CN106635946A - 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述谷氨酸棒杆菌，具有L‑谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。本发明所述谷氨酸棒杆菌解除了对谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰作用从而增加L‑谷氨酰胺的产量，同时减少L‑谷氨酰胺的分解，使培养基中L‑谷氨酰胺的量增多，进而提高菌株发酵产L‑谷氨酰胺的能力。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L‑谷氨酰胺高产菌株，能有效积累L‑谷氨酰胺，提高L‑谷氨酰胺的产量，为L‑谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础。

Description

一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
背景技术
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，学名为2-氨基-5-羧基戊酰胺，分子式为C5H10N2O3，分子量为146。L-谷氨酰胺是人体内氮源代谢过程中不可缺少的条件性必需氨基酸，对保持肌肉新陈代谢、细胞分化和生长、组织创伤的修复、体内毒素的中和有着重要作用。
L-谷氨酰胺广泛存在于自然界，例如，以游离状态含于南瓜、向日葵的幼苗中。虽然可自天然产物提取谷氨酰胺，但L-Gln的生产方法主要有化学合成法、酶促合成法和发酵法。化学合成法是以L-Glu为原料,经过多步化学反应合成L-Gln。其中研究时间最长、技术条件最成熟的合成法主要有：L-Gln甲酯法(“手性源”合成法)和肼法。合成法的特点是使用化学试剂直接合成,方法直接且反应速度较快,但转化率不高且产品中反应物及副产物残留是限制产品质量和使用范围。酶促合成法生产L-Gln是以NH4 +及谷氨酸作原料，经L-Gln合成酶(GS)催化而成。与化学合成法相比，酶促合成法反应步骤相对简单，其中三磷酸腺苷(ATP)是必需的。ATP价格昂贵，同时酶促反应底物NH4 +、副产品二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制L-Gln的生成，因此该生产方法不能满足大规模工业化生产的需要。
发酵法是目前最常用的L-Gln生产方法，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为生产菌发酵生产L-Gln。谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性，作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产L-氨基酸、核苷酸及其他有机酸。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前L-Gln的菌种的发酵性能仍较差、L-Gln的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种L-谷氨酰胺产量高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。
具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。腺苷酰基转移酶的活性降低或丧失可解除对谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰作用从而增加L-谷氨酰胺的产量。而谷氨酰胺酶活性降低或丧失可减少L-谷氨酰胺的分解，使培养基中L-谷氨酰胺的量增多。
优选的，所述谷氨酸棒杆菌具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因表达同时降低或丧失。
本领域技术人员可以理解所述腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性的降低不限于基因表达的降低，还可以通过对腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶进行蛋白修饰实现。
进一步的，基因表达的降低或丧失的基因编辑技术包括但不限于编码基因被敲除、RNAi干扰。
优选的，所述谷氨酸棒杆菌具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。
在一个实施方案中，本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌MHZ-0512-3，其细胞内glnE和glsA被敲除，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13404。
本发明提供了一种所述谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括：
步骤A、分别构建glnE基因敲除重组载体和glsA基因敲除重组载体；
步骤B、将glnE基因敲除重组载体转化谷酸棒杆菌MHZ-0512-1中获得重组菌株；
步骤C、将glsA基因敲除重组载体转化步骤B获得的重组菌株即得。
优选的，所述glnE基因敲除重组载体和glsA基因敲除重组载体均通过采用同源重组的方法构建。
优选的，所述载体为pK18mobsacB。即所述glnE基因敲除重组载体为pK18mobsacB-ΔglnE。所述glsA基因敲除重组载体为pK18mobsacB-ΔglsA。
利用本发明获得的谷氨酸棒杆菌进行发酵生产，可获得L-谷氨酰胺的有效积累，为L-谷氨酰胺的工业化生产奠定基础。因此本发明还提供了所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产谷氨酰胺中的应用。优选的，所述谷氨酸棒杆菌为保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌MHZ-0512-3。
进一步的，本发明还提供了一种L-谷氨酰胺的生产方法，将保藏编号为CGMCCNo.13404的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。
其中，优选的，所述种子培养基由葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆30g/L组成，pH7.0。
优选的，所述扩繁的条件为33℃、培养5-10小时。
优选的，所述发酵培养基由葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L组成，pH 7.0。
优选的，所述发酵条件为33℃，发酵48h。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述谷氨酸棒杆菌，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。本发明所述谷氨酸棒杆菌解除了对谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰作用从而增加L-谷氨酰胺的产量，同时减少L-谷氨酰胺的分解，使培养基中L-谷氨酰胺的量增多，进而提高菌株发酵产L-谷氨酰胺的能力。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L-谷氨酰胺高产菌株，能有效积累L-谷氨酰胺，提高L-谷氨酰胺的产量，为L-谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础。
生物保藏说明
MHZ-0512-3，分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13404。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组质粒pK18mobsacB-ΔglnE图谱；
图2示重组质粒pK18mobsacB-ΔglsA图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，本实验出发菌株MHZ-0512-1为谷氨酸棒状杆菌ATCC14067。所述BHI液体培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液，所述BHI固体培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液和1.8％琼脂粉。
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-ΔglnE，pK18mobsacB-ΔglsA的构建
在NCBI GenBank数据库中获得谷氨酸棒杆菌ATCC14067glnE基因的核苷酸序列，设计在特定位置(敲除该基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列)引入碱基缺失以使glnE基因失活，基于碱基序列及所选缺失位置合成了四条引物(如表1所示)。
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以A1/A2，A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067的基因组DNA作为模板制备glnE碱基缺失位点的上下游片段。
PCR程序为：98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸20s，循环30次后。所得两个片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化后，利用引物组A1/A4进行overlap PCR扩增得到产物，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化后利用XbaI/SacI进行消化，同时将pK18mobsacB利用XbaI/SacI进行消化，并用T4DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGenBiotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/SacI酶切鉴定得到overlap PCR片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，提取质粒，用T1/T2扩增片段，通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段确实为glnE基因待缺失位点的上下游同源臂片段，即为pK18mobsacB-ΔglnE重组质粒。
pK18mobsacB-ΔglsA质粒的构建与上述类似，同样敲除glsA基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列，所用引物为B1/B3，B2/B4扩增glsA缺失基因的上下游同源臂片段。
表1引物序列
引物 核苷酸序列 SEQID
A1 GCTCTAGACAACTGCGGCAACCTGGGGTGTA 1
A2 GCGACCCAATAAAGGAGGGGAGAAGCTTTTTTACACG 2
A3 GGCCCGGTAACACTAGCCGTGTAAAAAAGCTTCTCCC 3
A4 TCTGTCGACCGCCCAGCGCTTGTAATACGCCA 4
T1 CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG 5
T2 AGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGG 6
B1 GCTCTAGACCTTGCACTTCACGGCTCAT 7
B2 CGCAAAAGAAATCACTAGTCTTGATTCTCCTCTCCATC 8
B3 TTGCGCAGCATGTGGGCGATGGAGAGGAGAATCAAGA 9
B4 TCTGTCGACTTGGATGAAGGTGGTGTCGC 10
实施例2：从MHZ-0512-1菌株构建glnE基因破坏的菌株
谷氨酸棒杆菌感受态的制备：从-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种MHZ-0512-1至BHI固体培养基平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5ml BHI液体培养基(3.7％脑心浸粉)试管中，200rpm，30℃培养12h。按1％接种量接种至100ml BHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD 600达到1.5。4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液。用TG Buffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml 10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。
电转化：将谷氨酸棒杆菌MHZ-0512-1感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μl pK18mobsacB-ΔglnE重组质粒DNA入溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI液体培养基中，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6min，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L卡那霉素的BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养24h。
在含有25mg/L的卡那霉素的BHI固体选择培养基上选择单交换转化体，其中带有glnE碱基缺失的序列通过与内源glnE基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以A1/T2，T1/A4引物对进行菌落PCR鉴定具有卡那霉素抗性的单克隆，PCR反应程序为：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共26个循环。两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。
将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI液体培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的BHI固体培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那霉素抗性表型验证，挑选对卡那霉素抗性敏感的二次重组子利用A1/A4引物对扩增目的片段，阳性克隆的目的片段较野生型所扩增的片段小，将阳性克隆进行测序验证，得到glnE碱基缺失的菌株，命名为MHK-0512-2。
实施例3：从MHZ-0512-2菌株构建glsA基因破坏的菌株
参照实施例2方法制备MHZ-0512-2感受态细胞。通过电转化将重组质粒pK18mobsacB-ΔglsA转化该感受态细胞，并在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中带有glsA碱基缺失的序列通过与内源glsA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定有卡那霉素抗性的单克隆，PCR反应程序为：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共26个循环，两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI液体培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的BHI固体培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选对卡那霉素抗性敏感的二次重组子利用B1/B4引物对扩增目的片段，阳性克隆的目的片段较野生型所扩增的片段小，将阳性克隆进行测序验证，得到glsA碱基缺失的菌株，命名为MHZ-0512-3。
实施例4：从MHZ-0512-1菌株构建glsA基因破坏的菌株
参照实施例2方法制备MHZ-0512-1感受态细胞。通过电转化将重组质粒pK18mobsacB-ΔglsA转化该感受态细胞，并在含有25mg/L卡那霉素抗性的BHI固体选择培养基上筛选转化子，其中带有glsA碱基缺失的序列通过与内源glsA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定Kan R克隆，PCR反应程序为：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共26个循环。两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。
将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI液体培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的BHI固体培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那霉素抗性表型验证，挑选对卡那霉素抗性敏感的二次重组子利用B1/B4引物对扩增目的片段，阳性克隆的目的片段较野生型所扩增的片段小，将阳性克隆进行测序验证，得到glsA碱基缺失的菌株，命名为MHZ-0512-4。
实施例5：L-谷氨酰胺基因工程菌发酵生产L-谷氨酰胺
分别将出发菌株MHZ-0512-1、实施例2-4所构建基因工程菌株MHZ-0512-2、MHZ-0512-3和MHZ-0512-4接种于量程大小为200ml三角瓶进行种子培养，装液量50ml/瓶，装液量为种子培养基含量。然后于量程大小500ml三角摇瓶中进行发酵培养，装液量为20ml/瓶，接种量为10％。培养温度33℃，培养时间48h。每组实验设置三个平行，最终结果取三组实验的平均值。各菌株发酵产L-谷氨酰胺结果见表2。
其中所述种子培养基成分如下：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆30g/L，NaOH调pH7.0。
所述发酵培养基组分如下：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，NaOH调pH7.0。
表2：各菌株发酵产L-谷氨酰胺结果
菌株 OD562(×100) L-Gln含量(g/L) L-Gln转化率(％) L-Glu含量(g/L)
MHZ-0512-1 0.49 14.5 16.11 5.7
MHZ-0512-2 0.48 18.2 20.22 5.4
MHZ-0512-4 0.46 17.6 19.55 0.5
MHZ-0512-3 0.52 28.4 31.55 0.3
由表2可知，敲除glnE基因的菌株MHZ-0512-2谷氨酰胺的产量和对照组菌株MHZ-0512-1相比有所提高，差异显著(P＜0.05)。同样敲除glsA基因的菌株MHZ-0512-4的L-谷氨酰胺的产量有一定的增加，和对照相比差异显著(P＜0.05)，并且副产物L-谷氨酸含量下降。
同时敲除glnE基因和glsA基因的菌株MHZ-0512-3，相比对照组菌株MHZ-0512-1产量具有显著差异(P＜0.05)，产量和转化率有大幅度提高，L-谷氨酰胺产量提高了13.9g/L，转化率提高了15.44％。与对照组菌株相比，此时培养基中只有微量的L-谷氨酸残余。glnE基因和glsA基因的功能同时丧失具有一定的协同作用，使L-谷氨酰胺的产量大幅度提高，副产物含量降低，从而提高了发酵过程中L-谷氨酰胺的产量。
综上所述，本发明所构建的L-谷氨酰胺基因工程菌MHZ-0512-3(保藏编号为CGMCCNo.13404)能够实现发酵过程中L-谷氨酰胺的有效积累，且具有较高的转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
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<213> 人工序列
<400> 10
tctgtcgact tggatgaagg tggtgtcgc 29

Claims (10)

1.一种谷氨酸棒杆菌，其特征在于，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶活性同时降低或丧失。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因表达同时降低或丧失。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。
4.根据权利要求1所述谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13404。
5.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括：
步骤A、分别构建glnE基因敲除重组载体和glsA基因敲除重组载体；
步骤B、将glnE基因敲除重组载体转化谷酸棒杆菌MHZ-0512-1中获得重组菌株；
步骤C、将glsA基因敲除重组载体转化步骤B获得的重组菌株即得。
6.权利要求1-4任意一项所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产谷氨酰胺中的应用。
7.一种L-谷氨酰胺的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。
8.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基由葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆30g/L组成，pH7.0。
9.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述发酵培养基由葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L组成，pH 7.0。
10.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述发酵条件为33℃，发酵48h。
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