CN105441473A - 一种谷氨酸生产菌株及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种谷氨酸生产菌株的制备方法，该方法包括将生产谷氨酸的野生菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列。本发明的方法能够在不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下，提高谷氨酸的产量，制得产生谷氨酸能力较强的谷氨酸生产菌株。

Description

一种谷氨酸生产菌株及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种谷氨酸生产菌株的制备方法，以及该方法制备的谷氨酸生产菌株。
背景技术
工业生产和学术研究一般使用具有产生L-谷氨酸能力的棒状杆菌属(Corynebacteriumspp.)或短杆菌属(Brevibacteriumspp.)细菌(现在一般认为短杆菌属细菌也属于棒状杆菌属)发酵产生L-谷氨酸。为了提高这些产生L-谷氨酸细菌的生产能力，使用从自然界分离的细菌菌株，或它们的人工突变菌株或通过基因重组修饰的菌株。
在谷氨酸代谢通路上的某些环节中的限速步骤中，对相关基因及其产物进行过量表达，从而提高谷氨酸合成途径上某些关键酶在生产菌株胞内的数量和/或活力，是提高谷氨酸产量的常用策略；同样，在合成途径某些节点上的酶会分散主代谢途径上的物质和/或能量流，或者产生某些不需要的副产物。在这种情况下，通过降低代谢通路节点上对主代谢流有分流作用的内源酶的数量和/或活力，从而增加主代谢通路上的代谢能力并提高产物产量，也是谷氨酸菌株代谢工程和遗传育种的重要手段。
上调基因表达水平典型的方法主要是向宿主菌转化携带编码靶基因核酸序列且可自主复制的质粒载体，这种方法常常存在两个问题：一是胞内目的基因拷贝数过多，造成该基因的超剂量表达，而这种超剂量表达的目的蛋白会造成整个胞内的代谢失衡，反而降低宿主菌的生长和生产速率；二是许多表达质粒载体需要诱导型启动子，这在工业生产中会增加额外成本。其他还包括在基因组上增加基因的拷贝数量，在合适的基因组位置上插入强启动子以调节基因拷贝在基因组上的转录强度，和通过优化核糖体结合位点(RBS)序列，而这些方法的操作常常比较复杂。
下调基因表达水平典型的方法主要是基因敲除、反义技术、RNAi等基因操作技术，但是，这些技术往往造成在敲除靶基因的同时完全丧失某种内源酶活性，影响细菌某一方面的生理功能甚至影响细菌的生长、增殖。在仅需要在一定程度上降低某种酶蛋白数量的应用情况下，以上基因下调表达水平技术将会出现问题，因此，可以通过将靶基因野生型的启动子替换成较弱启动子的方式来降低酶蛋白表达量，但是寻找一种比靶基因的野生型启动子弱的突变启动子的实验操作比较麻烦，而且费时费力。
因此，目前需要一种简单的、适度的、精细的靶基因调控方法，该方法能够在不改变基因组拷贝数且不对谷氨酸生产菌株生长及代谢产生显著影响的基础上提高谷氨酸的产量。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中提高谷氨酸表达量会导致基因组拷贝数改变，且方法复杂、不易操作和控制的缺陷，提供一种谷氨酸生产菌株的制备方法，以及该方法制备的谷氨酸生产菌株。
本发明的发明人在研究中发现，通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列，能够在不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下提高谷氨酸的表达量，且方法简单、易于操作和控制。
因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种谷氨酸生产菌株的制备方法，该方法包括将生产谷氨酸的野生菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列。
另一方面，本发明还提供了由上述方法制备的谷氨酸生产菌株。
本发明中，利用密码子的简并性和生产谷氨酸的野生菌株对不同密码子的偏好性，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，能够在不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下，提高谷氨酸的产量，制得产生谷氨酸能力较强的谷氨酸生产菌株。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种谷氨酸生产菌株的制备方法，该方法包括将生产谷氨酸的野生菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列。
本领域的技术人员应该理解的是，为了便于操作，通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，具体的方法是将促进谷氨酸产生的基因的有义链上的碱基进行替换，使得该有义链转录得到的mRNA上的密码子至少部分为偏好性高的密码子；通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，具体的方法是将抑制谷氨酸产生的基因的有义链上的碱基进行替换，使得该有义链转录得到的mRNA上的密码子至少部分为偏好性低的密码子。在此，有义链是指DNA双链在转录过程中与转录形成的mRNA序列相同(T对应U)的那条单链叫做有义链。
根据本发明所述的方法，其中，对进行密码子偏好性改造的量没有特别的限定，例如可以为：以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子的0.01-50％替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子的0.01-50％替换为偏好性低的密码子。
本发明的发明人在研究中发现，当以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20％密码子替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将该抑制谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20％密码子替换为偏好性低的密码子时，能够进一步提高谷氨酸的产量。在此，“起始密码子”指的是基因的有义链上的起始密码子序列。在本发明中，从起始密码子开始均指包括该起始密码子。
根据本发明所述的方法，其中，谷氨酸代谢通路上的酶可以为任何能够影响谷氨酸表达量变化的酶，例如，促进谷氨酸产生的酶可以为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、柠檬酸合酶和机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白(NCgl1221)中的至少一种，抑制谷氨酸产生的酶可以为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基(DtsR1)、α-酮戊二酸脱氢酶系、乳酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶中的至少一种。
更优选地，当促进谷氨酸产生的酶为机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白(NCgl1221)时，能够进一步提高谷氨酸的产量；当抑制谷氨酸产生的酶为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基(DtsR1)时，能够进一步提高谷氨酸的产量。
根据本发明所述的方法，其中，所述生产谷氨酸的野生菌株可以为本领域常规的用于生产谷氨酸的野生菌株，例如可以为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、高效棒状杆菌(C.efficiens)和黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)中的至少一种，优选为谷氨酸棒状杆菌，能够进一步提高谷氨酸的产量。
根据本发明所述的方法，其中，对于上述生产谷氨酸的野生菌株而言，偏好性高的密码子可以包括：起始密码子AUG、苯丙氨酸密码子UUC、亮氨酸密码子CUG或CUC、异亮氨酸密码子AUC、缬氨酸密码子GUU或GUC、酪氨酸密码子UAC、组氨酸密码子CAC、谷氨酰胺密码子CAG、天冬酰胺密码子AAC、赖氨酸密码子AAG、天冬氨酸密码子GAU、谷氨酸密码子GAA、丝氨酸密码子UCC或UCU、脯氨酸密码子CCA或CCU、苏氨酸密码子ACC或ACU、丙氨酸密码子GCA或GCU、半胱氨酸密码子UGC、精氨酸密码子CGC或CGU；所述偏好性低的密码子可以包括：起始密码子UUG或GUG、苯丙氨酸密码子UUU、亮氨酸密码子UUA或CUA、异亮氨酸密码子AUA、缬氨酸密码子GUA、酪氨酸密码子UAU、组氨酸密码子CAU、谷氨酰胺密码子CAA、天冬酰胺密码子AAU、赖氨酸密码子AAA、天冬氨酸密码子GAC、谷氨酸密码子GAG、丝氨酸密码子AGC或AGU、脯氨酸密码子CCC或CCG、苏氨酸密码子ACG或ACA、丙氨酸密码子GCG或GCC、半胱氨酸密码子UGU、精氨酸密码子AGG或AGA。
本领域的技术人员应该理解的是，该方法还可以包括先获得需要进行密码子改造的靶基因的初始同源序列，具体方法可以为：根据数据库上公布的生产谷氨酸的野生菌株的谷氨酸代谢通路上靶基因的基因序列，或者利用PCR的方法从生产谷氨酸的野生菌株的基因组上扩增靶基因并进行测序，从而获得靶基因的初始同源序列。在此，靶基因的初始同源序列是指含有上述编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因的序列。
根据本发明所述的方法，其中，该方法还可以包括：将经密码子偏好性改造的基因序列用于构建具有经密码子偏好性改造的基因的质粒，将所述质粒转化生产谷氨酸的野生菌株的感受态细胞，然后进行菌株筛选，得到谷氨酸生产菌株。
本发明中，将经密码子偏好性改造的基因序列用于构建具有经密码子偏好性改造的基因的质粒的方法可以为本领域的常规方法，例如可以为：(1)在经密码子偏好性改造的基因序列的起始密码子的上游添加该基因上游的初始同源序列1000bp，并在该1000bp的初始同源序列前添加XbaI限制性内切酶识别序列(TCTAGA)，在该XbaI限制性内切酶识别序列前添加保护碱基(GCG)；从起始密码子开始的已进行密码子替换的DNA片段的下游取1000bp的该基因的序列，在该1000bp的基因序列后添加HindIII限制性内切酶识别序列(AAGCTT)，在该HindIII限制性内切酶识别序列后添加保护碱基(CGC)，从而获得待合成的基因序列；(2)待合成的基因序列；(3)采用XbaI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶将上述已合成的基因序列进行双酶切，并将质粒采用同样的酶和方法也进行双酶切，然后将上述经过双酶切得到的两类产物进行连接反应，构建得到具有经密码子偏好性改造的基因的质粒。其中，未构建前的质粒可以为pK18mobsacB、pK19mobsacB和pDXW-8中的至少一种，优选为pK18mobsacB。
本发明中，将上述构建的质粒转化生产谷氨酸的野生菌株的感受态细胞，的方法可以为本领域常规的转化方法，例如可以为电击转化或化学转化法。其中，感受态细胞可以商购或制备。
当感受态细胞为制备的感受态细胞时，其制备方法可以为本领域常规的制备感受态细胞的方法，例如可以为：a、挑取在固体培养基平板上生长了1天的生产谷氨酸的野生菌株的单菌落接种到含5-10mL正常液体培养基的大试管中，30-32℃培养过夜；b、取400-450μL种子液转接到30-35mL制备感受态所需液体培养基中，在30-32℃下150-160rpm的转速下振荡培养，至OD600达到0.8-0.9时(该过程需要3-5h)，在冷冻离心机中4℃下，8000rpm收集细胞；c、用10％(v/v)的甘油洗涤细胞3-4遍，最后将细胞悬浮在0.5mL10％的甘油中；d、将制得的感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使用。
本发明中，电击转化生产谷氨酸的野生菌株的感受态细胞的方法可以为本领域常规的电击转化的方法，例如可以为：a、取50-60μL感受态细胞与5-6μL已构建完成的具有经密码子偏好性改造的基因的质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；b、将电转杯置于冰浴上20min；c、冰浴后在电转参数为25μF、2.5kV、电击时间为5-8ms的条件下进行电击转化；d、电转化结束后，立即加入600-800μL的正常液体培养基；e、46-50℃水浴中热击6-7min；f、热击结束后将电转化后细胞在30-32℃条件下温育2-3h；g、5000rpm离心2min收集细胞，除去多余上清，留100-200μL上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂布。
本发明中，菌株筛选方法可以本领域常规的筛选方法，例如可以为：a、将上述重悬细胞均匀涂布在含有25-26μg/mL抗生素的LB固体培养基平板上，30-32℃条件下静置培养24-48h，待长出菌落后挑取具有抗性的菌落至含有5mLLB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；b、吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基平板上，能够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞，将该菌株细胞进行基因PCR扩增实验；c、将扩增实验显阳性的菌株进行液体扩大培养，并利用细菌质粒提取试剂盒对含有经密码子偏好性改造的基因的质粒的谷氨酸生产野生菌株进行质粒提取，然后以该提取的质粒为模板进行PCR扩增；d、将步骤c中PCR扩增产物序列送测序公司进行测定，若测序结果与上述待合成的序列相同，则证明经密码子偏好性改造的基因的质粒已导入到了的生产谷氨酸的野生菌株中。
本发明中，产生谷氨酸的能力是指当在培养基中培养利用本发明所述方法制得的谷氨酸生产菌株时，在培养基或细胞中积累并向胞外运输L-谷氨酸的能力。
本发明中，采用制得的谷氨酸生产菌株进行发酵培养来判断该菌株产生谷氨酸的能力。其中，发酵培养的方法可以为本领域常规的用于谷氨酸生产的发酵方法。例如发酵培养的方法可以为：分别将冻存于-80℃冰箱中的甘油冻存管中谷氨酸生产菌株接种于谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，然后过夜培养，将过夜培养液进行扩大培养，制得种子液；以10体积％的接种量分别将上述种子液接种至装有2-3L谷氨酸生产发酵培养基的5L全自动发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为30-32℃，初始通气量为1-2L/min，初始搅拌速度为500-600rpm，发酵过程中相关参数控制可以如下：温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为30-32℃，并且每间隔3-5h使发酵温度提高0.5℃；溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使发酵菌种在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5％-10％，而在产酸旺盛的对数生长期溶氧浓度控制在20％-25％；pH：发酵过程中自动流加25重量％的氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2；泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况流加15-25％(w/v)浓度的泡敌进行消泡；补料：当残糖含量降至1％时，采用流加40-60％(w/v)浓度葡萄糖溶液进行补料。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
在以下实施例和对比例中所涉及的培养基的种类和组成如下：
(1)LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl；LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，15g/L琼脂；
(2)谷氨酸棒杆菌液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L葡萄糖；谷氨酸棒杆菌固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L葡萄糖，15g/L琼脂；
(3)制备谷氨酸棒杆菌感受态所需的培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L葡萄糖，40g/L甘氨酸；
(4)谷氨酸生产种子培养基：26g/L葡萄糖，2.8g/L玉米浆，5.6g/L尿素，1.6g/LK2HPO4·3H2O，0.5g/LMgSO4·7H2O，pH＝7.1±0.1；
(5)谷氨酸生产发酵培养基：140g/L葡萄糖，3.0g/L玉米浆，2.0g/L糖蜜，2.0g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/LKCl，0.6g/LMgSO4·7H2O，2mg/LMnSO4·H2O，2mg/LFeSO4·7H2O，0.2mg/L维生素B1，pH＝7.1±0.1。
在以下实施例和对比例中，pK18mobsacB质粒购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，货号为SMD1168H；谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，货号为CICC20213；谷氨酸棒杆菌野生菌株S9114购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，货号为CICC20935。双酶切试剂为购自天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒，连接反应试剂为购自天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒。
所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1。
表1
引物 序列
dtsR1*F： CCTACCGCTACGATTTCAA(SEQ ID No：9)
dtsR1*R TTCTTGTGTTTGAGCAGGC(SEQ ID No：10)
ncgl1221*F GCGTACCCATTCAATATATGCT(SEQ ID No：11)
ncgl1221*R GTCATTCGTGCGGAAGCTAC(SEQ ID No：12)
实施例1
本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
(1)在GenBank数据库上查找已公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032野生菌株的乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基基因dtsR1序列(GeneID：3345446)(SEQIDNo：1)的同源序列；
(2)对上述dtsR1基因序列(SEQIDNo：1)进行密码子偏好性改造，具体步骤为：将dtsR1基因序列的有义链的从起始密码子开始的前180bp(相当于60个密码子)进行替换，使得该基因有义链转录得到的mRNA上的前60个密码子均为偏好性低的密码子，从而得到经密码子偏好性改造的基因序列dtsR1*(SEQIDNo：2)；
(3)将基因序列dtsR1*的起始密码子的上游添加该基因上游的初始同源序列1000bp，并在该1000bp的初始同源序列前添加XbaI限制性内切酶识别序列(TCTAGA)，在该XbaI限制性内切酶识别序列前添加保护碱基(GCG)；从dtsR1*的起始密码子开始的已替换180bp(相当于60个密码子)的DNA片段的下游取1000bp的dtsR1*基因序列，在1000bp的dtsR1*基因序列后添加HindIII限制性内切酶识别序列(AAGCTT)，在该HindIII限制性内切酶识别序列后添加保护碱基(CGC)，获得待合成的ΔdtsR1::dtsR1*基因序列(SEQIDNo：3)；
(4)对ΔdtsR1::dtsR1*基因序列进行人工合成；
(5)对合成的ΔdtsR1::dtsR1*基因序列进行XbaI和HindIII双酶切，分别切除5'端6bp和3'端6bp序列，形成两端带有XbaI和HindIII酶切位点粘性末端的线性DNA序列ΔdtsR1::dtsR1*-；对pK18mobsacB质粒进行XbaI和HindIII双酶切，使pK18mobsacB形成两端带有XbaI和HindIII酶切位点粘性末端的线性DNA质粒载体pK18mobsacB-，将带有XbaI和HindIII酶切位点粘性末端的线性DNA序列ΔdtsR1::dtsR1*-与pK18mobsacB-质粒进行连接反应，得到pK18mobsacB-ΔdtsR1::dtsR1*质粒；
其中，对合成的ΔdtsR1::dtsR1*基因序列进行XbaI和HindIII双酶切的体系为：XbaI，1μL；HindIII，1μL；10×MBuffer，2μL；ΔdtsR1::dtsR1*DNA，≤1μg；ddH2O2加至反应体系为20μL。反应过程为将装载上述20μL反应体系的EP管，置于37℃水浴锅中进行酶切1h。
对pK18mobsacB质粒进行XbaI和HindIII双酶切的体系为：XbaI，1μL；HindIII，1μL；10×MBuffer，2μL；pK18mobsacB质粒，≤1μg；ddH2O2加至反应体系为20μL。反应过程为将装载上述20μL反应体系的EP管，置于37℃水浴锅中进行酶切1h。
连接反应的体系为：ΔdtsR1::dtsR1*DNA，7μL；pK18mobsacB，1μL；10×T4DNALigationBuffer，1μL；T4DNALigase，1μL，过程为在16℃下连接过夜。
(6)采用电击转化法将pK18mobsacB-ΔdtsR1::dtsR1*质粒导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞中，然后进行菌株筛选。
制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞的方法为：a、挑取在谷氨酸棒杆菌固体培养基上生长了1天的谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032的单菌落接种到含5mL谷氨酸棒杆菌液体培养基的大试管中，30℃培养过夜；b、取400μL种子液转接到30mL制备谷氨酸棒杆菌感受态所需的液体培养基中，在30℃下150rpm的转速下振荡培养，至OD600达到0.8时(该过程需要3-5h)，在冷冻离心机中4℃下，8000rpm收集细胞；c、用10％(v/v)的甘油洗涤细胞3-4遍，最后将细胞悬浮在0.5mL10％的甘油中；d、将制得的谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使用。
电击转化法的具体过程为：a、取50μL谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞与5μLpK18mobsacB-ΔdtsR1::dtsR1*质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；b、将电转杯置于冰浴上20min；c、冰浴后在电转参数为25μF、2.5kV、电击时间为5ms的条件下进行电击转化；d、电转化结束后，立即加入600μL的正常液体培养基；e、46℃水浴中热击6min；f、热击结束后将电转化后细胞在30℃条件下温育2h；g、5000rpm离心2min收集细胞，除去多余上清，留100μL上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂布。
菌株筛选方法为：a、将上述重悬细胞均匀涂布在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，30℃条件下静置培养24h，待长出菌落后挑取具有卡那霉素抗性的菌落至含有25μg/mL卡那霉素的5mLLB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；b、吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基上，能够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞，挑取具有双重抗性的菌株细胞的单克隆于10mL的液体培养基中，在30℃条件下180rpm振荡培养12h后备用，采用表1中的引物对过夜菌液进行基因PCR扩增实验；c、将扩增实验显阳性的菌株进行液体扩大培养，以该扩大培养的菌液为模板进行PCR扩增实验；d、将步骤c中PCR扩增产物序列送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，若测序结果与dtsR1*基因序列相同，则证明pK18mobsacB-ΔdtsR1::dtsR1*质粒已导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中，得到了谷氨酸突变菌株ATCC13032-pK18mobsacB-ΔdtsR1::dtsR1*，将该菌株编号为A1。
其中，步骤b和c中的PCR扩增实验的体系为：2×PrimeSTARMaxPremix，25μL；dtsR1*F，0.5μL；dtsR1*R，0.5μL；菌液，10μL；ddH2O，14μL；总体系50μL；PCR扩增条件为：94℃×3min；94℃×30s；58℃×30s；72℃×45s×30个循环；72℃×5min；12℃×∞。
实施例2
本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
按照实施例1的方法制备谷氨酸生产菌株，不同的是，步骤(2)中将dtsR1基因序列的有义链的起始密码子ATG替换为偏好性低的密码子GTG，将该有义链中间第274bp到279bp(相当于2个密码子)进行替换，使得该基因有义链转录得到的mRNA上中间位置的2个密码子为偏好性低的密码子，从而得到经密码子偏好性改造的基因序列dtsR1#(SEQIDNo：4)，制得谷氨酸突变菌株ATCC13032-pK18mobsacB-ΔdtsR1::dtsR1#，将该菌株编号为A2。
对比例1
按照实施例1的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，然后将pK18mobsacB质粒采用实施例1的方式电击转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，得到已导入空质粒pK18mobsacB的谷氨酸菌株，将该菌株编号为D1。
实施例3
本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
(1)在GenBank数据库上查找已公布的谷氨酸棒杆菌S9114菌株野生菌株的机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白基因ncgl1221序列(GeneID：AFYA01000002.1)(SEQIDNo：5)的同源序列；
(2)对上述ncgl1221基因序列(SEQIDNo：5)进行密码子偏好性改造，具体步骤为：将ncgl1221基因序列的有义链的从起始密码子开始的前129bp(相当于43个密码子)进行替换，使得该基因有义链转录得到的mRNA上的前43个密码子均为偏好性高的密码子，从而得到经密码子偏好性改造的基因序列ncgl1221*(SEQIDNo：6)；
(3)将基因序列ncgl1221*的起始密码子的上游添加该基因上游的初始同源序列1000bp，并在该1000bp的初始同源序列前添加XbaI限制性内切酶识别序列(TCTAGA)，在该XbaI限制性内切酶识别序列前添加保护碱基(GCG)；从ncgl1221*的起始密码子开始的已替换129bp(相当于43个密码子)的DNA片段的下游取1000bp的ncgl1221*基因序列，在1000bp的ncgl1221*基因序列后添加HindIII限制性内切酶识别序列(AAGCTT)，在该HindIII限制性内切酶识别序列后添加保护碱基(CGC)，获得待合成的Δncgl1221::ncgl1221*基因序列(SEQIDNo：7)；
(4)对Δncgl1221::ncgl1221*基因序列进行人工合成；
(5)对合成的Δncgl1221::ncgl1221*基因序列进行XbaI和HindIII双酶切，分别切除5'端6bp和3'端6bp序列，形成两端带有XbaI和HindIII酶切位点粘性末端的线性DNA序列Δncgl1221::ncgl1221*-；对pK18mobsacB质粒进行XbaI和HindIII双酶切，使pK18mobsacB形成两端带有XbaI和HindIII酶切位点粘性末端的线性DNA质粒载体pK18mobsacB-，将带有XbaI和HindIII酶切位点粘性末端的线性DNA序列Δncgl1221::ncgl1221*-与pK18mobsacB-质粒进行连接反应，得到pK18mobsacB-Δncgl1221::ncgl1221*质粒；
其中，对合成的Δncgl1221::ncgl1221*基因序列进行XbaI和HindIII双酶切的体系为：XbaI，1μL；HindIII，1μL；10×MBuffer，2μL；Δncgl1221::ncgl1221*DNA，≤1μg；ddH2O2加至反应体系为20μL。反应过程为将装载上述20μL反应体系的EP管，置于37℃水浴锅中进行酶切1h。
对pK18mobsacB质粒进行XbaI和HindIII双酶切的体系为：XbaI，1μL；HindIII，1μL；10×MBuffer，2μL；pK18mobsacB质粒，≤1μg；ddH2O2加至反应体系为20μL。反应过程为将装载上述20μL反应体系的EP管，置于37℃水浴锅中进行酶切1h。
连接反应的体系为：Δncgl1221::ncgl1221*DNA，7μL；pK18mobsacB，1μL；10×T4DNALigationBuffer，1μL；T4DNALigase，1μL，过程为在16℃下连接过夜。
(6)采用电击转化法将pK18mobsacB-Δncgl1221::ncgl1221*质粒导入到谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞中，然后进行菌株筛选。
制备谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞的方法为：a、挑取在谷氨酸棒杆菌固体培养基上生长了1天的谷氨酸棒杆菌野生菌株S9114的单菌落接种到含6mL谷氨酸棒杆菌液体培养基的大试管中，32℃培养过夜；b、取400μL种子液转接到35mL制备谷氨酸棒杆菌感受态所需的液体培养基中，在32℃下160rpm的转速下振荡培养，至OD600达到0.9时(该过程需要3-5h)，在冷冻离心机中4℃下，8000rpm收集细胞；c、用10％(v/v)的甘油洗涤细胞3-4遍，最后将细胞悬浮在0.5mL10％的甘油中；d、将制得的谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使用。
电击转化法的具体过程为：a、取60μL谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞与6μLpK18mobsacB-Δncgl1221::ncgl1221*质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；b、将电转杯置于冰浴上20min；c、冰浴后在电转参数为25μF、2.5kV、电击时间为5ms的条件下进行电击转化；d、电转化结束后，立即加入800μL的正常液体培养基；e、46℃水浴中热击7min；f、热击结束后将电转化后细胞在30℃条件下温育3h；g、5000rpm离心2min收集细胞，除去多余上清，留200μL上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂布。
菌株筛选方法为：a、将上述重悬细胞均匀涂布在含有26μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，30℃条件下静置培养48h，待长出菌落后挑取具有卡那霉素抗性的菌落至含有26μg/mL卡那霉素的5mLLB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；b、吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基上，能够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞，挑取具有双重抗性的菌株细胞的单克隆于10mL的液体培养基中，在30℃条件下180rpm振荡培养12h后备用，采用表1中的引物对过夜菌液进行基因PCR扩增实验；c、将扩增实验显阳性的菌株进行液体扩大培养，以该扩大培养的菌液为模板进行PCR扩增实验；d、将步骤c中PCR扩增产物序列送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，若测序结果与ncgl1221*基因序列相同，则证明pK18mobsacB-Δncgl1221::ncgl1221*质粒已导入到谷氨酸棒杆菌S9114菌株中，得到了谷氨酸突变菌株S9114-pK18mobsacB-Δncgl1221::ncgl1221*，将该菌株编号为A3。
其中，步骤b和c中的PCR扩增实验的体系为：2×PrimeSTARMaxPremix，25μL；ncgl1221*F，0.5μL；ncgl1221*R，0.5μL；菌液，10μL；ddH2O，14μL；总体系50μL；PCR扩增条件为：94℃×3min；94℃×30s；58℃×30s；72℃×45s×30个循环；72℃×5min；12℃×∞。
实施例4
本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
按照实施例1的方法制备谷氨酸生产菌株，不同的是，步骤(2)中将ncgl1221基因序列的有义链的起始密码子TTG替换为偏好性高的密码子ATG，从而得到经密码子偏好性改造的基因序列ncgl1221#(SEQIDNo：8)，制得谷氨酸突变菌株ATCC13032-pK18mobsacB-ΔdtsR1::ncgl1221#，将该菌株编号为A4。
对比例2
按照实施例3的方法制备谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞，然后将pK18mobsacB质粒采用实施例3的方式电击转化谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞，得到已导入空质粒pK18mobsacB的谷氨酸菌株，将该菌株编号为D2。
测试例
将实施例1-4制备的谷氨酸突变菌株A1-A4和对比例1-2制备的谷氨酸菌株D1-D2分别进行发酵验证实验。
发酵验证实验具体过程为：分别将冻存于-80℃冰箱中的甘油冻存管中的测序正确的谷氨酸突变菌株A1-A4和谷氨酸菌株D1-D2100μL接种于100mL谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，于32℃下150rpm培养过夜；从该过夜的培养液中吸取20mL液体，接种于200mL谷氨酸生产种子培养基中，于32℃下200rpm条件下培养10h，制得种子液；
以10体积％的接种量分别将上述种子液接种至装有2L谷氨酸生产发酵培养基的5L全自动发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为32℃，初始通气量为1.5L/min，初始搅拌速度为560rpm，发酵过程中相关参数控制如下：
温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为32℃，并且每间隔4h使发酵温度提高0.5℃；
溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使发酵菌种在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5％-10％，而在产酸旺盛的对数生长期溶氧浓度控制在20％-25％；
pH：发酵过程中自动流加25重量％的氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2；
泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况流加20％(w/v)浓度的泡敌进行消泡；
补料：当残糖含量降至1％时，采用流加50％(w/v)浓度葡萄糖溶液进行补料；
在发酵32h时，采用SBA-40E型葡萄糖-谷氨酸生物分析仪分别测定上述6个发酵罐中的发酵液产生的L-谷氨酸的产量和葡萄糖的含量，测试结果见表2。采用公式1计算糖酸转化率。
谷氨酸转化率＝C谷氨酸×V发酵液/(285+500×V流加糖)×100％公式1
C谷氨酸表示发酵结束后发酵液中谷氨酸的浓度；
V发酵液表示发酵结束后发酵液的体积；
V流加糖表示发酵结束后所用流加糖液的总体积。
表2
实施例 L-谷氨酸的含量 糖酸转化率 OD
实施例1 22.4g/L 17.2％ 36.02
实施例2 17.9g/L 13.8％ 37.29
对比例1 0.2g/L 0.1％ 38.31
实施例3 106.3g/L 54.3％ 28.78
实施例4 95.9g/L 51.9％ 29.91
对比例2 85.4g/L 50.7％ 30.62
通过表2的数据可以看出，实施例1-4与对比例1-2相比，将本发明的方法制得的谷氨酸生产菌株用于发酵产生L-谷氨酸的含量较高，且糖酸转化率也较高，表明本发明的方法制得的谷氨酸生产菌株具有较强的产生谷氨酸的能力。
分别将实施例1与实施例2、实施例3与实施例4比较可以看出，以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20％密码子替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将该抑制谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20％密码子替换为偏好性低的密码子，能够进一步提高谷氨酸生产菌株产生谷氨酸的能力。
本发明中，利用密码子的简并性和生产谷氨酸的野生菌株对不同密码子的偏好性，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，从而能够实现在不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下，提高谷氨酸的产量的发明目的，制得产生谷氨酸能力较强的谷氨酸生产菌株。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种谷氨酸生产菌株的制备方法，其特征在于，该方法包括将生产谷氨酸的野生菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子的0.01-50％替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子的0.01-50％替换为偏好性低的密码子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20％密码子替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将该抑制谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20％密码子替换为偏好性低的密码子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，谷氨酸代谢通路上，促进谷氨酸产生的酶为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、柠檬酸合酶和机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白中的至少一种，抑制谷氨酸产生的酶为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基、α-酮戊二酸脱氢酶系、乳酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，促进谷氨酸产生的酶为机械应力敏感型谷氨酸外排蛋白，抑制谷氨酸产生的酶为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生产谷氨酸的野生菌株为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、高效棒状杆菌(C.efficiens)和黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述生产谷氨酸的野生菌株为谷氨酸棒状杆菌。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述偏好性高的密码子包括：起始密码子AUG、苯丙氨酸密码子UUC、亮氨酸密码子CUG或CUC、异亮氨酸密码子AUC、缬氨酸密码子GUU或GUC、酪氨酸密码子UAC、组氨酸密码子CAC、谷氨酰胺密码子CAG、天冬酰胺密码子AAC、赖氨酸密码子AAG、天冬氨酸密码子GAU、谷氨酸密码子GAA、丝氨酸密码子UCC或UCU、脯氨酸密码子CCA或CCU、苏氨酸密码子ACC或ACU、丙氨酸密码子GCA或GCU、半胱氨酸密码子UGC、精氨酸密码子CGC或CGU；所述偏好性低的密码子包括：起始密码子UUG或GUG、苯丙氨酸密码子UUU、亮氨酸密码子UUA或CUA、异亮氨酸密码子AUA、缬氨酸密码子GUA、酪氨酸密码子UAU、组氨酸密码子CAU、谷氨酰胺密码子CAA、天冬酰胺密码子AAU、赖氨酸密码子AAA、天冬氨酸密码子GAC、谷氨酸密码子GAG、丝氨酸密码子AGC或AGU、脯氨酸密码子CCC或CCG、苏氨酸密码子ACG或ACA、丙氨酸密码子GCG或GCC、半胱氨酸密码子UGU、精氨酸密码子AGG或AGA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：将经密码子偏好性改造的基因序列用于构建具有经密码子偏好性改造的基因的质粒，将所述质粒转化生产谷氨酸的野生菌株的感受态细胞，然后进行菌株筛选，得到谷氨酸生产菌株。
10.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法制备的谷氨酸生产菌株。
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