CN103045528B - 生产dl-丙氨酸的工程菌及利用该工程菌生产dl-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产DL-丙氨酸的工程菌。该生产DL-丙氨酸工程菌自身的乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脱氢酶、乙酸激酶、富马酸还原酶、丙氨酸消旋酶、甲基乙二醛合成酶均被失活；且其染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因和丙氨酸消旋酶基因。本申请中，通过在工程菌染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因，从而将糖酵解的中间物丙酮酸转化为L-丙氨酸；再进一步的整合外源丙氨酸消旋酶基因，将部分L-丙氨酸转化为D-丙氨酸。从而实现由糖原料一步生产DL-丙氨酸，减小DL-丙氨酸的生产周期，且可提高DL-丙氨酸的产率。
Description
技术领域
本发明涉及DL-丙氨酸生产领域，具体涉及一种生产DL-丙氨酸及利用该工程菌生产DL-丙氨酸的方法。
背景技术
DL-丙氨酸主要用于食品加工业，用作营养增补剂及调味料，具有良好的鲜味，可以增强调味料的调味效果。其次用于医药工业，用于合成一些农药、医药和医药中间体。
目前，DL-丙氨酸的生产主要是通过酶催化技术(丙氨酸消旋酶)或化学消旋法来生产，而化学消旋法因需要以有机酸为溶剂，存在着污染环境和收率偏低等缺点，因此逐渐被淘汰。酶催化技术是先将葡萄糖发酵生成L-丙氨酸，再将L-丙氨酸通过酶催化转化成D-丙氨酸，在该方案中，DL-丙氨酸积累量为30～50g/L，产率偏低，且生产周期长；其次，需要对菌株进行高密度培养以分泌生产DL-丙氨酸所需的丙氨酸消旋酶，该过程对氧气的需求量大；另外，由于丙氨酸消旋酶基因是克隆在质粒上进行高表达的，因此在菌株培养过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传复制。因此该方案也不易实现工业化生产。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种生产DL-丙氨酸的工程菌，该工程菌可利用葡萄糖直接生产DL-丙氨酸，且生产周期短、DL-丙氨酸的产率高。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：该生产DL-丙氨酸的工程菌，是将出发细菌染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、丙氨酸消旋酶基因、甲基乙二醛合成酶基因灭活；且其染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因，筛选得到生产DL-丙氨酸的工程菌。所述灭活的方法为敲除、插入突变、或利用小RNA干扰所述基因的表达。
由于细菌在代谢过程中进行L-丙氨酸合成代谢，因此上述限定的方案可在常用所有细菌中实现，本身申请中优选选用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(统称大肠杆菌)作为生产DL-丙氨酸的工程菌的构建细菌。
所述外源的L-丙氨酸脱氢酶基因来自于嗜热脂肪地芽孢杆菌；所述外源的丙氨酸消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌，优选来源于枯草芽孢杆菌168；丙氨酸消旋酶的失活主要是指大肠杆菌自身的丙氨酸消旋酶(DadX)基因被敲除。
上述构建方案中直接将alaR基因整合到生产L-丙氨酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A26菌株(CN 102329765A)内。XZ-A26菌株于2010年7月26日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.4036。XZ-A26菌株中的乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脱氢酶、乙酸激酶、富马酸还原酶、丙氨酸消旋酶均已被失活且其染色体上已经整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因，因此只需要在XZ-A26菌株染色体上整合外源丙氨酸消旋酶基因，并敲除甲基乙二醛合成酶基因即可。若用原始的细菌构建本发明中生产DL-丙氨酸工程菌，可采用敲除细菌自身染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、丙氨酸消旋酶基因、甲基乙二醛合成酶基因，并整合外源的L-丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶基因来达到相同效果，敲除和整合上述基因的方法可按照名称为“一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用”(CN 102329765A)的中国专利文件中所记载的技术方案进行实施。
本发明生产DL-丙氨酸工程菌的构建方法具体包括以大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)XZ-A26CGMCC No.4036为出发菌株，并将外源的丙氨酸消旋酶基因整合在该菌株染色体上的甲基乙二醛合成酶基因位点。所述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列为序列表中序列14，所述甲基乙二醛合成酶基因的序列为自序列表中序列15的5′端第495-953位核苷酸；所述人工调控元件M1-93的序列为序列表中序列17。
本发明生产DL-丙氨酸的工程菌是通过以下操作步骤构建得到；
(a)丙氨酸消旋酶基因的克隆和整合：
1)构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游臂、氯霉素基因、果聚糖蔗糖转移酶基因和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游臂组成的DNA片段I，将DNA片段I电激转化带有pKD46质粒的大肠埃希氏菌XZ-A26CGMCC No.4036，筛选氯霉素抗性的菌落，并用序列为SEQ ID NO：3的DNA片段和序列SEQ ID NO：4的DNA片段组成的引物对鉴定，获得扩增产物为4111bp的菌株，命名为XZ-A27；
2)构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游臂、lacI基因、trc启动子、枯草芽孢杆菌168的丙氨酸消旋酶基因alaR和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游臂组成的DNA片段II；将DNA片段II电激转化带有pKD46质粒的XZ-A27，用含有蔗糖不含氯化钠的LB培养基培养，并筛选用序列为SEQ ID NO：3的DNA片段和序列SEQID NO：4的DNA片段组成的引物对鉴定扩增产物为4210bp的菌株；命名为XZ-A28；
(b)丙氨酸消旋酶基因alaR的调控：
3)构建DNA片段III；DNA片段III电激转化带有pKD46质粒的XZ-A28，用序列为SEQ ID NO：11的DNA片段和序列SEQ ID NO：13的DNA片段组成的引物对鉴定，获得扩增产物为1890bp的菌株，即为生产DL-丙氨酸的工程菌；
其中，更具体的，DNA片段I的获得方法如下所示：将以大肠杆菌ATCC 8739的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对为引物扩增得到的甲基乙二醛合成酶基因mgsA及其上下游片段，将扩增得到的产物克隆至pEASY-Blunt克隆载体上，获得卡那霉素抗性质粒pXZ-A19；用SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示的DNA片段为引物以pXZ-A19为模板扩增的产物与含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段连接得到质粒pXZ-A20，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的DNA片段为引物，以pXZ-A20质粒DNA为模板，扩增出DNA片段I；其中，含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段的获得方法是以pLOI4162质粒为模板，以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对为引物扩增得到的DNA片段；
DNA片段II的获得方法如下所示：以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物扩增得到的丙氨酸消旋酶基因片段插入到pTrc99A质粒的XbaI和SalI酶切位点之间，获得质粒pTrc99A-alaR；用SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示的DNA片段为引物以pXZ-A19为模板扩增的产物与以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物以pTrc99A-alaR为模板扩增的产物连接得到质粒pXZ-A21，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的DNA片段为引物，以pXZ-A21质粒DNA为模板，扩增出DNA片段II；
DNA片段III的获得方法如下所示：以重组大肠杆菌菌株M1-93的基因组DNA为模板，以序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的DNA片段为引物，扩增得到DNA片段III(序列如序列表中序列16所示)。
更为具体的方案为，该生产DL-丙氨酸的工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)XZ-A30菌株，已于2012年10月12日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.6667。其具有发酵产生高浓度DL-丙氨酸的能力，且D-丙氨酸和L-丙氨酸的光学纯度比例是50∶50。
如图1所示，本申请中，通过在工程菌染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因，从而将糖酵解的中间物丙酮酸转化为L-丙氨酸；再进一步的整合外源丙氨酸消旋酶基因，将部分L-丙氨酸转化为D-丙氨酸。从而实现由糖原料一步生产DL-丙氨酸，减小DL-丙氨酸的生产周期；同时对工程菌自身的乳酸脱氢酶、甲基乙二醛合成酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脱氢酶、乙酸激酶、富马酸还原酶均被失活，避免代谢过程中副产物乳酸、甲酸、乙醇、乙酸、丁二酸的合成，使得原料糖按照限定的途径进行代谢合成DL-丙氨酸，提高DL-丙氨酸的产率。这里所指的DL-丙氨酸是指D-丙氨酸和L-丙氨酸。引入外源丙氨酸消旋酶基因主要是保证生成L-丙氨酸能够有一半转化为D-丙氨酸，使得发酵得到的产物中L-丙氨酸与D-丙氨酸光学纯度比为50∶50，以满足产品的生产需求。
本发明的另一个目的是提供一种利用该工程菌生产DL-丙氨酸的方法，其采取的方案为：
一种生产DL-丙氨酸的方法，在厌氧/有氧培养条件，培养温度为30～42℃，控制pH在6.5～7.5，发酵培养上述构建的生产DL-丙氨酸的工程菌菌株，分离提取DL-丙氨酸。
发酵培养的培养基中由糖类原料、氮源和微量无机盐组成，其中，糖类原料选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、木质纤维素或其水解物和糖浆中的一种或两种以上任意组合；氮源为无机含氮化合物，选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或两种以上任意组合；微量无机盐选自可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或两种以上任意组合；所述培养基优选由葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl22H2O 0.1g/L和微量无机盐4ml/L组成，其中，微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
所述发酵培养的时间为40-60小时；所述发酵培养前还包括将所述工程菌进行种子培养，所述种子培养的条件为30℃，摇床转速为50r/min(50转/分)，培养18h。
利用本发明的工程菌生产DL-丙氨酸工艺简单，只需在起始阶段向发酵罐中投加葡萄糖等糖原和无机盐，并接入少量的该工程菌菌种即可发酵生产DL-丙氨酸。本申请中优选采用的厌氧培养条件下进行发酵，该条件下发酵DL-丙氨酸产量可高达114.6g/L，提高DL-丙氨酸产率和减少能耗，另外发酵过程也不需要添加抗生素，节约原料成本同时提高产品的品质。
附图说明
图1为生产DL-丙氨酸的工程菌代谢途径。
图2为质粒pXZ-A19的示意图。
图3为质粒pXZ-A20的示意图。
图4为质粒pXZ-A21的示意图。
图5为XZ-A30菌株发酵液的高效液相色谱仪测得的组分图谱。
具体实施方式
以下实施例是对本发明进一步的说明，并不构成对本发明实质内容的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中实施例1是构建该生产DL-丙氨酸的工程菌的实施例，实施例2～5是利用实施例1中构建的工程菌生产DL-丙氨酸的实施例，实施例2～5所使用的分析方法为：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定；DL-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(ChiralpakMA(+))；发酵液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H糖分析柱。其中实施例2～5中所得发酵液的组分含量高效液相色谱仪测定的结果如附图5所示。下述实施例中以D-丙氨酸和L-丙氨酸为标准品采用外标法(标准曲线法)进行定量。
实施例1XZ-A30菌株的构建
XZ-A30菌株构建包括(a)、(b)两操作步骤，具体操作如下：
(a)丙氨酸消旋酶基因的克隆和整合
丙氨酸消旋酶基因alaR的克隆和整合，分为以下两个步骤：
(a1)alaR基因的克隆
以枯草芽孢杆菌168(Moszer I，Jones LM，Moreira S，Fabry C，Danchin A.SubtiList：the reference database for the Bacillus subtilis genome.NucleicAcids Res.2002，30(1)：62-65.公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得)的基因组DNA为模板，使用引物alaR up-XbaI/alaR down-SalI，扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR(序列14)。引物序列为：
alaR up-XbaI：GGAGAGTCTAGAATGAGCACAAAACCTTT(SEQ ID NO：1)；
alaR down-SalI：CGCTGCGTCGACTTAATTGCTTATATTTACC(SEQ ID NO：2)。
扩增体系为：Stratagene PfuUltra 10Xbuffer 5ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物(10uM)1ul、PfuUltra(2.5U/ul)1ul、蒸馏水40ul，总体积为50ul。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物克隆到pTrc99A质粒(Amann，E.，Ochs，B.and Abel，K.J.Tightly regulated tac promotervectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichiacoli.Gene.1988，69：301-15.公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得)的XbaI和SalI酶切位点，获得质粒pTrc99A-alaR。
其中，克隆步骤为：将以引物alaR up-XbaI/alaR down-SalI扩增获得的alaR基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有alaR基因的DNA片段(1192bp，含有序列14及引物1和2引入的序列)。酶切体系为：0.2μg的alaR DNA片段，2μl 10*FastDigest Green buffer(Thermo Scientific公司)，1μl FastDigest XbaI(ThermoScientific公司)，1μl FastDigest SalI(Thermo Scientific公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有alaR(序列14)的DNA片段。质粒pTrc99A的酶切体系：1μg的质粒pTrc99A，2μl 10*FastDigestGreen buffer(Thermo Scientific公司)，1μl FastDigest XbaI(Thermo Scientific公司)，1μl FastDigest SalI(Thermo Scientific公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pTrc99A的DNA片段。连接体系：10ng酶切回收的pTrc99A片段，20ng alaR的DNA片段，2μl Quick Ligation ReactionBuffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl Quick T4DNA Ligase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氨苄青霉素(终浓度为100ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将alaR DNA片段克隆到pTrc99A中的质粒)进行测序验证，测序结果在酶切后的pTrc99A质粒中连接上了含有alaR的DNA片段，证明质粒构建正确，质粒命名为pTrc99A-alaR。
(a2)将alaR基因整合到L-丙氨酸生产菌XZ-A26染色体的甲基乙二醛合成酶基因mgsA处
将alaR基因整合到L-丙氨酸生产菌XZ-A26 CGMCC No.4036(专利公告号为CN102329765A，安徽华恒生物工程有限公司)染色体的甲基乙二醛合成酶基因mgsA处，分为以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC 8739(Zhang X，Jantama K，Shanmugam KT，Ingram LO.Re-Engineering Escherichia coli for succinate production in mineral saltsmedium.Appl Environ Microbiol.2009，75(24)：7807-7813，公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得)基因组DNA为模板，使用引物mgsA-up/mgsA-down，扩增大肠杆菌ATCC 8739的甲基乙二醛合成酶基因mgsA(GeneID：6064585)及上下游400bp左右碱基。引物序列为：
mgsA-up：CAGCTCATCA ACCAGGTCAA (SEQ ID NO：3)；
mgsA-down：AAAAGCCGTC ACGTTATTGG (SEQ ID NO：4)。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)各1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、59℃退火10秒、72℃延伸1分钟30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。PCR扩增得到的产物为如序列15所示的DNA片段，该片段包括了甲基乙二醛合成酶基因(自序列表中序列15的5′端第495-953位核苷酸)及该基因的上游400bp左右片段(自序列表中序列15的5′端第1-494位核苷酸)和该基因的下游400bp左右片段(自序列表中序列15的5′端第954-1435位核苷酸)。将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系为：1μl PCR扩增产物、1μl pEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50μl Trans1-T1感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了甲基乙二醛合成酶基因及上下游400bp左右碱基片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ-A19(图2)。
第二步，以pXZ-A19质粒DNA为模板，使用引物mgsA-1/mgsA-3扩增出一段DNA片段，引物序列为：
mgsA-1：AGCGTTATCT CGCGGACCGT (SEQ ID NO：5)；
mgsA-3：GCATTTGTTTGCAGTGATCG (SEQ ID NO：6)。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)各1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)2μl、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、60℃退火10秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。PCR扩增产物包含pEASY-Blunt载体和甲基乙二醛合成酶基因的上下游400bp左右碱基，即pEASY-Blunt载体和自序列15的5′端第925-1435位核苷酸序列和自序列15的5′端第1-570位核苷酸序列。
第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。以pLOI4162质粒(Jantama K，Zhang X，Moore JC，Shanmugam KT，Svoronos SA，Ingram LO.Eliminating side products and increasingsuccinate yields in engineered strains of Escherichia coli C.Biotechnol Bioeng.2008，101(5)：881-893.，公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得)为模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR扩增cat-sacB片段。引物序列为：
cat-sacB-up：GGAGAAAATACCGCATCAGG (SEQ ID NO：7)；
cat-sacB-down：GCGTTGGCCGATTCATTA (SEQ ID NO：8)。
扩增体系同第一步，琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp。将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物的连接体系为：10ng的第二步PCR扩增产物，30ng的cat-sacB DNA片段，2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)，1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μl。室温连接2小时，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ-A19中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ-A20(图3)。
第四步，以pXZ-A20质粒DNA为模板，使用引物mgsA-up/mgsA-down(SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4)扩增出DNA片段I，扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)各1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、59℃退火10秒、72℃延伸1分钟40秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增得到DNA片段I，DNA片段I由依次连接的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游400个左右碱基(自序列15的5′端第1-570位核苷酸序列)、cat-sacB DNA片段、甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游400个左右碱基(自序列15的5′端第925-1435位核苷酸序列)组成。
将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒(Dower et al.，1988；Dower，W.J.，Miller，J.F.，Ragsdale，C.W.1988.High efficiency transformationof E.coli by high voltage electroporation.Nucleic Acids Res.16：6127-6145。公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电激转化至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739。
电激转化条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物mgsA-up/mgsA-down(SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4)进行验证，正确的菌落扩增产物为4111bp。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A27。XZ-A27中，染色体上甲基乙二醛合成酶基因通过同源重组替换为cat-sacB DNA片段。
第五步，以质粒pTrc99A-alaR为模板，使用引物alaR-up/alaR-down扩增出pTrc99A质粒载体上的lacI基因和trc启动子以及丙氨酸消旋酶基因alaR，并连接至第二步PCR扩增产物。引物序列为：
alaR-up：GGCATGCATTTACGTTGACA (SEQ ID NO：9)；
alaR-down：AGAAACGCAAAAAGGCCATC (SEQ ID NO：10)。
克隆体系与中第三步相同。取200μl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15ug/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pXZ-A19上插入了丙氨酸消旋酶基因alaR，证明质粒构建正确，将得到的质粒命名为pXZ-A21(图4)。
第六步，以pXZ-A21质粒DNA为模板，用引物mgsA-up/mgsA-down(SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4)扩增出DNA片段II。DNA片段II有依次连接的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游400个左右碱基(自序列15的5′端第1-570位核苷酸序列)、lacI基因、trc启动子、丙氨酸消旋酶基因alaR、甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游400个左右碱基(自序列15的5′端第925-1435位核苷酸序列)组成。DNA片段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-A27，然后将DNA片段II电激转化至带有pKD46质粒的XZ-A27。
电激转化条件为：首先准备带有pKD46质粒的XZ-A27的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时。将菌液转移至含有10％(质量百分含量)蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6％(质量百分含量)蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物mgsA-up/mgsA-down(SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4)进行验证，正确的菌落扩增产物为4210bp的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A28。XZ-A28中，染色体上cat-sacB DNA片段通过同源重组替换为lacI基因、trc启动子和丙氨酸消旋酶基因alaR。
(b)丙氨酸消旋酶基因alaR的调控
丙氨酸消旋酶基因alaR的调控，共以下两步：
第一步，以重组大肠杆菌菌株M1-93的基因组DNA(Lu J，Tang JL，Liu Y，ZhuX，Zhang T，Zhang X.Combinatorial modulation of galP and glk gene expressionfor improved alternative glucose utilization.Appl Microbiol Biotechnol.2012.93：2455-2462。公众可从安徽华恒生物工程有限公司获得)为模板，使用引物mgsA-up-FRT/mgsA-alaR-FRT-down扩增用于alaR基因表达调控的DNA片段III(序列为序列表中序列16)，引物序列为：
mgsA-up-FRT：ATGGAACTGACGACTCGCACTTTACCTGCGCGGAAACATATTGCGCTGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO：11)；
mgsA-alaR-FRT-down：GACAAGTCAATTTCCGCCCACGTATCTCTGTAAAAAGGTTTTGTGCTCATAGCTGTTTCCTGGTT (SEQ ID NO：12)。
第二步：将DNA片段III电转至带有pKD46质粒的XZ-A28。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌XZ-A28的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段III，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有卡纳霉素(终浓度为15ug/ml)的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物mgsA-up-FRT/alaR-FRT-cexu(SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：13)进行验证，引物序列为：
alaR-FRT-cexu：GCAGCGATTGCCACATACTC (SEQ ID NO：13)。
正确的菌落扩增产物为1890bp，挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A30菌株。在XZ-A30菌株中，丙氨酸消旋酶基因alaR受人工调控元件M1-93(序列17)的调控
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A30菌株，已于2012年10月12日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.6667。其具有发酵产生高浓度DL-丙氨酸的能力，且D-丙氨酸和L-丙氨酸的光学纯度比例是50∶50。
上述XZ-A30菌株的构建过程中所使用所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所使用到质粒(如图2、3、4所示)及其构建如表1所示。
表1：本发明的DL-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒
实施例2以XZ-A30菌株厌氧发酵生产DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为：葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl22H2O 0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH 6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A30，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min(50转/分)，培养18h，用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V，)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm(100转/分)。发酵过程采用氨水控制pH在6.5，发酵时间为48h。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。DL-丙氨酸的定量和手性测定采用大赛璐(Daciel)公司的配基交换型手性异构体液相色谱分离柱(Chiralpak MA(+))。发酵液中的残存葡萄糖和杂酸测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX-87H糖分析柱。
结果：发酵液中DL-丙氨酸和有机酸含量：DL-丙氨酸的浓度为114.6g/L，其中D-丙氨酸为57.3g/L，L-丙氨酸为57.3g/L，D-丙氨酸和L-丙氨酸的光学纯度比例为50∶50(如图5所示)。乳酸含量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含量低于0.1g/L。
实施例3以XZ-A30菌株厌氧发酵生产DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为：葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl22H2O 0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH 6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A30，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min(50转/分)，培养18h，用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V，)，发酵温度为42℃，搅拌转速为100rpm(100转/分)。发酵过程采用氨水控制pH在7.5，发酵时间为60h。
结果：发酵液中DL-丙氨酸和有机酸含量：DL-丙氨酸的浓度为83.2g/L，其中D-丙氨酸为41.6g/L，L-丙氨酸为41.6g/L，D-丙氨酸和L-丙氨酸的光学纯度比例为50∶50。乳酸含量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含量低于0.1g/L。
实施例4以XZ-A30菌株有氧发酵生产DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为：葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl22H2O O.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH 6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A30，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min(50转/分)，培养18h，用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm(100转/分)，通气量(空气)为0.1L/min·L。发酵过程采用氨水控制pH在6.5，发酵时间为40h。
结果：发酵液中DL-丙氨酸和有机酸含量：DL-丙氨酸的浓度为110.8g/L，其中D-丙氨酸为55.4g/L，L-丙氨酸为55.4g/L，D-丙氨酸和L-丙氨酸的光学纯度比例为50∶50。乳酸含量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含量低于0.1g/L。
实施例5以XZ-A30菌株有氧发酵生产DL-丙氨酸
种子培养基和发酵培养基组成均为：葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl22H2O 0.1g/L，微量无机盐4ml/L，培养基pH 6.5。微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg，CuCl2·2H2O 0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却后接入XZ-A30，培养温度为30℃，摇床转速为50r/min(50转/分)，培养18h，用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为0.1％(V/V)，发酵温度为42℃，搅拌转速为100rpm(100转/分)，通气量(空气)为0.1L/min·L。发酵过程采用氨水控制pH在7.5，发酵时间为54h。
结果：发酵液中DL-丙氨酸和有机酸含量：DL-丙氨酸的浓度为80.4g/L，其中D-丙氨酸为40.2g/L，L-丙氨酸为40.2g/L，D-丙氨酸和L-丙氨酸的光学纯度比例为50∶50。乳酸含量低于0.1g/L、乙酸含量低于0.1g/L、乙醇含量低于0.1g/L、丁二酸含量低于0.1g/L。
Claims (10)
1.一种生产DL-丙氨酸的工程菌，其特征在于：是将出发细菌染色体上的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因、丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶基因灭活；且其染色体上整合了外源的L-丙氨酸脱氢酶基因和外源的丙氨酸消旋酶基因，筛选得到生产DL-丙氨酸的工程菌；
所述外源的L-丙氨酸脱氢酶基因来自于嗜热脂肪地芽孢杆菌；所述外源的丙氨酸消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌；
所述生产DL-丙氨酸的工程菌，其构建方法包括以保藏编号为CGMCC No.4036的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A26为出发菌株，将外源的丙氨酸消旋酶基因整合在该菌株染色体的甲基乙二醛合成酶基因位点，并用人工调控元件M1-93对外源的丙氨酸消旋酶基因的表达进行调控；所述外源的丙氨酸消旋酶基因的序列为序列表中序列14，所述甲基乙二醛合成酶基因的序列为自序列表中序列15的5′端第495-953位核苷酸；所述人工调控元件M1-93的序列为序列表中序列17。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述灭活的方法为敲除、插入突变、或利用小RNA干扰所述基因的表达。
3.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述外源的丙氨酸消旋酶基因来自于枯草芽孢杆菌168。
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：该生产DL-丙氨酸的工程菌是通过以下操作步骤构建得到；
1）构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游片段、氯霉素基因、果聚糖蔗糖转移酶基因和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游片段组成的DNA片段I，将DNA片段I电激转化带有pKD46质粒的保藏编号为CGMCC No.4036的大肠埃希氏菌XZ-A26，筛选氯霉素抗性的菌落，并用序列为SEQ ID NO：3的DNA片段和序列SEQ ID NO：4的DNA片段组成的引物对鉴定，获得扩增产物为4111bp的菌株，命名为XZ-A27；DNA片段I的获得方法如下所示：以大肠杆菌ATCC8739的基因组基因为模板，以SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对为引物，扩增得到甲基乙二醛合成酶基因mgsA及其上下游片段，将扩增得到的片段克隆至pEASY-Blunt克隆载体上，获得卡那霉素抗性质粒pXZ-A19；将以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的DNA片段为引物，以pXZ-A19为模板所扩增的产物与含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段连接，得到质粒pXZ-A20，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的DNA片段为引物，以pXZ-A20质粒DNA为模板，扩增出DNA片段I；其中，含有氯霉素基因和果聚糖蔗糖转移酶基因的DNA片段的获得方法是以pLOI4162为模板，以SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示的引物对为引物扩增得到的DNA片段；
2）构建由依次串联的甲基乙二醛合成酶基因mgsA上游臂、lacI基因、trc启动子、枯草芽孢杆菌168的丙氨酸消旋酶基因和甲基乙二醛合成酶基因mgsA下游臂组成的DNA片段II；将DNA片段II电激转化带有pKD46质粒的XZ-A27，用含有蔗糖不含氯化钠的LB培养基培养，并用序列SEQ ID NO：3的DNA片段和序列SEQ ID NO：4的DNA片段组成的引物对筛选鉴定，将扩增产物为4210bp的菌株命名为XZ-A28；DNA片段II的获得方法如下所示：以枯草芽孢杆菌168为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2为引物扩增得到的丙氨酸消旋酶基因片段插入到pTrc99A质粒的XbaI和SalI酶切位点之间，获得质粒pTrc99A-alaR；将以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的DNA片段为引物，以pXZ-A19为模板扩增的产物，与用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物对扩增质粒pTrc99A-alaR的lacI基因和trc启动子以及丙氨酸消旋酶基因alaR所得的片段连接，得到质粒pXZ-A21，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的DNA片段为引物，以pXZ-A21质粒DNA为模板，扩增出DNA片段II；
3）构建DNA片段III；DNA片段III电激转化带有pKD46质粒的XZ-A28，用序列为SEQ ID NO：11的DNA片段和序列SEQ ID NO：13的DNA片段组成的引物对鉴定，获得扩增产物为1890bp的菌株，即为生产DL-丙氨酸的工程菌；DNA片段III的序列为序列表中序列16。
5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述生产DL-丙氨酸的工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)XZ-A30，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6667。
6.权利要求1-5中任意一项所述的工程菌在生产DL-丙氨酸中的应用。
7.一种生产DL-丙氨酸的方法，是在厌氧或有氧培养条件下，控制培养温度为30～42℃，pH为6.5～7.5，发酵培养权利要求1-5中任意一项所述的工程菌，分离提取DL-丙氨酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：发酵培养的培养基中由糖类原料、氮源和微量无机盐组成，其中，糖类原料选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、木质纤维素或其水解物和糖浆中的一种或两种以上任意组合；氮源为无机含氮化合物，选自氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或两种以上任意组合；微量无机盐选自可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钼酸盐中的一种或两种以上任意组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养基由葡萄糖120g/L，氯化铵4g/L，NaH2PO45g/L，Na2HPO45g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O0.1g/L和微量无机盐4ml/L组成，其中，微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O1.5mg，CoCl2·6H2O0.1mg，CuCl2·2H2O0.1mg，ZnCl20.1mg，Na2MoO4·2H2O0.1mg，MnCl2·4H2O20.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的时间为40-60小时；所述发酵培养前还包括将所述工程菌进行种子培养，所述种子培养的条件为30℃，摇床转速为50转/分，培养18小时。
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