmente a cepa que não pode causar acúmulo de ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso, por exemplo, Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13869, cepa ATCC13032, cepa ATCC14067, e Corynebacterium melassecola cepa ATCC17965.

[000113] Para triar para um gene yggB tipo mutante, cepa deficiente em yggB cepa é preferivelmente usada. A construção da cepa rompida em gene yggB- pode ser realizada por um método similar ao método acima mencionado em que o gene sacB é usado. Por exemplo, PCR é realizado usando iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 39 e 40 e o DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC13869 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal do gene yggB. Similarmente, PCR é realizado usando DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 41 e 42 como iniciadores para preparar um fragmento C-terminal. SEQ ID NOS: 40 e 41 são complementares entre si. Subseqüentemente, PCR é realizado usando uma mistura de quantidades equimolares do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 39 e 42 como iniciadores para preparar um fragmento em que uma sequência interna do gene yggB é deletada.

[000114] O fragmento PCR obtido é inserido em um plasmídeo para ruptura de genes, por exemplo, pBS4S transportando o gene levan sucrase. O plasmídeo obtido é introduzido dentro do cromossomo de bactéria corineforme, por exemplo, C. glutamicum cepa ATCC13869 para construir uma cepa rompida em gene yggB.

[000115] Então, por exemplo, mutagênese in vitro do gene yggB pode ser realizada como a seguir. Primeiro, yggB é clonado em um plasmídeo que pode replicar em bactéria corineforme. Cerca de 10 μg do plasmídeo transportando gene yggB obtido é dissolvido em um tampão contendo mutagenes, por exemplo, 500 mM tampão fosfato contendo 400 mM hidroxilamina e 1 mM EDTA (pH 6,0), e aquecido a 75°C durante 60 a 90 minutos para introduzir uma mutação dentro de um gene yggB. Após mutagênese, o plasmídeo é dessalinizado com SUPREC-02 (Takara Bio INC.) ou outros, e então introduzido em ΔyggB cepa ATCC13869, e transformantes são triados em um meio contendo um antibiótico. Como um controle, plasmídeo transportando gene yggB sem mutagênese é introduzido dentro de ΔyggB cepa ATCC13869. Os transformantes emergidos são inoculados em um meio contendo biotina em excesso e cultivados com agitação, e então a concentração de ácido L-glutâmico acumulado é determinada. Ácido L- glutâmico não substancialmente acumulado em um meio em que a cepa introduzida no plasmídeo transportando gene yggB tipo selvagem cultivado, enquanto uma significante quantidade de ácido L-glutâmico acumula em um meio em que a cepa introduzida no plasmídeo transportando gene yggB tipo mutante é cultivada. Se a cepa transportar um gene yggB tipo mutante ou não pode ser confirmado por extração de um plasmídeo da cepa e determinando a sequência nucleotídica do gene yggB.

[000116] Alternativamente, um gene yggB tipo mutante pode ser obtido por introdução artificial de mutações dentro de um gene yggB por tais métodos como PCR passível de erro, embaralhamento de DNA, e StEP-PCR (Firth AE, Patrick WM; Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction).

[000117] Os métodos de introdução de uma mutação dentro de um gene yggB no cromossomo incluem, além do método acima mencionado, um método de tratamento de uma bactéria corineforme com irradiação de raios-X ou raios ultravioleta com um mutagene como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina, e selecionar a cepa que produz ácido L-glutâmico na presença de biotina em excesso. Se o gene yggB tipo mutante foi introduzido ou não pode ser confirmado por determinação da sequência nucleotídica do gene yggB no cromossomo. (II-4) Método de triagem de cepas resistentes a análogo de ácido L-glutâmico

[000118] Genes yggB tipo mutantes podem ser obtidos por cultivo de uma bactéria corineforme tendo um gene yggB tipo selvagem em um meio contendo um análogo de ácido L-glutâmico, e seleção de cepas resistentes a análogo de ácido L-glutâmico que podem crescer no meio. A cepa parental usada neste método é preferivelmente a cepa tipo selvagem de bactéria corineforme como descrita acima, e pode ser qualquer cepa tendo um gene yggB tipo selvagem, incluindo a cepa tendo um plasmídeo contendo um gene yggB tipo selvagem.

[000119] "Análogos de ácido L-glutâmico" como usado aqui incluem y- metil L-glutamato, ácido α-metil glutâmico, ácido e-hidroxiglutâmico, metionina sulfoximina, ácido glutâmico-y-monohidroxamato, ácido 2-amino- 4-fosfonobutírico, y-monoetil L-glutamato, dimetil L-glutamato, di-t-butil L- glutamato, ácido monofluoroglutâmico, dietil L-glutamato, ácido D- glutâmico, e ácido 4-fluoroglutâmico, e dentre estes, ácido 4-fluoroglutâmico é preferivelmente usado. Por exemplo, cepas resistentes a análogo de ácido L- glutâmico pode ser obtido como a seguir. Isto é, uma bactéria corineforme é inoculada em um meio mínimo contendo um análogo de ácido L-glutâmico, e colônias que apareceram após 24-48 horas são coletadas. Concentração do análogo de ácido L-glutâmico adicionado ao meio é preferivelmente uma concentração em que a cepa tendo um gene não yggB mudado não pode crescer e a cepa tendo um gene yggB mudado pode crescer. Especificamente, a concentração de ácido 4-fluoroglutâmico é de 1,25 mM ou mais, preferivelmente 2,5 mM ou mais, e mais preferivelmente 5 mM ou mais. Por exemplo, “cepa resistente a análogo de ácido L-glutâmico” como usado aqui significa que quando a cepa é cultivada em um meio mínimo contendo ácido 4-fluoroglutâmico, onde a contagem de células viáveis (número de células capazes de formar colônias) de uma cepa tipo selvagem é suprimida a não mais do que 1/100 que quando em ausência de ácido 4-fluoroglutâmico, a cepa demonstra 1/10 ou mais crescimento da cepa cultivada na ausência de ácido 4-fluoroglutâmico.

[000120] As obtidas cepas resistentes a análogo de ácido L-glutâmico são inoculadas em um meio líquido contendo biotina em excesso e cultivadas com agitação, seguido por medida da concentração de ácido L-glutâmico que tinha acumulado no meio. Considerando uma cepa tendo um gene yggB tipo selvagem acumula pouco ácido L-glutâmico, algumas das cepas resistentes a análogo de ácido L-glutâmico acumulam uma significante quantidade de ácido L-glutâmico. O gene yggB é amplificado a partir de tal cepa e a sequência nucleotídica do mesmo é determinada, e assim, um novo gene yggB tipo mutante pode ser obtido. (III) Genes yggB tipo mutante

[000121] Abaixo, exemplos específicos do gene yggB tipo mutante são descritos. No entanto, o gene yggB tipo mutante da presente invenção não é limitado a estes genes.

[000122] O gene yggB tipo mutante obtido pelo método acima mencionado não é particularmente limitado desde que ele tenha uma função para melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme na presença de biotina em excesso quando ela é introduzida em uma bactéria corineforme. (III-1) Mutação na região C-terminal do gene yggB

[000123] Esta mutação é introduzida dentro da região de codificação de aminoácidos 419-533 de SEQ ID NO: 6, 68, 84 ou 85, ou aminoácidos 419- 529 de SEQ ID NO: 62. Por exemplo, em SEQ ID NO: 5, esta região corresponde à região consistindo de nucleotídeos 2692 to3035. Esta mutação podem ser de qualquer tipo, desde que seja introduzida dentro da região, e inclua mutações em pontos e inserção de uma sequência artificial. Dentre estas, mutações que introduzem uma sequência de inserção (IS) ou um transposon artificial são preferíveis. A mutação pode causar substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), mudança de fase, ou códon de parada (mutação não sentido) como um resultado da mutação de pontos, inserção de IS, ou transposon. (III-1-1) A mutação por inserção de elemento transposável (tipo 2A-1 mutação)

[000124] Exemplos da mutação na região C-terminal incluem a mutação que insere um elemento transposável como sequência de inserção (IS) próximo do "G" na posição 2691 de SEQ ID NO: 5. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo esta mutação é mostrada em SEQ ID NO: 7, e a sequência de aminoácidos da proteína de YggB tipo mutante codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 8. O IS inserido dentro da sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 7 tem uma homologia elevada para IS1207 (GenBank No. de Acesso X96962) e IS719 (GenBank No. de Acesso E12759). Na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a região C- terminal contendo Val na posição 419 e a seguir da proteína Ygg (SEQ ID NO: 6) é substituída por uma sequência derivada de IS mais curta. Este tipo of mutação, incluindo as mutações mudando ou deletando a região C-terminal na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 6, 62, 68, 84 e 85, é nomeada uma mutação de tipo 2A-1.

[000125] Além disso, a mutação tipo 2A-1 também inclui outras mutações que introduzem outro IS ou transposon dentro do mesmo sítio que a mutação de tipo 2A-1. A posição em que o IS ou transposon é inserido pode ser qualquer posição desde que esteja localizada dentro da região acima descrita. È preferível que um IS seja inserido em uma posição onde a transposase pode prontamente reconhecer a mesma, ou pontos quentes onde um IS é fácil de inserir. (III-1-2) A mutação que resulta em substituição da prolina com outro aminoácido (mutações tipo 66 e tipo 22)

[000126] Além disso, um exemplo de uma mutação na região C- terminal também inclui a mutação que resulta em substituição da prolina em região C-terminal com outro aminoácido. As prolinas nas seguintes posições podem ser substituídas com outro aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Pro na posição 424 (424 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 437 (437 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 453 (453 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 457 (457 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 462 (462 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 469 (469i n SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 484 (484 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 489 (489 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 497 (497 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 515 (515 em SEQ ID NO: 62,68,84,85) Pro na posição 529 (529 em SEQ ID NO: 68,84,85, 525 em SEQ ID NO:62 ) Pro na posição 533 (533 em SEQ ID NO: 68,84,85, 529 em SEQ ID NO:62 )

[000127] Considera-se que os resíduos de prolina na região C-terminal da proteína YggB desempenham um papel importante na manutenção da estrutura tri-dimensional da proteína YggB (Protein Eng. 2002 Jan;15(1):29- 33, J Biol Chem. 1991 Dez 25;266(36):24287-94.).

[000128] Especialmente, substituindo-se a prolina na posição 424 e/ou a prolina na posição 437 em SEQ ID NO: 6, 62, 68, 84 ou 85 com outro aminoácido é preferível.

[000129] Exemplos dos outros aminoácidos incluem Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, Tyr, Val, e Thr. Como os outros aminoácidos substituindo a prolina na posição 424, aminoácidos hidrofóbicos como Ala, Gly, Val, Leu, e Ile são preferíveis, e aminoácidos tendo cadeia ramificada como Leu, Val, e Ile são mais preferíveis. Um exemplo de uma mutação que substitui Pro na posição 424 com Leu inclui a mutação que substitui “C” na posição 1673 com “T” em SEQ ID NO: 67. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo esta mutação é mostrada em SEQ ID NO: 69 e a sequência de aminoácidos da proteína YggB tipo mutante codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 70.

[000130] Como o outro aminoácido substituindo a prolina na posição 437, aminoácidos contendo um grupo hidroxila, como Thr, Ser, Tyr são preferíveis, e aminoácidos tendo Ser são mais preferíveis. Um exemplo de uma mutação que substitui Pro na posição 437 com Ser inclui a mutação que substitui “C” na posição 2745 com “T” em SEQ ID NO:5. Além disso, esta mutação podem ser acompanhada pela mutação que substitui o “C” na posição 3060 com “T” em SEQ ID NO: 5. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo esta mutação é mostrada em SEQ ID NO: 73 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 74. (III-2) Mutação em uma região transmembrana do gene yggB

[000131] A proteína YggB codificada pelo gene yggB é presumida como tendo cindo regiões transmembranas. Em uma sequência de aminoácidos da proteína YggB tipo selvagem mostrada em SEQ ID NOs: 6, 62, 68, 84 e 85, as regiões de transmembrana correspondem a aminoácidos 1 a 23 (primeira região transmembrana), aminoácidos 25 a 47 (segunda região transmembrana), aminoácidos 62 to 84 (terceira região transmembrana), aminoácidos 86 a 108 (quarta região transmembrana), e aminoácidos 110 a 132 (quinta região transmembrana). Em SEQ ID NO: 5, nucleotídeos codificando estas regiões correspondem a nucleotídeos 1437 a 1505, nucleotídeos 1509 a 1577, nucleotídeos 1620 a 1688, nucleotídeos 1692 a 1760, e nucleotídeos 1764 a 1832, respectivamente. Este tipo de mutação é preferivelmente introduzido nestas regiões. Este tipo de mutação preferivelmente introduz uma substituição, deleção, adição, inserção, ou inversão de um ou mais aminoácidos nestas regiões sem causar uma mutação de mudança de fase e a terminação de translação. Dentre estes, mutações de sentido errado, causando substituição de aminoácidos nas regiões acima mencionadas são preferíveis. O número de “vários” aminoácidos a serem substituídos, deletados, adicionados, inseridos, ou invertidos significa 2 a 20, preferivelmente 2 a 10, mais preferivelmente 2 a 5, e ainda mais preferivelmente 2 ou 3. As mutações causando inserção e deleção de um ou vários aminoácidos sem uma mudança de fase são também preferíveis, e, mais preferivelmente, inserção ou deleção de 3, 6, 9, 12, 15, 18 ou 21 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente, deleção ou inserção de 3, 6, ou 9 nucleotídeos, e bem mais preferivelmente, deleção ou inserção de 3 nucleotídeos.

[000132] Exemplos específicos da mutação nas regiões de transmembrana incluem os seguintes: (III-2-1) Mutação na primeiro região de transmembrana (Tipo A1 mutação)

[000133] Este tipo de mutação inclui uma que introduz um ou mais aminoácidos entre a leucina na posição 14 e o triptofano na posição 15 na sequência de aminoácidos mostrada por SEQ ID NOs: 6, 62, 68, 84 e 85, e mais especificamente inclui a mutação que introduz três aminoácidos, por exemplo, Cys-Ser-Leu, entre o Leu na posição 14 e o triptofano na posição 15. Esta mutação inclui inserção de TTCATTGTG próximo de G na posição 1480 no gene yggB tipo selvagem de SEQ ID NO: 5. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo esta mutação é mostrada em SEQ ID NO: 19 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 20. (III-2-2) Mutação na quarta região de transmembrana (mutação tipo A1)

[000134] Este tipo de mutação inclui substituição de Ala na posição 100 com outro aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NOs: 6, 62, 68, 84 e 85. Exemplos dos outros aminoácidos incluem Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val, e Thr. Dentre estes, aminoácidos contendo um grupo hidroxila como Thr, Ser, e Tyr são preferíveis e, treonina é mais preferível. A mutação que substitui o Ala na posição 100 com Thr inclui a mutação que substitui o “G” na posição 1734 com “A” de SEQ ID NO: 5. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo esta mutação é mostrada em SEQ ID NO: 21 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 22. (III-2-3) Mutação na quinta região de transmembrana (mutação tipo L30, mutação tipo 8)

[000135] Este tipo de mutação inclui uma que substitui o Ala na posição 111 com outro aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NOs: 6, 62, 68, 84 e 85. Exemplos dos outros aminoácidos incluem Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val, e Thr. Dentre estes, aminoácidos contendo cadeias ramificadas como Val, Ile, e Leu, e aminoácidos contendo grupo hidroxila como Thr, Ser, e Tyr são preferíveis, e Val ou Thr é preferível. Este tipo de mutação inclui uma que substitui o “C” na posição 1768 com um “T” na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 5 (mutação tipo L30), e a mutação que substitui o “G” na posição 837 com um “A” na sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 61 (mutação tipo 8). A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo uma mutação tipo L30 é mostrada em SEQ ID NO: 23 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 24. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo mutação tipo 8 é mostrada em SEQ ID NO: 63 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 64. (IV) Equivalentes do genes yggB tipo mutante

[000136] O "gene yggB tipo mutante" usado na presente invenção pode ser um gene funcionalmente equivalente que é substancialmente homólogo aos "genes yggB tipo mutante", acima mencionados, por exemplo, um gene tipo mutante compreendendo uma sequência nucleotídica que é capaz de hibridizar em uma sequência nucleotídica complementar a pelo menos uma das sequências nucleotídicas selecionadas dentre o grupo consistindo dos nucleotídeos 1437 a 2705 de SEQ ID NO: 7, os nucleotídeos 1437 a 3044 de SEQ ID NO: 19, os nucleotídeos 1437 a 3035 de SEQ ID NO: 21, os nucleotídeos 507 a 2093 de SEQ ID NO: 63, os nucleotídeos 403 a 2001 de SEQ ID NO: 69, e os nucleotídeos 1437 a 3035 de SEQ ID NO: 23, os nucleotídeos 548 a 2146 de SEQ ID NO: 73 com uma sonda preparada a partir destas sequências nucleotídicas sob condições estringentes, desde que o gene tenha uma função para melhorar a capacidade de produção de ácido L- glutâmico de uma bactéria corineforme na presença de biotina em excesso.

[000137] “Condições estringentes” como usado aqui são condições sob as quais um assim chamado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos de condições estringentes incluem, as sob as quais os DNAs tendo homologia elevada hibridizam um com cada outro, por exemplo, DNAs tendo uma homologia de não menos que 70%, preferivelmente não menos que 80%, mais preferivelmente não menos que 90%, especialmente preferivelmente não menos que 95%, hibridizam entre si, e DNAs tendo homologia menor do que 70% não hibridizam entre si, e os sob os quais DNAs hibridizam entre si a uma concentração de sal com lavagem típica de hibridização Southern, isto é, lavagem uma vez ou preferivelmente 2-3 vezes sob 1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68°C.

[000138] O gene yggB tipo mutante usado na presente invenção inclui um gene codificando uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 8, 20, 22, 24, 64, 70, ou 74 pelo que um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados em uma ou mais posições diferentes de aminoácido específico como descrito acima, enquanto mantendo uma função para melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme na presença de biotina em excesso. Apesar do número de “vários” resíduos de aminoácidos referidos aqui poder variar dependendo das posições na estrutura tri-dimensional ou tipos de resíduos de aminoácidos da proteína, eles podem ser preferivelmente 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10, particularmente preferivelmente 2 a 5.

[000139] O gene yggB preferivelmente codifica uma proteína tendo a substituição específica acima-descrita de aminoácido ou deleção e tendo homologia de não menos que 70%, mais preferivelmente não menos que 80%, ainda mais preferivelmente não menos que 90%, particularmente preferivelmente não menos que 95% para uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NOs: 8, 20, 22 ou 24, 64, 70, ou 74 enquanto mantendo uma função para melhorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme na presença de biotina em excesso. A substituição acima mencionada é preferivelmente uma substituição conservativa (mutação neutral). No caso de aminoácidos aromáticos, substituições conservativas incluem substituições de phe, trp, e tyr entre si. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, substituições conservativas incluem substituições de leu, ile, e val entre si. No caso de aminoácidos polares, substituições conservativas incluem substituições de gln e asn entre si. No caso de aminoácidos básicos, substituições conservativas incluem substituições de arg, lys, e his entre si. No caso de aminoácidos ácidos, substituições conservativas são substituições de asp e glu entre si. No caso de aminoácidos contendo grupo hidroxila, substituições conservativas incluem substituições de ser e thr entre si. As substituições conservativas também incluem: substituição de ser ou thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr e substituição de Met, Ile ou Leu por Val. Como acima mencionado, os aminoácidos mostrados como Xaa podem ser substituídos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.

[000140] Especialmente, as seguintes aminoácidos podem ser substituídos ou deletados na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 20, 22, 24, 64, 70, ou 74. Glu na posição 48 (preferivelmente substituído por Arg)Asp na posição 275 (preferivelmente substituído por Ser) Glu na posição 298 (preferivelmente substituído por Ala) Ala na posição 343 (preferivelmente substituído por Val) Phe na posição 396 (preferivelmente substituído por Ile) Ser na posição 438 (preferivelmente substituído por Gly) Val na posição 445 (preferivelmente substituído por Ala) Ala na posição 454 (preferivelmente substituído por Val) Pro na posição 457 (preferivelmente substituído por Ser) Ser na posição 474 (preferivelmente substituído por Asp) Val na posição 517 (preferivelmente deletados) Glu na posição 518 (preferivelmente deletados) Ala na posição 519 (preferivelmente deletados) Pro na posição 520 (preferivelmente deletados)

(V) Métodos de introduzir os genes yggB tipo mutante acima descritos em bactéria corineforme

[000141] O gene yggB tipo mutante tendo a mutação específica acima mencionada pode ser obtido por métodos convencionais incluindo a técnica de mutagênese dirigida ao sítio. A técnica de mutagênese dirigida ao sítio inclui um método de PCR de extensão de sobreposição que amplifica um gene mutante usando um iniciador de PCR tendo uma mutação (Urban, A., Neukirchen, S. e Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site- directed mutagênese using one-step overlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997)).

[000142] A bactéria corineforme da presente invenção tendo gene yggB tipo mutante acima mencionado pode ser obtida por introdução do gene yggB tipo mutante acima mencionado em uma bactéria corineforme. Um gene yggB tipo selvagem em um cromossomo podem ser substituído com o gene yggB tipo mutante. O gene yggB tipo mutante pode ser introduzido em uma bactéria corineforme em que um gene yggB tipo selvagem é rompido. Além disso, como no caso de recombinantes de cruzamento único, o gene yggB tipo mutante pode co-existir com um gene yggB tipo selvagem em uma bactéria corineforme. Por exemplo, a substituição do gene yggB no cromossomo pode ser realizada por uso, por exemplo, de um plasmídeo sensível à temperatura contendo um gene sacB codificando levan sucrase acima mencionada. Além disso, para introduzir o gene yggB tipo mutante em bactéria corineforme, um vetor como um plasmídeo replicável em bactéria corineforme ou transposon compreendendo o gene yggB tipo mutante pode ser usado.

[000143] Para introduzir o gene yggB tipo mutante dentro do DNA cromossômico das bactérias corineformes, também é possível realizar recombinação homóloga por marcação de uma sequência que está presente no DNA cromossômico em cópias múltiplas. Exemplos desta sequência incluem um DNA repetitivo e uma repetição invertida que está presente na extremidade de um elemento transposável. O gene yggB tipo mutante pode existir em bactéria corineforme em uma cópia única ou cópias múltiplas. A introdução do gene yggB tipo mutante em bactéria corineforme pode ser confirmado por PCR, hibridização Southern, ou outros.

[000144] Além disso, o gene yggB tipo mutante pode estar sob o controle de um promotor potente que é derivado dos outros genes, como descrito em WO00/18935. Por exemplo, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor PS2, e outros, são conhecidos como promotores potentes. Também é possível introduzir substituição de nucleotídeos dentro da região de promotor do gene yggB tipo mutante de modo que expressão do gene yggB tipo mutante é melhorada. A substituição da sequência regulando a expressão pode ser realizada usando, por exemplo, um plasmídeo sensível a temperatura.

(VI) Resistência de análogo de ácido L-glutâmico

[000145] Além disso, a bactéria corineforme da presente invenção pode ter aumentada resistência a análogos de ácido L-glutâmico como um resultado da introdução do gene yggB tipo mutante da presente invenção. "Análogos de ácido L-glutâmico" como usados aqui incluem Y—metil L-glutamato, ácido α— metil glutâmico, ácido e—hidroxiglutâmico, ácido metionina sulfoximina, ácido glutâmico -Y-monohidroxamato, ácido 2-amino-4-fosfonobutírico, Y- monoetil L-glutamato, dimetil L-glutamato, di-t-butil L-glutamato, ácido monofluoroglutâmico, dietil L-glutamato, ácido D-glutâmico, e ácido 4- fluoroglutâmico. Por exemplo, um aumento em resistência a análogos de ácido L-glutâmico é confirmado pelo fato de que quando a cepa da presente invenção é cultivada em um meio mínimo contendo ácido 4-fluoroglutâmico a uma concentração que a contagem de células viáveis (número de células capazes de formar colônias) da cepa parental pode ser suprimida a não mais do que 1/100, a cepa demonstra 1/10 ou mais crescimento como comparado a quando cultivada na ausência de ácido 4-fluoroglutâmico. Especificamente, prefere-se que a cepa tenha uma resistência a 1,25 mM ou mais, preferivelmente 2,5 mM ou mais, e mais preferivelmente 5 mM ou mais de ácido 4-fluoroglutâmico.

(VII) Outra modificação para inativar o gene que suprime a função do gene yggB tipo mutante

[000146] A bactéria corineforme da presente invenção pode ser ainda modificada de modo a inativar um gene que suprime a função do gene yggB tipo mutante. O “gene que suprime a função do gene yggB tipo mutante” significa que a produção de ácido L-glutâmico por um cepa introduzida no gene yggB tipo mutante é suprimida por amplificação do gene em uma cepa. Um exemplo deste gene inclui o gene symA (supressor de mutação de_yggB). O gene symA é mostrado como números de nucleotídeos 2051306-2051845 da sequência do genoma (Genbank No. Acesso NC_003450) de corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032, e registrado como NCgl 1867 (NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147]). O gene symA de corynebacterium glutamicum cepa ATCC13869 é mostrado em nucleotídeos 585-1121 de SEQ ID NO: 86. O gene symA pode ser um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência nucleotídica complementar a nucleotídeos 585 a 1121 de SEQ ID No: 86, ou uma sonda preparada a partir dos referidos nucleotídeos sob condições estringentes, desde que o DNA suprime uma função do referido gene yggB tipo mutante em uma bactéria corineforme.

[000147] A inativação do gene pode ser realizada por ruptura do gene, deleção do gene, ou sua modificação para diminuir a expressão do gene. Inativação do gene symA pode ser realizada usando um método similar como os métodos acima-descritos para diminuir a atividade enzimática.

(VIII) Outra modificação para diminuir atividade α- cetoglutarato desidrogenase

[000148] Na presente invenção, uma bactéria corineforme é preferivelmente modificada de modo que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (abaixo, referida como "α-KGDH") é diminuída além da modificação usando um gene yggB. A “atividade α-KGDH é diminuída" significa que a atividade α-KGDH é diminuída como comparado com a da cepa tipo selvagem ou cepas não modificadas, como a cepa parental. A atividade α-KGDH pode ser medida de acordo com o método de Shiio et al. (Isamu Shiio e Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897- 1904, 1980). Apesar de ser suficiente que a atividade α-KGDH seja diminuída como comparado com uma cepa não modificada, como a cepa tipo selvagem ou uma cepa parental, prefere-se que a atividade α-KGDH seja diminuída a cerca de 1/2 vez ou menos, preferivelmente cerca de 1/4 vez ou menos, e mais preferivelmente cerca de 1/10 vez ou menos com relação a uma cepa tipo selvagem ou não modificada. A bactéria corineforme da presente invenção pode não ter uma atividade detectável de α-KGDH.

[000149] A bactéria corineforme em que a atividade α -KGDH é diminuída pode ser construída em um modo similar como descrito acima.

[000150] Por exemplo, atividade α-KGDH pode ser diminuída por introdução de um gene codificando a subunidade E1o do complexo α-KGDH tendo a mutação em a região de ligação de tiamina pirofosfato (a região codificada por nucleotídeos 2498 a 2584 de SEQ ID NO: 43 (686Gly-714Asp de SEQ ID NO: 44)).

[000151] Exemplos da cepa tendo a atividade diminuída de α-KGDH incluem Brevibacterium lactofermentum cepa ΔS (WO95/34672) e Brevibacterium lactofermentum cepa AJ12821 (FERM BP-4172) (JP-A-06- 237779). Quando usando uma bactéria corineforme transportando o gene yggB tipo mutante e tendo diminuída atividade α-KGDH, ou a diminuição de atividade α-KGDH ou a introdução do gene yggB tipo mutante podem ser realizadas primeiro. <2>Método de produzir ácido L-glutâmico

[000152] Ácido L-glutâmico pode ser produzido por cultivo de uma bactéria corineforme da presente invenção em um meio para causar acúmulo de ácido L-glutâmico no meio e/ou nas células bacterianas, e coleta do ácido L-glutâmico do meio e/ou das células bacterianas. No método de produção da presente invenção, ácido L-glutâmico é produzido preferivelmente por cultivo da bactéria corineforme da presente invenção, por exemplo, a 25 a 40°C durante 8 a 120 horas.

[000153] O meio de cultura pode ser um meio comum que contém a fonte de carbono, fonte de nitrogênio, um sal inorgânico, e opcionalmente micronutrientes orgânicos como aminoácidos e vitaminas. Ou um meio sintético ou um meio natural podem ser usados. Qualquer tipo de fonte de carbono e de nitrogênio pode ser usada desde que possa ser usada por uma cepa sendo cultivada.

[000154] Sacarídeos como glicose, glicerol, fructose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido, e melaços podem ser usados como a fonte de carbono. Além disso, ácidos orgânicos como ácido acético e cítrico, e álcoois como etanol também podem ser usados sozinhos ou em combinação como uma fonte de carbono. Amônia, sais de amônio como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, e acetato de amônio, nitratos, e outros podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, substâncias contendo produtos de decomposição de peptona, casaminoácido, extrato de levedura, e proteína de soja podem ser usados em uma quantidade leve como os nutrientes orgânicos. Quando uma cepa mutante auxotrópicas que requer um aminoácido etc.para crescimento é usada, este nutriente requerido é preferivelmente adicionado. Fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês, e outros podem ser usados como sais inorgânicos.

[000155] Tensoativos como Tween40, penicilina, ou biotina podem ser adicionados em uma quantidade apropriada dependendo da cepa a ser cultivada. Por exemplo, a cepa tendo um gene yggB tipo mutante pode ser cultivada na presença de biotina em excesso, apesar desta cepa também poder ser cultivada sob condições L-glutâmicas contendo tensoativos ou penicilina, ou quando biotina é limitada.

[000156] Preferivelmente, cultivo aeróbico é realizado por controle da temperatura de fermentação e ajuste do pH do meio de cultura a 3 a 9. Quando o pH diminui durante a cultura o meio é neutralizado por adição de álcalis como carbonato de cálcio ou gás amônia. Cultura durante cerca de 10 a cerca de 120 horas resulta em acúmulo de uma considerável quantidade de ácido L-glutâmico no meio.

[000157] Além disso, a cultura pode ser realizada por uso de um meio líquido ajustado a condições sob as quais o ácido L-glutâmico produzido cristaliza e precipita. As condições sob as quais o ácido L-glutâmico cristaliza incluem pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente pH 4,0 (EP1233069, EP1233070).

[000158] Coleta de ácido L-glutâmico do meio após completar a cultura pode ser realizada por métodos convencionais. Ácido L-glutâmico pode ser coletado, por exemplo, por remoção células bacterianas do meio e concentração do ácido L-glutâmico ou por uso de cromatografia de troca iônica. Quando a cultura é realizada sob condições sob as quais o ácido L- glutâmico cristaliza e precipita, o ácido L-glutâmico cristalizado pode ser coletado, por exemplo, por centrifugação ou filtração. Neste caso, ácido L- glutâmico dissolvido no meio também pode ser coletado após cristalização do ácido L-glutâmico dissolvido.

EXEMPLOS

[000159] Abaixo, a presente invenção é especificamente explicada por referência aos seguintes exemplos não limitativos. Exemplo 1 < Construção de um vetor para ruptura de genes transportando o gene sacB>

(1-1) Construção de pBS3

[000160] Construção do transportando o gene sacB foi realizada por uso do método em WO2005/113745 e WO2005/113744. um gene sacB (SEQ ID NO: 11) foi obtido por PCR usando um DNA cromossômico de bacillus subtilis como um gabarito e oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 13 e 14 como iniciadores. O PCR foi realizado usando LA taq (fabricado por TaKaRa) como a seguir: um ciclo de retenção de calor a 94°C durante 5 minutos; e 25 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelando a 49°C durante 30 segundos, e alongando a 72°C durante 2 minutos. O produto PCR obtido foi purificado por um método convencional, e então digerido com BglII e BamHI e terminado cego. O fragmento foi inserido em pHSG299 que tinha sido digerido com AvaII e terminado cego. O obtido DNA foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por TAKARA BIO INC.). Então, as células bacterianas transformadas foram espalhadas em meio LB agar contendo 25 μg/ml Canamicina (abaixo, abreviado com "Km"), e incubadas durante uma noite. A seguir, colônias únicas foram isoladas como transformantes. Plasmídeos foram extraídos dos obtidos transformantes e o plasmídeo que tinha um inserto do Produto PCR objeto foi chamado pBS3. Fig. 1 mostra o procedimento para construção de pBS3.

(1-2) Construção de pBS4S

[000161] O sítio de reconhecimento de SmaI no gene resistente a canamicina em pBS3 foi modificado por substituição de nucleotídeo usando PCR cruzado sem causar substituição de aminoácido de modo que pBS3 não é cortado por SmaI endonuclease. Primeiro, PCR foi realizado usando pBS3 como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 15 e 16 como iniciadores, para assim obter um fragmento N-terminal do gene resistente a canamicina. Por outro lado, para obter um fragmento C-terminal do gene resistente a canamicina, PCR foi realizado usando pBS3 como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 17 e 18 como iniciadores. PCR foi realizado usando Pyrobest DNA Polymerase (fabricado por TAKARA BIO INC.) como a seguir: um ciclo de retenção de calor a 98°C durante 5 minutos; e 25 ciclos de desnaturação a 98°C durante 10 segundos, anelando a 57°C durante 30 segundos, e alongamento a 72°C durante 1 minuto, para obter o produto PCR objeto. SEQ ID NOS: 16 e 17 são parcialmente complementares entre si e não contém o sítio de reconhecimento de SmaI. Então, para obter um fragmento de comprimento completo do gene mutante resistente a canamicina sem o sítio de reconhecimento de SmaI, os produtos de gene N- terminal e C-terminal acima mencionados foram misturados juntos em quantidades substancialmente equimolares. PCR foi realizado usando os produtos de genes como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 15 e 18 como iniciadores para obter um fragmento de gene resistente a canamicina modificado no sítio de SmaI. O PCR foi realizado usando Pyrobest DNA Polymerase (fabricado por TAKARA BIO INC.) como a seguir: um ciclo de retenção de calor a 98°C durante 5 minutos; e 25 ciclos de desnaturação a 98°C durante 10 segundos, anelando a 57°C durante 30 segundos, e alongando a 72°C durante 1,5 minutos, para assim obter o produto PCR objeto.

[000162] O produto PCR foi purificado por um método convencional, e então digerido com BamII e então inserido dentro do sítio de reconhecimento de BamII acima-descrito de pBS3. O resultante plasmídeo foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (disponíveis de Takara Bio). Isto é, as células bacterianas transformadas foram espalhadas em meio LB agar contendo 25 μg/ml de canamicina, e incubadas durante uma noite. A seguir, colônias que apareceram foram selecionadas como transformantes. Plasmídeos foram isolados dos obtidos transformantes e o plasmídeo tendo um inserto do produto PCR objeto foi chamado pBS4S. Fig. 2 mostra o procedimento para construir pBS4S. Exemplo 2 <Construção de uma cepa rompida em gene odhA de C. glutamicum cepa ATCC13869 >

[000163] A sequência nucleotídica do gene odhA codificando α- cetoglutarato desidrogenase de bactéria corineforme já foi identificada (Microbiology 142, 3347-3354, (1996), GenBank No. de Acesso D84102). Com base em uma sequência nucleotídica do gene odhA, os iniciadores descritos em SEQ ID NOS: 1 e 2 foram projetados, e PCR foi realizado usando os iniciadores e o DNA cromossômico da cepa ATCC13869 como um gabarito para amplificar a sequência interna do gene odhA. O fragmento amplificado PCR foi completamente digerido com BamHI e inserido no sítio BamHI de pBS4S construído em Exemplo 1, assim o plasmídeo pBS4SΔsucAint foi obtido (Fig. 3).

[000164] pBS4SΔsucAint foi introduzido em C. glutamicum cepa ATCC13869 pelo método de pulso elétrico (JP-A-02-207791) e as células bacterianas transformadas foram espalhadas sobre meio CM-Dex agar (5g/l glicose, 10g/l polipeptona, 10g/l extrato de levedura, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgS(')-7l l.-('), 0,01 g/l l;eS(')-7l l.-('), 0,01 g/l MnSOU-51 H), 3 g/l uréia, 1,2 g/l hidrolisado proteína de soja, e 20 g/l agar, ajustado a pH 7,5 com NaOH: autoclavado a 120°C durante 20 minutos) contendo 25 μg/ml canamicina. Após cultivar a 31,5°C, PCR foi realizado usando cada um dos cromossomos extraídos das cepas que pareceram confirmar que estas cepas foram recombinantes de cruzamento único em que pBS4SΔsucAint foi incorporado por recombinação homóloga dentro do cromossomo. Iniciadores tendo cada a sequência (SEQ ID N): 3) específica para pBS4S plasmídeo e a sequência (SEQ ID N): 4) complementar à sequência cromossômica foi usado for PCR. Porque a sequência de pBS4S está ausente em uma cepa não recombinante, o fragmento é amplificado da cepa não recombinante enquanto um fragmento único é amplificado de um recombinante de cruzamento único.

[000165] O recombinante de cruzamento único assim obtido foi chamado cepa 2A-1. A cepa 13869 tipo selvagem e a cepa 2A-1 foram inoculadas em 20 ml de um meio de frasco (30g/l glicose, 15 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4^7H2O, 0,01 g/l FeSO4^7H2O, 0,01 g/l MnSO4^4-5H2O, 200 μg/l VB1 (vitamina B1), 300 μg/l Biotina, e 0,48 g/l hidrolisados de soja (T-N: nitrogênio total), ajustado a pH 8,0 com K)H: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), seguido por adição de 1 g de carbonato de cálcio esterilizado por calor, e cada uma das cepas foi cultivada com agitação a 31,5°C. Após o açúcar estar completamente consumido, a concentração de ácido L-glutâmico que tinha acumulado no meio foi determinada. )s resultados são mostrados em Tabela 1 ()D620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída a 101 vezes, e indica a quantidade de células,, e Glu (g/L) indica a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado ). Verificou-se que a cepa 2A-1 produziu ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina, enquanto a cepa parental ATCC 13869 não produziu ácido L-glutâmico de todo.<Tabela 1 Quantidade de ácido L-glutâmico produzido pelo controle e a cepa 2A-1 >

Exemplo 3 <Construção de uma cepa revertente a gene odhA da cepa 2A- 1 (odhA gene-revertant strain)>

[000166] Na cepa 2A-1, o gene odhA no cromossomo foi rompido por pBS4SΔsucAint. Por cura do plasmídeo (plasmid curing) do cromossomo desta cepa, o gene odhA pode ser revertido para o tipo selvagem. Apesar da cepa rompida em gene odhA crescer muito lentamente em um meio não contendo açúcar, a cepa revertante de gene odhA em que o gene odhA reverteu para o tipo selvagem cresce bem em um meio não contendo açúcar como CM2B (10 g/l polipeptona, 10 g/l extrato de levedura, 5 g/l NaCl, 10 μg/l Biotina, 20 g/l agar, ajustado a pH 7,0 com KOH). Para obter esta cepa revertante, a cepa 2A-1 foi espalhada sobre meio agar CM2B para selecionar cepas melhoradas no crescimento. A cepa melhorada no crescimento que apareceu foi chamada 2A-1R e isolada no meio agar CM2B e a sensibilidade a canamicina da cepa 2A-1R foi examinada. Como resultado, verificou-se que todas das cepas selecionadas foram sensíveis a canamicina e resistentes a sacarose. Porque pBS4SΔsucAint contém um gene resistente a canamicina e o gene sacB codificando levan sucrase, cepas abrigando pBS4SΔsucAint demonstram resistência a canamicina e sensibilidade a sacarose, enquanto cepas das quais pBS4SΔsucAint foi removido demonstram sensibilidade a canamicina e resistência a sacarose. Assim, foi considerado que o gene odhA reverteu para uma de tipo selvagem na cepa 2A-1R. Determinação de uma sequência nucleotídica do gene odhA confirmou que a cepa tinha o gene odhA tipo selvagem.

[000167] A capacidade de cepa 2A-1R de produzir ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina foi confirmada pelo mesmo método como no exemplo 2. Os resultados são mostrados em Tabela 2 (OD620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída a 101 vezes, e indica a quantidade de células, e Glu (g/L) indica a quantidade de ácido L- glutâmico acumulado ). Apesar do acúmulo de ácido L-glutâmico pela cepa 2A-1R ser levemente diminuído como comparado à cepa 2A-1, a cepa 2A-1R produziu uma quantidade bem maior de ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina do que a cepa de tipo selvagem ATCC13869 (Tabela 2). Além disso, quando a cultura em agitação foi continuada após o açúcar estar completamente consumido, decomposição de ácido L-glutâmico foi observada na cepa 2A-1R, que provou que o gene odhA tinha revertido para o tipo selvagem nesta cepa (Fig.4). <Tabela 2 Produção de ácido L-glutâmico pela cepa de controle, cepa rompida em gene odhA e cepa revertante de gene odhA >

Exemplo 4 <Isolamento de um gene que está envolvido na produção de ácido L-glutâmico pela cepa 2A-1R>

[000168] No meio agar CM2B, a cepa 2A-1R pode formar colônias em substancialmente a mesma taxa que a da cepa tipo selvagem ATCC13869. No entanto, no meio de placa mínimo (20 g/l glicose, 2,64 g/l sulfato de amônio, 0,5 g/l KH2PO4, 0,5 g/l K2HPO4, 0,25 g/l MgSO4^7H2O, 0,01 g/l FeSO4^7H2O, 0,01 g/l MnSO^HO, 0,01 g/l CaCh, 0,02 mg/l CuSO4, 40 g/l MOPS, 30 mg/l ácido protocatequíco, 200 μg/l VBpHu, 300 μg/l Biotina, 20 g/l agar, ajustado a pH 6,7 com NaOH), a cepa 2A-1R mostrou uma taxa de formação de colônias consideravelmente diminuída como comparado com a cepa tipo selvagem ATCC13869. Assim, um gene que pode recuperar o crescimento de uma cepa 2A-1R na meio mínimo foi encontrado.

[000169] O DNA cromossômico da cepa ATCC13869 foi parcialmente digerido com Sau3AI e ligado no vetor bidirecional pVK9 que tinha sido digerido com BamHI. O obtido plasmídeo foi precipitado com etanol e usado para transformar célula competente de E. coli DH5α (TAKARA BIO INC.) por um método de pulso elétrico. pVK9 é um vetor bidirecional obtido por terminação cega do sítio AvaII de pHSG299 (TAKARA BIO INC.) e inserindo ai um fragmento compreendendo a sequência automaticamente replicável em bactérias corineformes excisadas com BamHI e KpnI de pHK4 (JP-A-05-007491). As células transformadas foram espalhadas sobre um meio agar LB (10 g/l polipeptona, 5 g/l extrato de levedura, 5 g/l NaCl, 20 g/l agar, ajustado a pH 7,0 com NaOH) contendo 25 μg/ml canamicina, e cultivado a 37°C durante uma noite. No próximo dia, todas as e colônias que apareceram foram coletadas da placa com um laço de platina e plasmídeos foram extraídos para construir uma biblioteca de plasmídeo da cepa ATCC13869. A biblioteca de plasmídeo foi transformada em uma cepa 2A-1R obtida em Exemplo 3 pelo método de pulso elétrico, e as células transformadas foram aplicadas a um meio agar mínimo contendo 25 μg/ml canamicina. As cepas que mostraram uma aumentada taxa de formação de colônias foram selecionadas. Por extração de um plasmídeo das cepas selecionadas mostrando a aumentada taxa de formação de colônias, verificou-se que o fragmento tendo uma sequência nucleotídica mostrada em SEQ ID NO: 5 foi inserido dentro do sítio BamHI de pVK9. O obtido plasmídeo foi chamado pL5k.

[000170] Comparação de uma sequência nucleotídica inserida na pL5k com a sequência de genoma já publicada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Acc. No. NC_003450) mostrou que pL5k continha somente um ORF codificando a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6.

[000171] O programa "SOSUI"disponível na Internet (sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html como de 2004/10/07) foi usado para prever se o ORF codifica a proteína de membrana. Resultados de análise do ORF por uso de "SOSUI" sugeriram que cinco regiões de transmembrana estão presentes nesta sequência de aminoácidos. Em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, as regiões de transmembrana correspondem às regiões de aminoácidos 1 a 23, aminoácidos 25 a 47, aminoácidos 62 to 84, aminoácidos 86 a 108, e aminoácidos 110 a 132. Sequências DNA codificando estas regiões correspondem aos nucleotídeos 1437 a 1505, nucleotídeos 1509 a 1577, nucleotídeos 1620 a 1688, nucleotídeos 1692 a 1760, e nucleotídeos 1764 a 1832 de SEQ ID NO: 5. Cada uma sequência de aminoácidos destas regiões é mostrada em SEQ ID NOS: 25 a 29 e Tabela 3. <Tabela 3 Regiões de transmembrana previstas da proteína codificada pelos genes inseridos>

[000172] Uma outra pesquisa da literatura revelou que o ORF é chamado YggB (NCgl 1221) (FEMS Microbiology letters 218(2003)305- 309). Exemplo 5 <Identificação da mutação introduzida dentro de um gene yggB de uma cepa 2A-1R>

[000173] O gene yggB pode recuperar o crescimento de uma cepa 2A- 1R no meio mínimo, o que sugeriu a possibilidade que o gene yggB da cepa 2A-1R tem algumas mutações. Assim, a sequência nucleotídica do gene yggB da cepa 2A-1R foi determinada. Os resultados indicaram que na cepa 2A-1R, um IS foi inserido dentro da região C-terminal do gene yggB tipo selvagem (Fig. 5). A sequência nucleotídica of o gene yggB tipo mutante derivada de uma cepa 2A-1R é mostrada em SEQ ID NO: 7 e a correspondente sequência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 8.

[000174] Isto sugeriu a possibilidade que a capacidade de uma cepa 2A- 1R para produzir ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina foi devido à mutação no gene yggB. Deve ser notado que esta mutação estava presente não somente na cepa 2A-1R, mas também na cepa 2A-1. É assumido que esta mutação tenha ocorrido como uma mutação de supressão para excreção de ácido L-glutâmico da célula de forma estável mediante ao rompimento do gene odhA. A mutação em que um IS foi inserido foi chamado a mutação tipo 2A-1. Exemplo 6 <Construção da cepa tendo o gene yggB mutante tipo 2A-1 e avaliação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico> (6-1) Introdução de uma mutação tipo 2A-1 em uma cepa tipo selvagem e avaliação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico (recombinantes de cruzamento único)

[000175] PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de uma cepa 2A-1 como um gabarito e DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 10 como iniciadores para amplificar o fragmento do gene yggB tendo a mutação tipo 2A-1. O produto amplificado foi tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS3 obtido em Exemplo 1 para assim obter um plasmídeo contendo gene yggB mutante tipo 2A-1 (pBS3yggB2A).

[000176] O pBS3yggB2A obtido foi introduzido em C. glutamicum ATCC13869 pelo método de pulso elétrico e as células transformadas foram espalhadas sobre meio agar CM-Dex contendo 25 μg/ml canamicina. A cepas que apareceram após cultivar a 31,5°C foram avaliadas por PCR para confirmar que são recombinantes de cruzamento único em que pBS3yggB2A foi incorporado dentro do cromossomo por recombinação homóloga. O recombinante obtido de cruzamento único foi chamado 13869-2A. Nesta cepa, tanto o gene yggB tipo selvagem como o gene yggB tipo mutante estão presentes e são expressados.

[000177] A capacidade da obtida cepa introduzida no gene yggB tipo mutante 13869-2A para produzir ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina foi avaliada pelo método descrito em Exemplo 2. Os resultados são mostrados em Tabela 4 (OD620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída 101 vezes, e indica a quantidade de células, e Glu (g/L) indica a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado ). A cepa 13869-2A produziu ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina quando a cepa ATCC13869de tipo selvagem não pode produzir ácido L-glutâmico. Isto indicou que a mutação no gene yggB pode melhorar a produção de ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina. <Tabela 4 Quantidade de ácido L-glutâmico acumulado pela cepa de controle, cepa 2A-1R, e a cepa introduzida no gene yggB tipo mutante >

(6-2) Introdução gene yggB mutante tipo 2A-1 dentro da cepa tipo selvagem e avaliação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico (recombinantes cruzados duplos)

[000178] Para construir a cepa tendo somente o gene yggB tipo mutante, a cepa 13869-2A foi cultivada no meio líquido CM-Dex durante uma noite e a cultura obtida foi espalhada sobre o meio agar S10 (100 g/l sacarose, 10 g/l polipeptona, 10 g/l extrato de levedura, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSOi^7H2O, 0,01 g/l FeSO^IH), 0,01 g/l MnSOU-51120, 3 g/l uréia, 1,2 g/l hidrolisados de proteína de soja, 20 g/l agar, ajustado a pH 7,5 com NaOH: autoclavado a 120°C durante 20 minutos) e cultivado a 31,5°C. Dentre as colônias que apareceram, a cepa demonstrando sensibilidade a canamicina foi isolada em meio agar CM2B. DNAs cromossômicos foram preparados a partir das cepas. Então, foi realizado PCR usando DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID N)S: 9 e 10 como iniciadores para confirmar que a cepa tem somente um gene yggB tipo mutante. A cepa contendo o gene yggB tipo mutante em que uma sequência semelhante a IS foi inserida foi chamada 13869-2A-7.

[000179] A capacidade da cepa obtida 13869-2A-7 para produzir ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina foi avaliada pelo método descrito em Exemplo 2. )s resultados são mostrados em Tabela 5 ()D620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída a 101 vezes, e indica a quantidade de células, e Glu (g/L) indica a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado ). A cepa 13869-2A-7 produziu ácido L- glutâmico equivalente a ou maior do que uma cepa 2A-1R, que confirmou que a produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme na presença de uma quantidade em excesso de biotina foi causada pela mutação no gene yggB. <Tabela 5 Quantidade de ácido L-glutâmico produzido pela cepa de controle, cepa 2A-1R e a cepa introduzida no gene yggB tipo mutante>

Exemplo 7 <Construção da cepa introduzida no gene yggB mutante tipo A1 e avaliação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico >

[000180] Como resultado da triagem usando a cepa com o gene odhA rompido produzindo ácido L-glutâmico acima mencionada (cepa ΔsucA), cinco tipos de mutações foram identificados em um gene yggB além da mutação 2A-1 acima mencionada. Abaixo, estas mutações foram chamadas mutação tipo A1, mutação tipo 19, mutação tipo L30, mutação tipo 8, e mutação tipo 66. Os genes yggB tipo mutantes tendo cada uma mutação Tipo A1, mutação tipo 19 e mutação tipo L30 foram introduzidos dentro do cromossomo da cepa ATCC13869, e o efeito de cada mutação foi avaliado. O gene yggB tipo mutante tendo mutação tipo 8 foi introduzido dentro do cromossomo da cepa ATCC14067, e o efeito da mutação foi avaliado. O gene yggB tipo mutante tendo mutação tipo 66 foi introduzido dentro do cromossomo da cepa de C. melassecola ATCC17965 cepa, e o efeito da mutação foi avaliado.

[000181] A mutação A1 tipo é uma mutação que insere “TTCATTGTG” próximo da posição “G” na posição 1480 do gene yggB tipo selvagem (o gene tipo selvagem de C. glutamicum é mostrado em nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID NO: 5), e causa inserção de CysSerLeu entre Leu na posição 14 e o Trp na posição 15 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante em que esta mutação foi introduzida é mostrada em SEQ ID NO: 19 e a sequência de aminoácidos do mutante tipo YggB codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 20.

[000182] O gene mutante tipo A1 pode ser obtido como a seguir. PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 30 e 31 como iniciadores e o DNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal. Similarmente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 32 e 33 como iniciadores para preparar um fragmento C-terminal. Subseqüentemente, PCR é realizado por uso de uma mistura equimolar do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e os DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 34 como iniciadores para amplificar um fragmento parcial do gene yggB mutante tipo A1. O obtido fragmento de gene yggB tipo mutante é tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS4S para obter um plasmídeo par introduzir este tipo de mutação. O pBS4yggBA1 assim obtido é introduzido dentro do cromossomo da cepa ATCC13869 no mesmo modo como descrito em Exemplo 6 e então somente a porção de plasmídeo foi curada do cromossomo. A sequência nucleotídica do gene yggB da cepa sensível a canamicina obtida é determinada e a cepa tendo o gene yggB mutante tipo A1 é selecionada. A cepa tipo A1 introduzida no gene yggB mutante foi chamada cepa ATCC13869-A1.

[000183] A cepa ATCC13869-A1 e a cepa de controle ATCC13869 foram cultivadas no mesmo modo como em Exemplo 2. Após completar a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha se acumulado no meio de cultura foi medida pelo método conhecido. Verificou-se que a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo A1 produziu ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina em uma quantidade maior como comparado a uma cepa de controle. <Tabela 6 Quantidade de ácido L-glutâmico produzido pela cepa de controle, e a cepa introduzida no gene yggB tipo mutante (tipo A1) >

Exemplo 8 <Construção da cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 19 e avaliação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico>

[000184] A mutação tipo 19 é uma mutação que substitui o “G” na posição 1734 do gene yggB tipo selvagem (o gene tipo selvagem de C. glutamicumé mostrado em nucleotídeos 1437-3035 de SEQ ID NO: 5) com um “A”, e causa substituição do Ala na posição 100 com Thr na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo este tipo of mutação é mostrada em SEQ ID NO: 21 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 22.

[000185] No mesmo modo como em Exemplo 7, a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 19 é construída. Especificamente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 30 e 35 como iniciadores e o DNA cromossômico da cepa ATCC13869 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal. Similarmente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 33 e 36 como iniciadores para preparar um fragmento C-terminal. Subseqüentemente, PCR é realizado por uso de uma mistura equimolar do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e os DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 34 como iniciadores, para amplificar um fragmento parcial do gene yggB mutante tipo 19. O obtido fragmento yggB é tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS4S para obter um plasmídeo para introduzir esta mutação. O assim obtido pBS4yggB19 é introduzido dentro do cromossomo da cepa ATCC13869 no mesmo modo como descrito em Exemplo 6 e então a porção de vetor é curada do cromossomo. A sequência nucleotídica do gene yggB da cepa sensível à canamicina obtida é determinada e a cepa tendo o tipo 19 gene yggB é selecionada. A cepa mutante tipo 19 foi chamada cepa ATCC13869-19.

[000186] A cepa ATCC13869-19 e a cepa de controle ATCC13869 foram cultivadas no mesmo modo como em exemplo 2. Após completar a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado no caldo de cultura foi medida por um método convencional. Verificou-se que a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 19 produziu ácido L-glutâmico na presença de uma quantidade em excesso de biotina em uma quantidade maior como comparado a uma cepa de controle. <Tabela 7 Quantidade de ácido L-glutâmico produzido pela cepa de controle, e a cepa introduzida no gene yggB tipo mutante (tipo19>

Exemplo 9 <Construção de cepa introduzida no gene yggB mutante tipo L30 e avaliação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico>

[000187] A mutação tipo L30 é uma mutação que substitui o “C” na posição 1768 do gene yggB de tipo selvagem (o gene de tipo selvagem de C. glutamicum é mostrado em SEQ ID NO: 5) com “T”, e causa substituição do Ala na posição 111 com Val na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo este tipo de mutação é mostrada em SEQ ID NO: 23 e a sequência de aminoácidos da proteína YggB tipo mutante codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 24.

[000188] No mesmo modo como em exemplo 7, a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo L30 foi construída. Especificamente, PCR foi realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 30 e 37 como iniciadores e o DNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal. Similarmente, PCR foi realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 34 e 38 como iniciadores para preparar um fragmento C-terminal. Subseqüentemente, PCR foi realizado por uso de uma mistura equimolar do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e os DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 34 como iniciadores para amplificar um fragmento parcial do gene yggB mutante tipo L30. O obtido fragmento de yggB foi tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS4S para obter um plasmídeo para introduzir esta tipo of mutação. O assim obtido pBS4yggB-L foi introduzido dentro do cromossomo da cepa ATCC13869 no mesmo modo como descrito em Exemplo 6, e então a porção de vetor foi curada do cromossomo. A sequência nucleotídica do gene yggB da cepa obtida sensível a canamicina foi determinada e a cepa tendo gene yggB mutante tipo L30 foi selecionada. A cepa introduzida no gene yggB mutante tipo L30 foi chamada cepa ATCC13869-L30.

[000189] A cepa ATCC13869-L30 e a cepa de controle ATCC13869 foram cultivadas no mesmo modo como em exemplo 2. Após completar a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado no caldo de cultura foi medida por um método convencional. Os resultados são mostrados em Tabela 8 (OD620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída a 101 vezes, e indica a quantidade de células, e Glu (g/L) indica a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado). A cepa ATCC13869-L30 tendo o gene yggB mutante tipo L30 causou um acúmulo de ácido L-glutâmico em uma maior quantidade como comparado com a cepa parental ATCC13869. <Tabela 8 Quantidade de ácido L-glutâmico produzido pela cepa de controle e a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo L30>

Exemplo 10

[000190] Avaliação das cepas introduzidas no gene yggB tipo mutante sob condições de produção de ácido L-glutâmico

[000191] Produção de ácido L-glutâmico de bactéria corineforme é induzida por adição de tensoativos como Tween40 ou por limitação da concentração de biotina. Assim, a cepa ATCC13869 e a cepa ATCC13869-19 foram cultivadas sob a condição contendo Tween40 e uma condição contendo uma quantidade limitada de biotina, respectivamente.

[000192] Cada uma das cepas foi inoculada em 20 ml de meio de cultura de semente (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. A solução de cultura obtida após completo consumo de açúcares foi usada como uma solução de cultura de semente na seguinte cultura principal.

[000193] Para cultivar com Tween40, 2 ml da solução de cultura de semente foram inoculados em 20 ml do meio de cultura principal (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. quando OD620 no caldo de cultura diluído 101 vezes alcançou 0,2, Tween40 foi adicionado a uma final concentração de 5g/L e a cultura foi continuada.

[000194] Para cultivar com biotina limitada, 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em 20 ml do meio de cultura principal (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. Sob estas condições de cultura, a concentração final de biotina é calculada para ser cerca de 2,9μg/L.

[000195] Após a cultura de 40 horas, a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado no meio foi medida para a cultura adicionada com Tween40 e a cultura limitada em biotina. O resultado é mostrado em Tabela 9. Verificou-se que a cepa ATCC13869-19 produziu ácido L-glutâmico em uma quantidade maior do que a cepa de controle sob condições de produção de ácido L-glutâmico. <Tabela 9 Quantidade de ácido L-glutâmico produzido por uma cepa de controle e a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 19 sob condições de produção de ácido L-glutâmico>

[000196] A cepa ATCC13869 tipo selvagem, cepas mutantes de yggB ATCC13869-19, ATCC13869-A1, ATCC13869-L30, e a cepa tendo um plasmídeo contendo um gene yggB tipo selvagem (ATCC13869/pL5k-1), e uma cepa tendo um plasmídeo de controle (ATCC13869/pVK9) foram cultivadas com Tween40. Cada uma destas cepas foi cultivada em um meio de placa CM-Dex durante a noite, e as células coletadas de área de 1/6 da placa foram inoculadas em 20 ml de um meio de frasco (80g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgS(V7l I2O, 0,01 g/l FeSO^I I2O, 0,01 g/l MnSOU-5IH), 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, e 0,48 g/l hidrolisados de soja (T-N: nitrogênio total), ajustado a pH 8,0 com K)H: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), seguido por adição de 1 g de carbonato de cálcio esterilizado por calor, e cada uma das cepas foi cultivada com agitação a 31,5°C. Após uma cultura de 5 horas, Tween40 foi adicionado a uma concentração final de 1g/L e a cultura foi continuada. Tabela 10 mostra a quantidade de células ()D620) e a quantidade de ácido L-glutâmico que tinham acumulado no meio após 24 horas. Verificou-se que a cepa ATCC13869-19, cepa ATCC13869-A1, cepa ATCC13869-L30, e a cepa tendo um plasmídeo contendo um gene yggB tipo selvagem apresentam uma melhorada capacidade de produzir ácido L-glutâmico sob condições de produção de ácido L-glutâmico. <Tabela 10>

Exemplo 11 <Construção da cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 8 e avaliação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico>

[000197] A mutação tipo 8 é uma mutação que substitui o “G” na posição 837 de SEQ ID NO: 61 com um “A”, e causa substituição do Ala na posição 111 com Thr na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo este tipo de mutação é mostrada em nucleotídeos 507-2093 de SEQ ID NO: 63 e a sequência de aminoácidos da proteína YggB tipo mutante codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 64.

[000198] No mesmo modo como em exemplo 7, a cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 8 é construída. Especificamente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 30 e 65 como iniciadores e o DNA cromossômico de Brevibacterium flavum cepa ATCC14067 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal. Similarmente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 34 e 66 como iniciadores para preparar um fragmento C- terminal. Subseqüentemente, PCR é realizado por uso de uma mistura equimolar do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e os DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 34 como iniciadores para amplificar um fragmento parcial do gene yggB mutante tipo 8. O obtido fragmento do gene yggB é tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS4S para obter um plasmídeo para introduzir este tipo de mutação. O pBS4yggB8 assim obtido é introduzido dentro do cromossomo de cepa ATCC14067 no mesmo modo como descrito em Exemplo 6 e então a porção de vetor é curada do cromossomo. A sequência nucleotídica do gene yggB de da cepa sensível à canamicina obtida é determinada e a cepa tendo o gene yggB mutante tipo 8 foi selecionada. A cepa tipo 8 introduzida no gene yggB mutante tipo 8 é chamada cepa ATCC14067-yggB8. Exemplo 12 <Construção da cepa introduzida no gene yggB mutante tipo 6 e avaliação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico>

[000199] A mutação tipo 66 é uma mutação que substitui o “C” na posição 1673 de SEQ ID NO: 67 com um “T”, e causa substituição do Pro na posição 424 com Leu na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68. A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo este tipo de mutação é mostrada em SEQ ID NO: 69 e a sequência de aminoácidos de uma proteína YggB tipo mutante codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 70.

[000200] No mesmo modo como em exemplo 7, a cepa tipo 66 introduzida no gene yggB mutante é construída. Especificamente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 30 e 71 como iniciadores e DNA cromossômico de C. melassecola cepa ATCC17965 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal. Similarmente, PCR é realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 34 e 72 como iniciadores para preparar um fragmento C-terminal. Subseqüentemente, PCR é realizado por uso de uma mistura equimolar do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e os DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 9 e 34 como iniciadores para amplificar um fragmento parcial do gene yggB mutante tipo 66. O fragmento yggB obtido é tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS4S para obter um plasmídeo para introduzir este tipo de mutação. O pBS4yggB66 assim obtido é introduzido dentro do cromossomo de cepa ATCC17965 no mesmo modo como descrito em Exemplo 6 e então uma porção de vetor é curada do cromossomo. A sequência nucleotídica do gene yggB da cepa sensível à canamicina obtida é determinada e a cepa tendo o gene yggB mutante tipo 66 foi selecionada. A cepa tipo 66 introduzida no gene yggB mutante é chamada cepa ATCC17965-yggB66. Exemplo 13 <Triagem dos genes yggB tipo mutante por mutação in vitro>

[000201] Genes yggB tipo mutante podem ser obtidos por introdução de uma mutação aleatória dentro de um gene yggB tipo selvagem in vitro, transformando uma bactéria corineforme com o gene yggB introduzido na mutação, e selecionando cepas mutantes capazes de produzir ácido L- glutâmico sem adição de tensoativos ou penicilina na presença de uma quantidade em excesso de biotina.

(13-1) Construção de uma cepa rompida em gene yggB

[000202] Para realizar a triagem para genes yggB tipo mutante, primeiro uma cepa rompida em gene yggB foi construída. PCR foi realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 39 e 40 como iniciadores e o DNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito para preparar um fragmento N-terminal. Similarmente, PCR foi realizado por uso dos DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 41 e 42 como iniciadores para preparar um fragmento C-terminal. SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41 são complementar entre si. Subseqüentemente, PCR foi realizado por uso de uma mistura equimolar do fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal como um gabarito e os DNAs sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 39 e 42 como iniciadores para obter um fragmento contendo um gene yggB em que ORF é deletado.

[000203] O PCR fragmento obtido foi tratado com SacI e inserido dentro do sítio SacI de pBS4S para obter um plasmídeo utilizável para romper o gene yggB. O pBS4ΔyggB assim obtido foi introduzido dentro do cromossomo de cepa ATCC13869 no mesmo modo como descrito em Exemplo 6 e uma porção de vetor é curada do cromossomo. PCR foi realizado por uso do DNA cromossômico da cepa sensível à canamicina obtida como um gabarito e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 39 e 42 como iniciadores par confirmar que o gene yggB foi rompido. O a cepa rompida em yggB foi chamada cepa ATCC13869ΔyggB.

(13-2) Triagem in vitro de genes yggB tipo mutante

[000204] Mutagênese do gene yggB foi realizada como a seguir. Primeiro, o plasmídeo pL5k acima-descrito foi tratado com XhoI e SalI e auto-ligado para remover as regiões diferentes do gene yggB, e assim o plasmídeo pL5kXS foi obtido. Um sítio de reconhecimento SalI não existe em uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 5 mas está presente no sítio de multi-clonagem de pBS3. Cerca de 10 μg do pL5kXS obtido foram dissolvidos em tampão fosfato 500 mM contendo 400 mM hidroxilamina e 1 mM EDTA (pH 6,0), e aquecido a 75°C durante 30 a 90 minutos para introduzir uma mutação. O plasmídeo após tratamento de mutagênese foi dessalinizado usando SUPREC-02 (fabricado por TAKARA BIO INC.) e então introduzido em cepa ATCC13869ΔyggB pelo método descrito em Exemplo 6. Transformadas células foram triadas no meio CM2B contendo 25 μg/ml de canamicina. Como um controle, pL5kXS sem tratamento de mutagênese foi introduzido entro da cepa ATCC13869ΔyggB. Os transformantes que apareceram são inoculados em 2 ml de um meio líquido CM2BGU2 (meio CM2B descrito em Exemplo 3 ainda contendo 10 g/l glicose e 15 g/l uréia) e cultivado a 31,5°C durante 5 horas com agitação, seguido por determinação da concentração de ácido L-glutâmico que tinha acumulado no caldo de cultura.

[000205] Tabela 11 mostra o resultado de cultivar a cepa obtida por transformação da cepa ATCC13869ΔyggB com pL5kXS mudado no meio CM2BGU2. Três cepas que causam acúmulo de mais do que 1g/L de ácido L- glutâmico foram obtidas dentre os transformantes transformados com plasmídeos mudados de 60, ou 90 minutos. A quantidade de ácido L- glutâmico contida no meio de partida é de 0,16g/L, e a quantidade de ácido L- glutâmico que tinha acumulado pela cepa de controle ATCC13869ΔyggB/pL5kXS (sem tratamento de mutagênese) foi de 0,31g/L.

[000206] Tabela 12 mostra os resultados de cultivar transformantes obtidos por transformação de cepa ATCC13869ΔyggB com pL5kXS mudado no meio CM2BGU, que tem a mesma composição que o meio CM2BGU2 acima mencionado exceto que a concentração de uréia é 1,5g/L. Um clone que causa acúmulo de mais do que 1g/L de ácido L-glutâmico foi obtido dentre os transformantes transformados com plasmídeos mudados em 90 minutos. <Tabela 11. Quantidade de produção de ácido L-glutâmico por cepas transformadas com plasmídeos mudados>

<Tabela 12. Quantidade de produção de ácido L-glutâmico por cepas transformadas com plasmídeos mudados >

[000207] Um plasmídeo foi extraído da cepa transformada com plasmídeos mudados 60-minuto que produziu mais do que 1g/L de ácido L- glutâmico mostrado em Tabela 11, e o obtido plasmídeo foi chamado pL5kXSm-22. A plasmídeo foi também extraído da cepa transformada com plasmídeos mudados em 60-minuto que produziu mais do que 0,9g/L de ácido L-glutâmico mostrado em Tabela 12, e o obtido plasmídeo foi chamado pL5kXSm-27. Cepa ATCC13869 foi transformada com os plasmídeos e as cepas obtidas foram chamadas ATCC13869ΔyggB/pL5kXS e ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27, ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22, respectivamente. Estas cepas foram cultivadas sob as condições descritas em Exemplo 2, e o acúmulo de ácido L-glutâmico após uma cultura de 4 horas foi analisado. Tabela 13 mostra o valor médio de três experimentos independentes. Verificou-se que a cepa ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27 e a cepa ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22 produziram significantemente mais ácido L-glutâmico do que a cepa introduzida no plasmídeo não mudado. Estes resultados demonstram que o gene yggB tipo mutante da presente invenção pode ser obtido por mutagênese aleatória in vitro. A sequência nucleotídica do gene yggBs contida em pL5kXSm-22 é mostrada em SEQ ID NOS: 73 e 75, respectivamente. O plasmídeo pL5kXSm-22 tem uma mutação que substitui “C” na posição 2745 com “T” em SEQ ID NO: 5 e causa substituição de Pro na posição 437 de SEQ ID NO: 6 com Ser. Além disso, esta mutação foi acompanhada pela mutação que substitui “C” na posição 3060 com T em SEQ ID NO: 5 (mutação tipo 22). A sequência nucleotídica do gene yggB tipo mutante tendo esta mutação é mostrada em SEQ ID NO: 73 e a sequência de aminoácidos da proteína YggB tipo mutante codificada pelo gene é mostrada em SEQ ID NO: 74. <Tabela 13. Quantidade de produção de ácido L-glutâmico por cepas transformadas com plasmídeos compreendendo o gene yggB mudado>

(13-3) Introdução dos genes yggB tipo mutante em bactérias corineformes e avaliação de produção de ácido L-glutâmico

[000208] O gene yggB tipo mutante obtido em (13-2) é introduzido em uma bactéria corineforme. O método de introduzir o gene é como a seguir.

[000209] Cada um dos genes yggB tipo mutante é introduzido em pBS4S pelo método descrito em Exemplo 6 e o plasmídeo obtido é usado para obter uma cepa em que um gene yggB tipo selvagem no cromossomo é substituído com o gene yggB tipo mutante. A cepa em que o gene yggB tipo mutante é introduzido e a cepa de controle ATCC13869 foram cultivadas no mesmo modo como em exemplo 2. Após completar a cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado na cultura meio é medida por um método conhecido para confirmar que o acúmulo de ácido L-glutâmico é aumentado por introdução do gene yggB tipo mutante. Deste modo, uma cepa tendo um gene yggB tipo mutante com aumentada capacidade para produzir ácido L-glutâmico pode ser obtida. Exemplo 14 <Avaliação da resistência do análogo de ácido L-glutâmico de uma cepa tendo o gene yggB tipo mutante>

(14-1) Avaliação de resistência a ácido 4-fluoroglutâmico em um meio sólido

[000210] Previu-se que as cepas que tem melhorada capacidade de produção de ácido L-glutâmico devido à introdução do gene yggB tipo mutante devem ter uma diminuída sensibilidade (resistência aumentada) aos análogos de ácido L-glutâmico. Assim, sensibilidade das cepas a ácido 4- fluoroglutâmico foi analisada como a seguir.

[000211] Solução de ácido 4-fluoroglutâmico que foi ajustada a pH 6,7 com NaOH e esterilizada com filtração foi adicionada ao meio mínimo descrito em Exemplo 4 de modo que da concentração final de ácido 4- fluoroglutâmico foi 7,5 mM. Cada uma dentre as cepa ATCC13869, cepa ATCC13869-L30, e cepa ATCC13869-A1 foi espalhada sobre a placa CM- Dex e cultivada durante a noite. Então, as células foram coletadas da placa e lavadas com solução a 0,85% de NaCl esterilizada, e diluídas na concentração de células descrito em Figura 6, colocadas em pontos sobre a placa contendo ácido 4-fluoroglutâmico e uma placa de controle que não continha ácido 4- fluoroglutâmico, e cultivadas a 31,5°C. O curso de tempo de crescimento de cada cepa é mostrado em Figura 6. Apesar da cepa ATCC13869 de tipo selvagem crescer mais rápido do que a cepa introduzida no gene yggB tipo mutante na ausência de ácido 4-fluoroglutâmico, a cepa introduzida no gene yggB tipo mutante cresce mais rápido do que a cepa ATCC13869 tipo selvagem na presença de ácido 4-fluoroglutâmico.

(14-2) Avaliação de resistência a ácido 4-fluoroglutâmico em um meio líquido

[000212] Ácido 4-fluoroglutâmico foi adicionado no meio mínimo líquido tendo a mesma composição como descrito em Exemplo 4, mas não contendo ágar na concentração final de 1,25mM, 2,5mM, 5mM, 10mM, e 20mM, respectivamente. Cada uma dentre a cepa ATCC13869, cepa ATCC13869ΔyggB, cepa ATCC13869-L30, e cepa ATCC13869-A1 foi espalhada sobre uma placa CM-Dex e cultivada a 31,5°C durante a noite. Então, células foram coletadas, e após lavagem com a solução a 0,85% NaCl esterilizada, inoculadas dentro do meio líquido e cultivadas a 31,5 °C com agitação. Quando o OD660 de cada cepa cultivada sem ácido 4- fluoroglutâmico alcançou 1,0, a cultura foi terminada e a solução de cultura obtida foi diluída de modo apropriado e espalhada sobre a placa CM-Dex durante a noite. O número de colônias que apareceram foi calculado e designado como o número de células viáveis. Figura 7 mostra o número de células relativo em cada concentração de ácido 4-fluoroglutâmico quando o número de células da cultura sem ácido 4-fluoroglutâmico foi fixado a 1.

[000213] Verificou-se que a cepa ATCC13869-A1 e a cepa ATCC13869-L30 tem diminuída sensibilidade a ácido 4-fluoroglutâmico.

[000214] Estes resultados também mostraram que cepas tendo um gene yggB tipo mutante podem ser obtidas pela triagem usando análogos de ácido L-glutâmico como ácido 4-fluoroglutâmico. Exemplo 15 <Construção do gene yggB e cepa mutante dupla de gene odhA >

[000215] A cepa mutante dupla de gene yggB e gene odhA foi preparada por introdução de um gene odhA tipo mutante dentro da cepa ATCC13869-L30 acima mencionada.

[000216] Primeiro, cada uma das mutações mostradas em Tabela 14 foi introduzida dentro de um gene odhA codificando subunidade E1o de α- KGDH no cromossomo da cepa ATCC13869-L30. Na Tabela 14, sequências nucleotídicas da região correspondendo a nucleotídeos 2528 a 2562 de SEQ ID NO: 43 em cada um dentre o gene odhA tipo mutante são mostradas. Na Tabela 15, as sequências de aminoácidos da região correspondendo a aminoácidos 696 a 707 de SEQ ID NO: 44 em cada uma das sequências de aminoácidos codificadas pelos genes odhA tipo mutante são mostradas.

[000217] A cepa L30sucA8 em que o gene odhA tendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 45 é introduzido pode ser obtida como a seguir. O fragmento de gene odhA mutante é preparado por PCR usando iniciadores de SEQ ID NOS: 53 e 54. O fragmento obtido é digerido com BamHI e ligado ao sítio BamHI de plasmídeo pKF19m que é fixado a Mutan-Super Express Km (Takara Bio). Então, PCR é realizado usando um iniciador de SEQ ID NO: 55 tendo uma extremidade 5’ fosforilada e o iniciador de seleção de Mutan-Super Express Km, e produto PCR obtido é usado para transformar cepa sup0 de E. coli, como cepa MV1184, para obter um plasmídeo contendo o fragmento de odhA mutante. Este fragmento é inserido dentro do plasmídeo pBS4S e o plasmídeo obtido é usado para transformar a cepa ATCC13869- L30 para assim obter a cepa em que o plasmídeo é integrado em seu cromossomo. Então, a cepa que é resistente a sacarose e sensível a canamicina é selecionada a partir destas cepas. A sequência nucleotídica do gene odhA das cepas selecionadas é determinada e a cepa em que a função de α-KGDH é deficiente por mutação de mudança de fase no gene odhA é selecionada como a cepa ATCC13869-L30sucA8 (odhA8).

[000218] As outras cepas de odhA mutante podem ser obtidas pelos procedimentos similares usando a cepa ATCC13869-L30.

[000219] A cepa sucA801 em que um gene odhA mutante tendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 47 é introduzido pode ser obtida por um método similar como descrito acima em que um iniciador de SEQ ID NO: 56 tendo uma extremidade 5’ fosforilada é usado em vez de um iniciador de SEQ ID NO: 55.

[000220] A cepa sucA805 em que um gene odhA mutante tendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 49 é introduzido pode ser obtida por um método similar como descrito acima em que um iniciador de SEQ ID NO: 57 tendo extremidade 5’ fosforilada é usado em vez de um iniciador de SEQ ID NO: 55.

[000221] A cepa sucA77 cepa em que um gene odhA mutante tendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 51 é introduzido pode ser obtida por um método similar como descrito acima em que um iniciador de SEQ ID NO: 58 tendo uma extremidade 5’ fosforilada é usado em vez de um iniciador de SEQ ID NO: 55.

[000222] A cepa L30sucA8 não tem α-KGDH intracelular porque a mutação sucA8 é uma mutação de mudança de fase que causa uma truncagem imatura da proteína α-KGDH. Por outro lado, cepa sucA801, cepa sucA805, e cepa sucA77 tem uma atividade de α-KGDH diminuída, mas ainda presente, porque estas mutações não são mutações de mudança de fase e não causam truncagem imatura da proteína α-KGDH. Tabela 14: Sequência ácido nucleotídeo parcial dos genes odhA mutantes

Tabela 15: Sequência de aminoácidos de mutantes odhA

<Produção de ácido L-glutâmico usando o gene yggB e a cepa mutante dupla de gene odhA >

[000223] A produtividade de ácido L-glutâmico da cepa mutante dupla de gene odhA e do gene ygg obtida foi avaliada por cultivo destas cepas em um frasco Sakaguchi. Cada uma das cepas listadas em Tabela 14 foi cultivada a 31,5oC durante a noite em meio agar CM-Dex, e então 1/6 da cultura foi transferido para 20 ml de um meio contendo 60 g/l glicose, 22,5 g/l (NH4) 2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO^7IH), 0,01 g/l FeSO/71 H), 0,01 g/l MnSOr4-5H2O, 200 μg/l vitamina B1, 0,48 g/l hidrolisado de proteína de soja, e 300 μg/l biotina (ajustado a pI 8,0 com K)I), adicionados com CaC)3 e cultivados com agitação a 115rpm a 31,5oC. A quantidade de ácido L-glutâmico acumulado após 19 horas de cultura é mostrada em Tabela 16. As cepas sucA801, sucA805, e sucA77 demonstraram maior produtividade de ácido L-glutâmico do que a cepa ATCC13869-L30 transportando um gene odhA tipo selvagem e a cepa sucA8 transportando gene odhA com uma mutação de mudança de fase. Estes resultados mostraram que ácido L- glutâmico é efetivamente produzido por regulação da atividade de α-KGDH por introdução de mutações dentro na proximidade da região de ligação de tiamina pirofosfato do gene odhA. Tabela 16: Produção de ácido L-glutâmico por cepas mutantes odhA mutante

Exemplo 16 <Ruptura do gene odhA na cepa ATCC14067yggB8 >

[000224] O gene odhA foi rompido na cepa ATCC14067e a cepa ATCC14067yggB8, respectivamente e as cepas obtidas foram cultivadas. Primeiro, um plasmídeo para romper o gene odhA foi construído. PCR foi realizado usando os oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 77 e 78 como iniciadores e DNA cromossômico de cepa ATCC14067 como um gabarito para amplificar um fragmento cobrindo a região N-terminal do gene odhA. Outro PCR foi realizado usando os oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 79 e 80 como iniciadores e DNA cromossômico de cepa ATCC14067 como um gabarito para amplificar um fragmento cobrindo a região C-terminal do gene odhA. Subseqüentemente, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades equimolares do fragmento N- terminal e do fragmento C-terminal como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 81 e 82 como iniciadores para preparar um fragmento em que uma sequência interna do gene odhA é deletada. O produto PCR obtido foi digerido com BamHI e inserido dentro do pBS4S construído em Exemplo 1 para obter um plasmídeo pBSΔsucA47.

[000225] Cepa ATCC14067 e cepa ATCC14067yggB8 de Exemplo 11 foram transformadas com o pBSΔsucA47 como descrito em Exemplo 6 para introduzir o gene odhA de tipo de deleção dentro do cromossomo e remover somente a porção de vetor. Cepas em que o gene odhA foi rompido foram selecionadas a partir de cepas sensíveis a canamicina por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 77 e 80. As cepas assim obtidas foram chamadas cepa ATCC14067ΔodhA e cepa ATCC14067ΔodhA yggB8, respectivamente.

[000226] Tabela 17 mostra os resultados de cultivação da cepa ATCC14067ΔodhA e da cepa ATCC14067ΔodhA yggB8 de acordo com o método descrito em Exemplo 3. Verificou-se que a introdução do gene yggB mutante tipo 8 melhora a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da cepa rompida em gene odhA. <Tabela 17. Produção de ácido L-glutâmico da cepa rompida em gene odhA e a cepa rompida em odhA e tipo 8 introduzida no gene yggB mutante >

Exemplo 17 <Ruptura do gene symA na cepa mutante yggB >

[000227] O gene symA foi rompido na cepa 2A-1R construída em Exemplo 3 e tendo um IS inserido dentro de um gene yggB, e a cepa obtida foi cultivada em comparação com a cepa 2A-1R. A sequência nucleotídica do gene symA da cepa ATCC13869 é mostrada em SEQ ID NO: 86, e a sequência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 87. Primeiro, um plasmídeo para o fim de romper o gene symA foi construído. PCR foi realizado usando os oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 88 e 89 como iniciadores e DNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito para amplificar um fragmento cobrindo a região N-terminal do gene symA. Outro PCR foi realizado usando os oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 90 e 91 como iniciadores e DNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito para amplificar um fragmento cobrindo a região C-terminal do gene symA. Subseqüentemente, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades equimolares do fragmento N- terminal e do fragmento C-terminal como um gabarito e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 88 e 91 como iniciadores para preparar um fragmento em que uma sequência interna do gene SymA é deletada. O produto PCR obtido foi digerido com BamHI e inserido dentro de pBS4S construído em Exemplo 1 para obter um plasmídeo pBSΔ1867.

[000228] A cepa 2A-1R foi transformada com o pBSΔ1867 do mesmo modo como descrito em Exemplo 6 para introduzir o gene SymA tipo deleção dentro do cromossomo e remover somente uma porção de vetor. Cepas em que o gene SymA foi rompido foram selecionadas a partir de cepas sensíveis a canamicina por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 88 e 91. As cepas assim obtidas foram chamadas cepa 2A-1RΔSymA.

[000229] Tabela 18 mostra os resultados de cultivação de cepa 2A- 1RΔSymA e da cepa 2A-1R de acordo com o método descrito em Exemplo 3. Verificou-se que deleção do gene SymA ainda melhora a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da cepa introduzida no gene yggB tipo mutante. <Tabela 18. Produção de ácido L-glutâmico de uma cepa 2A- 1R e o cepa 2A-1R rompida em gene symA>

Exemplo 18 <Construção de uma cepa amplificada em gene yggB tipo selvagem>

[000230] pL5k contendo um gene yggB tipo selvagem de uma bactéria corineforme foi usado para introduzir o gene yggB tipo selvagem em bactéria corineforme. Um plasmídeo tendo uma estrutura similar como pL5k pode também ser construído por realização de PCR usando iniciadores de SEQ ID Nos: 59 e 60 e DNA cromossômico de cepa ATCC13869 como um gabarito, digerindo o produto amplificado com BamHI, e inserindo o fragmento resultante dentro do sítio BamHI de pVK9. pVK9 é um vetor bidirecional que foi obtido por terminação cega no sítio AvaII de pHSG299 (Takara Bio) e inserindo ali um fragmento envolvido em replicação autônoma em bactérias corineformes excisadas de pHK4 (JP-A-05-007491) com BamHI e KpnI.

[000231] Uma cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foi transformada com pL5k pelo método de pulso elétrico (JP-A-2-207791). As células transformadas foram espalhadas sobre um meio de placa CM2B (10 g/l polipeptona, 10 g/l extrato de levedura, 5 g/l NaCl, 20 g/l agar, ajustado a pH 7,0 com KOH) e cultivado a 31,5°C durante uma noite. No próximo dias, colônias que apareceram foram purificadas em um meio de placa CM2B contendo 25 μg/ml canamicina para obter a cepa amplificada em gene yggB de tipo selvagem. Plasmídeos foram extraídos dos transformantes por um método convencional para confirmar que o plasmídeo de marcação foi introduzido. A cepa amplificada em gene yggB de tipo selvagem assim obtido foi chamada ATCC13869/pL5k. Como uma cepa de controle, ATCC13869/pVK9 introduzido com pVK9 foi construído no mesmo modo como descrito acima. Exemplo 19 <Avaliação de um cepa amplificada em gene yggB tipo selvagem>

(2-1) Avaliação sob condições de cultura limitadas em biotina

[000232] Três clones foram isolados de cada cepa amplificada em gene yggB tipo selvagem e cepa de controle construída em Exemplo 17, e cada clone foi inoculado em 20 ml de um meio de cultura de semente (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por cultura de agitação a 31,5°C. Após completo consumo de açúcares, 2 ml da cultura foram inoculados em 20 ml do meio de cultura principal não contendo biotina (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. Após o completo consumo de açúcares, a concentração de ácido L-glutâmico no meio foi determinada. Como resultado, verificou-se que a cepa amplificada em gene yggB tipo selvagem (ATCC13869/pL5k) causou acúmulo de mais ácido L-glutâmico do que a cepa introduzida no vetor. (Na Tabela 19, OD620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída a 101 vezes, e indica a quantidade de células e GH (g/L) indica a quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado.) Tabela 19.Quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado sob condições limitadas em biotina

(2-2) Avaliação sob condições adicionados de tensoativos

[000233] Os mesmos clones usados em acima (2-1) foram inoculadas em 20 ml de um meio de cultura de semente (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. Após o completo consumo de açúcares, 2 ml da cultura foram inoculados em 20 ml do meio de cultura principal (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. Após 2 horas do começo da cultura, Tween 40 foi adicionado a uma concentração final de 5 g/L, e a cultura foi continuada. Após o completo consumo de açúcares, a concentração de ácido L-glutâmico no meio foi determinada. Como resultado, verificou-se que a cepa amplificada em gene yggB tipo selvagem (ATCC13869/pL5k) causou acúmulo de mais ácido L-glutâmico do que a cepa introduzida no vetor. Tabela 20Quantidade de ácido L-glutâmico que tinha acumulado sob condições adicionadas de tensoativos

(OD620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída 101 vezes, e indica a quantidade de células e GH indica a quantidade de ácido L- glutâmico que tinha se acumulado.)

(2-3) Avaliação sob condições adicionadas a penicilina G

[000234] Os mesmos clones usados em acima (2-1) foram inoculados em 20 ml de um meio de cultura de semente (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. Após o consumo completo de açúcares, 2 ml da cultura foram inoculados em 20 ml do meio de cultura principal (80 g/l glicose, 30 g/l sulfato de amônio, 1 g/l KH2PO4, 0,4 g/l MgSO4.7H2O, 0,01 g/l FeSO4.7H2O, 0,01 g/l MnSO4.4-5H2O, 200 μg/l VB1, 60 μg/l biotina, 0,48 g/l hidrolisado de soja (T-N), ajustado a pH 8,0 com KOH: autoclavado a 115°C durante 10 minutos), e então 1 g de carbonato de cálcio esterilizado foi adicionado ao mesmo, seguido por uma cultura em agitação a 31,5°C. Após 2 horas do cultura, penicilina G foi adicionada a uma concentração final de 0,5 U/ml e a cultura foi continuada. Após o consumo completo de açúcares, a concentração de ácido L-glutâmico no meio foi determinada. Como resultado, verificou-se que a cepa amplificada em gene yggB tipo selvagem (ATCC13869/pL5k) causou acúmulo de mais ácido L-glutâmico do que a cepa introduzida no vetor. (Tabela 21) Tabela 21Quantidade de ácido L-glutâmico acumulado sob condições adicionadas a penicilina G

(OD620 é turvação a 620nm de solução de cultura diluída 101 vezes, e indica a quantidade de células e GH indica a quantidade de ácido L- glutâmico que tinha se acumulado.)

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[000235] De acordo com a presente invenção, ácido L-glutâmico é efetivamente produzido por uso da cepa modificada por uso de genes yggB.

[000236] Apesar da invenção ter sido descrita em detalhes com referência a suas formas de realização exemplares, será evidente para um versado na arte que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregados sem sair do escopo da invenção. Cada um dos documentos acima mencionado é incorporado por referência aqui em sua totalidade.

Claims (4)

1. Método para produzir ácido L-glutâmico, caracterizadopelo fato de compreender cultivar uma bactéria corineforme em um meio de modo a causar acúmulo de ácido L-glutâmico no meio ou na bactéria, e coletar ácido L-glutâmico do meio ou da bactéria, em que a referida bactéria corineforme tem capacidade de produção de ácido L-glutâmico, em que a referida bactéria corineforme é modificada pela introdução de um gene yggB do tipo mutante de modo que uma proteína yggB do tipo mutante é expressa e a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da bactéria é melhorada em comparação com uma cepa não modificada, em que a referida proteína yggB de tipo mutante tem uma mutação na região que codifica os aminoácidos 419-533 da SEQ ID NO: 6, ou a referida proteína yggB de tipo mutante tem uma mutação na região de codificação transmembrana da proteína yggB, em que a referida região de codificação transmembrana é selecionada a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 1-23, aminoácidos 25-47, aminoácidos 62-84, aminoácidos 86- 108 e aminoácidos 110-132 da SEQ ID NO: 6, em que a referida proteína yggB de tipo mutante consiste na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 74, em que o referido gene yggB de tipo mutante consiste na sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 19 ou suas sequências degeneradas que geram a mesma proteína conforme definida na SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 23 ou suas sequências degeneradas que geram a mesma proteína conforme definida na SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 63 ou suas sequências degeneradas que geram a mesma proteína conforme definida na SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 69 ou suas sequências degeneradas que geram a mesma proteína conforme definida na SEQ ID NO: 70; e SEQ ID NO: 73 ou suas sequências degeneradas que geram a mesma proteína conforme definida na SEQ ID NO: 74.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene yggB de tipo mutante consiste na sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 73.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria corineforme pertence ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Brevibacterium.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria corineforme é Corynebacterium glutamicum.

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