CN110241061A - 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高短乳杆菌γ‑氨基丁酸合成能力的方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明以同源重组的方式实现glnR基因的敲除，获得的短乳杆菌glnR敲除株可显著提高突变株的GABA合成能力及耐酸性。采用控酸流加补料法进行发酵，GABA的累计浓度为301.5g/L，生产效率最高达5.76g/L/h。经质粒消除后，本发明中的短乳杆菌glnR敲除菌株不携带其他外源基因，可用于GABA的规模化生产，降低GABA的生产成本，且glnR敲除菌株具有高耐受酸性环境，可用于酸性食品的发酵，如黄酒酿造、酸面团生产等。

Description

提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用
技术领域
本发明涉及提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用，属于微生物领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是作为一种重要的抑制性神经递质，对哺乳动物具有安神、降低血压、改善睡眠等多种生理功能，可作为生物活性物质广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域。食品级的GABA的多由微生物采用生物法合成。微生物主要是GAD系统(包括谷氨酸/GABA的反转运体、谷氨酸脱羧酶)的作用，通过谷氨酸/GABA反转运体将胞外的谷氨酸运输至胞内，通过消耗H+，由胞内的谷氨酸脱羧酶对谷氨酸底物进行催化脱羧合成GABA。合成的GABA再通过谷氨酸/GABA反转运体将GABA运出胞内，实现GABA的积累，同时维持胞内pH的稳定，帮助菌株抵抗酸性环境的胁迫。
已报道的GABA合成菌株中，乳酸菌具有绝对的优势，尤其是短乳杆菌。前期研究中本研究室从白酒酿造体系中筛选出一株高效合成GABA的短乳杆菌D17，该菌株的生长与GABA的合成耦联，通过发酵策略优化(控制发酵pH)可提高菌株的生产效率(3.76g/L/h)。
现有提高GABA的产量的方法主要针对高产GABA菌株的筛选，GABA生产发酵条件及培养基的优化，谷氨酸脱羧酶系统的过表达。但对于已有的GABA高产菌或低产菌而言，若要增加其工业化应用，继续提高其生产效率，需要有针对的调控其代谢途径。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种提高短乳杆菌菌株γ-氨基丁酸合成能力的方法。
在本发明的研究过程中，发明人发现，虽然模式菌株短乳杆菌ATCC 367与短乳杆菌D17的谷氨酸脱羧系统的相关基因(谷氨酸/GABA的反转运体、谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因)的氨基酸序列一致，但当菌株在5％的谷氨酸钠发酵时，菌株ATCC 367的GABA产量(10g/L)远低于短乳杆菌D17(17.8g/L)，且短乳杆菌ATCC 367与短乳杆菌D17的GABA产量并不随着谷氨酸钠的添加而增加，二者的GABA产量均受到限制。
谷氨酸(钠)不仅是GABA合成的唯一底物，同时也是微生物的氮源之一，它的代谢会受到一些调控子的控制，如TnrA，GlnR及CodY等。GlnR(谷氨酰胺合成酶抑制子)是广泛存在于革兰氏阳性菌中的一个重要的全局的氮源调控因子。它对氮源代谢的某些基因具有调控作用，尤其在链霉菌属、芽孢杆菌属中。在芽孢杆菌属中，当氮源充足时，GlnR会抑制glnRA操纵子的转录，降低氮源的利用。在链霉菌属中，GlnR不仅调控氮代谢且，控制碳源代谢、磷代谢，抗生素合成与菌株的耐受性(渗透压，耐酸、氧化)等。控制GABA的合成的GAD系统是微生物抵抗酸胁迫的耐酸系统，在谷氨酸氮源充足的情况下，可能受GlnR的阻遏调控。而且目前有关于乳酸菌的glnR基因敲除菌株未有报道。
本发明通过对短乳杆菌的glnR基因进行敲除，进一步解除了短乳杆菌GABA合成的限制，提高GABA产量，降低GABA合成时间，进一步提高GABA的工业化生产效率。
本发明的第一个目的是提供一种提高短乳杆菌菌株γ-氨基丁酸合成能力的方法，所述方法是敲除短乳杆菌菌株中的glnR基因(谷氨酰胺合成酶抑制子基因)。
在一种实施方式中，所述glnR基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一种实施方式中，编码所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一种实施方式中，所述短乳杆菌菌株为任意能够合成GABA的短乳杆菌。
在一种实施方式中，所述短乳杆菌菌株为短乳杆菌D17(保藏编号为CGMCCNO.14385)或者模式菌株短乳杆菌ATCC 367、短乳杆菌NCL912、短乳杆菌CGMCC1306、短乳杆菌145等。在一种实施方式中，所述敲除，是使用任意一种已知的敲除方法，比如同源重组，二类内含子(Targetron或Clostron)基因插入失活、CRISPR-Cas基因编辑等。
在一种实施方式中，所述敲除是使用无痕敲除，尤其是基于同源重组的无标记基因敲除。
在一种实施方式中，所述敲除，具体是：将要敲除的glnR基因上、下游同源片段1000bp(包含glnR基因前后端各21bp)分别按一定方向连接到乳酸菌的整合质粒pGID023上，获得靶基因的敲除质粒pGID023-ΔglnR。将敲除质粒通过电转化进入短乳杆菌中，通过在红霉素抗性平板上筛选得到含敲除质粒的重组菌株。随后选择正确的重组菌株，在含红霉素的GYP液体培养基中，进行传代，再在无红霉素抗性的GYP液体培养基中传代，将传代后的菌液涂于含红霉素的抗性平板上，筛选获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子。然后将单交换子在无红霉素条件下，液体GYP培养基中传代培养，将传代后的菌液涂于无抗生素的GYP平板上，挑选单克隆直至筛选得到发生第二次同源重组的无红霉素抗性实现靶基因敲除的菌株。
上述pGID023质粒携带能在大肠杆菌中复制的复制原点、多克隆位点MCS、红霉素抗性基因。
上述敲除质粒是通过将短乳杆菌染色体上要敲除的靶基因上游和下游、大小约为1000bp的同源序列片段分别按基因排列方向酶切连接至pGID023的多克隆位点上。
上述敲除质粒通过电转化进入短乳杆菌中得到含敲除质粒的菌株的方法：将1μg敲除质粒与短乳杆菌感受态细胞混合，采用合适的电转化条件，将质粒电转至短乳杆菌中。电击后迅速加入预冷MRS培养基，于37℃培养箱中复苏。离心去除上清，细胞重悬后涂布含红霉素的MRS平板，37℃培养至长出转化子。挑取转化子进行菌液PCR验证。
上述发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子的验证方法是：将含敲除质粒的短乳杆菌的转化子接种至含有红霉素的MRS培养基中37℃静置培养24h。取培养后的菌液接种于上述的含红霉素的MRS液体培养基中，37℃培养24h后，按照此步骤进行传代培养。将传代后的菌液稀释10-3～10-6倍后涂布含有红霉素的MRS平板37℃培养，直至长出单菌落。挑取单菌落接种于含有红霉素的MRS培养基中，37℃培养24h，进行菌液PCR验证，筛选获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的潜在单交换子，再将潜在单交换子提取全基因组DNA，采用PCR及测序验证，确保获得正确敲除glnR基因的突变株。
上述筛选发生第二次同源重组实现靶基因敲除的菌株的方法是：将单交换子接种到不含红霉素的液体MRS培养基中，37℃培养24h。在无抗的MRS培养基中传代后，菌液稀释10-3～10-6倍后涂布不含红霉素的MRS平板37℃培养，直至长出单菌落。挑取单菌落，接种于无红霉素抗性的MRS液体培养基中37℃培养24h，进行菌液PCR验证，从而得到glnR基因敲除的潜在突变株。再将潜在敲除株提取全基因组DNA，采用PCR及测序验证，确保获得正确敲除glnR基因的突变株。若未获得glnR基因敲除株，可继续传代，重复上述步骤，直至筛选获得glnR基因敲除株。
本发明的第二个目的是提供一种γ-氨基丁酸合成能力提高的短乳杆菌，所述短乳杆菌在出发菌株的基础上敲除了glnR基因。
在一种实施方式中，所述glnR基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一种实施方式中，编码所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一种实施方式中，所述出发菌株为任意能够合成GABA的短乳杆菌，可选地，为短乳杆菌D17(保藏编号为CGMCC NO.14385)、模式菌株短乳杆菌ATCC 367、短乳杆菌NCL912、短乳杆菌CGMCC1306或者短乳杆菌145等。
在一种实施方式中，所述敲除，可以使用任意一种已知的敲除方法，比如同源重组，二类内含子(Targetron或Clostron)基因插入失活、CRISPR-Cas基因编辑等。
本发明的第三个目的是提供一种合成γ-氨基丁酸的方法，所述方法是利用敲除了glnR基因的短乳杆菌进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵生产是将短乳杆菌接种于含有谷氨酸或谷氨酸钠的培养基中进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵生产可以是采用如下任意一种方法进行：
(2)将短乳杆菌glnR敲除株，接种于含有谷氨酸(钠)的液体发酵培养基中，进行发酵培养；
(2)发酵过程进行酸碱度调节的批次补料发酵：将短乳杆菌glnR敲除株接种于含谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中，pH控制为4.8-5.5，搅拌不通气条件下进行发酵；发酵6～24h间补充谷氨酸(钠)底物。优选地，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加；
(3)发酵过程进行酸碱度调节的流加葡萄糖的批次补料发酵：将短乳杆菌glnR敲除株接种于含谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中，pH控制为4.8-5.5，搅拌不通气条件下进行发酵；发酵6～36h间补充谷氨酸(钠)底物。优选地，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加，同时在6～36h流加葡萄糖碳源。
在一种实施方式中，所述发酵生产是采用如下任意一种方法进行：
(1)将短乳杆菌glnR敲除株分别接种于10g/L葡萄糖碳源，添加50g/L谷氨酸(钠)的GYP液体发酵培养基中，于37℃×200rpm培养条件下进行发酵。
(2)发酵过程进行酸碱度调节的批次补料发酵：采用生物反应器，将短乳杆菌ATCC367ΔglnR或D17ΔglnR突变株接种于含谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中。采用5mol/L浓度的硫酸将发酵液的pH控制为5.0，于37℃×200rpm搅拌不通气条件下进行发酵。为避免高浓度谷氨酸(钠)对菌体生长的抑制，于6～24h间补充谷氨酸(钠)底物。优选地，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加。发酵60h，ATCC 367ΔglnR的GABA的累计浓度为233.9g/L，发酵36h，生产效率最高达4.88g/L/h；发酵48h，D17ΔglnR的GABA的累计浓度为148.0g/L，发酵18h，生产效率最高达5.73g/L/h。
(3)发酵过程进行酸碱度调节的流加葡萄糖的批次补料发酵：采用生物反应器，将短乳杆菌ATCC 367ΔglnR或D17ΔglnR突变株接种于含谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中。采用5mol/L浓度的硫酸将发酵液的pH控制为5.0，于37℃×200rpm搅拌不通气条件下进行发酵。为避免高浓度谷氨酸(钠)对菌体生长的抑制，于6～36h间补充谷氨酸(钠)底物。优选地，ATCC 367ΔglnR的发酵过程中，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加，同时在12～36h流加葡萄糖碳源，发酵60h，ATCC 367ΔglnR的GABA的累计浓度为282.80g/L，发酵36h，生产效率最高达4.93g/L/h；优选地，D17ΔglnR的发酵过程中，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加，同时在6～30h流加葡萄糖碳源，发酵60h，D17ΔglnR的GABA的累计浓度为301.5g/L，发酵36h，生产效率最高达5.76g/L/h。
本发明的第四个目的是提供一种提高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌的耐酸能力的方法，所述方法是敲除短乳杆的菌glnR基因。
本发明的第五个目的是提供所述重组菌或者所述方法，在食品、制备药物、饲料、化工等领域的应用。
在一种实施方式中，所述食品为酸性发酵食品；比如黄酒或者酸面团生产。
本发明的第六个目的是提供所述重组菌或者所述方法，在制备对哺乳动物具有安神、降低血压、改善睡眠的药物或者保健品方面的应用。
生物材料：
短乳杆菌D17，已经在公布号CN 108034599A、公开日为2018年05月15日的专利申请2017112754179中公开；其分类学命名为短乳杆菌Lactobacillus brevis，于2017年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14385。
模式菌株短乳杆菌ATCC 367，购自中国微生物保藏中心编号CGMCC1.2028，也可以从美国模式培养物研究所编号ATCC 367购买得到。
本发明涉及的短乳杆菌NCL912、短乳杆菌CGMCC1306及短乳杆菌145已在本专利申请之前的文献中公开(Li,H.X.,Gao,D.D.,et al.A highγ-aminobutyric acid-producing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai[J].2008,Annals of Microbiology,58(4):649-653.Peng,C.L.,Huang,J.,et al.A Two-stage pH and Temperature Control with Substrate Feeding Strategy forProduction of Gamma-aminobutyric Acid by Lactobacillus brevis CGMCC 1306[J].Chinese Journal of Chemical Engineering,21(10):1190-1194.Wu,Q.,Law,Y.S.,etal.Dairy Streptococcus thermophilus improves cell viability of Lactobacillusbrevis NPS-QW-145 and its gamma-aminobutyric acid biosynthesis ability inmilk[J].Scientific Report,2015,5(12885):1-12.)。
整合质粒pGID023，如图1所示，已经在1994年的文献中公开(Pascal Hols,Thierry Ferain,Dominique Garmyn,et al.Use of homologous expression-secretionsignals and vector-free stable chromosomal integration in engineering ofLactobacillus plantarum for alpha-amylase and levanase expression.AppliedEnvironmental Microbiology 1994，60:1401-1413.)。
本发明的有益效果：
本发明首次发现glnR基因的缺失可显著提高短乳杆菌的GABA合成能力，且通过获得的短乳杆菌的glnR基因敲除菌株ATCC 367ΔglnR与短乳杆菌D17ΔglnR，发现该方法具有通用性，原则上适合所有的短乳杆菌。本发明利用敲除了glnR基因的菌株生产GABA，可以大幅度提高短乳杆菌GABA生产效率或产量、缩短发酵周期，同时可显著提高菌株在酸性环境中的存活能力，菌株也适用于黄酒酿造、酸面团生产等酸性食品的发酵。
附图说明
图1.用于基因敲除的pGID023质粒；
图2.敲除质粒pGID023-ΔglnR的构建；上图为glnR基因上下游同源臂扩增，下图为敲除质粒pGID023-ΔglnR；
图3.短乳杆菌glnR基因敲除的流程示意图；
图4.短乳杆菌ATCC 367及D17glnR基因敲除的PCR验证图；
附图4A中的标记为：M:500bp Marker；6:采用引物对F-glnR与R-glnR扩增短乳杆菌D17基因组；9:采用引物对F-glnR与R-glnR扩增短乳杆菌ATCC 367基因组；1～5:提取潜在短乳杆菌D17的glnR敲除菌株的基因组，采用引物对F-glnR与R-glnR扩增；7～8:提取潜在短乳杆菌ATCC 367的glnR敲除菌株的基因组，采用引物对F-up-glnR-BamH与R-down-glnR-Hind3扩增。
附图4B中的标记为：M:5kb Marker；1:采用引物对F-up-glnR-BamH与R-down-glnR-Hind3扩增短乳杆菌D17基因组；7.采用引物对F-up-glnR-BamH与R-down-glnR-Hind3扩增短乳杆菌ATCC 367基因组；2～6:提取潜在短乳杆菌D17的glnR敲除菌株的基因组，采用引物对F-up-glnR-BamH与R-down-glnR-Hind3扩增；8～9:提取潜在短乳杆菌ATCC 367的glnR敲除菌株的基因组，采用引物对F-up-glnR-BamH与R-down-glnR-Hind3扩增。
图5.短乳杆菌ATCC 367及D17的glnR基因敲除的测序验证；
图6.glnR基因的缺失对乳杆菌GABA合成的影响；附图6A中的标记为：367代表短乳杆菌ATCC 367野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株；附图6B中的标记为：367代表短乳杆菌D17野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌D17ΔglnR突变株。
图7.短乳杆菌glnR敲除菌在极端酸性环境的存活；附图7A中的标记为：367代表短乳杆菌ATCC 367野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株；附图7B中的标记为：367代表短乳杆菌D17野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌D17ΔglnR突变株。
图8.短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株采用酸碱度调节的批次补料发酵合成GABA；附图8中的标记为：367代表短乳杆菌ATCC 367野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株。
图9.短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株采用酸碱度调节的流加葡萄糖的批次补料发酵合成GABA；附图9中的标记为：367代表短乳杆菌ATCC 367野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株。
图10.短乳杆菌D17ΔglnR突变株采用酸碱度调节的批次补料发酵合成GABA；附图10中的标记为：D17代表短乳杆菌D17野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌D17ΔglnR突变株。
图11.短乳杆菌D17ΔglnR突变株采用酸碱度调节的流加葡萄糖的批次补料发酵合成GABA；附图11中的标记为：D17代表短乳杆菌D17野生菌；ΔglnR代表短乳杆菌D17ΔglnR突变株。
具体实施方式
MRS培养基：葡萄糖2％，酵母浸粉0.4％，蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.05％，均为质量-体积分数。调节pH为6.2。固体培养基中添加2％浓度的琼脂。
含红霉素的MRS液体培养基：在MRS培养基基础上加入终浓度为1μg/mL的红霉素；含红霉素的MRS平板：在MRS培养基基础上加入终浓度为4μg/mL的红霉素；
复苏液：葡萄糖2％，酵母浸粉0.4％，蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.05％，蔗糖10.26％，均为质量-体积分数。
LB培养基(g/L)：液体：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠10；固体培养基中添加2％浓度的琼脂。
含红霉素的LB培养基：在LB培养基基础上加入终浓度200μg/mL的红霉素。
GYP培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉1％，蛋白胨0.5％，乙酸钠0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.01％，硫酸亚铁0.01％，氯化钠0.01％，均为质量-体积分数。固体培养基中添加2％浓度的琼脂，发酵培养基中添加不同浓度谷氨酸钠。
耐酸能力测试：将短乳杆菌野生菌及glnR敲除株分别接种于10g/L葡萄糖碳源，10g/L谷氨酸(钠)的发酵培养基中，37℃发酵10h。离心收集细胞，采用pH 7.0的磷酸钾缓冲洗菌1次。并用含有或不含10mM谷氨酸(钠)的pH 7.0的磷酸钾缓冲重悬菌体，使其OD600为1.0。37℃分别静置培养0h，1h，2h，2.5h时，立即加入9倍体积含有或不含10mM谷氨酸钠pH2.5的磷酸钾缓冲于菌悬液中，继续静置培养至3h结束。取出样品立即用pH 7.4的PBS缓冲按10-1～10-5稀释，选择合适的梯度取100μL稀释液涂于GYP平板上，37℃静置培养24h。
实施例1：短乳杆菌glnR基因的无痕敲除
根据短乳杆菌的模式菌株ATCC 367或D17中glnR基因的上下游DNA序列，glnR基因的上游与下游保留各21bp(防止基因全切除影响上下游同源臂基因表达)，设计引物对F-up-glnR-BamHI与R-up，F-down与R-down-glnR-HindIII。以短乳杆菌ATCC 367或D17的基因组DNA为模板，分别用引物对F-up-glnR-BamHI与R-up和F-down与R-down-glnR-HindIII扩增glnR基因的上下游同源序列up-glnR(序列如SEQ ID NO:3所示)、down-glnR(序列如SEQID NO:4所示)。PCR条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸10min。采用Omega胶回收试剂盒回收上下游同源臂各1000bp。取等摩尔up-glnR、down-glnR片段加水补足为5μL，再加入5μL的Takara的PrimeSTAR Max DNAPolymerase，PCR条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火2min，72℃延伸2min，15个循环；72℃后延伸10min。以得到的PCR产物为模板，采用引物F-up-glnR-BamHI、R-down-glnR-HindIII继续进行PCR。PCR条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸10min。采用重叠PCR方法得到上下游同源臂的拼接片段up-down-glnR(序列如SEQ ID NO:5所示)。
利用BamHI和HindIII双酶切up-down-glnR片段和质粒pGID023，之后将酶切产物于16℃连接16h后，转化至大肠杆菌JM109中。经菌液PCR、酶切及测序鉴定获得阳性菌株，进而得到将glnR基因上下游同源序列克隆至pGID023的基因敲除质粒pGID023-ΔglnR(如图2所示)。
(1)发生第一次同源重组的单交换菌株的筛选
将构建好的基因敲除质粒pGID023-ΔglnR电转化入短乳杆菌ATCC 367或短乳杆菌D17的感受态细胞，其转化条件为电压2000V～2500V电击5ms，将菌液涂布在含红霉素(终浓度为4μg/μL)的MRS平板上37℃培养，直至长出单克隆。挑选单克隆，用引物对F-GID与R-GID进行PCR验证。挑选转入敲除质粒的正确重组菌。将重组菌单菌落接种至含有红霉素抗性的MRS液体培养基中传代，促进单交换整合的发生。将传代后的菌液稀释后，涂于含红霉素(终浓度为4μg/mL)的MRS平板上，挑取长出的抗性单菌落，接至含红霉素(终浓度为1μg/mL)的MRS培养基中37℃培养24h。取200μL菌液离心去除发酵上清，加入20μL去离子水重悬，并加入0.1g的玻璃粉(0.1mm)，采用珠磨仪破碎2min后，离心取上清进行菌液PCR验证。采用多对引物对F-367-0092与R-367-0090(同源臂两端设计的引物)、F-GID与R-GID、F-367-0092与R-GID、F-GID与R-367-0090验证，PCR条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸10min。确定筛选到正确的单交换子(单交换方式如图3所示)。
(2)发生第二次同源重组的基因敲除菌株的筛选
将单交换子接种到不含抗性的液体MRS培养基中，在无抗的情况下通过传代，促进染色体内的重组。将连续传代后的菌液稀释后，涂布于无抗性的平板。挑取平板上长出的单菌落接种至MRS液体培养基中37℃培养24h，采用上述的方法破碎细胞，取上清进行菌液PCR验证。引物对为F-up-glnR-BamHI与R-down-glnR-HindIII，PCR条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃后延伸10min。筛选出潜在的敲除菌株后，提取潜在敲除菌株的基因组DNA，用引物对F-up-glnR-BamHI与R-down-glnR-HindIII和F-glnR与R-glnR(根据glnR基因内部序列设计引物)进行PCR扩增(如图4所示)并测序验证(如图5所示)。
在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复突变成野生型，另一种就是glnR基因敲除株(图3)。
如图4A所示，采用引物对F-up-glnR-BamHI与R-down-glnR-HindIII，利用ΔglnR突变株的基因组只能扩增出约2000bp大小的PCR产物(含up-glnR和down-glnR)，而利用野生菌基因组可扩增出约2300bp大小的片段，说明在ΔglnR突变株中缺失glnR。如图4B所示采用引物对F-glnR与R-glnR，利用ΔglnR突变株的基因组无法扩增出PCR产物，说明glnR缺失，而利用野生菌基因组可扩增出约300bp大小的片段。
对野生菌与ΔglnR突变株的glnR基因进行测序，glnR缺失片段如图5所示。
通过该方法得到的正确的glnR基因敲除的短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株及短乳杆菌D17ΔglnR突变株。
表1引物
实施例2：短乳杆菌glnR基因敲除菌合成GABA的应用
在无菌条件下，将-80℃保存的短乳杆菌ATCC 367野生菌、ATCC 367ΔglnR突变株、短乳杆菌D17野生菌、D17ΔglnR突变株取出，分别划线于GYP固体平板上，37℃静置培养。
待单菌落长出后从活化的GYP固体平板上挑取短乳杆菌ATCC 367野生菌、ATCC367ΔglnR突变株及D17野生菌、D17ΔglnR突变株单菌落，接种于GYP种子培养基中，37℃静置培养24h。取种子培养液，按10％的接种量接种于新的GYP种子培养基中，37℃静置培养12h后，培养液作为发酵种子。在250mL三角瓶中装入100mL的添加10g/L葡萄糖碳源和50g/L谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基，取培养12h的发酵种子按10％的接种量接种，于37℃×200rpm培养48h。发酵上清液经高效液相色谱检测GABA含量。
结果显示：如图6A所示，短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株的GABA合成能力18.0g/L，相比野生菌ATCC 367的11.8g/L，提高了52.5％；短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株发酵24h,GABA达到最高产量，相比野生菌ATCC 367的48h，缩短了100％；发酵24h，短乳杆菌ATCC367ΔglnR突变株的生产效率为0.72g/L/h，相比野生菌ATCC 367的0.19g/L/h，提高了280％。
如图6B所示，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的GABA合成能力19.3g/L，相比野生菌D17的18.4g/L，仅提高了4.9％；但短乳杆菌D17ΔglnR突变株发酵24h,GABA达到最高产量，相比野生菌D17的36h，缩短到了50％；发酵24h，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的生产效率为0.76g/L/h，相比野生菌D17的0.55g/L/h，提高了38.2％。
综上所述，GlnR对短乳杆菌的GABA合成能力有调控作用，glnR敲除后可显著提高glnR敲除突变株的GABA生产效率。
实施例3：短乳杆菌glnR基因敲除菌提高耐酸性的应用
将斜面上活化的短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株与D17ΔglnR突变株，分别接种于GYP液体培养基中，37℃静置培养24h，制成一级种子培养液。按10％的接种量，将一级种子液接种于新鲜的GYP培养基中，37℃×200rpm培养15h，制成二级种子培养液。将二级种子培养液按10％接种量，接种于10g/L葡萄糖为碳源，10g/L谷氨酸(钠)底物的GYP的发酵培养基中，37℃×200rpm培养10h。9000rpm，4℃离心10min收集细胞。采用pH 7.0的磷酸钾缓冲液重悬菌体后，离心后去除上清。用含有10mM谷氨酸(钠)的pH 7.0的磷酸钾缓冲液重悬菌体，使其OD600为1.0。37℃静置培养0h，1h，2h，2.5h时，立即分别加入9倍体积含有10mM谷氨酸(钠)pH 2.5的磷酸钾缓冲液于不同培养时间的菌悬液中，继续静置培养至3h结束。同样的，用不含谷氨酸(钠)的pH 7.0的磷酸钾缓冲液重悬菌体，使其OD600为1.0。37℃静置培养0h，1h，2h，2.5h时，立即分别加入9倍体积不含谷氨酸(钠)pH 2.5的磷酸钾缓冲液于不同培养时间的菌悬液中，继续静置培养至3h结束。取出所以酸刺激的样品立即用pH 7.4的PBS缓冲液按10-1～10-5梯度稀释，选择合适的梯度，取100μL稀释液涂于GYP平板上，37℃静置培养24h，记录平板上的菌落数。
结果显示：如图7A所示，短乳杆菌ATCC 367野生菌与ATCC 367ΔglnR突变株，在未添加谷氨酸钠的酸性缓冲中0.5h后，完全没有活菌存在。而短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中0.5h后，菌落数为6.8×109cfu/mL，相比野生菌ATCC 367的4.4×109cfu/mL，提高了54.5％；短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中1h后，菌落数为4.9×109cfu/mL，相比野生菌ATCC 367的2.2×109cfu/mL，提高了122.7％；短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中2h后，菌落数为2.4×109cfu/mL，相比野生菌ATCC 367的1.2×109cfu/mL，提高了100％；短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中3h后，菌落数为1.5×109cfu/mL，相比野生菌ATCC 367的2.8×108cfu/mL，提高了435.7％；说明通过在缓冲中添加谷氨酸(钠)，短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株的耐酸能力显著高于野生菌ATCC 367。
如图7B所示，短乳杆菌D17野生菌与D17ΔglnR突变株，在未添加谷氨酸钠的酸性缓冲中刺激0.5h后，完全没有活菌存在。而短乳杆菌D17ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中0.5h后，菌落数为9.6×109cfu/mL，相比野生菌D17的7.0×109cfu/mL，提高了37.1％；短乳杆菌D17ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中1h后，菌落数为7.6×109cfu/mL，相比野生菌D17的3.7×109cfu/mL，提高了105.4％；短乳杆菌D17ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中2h后，菌落数为4.9×109cfu/mL，相比野生菌D17的2.2×109cfu/mL，提高了122.7％；短乳杆菌D17ΔglnR突变株在添加10mM谷氨酸(钠)缓冲中3h后，菌落数为2.6×109cfu/mL，相比野生菌D17的9.0×108cfu/mL，提高了188.9％；说明通过添加10mM谷氨酸(钠)，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的耐受极端酸性环境的能力显著高于野生菌D17。
综上说明GlnR可调控菌株的谷氨酸依赖的酸耐受性，glnR敲除后可有效提高glnR敲除突变株的耐酸性。获得的高耐酸的突变株适用于酸性的食品的发酵剂，如黄酒酿造，酸面团生产等。
实施例4：短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株采用酸碱度调节的批次补料发酵合成GABA的应用
将斜面上活化的短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株，接种于GYP液体培养基中，37℃静置培养24h，制成一级种子培养液。按10％的接种量，将一级种子液接种于新鲜的GYP培养基中，37℃×200rpm培养15h，制成二级种子培养液。将二级种子培养液按10％接种量，接于pH为5，30g/L葡萄糖为碳源及含有74.8g/L谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中。使用生物反应器控制温度37℃，进行200rpm搅拌不通气发酵，以5mol/L硫酸在线控制pH为5.0。在6～24h内，每6h补料(谷氨酸(钠))74.8g(100mL)，发酵72h。采用HPLC分析检测发酵上清液的GABA含量。野生菌ATCC 367采用同样的方法培养和测试发酵上清液的GABA含量。
结果显示，如附图8所示，发酵60h，短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株的GABA合成能力产量最高，为233.9g/L，相比野生菌ATCC 367的10.2g/L，提高了2193％；发酵36h，短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株的生产效率最高为4.88g/L/h，相比野生菌ATCC 367的0.20g/L/h，提高了2340％。
实施例5：短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株采用酸碱度调节的流加葡萄糖的批次补料发酵合成GABA的应用
将斜面上活化的短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株或野生菌ATCC 367，接种于GYP液体培养基中，37℃培养24h，制成一级种子培养液。按10％的接种量，将一级种子液接种于新鲜的GYP培养基中，37℃×200rpm培养15h，制成二级种子培养液。将二级种子培养液按10％接种量，接于pH为5，20g/L葡萄糖为碳源并含74.8g/L谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中，使用生物反应器控制温度37℃，进行200rpm搅拌不通气发酵，以5mol/L硫酸在线控制pH为5.0。在6～36h内每6h补料(谷氨酸(钠))74.8g(100mL)，同时在12～36h流加150g/L葡萄糖，流速为0.625g/h，发酵72h。采用HPLC分析检测发酵上清液的GABA含量。
结果显示，如附图9所示，发酵60h，短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株的GABA合成能力产量最高，为282.8g/L，相比野生菌ATCC 367的14.1g/L，提高了1906％；发酵36h，短乳杆菌ATCC 367ΔglnR突变株的生产效率最高为4.93g/L/h，相比野生菌ATCC 367的0.21g/L/h，提高了2248％。
实施例6：短乳杆菌D17ΔglnR突变株采用酸碱度调节的批次补料发酵合成GABA的应用
将斜面上活化的短乳杆菌D17ΔglnR突变株或野生菌短乳杆菌D17，接种于GYP液体培养基中，37℃培养24h，制成一级种子培养液。按10％的接种量，将一级种子液接种于新鲜的GYP培养基中，37℃×200rpm培养15h，制成二级种子培养液。将二级种子培养液按10％接种量，接于pH为5，50g/L葡萄糖为碳源含74.8g/L谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中。使用生物反应器控制温度37℃，进行200rpm搅拌不通气发酵，以5mol/L硫酸在线控制pH为5.0。在6～24h内每6h补料(谷氨酸(钠))74.8g(100mL)，发酵72h。采用HPLC分析检测发酵上清液的GABA含量。
结果如附图10所示，发酵60h，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的GABA合成能力产量最高，为148.0g/L，相比野生菌D17的116.1g/L，提高了27.4％；发酵18h，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的生产效率最高为5.73g/L/h，相比野生菌D17的3.39g/L/h，提高了70.0％。
实施例7：短乳杆菌D17ΔglnR突变株采用酸碱度调节的流加葡萄糖的批次补料发酵合成GABA的应用
将斜面上活化的短乳杆菌D17ΔglnR突变株或野生菌短乳杆菌D17，接种于GYP液体培养基中，37℃培养24h，制成一级种子培养液。按10％的接种量，将一级种子液接种于新鲜的GYP培养基中，37℃×200rpm培养15h，制成二级种子培养液。将二级种子培养液按10％接种量，接于pH为5，30g/L葡萄糖为碳源并含74.8g/L谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中，使用生物反应器控制温度37℃，进行200rpm搅拌不通气发酵，以5mol/L硫酸在线控制pH为5.0。在6～36h内每6h补料(谷氨酸(钠))74.8g(100mL)，同时在12～36h流加400g/L葡萄糖，流速为2.58g/h，发酵72h。采用HPLC分析检测发酵上清液的GABA含量。
结果如附图11所示，发酵60h，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的GABA合成能力产量最高，为301.5g/L，相比野生菌D17的180.7g/L，提高了66.8％；发酵36h，短乳杆菌D17ΔglnR突变株的生产效率最高为5.76g/L/h，相比野生菌D17的4.93g/L/h，提高了17.0％。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
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1 5 10 15
Thr Val Met Lys Leu Thr Asn Leu Thr Ala Arg Gln Ile Arg Tyr Tyr
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Glu Ala Gln Ala Leu Val Phe Pro Glu Arg Asn Asp Gly Asn Arg Arg
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Leu Ala Asp Gly Ile Asn Ile Ala Gly Ile Lys Ala Ile Tyr Asp Gln
65 70 75 80
Gln His Gln Ala Ala Gln Gln Lys Ala Ala Ala Gln Arg Gln Pro Leu
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Thr Asp Glu Asp Val Arg Arg Ile Leu Gln Asp Glu Phe Ile Arg Gln
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Gly Gly Leu Gly His Pro Thr Pro Gly Ile Gln Gln Gln Arg Pro Leu
115 120 125
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gtttgaaggg gcggtagtgg tgaaagaaaa agaattacgg 1000
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<213> 人工序列
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tgatggcaaa accggaatat tctaaagatg acattcgaca gatggcaaaa gacgaaaacg 120
tcaaattttt acggttaatg tttaccgacc tatttggaac gattaagaac gttgaagtcc 180
caattagtca actaggtaag ttattggata acaagttgat gtttgatggg tcttcaattg 240
acgggttcgt tcggattgag gaaagtgata tgtatcttta tcctgacttg tcgacgtgga 300
tgatcttccc atggagtacg gaacggggaa agattgcacg tgttatctgt gaggtttaca 360
caactgaagg caaaccattt acgggtgatc cgcggaataa tttgatccgg gtgttagatg 420
atatgcgtaa agctggtttt acggacttta acattggacc agaacctgag tttttcttgt 480
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acatggcccc aatggattta ggtgaaaatt gccggcgtga aattgttctg accttggaag 600
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attttaaata tgccgatgcg ttaaccgcgg cagataatat tcaaacgttt aaactggtgg 720
taaagaccat tgcacggaaa tatgggttgt atgcgacctt tatgccgaag ccattggccg 780
gaattaatgg ttctggtatg catttgaata tgtccttatt ccatgatcaa ggcaatgcct 840
tttatgataa agatggtgaa atggaattgt ctgaagacgc ctatcatttc ttaggcggac 900
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tatgggttgt atgcgacctt tatgccgaag ccattggccg gaattaatgg ttctggtatg 1800
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atggaattgt ctgaagacgc ctatcatttc ttaggcggac tgctgaaaca cgcgcggagc 1920
tttacagcca tctgcaaccc aatcgtgaac tcgtataagc ggttagttcc tggttacgaa 1980
gcaccggtct atgttgcttg g 2001
<210> 6
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<212> DNA
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<400> 6
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<213> 人工序列
<400> 15
agcccacctt gacgaatgaa ctc 23

Claims (10)

1.一种γ-氨基丁酸合成能力提高的短乳杆菌，其特征在于，所述短乳杆菌在出发菌株的基础上敲除了glnR基因。
2.根据权利要求1所述的短乳杆菌，其特征在于，所述glnR基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。可选地，编码所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的短乳杆菌，其特征在于，所述出发菌株为任意能够合成GABA的短乳杆菌。可选地，为短乳杆菌D17、模式菌株短乳杆菌ATCC 367、短乳杆菌NCL912、短乳杆菌CGMCC1306或者短乳杆菌145等。
4.根据权利要求1-3任一所述的短乳杆菌，其特征在于，所述敲除，可以使用任意一种已知的敲除方法。比如同源重组，二类内含子(Targetron或Clostron)基因插入失活、CRISPR-Cas基因编辑等。可选地，所述敲除是使用无痕敲除，尤其是基于同源重组的无标记基因敲除。
5.一种提高短乳杆菌菌株γ-氨基丁酸合成能力的方法，其特征在于，所述方法是敲除短乳杆菌菌株中的glnR基因。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述glnR基因表达的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
7.一种合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-4任一所述的敲除了glnR基因的短乳杆菌进行发酵生产。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵生产是将短乳杆菌接种于含有谷氨酸或谷氨酸钠的培养基中进行发酵生产。可选地，所述发酵生产可以是采用如下任意一种方法进行：
(1)将短乳杆菌glnR敲除株，接种于含有谷氨酸(钠)的液体发酵培养基中，进行发酵培养；
(2)发酵过程进行酸碱度调节的批次补料发酵：将短乳杆菌glnR敲除株接种于含谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中，pH控制为4.8-5.5，搅拌但不通气条件下进行发酵；发酵6～24h间补充谷氨酸(钠)底物。优选地，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加；
(3)发酵过程进行酸碱度调节的流加葡萄糖批次补料发酵：将短乳杆菌glnR敲除株接种于含谷氨酸(钠)的GYP发酵培养基中，pH控制为4.8-5.5，搅拌不通气条件下进行发酵；发酵6～36h间补充谷氨酸(钠)底物。优选地，每6h可进行谷氨酸(钠)底物添加，同时在6～36h流加葡萄糖碳源，流加速率0.6～3g/h。
9.一种提高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌的耐酸能力的方法，其特征在于，所述方法是敲除短乳杆菌的glnR基因。
10.权利要求1-4任一所述重组菌或者权利要求5-9任一所述方法，在食品、保健品、制备药物、饲料、化工等领域的应用。可选地，所述食品为酸性发酵食品，比如黄酒或者酸面团。可选地，所述药物为对哺乳动物具有安神、降低血压、改善睡眠的药物。
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