CN103205390A - 一种l-谷氨酸基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L-谷氨酸基因工程菌及其应用，所述基因工程菌是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。本发明进一步对所述基因工程菌发酵生产L-谷氨酸的工艺进行优化，优化后的发酵工艺能够显著提高所述基因工程菌中L-谷氨酸的产量，达到大约150g/L的水平，并且发酵过程中糖酸转化率也有所提高，达到60%以上。本发明方法构建的基因工程菌稳定、质粒不易丢失，此外发酵方法简单易行、周期短、设备要求低，特别适合进行工业化大规模的生产。

Description

一种L-谷氨酸基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵及基因工程领域，具体涉及一种能够提高L-谷氨酸产量的基因工程菌、其构建方法及其在生产L-谷氨酸上的应用。

背景技术

谷氨酸（Glutamic acid），其学名为2-氨基-5-羧基戊酸，是构成蛋白质的20种常见氨基酸之一，在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。L-谷氨酸是谷氨酸的左旋体，其具有增鲜、降低血氨、改善中枢神经系统、改善儿童智力发育、扩张血管、增强血液循环、促进花穗发育等功能，并且可以生产许多重要的下游产品，如L-谷氨酸钠、L-苏氨酸、聚谷氨酸等，被广泛应用于食品、医药、人造制革、化妆品、农业等行业。

谷氨酸的制备起始于18世纪。1866年德国化学家从小麦面筋的水解物中提取得到谷氨酸，1957年日本率先采用微生物发酵的方法生产谷氨酸，因发酵法具有原料成本低、反应条件温和、可大规模生产等优点，目前仍是谷氨酸生产的主要方法。目前我国发酵生产谷氨酸的菌种主要包括谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)、钝齿棒杆菌(Corynebacleriumcrenalum)、北京棒杆菌(Corynebaclerium pekinense)、黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）以及它们的突变株，如天津短杆菌T613的突变株TG-916、FM-415、CMTC6286、S9114等，钝齿棒杆菌AS1.542的突变株B9、F-263，北京棒杆菌AS1.299的突变株7338、D110、WTH-1等。

上述谷氨酸生产菌主要是通过选育及诱变育种的方式获得，其产酸能力伴随着谷氨酸发酵生产的发展获得了很大的提高。然而在现有的产酸能力下，继续采用经典微生物育种的方式来选育菌种，以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已经相当困难。近年来，随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032基因组测序的完成以及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造成为现实。

谷氨酸的生物合成的途径包括糖酵解作用（EMP途径）、磷酸戊糖途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路等。在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要反应包括谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应、转氨酶（AT）所催化的转氨反应以及谷氨酸合成酶（GS）所催化的合成反应，其中还原氨基化反应为主导反应。由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想代谢途径是先通过EMP和HMP途径生成丙酮酸，丙酮酸一部分在丙酮酸脱氢酶系统作用下生成乙酰CoA，另一部分经CO₂固定反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶的催化下合成柠檬酸，进入TCA循环，最终生成α-酮戊二酸，其经谷氨酸脱氢酶作用经还原氨基化作用生成谷氨酸，此时理论糖酸转化率为81.7%。

日本味之素株式会社依据谷氨酸合成的代谢途径对谷氨酸生产菌种作了一些基因改造，如在公开号为CN1261627A的中国发明专利中公开了通过在培养基中培养属于肠细菌并具有L-谷氨酸生成能力的引入了来自棒状细菌的柠檬酸合成酶基因微生物来生产L-谷氨酸；在CN1270226A中公开通过增加编码细胞内丙酮酸脱氢酶的基因的拷贝数获得的增强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性和具有谷氨酸生产能力的棒杆菌细菌；在CN1938418A中公开通过在培养基中培养其中L-谷氨酸输出基因YHFK基因的表达增强或过表达的微生物以产生并导致L-谷氨酸在培养基中累积等。

除了上述酶外，在谷氨酸生物合成代谢途径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO₂固定化从而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的关键酶，如CO₂固定反应不起作用，则丙酮酸将全部氧化成乙酰CoA，再通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸，此时理论糖酸转化率仅为54.4%，因此通过该酶的过量表达可能提高谷氨酸的发酵水平。此外，谷氨酸脱氢酶是谷氨酸合成途径中另一个关键酶，该酶催化α-酮戊二酸还原生成L-谷氨酸且受L-谷氨酸的反馈作用，因此过表达该酶可解除L-谷氨酸的反馈作用，从而达到提高产量的目的。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种依据代谢工程理论来通过分子生物学方法构建的谷氨酸基因工程菌，对该基因工程菌进行发酵可以显著提高L-谷氨酸的产量以及糖酸转化率。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种高产L-谷氨酸的基因工程菌，其是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。

特别是，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶用于催化CO₂固定化从而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸，谷氨酸脱氢酶用于催化α-酮戊二酸还原生成L-谷氨酸，这两种酶的大量表达有利用谷氨酸生产菌利用葡萄糖大量积累L-谷氨酸，从而提高谷氨酸的产量及糖酸转化率。

理论上，所有的谷氨酸生物素营养缺陷型菌株均适用于本发明，目前现有技术中以糖质为碳源的谷氨酸产生菌几乎都是生物素营养缺陷型。特别是，本发明所述谷氨酸生产菌选自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、天津短杆菌（Corynebacterium tianjin）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）中的一种，优选为谷氨酸棒杆菌GDK-9、北京棒杆菌AS1.299、钝齿棒杆菌AS1.542、天津短杆菌T613中的一种，进一步优选为谷氨酸棒杆菌GDK-9（其具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰抗性遗传标记，其定向育种研究已于2008年在《食品与发酵工业》第34卷第7期发表，现保藏于天津科技大学代谢工程研究室）；所述表达载体为pXMJ19。

特别是，所述基因工程菌的构建方法包括：利用PCR技术扩增谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶编码的gdh基因，将所述pepc基因和gdh基因克隆至表达载体后，转入谷氨酸生产菌中进行串联表达，得到所述基因工程菌。

尤其是，所述基因工程菌为GDK-PG，其构建方法包括：

1）利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)的pepc基因的DNA序列（GeneID:3343481）和gdh基因的DNA序列（GeneID:3343980）分别设计引物；

2）以谷氨酸棒杆菌GDK-9的基因组DNA为模板进行PCR扩增；

3）回收PCR扩增产物，与穿梭质粒pXMJ19进行连接，得到重组的表达载体pXMJ19PG；

4）将重组的表达载体pXMJ19PG导入谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态细胞，筛选阳性转化子，即构建得到谷氨酸基因工程菌GDK-PG。

其中，所述谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态细胞采用常规方法制备得到。

本发明另一方面提供所述的基因工程菌在生产L-谷氨酸上的应用。

特别是，所述应用是利用所述基因工程菌发酵生产L-谷氨酸。

本发明再一方面提供一种生产L-谷氨酸的方法，将所述基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，制得L-谷氨酸。

特别是，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖70-90g/L，玉米浆（来源于梅花生物科技集团股份有限公司霸州厂区）3-6ml/L，豆饼水解液（来源于宁夏伊品生物科技股份有限公司）15-25ml/L，KCl0.5-2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.5-2g/L，MgSO₄·7H₂O1-2g/L，MnSO₄·H₂O1-3mg/L，FeSO₄·7H₂O1-3mg/L，VB₁0.1-0.5mg/L，发酵培养基的pH值为7.0～7.4。

尤其是，所述发酵培养基的配方优选为：葡萄糖80g/L，玉米浆4.5ml/L，豆饼水解液19.8ml/L，KCl1.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O1.2g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，MnSO₄·H₂O2mg/L，FeSO₄·7H₂O2mg/L，VB₁0.2mg/L，发酵培养基的pH值为7.0～7.2。

其中，所述方法具体包括：先将所述基因工程菌接种于斜面培养基上进行活化，然后将活化的菌种接种于种子培养基中培养至对数生长中后期，得到种子液；再将所述种子液以一定的接种量接种至发酵培养基中，并在搅拌的方式下进行发酵，制得L-谷氨酸。

特别是，所述种子培养基的配方为：葡萄糖20-30g/L，尿素2-4g/L，K₂HPO₄·3H₂O1-3g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1.5g/L，玉米浆30-40mL/L，豆饼水解液20-30mL/L，pH7.0-7.4；优选为葡萄糖25.0g/L，尿素3g/L，K₂HPO₄·3H₂O2.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH7.0-7.2；所述接种量为5-15%，优选为10%；所述搅拌的速度为500r/min-880r/min，优选为500-600r/min。

其中，所述发酵为补料分批发酵；采用补料分批发酵可以避免在分批发酵中因一次投料过多而产生的底物抑制、产物反馈抑制及分解代谢物阻遏等作用，从而减少菌体生长量及提高糖酸转化率。

特别是，所述补料分批发酵具体包括：视所述发酵的发酵液中残留葡萄糖的情况来流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%，其中所述葡萄糖溶液的浓度为80-90wt%。较低的残糖浓度可使发酵液具有低的渗透压，从而有利于谷氨酸向胞外分泌。

尤其是，自发酵液中残留葡萄糖的浓度为5-2%时开始流加所述葡萄糖溶液（此时为发酵开始6-8h），优选自发酵液中残留葡萄糖的浓度为3-2%时开始流加所述葡萄糖溶液。

其中，采用间隔升温方式控制所述发酵的温度；所述间隔升温具体包括：控制发酵的起始温度为34℃，并且自发酵开始后每间隔4h使发酵温度升高0.5℃。由于谷氨酸发酵属于Ⅱ型，而谷氨酸棒杆菌GDK-9为温度敏感型菌种，因此温度的控制既是菌体生长所需，也是细胞转型和产酸的关键。本发明采用间隔升温，使细胞逐渐从生长型转变为产酸型，从而避免了因原料的影响而造成产酸不稳定的现象，有利于L-谷氨酸的大量积累。

其中，采用分段供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度；所述分段供氧具体包括：控制所述基因工程菌在其生长延滞期至对数生长期后期发酵液中的溶氧浓度为15-25%，优选为20%，所述基因工程菌在其生长稳定期至发酵结束发酵液中的溶氧浓度≤10%，优选为1-5%。

特别是，所述基因工程菌的生长延滞期至生长对数期后期为发酵0-10h，此阶段菌体大量生长，所需溶氧浓度大；所述生长稳定期至发酵结束为发酵10h至发酵结束，此阶段耗氧量降低，控制较低溶氧，利于产酸。

尤其是，在发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来进行所述分段供氧，其中控制初始通气量为1-2L/min，搅拌转速为500r/min-880r/min。

其中，所述发酵还包括：流加一定浓度的氨水，使发酵液的pH维持在7.0-7.4。特别是，所述氨水的浓度为20-30%，优选为25%。

其中，所述发酵还包括：根据发酵罐中的泡沫情况流加15-25%，优选为20%的泡敌进行消泡。

本发明采用所述谷氨酸基因工程菌进行发酵，具体包括：以一定的接种量将所述基因工程菌的菌液接种至发酵培养基中，并在搅拌的方式下进行发酵；其中，在发酵过程中通过间隔升温的方式控制发酵温度，通过分段供氧的方式控制发酵液中的溶氧浓度，并且通过流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%。

特别是，所述接种量为5-15%，优选为10%；所述搅拌的速度为500r/min-880r/min，优选为500-600r/min。

采用所述谷氨酸基因工程菌发酵28-32小时后，发酵液中L-谷氨酸的含量达到145-160g/L，糖酸转化率为60-65%。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明采用基因工程手段，将pepc基因和ghd基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达来构建基因工程菌，不仅构建方法简单易行、适用菌种范围广泛，此外构建的基因工程菌质粒稳定，不易丢失；

2、采用本发明构建的基因工程菌发酵制备L-谷氨酸，通过采用间隔升温、分段供氧及补料分批发酵等对发酵工艺进行控制，可以获得较高的谷氨酸产量及糖酸转化率，其中L-谷氨酸的产量高达145-160g/L，糖酸转化率高达60-65%，此方法工艺易于控制、所需设备简单，特别适用于L-谷氨酸的大规模化生产制备。

附图说明

图1是本发明基因工程菌重组质粒构建的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、谷氨酸基因工程菌的构建

1、pepc基因和gdh基因的克隆

根据谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)的pepc基因的DNA序列（GeneID:3343481）和gdh基因的DNA序列（GeneID:3343980）分别设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：

Primer1：5’-GCGAAGCTTGCTCCAGCAAACGCCT-3’（下划线为引入的HindⅢ酶切位点）

Primer2：5’-GCGTCTAGACACGCTTAAAGACACC-3’（下划线为引入的XbaⅠ酶切位点）

Primer3：5’-GGCGGTAACTGAACAAAAGAGCCCATCAAC-3’（下划线为引入的KpnⅠ酶切位点）

Primer4：5’-GGCGAATTCTTACTTCTTCAGTGCGTCAACG-3’（下划线为引入的EcoRⅠ酶切位点）

以谷氨酸棒杆菌GDK-9的基因组DNA为模板，采用TaKaRa Ex Taq PCR试剂盒（货号：DR001AM）、分别以Primer1和Primer2、以及Primer3和Primer4为引物进行PCR扩增，其中：

pepc基因的扩增体系（50μl）为：DNA聚合酶（5U/μl）0.25μl，10×PCR Buffer5μl，dNTP Mixture（各2.5mmol/L）4μl，模板（2.5ng/μl）1μl，Primer1和Primer2（10μmol/l）各2μl，去离子水35.75μl；扩增条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃3min30个循环，72℃10min1个循环；

gdh基因的扩增体系（50μl）为：DNA聚合酶（5U/μl），10×PCR Buffer5μl，dNTP Mixture（各2.5mmol/L）4μl，模板（2.5ng/μl）1μl，Primer1和Primer2（10μmol/l）各2μl，去离子水35.75μl；扩增条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃2min30个循环，72℃10min1个循环；

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到大小为2789bp（pepc基因）和1344bp（gdh基因）的扩增条带；

2、基因工程菌的构建

用DNA回收试剂盒回收PCR扩增产物，与穿梭质粒pXMJ19进行连接，得到重组的表达载体pXMJ19PG；

采用电转化法将上述重组的表达载体pXMJ19PG导入谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态细胞中，在含有10ug/ml氯霉素的平板上筛选阳性转化子，经提取质粒进行PCR和酶切验证后，得到谷氨酸基因工程菌GDK-PG，冻存于-80℃甘油管中。

二、谷氨酸基因工程菌的质粒稳定性

采用平板稀释计数法，将上述冻存于-80℃甘油管中的谷氨酸基因工程菌在含10μg/L氯霉素的LB平板上进行三区划线，于37℃培养16h后，挑取单菌落接种于5ml液体选择性培养基（LB/Cm^r）中，摇管培养12h后以1％的接种量转入5ml液体非选择性培养基（LB），开始连续摇管培养试验；其中每12h转接一次，接种量为1％，连续传代30次，并每隔5次取样进行平板稀释检测质粒的缺失程度；

检测时，取菌液lml用无菌水逐级稀释，取三个合适的梯度，分别涂布在固体选择性培养基和非选择性培养基平板上，倒置在37℃培养箱中培养16h后，计算各皿中的菌落数，其中每个处理三个重复；

将选择性培养基中的菌落数与非选择性培养基中菌落数进行比较，计算出质粒的缺失率，结果见表1；

表1谷氨酸基因工程菌GDK-PG的质粒稳定性

由表1结果可知，本发明构建的谷氨酸基因工程菌质粒稳定，不易丢失。

三、基因工程菌的发酵

1、培养基配方：

斜面培养基（g/L）：酵母粉5，牛肉膏10，蛋白胨10，NaCl5，琼脂条2.5，pH7.0-7.2，0.1MPa灭菌30min；

种子培养基（g/L）：葡萄糖25.0，尿素3，K₂HPO₄·3H₂O2.2，MgSO₄·7H₂O0.9，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH7.0-7.2，0.1Mpa灭菌15min；

发酵培养基：葡萄糖80g/L，玉米浆4.5ml/L，豆饼水解液19.8ml/L，KCl1.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O1.2g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，MnSO₄·H₂O2mg/L，FeSO₄·7H₂O2mg/L，VB₁0.2mg/L，培养基pH值为7.0-7.2，0.1Mpa灭菌15min；

2、基因工程菌的发酵

将冻存于-80℃甘油管中的谷氨酸基因工程菌GDK-PG接种于上述斜面培养基中进行活化，于33℃下培养16-20h至长出菌苔；

从新鲜活化的斜面上挑取谷氨酸基因工程菌的菌苔，接种于上述种子培养基中，于33℃、200r/min下振荡培养至对数生长中后期（16h左右），制得种子液；

以10%的接种量将上述种子液接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为34℃，初始通气量为1.5L/min，初始搅拌转速为600r/min，发酵过程中相关参数控制如下：

温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为34℃，并且每间隔4h使发酵的温度升高0.5℃；

溶氧：采用分段供氧方式通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使基因工程菌在其生长延滞期至对数生长期后期发酵液中的溶氧浓度为18-20%，在其生长稳定期至发酵结束发酵液中的溶氧浓度为2-5%；

pH值：发酵过程中自动流加25%的氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2；

消泡：根据发酵罐中的泡沫情况流加20%的泡敌进行消泡；

补料：当发酵液中的残留葡萄糖的含量降至3%左右时，采用流加葡萄糖方式进行补料，即以一定的脉冲速度流加80%的葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%的范围内；

采用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪测定葡萄糖及L-谷氨酸的含量，其中发酵32h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达151g/L，糖酸转化率为63.2%。

实施例2

斜面培养基和种子培养基配方同实施例1；

发酵培养基：葡萄糖70g/L，玉米浆6ml/L，豆饼水解液15ml/L，KCl0.6g/L，Na₂HPO₄·12H₂O1.8g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，MnSO₄·H₂O1mg/L，FeSO₄·7H₂O3mg/L，VB₁0.4mg/L，培养基pH值为7.0～7.2，0.1Mpa灭菌15min；

采用实施例1构建的谷氨酸基因工程菌GDK-PG进行发酵，发酵过程中除接种量为6%，初始通气量为2L/min，搅拌转速为500r/min；采用分段供氧方式通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使基因工程菌GDK-PG在其生长延滞期至对数生长期后期发酵液中的溶氧浓度为20-25%，在其生长稳定期至发酵结束发酵液中的溶氧浓度为5-10%；当发酵液中的残留葡萄糖的含量降至2%左右时采用流加葡萄糖方式进行补料外，其余均与实施例1相同；发酵28h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达149g/L，糖酸转化率为61.9%。

实施例3

斜面培养基和种子培养基配方同实施例1；

发酵培养基：葡萄糖90g/L，玉米浆3ml/L，豆饼水解液24ml/L，KCl1.8g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.8g/L，MgSO₄·7H₂O1.8g/L，MnSO₄·H₂O2.5mg/L，FeSO₄·7H₂O1.5mg/L，VB₁0.5mg/L，培养基pH值为7.0-7.2，0.1Mpa灭菌15min；

采用实施例1构建的谷氨酸基因工程菌GDK-PG进行发酵，发酵过程中除接种量为15%，初始通气量为1L/min，搅拌转速为700r/min；采用分段供氧方式通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使基因工程菌GDK-PG在其生长延滞期至对数生长期后期发酵液中的溶氧浓度为15-18%，在其生长稳定期至发酵结束发酵液中的溶氧浓度为1-5%；当发酵液中的残留葡萄糖的含量降至4%左右时采用流加葡萄糖方式进行补料外，其余均与实施例1相同；发酵30h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达155g/L，糖酸转化率为64.8%。

实施例4

以北京棒杆菌AS1.299的基因组DNA为模板，采用TaKaRa Ex Taq PCR试剂盒、分别以实施例1的Primer1和Primer2、以及Primer3和Primer4为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到大小为2789bp（pepc基因）和1344bp（gdh基因）的扩增条带；用DNA回收试剂盒回收PCR扩增产物，与穿梭质粒pXMJ19进行连接，得到重组的表达载体；采用电转化法将上述重组的表达载体导入北京棒杆菌AS1.299的感受态细胞中，在含有10ug/ml氯霉素的平板上筛选阳性转化子，经提取质粒进行PCR和酶切验证后，得到谷氨酸基因工程菌1.299-PG，冻存于-80℃甘油管中，采用实施例1的方法测定其质量稳定性，结果见表2；

表2谷氨酸基因工程菌1.299-PG的质粒稳定性

15	91	92	0.01
				20	87	89	0.02
25	82	85	0.04
				30	70	74	0.05

采用实施例1的方法对上述构建的谷氨酸基因工程菌1.299-PG进行发酵，发酵液中L-谷氨酸的产量达150g/L，糖酸转化率为62.1%。

对照例1谷氨酸棒杆菌GDK-9发酵

采用谷氨酸棒杆菌GDK-9按照实施例1所述的方法进行发酵，发酵32h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达134g/L，糖酸转化率为59.2%；由此说明本发明将pepc基因和ghd基因通过表达载体引入谷氨酸棒杆菌GDK-9中进行串联表达，能够大幅度提高L-谷氨酸的产量及糖酸转化率，其中L-谷氨酸的产量提高了11.2-15.7%，糖酸转化率提高了4.6-9.4%。

对照例2北京棒杆菌AS1.299发酵

采用北京棒杆菌AS1.299按照实施例1所述的方法进行发酵，发酵32h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达131g/L，糖酸转化率为58.4%；由此说明本发明将pepc基因和ghd基因通过表达载体引入北京棒杆菌AS1.299中进行串联表达，能够大幅度提高L-谷氨酸的产量及糖酸转化率，其中L-谷氨酸的产量提高了14.5%，糖酸转化率提高了6.3%。

对照例3GDK-PG一次升温发酵

采用实施例1构建的谷氨酸基因工程菌GDK-PG进行发酵，发酵过程中除升温方式采用一次升温（即初始发酵温度为34℃，在发酵24h时升温至37℃）外，其它发酵工艺控制同实施例1，发酵32h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达141g/L，糖酸转化率为60.7%；由此说明本发明采用间隔升温方式进行发酵能够使L-谷氨酸的产量提高5.7-9.9%，糖酸转化率提高2-6.8%。

对照例4GDK-PG高溶氧发酵

采用实施例1构建的谷氨酸基因工程菌GDK-PG进行发酵，发酵过程中除通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度维持在30%左右外，其它发酵工艺控制同实施例1，发酵32h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达140g/L，糖酸转化率为60.1%；由此说明相对于高溶氧发酵而言，本发明采用分段供氧方式进行发酵能够使L-谷氨酸的产量提高6.4-10.7%，糖酸转化率提高3-7.8%。

对照例5GDK-PG低溶氧发酵

采用实施例1构建的谷氨酸基因工程菌GDK-PG进行发酵，发酵过程中除通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度维持在10%左右外，其它发酵工艺控制同实施例1，发酵32h后，发酵液中L-谷氨酸的产量达130g/L，糖酸转化率为58.0%；由此说明相对于低溶氧发酵而言，本发明采用分段供氧方式进行发酵能够使L-谷氨酸的产量提高14.6-19.2%，糖酸转化率提高6.7-11.7%。

Claims (10)

1.一种L-谷氨酸基因工程菌，其特征在于，其是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸生产菌选自谷氨酸棒杆菌、天津短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌中的一种，所述表达载体为pXMJ19。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌在生产L-谷氨酸上的应用。

4.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，制得L-谷氨酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖70-90g/L，玉米浆3-6ml/L，豆饼水解液15-25ml/L，KCl0.5-2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O0.5-2g/L，MgSO₄·7H₂O1-2g/L，MnSO₄·H₂O1-3mg/L，FeSO₄·7H₂O1-3mg/L，VB₁0.1-0.5mg/L，发酵培养基的pH值为7.0-7.4。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵为补料分批发酵。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述补料分批发酵具体包括：视所述发酵的发酵液中残留葡萄糖的情况来流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%。

8.如权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于，采用间隔升温方式控制所述发酵的温度，其中所述间隔升温具体包括：控制发酵的起始温度为34℃，并且自发酵开始后每间隔4h使发酵温度升高0.5℃。

9.如权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于，采用分段供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，其中所述分段供氧具体包括：控制所述基因工程菌在其生长延滞期至对数生长期后期发酵液中的溶氧浓度为15-25%，所述基因工程菌在其生长稳定期至发酵结束发酵液中的溶氧浓度≤10%。

10.如权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于，所述发酵还包括：流加一定浓度的氨水，使发酵液的pH维持在7.0-7.4。

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