KR20070097557A - Ｌ-글루탐산 생산 미생물 및 ｌ-글루탐산의 제조방법 - Google Patents

Ｌ-글루탐산 생산 미생물 및 ｌ-글루탐산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

yggB 유전자를 이용하여 변형시켜 비변형 균주와 비교하여 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네형 세균을, 배지 또는 세균 세포내에 L-글루탐산이 축적되도록 배지에서 배양하고, 배지 또는 세포로부터 L-글루탐산을 수거한다.
yggB 유전자, L-글루탐산, 코리네형 세균, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제

Description

Ｌ-글루탐산 생산 미생물 및 Ｌ-글루탐산의 제조방법{L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid}
본 발명은 L-글루탐산 생산 미생물 및 당해 미생물을 이용하여 L-글루탐산을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 식품 산업에서 예를 들면, 조미료 생산용 원료로서 널리 사용된다.
L-글루탐산은 통상적으로 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 세균과 같이 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 사용한 발효 방법에 의해 산업적 규모로 제조되어 왔다. 이 목적을 위해 천연으로부터 분리된 균주 또는 그것의 인공 돌연변이체를 사용해 왔다.
일반적으로, 코리네형 세균의 야생형 균주는 과량의 비오틴이 존재하는 경우에 L-글루탐산을 생산하지 않는다. 따라서, 코리네형 세균에 의한 L-글루탐산의 생산은 일반적으로 비오틴이 제한된 조건하에서 이루어지거나, 배양 배지에 계면활성제 또는 페니실린을 첨가하여 이루어진다[참조 문헌: Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61(7), p1109-1112]. 반면에, 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생 산할 수 있는 돌연변이 균주가 L-글루탐산 생산에 사용된다. 이러한 균주에는 계면활성제-온도-민감성 균주 (WO99/02692), 페니실린-민감성 균주 (JP-A-55-0124492), 및 리소자임-민감성 균주 (WO00/14241)가 포함된다. 그러나 이와 같은 돌연변이 균주는 지방산 또는 세포벽 합성의 감소를 종종 나타낼 수 있고, 균주의 충분한 성장을 유지하는 동시에 이러한 균주를 이용하여 L-글루탐산을 생산함에 있어서 어려움이 있었다.
한편, 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하기 위해 α-케토글루타르산 데하이드로게나제(α-KGDH)를 암호화하는 유전자가 파괴된 유전자 변형된 균주를 사용해왔다 (WO95/34672). 그러나 α-KGDH 유전자에 결함이 있는 균주는 TCA 사이클이 중간에서 차단되어 성장이 느리고, L-글루탐산 생산에 필요한 충분한 양의 세포를 수득하기 어렵다.
코리네형 세균의 yggB 유전자는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 yggB 유전자의 동족체이고[참조: FEMS Microbiol Lett. 2003, 218(2), p305-309, Mol Microbiol. 2004, 54(2), p420-438], 기계적감각 통로의 일종인 것으로 보고되어 있다[참조: EMBO J. 1999, 18(7):1730-7]. 그러나 그것이 L-글루탐산 생산에 미치는 영향은 보고되어 있지 않다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 개선시키는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 이 목적을 달성하기 위해 광범위한 연구를 수행하였고, 야생형 yggB 유전자의 발현을 향상시킴으로써 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 개선시킬 수 있음을 밝혔다. 또한, 보통의 L-글루탐산 생산 조건에서뿐만 아니라 과량의 비오틴의 존재하에서도 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 개선시키는 돌연변이형 yggB 유전자를 수득하였고, 그것에 의하여 본 발명이 이루어졌다.
본 발명의 목적은 균주의 L-글루탐산 생산능이 비변형 균주에 비해 향상되도록 yggB 유전자를 이용하여 변형시킨, L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 yggB 유전자가,
(a) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
(c) 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번을 포함하는 DNA,
(d) 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
(e) 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번을 포함하는 DNA,
(f) 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
(g) 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번을 포함하는 DNA, 및
(h) 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 yggB 유전자가,
(A) 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및
(B) 당해 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열내의 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 비변형 균주에 비해 yggB 유전자의 발현이 향상되도록 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 yggB 유전자의 카피 수를 증가시키거나 yggB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 yggB 유전자의 발현이 향상된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시킴으로써 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 서열번호 6, 68, 84 또는 85의 아미노산 419번 내지 533번, 또는 서열번호 62의 아미노산 419번 내지 529번을 암호화하는 영역에 돌연변이가 있는 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이가 상기 영역의 결실인, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이가 삽입 서열 또는 트랜스포존(transposon)의 상기 영역으로의 삽입인, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 상기 영역에 있는 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 아미노산 서열에서 424번 위치의 프롤린 및/또는 437번 위치의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 yggB 단백질의 막관통 암호화 영역에 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 막관통 암호화 영역이 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 아미노산 1번 내지 23번, 아미노산 25번 내지 47번, 아미노산 62번 내지 84번, 아미노산 86번 내지 108번, 및 아미노산 110번 내지 132번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 프레임 이동(frame-shift)을 야기하지 않으면서 상기 돌연변이가 도입된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85에 제시된 아미노산 서열에서 100번 위치의 알라닌 및/또는 111번 위치의 알라닌을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 적어도 1개의 아미노산을 삽입시키는 돌연변이를 갖는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시킴으로써 상기 균 주의 L-글루탐산 유사체에 대한 내성이 증가된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 불활성화시키기 위해 상기 코리네형 세균이 추가로 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 상기 유전자가 symA 유전자이고, 상기 symA 유전자가,
(a) 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번을 포함하는 DNA,
(b) 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균에서 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성을 저하시키기 위해 상기 코리네형 세균이 추가로 변형된, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속에 속하는 세균인, 상기한 코리네형 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 배지 또는 세포 안에 L-글루탐산을 축적하기 위해 상기한 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 배지 또는 세포로부터 L-글루탐산을 수거하는 단계를 포함하는, L-글루탐산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은,
(a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(b) 서열번호 8과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴을 함유하는 조건하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(d) 서열번호 20과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(e) 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(f) 서열번호 22와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(g) 서열번호 24의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(h) 서열번호 24와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(j) 서열번호 64와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자 가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(k) 서열번호 70의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(l) 서열번호 70과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
(m) 서열번호 74의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
(n) 서열번호 74와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이형 yggB 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자에 결함이 있는 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주로서 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 시험관내에서 무작위로 돌연변이를 도입시킨 yggB 유전자가 도입된 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주로서 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법 을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 염색체상에 무작위로 전위요소(transposable element)가 도입된 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주로서 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에 코리네형 세균을 접종하고, 상기 배지에서 성장하는 균주를 선별하는 단계를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주가 상기한 코리네형 세균인, 상기한 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 과량의 비오틴을 함유하는 배지가 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는 배지인, 상기한 코리네형 세균의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 플라스미드 pBS3의 작제를 도시한 것이다.
도 2는 플라스미드 pBS4S의 작제를 도시한 것이다.
도 3은 플라스미드 pBS4sucAint의 작제를 도시한 것이다.
도 4는 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주 및 대조군 균주에 의한 L-글루탐산의 축적을 도시한 그래프이다.
도 5는 yggB 유전자에서 2A-1형 돌연변이를 도시한 것이다.
도 6은 CM-Dex 플레이트 배지에서 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 4-플루오로글루탐산에 대한 내성을 도시한 사진이다.
도 7은 4-플루오로글루탐산(4-FG)을 함유하는 액체 배지에서 대조군 균주 및 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 성장을 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
<1> 본 발명의 코리네형 세균
본 발명의 코리네형 세균은 L-글루탐산 생산능을 가지며, 비변형 균주와 비교하여 L-글루탐산 생산능이 향상되도록 yggB 유전자를 이용하여 변형되었다.
본 발명에서, 코리네형 세균의 예에는 통상의 코리네형 세균이 포함되며, 또한 코리네박테리움 세균에 매우 가까운 브레비박테리움 세균뿐만 아니라, 브레비박테리움 속으로 분류되었지만 현재는 코리네박테리움 속으로 분류된 세균[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)]이 포함된다. 이러한 코리네형 세균의 예에는 다음이 포함된다:
코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티컴(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리엄(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes; 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens))
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)
브레비박테리움 이마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum; 브레비박테리움 글루타미컴(Brevibacterium glutamicum))
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오제니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리넘(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum)
코리네형 세균의 구체적 예는 다음과 같다.
코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC13870
코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC15806
코리네박테리움 알카놀리티컴 ATCC21511
코리네박테리움 칼루내 ATCC15991
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
코리네박테리움 릴리엄 ATCC15990
코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965
코리네박테리움 서모아미노제네스 AJ12340(FERM BP-1539)
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868
브레비박테리움 디바리카텀 ATCC14020
브레비박테리움 플라붐 ATCC13826,
브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC14067,
브레비박테리움 플라붐 AJ12418(FERM BP-2205)
브레비박테리움 이마리오필럼 ATCC14068
브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC13869
브레비박테리움 로세움 ATCC 13825
브레비박테리움 사카롤리티컴 ATCC14066
브레비박테리움 티오제니탈리스 ATCC19240
브레비박테리움 암모니아제네스 ATCC6871, ATCC6872
브레비박테리움 알붐 ATCC15111
브레비박테리움 세리넘 ATCC15112
마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC15354
이러한 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC, 주소: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)으로부터 입수할 수 있다. 즉, 각 균주는 ATCC의 카탈로그에 열거된 고유의 등록 번호가 부여되어 있다. 균주는 이 등록 번호를 이용하여 주문할 수 있다. AJ12340 균주는 부다페스트 조약하에 1989년 10월 27일자로 국제 통상부 장관 산하 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)[현재는 독립행정법인 산업 기술종합연구소 특허생물기탁센터(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 쓰쿠바 센트랄 6, 305-5466]에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-1539를 부여받았다. AJ12418 균주는 부다페스트 조약하에 1989년 1월 5일자로 국제 통상부 장관 산하 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-2205를 부여받았다.
본 발명에서 코리네형 세균은 L-글루탐산 생산능을 갖는다. "L-글루탐산 생산능"은 본 발명의 코리네형 세균을 배지에서 배양하는 경우에 배지에 충분한 양의 L-글루탐산을 축적시키는 능력을 의미한다. L-글루탐산 생산능은 본 발명의 코리네형 세균의 모균주의 성질일 수 있는데, 이는 대부분의 야생형 코리네형 세균 균주가 하기하는 L-글루탐산 생산 조건하에서 L-글루탐산을 생산하기 때문이다. 하지만 L-글루탐산 생산능은 하기와 같이 돌연변이, 유전자 재조합 기술 등에 의해 부여되거나 향상될 수 있다. 또한, L-글루탐산 생산능은 yggB 유전자의 발현을 향상시킴으로써 부여될 수 있다.
"코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능이 향상되었다"는 어구는 본 발명의 코리네형 세균이 비변형 균주와 비교하여 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는다는 것을 의미한다. 비변형 균주의 예에는 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032, 13869, 14067, 및 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965가 포함된다. 비변형 균주는 야생형 균주와 동일한 수준으로 야생형 yggB 유전자를 발현하는 균주 또는 yggB 유전자의 암호화 영역내로 돌연변이가 도입되지 않은 균주를 포함할 수도 있다.
L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법의 예에는 L-글루탐산 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 향상시키는 것이 포함된다. L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소의 예에는 글루타메이트 데하이드로게나제, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신테타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 피루베이트 카복실라제, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 포스포에놀피루베이트 신타제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 프럭토즈 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제 및 글루코즈 포스페이트 이소머라제가 포함된다.
이러한 유전자의 발현은 하기하는 yggB 유전자의 발현을 향상시키는 방법과 동일한 방법으로 향상시킬 수 있다.
시트레이트 신타제 유전자, 이소시트레이트 데하이드로게나제 유전자, 피루베이트 데하이드로게나제 유전자 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 향상되도록 변형된 미생물의 예에는 국제 공보 제WO00/18935호 및 일본 공개특허공보 제2000-232890A호(유럽 특허 제1010755A호)에 개시된 미생물이 포함된다.
L-글루탐산 생산능을 부여하는 변형에는 L-글루탐산 이외의 화합물을 합성하는 반응 및 L-글루탐산 생합성 경로로부터 분지된 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 제거하는 방법이 포함된다. 이러한 효소의 예에는 이소시트레이트 리아제, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 아세틸 포스페이트 트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 아세틸 포르메이트 트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제 및 글루타메이트 데카복실라제가 포함된다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하된 균주의 예에는 다음의 균주가 포함된다.
브레비박테리움 락토퍼멘텀 △S 균주(WO95/34672)
브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821 균주(FERM BP-4172; FR9401748)
브레비박테리움 플라붐 AJ12822 균주(FERM BP-4173; FR9401748)
브레비박테리움 글루타미컴 AJ12823 균주(FERM BP-4174; FR9401748)
상기한 효소의 활성을 저하시키거나 제거하기 위해서, 효소 활성의 저하 또는 감소를 유발하는 돌연변이 또는 결실을 염색체상에 있는 효소의 유전자내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 염색체상의 효소를 암호화하는 유전자를 파괴하거나 유전자의 프로모터 및/또는 샤인 달가노(SD) 서열과 같은 발현 조절 서열을 변형시켜 달성할 수 있다. 또한, 이러한 효소의 활성은, 아미노산 치환을 유발하는 미스센스 돌연변이, 종결 코돈을 생성하는 넌센스 돌연변이, 또는 암호화 영역내로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드를 부가하거나 결실시키는 프레임 이동 돌연변이를 도입시키거나, 또는 유전자의 부분 또는 전체를 결실시킴으로써, 저하시키거나 제거할 수 있다[참조: Journal of biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)]. 예를 들면, 이러한 효소의 활성은, 암호화 영역이 결실되어 돌연변이 효소를 암호화하는 유전자를 작제하여 염색체상의 유전자를 수득된 유전자로 상동성 재조합에 의해 대체시키거나, 트랜스포존 또는 IS 인자를 이러한 유전자내로 도입시킴으로써, 저하시키거나 제거할 수 있다.
예를 들면, 상기 효소의 활성을 저하시키거나 제거하는 돌연변이는 유전자 재조합에 의해 다음과 같이 도입시킬 수 있다. 즉, 정상적인 효소가 생산되지 않도록 표적 유전자의 서열의 부분을 변형시킴으로써 돌연변이형 유전자를 작제하고, 돌연변이형 유전자를 사용하여 코리네형 세균을 형질전환시켜 염색체상의 표적 유전자와 재조합이 유발되도록 함에 의해, 염색체상의 표적 유전자를 돌연변이형 유전자로 대체시킬 수 있다. 이와 같이 상동성 재조합을 이용한 유전자 대체에 의해 유전자를 파괴하는 방법은 이미 보고되어 있고, 선형 DNA를 이용하는 방법 또는 온도 민감성 복제 오리진을 포함하는 플라스미드를 이용하는 방법을 포함한다(미국 특허 제6,303,383호 또는 일본 공개특허 공보 제05-007491호). 코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드의 예에는 p48K 및 pSFKT2(미국 특허 제6303383호), pHSC4(프랑스 공개특허 공보 제2667875호(1992) 및 일본 공개특허 공보 제5-7491A호) 등이 포함된다. 코리네형 세균내에서 이러한 플라스미드는 적어도 25℃의 온도에서는 자발적으로 복제할 수 있지만, 37℃의 온도에서는 자발적으로 복제할 수 없다. pHSC4를 보유한 AJ12571 균주는 부다페스트 조약하에 1991년 8월 26일자로 국제 통상부 장관 산하 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현재는 독립행정법인 산업 기술종합연구소 특허생물기탁센터, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 쓰쿠바 센트랄 6, 305-5466)에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-3524를 부여받았다.
상기한 상동성 재조합을 이용한 유전자 대체에 의해 유전자를 파괴하는 방법은 코리네형 세균내에서 복제 불가능한 플라스미드를 이용하여 수행될 수도 있다. 바람직하게는 코리네형 세균내에서 복제 불가능하며 에스케리키아 세균내에서 복제 가능한 플라스미드가 사용된다. 이러한 플라스미드의 예에는 pHSG299(Takara Bio) 및 pHSG399(Takara Bio)가 포함된다.
상기한 효소 중의 하나를 암호화하는 염색체상의 유전자는, 예를 들면 sacB를 이용한 상동성 재조합에 의해 결실형 유전자로 대체될 수 있다[참조: Schafer, A. et al., Gene 145 (1994) 69-73]. sacB 유전자는 레반 슈크라제를 암호화하며, 염색체상의 표적 유전자가 돌연변이 유전자로 대체되고 벡터 부분이 염색체로부터 제거된 균주를 효율적으로 선별하기 위해 사용된다(WO2005/113745 및 WO2005/113744).
먼저, 결실형(돌연변이) 유전자, sacB 유전자, 및 클로람페니콜-내성 유전자와 같은 선별 마커를 온도 민감성 복제 오리진을 포함하는 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드를 작제한다. 이어서 플라스미드를 코리네형 세균의 숙주 균주에 도입시킨다. 레반 슈크라제가 코리네형 세균에서 발현되는 경우, 슈크로즈가 전환되어 레반이 생성되고 레반은 세균에게 치명적이므로 슈크로즈를 함유하는 배지에서 세균이 성장하지 못한다. 따라서, 슈크로즈를 함유한 플레이트에서 배양함으로써, 플라스미드에 있는 돌연변이 유전자와 염색체상의 유전자 간에 대체가 일어나고 플라스미드의 다른 부분이 세포로부터 제거된 균주를 선별할 수 있다.
sacB 유전자의 예에는 다음이 포함된다:
바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) : sacB GenBank 승인번호 X02730 (서열번호 11)
바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens) : sacB GenBank 승인번호 X52988
지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) : sacB Genbank 승인번호 L33402
바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) : surB GenBank 승인번호 U34874
락토바실러스 산프란시스켄시스(Lactobacillus sanfranciscensis) : frfA GenBank 승인번호 AJ508391
아세토박터 자일리너스(Acetobacter xylinus) : lsxA GenBank 승인번호 AB034152
글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) : lsdA GenBank 승인번호 L41732
형질전환체 균주를 온도 민감성 복제 오리진이 작용하는 온도(예:25℃)에서 배양하여 플라스미드가 도입된 균주를 수득한다. 이어서, 형질전환체를 온도 민감성 복제 오리진이 작용하지 않는 고온(예:34℃)에서 배양하여 온도 민감성 플라스미드를 제거하고 카나마이신과 같은 항생제를 함유한 플레이트 배지에 도말한다. 플라스미드가 제거된 균주는 이러한 항생제를 함유한 플레이트에서 성장할 수 없지만, 염색체상의 유전자가 돌연변이 유전자로 대체된 소수 균주는 성장하여 콜로니로서 나타날 수 있다.
돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 DNA가 염색체 DNA내로 통합된 균주의 경우, 재조합 DNA는 본래 염색체상에 존재하는 유전자와 재조합을 일으키고, 염색체상의 유전자와 돌연변이 유전자가 융합된 유전자가 염색체내로 삽입되어 재조합 DNA의 다른 부분(벡터 절편, 온도 민감성 복제 오리진 및 항생제 내성 마커)이 융합 유전자들 사이에 존재한다. 이어서, 염색체 DNA상에 돌연변이 유전자만을 남기기 위해서, 염색체 DNA로부터 1카피의 유전자를 벡터 절편(온도 민감성 복제 오리진 및 항생제 내성 마커를 포함)과 함께 제거한다. 이 경우, 정상 유전자가 염색체 DNA상에 남고 돌연변이 유전자가 염색체 DNA로부터 제거되거나, 반대로 돌연변이 유전자가 염색체 DNA에 남고 정상 유전자가 염색체 DNA로부터 제거된다. 두 경우에, 온도 민감성 복제 오리진이 작용할 수 있는 온도에서 코리네형 세균이 배양되면, 제거된 DNA는 코리네형 세균의 세포내에 남는다. 이어서, 온도 민감성 복제 오리진이 작용할 수 없는 온도에서 코리네형 세균을 배양함으로써, 플라스미드에 있는 유전자를 플라스미드와 함께 세포로부터 제거한다. sacB 유전자를 이용하는 경우, 슈크로즈를 함유한 배지에서 코리네형 세균을 배양함으로써, 플라스미드가 제거된 균주를 효율적으로 수득할 수 있다. 플라스미드가 제거된 균주로부터 돌연변이가 표적 유전자로 도입된 균주를 선별함으로써, 표적 유전자가 돌연변이형 또는 결실형 유전자로 대체된 균주를 수득할 수 있다.
L-글루탐산 생산능은 또한 유기산 유사체, 호흡 억제제, 또는 슈퍼옥사이드 발생제에 대해 내성이 있는 균주를 스크리닝하거나 세포벽 합성 억제제에 민감한 균주를 스크리닝함으로써 부여될 수 있다. 이러한 방법의 예에는 모노플루오로아세테이트에 대한 내성의 부여(JP50-113209A), 아데닌 또는 티민에 대한 내성의 부여(JP57-065198A), 말론산에 대한 내성의 부여(JP52-038088A), 우레아제 활성 저하(JP52-038088A), 벤조피론 또는 나프토퀴논에 대한 내성의 부여(JP56-1889A), HOQNO에 대한 내성의 부여(JP56-140895A), α-케토말론산에 대한 내성의 부여(JP57-2689A), 구아니딘에 대한 내성의 부여(JP56-35981A), 다우노마이신에 대한 내성의 부여(JP58-158192A), 및 페니실린에 대한 민감성의 부여(JP04-88994A)가 포함된다.
이러한 세균의 구체적 예에는 다음의 균주가 포함된다:
브레비박테리움 플라붐 AJ3949(FERM BP-2632; JP50-113209A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11628(FERM P-5736; JP57-065198A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11355(FERM P-5007; JP56-1889A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11368(FERM P-5020; JP56-1889A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11217(FERM P-4318; JP57-2689A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11218(FERM P-4319; JP57-2689A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11564(FERM P-5472; JP56-140895A)
브레비박테리움 플라붐 AJ11439(FERM P-5136; JP56-35981A)
코리네박테리움 글루타미컴 H7684(FERM BP-3004; JP04-88994A)
브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11426(FERM P5123 JP56-048890A)
코리네박테리움 글루타미컴 AJ11440(FERM P5137 JP56-048890A)
브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11796(FERM P6402 JP58-158192A)
본 발명의 코리네형 세균은 L-글루탐산 생산능을 갖는 상기 코리네형 세균을 yggB 유전자를 이용하여 변형시켜 L-글루탐산 생산능이 보다 향상되도록 함으로써 수득할 수 있다. 또한, yggB 유전자를 이용하여 먼저 변형시키고 추가적인 변형을 수행하여 L-글루탐산 생산능을 부여하거나 향상시킬 수 있다.
yggB 유전자를 이용한 변형에는, 제한되지 않지만, 코리네형 세균에서 yggB 유전자의 발현을 향상시키는 방법 및 돌연변이를 코리네형 세균의 yggB 유전자내로 도입시키는 방법이 포함된다.
<I> yggB 유전자 발현의 향상
yggB 유전자는 "mscS"로도 언급되는 일종의 기계적감각 통로를 암호화한다[참조: FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9].
코리네형 세균에서의 yggB 유전자 발현 향상은 비변형 균주와 비교하여 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능 개선을 유도한다. 즉, 야생형 균주와 같은 비변형 균주와 비교하여 yggB 유전자의 발현이 증가하도록 코리네형 세균 균주가 변형된 경우, 비변형 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적 또는 더 높은 속도의 L-글루탐산의 생산을 야기한다.
yggB 유전자의 발현 향상이, 비변형 균주와 비교하여 2% 초과(소모된 당에 대한 수율), 보다 바람직하게는 4% 초과, 보다 바람직하게는 6% 초과의 L-글루탐산의 생산량의 증가를 야기하는 것이 바람직하다. 또한, 세균 세포의 구성을 위해 사용되는 탄소를 제외한 탄소(당)에 대한 L-글루탐산의 수율은 yggB 유전자의 발현을 향상시킴으로써 증가될 수 있다.
yggB 유전자의 발현이 향상되지 않은 비변형 균주와 비교하여 yggB 유전자의 발현 수준이 증가하는 한 이의 발현 수준이 임의의 수준일 수 있지만, 비변형 균주와 비교하여 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상으로 발현이 증가한다. yggB 유전자의 mRNA의 양을 측정함으로써 yggB 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 발현 수준을 측정하는 방법에는 노던 하이브리드화 및 RT-PCR이 있다[참조: Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)]. 대조군으로서 사용될 수 있는 야생형 코리네형 세균의 예에는 코레네박테리움 글루타미컴(브레비박테리움 락토퍼멘텀) ATCC13869, ATCC13032, ATCC14067 및 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965 균주가 포함된다.
yggB 유전자를 이용하여 변형된 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능은, L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 및/또는 과량의 비오틴의 존재하에서 비변형 균주와 비교하여 향상될 수 있다. 여기서, "L-글루탐산을 생산하는 조건"에는 탄소원, 질소원, 무기 염, 및 아미노산 및 비타민과 같은 미량의 유기 영양소(필요한 경우에)를 함유한 통상적인 배지에 L-글루탐산 생산을 유도하는 물질이 첨가된 경우, 및 이러한 통상적인 배지에서 L-글루탐산 생산을 억제하는 물질의 양이 제한된 경우가 포함된다. L-글루탐산 생산을 유도하는 물질에는 페니실린 및 Tween 40 (등록 상표)과 같은 포화 지방산을 포함하는 계면활성제가 포함된다. L-글루탐산 생산을 억제하는 물질에는 비오틴이 포함된다[참조: Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press 1986]. 배지내의 페니실린의 농도는 바람직하게는 0.1U/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.2U/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.4U/ml 이상이다. 배지내의 계면활성제의 농도는 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1g/L 이상, 보다 바람직하게는 2g/L 이상이다. 배지에 첨가되는 비오틴의 농도는 L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 바람직하게는 15㎍/L 미만, 보다 바람직하게는 10㎍/L 미만, 보다 바람직하게는 5㎍/L 미만이다. L-글루탐산을 생산하는 조건은 비오틴을 전혀 함유하지 않을 수 있다.
반면에, 과량의 비오틴을 함유하는 조건은 비오틴을 30㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 40㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 50㎍/L 이상 함유하는 조건일 수 있다.
코리네형 세균의 yggB 유전자의 예에는 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 서열번호 62의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 서열번호 68의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA가 포함된다. 코리네형 세균의 yggB 유전자의 구체적 예에는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 및 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 및 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번이 포함된다. 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032의 yggB 유전자이고, GenBank 승인번호 NC_003450의 게놈 서열에 있는 뉴클레오타이드 1336092번 내지 1337693번에 상응하며, NCgl1221(NP_600492. Reports small-conductance mechanosensitive channel...[gi:19552490])로서 등록되어있다. 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869의 yggB 유전자이다. 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 글루타미컴(브레비박테리움 플라붐) ATCC14067의 yggB 유전자이다. 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번의 뉴클레오타이드 서열은 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965의 yggB 유전자이다. 또한, yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 종 및 균주마다 상이할 수 있기 때문에, 본 발명에서 사용되는 yggB 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번의 뉴클레오타이드 서열의 변이체일 수 있다. 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번의 뉴클레오타이드 서열을 사용하기 위해 yggB 유전자의 변이체를, 예를 들면, BLAST(//blast.genome.jp/)에 의해 검색할 수 있다. yggB 유전자의 변이체에는 서열번호 75 및 76의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수득된 유전자가 포함된다. yggB 유전자는 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시킬 수 있는한 다른 미생물로부터 유래한 유전자일 수 있다. yggB 유전자는 하기의 돌연변이형 yggB일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 yggB 유전자는 서열번호 6, 62, 68, 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 제한되지 않고, 코리네형 세균내로 유전자가 도입되는 경우 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 능력을 계속 유지하는 동시에, 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된, 서열번호 6, 62, 68, 또는 84의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수도 있다. 여기서 언급된 "수개"의 아미노산 잔기의 수는 3차원 구조에서의 위치 또는 단백질의 아미노산 잔기의 유형에 따라 다를 수 있지만, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다. yggB 유전자는 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 능력을 유지하는 동시에, 서열번호 6, 62, 68, 84, 또는 85에 제시된 아미노산 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상 상동성인 단백질을 암호화하는 것이 바람직하다. 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 아미노산 서열 간의 상동성은 카를린(Karlin)과 알트슐(Altschul)이 개발한 BLAST[참조: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] 및 피어슨(Pearson)이 개발한 FASTA[참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]를 포함한 알고리듬에 의해 측정할 수 있다. BLASTN 및 BLASTP를 포함한 상동성 검색 프로그램은 알고리듬에 기반하여 개발되어 왔다(//www.ncbi.nlm.nih.gov에서 사용 가능).
상기한 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 방향족 아미노산의 경우, 보존적 치환은 phe, trp, 및 tyr 서로 간의 치환을 포함한다. 소수성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 leu, ile, 및 val 서로 간의 치환을 포함한다. 극성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 gln 및 asn 서로 간의 치환을 포함한다. 염기성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 arg, lys, 및 his 서로 간의 치환을 포함한다. 산성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 asp 및 glu 서로 간의 치환이다. 하이드록실 그룹 함유 아미노산의 경우, 보존적 치환은 ser 및 thr 서로 간의 치환이다. 보존적 치환은 또한 Ala에서 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg에서 Gln, His 또는 Lys으로의 치환, Asn에서 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp에서 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln에서 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg으로의 치환, Glu에서 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly에서 Pro으로의 치환, His에서 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr으로의 치환, Ile에서 Leu, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Leu에서 Ile, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Lys에서 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg으로의 치환, Met에서 Ile, Leu, Val 또는 Phe으로의 치환, Phe에서 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu으로의 치환, Ser에서 Thr 또는 Ala으로의 치환, Thr에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp에서 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr에서 His, Phe 또는 Trp으로의 치환, 및 Val에서 Met, Ile 또는 Leu으로의 치환을 포함한다.
특히, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 다음의 아미노산은 치환 또는 결실될 수 있다. 코리네형 세균 가운데 보존된 YggB 단백질의 아미노산 서열, 즉 보존서열은 서열번호 85에 제시되어 있다. 서열번호 85에 제시된 Xaa 잔기는 치환 또는 결실될 수 있다.
48번 위치의 Glu (바람직하게는 Arg으로 치환된다)
275번 위치의 Asp (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
298번 위치의 Glu (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
343번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
396번 위치의 Phe (바람직하게는 Ile으로 치환된다)
438번 위치의 Ser (바람직하게는 Gly으로 치환된다)
445번 위치의 Val (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
454번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
457번 위치의 Pro (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
474번 위치의 Ser (바람직하게는 Asp로 치환된다)
517번 위치의 Val (바람직하게는 결실된다)
518번 위치의 Glu (바람직하게는 결실된다)
519번 위치의 Ala (바람직하게는 결실된다)
520번 위치의 Pro (바람직하게는 결실된다)
상기한 yggB 유전자 동족체는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 또는 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써, 예를 들면 암호화된 단백질의 특이적인 위치에서 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 일어나도록 하는 부위-특이적 돌연변이유발 기술로 수득할 수 있다. 또한, 이러한 유전자는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리를 하여 수득할 수 있다. 돌연변이 처리의 예에는, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 또는 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자를 시험관내에서 하이드록실아민으로 처리하여, 미생물, 예를 들면 에스케리키아 세균을 처리하고, 유전자에 자외선을 조사하거나 유전자에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS(에틸 메탄설포네이트)와 같이 돌연변이 처리에서 일반적으로 사용되는 돌연변이유발제를 처리하는 방법이 포함된다. 상기한 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등에 대한 돌연변이에는 yggB 유전자를 보유한 미생물 종에서의 차이 및 개체의 차이(돌연변이체 또는 변이체)로부터 초래되는 자연발생 돌연변이도 포함된다. 이러한 유전자가 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시킬 수 있는지의 여부는, 예를 들면 유전자를 야생형 코리네형 세균에서 발현시키고, 수득된 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능이 야생형 균주와 같은 비변형 균주에 비해 향상되는지 측정함으로써 확인될 수 있다.
yggB 유전자는, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 또는 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 이들 가운데 어떤 뉴클레오타이드로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있고, 코리네형 세균내로 도입되는 경우 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시킬 수 있는 DNA일 수도 있다.
본원에서 사용되는 "엄중한 조건"이란 소위 특이적인 하이브리드는 형성되고 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 엄중한 조건의 예에는, 고도로 상동성인 DNA가 서로 하이브리드화 하는 조건, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상 상동성인 DNA는 서로 하이브리드화하고, 70% 미만의 상동성인 DNA는 서로 하이브리드화하지 않는 조건, 및 서던 하이브리드화의 전형적 세척과 염 농도에서, 즉 60℃에서 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 바람직하게는 2 내지 3회 세척하에 DNA가 서로 하이브리드화하는 조건이 포함된다.
yggB 유전자의 상보적인 부분 서열이 프로브로서 사용될 수도 있다. 이러한 프로브는 당업자에게 공지된 방법으로 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 고안된 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해 제조될 수 있다. 약 300 bp의 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 하이브리드화 이후의 세척 조건은 50℃에서 2×SSC, 0.1% SDS로서 예시될 수 있다. 서열번호 75 및 76에 제시된 올리고뉴클레오타이드는 상기 프로브를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또한, yggB 유전자는 <II> 내지 <IV>에 하기하는 돌연변이형 yggB 유전자일 수 있다.
상기한 yggB 유전자의 발현 향상은, 플라스미드, 또는 상동성 재조합, 접합, 전위 등을 이용한 형질전환을 사용함으로써, yggB 유전자의 카피 수를 증가시키거나, yggB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키거나, yggB 유전자의 발현을 증가시키는 조절인자를 암호화하는 유전자를 증폭시키거나, yggB 유전자의 발현을 감소시키는 조절인자를 암호화하는 유전자를 파괴 또는 약화시킴으로써 달성될 수 있다.
예를 들면, 재조합 DNA는, yggB 유전자를 포함하는 유전자 단편을 벡터, 바람직하게는 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 다중 카피 벡터에 연결시키고, 수득된 벡터를 L-글루탐산을 생산하는 코리네형 세균내로 도입시킴으로써 제조될 수 있다.
yggB 유전자의 카피 수는 다수의 yggB 유전자 카피를 미생물의 염색체 DNA내로 통합시킴으로써 증가될 수도 있다. 다수의 yggB 유전자 카피를 미생물의 염색체 DNA내로 통합시키기 위해서, 염색체 DNA상에 다중 카피로 존재하는 서열을 표적하여 상동성 재조합을 수행할 수 있다. 트랜스포존의 말단에 있는 반복 DNA 및 역위 반복체가 사용될 수 있다. 또한, 일본 공개특허 공보 제2-109985A호에 게시된 바와 같이, yggB 유전자를 트랜스포존내로 혼입시키고, 다수의 유전자 카피가 염색체 DNA내로 통합되도록 전달하는 것도 가능하다. yggB 유전자의 부분 서열을 갖는 프로브를 사용한 서던 하이브리드화로 yggB 유전자를 염색체내로 통합시킬 수 있다.
이하, yggB 유전자의 발현이 향상되도록 변형된 코리네형 세균을 작제하는 방법의 예를 제시할 것이다. 이 방법은 문헌[참조: Molecular cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)]에 기술된 바와 같은 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다.
먼저, 코리네형 세균의 염색체 DNA로부터 yggB 유전자를 클로닝한다. 염색체 DNA를 코리네형 미생물로부터, 예를 들면 사이토(Saito)와 미우라(Miura)의 방법[참조: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan, 1992)]에 의해 제조할 수 있다. PCR을 위해 서열번호 75 및 76에 제시된 것과 같은 올리고뉴클레오타이드가 프라이머로서 사용될 수 있다.
이어서, 증폭된 yggB 유전자를 코리네형 세균에서 작용할 수 있는 벡터 DNA에 연결시켜 재조합 DNA를 제조한다. 플라스미드를 작제하기 위해 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 및 코리네형 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터가 사용된다. 코리네형 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), pVK7 (US2003-0175912), 및 pSFK6 (JP2000-262288A), pCRY30 (JP3-210184A), pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, pCRY3KX (JP2-72876A 및 미국 특허 제5,185,262호), pCRY2, 및 pCRY3 (JP1-191686), 및 pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP58-192600A), pCG1 (JP57-134500A), pCG2 (JP58-35197), pCG4, pCG11 (S57-183799)가 포함된다. 에스케리키아 콜라이에서 자발적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG 및 pACYC는 Takara Bio로부터 입수할 수 있다), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW는 Nippon Gene으로부터 입수할 수 있다), pTrc99A [참조: Amann et al., Gene 69:301-315(1988)]등이 포함된다.
yggB 유전자를 상기한 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 제조하기 위해서, yggB 유전자를 포함하는 벡터 및 단편을 제한효소로 분해시키고, 일반적으로 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 서로 연결시킨다.
상기한 재조합 플라스미드를 통상적인 형질전환 방법으로 숙주 코리네형 세균내로 도입시킨다. 형질전환 방법의 예에는, 에스케리키아 콜라이 K-12에 대해 보고된 바 있는 방법인, 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], 및 바실러스 섭틸리스에 대해 보고된 바 있는 방법인, 성장기에 있는 세포로부터 컴피턴트 세포를 제조하여 DNA로 형질전환시키는 방법[참조: Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1997)] 등이 포함된다. 이러한 방법 외에도, 바실러스 섭틸리스, 방선균 및 효모에 적용할 수 있는 것으로 보고된 바 있는 방법인, 재조합 DNA를 원형질체- 또는 스페로플라스트-유사 수용 세포내로 도입시키는 방법[참조: Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)]을 사용할 수 있다. 또한, 전기 펄스 방법(일본 공개특허 공보 제2-207791A호)을 사용하여 미생물의 형질전환을 수행할 수도 있다.
yggB 유전자의 카피 수는 다수의 유전자 카피를 코리네형 세균의 염색체 DNA내로 통합시킴으로써 증가될 수도 있다. 다수의 yggB 유전자 카피를 코리네형 세균의 염색체 DNA내로 통합시키기 위해서, 염색체 DNA상에 다수의 카피로 존재하는 서열을 표적하여 상동성 재조합을 수행할 수 있다. 트랜스포존의 말단에 있는 반복 DNA 및 역위 반복체가, 염색체 DNA상에 다수의 카피로 존재하는 서열로서 사용될 수 있다. 또한, 유럽 특허 제0332488B호 및 문헌[참조: Vertes, A.A., Asai, Y., Inui, M., Kobayashi, M., Kurusu, Y. and Yukawa, H. :Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)]에 게시된 바와 같이, yggB 유전자를 트랜스포존내로 혼입시키고, 다수의 유전자 카피가 염색체 DNA내로 통합되도록 전달하는 것도 가능하다.
또한, Mu 파아지(유럽 특허 제0332488B) 또는 접합 방법[참조: Biotechnology (N Y). 1991 Jan;9(1):84-7]을 사용하여 yggB 유전자를 숙주 염색체내로 혼입시킬 수도 있다. 또한, yggB 유전자의 카피 수는 하기하는 인공 트랜스포존을 사용함으로써 증가될 수도 있다.
또한, 숙주 코리네형 세균내에서 복제할 수 없는 복제 오리진을 갖는 플라스미드 또는 숙주 코리네형 세균내에서 복제할 수 없는 복제 오리진을 갖고 접합에 의해 전달될 수 있는 플라스미드에 yggB 유전자를 삽입함으로써, 염색체상에서 yggB 유전자를 증폭시킬 수도 있다. 이러한 플라스미드의 예에는 pSUP301[참조: Simo et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 및 pK19mob[참조: Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T(Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO[참조: Shuman (1994) Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5487993], pCR(R)Blunt(Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1[참조: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516], 및 pBGS8[참조: Spratt et al., 1986, Gene, 41:337-342]이 포함된다. yggB 유전자를 갖는 플라스미드를 접합 또는 형질전환에 의해 코리네형 세균내로 전달한다. 유전자 전달을 접합에 의해, 예를 들면 문헌[참조: Schaefer et al. Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술된 방법에 의해 수행할 수도 있다. 유전자 전달을 형질전환에 의해, 예를 들면 문헌[Theirbach et al. Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1998)], 문헌[Dunican and Shivinan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)], 및 문헌[Tauch et al. FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술된 방법에 의해 수행할 수도 있다.
yggB 유전자의 발현 향상은, 염색체 DNA 또는 플라스미드상에 있는, yggB 유전자의 프로모터를 포함하는, 발현 조절 서열을 보다 강한 것으로 대체함으로써, 오퍼레이터(operator) 및/또는 리프레서(repressor)와 같이 yggB 유전자의 발현 조절에 관계된 요소를 변형시킴으로써, 또는 yggB 유전자의 종결 코돈 하류에 강한 터미네이터(terminator)를 융합시킴으로써[참조: Hamilton et al.; Journal of Bacterology 171:4617-4622] 달성될 수도 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PL 프로모터, PS2 프로모터[참조: Appl Environ Microbiol. 2003 Jan;69(1):358-66; Mol Microbiol. 1993 Jul;9(1):97-109; WO93/03158] 등이 강한 프로모터로서 알려져 있다. 프로모터의 세기를 평가하는 방법 및 강한 프로모터의 예는 문헌[참조: Goldstein et al. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annul. Rev., 1995, 1, 105-128]에 게시되어 있다. 또한, 프로모터를 보다 강하게 하기 위해서, 수개의 뉴클레오타이드 치환을 yggB 유전자의 프로모터 영역내로 도입시키는 것도 가능하다(WO00/18935). 예를 들면, "-35 영역"을 "TTGACA" 또는 "TTGCCA"로 치환시키거나, "-10 영역"을 "TATAAT" 또는 "TATAAC"로 치환시킬 수 있다. 또한, 특히 개시 코돈의 바로 수개의 뉴클레오타이드 상류에 있는, 리보솜 결합 부위(RBS)와 해독 개시 코돈 사이의 스페이서 서열이 해독 효율에 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 서열을 변형시킬 수 있다. yggB 유전자의 "발현 조절 서열"은 yggB 유전자의 발현량에 영향을 주는 영역을 의미하며, 그것의 예에는 yggB 유전자의 상류 영역이 포함된다. yggB 유전자 발현을 향상시키기 위한 변형에 적합한 상류 영역에는 yggB 유전자의 해독 개시 코돈의 상류 영역(예를 들면, 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1436번의 상류 영역)이 포함되고, 그것의 바람직한 예에는 해독 개시 코돈의 적어도 500bp 상류 영역이 포함되며, 그것의 보다 바람직한 예에는 해독 개시 코돈의 적어도 300bp 상류 영역이 포함된다.
발현 조절 서열의 대체는, 예를 들면 상기한 온도 민감성 플라스미드를 사용함으로써 달성될 수도 있다.
발현 조절 서열의 변형으로 yggB 유전자의 카피 수가 증가될 수도 있다.
<II> 돌연변이형 yggB 유전자의 도입
yggB 유전자를 이용한 변형으로 돌연변이형 yggB 유전자가 코리네형 세균내로 도입될 수 있다. 돌연변이형 yggB 유전자의 도입에는, 염색체상의 yggB 유전자내로 돌연변이의 도입, 돌연변이형 yggB 유전자를 포함하는 플라스미드의 도입, 및 염색체상의 yggB 유전자의 돌연변이형 yggB 유전자로의 대체가 포함된다.
본 발명에서, "돌연변이형 yggB 유전자"는 코리네형 세균내로 도입되는 경우 과량의 비오틴의 존재하에서 yggB 유전자가 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키게 하는 암호화 영역내에 돌연변이를 포함하는 yggB 유전자를 의미한다. 돌연변이형 yggB 유전자는, 코리네형 세균내로 도입되는 경우 과량의 비오틴의 존재하에서뿐만 아니라 L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 유전자일 수도 있다.
"과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능이 향상된다"라는 어구는, 코리네형 세균의 비변형 균주가 실질적으로 L-글루탐산을 생산할 수 없는 농도의 비오틴을 함유하는 배지에서, 예를 들면 30㎍/L 이상의 비오틴을 함유하는 배지에서, 본 발명의 코리네형 세균을 배양하는 경우에, 배지에 비변형 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기하거나, 또는 비변형 균주보다 더 높은 속도로 L-글루탐산을 생산하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자를 수득하는 방법 및 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시키는 방법의 예를 기술할 것이다. 그러나 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자를 수득하는 방법 및 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시키는 방법은 이러한 예들로 제한되지 않는다.
(II-1) odhA 유전자에 결함이 있는 균주를 사용하는 방법
본 발명의 발명자들은 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제의 E1o 서브유닛을 암호화하는 유전자가 파괴된, odhA(sucA) 유전자-파괴된 균주를 이용함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 효율적으로 수득할 수 있음을 밝혔다.
본 발명에서, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(α-KGDH) 활성은 석시닐-CoA를 생성시키는 α-케토글루타르산(2-옥소글루타르산)의 산화성 탈카복실화 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 이 반응은 세 종류의 효소, 즉 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(E1o EC1.2.4.2), 디하이드로리포아미드-S-석시닐트랜스퍼라제(E2o) 및 디하이드로리포아미드 데하이드로게나제(E3)에 의해 촉매된다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제는 옥소글루타레이트 데하이드로게나제(석시닐-트랜스퍼라제) 또는 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제로도 지칭된다. α-KGDH의 활성은 문헌[참조: Shiio et al. Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980]의 방법으로 측정할 수 있다.
코리네형 세균의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제의 E1o 서브유닛을 암호화하는 유전자(odhA)의 뉴클레오타이드 서열은 이미 동정되었다[참조: Microbiology 142, 3347-3354, (1996), Genbank 승인번호 D84102]. odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 43의 뉴클레오타이드 443번 내지 4213번에 제시되어 있고, odhA 유전자의 아미노산 서열은 서열번호 44에 제시되어 있다.
odhA 유전자-파괴된 균주는, 예를 들면 상기한 sacB 유전자를 사용하는 방법으로 수득할 수 있다. 먼저, 서열번호 1 및 2에 제시된 것과 같은 odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 고안된 프라이머, 및 주형으로서 ATCC13869 균주와 같은 코리네형 세균의 염색체 DNA를 이용하여 PCR로 odhA 유전자의 내부서열을 증폭시킨다. odhA 유전자가 파괴된 플라스미드를 작제하기 위해 odhA 유전자의 내부단편을 플라스미드내로 삽입한다. 유전자를 파괴하기 위해 사용되는 플라스미드에는 코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드(JP-A-05-00791), 및 실시예 1에 기술된 sacB 유전자를 포함하는 자살벡터인 pBS3가 포함된다.
수득된 플라스미드를, 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산의 축적을 야기할 수 없는 균주, 예를 들면 야생형 씨. 글루타미컴 ATCC13869, ATCC13032 균주내로 전기 펄스 방법(JP-A-2-207791)에 의해 도입시킨다. 플라스미드상의 돌연변이형 odhA 유전자와 염색체 odhA 유전자 사이에 상동성 재조합이 일어난 단일교차 재조합체를 수득한다. 온도 민감성 플라스미드를 사용하는 경우, 플라스미드가 복제할 수 없는 온도에서 단일교차 재조합체를 수득한다. 균주가 단일교차 재조합체인지의 여부는, 예를 들면 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오타이드를 이용함으로써 확인할 수 있다.
이렇게 수득된 odhA 유전자가 파괴된 균주를 당을 함유하는 배지에서 분리한다. 분리 공정에서, 높은 빈도로 자발적 돌연변이가 염색체상의 yggB 유전자내로 도입된다. 이어서, 과량의 비오틴을 함유하는 배지에서 균주를 배양함으로써, 분리된 균주의 L-글루탐산 생산능을 평가한다. 예를 들면, 후보 균주를 20ml의 배양 배지(30g/l 글루코즈, 15g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l 비타민 B1, 300㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(총 질소), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 1g의 열-멸균된 탄산칼슘을 부가하고 진탕하면서 균주를 배양한다. 당이 완전히 소비된 후, 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한다. L-글루탐산을 생산하는 균주, 예를 들면 50% 이상(당에 대한 수율)의 L-글루탐산을 생산하는 균주를 선별하고, 선별된 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 yggB 유전자내로 돌연변이가 도입된 균주를 수득한다.
돌연변이형 yggB 유전자만을 보유한 균주를 작제하기 위해서, 플라스미드에 의해 피괴된 염색체상의 odhA 유전자를 야생형 odhA 유전자로 대체하는 것이 바람직하다. odhA 유전자에 결함이 있는 균주는 당이 없는 배지에서 상당히 느리게 성장한다. 하지만 odhA 유전자가 야생형 유전자로 복귀되면 당이 없는 배지, 예를 들면 CM2B 배지(10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 10㎍/l 비오틴, 20g/l 한천, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)에서 균주가 잘 성장할 수 있다. 따라서, odhA 유전자-파괴된 균주를 CM2B 플레이트에 도말하여, 성장이 개선된 균주를 선별한다. 이렇게 출현한 성장이 개선된 균주를 CM2B 플레이트에서 정제하고, 균주가 야생형 odhA 유전자를 포함하는지의 여부는, 잔존하는 벡터의 부재에 기반하여 항생제에 대한 균주의 민감성을 검사하여 평가할 수 있다. 또한, odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수도 있다.
또한, 돌연변이형 yggB 유전자를 odhA-yggB 이중 돌연변이 균주로부터 클로닝하고, 야생형 균주내로 도입시킬 수도 있다. 예를 들면, 주형으로서 이중 돌연변이 균주의 염색체 DNA를 사용하고 서열번호 9 및 10에 제시된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 증폭시킬 수 있다. pHSC4(JP-A-05-007491) 또는 실시예 1에 기술된 자살벡터인 pBS3와 같이 코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드에 증폭된 생성물을 삽입하여, 염색체상의 야생형 yggB 유전자를 돌연변이형 yggB 유전자로 대체시킨다. 돌연변이가 염색체상의 yggB 유전자내로 도입되었는지의 여부는 염색체상의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 확인할 수 있다.
(II-2) 전위요소를 사용하는 방법
코리네형 세균의 전위요소를 이용하여, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 스크리닝할 수도 있다. 전위요소에는 삽입서열(IS) 및 인공 트랜스포존이 포함될 수 있다. 돌연변이형 yggB 유전자는, 암호화 영역내로 우연히 삽입된 IS 및/또는 트랜스포존을 갖는 유전자, 또는 인공 트랜스포존을 사용하여 인공적으로 수득한 유전자일 수 있다. 전위요소가 삽입된 균주는, 예를 들면 L-글루탐산 유사체에 대한 민감성의 감소에 기초하여 선별할 수 있다. L-글루탐산 유사체로서 4-플루오로글루탐산이 사용될 수 있다. 또한, 항생제-내성 유전자를 포함하는 인공 트랜스포존으로 항생제-내성 균주를 무작위로 선별하고, 항생제-내성 균주의 yggB 유전자의 길이를 PCR로 확인함으로써, 전위요소가 삽입된 균주를 선별할 수 있다.
코리네형 세균내로 IS를 도입시키기 위해 일본 공개특허 공보 제9-070291호에 기술된 방법을 사용할 수도 있다. IS의 양측면에 역위 반복체(IR) 사이에 끼어있는 트랜스포사제의 구조 유전자 및 마커 유전자를 포함한 인공 트랜스포존을 사용할 수도 있다. 이 경우, 트랜스포사제의 구조 유전자는 마커 유전자 및 IS와 함께 동일한 플라스미드에 존재하거나 별개의 플라스미드에 존재할 수 있다. 또한, 숙주 코리네형 세균의 염색체상에 존재하는 트랜스포존의 기능을 사용할 수도 있다. 코리네형 세균으로부터 유래한 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 예를 GenBank 승인번호로 제시하였다.
1. NCgl0179 Cgl0182; 트랜스포사제
2. NCgl0235 Cgl0238; 추정되는 트랜스포사제
3. NCgl0348 Cgl0355; 추정되는 트랜스포사제
4. NCgl0688 Cgl0718; 추정되는 트랜스포사제
5. NCgl0919 Cgl0959; 트랜스포사제
6. NCgl0993 Cgl1037; 트랜스포사제
7. NCgl1021 Cgl1066; 트랜스포사제
8. NCgl1464 Cgl1521; 추정되는 트랜스포사제
9. NCgl1496 Cgl1557; 트랜스포사제
10. NCgl1662 Cgl1733; 추정되는 트랜스포사제
11. NCgl1664 Cgl1734; 트랜스포사제
12. NCgl2131 Cgl2212; 트랜스포사제
13. NCgl2284 Cgl2367; 트랜스포사제
14. NCgl2392 Cgl2479; 추정되는 트랜스포사제
15. NCgl2418 Cgl2504; 추정되는 트랜스포사제
16. NCgl2420 Cgl2506; 추정되는 트랜스포사제
17. NCgl2460 Cgl2548; 예측된 트랜스포사제
18. NCgl2542 Cgl2631; 예측된 트랜스포사제
19. NCgl2665 Cgl2761; 추정되는 트랜스포사제
20. NCgl2748 Cgl2845; 추정되는 트랜스포사제
21. NCgl2850 Cgl2951; 예측된 트랜스포사제
IS 또는 인공 트랜스포존은 적당한 벡터, 예를 들면 코리네형 세균에서 복제할 수 있는 플라스미드를 사용하여, 코리네형 세균내로 도입시킬 수 있다. 플라스미드의 구체적 예에는 pHM1519[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)], pAM330[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)], 및 약물 내성 유전자를 보유하도록 이러한 플라스미드를 변형시킴으로써 수득된 플라스미드가 포함된다. 또한, 염색체상의 IS 또는 인공 트랜스포존을 효율적으로 증폭시키기 위해 상기 (1)에 기술된 바와 같은 온도 민감성 복제 오리진을 갖는 플라스미드가 바람직하게 사용된다(일본 공개특허 공보 제5-7491호 참조). 이러한 스크리닝에 사용되는 모균주는 바람직하게는 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산의 축적을 야기할 수 없는 균주, 예를 들면 씨. 글루타미컴의 야생형 균주인 ATCC13869 균주이다.
IS 또는 인공 트랜스포존을 보유하는 플라스미드를 코리네형 세균내로 도입시키는 방법으로서, 원형질체 방법[참조: Gene, 39, 281-286 (1985)], 전기천공 방법[참조: Bio/Technology, 7, 1067-1070 (1989)]과 같은 통상적으로 사용되는 방법 등이 사용될 수 있다.
온도 민감성 플라스미드가 보유하는 IS 또는 인공 트랜스포존의 코리내형 세균내로의 도입은, 플라스미드로 코리네형 세균을 형질전환시키고, 플라스미드가 복제하여 IS 또는 인공 트랜스포존이 세포당 수십 내지 수백 카피로 증폭되고 염색체상으로 IS 또는 인공 트랜스포존을 도입시킬 수 있게 하는 25℃에서 형질전환체를 배양하고, 이어서 과량의 플라스미드를 제거하기 위해 34℃에서 세포를 배양함으로써 수행할 수 있다. 또한, IS 또는 인공 트랜스포존만의 DNA 단편, 또는 코리네형 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드 벡터(예를 들면, 에스케리키아 콜라이에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터)가, IS 또는 인공 트랜스포존을 코리네형 세균의 염색체내로 도입시키기 위해 사용될 수 있다[참조: 일본 공개특허 공보 제7-107976호, Vertes, A.A., Asai, Y., Inui, M., Kobayashi, M., Kurusu, Y. and Yukawa, H.: Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)].
L-글루탐산의 축적을 야기하는 균주를 선별하기 위해서, 염색체상에 IS 또는 인공 트랜스포존이 있는 균주를 과량의 비오틴을 함유하는 배지에서 배양한다. 이 균주의 염색체상의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 수득할 수 있다.
(II-3) 시험관내에서 yggB 유전자내로 돌연변이를 무작위로 도입시키는 방법
또한, 시험관내에서 yggB 유전자내로 돌연변이를 무작위로 도입시키고, 돌연변이 유전자를 코리네형 세균내로 도입시키고, 돌연변이형 yggB 유전자가 존재하여 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 균주를 스크리닝함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다. 스크리닝에 유용한 모균주는 바람직하게는 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산의 축적을 야기할 수 없는 균주, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869 균주, ATCC13032 균주, ATCC14067 균주, 및 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965 균주이다.
돌연변이형 yggB 유전자를 스크리닝하기 위해서 yggB에 결함이 있는 균주가 바람직하게 사용된다. sacB 유전자를 사용하는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, yggB 유전자-파괴된 균주를 작제할 수 있다. 예를 들면, yggB 유전자의 N-말단 단편을 제조하기 위해서, 서열번호 39 및 40에 제시된 프라이머 및 주형으로서 씨. 글루타미컴 ATCC13869의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 41 및 42의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 서열번호 40 및 41은 서로 상보적이다. 이어서, yggB 유전자의 내부서열이 결실된 단편을 제조하기 위해서, 주형으로서 등몰량의 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 39 및 42의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다.
수득된 PCR 단편을, 유전자 파괴를 위한 플라스미드, 예를 들면 레반 슈크라제 유전자를 보유한 pBS4S내로 삽입한다. yggB 유전자-파괴된 균주를 작제하기 위해서, 수득된 플라스미드를 코리네형 세균, 예를 들면 씨. 글루타미컴 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시킨다.
이어서, 예를 들면, 다음과 같이 yggB 유전자의 시험관내 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 먼저, 코리네형 세균에서 복제할 수 있는 플라스미드내로 yggB를 클로닝한다. 수득된 yggB 유전자를 보유하는 플라스미드 약 10㎍을, 돌연변이유발제를 함유하는 완충액, 예를 들면 400mM 하이드록실아민 및 1mM EDTA (pH 6.0)를 함유하는 500mM 인산염 완충액에 용해시키고, yggB 유전자내로 돌연변이를 도입시키기 위해서 75℃에서 60 내지 90분 동안 가열한다. 돌연변이유발 후, SUPREC-02 (Takara Bio INC.) 등으로 플라스미드를 탈염시키고, 이어서 ATCC13869 △yggB 균주내로 도입시키고, 항생제를 함유하는 배지에서 형질전환체를 스크리닝한다. 대조군으로서, 돌연변이가 유발되지 않은, yggB 유전자 보유 플라스미드를 ATCC13869 △yggB 균주내로 도입시킨다. 출현한 형질전환체를 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하고, 진탕하면서 배양하고나서, 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정한다. 야생형 yggB 유전자를 보유하는 플라스미드가 도입된 균주를 배양하는 배지에서는 실질적으로 L-글루탐산이 축적되지 않는 반면, 돌연변이형 yggB 유전자를 보유하는 플라스미드가 도입된 균주를 배양하는 배지에서는 상당한 양의 L-글루탐산이 축적된다. 균주가 돌연변이형 yggB 유전자를 보유하는지의 여부는 균주로부터 플라스미드를 추출하고 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 확인할 수 있다.
또한, 오류 유발(error prone) PCR, DNA 셔플링, 및 StEP-PCR[참조: Firth AE, Patrick WM; Bioinformatics. 2005 Jun 2; Statistics of protein library construction]과 같은 방법에 의해 yggB 유전자내로 돌연변이를 인공적으로 도입시킴으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다.
염색체상의 yggB 유전자내로 돌연변이를 도입시키는 방법에는, 상기한 방법 외에도, 코리네형 세균에 X-선 또는 자외선을 조사하거나 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 돌연변이유발제를 처리하고 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 균주를 선별하는 방법이 포함된다. 돌연변이형 yggB 유전자가 도입되었는지의 여부는 염색체상의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 확인할 수 있다.
(II-4) L-글루탐산 유사체-내성 균주를 스크리닝하는 방법
야생형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에서 배양하고, 배지에서 성장할 수 있는 L-글루탐산 유사체-내성 균주를 선별함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다. 이 방법에서 사용되는 모균주는 바람직하게는 상기한 코리네형 세균의 야생형 균주이고, 야생형 yggB 유전자를 갖는 균주일 수도 있으며, 야생형 yggB 유전자를 포함하는 플라스미드를 갖는 균주가 포함된다.
본원에서 사용되는 "L-글루탐산 유사체"에는 γ-메틸 L-글루타메이트, α-메틸 글루탐산, β-하이드록시글루탐산, 메티오닌설폭시민, 글루탐산-γ-모노하이드록사메이트, 2-아미노-4-포스포노부티르산, γ-모노에틸 L-글루타메이트, 디메틸 L-글루타메이트, 디-t-부틸 L-글루타메이트, 모노플루오로글루탐산, 디에틸 L-글루타메이트, D-글루탐산, 및 4-플루오로글루탐산이 포함되고, 이들 가운데 4-플루오로글루탐산이 바람직하게 사용된다. 예를 들면, 다음과 같이 L-글루탐산 유사체-내성 균주를 수득할 수 있다. 즉, L-글루탐산 유사체를 함유하는 최소 배지에 코리네형 세균을 접종하고, 24 내지 48시간 후에 출현하는 콜로니를 수거한다. 배지에 첨가되는 L-글루탐산 유사체의 농도는 바람직하게는, 비돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주는 성장할 수 없고 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주는 성장할 수 있는 농도이다. 구체적으로, 4-플루오로글루탐산의 농도는 1.25mM 이상, 바람직하게는 2.5mM 이상, 보다 바람직하게는 5mM 이상이다. 예를 들면, 본원에서 사용되는 "L-글루탐산 유사체-내성 균주"는, 야생형 균주의 생존성 세포 수(콜로니를 형성할 수 있는 세포의 수)가 4-플루오로글루탐산이 없을 때의 1/100 이하로 억제되는 4-플루오로글루탐산을 함유한 배지에서 균주를 배양할 때, 균주가 4-플루오로글루탐산 없이 배양된 균주의 1/10 이상의 성장을 나타내는 것을 의미한다.
수득된 L-글루탐산 유사체-내성 균주를 과량의 비오틴을 함유하는 액체 배지에 접종하고, 진탕하면서 배양하고나서, 배지에 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정한다. 야생형 yggB 유전자를 갖는 균주는 L-글루탐산을 거의 축적하지 못하는 반면, L-글루탐산 유사체-내성 균주의 일부는 상당한 양의 L-글루탐산을 축적한다. 이러한 균주로부터 yggB 유전자를 증폭시키고 그것의 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써 새로운 돌연변이형 yggB 유전자를 수득할 수 있다.
(III) 돌연변이형 yggB 유전자
이하, 돌연변이형 yggB 유전자의 구체적 예를 기술할 것이다. 그러나 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자는 이러한 유전자들로 제한되지 않는다.
상기한 방법에 의해 수득된 돌연변이형 yggB 유전자는, 코리네형 세균내로 도입되는 경우 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다.
(III-1) yggB 유전자의 C-말단 영역내의 돌연변이
이 돌연변이는 서열번호 6, 68, 84 또는 85의 아미노산 419번 내지 533번, 또는 서열번호 62의 아미노산 419번 내지 529번을 암호화하는 영역내로 도입된다. 예를 들면, 서열번호 5에서 이 영역은 뉴클레오타이드 2692번 내지 3035번으로 이루어진 영역에 상응한다. 이 돌연변이는, 이 영역내로 도입되는 한, 어떠한 유형이라도 될 수 있으며, 점 돌연변이 및 인공 서열의 삽입을 포함한다. 이들 가운데, 삽입 서열(IS) 또는 인공 트랜스포존을 도입시키는 돌연변이가 바람직하다. 돌연변이는 점 돌연변이, IS 또는 트랜스포존의 삽입의 결과로, 아미노산 치환(미스-센스 돌연변이), 프레임-이동, 또는 종결 코돈(넌-센스 돌연변이)을 야기할 수 있다.
(III-1-1) 전위요소의 삽입에 의한 돌연변이 (2A-1형 돌연변이)
C-말단 영역내의 돌연변이의 예에는 삽입 서열(IS)과 같은 전위요소를 서열번호 5의 2691번 위치의 "G" 다음에 삽입시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7에 제시되어 있고, 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다. 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열내로 삽입된 IS는 IS1207(GenBank 승인번호 X96962) 및 IS719(GenBank 승인번호 E12759)와 높은 상동성을 갖는다. 서열번호 8의 아미노산 서열에서, 419번 위치의 Val을 포함하는 C-말단 영역 및 그 이후의 Ygg 단백질(서열번호 6)은 IS로부터 유래한 더 짧은 서열로 대체된다. 서열번호 6, 62, 68, 84, 및 85의 아미노산 서열내의 C-말단 영역을 변화 또는 결실시키는 돌연변이를 포함하여, 이 유형의 돌연변이는 2A-1형 돌연변이라 명명한다.
또한, 2A-1형 돌연변이에는 다른 IS 또는 트랜스포존을 2A-1형 돌연변이와 동일한 위치내로 도입시키는 다른 돌연변이도 포함된다. IS 또는 트랜스포존이 삽입되는 위치는, 상기한 영역내에 위치하는 한, 어떠한 위치라도 될 수 있다. 트랜스포사제가 쉽게 인식할 수 있는 위치, 또는 IS가 쉽게 삽입될 수 있는 돌연변이 다발점(hot spot)으로 IS가 삽입되는 것이 바람직하다.
(III-1-2) 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이 (66형 및 22형 돌연변이)
또한, C-말단 영역내의 돌연변이의 예에는 C-말단 영역내의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이도 포함된다. 서열번호 6의 아미노산 서열에서 다음과 같은 위치의 프롤린은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
424번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 424번)
437번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 437번)
453번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 453번)
457번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 457번)
462번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 462번)
469번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 469번)
484번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 484번)
489번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 489번)
497번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 497번)
515번 위치의 Pro (서열번호 62, 68, 84, 85의 515번)
529번 위치의 Pro (서열번호 68, 84, 85의 529번, 서열번호 62의 525번)
533번 위치의 Pro (서열번호 68, 84, 85의 533번, 서열번호 62의 529번)
YggB 단백질의 C-말단 영역에 있는 프롤린 잔기가 YggB 단백질의 3차원 구조의 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다[참조: Protein Eng. 2002 Jan; 15(1):29-33, J Biol Chem. 1991 Dec 25; 266(36):24287-94].
특히, 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 424번 위치의 프롤린 및/또는 437번 위치의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다.
다른 아미노산의 예에는 Ala, Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, Tyr, Val, 및 Thr이 포함된다. 424번 위치의 프롤린을 치환하는 다른 아미노산으로서 Ala, Gly, Val, Leu, 및 Ile과 같은 소수성 아미노산이 바람직하고, Leu, Val, 및 Ile과 같이 분지쇄를 갖는 아미노산이 보다 바람직하다. 424번 위치의 Pro을 Leu으로 치환시키는 돌연변이의 예에는 서열번호 67의 1673번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 69에 제시되어 있고, 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 70에 제시되어 있다.
437번 위치의 프롤린을 치환하는 다른 아미노산으로서 Thr, Ser, Tyr과 같이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산이 바람직하고, Ser을 포함한 아미노산이 보다 바람직하다. 437번 위치의 Pro을 Ser으로 치환시키는 돌연변이의 예에는 서열번호 5의 2745번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 또한, 이 돌연변이에는 서열번호 5의 3060번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이도 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 73에 제시되어 있고, 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 74에 제시되어 있다.
(III-2) yggB 유전자의 막관통 영역내의 돌연변이
yggB 유전자에 의해 암호화되는 YggB 단백질은 5개의 막관통 영역을 갖는 것으로 예상된다. 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 야생형 YggB 단백질의 아미노산 서열에서, 막관통 영역은 아미노산 1번 내지 23번(첫 번째 막관통 영역), 아미노산 25번 내지 47번(두 번째 막관통 영역), 아미노산 62번 내지 84번(세 번째 막관통 영역), 아미노산 86번 내지 108번(네 번째 막관통 영역), 및 아미노산 110번 내지 132번(다섯 번째 막관통 영역)에 상응한다. 서열번호 5에서, 이러한 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 1437번 내지 1505번, 뉴클레오타이드 1509번 내지 1577번, 뉴클레오타이드 1620번 내지 1688번, 뉴클레오타이드 1692번 내지 1760번, 및 뉴클레오타이드 1764번 내지 1832번에 각각 상응한다. 이 유형의 돌연변이는 바람직하게는 이러한 영역내로 도입된다. 이러한 종류의 돌연변이는 바람직하게는, 프레임 이동 돌연변이 및 해독 종결을 야기하지 않으면서 이러한 영역내로 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입 또는 역위를 도입시킨다. 이들 가운데, 상기한 영역에서 아미노산 치환을 야기하는 미스-센스 돌연변이가 바람직하다. 치환, 결실, 부가, 삽입 또는 역위되는 "수개"의 아미노산의 수는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 2 내지 3개를 의미한다. 프레임 이동 없이 1개 또는 수개의 아미노산의 삽입 및 결실을 야기하는 돌연변이도 바람직하고, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 또는 21개의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실이 보다 바람직하며, 3, 6, 또는 9개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입이 보다 바람직하고, 3개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입이 보다 바람직하다.
막관통 영역내의 돌연변이의 구체적 예에는 다음이 포함된다:
(III-2-1) 첫 번째 막관통 영역내의 돌연변이(A1형 돌연변이)
이 유형의 돌연변이에는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 아미노산 서열에서 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 돌연변이가 포함되고, 특히 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 3개의 아미노산, 예를 들면 Cys-Ser-Leu을 도입시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이에는 서열번호 5의 야생형 yggB 유전자에서 1480번 위치의 G 다음에 TTCATTGTG를 삽입시키는 돌연변이가 포함된다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시되어 있다.
(III-2-2) 네 번째 막관통 영역내의 돌연변이(19형 돌연변이)
이 유형의 돌연변이에는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 아미노산 서열에서 100번 위치의 Ala을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 다른 아미노산의 예에는 Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val, 및 Thr이 포함된다. 이들 가운데, Thr, Ser, 및 Tyr과 같이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산이 바람직하며, 트레오닌이 보다 바람직하다. 100번 위치의 Ala을 Thr으로 치환시키는 돌연변이에는 서열번호 5의 1734번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이가 포함된다.
이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 21에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되어 있다.
(III-2-3) 다섯 번째 막관통 영역내의 돌연변이(L30형 돌연변이, 8형 돌연변이)
이 유형의 돌연변이에는 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85에 제시된 아미노산 서열에서 111번 위치의 Ala을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이가 포함된다. 다른 아미노산의 예에는 Arg, Asp, Asn, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr, Val, 및 Thr이 포함된다. 이들 가운데, Val, Ile, 및 Leu과 같이 분지쇄를 갖는 아미노산 및 Thr, Ser, 및 Tyr과 같이 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산이 바람직하고, Val 또는 Thr이 바람직하다. 이 유형의 돌연변이에는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열의 1768번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이(L30형 돌연변이) 및 서열번호 61의 뉴클레오타이드 서열의 837번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이(8형 돌연변이)가 포함된다. L30형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되어 있다. 8형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 63에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 64에 제시되어 있다.
(IV) 돌연변이형 yggB 유전자와 동등한 유전자
본 발명에서 사용되는 "돌연변이형 yggB 유전자"는 상기한 "돌연변이형 yggB 유전자"와 실질적으로 상동성을 갖고 기능적으로 동등한 유전자, 예를 들면 과량의 비오틴의 존재하에서 유전자가 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 한, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 1437번 내지 2705번, 서열번호 19의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3044번, 서열번호 21의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 서열번호 63의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번, 서열번호 69의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번, 서열번호 23의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번, 및 서열번호 73의 뉴클레오타이드 548번 내지 2146번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열 가운데 적어도 하나에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 및 이러한 뉴클레오타이드 서열로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돌연변이형 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 "엄중한 조건"이란 소위 특이적인 하이브리드는 형성되고 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 엄중한 조건의 예에는, 높은 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화 하는 조건, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하고, 70% 이하의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하지 않는 조건, 및 서던 하이브리드화의 전형적 세척과 염 농도에서, 즉 60℃에서 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 바람직하게는 2 내지 3회 세척하에 DNA가 서로 하이브리드화하는 조건이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 돌연변이형 yggB 유전자에는, 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 유지하는 동시에, 상기한 구체적 아미노산 이외의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된, 서열번호 8, 20, 22, 24, 64, 70, 또는 74의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된다. 여기서 언급된 "수개"의 아미노산 잔기의 수는 3차원 구조에서의 위치 또는 단백질의 아미노산 잔기의 유형에 따라 다를 수 있지만, 바람직하게는 2 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다.
yggB 유전자는 바람직하게는, 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 유지하는 동시에, 상기한 구체적 아미노산 치환 또는 결실을 갖고, 서열번호 8, 20, 22, 24, 64, 70, 또는 74에 제시된 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화한다. 상기한 치환은 바람직하게는 보존적 치환(중성 돌연변이)이다. 방향족 아미노산의 경우, 보존적 치환은 phe, trp, 및 tyr 서로 간의 치환을 포함한다. 소수성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 leu, ile, 및 val 서로 간의 치환을 포함한다. 극성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 gln 및 asn 서로 간의 치환을 포함한다. 염기성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 arg, lys, 및 his 서로 간의 치환을 포함한다. 산성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 asp 및 glu 서로 간의 치환이다. 하이드록실 그룹 함유 아미노산의 경우, 보존적 치환은 ser 및 thr 서로 간의 치환을 포함한다. 보존적 치환은 또한 Ala에서 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg에서 Gln, His 또는 Lys으로의 치환, Asn에서 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp에서 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Gln에서 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg으로의 치환, Glu에서 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly에서 Pro으로의 치환, His에서 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr으로의 치환, Ile에서 Leu, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Leu에서 Ile, Met, Val 또는 Phe으로의 치환, Lys에서 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg으로의 치환, Met에서 Ile, Leu, Val 또는 Phe으로의 치환, Phe에서 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu으로의 치환, Ser에서 Thr 또는 Ala으로의 치환, Thr에서 Ser 또는 Ala으로의 치환, Trp에서 Phe 또는 Tyr으로의 치환, Tyr에서 His, Phe 또는 Trp으로의 치환, 및 Val에서 Met, Ile 또는 Leu으로의 치환을 포함한다. 상기한 바와 같이, 서열번호 85의 아미노산 서열에서 Xaa로 제시된 아미노산은 치환될 수 있다.
특히, 서열번호 8, 20, 22, 24, 64, 70, 또는 74의 아미노산 서열에서 다음의 아미노산은 치환 또는 결실될 수 있다.
48번 위치의 Glu (바람직하게는 Arg으로 치환된다)
275번 위치의 Asp (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
298번 위치의 Glu (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
343번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
396번 위치의 Phe (바람직하게는 Ile으로 치환된다)
438번 위치의 Ser (바람직하게는 Gly으로 치환된다)
445번 위치의 Val (바람직하게는 Ala으로 치환된다)
454번 위치의 Ala (바람직하게는 Val으로 치환된다)
457번 위치의 Pro (바람직하게는 Ser으로 치환된다)
474번 위치의 Ser (바람직하게는 Asp로 치환된다)
517번 위치의 Val (바람직하게는 결실된다)
518번 위치의 Glu (바람직하게는 결실된다)
519번 위치의 Ala (바람직하게는 결실된다)
520번 위치의 Pro (바람직하게는 결실된다)
(V) 상기한 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시키는 방법
상기한 구체적 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자는 부위-지시된 돌연변이유발 기술을 포함하는 통상적인 방법에 의해 수득할 수 있다. 부위-지시된 돌연변이유발 기술에는 돌연변이를 갖는 PCR 프라이머를 이용하여 돌연변이 유전자를 증폭시키는 중첩연장 PCR 방법이 포함된다[참조: Urban, A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997)].
상기한 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 본 발명의 코리네형 세균은 상기한 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시킴으로써 수득할 수 있다. 염색체상의 야생형 yggB 유전자를 돌연변이형 yggB 유전자로 대체시킬 수 있다. 돌연변이형 yggB 유전자를 야생형 yggB 유전자가 파괴된 코리네형 세균내로 도입시킬 수도 있다. 또한, 단일교차 재조합체의 경우에서와 같이 돌연변이형 yggB 유전자가 코리네형 세균내에서 야생형 yggB 유전자와 공존할 수 있다. 예를 들면, 상기한 레반 슈크라제를 암호화하는 sacB 유전자를 포함하는 온도 민감성 플라스미드를 사용하여 염색체상의 yggB 유전자를 대체시킬 수 있다. 또한, 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시키기 위해서, 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 플라스미드 또는 돌연변이형 yggB 유전자를 포함하는 트랜스포존과 같은 벡터를 사용할 수 있다.
돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균의 염색체 DNA내로 도입시키기 위해서, 염색체 DNA상에 다수의 카피로 존재하는 서열을 표적하여 상동성 재조합을 수행할 수도 있다. 이러한 서열의 예에는 전위요소의 말단에 있는 반복 DNA 및 역위 반복체가 포함된다. 돌연변이형 yggB 유전자는 코리네형 세균내에 단일 카피 또는 다수의 카피로 존재할 수 있다. PCR, 서던 하이브리드화 등의 방법으로 돌연변이형 yggB 유전자를 코리네형 세균내로 도입시킬 수 있다.
또한, 돌연변이형 yggB 유전자는, 국제 공보 제WO00/18935호에 기술된 바와 같이, 다른 유전자로부터 유래한 강한 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PS2 프로모터 등이 강한 프로모터로서 알려져 있다. 돌연변이형 yggB 유전자의 발현이 향상되도록 돌연변이형 yggB 유전자의 프로모터 영역내의 뉴클레오타이드를 치환시킬 수도 있다. 발현 조절 서열을, 예를 들면 온도 민감성 플라스미드를 사용하여 대체시킬 수 있다.
(VI) L-글루탐산 유사체 내성
또한, 본 발명의 코리네형 세균은, 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자가 도입된 결과로, L-글루탐산 유사체에 대한 내성이 향상될 수 있다. 본원에서 사용되는 "L-글루탐산 유사체"에는 γ-메틸 L-글루타메이트, α-메틸 글루탐산, β-하이드록시글루탐산, 메티오닌설폭시민, 글루탐산-γ-모노하이드록사메이트, 2-아미노-4-포스포노부티르산, γ-모노에틸 L-글루타메이트, 디메틸 L-글루타메이트, 디-t-부틸 L-글루타메이트, 모노플루오로글루탐산, 디에틸 L-글루타메이트, D-글루탐산, 및 4-플루오로글루탐산이 포함된다. 예를 들면, 모균주의 생존성 세포 수(콜로니를 형성할 수 있는 세포의 수)가 1/100 이하로 억제될 수 있는 농도의 4-플루오로글루탐산을 함유한 배지에서 본 발명의 균주를 배양할 때, 균주가 4-플루오로글루탐산 없이 배양될 때와 비교하여 1/10 이상의 성장을 나타낸다는 사실에 의해, L-글루탐산 유사체에 대한 내성의 향상을 확인할 수 있다. 구체적으로는, 균주가 1.25mM 이상, 바람직하게는 2.5mM 이상, 보다 바람직하게는 5mM 이상의 4-플루오로글루탐산에 대한 내성을 갖는 것이 바람직하다.
(VII) 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 불활성화시키기 위한 추가의 변형
본 발명의 코리네형 세균은, 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자를 불활성화시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. "돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자"는 균주내에서 증폭하여 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주에 의한 L-글루탐산 생산을 억제하는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자의 예에는 symA(suppressor of yggB mutation) 유전자가 포함된다. symA 유전자는 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032 균주의 게놈 서열(Genbank 승인번호 NC_003450)의 뉴클레오타이드 2051306번 내지 2051845번으로서 제시되어 있으며, NCgl 1867(NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147])로서 등록되어있다. 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869 균주의 symA 유전자는 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 제시되어 있다. symA 유전자는, DNA가 코리네형 세균에서 상기 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 한, 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 DNA일 수 있다.
유전자의 발현을 감소시키기 위해 유전자를 파괴, 결실, 또는 변형시킴으로써 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 효소 활성을 저하시키기 위한 상기의 방법과 유사한 방법을 사용하여 symA 유전자를 불활성화시킬 수 있다.
(VIII) α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성을 저하시키기 위한 추가의 변형
본 발명에서, 코리네형 세균은 yggB 유전자를 사용한 변형 외에도, 바람직하게는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(이하, "α-KGDH"로 언급된다)의 활성이 저하되도록 변형된다. "α-KGDH 활성이 저하된다"는 α-KGDH 활성이 모균주와 같은 야생형 균주 또는 비변형 균주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. α-KGDH 활성은 문헌[참조: Shiio et al. Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980]의 방법에 따라서 측정할 수 있다. α-KGDH 활성은 야생형 균주 또는 모균주와 같은 비변형 균주와 비교하여 저하되는 것으로도 충분하지만, 야생형 또는 비변형 균주에 대하여 약 1/2배 이하, 바람직하게는 약 1/4배 이하, 보다 바람직하게는 약 1/10배 이하로 α-KGDH 활성이 저하되는 것이 바람직하다. 본 발명의 코리네형 세균은 검출가능한 α-KGDH 활성을 갖지 않을 수 있다.
α-KGDH 활성이 저하된 코리네형 세균은 상기의 방법과 유사한 방법으로 작제할 수 있다.
예를 들면, 티아민 피로포스페이트 결합 영역(서열번호 43의 뉴클레오타이드 2498번 내지 2584번(서열번호 44의 686번 Gly 내지 714번 Asp)에 의해 암호화되는 영역)내에 돌연변이를 포함하는 α-KGDH 복합체의 E1o 서브유닛을 암호화하는 유전자를 도입시킴으로써 α-KGDH 활성을 저하시킬 수 있다.
저하된 α-KGDH 활성을 갖는 균주의 예에는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 △S 균주(WO95/34672) 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821(FERM BP-4172) 균주(JP-A-06-237779)가 포함된다. 돌연변이형 yggB 유전자를 보유하고 저하된 α-KGDH 활성을 갖는 코리네형 세균을 사용하는 경우, α-KGDH 활성을 먼저 저하시키거나 또는 돌연변이형 yggB 유전자를 먼저 도입시킬 수 있다.
<2> L-글루탐산 생산 방법
배지 및/또는 세균 세포내에 L-글루탐산이 축적되도록 본 발명의 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 배지 및/또는 세균 세포로부터 L-글루탐산을 수거하여 L-글루탐산을 생산할 수 있다. 본 발명의 생산 방법에서, 바람직하게는 본 발명의 코리네형 세균을, 예를 들면 25 내지 40℃에서 8 내지 120시간 동안 배양하여 L-글루탐산을 생산한다.
배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기 염, 및 임의로 아미노산 및 비타민과 같은 유기 미량영양소를 함유하는 통상적인 배지일 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지가 사용될 수 있다. 배양되는 균주에 의해 사용될 수 있는 한 어떠한 종류의 탄소원 및 질소원이라도 사용할 수 있다.
글루코즈, 글리세롤, 프럭토즈, 슈크로즈, 말토즈, 만노즈, 갈락토즈, 전분 가수분해물, 및 당밀과 같은 당류가 탄소원으로 사용될 수 있다. 또한, 아세트산, 시트르산과 같은 유기산 및 에탄올과 같은 알코올도 단독으로 또한 함께 탄소원으로서 사용될 수 있다. 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 암모늄 아세테이트, 니트레이트 등과 같은 암모니아, 암모늄 염이 질소원으로서 사용될 수 있다. 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 펩톤 함유 물질, 카사미노산, 효모 추출물 및 대두 단백질 분해 산물이 유기 영양소로서 소량으로 사용될 수 있다. 성장을 위해 아미노산 등이 필요한 영양요구성 돌연변이 균주가 사용되는 경우, 당해 필요한 영양분을 부가하는 것이 바람직하다. 인산염, 마그네슘 염, 칼슘 염, 철 염, 망간 염 등이 무기 염으로서 사용될 수 있다.
배양될 균주에 따라 Tween40과 같은 계면활성제, 페니실린, 또는 비오틴을 적당량 첨가할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주를, 계면활성제 또는 페니실린을 함유하는 L-글루탐산 생산 조건 또는 비오틴이 제한된 조건에서 배양할 수도 있지만, 과량의 비오틴의 존재하에서 배양할 수 있다.
바람직하게는, 발효 온도를 조절하고 배양 배지의 pH를 3 내지 9로 조정하여 호기적 배양을 수행한다. 배양하는 동안에 pH가 낮아지는 경우, 탄산칼슘 또는 암모니아 가스와 같은 알칼리를 부가하여 배지를 중화시킨다. 약 10 내지 약 120시간 동안 배양하면 상당한 양의 L-글루탐산이 배지에 축적된다.
또한, 생산된 L-글루탐산이 결정화하고 침전하는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여 배양할 수 있다. L-글루탐산이 결정화하는 조건에는 pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0이 포함된다(EP1233069, EP1233070).
배양 완료 후에 배지로부터 통상적인 방법으로 L-글루탐산을 수거할 수 있다. L-글루탐산은, 예를 들면 배지로부터 세균 세포를 제거하고 L-글루탐산을 농축시키거나, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수거할 수 있다. L-글루탐산이 결정화하고 침전하는 조건하에서 배양하는 경우, 결정화된 L-글루탐산은, 예를 들면 원심분리 또는 여과에 의해 수거할 수 있다. 이 경우, 배지에 용해된 L-글루탐산은 용해된 L-글루탐산이 결정화된 후에 수거할 수도 있다.
이하, 하기 비제한적 실시예를 참조로 하여 본 발명을 구체적으로 설명할 것이다.
실시예 1
<유전자 파괴를 위한 sacB 유전자를 보유하는 벡터의 작제>
(1-1) pBS3의 작제
국제 공보 제WO2005/113745호 및 국제 공보 제WO2005/113744호의 방법을 사용함으로써 sacB 유전자를 보유하는 유전자 파괴 벡터를 작제하였다. 주형으로서 바실러스 섭틸리스의 염색체 DNA 및 프라이머로서 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해 sacB 유전자(서열번호 11)를 수득하였다. LA taq(구입원: TaKaRa)을 이용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다: 94℃에서 5분 동안의 보온의 1회 사이클; 및 94℃에서 30초 동안의 변성, 49℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 신장의 25회 사이클. 수득된 PCR 산물을 통상적인 방법으로 정제하고, 이어서 BglII 및 BamHI으로 분해시키고 평활말단화시켰다. AvaII로 분해되어 평활말단화된 pHSG299에 당해 단편을 삽입하였다. 수득된 DNA를 사용하여 에스케리키아 콜라이 JM109(구입원: TAKARA BIO INC.)의 컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml의 카나마이신(이하, "Km"으로 약칭됨)을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후에, 형질전환체로서 하나의 콜로니를 분리하였다. 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하고, 목적 PCR 산물이 삽입된 플라스미드를 pBS3이라 명명하였다. 도 1에 pBS3의 작제 공정이 도시되어 있다.
(1-2) pBS4S의 작제
SmaI 엔도뉴클레아제에 의해 pBS3가 절단되지 않도록, 아미노산 치환은 야기하지 않으면서 교차 PCR을 사용하여, pBS3 상의 카나마이신-내성 유전자 내의 SmaI 인식 부위를 뉴클레오타이드 치환에 의해 변형시켰다. 먼저, 주형으로서 pBS3 및 프라이머로서 서열번호 15 및 16의 합성 DNA를 사용한 PCR을 수행하여 카나마이신- 내성 유전자의 N-말단 단편을 수득하였다. 한편, 카나마이신-내성 유전자의 C-말단 단편을 수득하기 위해서 주형으로서 pBS3 및 프라이머로서 서열번호 17 및 18의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. Pyrobest DNA 폴리머라제(구입원: TAKARA BIO INC.)를 이용하여 다음과 같이 PCR을 수행하여 목적 PCR 산물을 수득하였다: 98℃에서 5분 동안의 보온의 1회 사이클; 및 98℃에서 10초 동안의 변성, 57℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1분 동안의 신장의 25회 사이클. 서열번호 16 및 17은 서로 부분적으로 상보적이고 SmaI 인식 부위를 포함하지 않는다. 이어서, SmaI 인식 부위가 없는 돌연변이 카나마이신-내성 유전자의 전체길이 단편을 수득하기 위해, 상기한 N-말단 및 C-말단 유전자 산물을 실질적인 등몰량으로 혼합하였다. SmaI 부위가 변형된 카나마이신-내성 유전자 단편을 수득하기 위해서, 주형으로서 유전자 산물 및 프라이머로서 서열번호 15 및 18의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. Pyrobest DNA 폴리머라제(구입원: TAKARA BIO INC.)를 이용하여 다음과 같이 PCR을 수행하여 목적 PCR 산물을 수득하였다: 98℃에서 5분 동안의 보온의 1회 사이클; 및 98℃에서 10초 동안의 변성, 57℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1.5분 동안의 신장의 25회 사이클.
PCR 산물을 통상적인 방법으로 정제하고, 이어서 BanII로 분해시키고 상기한 pBS3의 BanII 인식 부위내로 삽입시켰다. 수득된 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이 JM109의 컴피턴트 세포(구입원: TaKaRa Bio)를 형질전환시켰다. 즉, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 출현한 콜로니를 형질전환체로서 선별하였다. 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 목적 PCR 산물이 삽입된 플라스미드를 pBS4S라 명명하였다. 도 2에 pBS4S의 작제 공정이 도시되어 있다.
실시예 2
<씨. 글루타미컴 ATCC13869 균주로부터 odhA 유전자-파괴된 균주의 작제>
코리네형 세균의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이미 동정되었다[참조: Microbiology 142, 3347-3354, (1996), GenBank 승인번호 D84102]. odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여, 서열번호 1 및 2에 기술된 프라이머를 고안하였고, odhA 유전자의 내부서열을 증폭시키기 위해 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 단편을 BamHI으로 완전히 분해시키고, 실시예 1에서 작제된 pBS4S의 BamHI 부위로 삽입시켜 pBS4S△sucAint 플라스미드를 수득하였다(도 3).
전기 펄스 방법(JP-A-02-207791)에 의해 pBS4S△sucAint를 씨. 글루타미컴 ATCC13869 균주내로 도입시키고, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 한천 배지(5g/l 글루코즈, 10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 3g/l 우레아, 1.2g/l 대두 단백질 가수분해물, 및 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정함: 120℃에서 20분간 고압증기멸균함)에 도말하였다. 31.5℃에서 배양한 후, 출현한 균주로부터 추출한 각각의 염색체를 사용한 PCR을 수행하여, 이러한 균주가 상동성 재조합에 의해 염색체내로 pBS4S△sucAint가 혼입된 단일교차 재조 합체임을 확인하였다. 각각 pBS4S 플라스미드에 특이적인 서열(서열번호 3) 및 염색체상의 서열에 상보적인 서열(서열번호 4)을 갖는 프라이머를 PCR에 사용하였다. 단일 단편이 단일교차 재조합체로부터 증폭되는 반면에, 비재조합체 균주에는 pBS4S의 서열이 없기 때문에 비재조합체 균주로부터는 단편이 증폭되지 않는다.
이렇게 수득된 단일교차 재조합체를 2A-1 균주라 명명하였다. 야생형 13869 균주 및 2A-1 균주를 20ml의 플라스크 배지(30g/l 글루코즈, 15g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1(비타민 B1), 300㎍/l 비오틴, 및 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N: 총 질소), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 1g의 열-멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 각각의 균주를 31.5℃에서 진탕하면서 배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지에 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 결과는 표 1에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 과량의 비오틴의 존재하에서 모균주 ATCC 13869는 L-글루탐산을 전혀 생산하지 못한 반면에, 2A-1 균주는 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00001
실시예 3
<2A-1 균주로부터 odhA 유전자-복귀돌연변이 균주의 작제>
2A-1 균주에서, pBS4S△sucAint에 의해 염색체상의 odhA 유전자를 파괴하였다. 이 균주의 염색체로부터 플라스미드를 제거함으로써 odhA 유전자를 야생형 유전자로 복귀시킬 수 있었다. odhA 유전자-파괴된 균주는 당을 함유하지 않는 배지에서 매우 느리게 성장하지만, odhA 유전자가 야생형 유전자로 복귀된 odhA 유전자-복귀돌연변이 균주는 CM2B(10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 10㎍/l 비오틴, 20g/l 한천, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)와 같이 당을 함유하지 않는 배지에서 잘 성장한다. 이러한 복귀돌연변이 균주를 수득하기 위해서, 2A-1 균주를 CM2B 한천 배지에 도말하여 성장이 개선된 균주를 선별하였다. 출현한 성장이 개선된 균주를 2A-1R이라 명명하였고, CM2B 한천 배지상에 분리하였으며, 2A-1R 균주의 카나마이신-민감성을 검사하였다. 그 결과, 선별된 모든 균주가 카나마이신-민감성 및 슈크로즈-내성임이 밝혀졌다. pBS4S△sucAint는 카나마이신-내성 유전자 및 레반 슈크라제를 암호화하는 sacB 유전자를 포함하기 때문에, pBS4S△sucAint를 보유한 균주는 카나마이신-내성 및 슈크로즈-민감성을 나타내는 반면에, pBS4S△sucAint가 제거된 균주는 카나마이신-민감성 및 슈크로즈-내성을 나타낸다. 따라서, 2A-1R 균주내의 odhA 유전자가 야생형 유전자로 복귀된 것으로 생각된다. odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 균주가 야생형 odhA 유전자를 보유함을 확인하였다.
과량의 비오틴의 존재하에서 2A-1R 균주가 L-글루탐산을 생산하는 능력을 실시예 2와 같은 방법에 의해 확인하였다. 결과는 표 2에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 2A-1R 균주에 의한 L-글루탐산의 축적은 2A-1 균주와 비교하여 약간 감소하였지만, 과량의 비오틴의 존재하에서 2A-1R 균주는 야생형 ATCC13869 균주보다 더 많은 L-글루탐산을 생산하였다(표 2). 또한, 당이 완전히 소비된 후 진탕배양을 계속한 경우에, L-글루탐산의 분해가 관찰되어, 이 균주에서 odhA 유전자가 야생형으로 복귀되었음이 입증되었다(도 4).
Figure 112007055114007-PCT00002
실시예 4
<2A-1R 균주의 L-글루탐산 생산에 관여하는 유전자의 분리>
CM2B 한천 배지상에서, 2A-1R 균주는 야생형 균주 ATCC13869와 실질적으로 동일한 비율로 콜로니를 형성할 수 있었다. 그러나 최소 플레이트 배지(20g/l 글루코즈, 2.64g/l 황산암모늄, 0.5g/l KH2PO4, 0.5g/l K2HPO4, 0.25g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·7H2O, 0.01g/l CaCl2, 0.02mg/l CuSO4, 40g/l MOPS, 30mg/l 프로토카테쿠산, 200㎍/l VB1·Hu, 300㎍/l 비오틴, 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 6.7로 조정함)상에서, 2A-1R 균주는 야생형 ATCC13869 균주와 비교하여 상당히 감소된 콜로니 형성 비율을 나타내었다. 따라서, 최소 배지에서 2A-1R 균주의 성장을 회복시킬 수 있는 유전자를 밝혔다.
ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 Sau3AI으로 부분적으로 분해시키고, BamHI으로 분해된 pVK9 셔틀벡터에 연결시켰다. 수득된 플라스미드를 에탄올로 침전시키고, 전기 펄스 방법에 의해 이. 콜라이 DH5α(TAKARA BIO INC.)의 컴피턴트 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. pVK9은, pHSG299(TAKARA BIO INC.)의 AvaII 부위를 평활말단화시키고, 코리네형 세균에서 자발적으로 복제할 수 있는 서열을 포함하는, pHK4(JP-A-05-007491)로부터 BamHI 및 KpnI으로 절단된 단편을 삽입시킴으로써 수득된 셔틀벡터이다. 형질전환된 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지(10g/l 폴리펩톤, 5g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날에, 출현한 모든 콜로니를 백금이로 플레이트로부터 수거하고, ATCC13869 균주의 플라스미드 라이브러리를 작제하기 위해 플라스미드를 추출하였다. 플라스미드 라이브러리를 실시예 3에서 수득된 2A-1R 균주로 전기 펄스 방법에 의해 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 최소 한천 배지에 적용시켰다. 콜로니 형성 비율의 증가를 나타내는 균주를 선별하였다. 콜로니 형성 비율의 증가를 나타내는 선별된 균주로부터 플라스미드를 추출함으로써, 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단편이 pVK9의 BamHI 부위내로 삽입되었음이 밝혀졌다. 수득된 플라스미드를 pL5k라 명명하였다.
pL5k에 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 이미 보고된 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032(승인번호 NC_003450)의 게놈 서열과 비교하여, pL5k가 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 1개의 ORF만을 보유함이 나타났다.
ORF가 막단백질을 암호화하는지의 여부를 예측하기 위해 인터넷상에서 입수할 수 있는 "SOSUI" 프로그램(sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html, 2004년10월7일 현재)을 사용하였다. "SOSUI"를 이용한 ORF의 분석 결과는 이 아미노산 서열에 5개의 막관통 영역이 존재함을 시사하였다. 서열번호 6의 아미노산 서열에서, 막관통 영역은 아미노산 1번 내지 23번, 아미노산 25번 내지 47번, 아미노산 62번 내지 84번, 아미노산 86번 내지 108번, 및 아미노산 110번 내지 132번에 상응한다. 이러한 영역을 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 1505번, 뉴클레오타이드 1509번 내지 1577번, 뉴클레오타이드 1620번 내지 1688번, 뉴클레오타이드 1692번 내지 1760번, 및 뉴클레오타이드 1764번 내지 1832번에 상응한다. 이러한 영역의 각각의 아미노산 서열은 서열번호 25 내지 29 및 표 3에 제시되어 있다.
Figure 112007055114007-PCT00003
추가적인 문헌의 검색에서, 상기 ORF를 YggB (NCgl1221)라 명명하는 것으로 나타났다[참조: FEMS Microbiology letters 218(2003) 305-309].
실시예 5
<2A-1R 균주의 yggB 유전자내로 도입된 돌연변이의 동정>
yggB 유전자는 최소 배지에서 2A-1R 균주의 성장을 회복시킬 수 있었고, 이는 2A-1R 균주의 yggB 유전자에 어떤 돌연변이가 있을 가능성을 시사하였다. 따라서, 2A-1R 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 그 결과, 2A-1R 균주에서 야생형 yggB 유전자의 C-말단 영액내로 IS가 삽입된 것으로 나타났다(도 5). 2A-1R 균주로부터 유래한 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7에 제시되어 있고, 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다.
이는 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 2A-1R 균주의 능력이 yggB 유전자내의 돌연변이 때문이었을 가능성을 시사하였다. 이 돌연변이는 2A-1R 균주뿐만 아니라 2A-1 균주에도 존재했음을 유의해야 한다. 이 돌연변이는, odhA 유전자가 파괴된 경우, L-글루탐산을 세포로부터 안정하게 분비하기 위한 서프레서 돌연변이로서 발생한 것으로 예상된다. IS가 삽입된 돌연변이를 2A-1형 돌연변이라 명명하였다.
실시예 6
<2A-1형 돌연변이 yggB 유전자를 보유한 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
(6-1) 야생형 균주내로의 2A-1형 돌연변이의 도입 및 L-글루탐산 생산능의 평가 (단일교차 재조합체)
2A-1형 돌연변이를 갖는 yggB 유전자의 단편을 증폭시키기 위해 주형으로서 2A-1 균주의 염색체 DNA 및 프라이머로서 서열번호 9 및 10에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 산물을 SacI으로 처리하고 실시예 1에서 수득된 pBS3의 SacI 부위내로 삽입시켜 2A-1형 돌연변이 yggB 유전자를 보유한 플라스미드를 수득하였다(pBS3yggB2A).
수득된 pBS3yggB2A를 전기 펄스 방법에 의해 씨. 글루타미컴 ATCC13869내로 도입시키고, 형질전환된 세포를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 한천 배지에 도말하였다. 31.5℃에서 배양한 후 출현한 균주를 PCR로 평가하여, 상동성 재조합에 의해 염색체내로 pBS3yggB2A가 혼입된 단일교차 재조합체임을 확인하였다. 수득된 단일교차 재조합체를 13869-2A라 명명하였다. 이 균주에는, 야생형 yggB 유전자 및 돌연변이형 yggB 유전자가 둘다 존재하고 발현된다.
수득된 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주 13869-2A가 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 능력은 실시예 2에 기술된 방법에 의해 평가하였다. 결과는 표 4에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 과량의 비오틴의 존재하에서 야생형 ATCC13869 균주가 L-글루탐산을 생산할 수 없을 때 13869-2A 균주는 L-글루탐산을 생산하였다. 이는 yggB 유전자내의 돌연변이가 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산 생산을 향상시킬 수 있음을 나타내었다.
Figure 112007055114007-PCT00004
(6-2) 야생형 균주내로의 2A-1형 돌연변이 yggB 유전자의 도입 및 L-글루탐산 생산능의 평가 (이중교차 재조합체)
돌연변이형 yggB 유전자만을 보유한 균주를 작제하기 위해서, 13869-2A 균주를 CM-Dex 액체 배지에서 하룻밤 동안 배양하고, 수득된 배양물을 S10 한천 배지(100g/l 슈크로즈, 10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 3g/l 우레아, 1.2g/l 대두 단백질 가수분해물, 20g/l 한천, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조정함: 120℃에서 20분간 고압증기멸균함)에 도말하고 31.5℃에서 배양하였다. 출현한 콜로니 가운데, 카나마이신에 대한 민감성을 나타내는 균주를 CM2B 한천 배지상에 분리하였다. 염색체 DNA를 균주로부터 제조하였다. 이어서, 균주가 돌연변이형 yggB 유전자만을 보유함을 확인하기 위해 프라이머로서 서열번호 9 및 10에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. IS와 유사한 서열이 삽입된 돌연변이형 yggB 유전자를 보유한 균주를 13869-2A-7이라 명명하였다.
수득된 13869-2A-7 균주가 과량의 비오틴의 존재하에서 L-글루탐산을 생산하는 능력은 실시예 2에 기술된 방법에 의해 평가하였다. 결과는 표 5에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). 13869-2A-7 균주는 2A-1R 균주와 동등한 또는 보다 더 많은 L-글루탐산을 생산하여, 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산은 yggB 유전자내의 돌연변이에 의해 야기되었음이 확인되었다.
Figure 112007055114007-PCT00005
실시예 7
<A1형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
L-글루탐산을 생산하는 상기한 odhA 유전자-파괴된 균주(△sucA 균주)를 이용하여 스크리닝한 결과, 상기한 2A-1 돌연변이 외에도 yggB 유전자상에 다섯 종류의 돌연변이가 동정되었다. 이하, 이러한 돌연변이를 Al형 돌연변이, 19형 돌연변이, L30형 돌연변이, 8형 돌연변이, 및 66형 돌연변이라 명명하였다. 각각의 A1형 돌연변이, 19형 돌연변이, 및 L30형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자를 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 각 돌연변이의 영향을 평가하였다. 8형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자를 ATCC14067 균주의 염색체내로 도입시키고, 돌연변이의 영향을 평가하였다. 66형 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자를 씨. 멜라세콜라 ATCC17965 균주의 염색체내로 도입시키고, 돌연변이의 영향을 평가하였다.
A1형 돌연변이는 야생형 yggB 유전자(씨. 글루타미컴의 야생형 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 제시되어 있다)의 1480번 위치의 "G" 다음에 "TTCATTGTG"를 삽입시키는 돌연변이이며, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 14번 위치의 Leu 및 15번 위치의 Trp 사이에 CysSerLeu의 삽입을 야기한다. 이러한 돌연변이가 도입된 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB의 아미노산 서열은 서열번호 20에 제시되어 있다.
다음과 같이 A1형 돌연변이 유전자를 수득할 수 있다. N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 31에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 32 및 33에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, A1형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 돌연변이형 yggB 유전자 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggBA1을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 플라스미드 부분만을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, A1형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별한다. A1형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC13869-A1 균주라 명명하였다.
ATCC13869-A1 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 공지된 방법에 의해 측정하였다. A1형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주는 과량의 비오틴의 존재하에서 대조군 균주와 비교하여 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00006
실시예 8
<19형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
19형 돌연변이는 야생형 yggB 유전자(씨. 글루타미컴의 야생형 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 제시되어 있다)의 1734번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 100번 위치의 Ala을 Thr으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 21에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, 19형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제한다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 35에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 33 및 36에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, 19형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 yggB 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggB19를 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 19형 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별한다. 19형 돌연변이 균주를 ATCC13869-19 균주라 명명하였다.
ATCC13869-19 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 액체배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 통상적인 방법에 의해 측정하였다. 19형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주는 과량의 비오틴의 존재하에서 대조군 균주와 비교하여 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00007
실시예 9
<L30형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
L30형 돌연변이는 야생형 yggB 유전자(씨. 글루타미컴의 야생형 유전자는 서열번호 5에 제시되어 있다)의 1768번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열에서 111번 위치의 Ala을 Val으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, L30형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제하였다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 37에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 34 및 38에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, L30형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 yggB 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득하였다. 이렇게 수득된 pBS4yggB-L을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거하였다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, L30형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별하였다. L30형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC13869-L30 균주라 명명하였다.
ATCC13869-L30 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 액체배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 통상적인 방법에 의해 측정하였다. 결과는 표 8에 제시되어 있다(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, Glu(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다). L30형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 ATCC13869-L30 균주는 ATCC13869 모균주와 비교하여 더 많은 양의 L-글루탐산의 축적을 야기하였다.
Figure 112007055114007-PCT00008
실시예 10
<L-글루탐산 생산 조건하에서 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 평가>
코리네형 세균의 L-글루탐산 생산은 Tween40과 같은 계면활성제의 부가 또는 비오틴 농도의 제한에 의해 유도된다. 따라서, Tween40을 함유하는 조건 및 제한된 양의 비오틴을 함유하는 조건하에서 각각 ATCC13869 균주 및 ATCC13869-19 균주를 배양하였다.
각각의 균주를 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후에 수득된 배양 용액은 다음의 본배양에서 종균배양 용액으로서 사용하였다.
Tween40이 부가된 배양을 하기 위해서, 2ml의 종균배양 용액을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 101배로 희석된 배양 액체배지의 OD620이 0.2에 도달했을 때, Tween40을 부가하여 최종농도가 5g/L가 되게 하고 배양을 계속하였다.
비오틴이 제한된 배양을 하기 위해서, 1ml의 종균배양 용액을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 이러한 배양 조건하에서, 비오틴의 최종농도는 약 2.9㎍/L로 계산된다.
40시간 배양한 후, Tween40이 부가된 배양 및 비오틴이 제한된 배양에 대해 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 측정하였다. 결과는 표 9에 제시되어 있다. ATCC13869-19 균주는 L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 대조군 균주보다 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00009
야생형 ATCC13869 균주, yggB 돌연변이 균주 ATCC13869-19, ATCC13869-A1, ATCC13869-L30, 및 야생형 yggB 유전자를 보유한 플라스미드를 갖는 균주(ATCC13869/pL5k-1), 및 대조군 플라스미드를 갖는 균주(ATCC13869/pVK9)를 Tween40을 부가하여 배양하였다. 이러한 각각의 균주를 CM-Dex 플레이트 배지상에서 하룻밤 동안 배양하고, 플레이트 면적의 1/6에서 수거한 세포를 20ml의 플라스크 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 및 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N: 총 질소), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 1g의 열-멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 각각의 균주를 31.5℃에서 진탕하면서 배양하였다. 5시간 배양한 후, Tween40을 부가하여 최종농도가 1g/L가 되게 하고 배양을 계속하였다. 24시간 후의 세포의 양(OD620) 및 배지에 축적된 L-글루탐산의 양은 표 10에 제시되어 있다. L-글루탐산을 생산하는 조건하에서 ATCC13869-19 균주, ATCC13869-A1 균주, ATCC13869-L30 균주, 및 야생형 yggB 유전자를 보유한 플라스미드를 갖는 균주는 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00010
실시예 11
<8형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
8형 돌연변이는 서열번호 61의 837번 위치의 "G"를 "A"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 62의 아미노산 서열에서 111번 위치의 Ala을 Thr으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 63의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 64에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, 8형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제한다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 65에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 34 및 66에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, 8형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 yggB 유전자 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggB8을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC14067 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 8형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별하였다. 8형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC14067-yggB8 균주라 명명하였다.
실시예 12
<66형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주의 작제 및 L-글루탐산 생산능의 평가>
66형 돌연변이는 서열번호 67의 1673번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이이며, 서열번호 68의 아미노산 서열에서 424번 위치의 Pro을 Leu으로 치환시킨다. 이 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 69에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 70에 제시되어 있다.
실시예 7과 같은 방법으로, 66형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 작제한다. 구체적으로는, N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 30 및 71에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 씨. 멜라세콜라 ATCC17965 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 34 및 72에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 이어서, 66형 돌연변이 yggB 유전자의 부분적 단편을 증폭시키기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 34에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행한다. 수득된 yggB 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 이 유형의 돌연변이 도입을 위한 플라스미드를 수득한다. 이렇게 수득된 pBS4yggB66을 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC17965 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거한다. 수득된 카나마이신-민감성 균주의 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 66형 돌연변이 yggB 유전자를 갖는 균주를 선별하였다. 66형 돌연변이 yggB 유전자-도입된 균주를 ATCC17965-yggB66 균주라 명명한다.
실시예 13
<시험관내 돌연변이에 의한 돌연변이형 yggB 유전자의 스크리닝>
돌연변이형 yggB 유전자는, 시험관내에서 무작위 돌연변이를 야생형 yggB 유전자내로 도입시키고, 돌연변이-도입된 yggB 유전자로 코리네형 세균을 형질전환시키고, 과량의 비오틴의 존재하에서 계면활성제 또는 페니실린의 부가 없이 L-글루탐산을 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 선별함으로써 수득할 수 있다.
(13-1) yggB 유전자-파괴된 균주의 작제
돌연변이형 yggB 유전자를 스크리닝하기 위해서, 먼저 yggB 유전자-파괴된 균주를 작제하였다. N-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 39 및 40에 제시된 합성 DNA 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 유사하게, C-말단 단편을 제조하기 위해서, 프라이머로서 서열번호 41 및 42에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 서열번호 40 및 서열번호 41은 서로 상보적이다. 이어서, ORF가 결실된 yggB 유전자를 갖는 단편을 수득하기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 39 및 42에 제시된 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다.
수득된 PCR 단편을 SacI으로 처리하고 pBS4S의 SacI 부위내로 삽입시켜 yggB 유전자 파괴에 유용한 플라스미드를 수득하였다. 이렇게 수득된 pBS4△yggB를 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 ATCC13869 균주의 염색체내로 도입시키고, 이어서 염색체로부터 벡터 부분을 제거하였다. 주형으로서 수득된 카나마이신-민감성 균주의 염색체 DNA 및 프라이머로서 서열번호 39 및 42의 합성 DNA를 사용한 PCR을 수행하여 yggB 유전자가 파괴되었음을 확인하였다. 수득된 yggB-파괴된 균주를 ATCC13869△yggB 균주라 명명하였다.
(13-2) 돌연변이형 yggB 유전자의 시험관내 스크리닝
다음과 같이 yggB 유전자의 돌연변이유발을 수행하였다. 먼저, 상기한 pL5k 플라스미드를 XhoI 및 SalI으로 처리하고 자가-연결시켜 yggB 유전자 이외의 영역을 제거함으로써 pL5kXS 플라스미드를 수득하였다. SalI 인식 부위는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열상에는 존재하지 않고, pBS3의 다중-클로닝 부위상에는 존재한다. 수득된 pL5kXS의 약 10㎍을, 400mM 하이드록실아민 및 1mM EDTA (pH 6.0)를 함유하는 500mM 인산염 완충액에 용해시키고, 돌연변이를 도입시키기 위해서 75℃에서 30 내지 90분 동안 가열하였다. 돌연변이유발 처리 후 SUPREC-02 (구입원: TAKARA BIO INC.)를 이용하여 플라스미드를 탈염시키고, 이어서 실시예 6에 기술된 방법에 의해 ATCC13869△yggB 균주내로 도입시켰다. 형질전환된 세포를 25㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 CM2B 배지에서 스크리닝하였다. 대조군으로서, 돌연변이유발 처리를 하지 않은 pL5kXS를 ATCC13869△yggB 균주내로 도입시켰다. 출현한 형질전환체를 2m의 CM2BGU2 액체 배지(추가로 10g/l 글루코즈 및 15g/l 우레아를 함유하는 실시예 3에 기술된 CM2B 배지)에 접종하고, 31.5℃에서 5시간 동안 진탕하면서 배양하고, 배양 액체배지에 축적된 L-글루탐산의 농도를 측정한다.
CM2BGU2 배지에서 돌연변이된 pL5kXS로 ATCC13869△yggB 균주를 형질전환시켜 수득된 균주의 배양 결과는 표 11에 제시되어 있다. 60 또는 90분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시킨 형질전환체 가운데 1g/L 이상의 L-글루탐산의 축적을 야기하는 세 균주를 수득하였다. 초기 배지에 함유된 L-글루탐산의 양은 0.16g/L이고, ATCC13869△yggB/pL5kXS 대조군 균주(돌연변이유발 처리를 하지 않은)에 의해 축적된 L-글루탐산의 양은 0.31g/L였다.
CM2BGU 배지에서 돌연변이된 pL5kXS로 ATCC13869△yggB 균주를 형질전환시켜 수득된 형질전환체의 배양 결과는 표 12에 제시되어 있으며, CM2BGU 배지는 우레아의 농도가 1.5g/L인 것을 제외하고 상기한 CM2BGU2 배지와 조성이 같다. 90분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시킨 형질전환체 가운데 1g/L 이상의 L-글루탐산의 축적을 야기하는 1개의 클론을 수득하였다.
Figure 112007055114007-PCT00011
Figure 112007055114007-PCT00012
60분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시켜 1g/L 이상의 L-글루탐산을 생산한 표 11에 제시된 균주에서 플라스미드를 추출하고, 수득된 플라스미드를 pL5kXSm-22라 명명하였다. 60분 동안 돌연변이시킨 플라스미드로 형질전환시켜 0.9g/L 이상의 L-글루탐산을 생산한 표 12에 제시된 균주에서도 플라스미드를 추출하고, 수득된 플라스미드를 pL5kXSm-27이라 명명하였다. 플라스미드로 ATCC13869 균주를 형질전환시키고, 수득된 균주를 각각 ATCC13869△yggB/pL5kXS 및 ATCC13869△yggB/pL5kXSm-27, ATCC13869△yggB/pL5kXSm-22라 명명하였다. 이러한 균주를 실시예 2에 기술된 조건하에서 배양하고, 4시간 배양한 후 L-글루탐산 축적을 분석하였다. 3개의 독립적인 실험의 평균값은 표 13에 제시되어 있다. ATCC13869△yggB/pL5kXSm-27 균주 및 ATCC13869△yggB/pL5kXSm-22 균주는 비돌연변이된 플라스미드-도입된 균주보다 상당히 더 많은 양의 L-글루탐산을 생산한 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 본 발명의 돌연변이형 yggB 유전자를 시험관내 무작위 돌연변이유발에 의해 수득할 수 있음을 증명한다. pL5kXSm-22에 포함된 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 73 및 75에 각각 제시되어 있다. pL5kXSm-22 플라스미드는 서열번호 5의 2745번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키고 서열번호 6의 437번 위치의 Pro을 Ser으로 치환시키는 돌연변이를 갖는다. 또한, 이 돌연변이는 서열번호 5의 3060번 위치의 "C"를 "T"로 치환시키는 돌연변이(22형 돌연변이)를 동반하였다. 이 돌연변이를 갖는 돌연변이형 yggB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 73에 제시되어 있고 이 유전자에 의해 암호화된 돌연변이형 YggB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 74에 제시되어 있다.
Figure 112007055114007-PCT00013
(13-3) 코리네형 세균내로의 돌연변이형 yggB 유전자의 도입 및 L-글루탐산 생산량의 평가
코리네형 세균내로 (13-2)에서 수득된 돌연변이형 yggB 유전자를 도입시킨다. 유전자를 도입시키는 방법은 다음과 같다.
각각의 돌연변이형 yggB 유전자를 실시예 6에 기술된 방법에 의해 pBS4S내로 도입시키고, 수득된 플라스미드를 사용하여 염색체상의 야생형 yggB 유전자가 돌연변이형 yggB 유전자로 대체된 균주를 수득한다. 돌연변이형 yggB 유전자가 도입된 균주 및 ATCC13869 대조군 균주를 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 배양 완료 후에 배양 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 공지된 방법에 의해 측정하여 돌연변이형 yggB 유전자의 도입으로 L-글루탐산의 축적이 증가함을 확인한다. 이러한 방법으로, L-글루탐산 생산능이 향상된 돌연변이형 yggB 유전자가 도입된 균주를 갖는 균주를 수득할 수 있다.
실시예 14
<돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주의 L-글루탐산 유사체-내성의 평가>
(14-1) 고체 배지상에서 4-플루오로글루탐산에 대한 내성의 평가
돌연변이형 yggB 유전자의 도입으로 인해 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는 균주는 L-글루탐산 유사체에 대한 민감성이 감소(내성이 증가)할 것이라고 예측하였다. 따라서, 4-플루오로글루탐산에 대한 균주의 민감성을 다음과 같이 분석하였다.
NaOH를 사용하여 pH 6.7로 조정하고 여과멸균한 4-플루오로글루탐산 용액을 실시예 4에 기술한 최소 배지에 부가하여 4-플루오로글루탐산의 최종농도가 7.5mM이 되게 하였다. 각각의 ATCC13869 균주, ATCC13869-L30 균주, 및 ATCC13869-A1 균주를 CM-Dex 플레이트에 도말하고 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트로부터 세포를 수거하고 멸균된 0.85% NaCl 용액으로 세척하였으며, 도 6에 기술된 세포 농도로 희석시키고, 4-플루오로글루탐산을 함유하는 플레이트 및 4-플루오로글루탐산을 함유하지 않은 대조군 플레이트에 접종하고, 31.5℃에서 배양하였다. 시간 경과에 따른 각 균주의 성장은 도 6에 도시되어 있다. 4-플루오로글루탐산이 없을 때 야생형 ATCC13869 균주는 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주보다 빠르게 성장하지만, 4-플루오로글루탐산의 존재하에서는 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주가 야생형 ATCC13869 균주보다 빠르게 성장한다.
(14-2) 액체 배지에서 4-플루오로글루탐산에 대한 내성의 평가
실시예 4에 기술한 것과 동일한 조성을 갖지만 한천을 함유하지 않는 최소 액체 배지에 4-플루오로글루탐산을 부가하여 최종농도가 각각 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM, 및 20mM이 되게 하였다. 각각의 ATCC13869 균주, ATCC13869△yggB 균주, ATCC13869-L30 균주, 및 ATCC13869-A1 균주를 CM-Dex 플레이트에 도말하고 31.5℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고 멸균된 0.85% NaCl 용액으로 세척한 후에, 액체 배지에 접종하고 31.5℃에서 진탕하면서 배양하였다. 4-플루오로글루탐산 없이 배양된 각 균주의 OD660이 1.0에 도달했을 때, 배양을 종료하고 수득된 배양 용액을 적절하게 희석하여 하룻밤 동안 CM-Dex 플레이트에 도말하였다. 출현한 콜로니의 수를 계산하고 생존성 세포 수라 명명하였다. 도 7은 4-플루오로글루탐산이 없을 때 배양된 세포의 수를 1이라고 했을 때, 각 4-플루오로글루탐산 농도에서의 상대적인 세포 수를 도시한 것이다.
ATCC13869-A1 균주 및 ATCC13869-L30 균주는 4-플루오로글루탐산에 대한 민감성이 저하된 것으로 밝혀졌다.
이러한 결과는 4-플루오로글루탐산과 같은 L-글루탐산 유사체를 사용하여 스크리닝함으로써 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 균주를 수득할 수 있음을 또한 보여주었다.
실시예 15
<yggB 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주의 작제>
돌연변이형 odhA 유전자를 상기한 ATCC13869-L30 균주내로 도입시킴으로써 yggB 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주를 제조하였다.
먼저, 표 14에 제시된 각 돌연변이를 ATCC13869-L30 균주의 염색체상에 있는 α-KGDH의 E1o 서브유닛을 암호화하는 odhA 유전자내로 도입시켰다. 표 14에, 각각의 돌연변이형 odhA 유전자에서 서열번호 43의 뉴클레오타이드 2528번 내지 2562번에 상응하는 영역의 뉴클레오타이드 서열이 제시되어 있다. 표 15에, 돌연변이형 odhA 유전자에 의해 암호화된 각각의 아미노산 서열에서 서열번호 44의 아미노산 696번 내지 707번에 상응하는 영역의 아미노산 서열이 제시되어 있다.
서열번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 odhA 유전자가 도입된 L30sucA8 균주를 다음과 같이 수득할 수 있다. 서열번호 53 및 54의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 돌연변이 odhA 유전자 단편을 제조한다. 수득된 단편을 BamHI으로 분해시키고 Mutan-Super Express Km(Takara Bio)에 부착된 플라스미드 pKF19m의 BamHI 부위에 연결시킨다. 이어서, 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 55의 프라이머 및 Mutan-Super Express Km의 선별 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 수득된 PCR 산물을 사용하여 MV1184 균주와 같은 sup0-이. 콜라이 균주를 형질전환시켜 돌연변이 odhA 단편을 보유하는 플라스미드를 수득한다. 이 단편을 pBS4S 플라스미드내로 삽입시키고 수득된 플라스미드를 사용하여 ATCC13869-L30 균주를 형질전환시킴으로써 플라스미드가 염색체내로 통합된 균주를 수득한다. 이어서, 이러한 균주로부터 슈크로즈에 대해 내성이고 카나마이신에 대해 민감성인 균주를 선별한다. 선별된 균주의 odhA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, odhA 유전자내의 프레임 이동 돌연변이에 의해 α-KGDH의 기능에 결함이 있는 균주를 ATCC13869-L30sucA8(odhA8) 균주로서 선별한다.
ATCC13869-L30 균주를 사용하는 유사한 공정에 의해 다른 odhA 돌연변이 균주를 수득할 수 있다.
서열번호 55의 프라이머 대신에 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 56의 프라이머가 사용되는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, 서열번호 47의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 돌연변이 odhA 유전자가 도입된 sucA801 균주를 수득할 수 있다.
서열번호 55의 프라이머 대신에 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 57의 프라이머가 사용되는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 돌연변이 odhA 유전자가 도입된 sucA805 균주를 수득할 수 있다.
서열번호 55의 프라이머 대신에 인산화된 5'-말단을 갖는 서열번호 58의 프라이머가 사용되는 상기한 방법과 유사한 방법에 의해, 서열번호 51의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 돌연변이 odhA 유전자가 도입된 sucA77 균주를 수득할 수 있다.
sucA8 돌연변이는 α-KGDH 단백질의 미성숙 절단을 야기하는 프레임-이동 돌연변이이기 때문에, L30sucA8 균주는 세포내 α-KGDH를 갖지 않는다. 반면에, sucA801 균주, sucA805 균주, 및 sucA77 균주는, 이들 돌연변이가 프레임-이동 돌연변이가 아니고 α-KGDH 단백질의 미성숙 절단을 야기하지 않기 때문에, 낮지만 약간의 α-KGDH 활성을 갖는다.
Figure 112007055114007-PCT00014
Figure 112007055114007-PCT00015
<yggB 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주를 사용한 L-글루탐산 생산>
ygg 유전자 및 odhA 유전자-이중 돌연변이 균주의 L-글루탐산 생산성을, Sakaguchi 플라스크에서 이들 균주를 배양하여 평가하였다. 표 14에 열거된 각각의 균주를 CM-Dex 한천 배지에서 하룻밤 동안 31.5℃에서 배양하고, 이어서 배양물의 1/6을 60g/l 글루코즈, 22.5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l 비타민 B1, 0.48g/l 대두 단백질 가수분해물, 및 300㎍/l 비오틴을 함유하는 20ml의 배지(KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함)로 옮기고, CaCO3를 부가하고, 31.5℃에서 115rpm으로 교반하면서 배양하였다. 19시간 배양한 후에 축적된 L-글루탐산의 양은 표 16에 제시되어 있다. sucA801, sucA805, 및 sucA77 균주는, 야생형 odhA 유전자를 보유한 ATCC13869-L30 균주 및 프레임-이동 돌연변이가 있는 odhA 유전자를 보유한 sucA8 균주보다 더 높은 L-글루탐산 생산성을 나타내었다. 이러한 결과는 odhA 유전자의 티아민 피로포스페이트 결합 영역에 인접한 부위로 돌연변이를 도입시켜 α-KGDH 활성을 조절함으로써 L-글루탐산이 효율적으로 생산됨을 보여주었다.
Figure 112007055114007-PCT00016
실시예 16
<ATCC14067yggB8 균주에서의 odhA 유전자의 파괴>
ATCC14067 균주 및 ATCC14067yggB8 균주에서 각각 odhA 유전자를 파괴하고, 수득된 균주를 배양하였다. 먼저, odhA 유전자 파괴를 위한 플라스미드를 작제하였다. odhA 유전자의 N-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 77 및 78에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC14067 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. odhA 유전자의 C-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 79 및 80에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC14067 균주의 염색체 DNA를 사용하여 또 다른 PCR을 수행하였다. 이어서, odhA 유전자의 내부서열이 결실된 단편을 제조하기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 81 및 82의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 BamHI으로 분해시키고 실시예 1에서 작제된 pBS4S내로 삽입시켜 플라스미드 pBS△sucA47을 수득하였다.
염색체내로 결실형 odhA 유전자를 도입시키고 벡터 부분만을 제거하기 위해서 pBS△sucA47로 실시예 11의 ATCC14067 균주 및 ATCC14067yggB8을 실시예 6과 같은 방법으로 형질전환시켰다. 서열번호 77 및 80의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 카나마이신-민감성 균주로부터 odhA 유전자가 파괴된 균주를 선별하였다. 이렇게 수득된 균주를 각각 ATCC14067△odhA 균주 및 ATCC14067△odhA yggB8 균주라 명명하였다.
실시예 3에 기술된 방법에 따른 ATCC14067△odhA 균주 및 ATCC14067△odhA yggB8 균주의 배양 결과는 표 17에 제시되어 있다. 8형 돌연변이 yggB 유전자를 도입시킴으로써 odhA 유전자-파괴된 균주의 L-글루탐산 생산능이 향상된 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00017
실시예 17
<yggB 돌연변이 균주에서의 symA 유전자의 파괴>
실시예 3에서 작제되고 yggB 유전자에 삽입된 IS를 갖는 2A-1R 균주에서 symA 유전자를 파괴시키고, 수득된 균주를 2A-1R 균주와 비교하여 배양하였다. ATCC13869 균주의 symA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 86에 제시되어 있고, 아미노산 서열은 서열번호 87에 제시되어 있다. 먼저, symA 유전자 파괴를 위한 플라스미드를 작제하였다. symA 유전자의 N-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 88 및 89에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. symA 유전자의 C-말단 영역을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해서, 프라이머로서 서열번호 90 및 91에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하여 또 다른 PCR을 수행하였다. 이어서, SymA 유전자의 내부서열이 결실된 단편을 제조하기 위해서, 주형으로서 N-말단 단편 및 C-말단 단편의 등몰량의 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 88 및 91의 합성 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 BamHI으로 분해시키고 실시예 1에서 작제된 pBS4S내로 삽입시켜 플라스미드 pBS△1867을 수득하였다.
염색체내로 결실형 SymA 유전자를 도입시키고 벡터 부분만을 제거하기 위해서 pBS△1867로 2A-1R 균주를 실시예 6에 기술된 방법과 같은 방법으로 형질전환시켰다. 서열번호 88 및 91의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 카나마이신-민감성 균주로부터 SymA 유전자가 파괴된 균주를 선별하였다. 이렇게 수득된 균주를 2A-1R△SymA 균주라 명명하였다.
실시예 3에 기술된 방법에 따른 2A-1R△SymA 균주 및 2A-1R 균주의 배양 결과는 표 18에 제시되어 있다. SymA 유전자를 결실시킴으로써 돌연변이형 yggB 유전자-도입된 균주의 L-글루탐산 생산능이 추가로 향상된 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00018
실시예 18
<야생형 yggB 유전자-증폭된 균주의 작제>
코리네형 세균내로 야생형 yggB 유전자를 도입시키기 위해서 코리네형 세균의 야생형 yggB 유전자를 보유하는 pL5k를 사용하였다. pL5k와 유사한 구조를 갖는 플라스미드는, 서열번호 59 및 60의 프라이머 및 주형으로서 ATCC13869 균주의 염색체 DNA를 사용하는 PCR을 수행하고, 증폭된 산물을 BamHI으로 분해시키고, 수득된 단편을 pVK9의 BamHI 부위내로 삽입시킴으로써 작제할 수도 있다. pVK9은, pHSG299(Takara Bio)의 AvaII 부위를 평활말단화시키고, BamHI 및 KpnI으로 pHK4(JP-A-05-007491)로부터 절단된 코리네형 세균에서의 자발적인 복제에 관여하는 단편을 삽입시킴으로써 수득된 셔틀벡터이다.
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13869 균주를 전기 펄스 방법(JP-A-2-207791)에 의해 pL5k로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 CM2B 플레이트 배지(10g/l 폴리펩톤, 10g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl, 20g/l 한천, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정함)에 도말하고, 하룻밤 동안 31.5℃에서 배양하였다. 다음날에, 출현한 콜로니를 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM2B 플레이트 배지에서 정제하여 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주를 수득하였다. 통상적인 방법에 의해 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하여 표적 플라스미드가 도입되었음을 확인하였다. 이렇게 수득된 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주를 ATCC13869/pL5k라 명명하였다. 대조군 균주로서, pVK9가 도입된 ATCC13869/pVK9를 상기한 방법과 같은 방법으로 작제하였다.
실시예 19
<야생형 yggB 유전자-증폭된 균주의 평가>
(2-1) 비오틴이 제한된 배양 조건하에서의 평가
실시예 17에서 작제된 각각의 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주 및 대조군 균주로부터 3개의 클론을 분리하고, 각 클론을 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 2ml의 배양물을 비오틴을 함유하지 않은 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지내의 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 그 결과, 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주(ATCC13869/pL5k)는 벡터-도입된 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기한 것으로 밝혀졌다.(표 19에서, OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, GH(g/L)는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다.)
Figure 112007055114007-PCT00019
(2-2) 계면활성제가 부가된 조건하에서의 평가
상기 (2-1)에서 사용된 동일한 클론을 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 2ml의 배양물을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 배양을 시작하고 2시간 후, Tween40을 부가하여 최종농도가 5g/L가 되게 하고 배양을 계속하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지내의 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 그 결과, 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주(ATCC13869/pL5k)는 벡터-도입된 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기한 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007055114007-PCT00020
(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, GH는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다.)
(2-3) 페니실린 G가 부가된 조건하에서의 평가
상기 (2-1)에서 사용된 동일한 클론을 20ml의 종균배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 당이 완전히 소비된 후, 2ml의 배양물을 20ml의 본배양 배지(80g/l 글루코즈, 30g/l 황산암모늄, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgSO4·7H2O, 0.01g/l FeSO4·7H2O, 0.01g/l MnSO4·4-5H2O, 200㎍/l VB1, 60㎍/l 비오틴, 0.48g/l 대두 가수분해물(T-N), KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정함: 115℃에서 10분간 고압증기멸균함)에 접종하고, 이어서 1g의 멸균된 탄산칼슘을 부가하고, 31.5℃에서 진탕배양하였다. 배양을 시작하고 2시간 후, 페니실린 G를 부가하여 최종농도가 0.5U/ml가 되게 하고 배양을 계속하였다. 당이 완전히 소비된 후, 배지내의 L-글루탐산의 농도를 측정하였다. 그 결과, 야생형 yggB 유전자-증폭된 균주(ATCC13869/pL5k)는 벡터-도입된 균주보다 더 많은 L-글루탐산의 축적을 야기한 것으로 밝혀졌다(표 21).
Figure 112007055114007-PCT00021
(OD620은 101배로 희석된 배양 용액의 620nm에서의 탁도이고 세포의 양을 나타내며, GH는 축적된 L-글루탐산의 양을 나타낸다.)
본 발명에 따라, yggB 유전자를 이용하여 변형된 균주를 사용함으로써 효율적으로 L-글루탐산을 생산한다.
본 발명의 대표적인 양태를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 본 발 명의 범위 내에서, 다양한 변형이 이루어질 수 있고 동등한 실시가 이루어질 수 있음이 당업자에게는 명백하다. 상기한 각각의 문헌은 본원에 그 자체로서 참조 문헌으로 인용되었다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> L-GLUTAMIC ACID-PRODUCING MICROORGANISM AND A METHOD FOR PRODUCING L-GLUTAMIC ACID <130> C401-C5216 <150> JP 2004-378615 <151> 2004-12-28 <150> JP 2004-378604 <151> 2004-12-28 <150> JP 2005-262087 <151> 2005-09-09 <160> 91 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> odhA primer <400> 1 ggggatccat cggtatgcca caccgtggtc gcc 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> odhA primer <400> 2 ggggatccac gactgcttct gcatcttcgt tgg 33 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> M1 primer <400> 3 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> odhA primer <400> 4 cagaaggaat catcggtgag caggc 25 <210> 5 <211> 3481 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1437)..(3035) <223> yggB <400> 5 gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60 agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120 gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180 cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240 ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300 aacgtaaagg acaggcttct tagactcacc gatcagtttg acagcctgct caatctgtcg 360 agcatgcggt gttgaaactg ggcggtagcc tggcaggtcg atctttggtg gccagacgaa 420 atccaattca gcgttctgaa catccttggg gatatccact agaacaggac cagggcgacc 480 agtaatcgcg aggtggaatg cctcagccaa tgcctgtgga atgtcgttgg ggttggtgac 540 catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600 atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660 caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720 gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780 ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840 tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900 aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960 cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020 aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080 agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140 ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200 gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260 ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320 aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380 ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439 Met 1 att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487 Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp 5 10 15 att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535 Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe 20 25 30 ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583 Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg 35 40 45 gtg gag tct 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att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967 Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys 165 170 175 atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015 Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile 180 185 190 ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063 Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu 195 200 205 gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111 Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile 210 215 220 225 ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159 Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr 230 235 240 gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207 Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val 245 250 255 acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255 Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile 260 265 270 atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303 Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly 275 280 285 acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351 Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser 290 295 300 305 ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399 Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala 310 315 320 gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447 Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp 325 330 335 aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495 Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu 340 345 350 gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543 Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu 355 360 365 aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591 Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr 370 375 380 385 tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639 Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg 390 395 400 atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687 Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe 405 410 415 aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga 2735 Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly 420 425 430 tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc acc tcc gaa 2783 Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu 435 440 445 act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg 2831 Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val 450 455 460 465 gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc 2879 Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr 470 475 480 tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc atc gaa ccg 2927 Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro 485 490 495 acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg cag acg cag 2975 Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln 500 505 510 tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca gtt gcg ccg 3023 Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro 515 520 525 acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact 3075 Thr Ser Thr Pro 530 attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca 3135 cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat tattagtcat 3195 cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct tcggttactg 3255 ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact acgccttcaa 3315 gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg gtgcccgcac 3375 tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct tcaactccct 3435 tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3481 <210> 6 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser 420 425 430 Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser 435 440 445 Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr 450 455 460 Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu 465 470 475 480 Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu 485 490 495 Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr 500 505 510 Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala 515 520 525 Pro Thr Ser Thr Pro 530 <210> 7 <211> 4934 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1437)..(2705) <223> 2A-1 <400> 7 gatcttgccg atttcggcag gatcaatgtc ggcgtgaatg atcttggcat caggtgcgaa 60 agtgtcaacg tcaccggtga cgcggtcatc aaagcgggag ccgatagcaa tcagcaggtc 120 gctgcgctgc agtgcaccaa cagcggacac agtgccatgc atgcctggca tacccatgtg 180 cagctcgtgg gactctggga aggttcccag cgccatcaat gtggtgacaa ctggaatgcc 240 ggtgtgctca gcgaacgcac gaagctcttc gtgggcatca gccttgataa cgccgccgcc 300 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ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200 gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260 ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320 aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380 ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439 Met 1 att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg 1487 Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp 5 10 15 att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt 1535 Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe 20 25 30 ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583 Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg 35 40 45 gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631 Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe 50 55 60 65 gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679 Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu 70 75 80 gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727 Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala 85 90 95 att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg 1775 Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823 Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln 115 120 125 ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871 Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val 130 135 140 145 gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919 Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr 150 155 160 att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967 Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys 165 170 175 atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015 Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile 180 185 190 ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063 Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu 195 200 205 gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111 Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile 210 215 220 225 ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159 Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr 230 235 240 gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207 Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val 245 250 255 acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255 Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile 260 265 270 atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303 Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly 275 280 285 acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351 Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser 290 295 300 305 ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399 Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala 310 315 320 gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447 Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp 325 330 335 aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495 Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu 340 345 350 gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543 Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu 355 360 365 aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591 Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr 370 375 380 385 tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639 Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg 390 395 400 atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687 Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe 405 410 415 aag ggg ctc ttc ctg ttt tagagtgcat tgatcttatg gaccaactgc 2735 Lys Gly Leu Phe Leu Phe 420 cctgaatgga taaggcaccg cagaatgtag tggttcaaat tacggaaacc tagagcaatc 2795 ccacgcaaat gctccaaccg tccgttgatc gcttcgaccg gaccgttgga gacaccaaca 2855 tcgaaatacg ccaacacatc accaagtcgt ttaaacaaac tacgacccaa ctgcgcgagt 2915 tccttattcg gccccttcaa cacccgaagc tgatcaataa tggtccgcat tttcttcttc 2975 gcttcacgct tattacccat ctgataacaa tcaataatcg cctgatacgc aagccacgca 3035 agctttaaca ccccgtagtc tttgtcatac gcccacaact gctccaagct ttcttgctga 3095 cgaggactca accacttgtg cgtggtcaac aaggtcttcc ggtttttata caacggatcc 3155 tggcttaaac cacgacgctg gtatttctcc cgctggaggc gttgccggca ggcggtgagc 3215 ttgtcaccag caagccgcac aacatggaat ggatccatca cgcgacgagc agaaggaatg 3275 agttctttac ttgctgtggc gtagccttgg aacccatcca tggacacgat ccgtatctga 3335 ttgcggaact gttcaccgcg ggaaccaagc caggaccgta aagcatcagc actacgacct 3395 gggacgacat ctaataaccg ggcaggacac cgtgagtcat accgatgccc ggtcatatcg 3455 acaatcacgg tgacaaaccc atcaccatgc ttagccctat tatgtgacca cttatgctca 3515 tccaccccaa tgacatacac tccatcaaga tggtgaggat cgttatagac cagctcacgg 3575 cacatatcga gggctagttg gcaggttaaa tcccacccta gcccaagtgc tttcgcggtt 3635 gcgtgaacac tcatccggtc aatagcaagg cgttgcaaaa tccagcgggt gacccggtgg 3695 gtgacctttt taccgtggtc agcgcagctt agttctgctt ggaaatactt ttgcttacat 3755 gtcgggttgg tgcagcggta gcgaggtaga cggataaaca gtttggtggg aaacccgacg 3815 atgggtaaat caatgagcat ccggtgggtg tgatgacgaa acaccccagg ttgggagcat 3875 tctgggcagg tggaggtata gtcgagtgcg tctgcttcga tcagggtgta atcacctgca 3935 tcggaagcgc cggtgatggt gagtcctagt tccgcagtgc ggcagatggt gtcagcgatg 3995 atgttgccgg tagacttcat gggtagagcc ttttgttggt gtttggttag cttagatacc 4055 taaaccttaa ccctgacaaa aggctcgttt attttcgggt ctacaccgct agcccaggtt 4115 ctgtgatgta ccccaaaacc ggaagggcct catgactgtg gaaccaagtg agaattggca 4175 aaactccagt ggatggctgt caccaagcac tgccacctca actgcggtga ccacctccga 4235 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Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu 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gcg aaa gaa acg aac caa aag cca 571 Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys Pro 25 30 35 tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg ctg 619 Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met Leu 40 45 50 caa atc cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa ttc 667 Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu Phe 55 60 65 gat tcg tcc aca att aaa aat atc tct tct gca aaa ggc ctg gac gtt 715 Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val 70 75 80 tgg gac agc tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac tat 763 Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn Tyr 85 90 95 100 cac ggc tac cac atc gtc ttt gca tta gcc gga gat cct aaa aat gcg 811 His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ala 105 110 115 gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act tct 859 Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr Ser 120 125 130 att gac agc tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac agc gac aaa 907 Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys 135 140 145 ttc gat gca aat gat tct atc cta aaa gac caa aca caa gaa tgg tca 955 Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser 150 155 160 ggt tca gcc aca ttt aca tct gac gga aaa atc cgt tta ttc tac act 1003 Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr 165 170 175 180 gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gca caa 1051 Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln 185 190 195 gtt aac gta tca gca tca gac agc tct ttg aac atc aac ggt gta gag 1099 Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val Glu 200 205 210 gat tat aaa tca atc ttt gac ggt gac gga aaa acg tat caa aat gta 1147 Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Asn Val 215 220 225 cag cag ttc atc gat gaa ggc aac tac agc tca ggc gac aac cat acg 1195 Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His Thr 230 235 240 ctg aga gat cct cac tac gta gaa gat aaa ggc cac aaa tac tta gta 1243 Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His Lys Tyr Leu Val 245 250 255 260 ttt gaa gca aac act gga act gaa gat ggc tac caa ggc gaa gaa tct 1291 Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu Glu Ser 265 270 275 tta ttt aac aaa gca tac tat ggc aaa agc aca tca ttc ttc cgt caa 1339 Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser Phe Phe Arg Gln 280 285 290 gaa agt caa aaa ctt ctg caa agc gat aaa aaa cgc acg gct gag tta 1387 Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg Thr Ala Glu Leu 295 300 305 gca aac ggc gct ctc ggt atg att gag cta aac gat gat tac aca ctg 1435 Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Thr Leu 310 315 320 aaa aaa gtg atg aaa ccg ctg att gca tct aac aca gta aca gat gaa 1483 Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu 325 330 335 340 att gaa cgc gcg aac gtc ttt aaa atg aac ggc aaa tgg tac ctg ttc 1531 Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe 345 350 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atgtcgttgg ggttggtgac 540 catgaagttg tgcttggtca ctggcatggt gatgccgcgg atatcggctt cctggaaagc 600 atcggtaccc agcaggctac ttccgacctg gccggtgatg gcaaccatgg gaacggagtc 660 caagtttgca tcagcgattg gggtaaccaa gttggttgcg cctgggccag aggttgcaat 720 gcagacgcca acgcgtccag taacctgcgc gtagccggtt gctgcgtggc ctgcgccctg 780 ctcgtggcgc actaggacgt ggcgcacctt tgtggaggaa tagagcgggt catacaccgg 840 tagcaccgca ccaccaggaa taccgaacac gatgtcggcg ttaagctcct cgagcgatcg 900 aacaattgcc tgtgcacctg tcatccgctc aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac 960 cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc cacattcacg actttctggc tcctttacta 1020 aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa 1080 agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg 1140 ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt 1200 gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc 1260 ggttactact acaagtcgaa taatggtcat ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc 1320 aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc caaaactccc ccacttcggt taaggaatca 1380 ggattctcac aaagttcagg caggctcccg ctacttttca gcgctaatct tggctc atg 1439 Met 1 att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgt tca ttg 1487 Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Cys Ser Leu 5 10 15 tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc 1535 Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val 20 25 30 ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc 1583 Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile 35 40 45 aag cag cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag 1631 Lys Gln Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln 50 55 60 65 ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt 1679 Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe 70 75 80 ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg 1727 Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala 85 90 95 ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt 1775 Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly 100 105 110 gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg 1823 Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr 115 120 125 gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc 1871 Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly 130 135 140 145 atc gtt gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa 1919 Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys 150 155 160 att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg 1967 Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala 165 170 175 aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt 2015 Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val 180 185 190 att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg 2063 Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala 195 200 205 cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca 2111 Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala 210 215 220 225 ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca 2159 Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr 230 235 240 ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc 2207 Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu 245 250 255 gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc 2255 Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg 260 265 270 aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act 2303 Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr 275 280 285 aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca 2351 Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro 290 295 300 305 aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag 2399 Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys 310 315 320 ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac 2447 Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp 325 330 335 gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag 2495 Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu 340 345 350 aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa 2543 Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu 355 360 365 ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc 2591 Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg 370 375 380 385 act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga 2639 Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly 390 395 400 cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg 2687 Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu 405 410 415 tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac 2735 Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn 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attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 3134 aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 3194 tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 3254 tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 3314 acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 3374 gtgcccgcac tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct 3434 tcaactccct tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3490 <210> 20 <211> 536 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 20 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Cys Ser 1 5 10 15 Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu 20 25 30 Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile 35 40 45 Ile Lys Gln Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn 50 55 60 Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala 65 70 75 80 Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu 85 90 95 Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu 115 120 125 Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn 130 135 140 Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr 145 150 155 160 Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr 165 170 175 Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val 180 185 190 Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile 195 200 205 Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile 210 215 220 Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val 225 230 235 240 Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe 245 250 255 Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile 260 265 270 Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr 275 280 285 Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu 290 295 300 Pro Lys 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Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln 115 120 125 ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871 Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val 130 135 140 145 gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg 1919 Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr 150 155 160 att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg tgc 1967 Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys 165 170 175 atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc 2015 Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile 180 185 190 ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa 2063 Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu 195 200 205 gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc 2111 Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile 210 215 220 225 ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg 2159 Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr 230 235 240 gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc 2207 Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val 245 250 255 acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc 2255 Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile 260 265 270 atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg gga 2303 Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly 275 280 285 acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc tcg 2351 Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser 290 295 300 305 ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct 2399 Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala 310 315 320 gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac 2447 Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp 325 330 335 aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt 2495 Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu 340 345 350 gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa 2543 Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu 355 360 365 aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac 2591 Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr 370 375 380 385 tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc 2639 Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg 390 395 400 atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt 2687 Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe 405 410 415 aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga 2735 Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly 420 425 430 tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc acc tcc gaa 2783 Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu 435 440 445 act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg 2831 Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val 450 455 460 465 gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc 2879 Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr 470 475 480 tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc atc gaa ccg 2927 Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro 485 490 495 acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg cag acg cag 2975 Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln 500 505 510 tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca gtt gcg ccg 3023 Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro 515 520 525 acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt ctttactact 3075 Thr Ser Thr Pro 530 attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg aaaaatttca 3135 cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat tattagtcat 3195 cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct tcggttactg 3255 ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact acgccttcaa 3315 gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg gtgcccgcac 3375 tttcgctcgc accacctccg atgcagaagt caccctcccc ggcgtcacct tcaactccct 3435 tccccgcctt gaagctgctt cccacggccg catccccgat gcgatc 3481 <210> 22 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Thr Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly 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att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag cga 1583 Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln Arg 35 40 45 gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg ttc 1631 Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe 50 55 60 65 gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt 1679 Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu 70 75 80 gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg 1727 Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala 85 90 95 att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gtg cag tcg 1775 Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Val Gln Ser 100 105 110 att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa 1823 Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln 115 120 125 ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt 1871 Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val 130 135 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agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr 30 35 40 ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616 Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln 45 50 55 aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala 60 65 70 cag ggg gga cca aat act acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712 Gln Gly Gly Pro Asn Thr Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser 75 80 85 90 gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala 95 100 105 aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gac aag acc gcc cct 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Asp Lys Thr Ala Pro 110 115 120 aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro 125 130 135 gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904 Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met 140 145 150 gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952 Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro 155 160 165 170 gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000 Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys 175 180 185 cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048 Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala 190 195 200 atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096 Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp 205 210 215 gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144 Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu 220 225 230 ggc ctt gct atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192 Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val 235 240 245 250 gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240 Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu 255 260 265 gca gcc tac gaa gac atc gtg gca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288 Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Ala Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr 270 275 280 atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336 Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly 285 290 295 atc ggt acc cgc cac tct gtt cca cgt cta acc aag ggc cag ggc acc 1384 Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr 300 305 310 atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432 Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala 315 320 325 330 tca gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt ggc aaa ctt gtc acc atc 1480 Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile 335 340 345 acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528 Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser 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acc gtt cgt gct cag tac 2872 Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr 795 800 805 810 acc gaa gac ctg ctc gga cgt gga gac ctc tcc aac gaa gat gca gaa 2920 Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu 815 820 825 gca gtc gtc cgc gac ttc cac gac cag atg gaa tct gtg ttc aac gaa 2968 Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu 830 835 840 gtc aag gaa ggc ggc aag aag cag gct gag gca cag acc ggc atc acc 3016 Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr 845 850 855 ggc tcc cag aag ctt cca cac ggc ctt gag acc aac atc tcc cgt gaa 3064 Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu 860 865 870 gag ctc ctg gaa ctg gga cag gct ttc gcc aac acc cca gaa ggc ttc 3112 Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe 875 880 885 890 aac tac cac cca cgt gtg gct ccc gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct 3160 Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser 895 900 905 gtc acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc 3208 Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe 910 915 920 ggt tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat 3256 Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp 925 930 935 tcc cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca 3304 Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro 940 945 950 gcg acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag 3352 Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys 955 960 965 970 ggc aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac 3400 Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr 975 980 985 gca ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc 3448 Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser 990 995 1000 atc gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc aac ggc gct 3493 Ile Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala 1005 1010 1015 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240 agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300 cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360 gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420 taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472 Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln 1 5 10 cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa ata aag ctc aat aaa ccc tca 520 Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser 15 20 25 aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr 30 35 40 ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616 Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln 45 50 55 aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala 60 65 70 cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712 Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser 75 80 85 90 gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala 95 100 105 aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro 110 115 120 aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro 125 130 135 gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904 Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met 140 145 150 gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952 Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro 155 160 165 170 gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000 Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys 175 180 185 cgc acc cgc ggt ggc aag atc tcc ttc acc cac atc att ggc tac gcc 1048 Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His Ile Ile Gly Tyr Ala 190 195 200 atg gtg aag gca gtc atg gct cac ccg gac atg aac aac tcc tac gac 1096 Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp Met Asn Asn Ser Tyr Asp 205 210 215 gtc atc gac ggc aag cca acc ctg atc gtg cct gag cac atc aac ctg 1144 Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val Pro Glu His Ile Asn Leu 220 225 230 ggc ctt gcc atc gac ctt cct cag aag gac ggc tcc cgc gca ctt gtc 1192 Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val 235 240 245 250 gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240 Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu 255 260 265 gca gca tac gaa gac atc gtg aca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288 Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr 270 275 280 atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336 Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly 285 290 295 atc ggt acc cgc cac tct gtc cca cgt ctg acc aag ggc cag ggc acc 1384 Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr 300 305 310 atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432 Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala 315 320 325 330 tcc gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt gga aag ctt gtc acc atc 1480 Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile 335 340 345 acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528 Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu 350 355 360 ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576 Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp 365 370 375 gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624 Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala 380 385 390 cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672 Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln 395 400 405 410 ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720 Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn 415 420 425 cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768 Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp 430 435 440 ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816 Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr 445 450 455 ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864 Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu 460 465 470 gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912 Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu 475 480 485 490 tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960 Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg 495 500 505 ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008 Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile 510 515 520 ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056 Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr 525 530 535 aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104 Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu 540 545 550 atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152 Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu 555 560 565 570 gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200 Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu 575 580 585 ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248 Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu 590 595 600 ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296 Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr 605 610 615 cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344 His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu 620 625 630 atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392 Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn 635 640 645 650 cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440 Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys 655 660 665 ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488 Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala 670 675 680 gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aag 2536 Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys 685 690 695 ctg cgt cgacgtcgga ggcaccatcc acatcgtggt gaacaaccag atcggcttca 2592 Leu Arg 700 ccaccacccc agactccagc cgctccatgc actacgcaac cgactacgcc aaggcattcg 2652 gctgcccagt cttccacgtc aatggtgatg acccagaggc agttgtctgg gttggccagc 2712 tggcaaccga gtaccgtcgt cgcttcggca aggacgtctt catcgacctc gtttgctacc 2772 gcctccgcgg ccacaacgaa gctgatgatc cttccatgac ccagccaaag atgtatgagc 2832 tcatcaccgg ccgcgagacc gttcgtgctc agtacaccga agacctgctc ggacgtggag 2892 acctctccaa cgaagatgca gaagcagtcg tccgcgactt ccacgaccag atggaatctg 2952 tgttcaacga agtcaaggaa ggcggcaaga agcaggctga ggcacagacc ggcatcaccg 3012 gctcccagaa gcttccacac ggccttgaga ccaacatctc ccgtgaagag ctcctggaac 3072 tgggacaggc tttcgccaac accccagaag gcttcaacta ccacccacgt gtggctccag 3132 ttgctaagaa gcgcgtctcc tctgtcaccg aaggtggcat cgactgggca tggggcgagc 3192 tcctcgcctt cggttccctg gctaactccg gccgcttggt tcgccttgca ggtgaagatt 3252 cccgccgcgg taccttcacc cagcgccacg cagttgccat cgacccagcg accgctgaag 3312 agttcaaccc actccacgag cttgcacagt ccaagggcaa caacggtaag ttcctggtct 3372 acaactccgc actgaccgag tacgcaggca tgggcttcga gtacggctac tccgtaggaa 3432 acgaagactc cgtcgttgca tgggaagcac agttcggcga cttcgccaac ggcgctcaga 3492 ccatcatcga tgagtacgtc tcctcaggcg aagctaagtg gggccagacc tccaagctga 3552 tccttctgct gcctcacggc tacgaaggcc agggcccaga ccactcttcc gcacgtatcg 3612 agcgcttcct gcagctgtgc gctgagggtt ccatgactgt tgctcagcca tccaccccag 3672 caaaccactt ccacctgctg cgtcgtcacg ctctgtccga cctgaagcgt 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520 Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser 15 20 25 aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr 30 35 40 ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616 Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln 45 50 55 aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala 60 65 70 cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712 Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser 75 80 85 90 gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala 95 100 105 aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro 110 115 120 aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856 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gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528 Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu 350 355 360 ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576 Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp 365 370 375 gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624 Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala 380 385 390 cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672 Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln 395 400 405 410 ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720 Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn 415 420 425 cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768 Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp 430 435 440 ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816 Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr 445 450 455 ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864 Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu 460 465 470 gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912 Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu 475 480 485 490 tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960 Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg 495 500 505 ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008 Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile 510 515 520 ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056 Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr 525 530 535 aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104 Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu 540 545 550 atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152 Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu 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Leu Leu His Gly Asp Ala 670 675 680 gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aag 2536 Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys 685 690 695 ctg cgt ctc gac gtc gga ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac cag 2584 Leu Arg Leu Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln 700 705 710 atc ggc ttc acc acc acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac gca 2632 Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala 715 720 725 730 acc gac tac gcc aag gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aat ggt 2680 Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly 735 740 745 gat gac cca gag gca gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gca acc gag tac 2728 Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr 750 755 760 cgt cgt cgc ttc ggc aag gac gtc ttc atc gac ctc gtt tgc tac cgc 2776 Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg 765 770 775 ctc cgc ggc cac aac gaa gct gat gat cct tcc atg acc cag cca aag 2824 Leu Arg Gly His Asn 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3160 Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val 895 900 905 acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc ggt 3208 Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly 910 915 920 tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat tcc 3256 Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser 925 930 935 cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca gcg 3304 Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala 940 945 950 acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag ggc 3352 Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly 955 960 965 970 aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac gca 3400 Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala 975 980 985 ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc gtc 3448 Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val 990 995 1000 gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc 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tgcttctcga 180 cgaagccacc tccaccctcg accccgccac cgaagccgtt atcctcaacg cctccgatcg 240 agtcactaag ggacgcacca gcatcatcgt cgcgcaccgc ttggcaaccg ctaaaagggc 300 cgaccgtatt cttgttgttg aacaaggacg tatcattgag gacggatctc acgacgcgtt 360 gttgtctgct aacggcacct acgcccgcat gtggcattta atggcctgac acgttatttt 420 taggagaact gtcaacaaat ta atg cta caa ctg ggg ctt agg cat aat cag 472 Met Leu Gln Leu Gly Leu Arg His Asn Gln 1 5 10 cca acg acc aac gtt aca gtg gat aaa ata aag ctc aat aaa ccc tca 520 Pro Thr Thr Asn Val Thr Val Asp Lys Ile Lys Leu Asn Lys Pro Ser 15 20 25 aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr 30 35 40 ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616 Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln 45 50 55 aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala 60 65 70 cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712 Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser 75 80 85 90 gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala 95 100 105 aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro 110 115 120 aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu Pro Glu Pro 125 130 135 gga caa acc cca atc agg ggt att ttc aag tcc atc gcg aag aac atg 904 Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys Ser Ile Ala Lys Asn Met 140 145 150 gat atc tcc ctg gaa atc cca acc gca acc tcg gtt cgc gat atg cca 952 Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Asp Met Pro 155 160 165 170 gct cgc ctc atg ttc gaa aac cgc gcg atg gtc aac gat cag ctc aag 1000 Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met Val Asn Asp Gln Leu Lys 175 180 185 cgc acc cgc 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Arg Val Met Gln 395 400 405 410 ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720 Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn 415 420 425 cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768 Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp 430 435 440 ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816 Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr 445 450 455 ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864 Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu 460 465 470 gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912 Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu 475 480 485 490 tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960 Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg 495 500 505 ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008 Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile 510 515 520 ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056 Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr 525 530 535 aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104 Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu 540 545 550 atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152 Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu 555 560 565 570 gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200 Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu 575 580 585 ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248 Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu 590 595 600 ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296 Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr 605 610 615 cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344 His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu 620 625 630 atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392 Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn 635 640 645 650 cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440 Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys 655 660 665 ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488 Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala 670 675 680 gca ttc gca ggc ctg ggc atc gtg cca gaa acc atc aac ctg gct aaa 2536 Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys 685 690 695 agc tgc gtc gac gtc gga ggc acc atc cac atc gtg gtg aac aac cag 2584 Ser Cys Val Asp Val Gly Gly Thr Ile His Ile Val Val Asn Asn Gln 700 705 710 atc ggc ttc acc acc acc cca gac tcc agc cgc tcc atg cac tac gca 2632 Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser Ser Arg Ser Met His Tyr Ala 715 720 725 730 acc gac tac gcc aag gca ttc ggc tgc cca gtc ttc cac gtc aat ggt 2680 Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys Pro Val Phe His Val Asn Gly 735 740 745 gat gac cca gag gca gtt gtc tgg gtt ggc cag ctg gca acc gag tac 2728 Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr 750 755 760 cgt cgt cgc ttc ggc aag gac gtc ttc atc gac ctc gtt tgc tac cgc 2776 Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg 765 770 775 ctc cgc ggc cac aac gaa gct gat gat cct tcc atg acc cag cca aag 2824 Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys 780 785 790 atg tat gag ctc atc acc ggc cgc gag acc gtt cgt gct cag tac acc 2872 Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr 795 800 805 810 gaa gac ctg ctc gga cgt gga gac ctc tcc aac gaa gat gca gaa gca 2920 Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala 815 820 825 gtc gtc cgc gac ttc cac gac cag atg gaa tct gtg ttc aac gaa gtc 2968 Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met Glu Ser Val Phe Asn Glu Val 830 835 840 aag gaa ggc ggc aag aag cag gct gag gca cag acc ggc atc acc ggc 3016 Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly 845 850 855 tcc cag aag ctt cca cac ggc ctt gag acc aac atc tcc cgt gaa gag 3064 Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu 860 865 870 ctc ctg gaa ctg gga cag gct ttc gcc aac acc cca gaa ggc ttc aac 3112 Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn 875 880 885 890 tac cac cca cgt gtg gct cca gtt gct aag aag cgc gtc tcc tct gtc 3160 Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Val 895 900 905 acc gaa ggt ggc atc gac tgg gca tgg ggc gag ctc ctc gcc ttc ggt 3208 Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly 910 915 920 tcc ctg gct aac tcc ggc cgc ttg gtt cgc ctt gca ggt gaa gat tcc 3256 Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser 925 930 935 cgc cgc ggt acc ttc acc cag cgc cac gca gtt gcc atc gac cca gcg 3304 Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala 940 945 950 acc gct gaa gag ttc aac cca ctc cac gag ctt gca cag tcc aag ggc 3352 Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly 955 960 965 970 aac aac ggt aag ttc ctg gtc tac aac tcc gca ctg acc gag tac gca 3400 Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala 975 980 985 ggc atg ggc ttc gag tac ggc tac tcc gta gga aac gaa gac tcc gtc 3448 Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser Val Gly Asn Glu Asp Ser Val 990 995 1000 gtt gca tgg gaa gca cag ttc ggc gac ttc gcc aac ggc gct cag 3493 Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln 1005 1010 1015 acc atc atc gat gag tac gtc tcc tca ggc gaa gct aag tgg ggc 3538 Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly 1020 1025 1030 cag acc tcc aag ctg atc ctt ctg ctg cct cac ggc tac gaa ggc 3583 Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly 1035 1040 1045 cag ggc cca gac cac tct tcc gca cgt atc gag cgc ttc ctg cag 3628 Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln 1050 1055 1060 ctg tgc gct gag ggt tcc atg act gtt gct cag cca tcc acc cca 3673 Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser Thr Pro 1065 1070 1075 gca aac cac ttc cac ctg ctg cgt cgt cac gct ctg tcc gac ctg 3718 Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp Leu 1080 1085 1090 aag cgt cca ctg gtt atc ttc acc ccg aag tcc atg ctg cgt aac 3763 Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn 1095 1100 1105 aag gct gct gcc tcc gca cca gaa gac ttc act gag gtc acc aag 3808 Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys 1110 1115 1120 ttc caa tcc gtg atc gac gat cca aac gtt gca gat gca gcc aag 3853 Phe Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys 1125 1130 1135 gtg aag aag gtc atg ctg gtc tcc ggc aag ctg tac tac gaa ttg 3898 Val Lys Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu 1140 1145 1150 gca aag cgc aag gag aag gac gga cgc gac gac atc gcg atc gtt 3943 Ala Lys Arg Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val 1155 1160 1165 cgt atc gaa atg ctc cac cca att ccg ttc aac cgc atc tcc gag 3988 Arg Ile Glu Met Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu 1170 1175 1180 gct ctt gcc ggc tac cct aac gct gag gaa gtc ctc ttc gtt cag 4033 Ala Leu Ala Gly Tyr Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln 1185 1190 1195 gat gag cca gca aac cag ggc cca tgg ccg ttc tac cag gag cac 4078 Asp Glu Pro Ala Asn Gln Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His 1200 1205 1210 ctc cca gag ctg atc ccg aac atg cca aag atg cgc cgc gtt tcc 4123 Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser 1215 1220 1225 cgc cgc gct cag tcc tcc acc gca act ggt gtt gct aag gtg cac 4168 Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala Thr Gly Val Ala Lys Val His 1230 1235 1240 cag ctg gag gag aag cag ctt atc gac gag gct ttc gag gct 4210 Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Glu Ala Phe Glu Ala 1245 1250 1255 taagtcttta tagtcctgca ctagcctaga gggccttatg cagtgtgaat cacacagcat 4270 aaggcccttt ttgctgccgt ggttgcctaa ggtggaaggc atgaaacgaa tctgtgcggt 4330 cacgatctct tcagtacttt tgctaagtgg ctgctcctcc acttccacca 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Asn Lys Pro Ser 15 20 25 aga agc aag gaa aag agg cga gta cct gcc gtg agc agc gct agt act 568 Arg Ser Lys Glu Lys Arg Arg Val Pro Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr 30 35 40 ttc ggc cag aat gcg tgg ctg gta gac gag atg ttc cag cag ttc cag 616 Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu Met Phe Gln Gln Phe Gln 45 50 55 aag gac ccc aag tcc gtg gac aag gaa tgg aga gaa ctc ttt gag gcg 664 Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp Arg Glu Leu Phe Glu Ala 60 65 70 cag ggg gga cca aat gct acc ccc gct aca aca gaa gca cag cct tca 712 Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr Thr Glu Ala Gln Pro Ser 75 80 85 90 gcg ccc aag gag tct gcg aaa cca gca cca aag gct gcc cct gca gcc 760 Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Lys Ala Ala Pro Ala Ala 95 100 105 aag gca gca ccg cgc gta gaa acc aag ccg gcc gcc aag acc gcc cct 808 Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro Ala Ala Lys Thr Ala Pro 110 115 120 aag gcc aag gag tcc tca gtg cca cag caa cct aag ctt ccg gag cca 856 Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Pro Lys Leu 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Asp Gly Ser Arg Ala Leu Val 235 240 245 250 gta gca gcc atc aag gaa acc gag aag atg aac ttc tcc gag ttc ctc 1240 Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met Asn Phe Ser Glu Phe Leu 255 260 265 gca gca tac gaa gac atc gtg aca cgc tcc cgc aag ggc aag ctc acc 1288 Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser Arg Lys Gly Lys Leu Thr 270 275 280 atg gat gac tac cag ggc gtt acc gtt tcc ttg acc aac cca ggt ggc 1336 Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser Leu Thr Asn Pro Gly Gly 285 290 295 atc ggt acc cgc cac tct gtc cca cgt ctg acc aag ggc cag ggc acc 1384 Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu Thr Lys Gly Gln Gly Thr 300 305 310 atc atc ggt gtc ggt tcc atg gat tac cca gca gag ttc cag ggc gct 1432 Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala 315 320 325 330 tcc gaa gac cgc ctt gca gag ctc ggc gtt gga aag ctt gtc acc atc 1480 Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val Gly Lys Leu Val Thr Ile 335 340 345 acc tcc acc tac gat cac cgc gtg atc cag ggt gct gtg tcc ggt gaa 1528 Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln Gly Ala Val Ser Gly Glu 350 355 360 ttc ctg cgt acc atg tct cgc ctg ctc acc gat gat tcc ttc tgg gat 1576 Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr Asp Asp Ser Phe Trp Asp 365 370 375 gag atc ttc gac gca atg aac gtt cct tac acc cca atg cgt tgg gca 1624 Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr Thr Pro Met Arg Trp Ala 380 385 390 cag gac gtt cca aac acc ggt gtt gat aag aac acc cgc gtc atg cag 1672 Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys Asn Thr Arg Val Met Gln 395 400 405 410 ctc att gag gca tac cgc tcc cgt gga cac ctc atc gct gac acc aac 1720 Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His Leu Ile Ala Asp Thr Asn 415 420 425 cca ctt tca tgg gtt cag cct ggc atg cca gtt cca gac cac cgc gac 1768 Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro Val Pro Asp His Arg Asp 430 435 440 ctc gac atc gag acc cac agc ctg acc atc tgg gat ctg gac cgt acc 1816 Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile Trp Asp Leu Asp Arg Thr 445 450 455 ttc agc gtc ggt ggc ttc ggc ggc aag gag acc atg acc ctg cgc gag 1864 Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu Thr Met Thr Leu Arg Glu 460 465 470 gta ctg tcc cgc ctg cgc gct gcc tac acc ttg aag gtc ggc tcc gaa 1912 Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Leu Lys Val Gly Ser Glu 475 480 485 490 tac acc cac atc ctg gac cgc gac gag cgc acc tgg ctg cag gac cgc 1960 Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg Thr Trp Leu Gln Asp Arg 495 500 505 ctc gaa gcc gga atg cca aag cca acc cag gca gag cag aag tac atc 2008 Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln Ala Glu Gln Lys Tyr Ile 510 515 520 ctg cag aag ctg aac gcc gca gag gct ttc gag aac ttc ctg cag acc 2056 Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Asn Phe Leu Gln Thr 525 530 535 aag tac gtc ggc cag aag cgc ttc tcc ctc gaa ggt gca gaa gct ctc 2104 Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ala Glu Ala Leu 540 545 550 atc cca ctg atg gac tcc gcc atc gac acc gcc gca ggc cag ggc ctc 2152 Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr Ala Ala Gly Gln Gly Leu 555 560 565 570 gac gaa gtt gtc atc ggt atg cca cac cgt ggt cgc ctc aac gtg ctg 2200 Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu 575 580 585 ttc aac atc gtg ggc aag cca ctg gca tcc atc ttc aac gag ttt gaa 2248 Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser Ile Phe Asn Glu Phe Glu 590 595 600 ggc caa atg gag cag ggc cag atc ggt ggc tcc ggt gac gtg aag tac 2296 Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly Ser Gly Asp Val Lys Tyr 605 610 615 cac ctc ggt tcc gaa ggc cag cac ctg cag atg ttc ggc gac ggc gag 2344 His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln Met Phe Gly Asp Gly Glu 620 625 630 atc aag gtc tcc ctg act gct aac ccg tcc cac ctg gaa gct gtt aac 2392 Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu Glu Ala Val Asn 635 640 645 650 cca gtg atg gaa ggt atc gtc cgc gca aag cag gac tac ctg gac aag 2440 Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys Gln Asp Tyr Leu Asp Lys 655 660 665 ggc gta gac ggc aag act gtt gtg cca ctg ctg ctc cac ggt gac gct 2488 Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu Leu Leu His Gly Asp Ala 670 675 680 gca ttc gca ggc 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ccatccac 28 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sucA801primer <400> 56 ctgcgtctcg acgtcggagg caccatccac 30 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sucA805primer <400> 57 gctaaaagct gcgtcgacgt cggaggcacc atccac 36 <210> 58 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sucA77 <400> 58 gctataagct gcgtcgacgt cggaggcacc atccac 36 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> yggB primer-N <400> 59 ggggatcctg ccgatttcgg caggatcaat gtc 33 <210> 60 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> yggB primer-C <400> 60 ttccttgctt gcggggatcc catcggggat g 31 <210> 61 <211> 2432 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (507)..(2093) <400> 61 aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc 60 cacattcacg actttctggc tcctttacta aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc 120 caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga 180 tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca 240 acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga 300 cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc ggttactact acaagtcgaa taatggtcat 360 ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc 420 caaaactccc ccacttcggt taaggaatca ggattctcac aaagttcagg caggctcccg 480 ctacttttca gcgctaatct tggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat 533 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr 1 5 ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta 581 Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val 10 15 20 25 gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg 629 Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu 30 35 40 gcc atg cgt att atc aag cgg cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac 677 Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp 45 50 55 acc act aag aac cag ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg 725 Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala 60 65 70 caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt 773 Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe 75 80 85 ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct 821 Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala 90 95 100 105 gcc att ggc ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga 869 Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly 110 115 120 ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgt 917 Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg 125 130 135 ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtc gaa ggc acc gtc att gag atc acc 965 Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr 140 145 150 atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc 1013 Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile 155 160 165 ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg 1061 Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser 170 175 180 185 cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc 1109 Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile 190 195 200 aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc 1157 Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly 205 210 215 cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca 1205 Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro 220 225 230 gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc 1253 Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val 235 240 245 acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc 1301 Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val 250 255 260 265 gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac 1349 Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr 270 275 280 ggc agc gca acc act aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt 1397 Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val 285 290 295 gag cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct 1445 Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala 300 305 310 ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct 1493 Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala 315 320 325 gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat 1541 Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn 330 335 340 345 gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa 1589 Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu 350 355 360 ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc 1637 Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu 365 370 375 cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc 1685 Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile 380 385 390 ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt 1733 Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly 395 400 405 gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt 1781 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser 410 415 420 425 gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc 1829 Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr 430 435 440 tca act gcg gtg acc acc tcc gaa act tcc gcg cca gta agc act tct 1877 Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Ser 445 450 455 tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct 1925 Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser 460 465 470 agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc 1973 Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro 475 480 485 cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag 2021 Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu 490 495 500 505 gaa acg act gcg tcg cag acg cag tct cca gca acc gcg gtt caa gag 2069 Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu 510 515 520 aca gtt gcg ccg acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt 2123 Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro 525 ctttactact attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 2183 aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 2243 tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 2303 tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 2363 acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 2423 gtgcccgca 2432 <210> 62 <211> 529 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 62 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser 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Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr 500 505 510 Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr 515 520 525 Pro <210> 63 <211> 2432 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (507)..(2093) <400> 63 aggggcggcg gatcgaccac ggcttgcaac cgtggcggga gtgggctgtt gagaagctgc 60 cacattcacg actttctggc tcctttacta aataaggatt ttcacaggac ccgtccaagc 120 caagccgatt tcaactcagc ctaaagacaa agccctcatt taaaattgtt ccgacgcgga 180 tgcgtgtgca cgcagtgcga cagatgtctg ttgcaaagtt ggctacttgg gtcataacca 240 acaagaaagc cctcgttcca acactgtggt gagtgttgtc gagggcgctt gacgagacga 300 cttggaaggc cgttacggca ggcgccgcgc ggttactact acaagtcgaa taatggtcat 360 ggtgtgtcat gctacacaca tcgagtttcc aattccacaa cgcacgaaaa ttcccacccc 420 caaaactccc ccacttcggt taaggaatca ggattctcac aaagttcagg caggctcccg 480 ctacttttca gcgctaatct tggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat 533 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr 1 5 ttg ctc tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta 581 Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val 10 15 20 25 gca att atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg 629 Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu 30 35 40 gcc atg cgt att atc aag cgg cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac 677 Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp 45 50 55 acc act aag aac cag ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg 725 Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala 60 65 70 caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt 773 Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe 75 80 85 ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct 821 Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala 90 95 100 105 gcc att ggc ctt ggt acg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga 869 Ala Ile Gly Leu Gly Thr Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly 110 115 120 ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgt 917 Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg 125 130 135 ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtc gaa ggc acc gtc att gag atc acc 965 Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr 140 145 150 atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc 1013 Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile 155 160 165 ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg 1061 Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser 170 175 180 185 cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc 1109 Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile 190 195 200 aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc 1157 Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly 205 210 215 cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca 1205 Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro 220 225 230 gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc 1253 Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val 235 240 245 acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc 1301 Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val 250 255 260 265 gaa cgc gcc atc cgc aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac 1349 Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr 270 275 280 ggc agc gca acc act aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt 1397 Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val 285 290 295 gag cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct 1445 Glu His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala 300 305 310 ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct 1493 Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala 315 320 325 gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat 1541 Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn 330 335 340 345 gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa 1589 Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu 350 355 360 ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc 1637 Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu 365 370 375 cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc 1685 Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile 380 385 390 ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt 1733 Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly 395 400 405 gcg ctg ctc ttg ctg tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt 1781 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser 410 415 420 425 gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc 1829 Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr 430 435 440 tca act gcg gtg acc acc tcc gaa act tcc gcg cca gta agc act tct 1877 Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Ser 445 450 455 tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct 1925 Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser 460 465 470 agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc 1973 Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro 475 480 485 cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag 2021 Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu 490 495 500 505 gaa acg act gcg tcg cag acg cag tct cca gca acc gcg gtt caa gag 2069 Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Thr Ala Val Gln Glu 510 515 520 aca gtt gcg ccg acg tcc acc cct taggacgctg attacagacg tgtcccattt 2123 Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro 525 ctttactact attggaaatt atgagttcag acgcagaaaa ggcatccgtg gagctttccg 2183 aaaaatttca cccagaacgc acccatattt tgggcgccgt tgtttttggc ctgatctcat 2243 tattagtcat cggcgcagcc cctcagtacc tgttttggct gctcgcgctc cctgtcatct 2303 tcggttactg ggttctaaaa tcatccacga tcgttgatga acagggcatc accgcaaact 2363 acgccttcaa gggcaaaaag gttgtggcct gggaagacct cgcaggaatc ggattcaagg 2423 gtgcccgca 2432 <210> 64 <211> 529 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 64 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Thr Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 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gtt 606 Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val 55 60 65 ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc 654 Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser 70 75 80 gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca 702 Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala 85 90 95 100 acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg 750 Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala 105 110 115 gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg 798 Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val 120 125 130 ggt gac tgg gtg cgt ttt gag ggc aac ggc atc gtt gtt gaa ggc acc 846 Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr 135 140 145 gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc acg att gca caa 894 Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln 150 155 160 gag acc gtg atc atc ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc 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act aca tcg gga acc ctc att 1278 Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ile 280 285 290 gat tcc tta cac gtt gcg cat gaa gag cca aag acc tcg ctt atc gac 1326 Asp Ser Leu His Val Ala His Glu Glu Pro Lys Thr Ser Leu Ile Asp 295 300 305 gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag gct gcg gcg acg 1374 Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu Ala Ala Ala Thr 310 315 320 gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca gac aat gca gac 1422 Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp 325 330 335 340 gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat 1470 Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp 345 350 355 gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa 1518 Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys 360 365 370 cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat 1566 Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn 375 380 385 cgg tgg cag aag atc ctg tcg atc ggc gga cgt gtc cgc atg agc acg 1614 Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr 390 395 400 tcc ctg ctg ttg ggt gcg ctc cta ttg ctg tca ctg ttt aag gtc atg 1662 Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met 405 410 415 420 act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca 1710 Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser 425 430 435 cca ggc act gcc acc tca act gcg gcg acc acc tcc gaa act tcc gcg 1758 Pro Gly Thr Ala Thr Ser Thr Ala Ala Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala 440 445 450 cca gta agc acg cct tcg atg aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc 1806 Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr 455 460 465 cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct 1854 Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro 470 475 480 gca acc gca acg ccg cag cga gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa 1902 Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu 485 490 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gcg acc aaa att cgc acg att gca caa 894 Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln 150 155 160 gag acc gtg atc atc ccc aac tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat 942 Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn 165 170 175 180 tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg 990 Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu 185 190 195 ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act 1038 Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr 200 205 210 cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa atc ctc ggt gaa 1086 Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu Ile Leu Gly Glu 215 220 225 ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca acg gtg gtc ggc 1134 Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro Thr Val Val Gly 230 235 240 atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa gtc acc gcc ggc 1182 Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln Val Thr Ala Gly 245 250 255 260 aat caa 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tgacgagacg acttggaagg ccgttacggc 360 aggcgccgcg cggttactac tacaagtcga ataatggtca tggtgtgtca tgctacacac 420 atcgagtttc caattccaca acgcacgaaa attcccaccc ccaaaactcc cccacttcgg 480 ttaaggaatc aggattctca caaagttcag gcaggctccc gctacttttc agcgctaatc 540 ttggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg 589 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu 1 5 10 tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc 637 Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val 15 20 25 30 ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc 685 Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile 35 40 45 aag cag cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag 733 Lys Gln Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln 50 55 60 ctc gcg ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt 781 Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe 65 70 75 ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg 829 Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala 80 85 90 ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt 877 Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly 95 100 105 110 gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg 925 Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr 115 120 125 gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc 973 Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly 130 135 140 atc gtt gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa 1021 Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys 145 150 155 att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg 1069 Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala 160 165 170 aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt 1117 Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val 175 180 185 190 att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg 1165 Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala 195 200 205 cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca 1213 Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala 210 215 220 ccg gaa atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca 1261 Pro Glu Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr 225 230 235 ccg cca acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc 1309 Pro Pro Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu 240 245 250 gtg caa gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc 1357 Val Gln Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg 255 260 265 270 aca gaa atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act 1405 Thr Glu Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr 275 280 285 aca tcg gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca 1453 Thr Ser Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro 290 295 300 aag acc tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag 1501 Lys Thr Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys 305 310 315 ccg gag gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac 1549 Pro Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp 320 325 330 gat gca gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag 1597 Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu 335 340 345 350 aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa 1645 Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu 355 360 365 ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc 1693 Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg 370 375 380 act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga 1741 Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly 385 390 395 cgt gtc cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg 1789 Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu 400 405 410 tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat tgg caa aac 1837 Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn 415 420 425 430 tcc agt gga tgg ctg tca tca agc act gcc acc tca act gcg gtg acc 1885 Ser Ser Gly Trp Leu Ser Ser Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr 435 440 445 acc tcc gaa act tcc gcg cca gca agc acg cct tcg atg aca gtg ccc 1933 Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro 450 455 460 act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct agc gtc gaa acg cag 1981 Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln 465 470 475 cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga gcc gac acc 2029 Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr 480 485 490 atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg act gca tcg 2077 Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser 495 500 505 510 cag acg cag tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc caa gaa aca 2125 Gln Thr Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val 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Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu 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atcaggattc tcacaaagtt caggcaggct cccgctactt 480 ttcagcgcta atcttggctc atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc 533 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu 1 5 10 tat tca ttg tgg aat tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att 581 Tyr Ser Leu Trp Asn Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile 15 20 25 atc ctg gtc ttg gcg ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg 629 Ile Leu Val Leu Ala Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met 30 35 40 cgt att atc aag cgc cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act 677 Arg Ile Ile Lys Arg Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr 45 50 55 aag aac cag ctc gcg ttc gcc ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att 725 Lys Asn Gln Leu Ala Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile 60 65 70 75 gtg gcg ttt ttc atg ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc 773 Val Ala Phe Phe Met Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe 80 85 90 tct ctc gcg ggc gct gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att 821 Ser Leu Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile 95 100 105 ggc ctt ggt gcg cag tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc 869 Gly Leu Gly Ala Gln Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe 110 115 120 atc ctg acg gaa aag caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgt ttt gag 917 Ile Leu Thr Glu Lys Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu 125 130 135 ggc aac ggc atc gtt gtc gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc 965 Gly Asn Gly Ile Val Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg 140 145 150 155 gcg acc aaa att cgc acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccc aac 1013 Ala Thr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn 160 165 170 tcc acg gcg aaa gtg tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg 1061 Ser Thr Ala Lys Val Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala 175 180 185 gtt gtc gtt att ccg atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat 1109 Val Val Val Ile Pro Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp 190 195 200 gtc atc gcg cgc tct gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag 1157 Val Ile Ala Arg Ser Glu Ala Ala Thr Arg 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Glu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser 320 325 330 tct aac gac gat gca gac aat gca gac gcc tcg gtg atc aat gca ggc 1541 Ser Asn Asp Asp Ala Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly 335 340 345 aat cca gag aag gaa ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc 1589 Asn Pro Glu Lys Glu Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser 350 355 360 agc gaa gaa ccg gaa gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc 1637 Ser Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly 365 370 375 ttc ttc cgc act gat tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg 1685 Phe Phe Arg Thr Asp Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser 380 385 390 395 ttt ggc gga cgt gtc cgc atg agc acg tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg 1733 Phe Gly Gly Arg Val Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu 400 405 410 ctc ttg ctg tca cta ttt aag gtc atg act gtg gaa cca agt gag aat 1781 Leu Leu Leu Ser Leu Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn 415 420 425 tgg caa aac tcc agt gga tgg ctg tca cca agc act gcc acc tca act 1829 Trp Gln Asn Ser Ser Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr 430 435 440 gcg gtg acc acc tcc gaa act tcc gcg cca gta agc acg cct tcg atg 1877 Ala Val Thr Thr Ser Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met 445 450 455 aca gtg ccc act acg gtg gag gag acc cca acg atg gaa tct aac gtc 1925 Thr Val Pro Thr Thr Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val 460 465 470 475 gaa acg cag cag gaa acc tca acc cct gca acc gca acg ccc cag cga 1973 Glu Thr Gln Gln Glu Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg 480 485 490 gcc gac acc atc gaa ccg acc gag gaa gcc acg tcg cag gag gaa acg 2021 Ala Asp Thr Ile Glu Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr 495 500 505 act gcg tcg cag acg cag tct cca gca gtg gaa gca cca acc gcg gtc 2069 Thr Ala Ser Gln Thr Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val 510 515 520 caa gag aca gtt gcg ccg acg tcc acc cct tag 2102 Gln Glu Thr Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro 525 530 <210> 84 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 84 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser 420 425 430 Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser 435 440 445 Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr 450 455 460 Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val Glu Thr Gln Gln Glu 465 470 475 480 Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu 485 490 495 Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr 500 505 510 Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala 515 520 525 Pro Thr Ser Thr Pro 530 <210> 85 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48), (275), (298), (343), (396), (438), (445), (454), (457), (474), (517)..(520) <223> Xaa = any amino acid <400> 85 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Xaa 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Xaa Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Xaa His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Ala Ser Xaa Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Xaa Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser 420 425 430 Gly Trp Leu Ser Pro Xaa Thr Ala Thr Ser Thr Ala Xaa Thr Thr Ser 435 440 445 Glu Thr Ser Ala Pro Xaa Ser Thr Xaa Ser Met Thr Val Pro Thr Thr 450 455 460 Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Xaa Val Glu Thr Gln Gln Glu 465 470 475 480 Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu 485 490 495 Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr 500 505 510 Gln Ser Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala 515 520 525 Pro Thr Ser Thr Pro 530 <210> 86 <211> 1550 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (585)..(1121) <400> 86 gcattgatgt tgaggtccac gacaatgcag atgcttacat ccgcaatggt ggcgaaactg 60 tcggcatgct ggtttctgaa ggtgcagaga agattgccag cggcagcggc gctgtcatcc 120 cggacgcatc cgcagagttt tccgcacgcg tgttgtctgc cgagtaccgc accaacactc 180 ttaccggcca gcgttttatc cacgcaacag ttgatggcct cttcgctttt gatgtgtgcc 240 ttcctgatgc accagaacta cctgcccgtg acagcgtgtt gtctggcaaa gtcatgctga 300 ctgctgccgt tatccccact gaggtcaccg gctgcggtgg ctccggtggc ggctgtggct 360 caggtagctg tggctgcggc ggacactaaa attctgcaca attttttaag aggaccccag 420 ctccggggtc cttttccatt ttttacccag tacttgaaac gtgatatatg tctattctga 480 aaatcatcgc atagaatact ggtgcaatcg tttacgttcg ctattaatgt gacacgtata 540 agccgacact tttaacgaag cgcagaagga gtgagagcaa gaaa atg gga gaa caa 596 Met Gly Glu Gln 1 ctt ccg ttt gct aat ggt tca cgc tcc aac aaa ctg ccg ctc atc gtc 644 Leu Pro Phe Ala Asn Gly Ser Arg Ser Asn Lys Leu Pro Leu Ile Val 5 10 15 20 atc ggt ttg tgc tgc ata atg ctg atc ctg tgg ctt aaa ctt ccc ggc 692 Ile Gly Leu Cys Cys Ile Met Leu Ile Leu Trp Leu Lys Leu Pro Gly 25 30 35 gta ctg ctt gcc acc atc att ggg gtt gcc acg gtg agt gtg atg cgg 740 Val Leu Leu Ala Thr Ile Ile Gly Val Ala Thr Val Ser Val Met Arg 40 45 50 atg cgc acc tcc acc cca gaa act gcc tcg ctg gtt act tct att cgg 788 Met Arg Thr Ser Thr Pro Glu Thr Ala Ser Leu Val Thr Ser Ile Arg 55 60 65 ctg tct gcg gaa gat att tcc gat gtg caa cat gag tgg cag cag ttt 836 Leu Ser Ala Glu Asp Ile Ser Asp Val Gln His Glu Trp Gln Gln Phe 70 75 80 ttg acc tcc ccc gag gcc gat gcg ctg gct gat cgc acg ctt gtc cgt 884 Leu Thr Ser Pro Glu Ala Asp Ala Leu Ala Asp Arg Thr Leu Val Arg 85 90 95 100 ccc gca ctg gcg gat cca gat tgt ggc gat aag gct atc gag aaa ttt 932 Pro Ala Leu Ala Asp Pro Asp Cys Gly Asp Lys Ala Ile Glu Lys Phe 105 110 115 cat tat gaa atc agc aat gcc aat cgc ttc ttg ggc agg ttg gac gct 980 His Tyr Glu Ile Ser Asn Ala Asn Arg Phe Leu Gly Arg Leu Asp Ala 120 125 130 cgt ctg caa caa aac ctc gtg gtc agt gag cta gaa aca ctt ctc aaa 1028 Arg Leu Gln Gln Asn Leu Val Val Ser Glu Leu Glu Thr Leu Leu Lys 135 140 145 gta acg gac gag cgc gca cta gag ctg cgg gaa acg tgg ctg gat gcg 1076 Val Thr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Leu Arg Glu Thr Trp Leu Asp Ala 150 155 160 cgt aaa gcg gcc cag aaa ctt ggg ccg aac tac aat cgc gaa tct 1121 Arg Lys Ala Ala Gln Lys Leu Gly Pro Asn Tyr Asn Arg Glu Ser 165 170 175 tagatctgca cctcaccgag tgcgatgatg gcgcttgggc cggtgagtgt ggagccgtcg 1181 tcaaatatct ggacttctac ttccccacct ggaacgcaca ctttaactgt gccttctccc 1241 aatccagcat cagctaaagc agcacacgct gcagcaacgg ttcccgtgcc acaggagcgg 1301 gtttcgccca ctccgcgttc ccacacgcgc atcgatactg cgtcatcttc taattctgtg 1361 acgatttcta cgttcacacc gtgggggaag aattcctgat caaacgtggg tgcgcgcagt 1421 tccatatcgg caagagccga cgcacttaag cccggcacaa cgcacgctag gtgtgggtta 1481 cccatatcaa cgccaaggcc agcgaatact tggccgttga tgtcgcaggt ggataatccc 1541 gtgacgtca 1550 <210> 87 <211> 179 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 87 Met Gly Glu Gln Leu Pro Phe Ala Asn Gly Ser Arg Ser Asn Lys Leu 1 5 10 15 Pro Leu Ile Val Ile Gly Leu Cys Cys Ile Met Leu Ile Leu Trp Leu 20 25 30 Lys Leu Pro Gly Val Leu Leu Ala Thr Ile Ile Gly Val Ala Thr Val 35 40 45 Ser Val Met Arg Met Arg Thr Ser Thr Pro Glu Thr Ala Ser Leu Val 50 55 60 Thr Ser Ile Arg Leu Ser Ala Glu Asp Ile Ser Asp Val Gln His Glu 65 70 75 80 Trp Gln Gln Phe Leu Thr Ser Pro Glu Ala Asp Ala Leu Ala Asp Arg 85 90 95 Thr Leu Val Arg Pro Ala Leu Ala Asp Pro Asp Cys Gly Asp Lys Ala 100 105 110 Ile Glu Lys Phe His Tyr Glu Ile Ser Asn Ala Asn Arg Phe Leu Gly 115 120 125 Arg Leu Asp Ala Arg Leu Gln Gln Asn Leu Val Val Ser Glu Leu Glu 130 135 140 Thr Leu Leu Lys Val Thr Asp Glu Arg Ala Leu Glu Leu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Trp Leu Asp Ala Arg Lys Ala Ala Gln Lys Leu Gly Pro Asn Tyr Asn 165 170 175 Arg Glu Ser <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 5'-primer <400> 88 ggagatctgc attgatgttg aggtccac 28 <210> 89 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 3'-primer <400> 89 cggtgaggtg cagatctatt ctcccatttt cttgctctc 39 <210> 90 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 5'-primer <400> 90 gagagcaaga aaatgggaga atagatctgc acctcaccg 39 <210> 91 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 3'-primer <400> 91 ggagatcttg acgtcacggg attatcca 28

Claims (29)

  1. yggB 유전자의 사용으로 변형시켜 비변형 균주에 비해 향상된 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네형 세균.
  2. 제1항에 있어서, yggB 유전자가,
    (a) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번을 포함하는 DNA,
    (b) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1437번 내지 3035번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
    (c) 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번을 포함하는 DNA,
    (d) 서열번호 61의 뉴클레오타이드 507번 내지 2093번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
    (e) 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번을 포함하는 DNA,
    (f) 서열번호 67의 뉴클레오타이드 403번 내지 2001번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L- 글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA,
    (g) 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번을 포함하는 DNA, 및
    (h) 서열번호 83의 뉴클레오타이드 501번 내지 2099번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는 DNA
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 코리네형 세균.
  3. 제1항에 있어서, yggB 유전자가,
    (A) 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및
    (B) 당해 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는, 서열번호 6, 62, 68, 84 및 85로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열내의 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 코리네형 세균.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, yggB 유전자의 발현이 비변형 균주에 비해 향상되도록 변형된 코리네형 세균.
  5. 제4항에 있어서, yggB 유전자의 카피 수를 증가시키거나 yggB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 yggB 유전자의 발현이 향상된 코리네형 세균.
  6. 제1항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가 도입되어 변형된 코리네형 세균.
  7. 제6항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가, 서열번호 6, 68, 84 또는 85의 아미노산 419번 내지 533번, 또는 서열번호 62의 아미노산 419번 내지 529번을 암호화하는 영역에 돌연변이를 갖는 코리네형 세균.
  8. 제7항에 있어서, 돌연변이가 상기 영역의 결실인 코리네형 세균.
  9. 제7항에 있어서, 돌연변이가 삽입 서열 또는 트랜스포존의 상기 영역으로의 삽입인 코리네형 세균.
  10. 제7항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가 상기 영역에 있는 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는 코리네형 세균.
  11. 제7항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 아미노산 서열에서 424번 위치의 프롤린 및/또는 437번 위치의 프롤린을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는 코리네형 세균.
  12. 제6항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가 yggB 단백질의 막관통 암호화 영역에 돌연변이를 갖는 코리네형 세균.
  13. 제12항에 있어서, 막관통 암호화 영역이 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 아미노산 1번 내지 23번, 아미노산 25번 내지 47번, 아미노산 62번 내지 84번, 아미노산 86번 내지 108번, 및 아미노산 110번 내지 132번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 코리네형 세균.
  14. 제12항에 있어서, 돌연변이가 프레임 이동을 유발하지 않으면서 도입된 코리네형 세균.
  15. 제12항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 100번 위치의 알라닌 및/또는 111번 위치의 알라닌을 다른 아미노산으로 치환시키는 돌연변이를 갖는 코리네형 세균.
  16. 제12항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자가 서열번호 6, 62, 68, 84 또는 85의 14번 위치의 류신과 15번 위치의 트립토판 사이에 하나 이상의 아미노산을 삽입시키는 돌연변이를 갖는 코리네형 세균.
  17. 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 균주의 L-글루탐산 유사체에 대한 내성이, 돌연변이형 yggB 유전자가 도입되어 증가된 코리네형 세균.
  18. 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자가 불활성화되도록 추가로 변형된 코리네형 세균.
  19. 제18항에 있어서, 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 유전자가 symA 유전자이고, symA 유전자가,
    (a) 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번을 포함하는 DNA, 및
    (b) 서열번호 86의 뉴클레오타이드 585번 내지 1121번에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 코리네형 세균에서 돌연변이형 yggB 유전자의 기능을 억제하는 DNA
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 코리네형 세균.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 코리네형 세균.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 코리네 형 세균.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따른 코리네형 세균을 배지 또는 세균 안에 L-글루탐산을 축적하도록 배지에서 배양하는 단계 및
    배지 또는 세균으로부터 L-글루탐산을 수거하는 단계
    를 포함하는, L-글루탐산의 제조방법.
  23. (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (b) 서열번호 8과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
    (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (d) 서열번호 20과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
    (e) 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (f) 서열번호 22와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
    (g) 서열번호 24의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (h) 서열번호 24와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
    (i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (j) 서열번호 64와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
    (k) 서열번호 70의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (l) 서열번호 70과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자,
    (m) 서열번호 74의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자,
    (n) 서열번호 74와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하고, 유전자가 코리네형 세균 안으로 도입되었을 때 과량의 비오틴의 존재하에서 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산능을 향상시키는 기능을 갖는 유전자
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이형 yggB 유전자.
  24. a) α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자에 결함이 있는 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계 및
    b) 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계
    를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법.
  25. a) 시험관내에서 무작위로 돌연변이가 도입된 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계 및
    b) 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계
    를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법.
  26. a) 염색체상에 무작위로 도입된 전위요소(transposable element)를 갖는 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계 및
    b) 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계
    를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법.
  27. a) L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에 코리네형 세균을 접종하는 단계 및
    b) L-글루탐산 유사체를 함유하는 배지에서 성장하는 균주를 선별하는 단계
    를 포함하는, 돌연변이형 yggB 유전자를 갖는 코리네형 세균의 제조방법.
  28. a) α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자에 결함이 있는 코리네형 세균을 과량의 비오틴을 함유하는 배지에 접종하는 단계 및
    b) 배지에 L-글루탐산을 축적할 수 있는 균주를 선별하는 단계
    를 포함하는, 제6항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 코리네형 세균의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 배지가 30㎍/l 이상의 비오틴을 함유하는, 코리네형 세균의 제조방법.
KR1020077017511A 2004-12-28 2005-12-28 Ｌ-글루탐산 생산 미생물 및 ｌ-글루탐산의 제조방법 KR100948246B1 (ko)

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