CN105734002B - 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备重组谷氨酸生产菌株的方法，该方法包括：使谷氨酸生产菌株中的基因pitR失活并使非PTS葡萄糖转运系统基因过量表达，所述非PTS葡萄糖转运系统基因包括基因iolT1和/或iolT2；和/或，使PTS葡萄糖转运系统基因失活并使葡萄糖激酶基因过量表达，所述PTS葡萄糖转运系统基因选自基因ptsI、ptsH或ptsG中的至少一个，所述葡萄糖激酶基因包括基因glk和/或ppgK。本发明还公开了由上述方法制得的重组谷氨酸生产菌株及其在发酵产谷氨酸中的应用。通过以上技术方案，本发明获得了葡萄糖转化率大、谷氨酸产量高的重组谷氨酸生产菌株，即，本发明的重组谷氨酸生产菌株具有较高的生产性能。

Description

一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用。

背景技术

工业生产和学术研究一般使用具有产生L-谷氨酸能力的棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)或短杆菌属(Brevibacterium spp.)细菌(现在一般认为短杆菌属细菌也属于棒状杆菌属)发酵产生L-谷氨酸。为了提高这些L-谷氨酸产生细菌的生产能力，使用从自然界分离的细菌菌株，或它们的人工突变菌株，或通过基因重组修饰的菌株。

目前，野生型的谷氨酸生产菌株具有较低产酸性能，因此，研究具有高产酸性能的基因工程菌具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有高产酸性能的重组谷氨酸生产菌株及其制备方法。

本发明的发明人发现，通过使基因pitR或PTS葡萄糖转运系统基因失活并使非PTS葡萄糖转运系统基因或葡萄糖激酶基因过量表达即可显著提高谷氨酸生产菌株的产酸性能，因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种制备重组谷氨酸生产菌株的方法，该方法包括：使谷氨酸生产菌株中的基因pitR失活并使非PTS葡萄糖转运系统基因过量表达，所述非PTS葡萄糖转运系统基因包括基因iolT1和/或iolT2；和/或，使PTS葡萄糖转运系统基因失活并使葡萄糖激酶基因过量表达，所述PTS葡萄糖转运系统基因选自基因ptsI、ptsH或ptsG中的至少一个，所述葡萄糖激酶基因包括基因glk和/或ppgK。

第二方面，本发明提供了由第一方面所述的方法制得的重组谷氨酸生产菌株。

第三方面，本发明提供了第二方面所述的重组谷氨酸生产菌株在发酵产谷氨酸中的应用。

通过以上技术方案，本发明获得了葡萄糖转化率大、谷氨酸产量高的重组谷氨酸生产菌株，即，本发明的重组谷氨酸生产菌株具有较高的产酸性能(或生产性能)。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中，在未做相反说明的情况下，述及的基因均指谷氨酸生产菌株基因组中的基因；“产酸性能”是指当在培养基中培养谷氨酸生产菌株时，在培养基或细胞中积累并向胞外运输L-谷氨酸的能力；“PTS”表示磷酸烯醇式丙酮酸依赖型糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system)；“iolT1”表示内消旋肌醇透性酶1基因(Myo-inositol facilitator 1，如Gene ID：14791469)；“iolT2”表示内消旋肌醇透性酶2基因(Myo-inositol facilitator 2，如Gene ID：1021001)；“glk”表示葡萄糖激酶基因(glucokinase，如Gene ID：3344807)；“ppgK”表示多磷酸盐葡糖激酶(polyphosphate glucokinase，如Gene ID：3344173)；“ptsI”表示PTS的酶I基因(phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system ENZYME I，如Gene ID：3345481)；“ptsH”表示PTS的磷酸组氨酸蛋白-己糖磷酸转移酶元件基因(phosphohistidinoprotein-hexose phosphotransferase component of PTS，如GeneID：3345653)；“ptsG”表示PTS葡萄糖转运系统基因(glucose-specific enzyme II BCcomponent of PTS，如Gene ID：3344282)；“pitR”表示次级葡萄糖转运系统抑制基因(如Gene ID：1020455)；“使基因失活”意指抑制该基因的表达且失活后的基因表达水平为失活前的10％以下；“使基因过量表达”意指增强该基因的表达且过量表达后的基因表达水平为过量表达前的120％以上。

本发明提供的制备重组谷氨酸生产菌株的方法包括：使谷氨酸生产菌株中的基因pitR失活并使非PTS葡萄糖转运系统基因过量表达，所述非PTS葡萄糖转运系统基因包括基因iolT1和/或iolT2；和/或，使PTS葡萄糖转运系统基因失活并使葡萄糖激酶基因过量表达，所述PTS葡萄糖转运系统基因选自基因ptsI、ptsH或ptsG中的至少一个(或两个，或三个)，所述葡萄糖激酶基因包括基因glk和/或ppgK。

优选地，所述非PTS葡萄糖转运系统基因为基因iolT1。

优选地，所述PTS葡萄糖转运系统基因为基因ptsI。

优选地，所述葡萄糖激酶基因为基因glk。

根据本发明最优选的实施方式，所述方法包括：使基因pitR失活并使基因iolT1过量表达，使基因ptsI失活并使glk过量表达。

本发明中，使基因失活的方式可以为同源敲除、移码突变和反义RNA干扰中的至少一种。失活的靶点可以为核糖体结合位点(RBS)、启动子及开放阅读框。

本发明优选采用同源敲除的方法使基因失活，同源敲除的方法可以为：根据数据库上公布的谷氨酸生产菌株相关的基因序列进行人工合成，或者利用PCR的方法从谷氨酸生产菌株的基因组上扩增靶基因并进行测序，从而获得靶基因的初始同源序列。在此，靶基因的部分或全部初始同源序列是指含有上述编码相关基因的序列。

同源敲除、移码突变和反义RNA干扰的具体操作方法均可以参照“Corynebacterium Glutamicum:Biology and Biotechnology”(Yukawa等人，Springer出版社，第51-106页，2012)，在此不再进行赘述。

本发明中，使基因过量表达的方式为将携带有该基因的表达载体导入谷氨酸生产菌株和/或强化该基因的启动子(包括增强启动子的启动能力和/或增加启动子的数量)。可以利用不同的中、低拷贝数质粒载体进行过量表达，利用基因组整合型质粒进行基因组单拷贝过量表达，或通过将原有基因启动子替换为启动能力更高的启动子等方法。类似地，具体操作均可以参照“Corynebacterium Glutamicum:Biology and Biotechnology”(Yukawa等人，Springer出版社，第51-106页，2012)，在此不再进行赘述。

本发明中，所述谷氨酸生产菌株为野生型的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，如谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032(中国工业微生物菌种保藏管理中心，货号为CICC20213)或谷氨酸棒杆菌野生菌株S9114(中国工业微生物菌种保藏管理中心，货号为CICC20935)。

本发明的方法可以包括：将经改造的基因序列用于构建具有基因敲除或基因过量表达功能的质粒，将所述质粒转化谷氨酸生产菌株(感受态细胞)，然后进行菌株筛选，即得到重组谷氨酸生产菌株。本发明的要点在于使特定的基因失活和/或过量表达，对转化和菌株筛选等操作均无特别的要求。

根据本发明的优选实施方式，使基因pitR失活并使基因iolT1过量表达的方式为：将SEQ ID NO：1所示的序列(ΔpitR::iolT1-LR序列)连接至pK18mobsacB质粒的Xba I酶切位点和Hind III酶切位点之间，并将得到的重组质粒导入谷氨酸生产菌株。根据本发明的优选实施方式，使基因ptsI失活并使glk过量表达所述方法为：将SEQ ID NO：2所示的序列(ΔptsI::glk-LR序列)连接至pK18mobsacB质粒的Xba I酶切位点和Hind III酶切位点之间，并将得到的重组质粒导入谷氨酸生产菌株。

本发明中，将构建的重组质粒转化(导入)生产谷氨酸生产菌株的方法可以为本领域常规的转化方法(为先制备谷氨酸生产菌株的感受态细胞，然后用重组质粒转化感受态细胞)，例如可以为电击转化或化学转化法。其中，感受态细胞可以人工制备，也可以商购获得。

感受态细胞的制备方法可以为本领域常规的制备感受态细胞的方法，例如，可以为：(a)、挑取在固体培养基平板上生长了1天的谷氨酸生产菌株的单菌落接种到含5-10mL正常液体培养基的大试管中，30-32℃培养过夜；(b)、取400-450μL种子液转接到30-35mL制备感受态所需液体培养基中，在30-32℃下150-160rpm的转速下振荡培养，至OD₆₀₀达到0.8-0.9时(该过程需要3-5h)，在冷冻离心机中4℃下，8000rpm收集细胞；(c)、用10体积％的甘油洗涤细胞3-4遍，最后将细胞悬浮在0.5mL的甘油(10体积％)中；(d)、将制得的感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使用。

本发明中，电击转化谷氨酸生产菌株的感受态细胞的方法可以为本领域常规的电击转化的方法，例如，可以为：(a)、取50-60μL感受态细胞与5-6μL已构建完成的具有经密码子偏好性改造的基因的质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；(b)、将电转杯置于冰浴上20min；(c)、冰浴后在电转参数为25μF、2.5kV、电击时间为5-8ms的条件下进行电击转化；(d)、电转化结束后，立即加入600-800μL的正常液体培养基；(e)、46-50℃水浴中热击6-7min；(f)、热击结束后将电转化后细胞在30-32℃条件下温育2-3h；(g)、5000rpm离心2min收集细胞，除去多余上清，留100-200μL上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂布。

本发明中，菌株筛选方法可以本领域常规的筛选方法，例如，可以为：(a)、将上述重悬细胞均匀涂布在含有25-26μg/mL抗生素的LB固体培养基平板上，30-32℃条件下静置培养24-48h，待长出菌落后挑取具有抗性的菌落至LB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；(b)、吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基平板上，能够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞，将该菌株细胞进行基因PCR扩增实验；(c)、将扩增实验显阳性的菌株进行液体扩大培养，并利用细菌质粒提取试剂盒对含有经密码子偏好性改造的基因的质粒的谷氨酸生产菌株进行质粒提取，然后以该提取的质粒为模板进行PCR扩增；(d)、将步骤(c)中PCR扩增产物序列送测序公司进行测定，若测序结果与上述待合成的序列相同，则证明经密码子偏好性改造的基因的质粒已导入到了的谷氨酸生产菌株中。

本发明还提供了由上述方法制备的重组谷氨酸生产菌株。

此外，本发明还提供了上述重组谷氨酸生产菌株在发酵产谷氨酸中的应用。

本发明中，对本发明的重组谷氨酸生产菌株进行发酵培养可以获得谷氨酸。其中，发酵培养的方法可以为本领域常规的用于谷氨酸生产的发酵方法。例如，发酵培养的方法可以为：分别将冻存于-80℃冰箱中的甘油冻存管中谷氨酸生产菌株接种于谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，然后过夜培养，将过夜培养液进行扩大培养，制得种子液；以10体积％的接种量分别将上述种子液接种至装有2-3L谷氨酸生产发酵培养基的5L全自动发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为30-32℃，初始通气量为1-2L/min，初始搅拌速度为500-600rpm，发酵过程中相关参数控制可以如下：温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为30-32℃，并且每间隔3-5h使发酵温度提高0.5℃；溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使发酵菌种在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5％-10％，而在产酸旺盛的对数生长期溶氧浓度控制在20％-25％；pH值：发酵过程中自动流加25重量％的氨水控制发酵液的pH值在7.0-7.2；泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况流加15-25％(w/v)浓度的泡敌进行消泡；补料：当残糖含量降至1％时，采用流加40-60％(w/v)浓度的葡萄糖溶液的方式进行补料。

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不用于限制本发明。

在以下实施例和对比例中所涉及的培养基的种类和组成如下：

(1)LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl；LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，15g/L琼脂；

(2)谷氨酸棒杆菌液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L葡萄糖；谷氨酸棒杆菌固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L葡萄糖，15g/L琼脂；

(3)制备谷氨酸棒杆菌感受态所需的培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L葡萄糖，40g/L甘氨酸；

(4)谷氨酸生产种子培养基：26g/L葡萄糖，2.8g/L玉米浆，5.6g/L尿素，1.6g/LK₂HPO₄·3H₂O，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH＝7.1±0.1；

(5)谷氨酸生产发酵培养基：140g/L葡萄糖，3.0g/L玉米浆，2.0g/L糖蜜，2.0g/LNa₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KCl，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，2mg/L MnSO₄·H₂O，2mg/L FeSO₄·7H₂O，0.2mg/L维生素B1，pH＝7.1±0.1。

在以下实施例和对比例中，pK18mobsacB质粒购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，货号为SMD1168H；谷氨酸棒杆菌野生菌株S9114购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，货号为CICC20935。双酶切试剂为购自天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒，连接反应试剂为购自天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒。

所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列(5’-3’)如下：

pitR*F：CCAGAACATTGGTCGGTA(SEQ ID NO：3)

pitR*R：GTGGGCTTAGGTTTTGAG(SEQ ID NO：4)

ptsI*F：GAATCGCATCAACCTCCA(SEQ ID NO：5)

ptsI*R：TGTTGAGCACCAATGAGC(SEQ ID NO：6)

iolT1F：TCGTTCGACTTTATGGCC(SEQ ID NO：7)

iolT1R：TAGTCGGAGGGGTCGTTT(SEQ ID NO：8)

glkF：GGCACTCTTATGCCACAAC(SEQ ID NO：9)

glkR：AGCCAACTAGGTGTTTTTCG(SEQ ID NO：10)

实施例1

本实施例用于说明本发明的重组谷氨酸生产菌株及其制备方法

(1)设计并合成pitR基因敲除并iolT1基因过量表达同源臂序列(ΔpitR::iolT1-LR)：左同源臂序列(ΔpitR::iolT1-L)719bp、右同源臂序列(ΔpitR::iolT1-R)821bp、以及连接于ΔpitR::iolT1-L和ΔpitR::iolT1-R之间的过量表达iolT1基因的序列(包括tac启动子260bp，核糖体结合位点序列14bp，谷氨酸棒杆菌CICC20935的iolT1基因1476bp，T7终止子152bp，共1902bp)；ΔpitR::iolT1-LR同源序列共3442bp，序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)对合成的ΔpitR::iolT1-LR基因序列进行Xba I和Hind III双酶切，分别切除5'端6bp和3'端6bp序列，形成两端带有Xba I和Hind III酶切位点粘性末端的线性DNA序列ΔpitR::iolT1-LR-；对pK18mobsacB质粒进行Xba I和Hind III双酶切，使pK18mobsacB形成两端带有Xba I和Hind III酶切位点粘性末端的线性DNA质粒载体pK18mobsacB-，将带有Xba I和Hind III酶切位点粘性末端的线性DNA序列ΔpitR::iolT1-LR-与pK18mobsacB-质粒进行连接反应，得到pK18mobsacB-ΔpitR::iolT1质粒；

其中，对合成的ΔpitR::iolT1-LR基因序列进行Xba I和Hind III双酶切的体系为：Xba I，1μL；Hind III，1μL；10×M Buffer，2μL；ΔpitR::iolT1-LR DNA，≤1μg；ddH₂O₂加至反应体系为20μL。反应过程为将装载上述20μL反应体系的EP管，置于37℃水浴锅中进行酶切1h。

对pK18mobsacB质粒进行Xba I和Hind III双酶切的体系为：Xba I，1μL；HindIII，1μL；10×M Buffer，2μL；pK18mobsacB质粒，≤1μg；ddH₂O₂加至反应体系为20μL。反应过程为将装载上述20μL反应体系的EP管，置于37℃水浴锅中进行酶切1h。

连接反应的体系为：ΔpitR::iolT1-LR-序列DNA，7μL；pK18mobsacB-，1μL；10×T4DNA Ligation Buffer，1μL；T4DNA Ligase，1μL，过程为在16℃下连接过夜。

(3)采用电击转化法将pK18mobsacB-ΔpitR::iolT1质粒导入到谷氨酸棒杆菌CICC20935野生型菌株感受态细胞中，然后进行菌株筛选。

制备谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞的方法为：(a)、挑取在谷氨酸棒杆菌固体培养基上生长了1天的谷氨酸棒杆菌CICC20935的单菌落接种到含5mL谷氨酸棒杆菌液体培养基的大试管中，30℃培养过夜；(b)、取400μL种子液转接到30mL制备谷氨酸棒杆菌感受态所需的液体培养基中，在30℃下150rpm的转速下振荡培养，至OD₆₀₀达到0.8时，在冷冻离心机中4℃下，8000rpm收集细胞；(c)、用10体积％的甘油洗涤细胞4遍，最后将细胞悬浮在0.5mL的甘油(10体积％)中；(d)、将制得的谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使用。

电击转化法的具体过程为：(a)、取50μL谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞与5μLpK18mobsacB-ΔpitR::iolT1质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；(b)、将电转杯置于冰浴上20min；(c)、冰浴后在电转参数为25μF、2.5kV、电击时间为5ms的条件下进行电击转化；(d)、电转化结束后，立即加入600μL的正常液体培养基；(e)、46℃水浴中热击6min；(f)、热击结束后将电转化后细胞在30℃条件下温育2h；(g)、5000rpm离心2min收集细胞，除去多余上清，留100μL上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂布。

菌株筛选方法为：(a)、将上述重悬细胞均匀涂布在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，30℃条件下静置培养24h，待长出菌落后挑取具有卡那霉素抗性的菌落至5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；(b)、吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基上，能够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞，挑取具有双重抗性的菌株细胞的单克隆于10mL的液体培养基中，在30℃条件下180rpm振荡培养12h后备用，采用上述引物对过夜菌液进行基因PCR扩增实验；(c)、将扩增实验显阳性的菌株进行液体扩大培养，以该扩大培养的菌液为模板进行PCR扩增实验；(d)、将步骤(c)中PCR扩增产物序列送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，若测序结果与ΔpitR::iolT1基因序列相同，则证明pK18mobsacB-ΔpitR::iolT1质粒已导入到谷氨酸棒杆菌CICC20935菌株中，得到了重组谷氨酸生产菌株CICC20935-ΔpitR::iolT1，将该菌株编号为A1。

其中，步骤(b)和(c)中的PCR扩增实验的体系为：2×PrimeSTARMax Premix，25μL；pitR*F，0.5μL；pitR*R，0.5μL；菌液，10μL；ddH₂O，14μL；总体系50μL；PCR扩增条件为：94℃×3min；94℃×30s；58℃×30s；72℃×45s×30个循环；72℃×5min；12℃×∞。

实施例2

本实施例用于说明本发明的重组谷氨酸生产菌株及其制备方法

(1)设计并合成ptsI基因敲除并glk基因过量表达同源臂序列(ΔptsI::glk-LR)：左同源臂序列(ΔptsI::glk-L)909bp、右同源臂序列(ΔptsI::glk-R)909bp、以及连接于ΔptsI::glk-L和ΔptsI::glk-R之间的过量表达glk基因的序列(包括tac启动子260bp，核糖体结合位点序列14bp，谷氨酸棒杆菌CICC20935的glk基因972bp，T7终止子152bp，共1398bp)；ΔptsI::glk-LR同源序列共3216bp，序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)采用与实施例1步骤(2)相同的方法对合成的ΔptsI::glk-LR基因序列进行Xba I和Hind III双酶切，从而得到pK18mobsacB-ΔptsI::glk质粒；

(3)参照与实施例1步骤(3)相同的方法，采用电击转化法将pK18mobsacB-ΔptsI::glk质粒导入到A1的感受态细胞中，然后进行菌株筛选，得到重组谷氨酸生产菌株A2。

对比例1

按照实施例1的方法制备谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞，然后将pK18mobsacB质粒采用实施例1的方式电击转化谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞，得到导入有空质粒pK18mobsacB的谷氨酸菌株，将该菌株编号为D1。

测试例1

将以上实施例和对比例制得的菌株A1、A2和D1分别进行发酵验证实验。

发酵验证实验具体过程为：分别将冻存于-80℃冰箱中的甘油冻存管中菌株A1、A2和D1各100μL接种于100mL谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，于32℃下150rpm培养过夜；从该过夜的培养液中吸取20mL液体，接种于200mL谷氨酸生产种子培养基中，于32℃下200rpm条件下培养10h，制得种子液。

以10体积％的接种量分别将上述种子液接种至装有2L谷氨酸生产发酵培养基的5L全自动发酵罐(每个菌株2个平行，结果取平均值)中，控制发酵罐起始培养温度为32℃，初始通气量为1.5L/min，初始搅拌速度为560rpm，发酵过程中相关参数控制如下：

温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为32℃，并且每间隔4h使发酵温度提高0.5℃；

溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使发酵菌种在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5％-10％，而在产酸旺盛的对数生长期溶氧浓度控制在20％-25％；

pH值：发酵过程中自动流加25重量％的氨水控制发酵液的pH值在7.0-7.2；

泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况流加20％(w/v)浓度的泡敌进行消泡；

补料：当残糖含量降至1％时，采用流加50％(w/v)浓度葡萄糖溶液进行补料；

在发酵32h时，采用SBA-40E型葡萄糖-谷氨酸生物分析仪分别测定上述6个发酵罐中的发酵液产生的L-谷氨酸的产量和葡萄糖的含量，测试结果见表1。

采用如下公式计算糖酸转化率：

糖酸转化率＝C_谷氨酸×V_发酵液/(285+500×V_流加糖)×100％

C_谷氨酸表示发酵结束后发酵液中谷氨酸的浓度；

V_发酵液表示发酵结束后发酵液的体积；

V_流加糖表示发酵结束后所用流加糖液的总体积。

表1

实施例	菌株	基因型	谷氨酸产量	糖酸转化率	OD<sub>600</sub>值
						实施例1	A1	ΔpitR::iolT1	86.5g/L	51.2％	38.72
实施例2	A2	ΔpitR::iolT1,ΔptsI::glk	96.1g/L	53.8％	32.29
						对比例1	D1	野生型	83.8g/L	50.3％	40.31

通过表1的数据可以看出，菌株A2与菌株D1相比发酵液中谷氨酸含量提高了12.3％，转化率提高了3.5％，本发明的方法制得的重组谷氨酸生产菌株用于发酵产生L-谷氨酸的含量较高，且糖酸转化率也较高，表明本发明的方法制得的重组谷氨酸生产菌株具有较强的产酸能力。

而敲除pitR、ptsI并对iolT1、glk过量表达的菌株A2与只敲除pitR并对iolT1进行过量表达的菌株A1相比，发酵液中谷氨酸含量增加了9.6％，转化率提高了2.6％，说明采用本发明优选实施方式获得的重组谷氨酸生产菌株具有更佳的产酸性能。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种制备重组谷氨酸生产菌株的方法，其特征在于，该方法包括：

使谷氨酸生产菌株中的基因pitR失活并使非PTS葡萄糖转运系统基因过量表达，所述非PTS葡萄糖转运系统基因包括基因iolT1和/或iolT2；或者，

使谷氨酸生产菌株中的基因pitR失活并使非PTS葡萄糖转运系统基因过量表达，所述非PTS葡萄糖转运系统基因包括基因iolT1和/或iolT2，并使PTS葡萄糖转运系统基因失活并使葡萄糖激酶基因过量表达，所述PTS葡萄糖转运系统基因选自基因ptsI、ptsH或ptsG中的至少一个，所述葡萄糖激酶基因包括基因glk和/或ppgK；

其中，基因pitR为Gene ID：1020455。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非PTS葡萄糖转运系统基因为基因iolT1。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PTS葡萄糖转运系统基因为基因ptsI。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述葡萄糖激酶基因为基因glk。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：使基因pitR失活并使基因iolT1过量表达，使基因ptsI失活并使glk过量表达。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，使基因失活的方式为同源敲除、移码突变和反义RNA干扰中的至少一种；使基因过量表达的方式为将携带有该基因的表达载体导入谷氨酸生产菌株和/或强化该基因的启动子。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，使基因pitR失活并使基因iolT1过量表达的方式为：将SEQ ID NO：1所示的序列连接至pK18mobsacB质粒的Xba I酶切位点和Hind III酶切位点之间，并将得到的重组质粒导入谷氨酸生产菌株；使基因ptsI失活并使glk过量表达所述方法为：将SEQ ID NO：2所示的序列连接至pK18mobsacB质粒的Xba I酶切位点和HindIII酶切位点之间，并将得到的重组质粒导入谷氨酸生产菌株。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述谷氨酸生产菌株为野生型的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

9.由权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的重组谷氨酸生产菌株。

10.权利要求9所述的重组谷氨酸生产菌株在发酵产谷氨酸中的应用。