CN106414714A - 生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2‑氨基苯甲酸从可再生资源发酵生产苯胺 - Google Patents

生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2‑氨基苯甲酸从可再生资源发酵生产苯胺 Download PDF

Info

Publication number
CN106414714A
CN106414714A CN201580019598.1A CN201580019598A CN106414714A CN 106414714 A CN106414714 A CN 106414714A CN 201580019598 A CN201580019598 A CN 201580019598A CN 106414714 A CN106414714 A CN 106414714A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
trpd
corynebacterium glutamicum
acid
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580019598.1A
Other languages
English (en)
Inventor
G.耶格
J.马格努斯
A.S.穆萨
G.奥尔夫
G.洛利
S.贝恩肯
J-W.尹
M.雅尔法尼
G.施普伦格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Covestro Deutschland AG
Original Assignee
Bayer MaterialScience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer MaterialScience AG filed Critical Bayer MaterialScience AG
Publication of CN106414714A publication Critical patent/CN106414714A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • B01J20/16—Alumino-silicates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C209/68—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton from amines, by reactions not involving amino groups, e.g. reduction of unsaturated amines, aromatisation, or substitution of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/43—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C07C211/44—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton having amino groups bound to only one six-membered aromatic ring
    • C07C211/45—Monoamines
    • C07C211/46—Aniline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02018—Anthranilate phosphoribosyltransferase (2.4.2.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99005—Chorismate mutase (5.4.99.5)

Abstract

本发明提供了能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐的重组微生物宿主细胞。本发明还提供了生产苯胺的方法，其包括步骤：a）使用能够将包含至少一种可发酵的碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐的重组微生物宿主细胞，通过发酵所述包含至少一种可发酵的碳底物的原料来生产邻氨基苯甲酸和/或盐，其中所述邻氨基苯甲酸和/或盐包含邻氨基苯甲酸阴离子，b）通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸，c）通过沉淀或通过溶解于有机溶剂回收所述邻氨基苯甲酸，和d）通过在有机溶剂中的热脱羧反应将所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。

Description

生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2-氨基苯甲酸从 可再生资源发酵生产苯胺
本发明涉及从可再生资源原料（如生物质）生产苯胺的领域，其经合适微生物宿主随后将中间产物化学转化为苯胺。
目前每年以数百万吨从化石原料生产苯胺，例如以生产聚氨酯。基于可再生资源的苯胺来源也称为“生物苯胺(bioaniline)”,对于化学工业而言是强烈需求的，从而不依赖于化石资源。更重要的是，对于化学加工以及通过增加可再生资源在原料中的使用，存在降低二氧化碳(CO2)排放的强烈需求。生物苯胺对于减少CO2排放具有高度潜力。
本发明还涉及微生物的工程化以及从其生产芳香化合物。具体而言，本发明涉及在合适的重组微生物宿主中从可再生资源诸如例如生物质生产邻氨基苯甲酸和/或盐（o-aminobenzoate）（oAB）的领域。通常，使用含有显著比例的可发酵糖的来源。这些糖可以包括多糖诸如二糖，例如蔗糖，或三糖例如蔗果三糖，以及C-6单糖诸如葡萄糖、果糖或甘露糖以及C-5单糖诸如木糖和阿拉伯糖。能够将糖转化为邻氨基苯甲酸和/或盐（2-氨基苯甲酸和/或盐、邻-氨基苯甲酸和/或盐、o-氨基苯甲酸和/或盐、oAB）的重组微生物菌株将能够从广泛的可再生资源包括糖用甜菜和糖用甘蔗、含淀粉的植物诸如玉米、小麦和黑麦、以及木质纤维素例如从麦秸、木材或甘蔗渣中生产邻氨基苯甲酸和/或盐。
目前，尚无邻氨基苯甲酸和/或盐的可再生的或生物衍生的来源或相应的可商购的酸，并且没有描述邻氨基苯甲酸和/或盐的大规模生物生产的已知实例。邻氨基苯甲酸和/或盐是莽草酸途径的天然中间体和芳香氨基酸L-色氨酸生物合成的前体。邻氨基苯甲酸和/或盐的生物合成途径在原核生物和真核生物中是相对充分了解的。可以实现邻氨基苯甲酸和/或盐至苯胺的化学转化。目前生产苯胺的方法依赖于从石油来源的原料的化学合成。此类石油来源的原料相对于可再生的原料诸如可再生资源“生物质”，是不可再生的。化学合成中涉及的若干化学步骤导致化学品的高生产成本。苯胺的转化化学合成可以与有害的中间体、溶剂以及可能对环境具有实质性影响的废品相关。芳环上非特异性的副反应导致产物产率的降低。石油来源的原料受全球石油价格导致的成本波动的影响。
WO 2013/103894 A1公开了经生物来源的对氨基苯甲酸（4-氨基苯甲酸）生产芳香胺的方法。然而，该文件公开了在大肠杆菌或在酿酒酵母(S. cerevisiae)中生产对氨基苯甲酸，但没有意识到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为宿主的优点。此外，该文件也没有公开如何将发酵方法与将生物来源的对氨基苯甲酸转化为芳香胺的下游化学方法成功地结合。
如果基于包括邻氨基苯甲酸至苯胺的酶促体内脱羧反应作为最后反应步骤的生物合成途径的话，作为一步转化的糖至苯胺的直接发酵被认为是最有效的。由于氨基苯甲酸脱羧酶无法经蛋白质工程成功地鉴定并开发，因此邻氨基苯甲酸至苯胺的脱羧反应无法通过纯酶促方法来进行。由于此类一步方法技术上不可行，因此考虑与酶促步骤相反，例如通过化学步骤进行将邻氨基苯甲酸脱羧为苯胺的最终反应步骤作为最终反应步骤的替代方法。
因此，本发明的技术问题已是提供基于可再生资源生产苯胺的方法，所述方法优于现有的发酵和化学方法并且其实现了相比于成熟的基于石油的生产方法的二氧化碳排放的大幅降低，不依赖于化石资源，以及相似的或更低的生产成本。
本发明已经通过提供重组微生物宿主细胞来解决了所述问题，所述重组微生物宿主细胞能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐。
本发明通过提供生产苯胺的方法进一步解决了所述问题，所述方法包括以下步骤：
a）使用如本文所述且如权利要求中要求保护的本发明的重组微生物宿主细胞，通过发酵包含至少一种可发酵的碳底物的原料来生产邻氨基苯甲酸和/或盐，所述重组微生物宿主细胞能够将所述包含至少一种可发酵的碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐，其中所述邻氨基苯甲酸和/或盐包含邻氨基苯甲酸阴离子，
b）通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸，
c）通过沉淀或通过溶解于有机溶剂回收所述邻氨基苯甲酸，以及
d）通过在有机溶剂中的热脱羧反应将所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。
基于可再生资源例如生物质或可发酵的碳源改变苯胺生产提供了显著降低CO2排放的优点，允许不依赖于化石资源，且实现生产成本中可能的降低。本发明的另外的优点在于将有害化学品的使用和产生的废料保持在最低。另外，生物来源的邻氨基苯甲酸和/或盐可以在对环境具有低得多的总体影响的方法中生产并转化为苯胺。
具体而言，本发明提供能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐的重组微生物宿主细胞。此类根据本发明的重组微生物宿主细胞可以是用于从可再生资源诸如例如生物质发酵生产邻氨基苯甲酸和/或盐的基因工程改造的微生物。例如，本发明提供谷氨酸棒杆菌的基因工程化菌株作为生物催化剂，其适合于从可发酵的碳源有效发酵生产邻氨基苯甲酸和/或盐。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是生活在土壤中的革兰氏阳性细菌。其属于高GC含量的革兰氏阳性放线菌。谷氨酸棒杆菌是具有年生产超过两百万吨氨基酸（主要为l-谷氨酸和l-赖氨酸）的生物技术上最重要的细菌物种之一。由于这一巨大的工业重要性，谷氨酸棒杆菌从其于1956年发现以后很短时间内已经开始被广泛地研究。谷氨酸棒杆菌的基因组在2003年进行测序并发表(Ikeda M, Nakagawa S, Appl MicrobiolBiotechnol, 2003, 62:99.; Kalinowski J, Bathe B, Bartels D, Bischoff N, BottM, Burkovski A, Dusch N, Eggeling L, Eikmanns BJ, Gaigalat L, Goesmann A,Hartmann M, 等人, J Biotechnol, 2003, 104:5)。谷氨酸棒杆菌展示出作为微生物工厂以生产不止氨基酸还有其他化学品的众多理想的内在属性。棒杆菌生理学的深入的基础知识和用于在组合方法中建模过程或涉及合成途径的后基因组工具构成了设计有效且多能的棒杆菌生物精炼厂(biorefineries)的重要基础。产生oAB的谷氨酸棒杆菌的生物合成途径已广泛地研究并且可以分为主要三个部分：中心代谢、共有的芳香族途径和L-色氨酸分支途径。oAB是L-色氨酸生物合成的中间体（图1）。然而，以菌株改进氨基酸生产的前期尝试主要依赖于经典的随机诱变和筛选程序，旨在删除竞争途径并消除生物合成途径中的反馈调节。经典方法的可用性有限，因为调节步骤的完全失调和合适的生物合成酶活性的增强是难于实现的。此外，随机诱变常常在基因组中的一些位置在期望的突变以外还产生不期望的突变。由于难以确定这些未鉴定的突变的影响，因此会影响进一步的菌株改进。这些问题广泛地存在于由随机诱变构成的工业菌株中。在最近十年中主要报道的文献的基础上，用通过经典方法产生的菌株的目前生产产生使糖（wt％）大约20-23流向l-色氨酸和约25流向l-苯丙氨酸。相反，对于许多其他氨基酸已经报道了糖流向（wt％）高得多的生产产率，例如，l-赖氨酸，40-50；l-谷氨酸，45-55；l-精氨酸，30-40；l-苏氨酸，40-50；l-缬氨酸，30-40；和；l-丙氨酸，45-55 (Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K, Appl MicrobiolBiotechnol, 2005, 69:1.; Ikeda M, Nakagawa S, Appl Microbiol Biotechnol,2003, 62:99)。
基于分子生物学中以及对导致糖至l-色氨酸（和oAB）的生物合成途径的功能性的理解中产生的近期优点，本发明提供了能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐的重组微生物宿主细胞，并且更具体而言，基于定向诱变和代谢工程方法的来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的oAB生产者。用以产生oAB生产者的代谢工程的某些基因靶点位于产生oAB并随后为l-色氨酸的芳香族生物合成途径中（图1）。l-色氨酸的生物合成在谷氨酸棒杆菌中在若干步骤中严格受控。因此，过量产生oAB需要基因去除存在于共有的芳香族途径中和l-色氨酸分支中的代谢控制。此外，扩增DAHP合成酶（其抑制芳香族途径）是作为本发明的另外的实施方案的增加向共有途径的净碳流的重要策略。这些突变与生成芳香族氨基酸缓慢生长型(bradytroph)菌株组合以绕开芳香族氨基酸补充的恒定需求。考虑到从葡萄糖生物合成1 mol的oAB需要1 mol赤藓糖-4-磷酸（E4P）和2 mol磷酸烯醇丙酮酸（PEP）作为开始前体，此外，在其途径中消耗1 mol的L-谷氨酸并释放1 mol的丙酮酸，针对前体的平衡供应来实现产物的有效生产。
在下文中，本发明人聚焦于谷氨酸棒杆菌作为用于生物生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组微生物菌株。因此，本发明提供能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐的重组微生物宿主细胞。所述谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，最优选为重组的谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
在本发明的另外的实施方案中，谷氨酸棒杆菌，优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032可以包含编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶的trpD基因(Cgl3032, SEQ ID NO: 1)的遗传修饰，其中所述遗传修饰优选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8，其均具有降低trpD基因表达的作用以产生色氨酸营养缺陷型菌株。单一的前述遗传修饰已经导致产生邻氨基苯甲酸和/或盐（oAB）的重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株。
在下文中，定义用于描述本发明的一些术语。
根据本发明的术语“生物苯胺”指基于来自可再生资源的原料的苯胺，所述原料诸如糖用甜菜、糖用甘蔗、含淀粉的植物，优选玉米、小麦和黑麦，和木质纤维素，优选麦秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1化合物，优选CO，或诸如可发酵糖，优选C-5单糖、C-6单糖、 二糖和三糖，其中所述C-5单糖优选为木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6单糖优选为蔗糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖优选为蔗糖，且其中所述三糖优选为蔗果三糖。
根据本发明的“邻氨基苯甲酸和/或盐(o-aminobenzoate)”指邻-氨基苯甲酸和/或盐（邻氨基苯甲酸和/或盐、“oAB”）。邻氨基苯甲酸和/或盐可以以包含邻氨基苯甲酸阴离子C6H4COO-和合适的阳离子诸如NH4+或Na+的邻氨基苯甲酸盐、或作为邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)（其为两性离子C6H4COO- NH3 +和C6H4COO- NH2）的形式存在。“邻氨基苯甲酸和/或盐”（“oAB”）与“4-氨基苯甲酸和/或盐”（“pAB”）的区别在于氨基在C4-位(对位)连接至苯环，与邻氨基苯甲酸和/或盐（“oAB”）的情况中的C2-位(邻位)不同。
在本发明的涵义内的术语“宿主”可以包括任何能够天然地或仅在转化后作为“重组微生物宿主”通过发酵产生邻氨基苯甲酸和/或盐、或转化后除了天然存在的邻氨基苯甲酸和/或盐外以邻氨基苯甲酸阴离子或邻氨基苯甲酸的形式通过发酵产生邻氨基苯甲酸和/或盐的宿主。根据本发明的“微生物宿主”可以选自细菌、酵母和真菌。所述宿主可以选自细菌、酵母和真菌，其中所述细菌优选为大肠杆菌菌株、棒杆菌菌株或假单胞菌菌株，其中所述棒杆菌菌株优选为谷氨酸棒杆菌且其中所述假单胞菌菌株优选为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。优选地，所述微生物宿主可以是重组微生物宿主。此类重组微生物宿主可以为大肠杆菌W3110 trpD9923，如实施例1中所示。此类重组宿主可以为恶臭假单胞菌KT2440，如实施例4中所示。此类重组宿主也可以为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，如实施例3中所示。
在本发明的涵义内的术语“遗传修饰”指微生物宿主的给定基因的核酸序列与野生型序列比较的改变。此类遗传修饰可以包括一个或多个脱氧核糖核酸的缺失以及插入。此类遗传修饰可以包括通过转化入微生物宿主的基因组引入的部分或全部缺失以及插入。此类遗传修饰可以产生重组微生物宿主，其中所述遗传修饰可以包括至少一个、两个、三个、四个或更多个单一核苷酸与各微生物宿主的野生型序列比较的改变。例如，遗传修饰可以为至少一个、两个、三个、四个或更多个单一核苷酸的缺失或插入或者至少一个、两个、三个、四个或更多个单一核苷酸的转变。根据本发明的遗传修饰可以具有例如各基因降低的表达或例如各基因增强的表达的作用。在根据本发明的此类遗传修饰的一个实例中，重组微生物宿主例如谷氨酸棒杆菌可以包含编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的trpD基因(Cgl3032, SEQ ID NO: 1)的遗传修饰，其中所述遗传修饰可以具有经修饰的trpD基因的降低的表达。此类经修饰的trpD基因可以选自 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, 和SEQ ID NO:8。上述遗传修饰的单独一个已经产生重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株，其显示产生邻氨基苯甲酸和/或盐（oAB）的经修饰的trpD基因的降低的表达。在本发明进一步的实施方案中，此类遗传修饰也可以是trpD基因的缺失，例如如在谷氨酸棒杆菌trpD中。
在本发明的涵义内的术语“分批发酵”指具有确定的起始点和确定的终止点的单一发酵反应。分批发酵也可以用于在其中微生物的生产速率无法以高速率以持续的发酵模式维持的情况下的根据本发明的方法的步骤a）中。
在本发明的涵义内的术语“补料分批发酵”，补料分批发酵指在生物技术方法中的操作技术，其中一种或多种营养物（底物）在培养过程中补料（供应）至生物反应器，且其中生物反应器中的产物保持直至运行结束。“补料分批发酵”也可以用于在其中微生物的生产速率无法以高速率以持续的发酵模式维持的情况下的根据本发明的方法的步骤a）中。
在本发明的涵义内的术语“连续发酵”指这样的发酵方法，其中在根据本发明的方法的步骤a）的发酵过程中持续添加底物并移除产物（即邻氨基苯甲酸和/或盐，oAB）。
在下文中，更详细地描述了本发明。
本发明提供能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐（oAB）的重组微生物宿主细胞。
此类微生物宿主细胞可以选自细菌、酵母和真菌，其中所述细菌优选为大肠杆菌菌株、棒杆菌菌株或假单胞菌菌株，且其中所述棒杆菌菌株优选为谷氨酸棒杆菌，更优选为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，且其中所述假单胞菌菌株优选为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），更优选为恶臭假单胞菌KT2440。
在本发明的重组微生物宿主细胞的另外的实施方案中，重组微生物宿主细胞可以为谷氨酸棒杆菌。在本发明更具体的实施方案中，谷氨酸棒杆菌ATCC13032是用于生产邻氨基苯甲酸和/或盐的优选的重组微生物宿主，这是由于本发明人观察到该生物体对邻氨基苯甲酸和/或盐具有高耐受性，而对于其他微生物，例如大肠杆菌K12，仅低浓度的邻氨基苯甲酸和/或盐就是有毒的。
在本发明的重组微生物宿主细胞的另外的实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌（优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032）可以包含编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的trpD基因的遗传修饰（图3）。
所述编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的trpD基因(Cgl3032, SEQ ID NO: 1)的遗传修饰可以选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，且其中所述遗传修饰具有trpD基因降低的表达的作用。更具体而言，上述序列中的突变可以改变trpD基因的核糖体结合位点和起始密码子之间的间隔区。此外，trpD基因的天然起始密码子的变更可以导致trpD的翻译降低因而导致朝向l-色氨酸的缓慢生长型菌株，其在不添加l-色氨酸的情况下产生以数克规模的邻氨基苯甲酸和/或盐。因此此类菌株特别优选作为根据本发明的重组微生物宿主。
在本发明的重组微生物宿主细胞的另外的实施方案中，微生物宿主细胞可以为谷氨酸棒杆菌，优选为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，其中所述谷氨酸棒杆菌或谷氨酸棒杆菌ATCC13032可以包含编码分支酸变位酶的csm基因(Cgl0853, SEQ ID NO: 9)的遗传修饰（图3），其中所述遗传修饰优选选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，且其中所述遗传修饰具有csm基因降低的表达的作用。具体而言，可以操纵csm基因来进一步通过将l-苯丙氨酸和l-色氨酸的产率降至最低来提高邻氨基苯甲酸和/或盐的产率。
降低csm基因表达的作用为朝向l-酪氨酸和l-苯丙氨酸结果的缓慢生长型菌株，其在不添加l-酪氨酸和l-苯丙氨酸的情况下以数克规模产生邻氨基苯甲酸和/或盐。这防止由于在l-酪氨酸和/或l-苯丙氨酸的芳香酸途径中催化反应的酶的反馈抑制而降低邻氨基苯甲酸和/或盐，如在添加有l-酪氨酸和/或l-苯丙氨酸的l-酪氨酸和/或l-苯丙氨酸营养缺陷型菌株中可能的那样。因此此类菌株特别优选作为根据本发明的重组微生物宿主。这一结果可以导致更高产量的邻氨基苯甲酸和/或盐。
在本发明的重组微生物宿主细胞的另外的实施方案中，谷氨酸棒杆菌微生物宿主细胞（优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032）可以进一步包含选自以下的一个或多个缺失：hpr(Cgl1937 – SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18)、ptsG (Cgl1537 - SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20)、pepco (Cgl1523 – SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22)、pyk (Cgl2089 – SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24)和gpi (Cgl0851 – SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28)。
基因hpr (Cgl1937 – SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18)和基因 ptsG (SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20): 这些基因的每一个均编码多酶复合体PEP-磷酸转移酶系统（PTS）的单元（图1、2）。谷氨酸棒杆菌的PTS的两个单元Hpr和PtsG被操作并关于其对生长、细胞活力以及oAB产生的影响进行比较，如实施例3中所示。
基因pepco (Cgl1523 – SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22)编码酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶通过将PEP（磷酸烯醇丙酮酸）转化为草酰乙酸而将其消耗（图1、2）。该反应是不供氧下的主要添补反应，而在标准的充足的氧供应下，丙酮酸激酶消耗大部分PEP以在获得一ATP的同时产生丙酮酸。谷氨酸棒杆菌的基因pepco进行操作并关于生长、细胞活力以及oAB产生与其他谷氨酸棒杆菌菌株进行比较，如实施例3中所示。
基因pyk (Cgl1937 – SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24)编码酶丙酮酸激酶。丙酮酸激酶通过产生丙酮酸和ATP而消耗PEP（磷酸烯醇丙酮酸）（图1、2）。该反应是谷氨酸棒杆菌中糖酵解的部分。Pyk编码基因（在谷氨酸棒杆菌基因组中注释的）如实施例3中所述缺失。
基因gpi (Cgl0851 – SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28)编码酶葡萄糖-6-磷酸异构酶。该酶催化将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的糖酵解的第一步（图1、2）。
在本发明的重组微生物宿主细胞的更具体的实施方案中，谷氨酸棒杆菌微生物宿主细胞（优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032）可以进一步过表达选自以下的一个或多个基因：galP (SEQ ID NO:30)、iolT2 (SEQ ID NO:31)、ppgk (SEQ ID NO:32)、pps (SEQ ID NO:33-35)、ppk (SEQ ID NO:36)、zwf1 (SEQ ID NO:37)、opcA (SEQ ID NO:38-39)、tktCg(SEQ ID NO:40)、tktEc (SEQ ID NO:41)、talCg (SEQ ID NO:42)、talEc (SEQ ID NO:43)、编码TrpEGS38F的基因 (trpEG S38F , SEQ ID NO:50)、编码TrpEGS38R的基因(trpEG S38R , SEQ ID NO:51)、编码TrpEGS40R的基因 (trpEG S40R , SEQ ID NO:52)、编码TrpEGS40F的基因 (trpEG S40F , SEQ ID NO:53)、编码AroGD146N的基因 (aroG D146N , SEQ IDNO:55)、大肠杆菌LJ110的aroL (SEQ ID NO:93)、aroK (SEQ ID NO:94)、glnA (SEQ IDNO:95)和qsuA (SEQ ID NO:96)。
谷氨酸棒杆菌微生物宿主（优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032）中反馈抗性的 trpEG 基因(邻氨基苯甲酸合成酶基因)（编码TrpEGS38F的基因 (trpEG S38F – SEQ ID NO: 50)、编码TrpEGS38R的基因 (trpEG S38R – SEQ ID NO: 51)、编码TrpEGS40R的基因 (trpEG S40R –SEQ ID NO: 52)、编码TrpEGS40F的基因 (trpEG S40F – SEQ ID NO: 53)），单独表达或与本发明的其他遗传修饰的任一者组合表达，是本发明的优选的实施方案。所述基因均具有共同的特征，即它们编码邻氨基苯甲酸合成酶单元的突变形式，其在形成邻氨基苯甲酸和/或盐和l-谷氨酸下释放丙酮酸分子（图3）。这些是TrpEG的反馈抗性形式，这即是为何相应的突变基因被称为trpEG fbr 。谷氨酸棒杆菌微生物宿主（优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032）中反馈抗性aroG基因（3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因）诸如编码AroGD146N的基因(aroG D146N – SEQ ID NO: 55)，单独或与本发明的其他遗传修饰的任一者组合过表达，是本发明的另一个优选的实施方案。编码AroGD146N的基因 (aroG D146N – SEQ ID NO: 55)编码AroG的突变形式，其是在大肠杆菌中催化从赤藓糖-4-磷酸（E4P）至3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸的反应的酶（图3）。
基因galP (Cgl2409 - SEQ ID NO:30)编码酶半乳糖通透酶。可以通过表达半乳糖通透酶在PTS破坏后恢复葡萄糖摄入（图1、2）。在谷氨酸棒杆菌中，鉴定基因并注释为半乳糖通透酶且因此是此类表达的良好候选。该候选在PTS遭破坏的谷氨酸棒杆菌中表达，如实施例3中所示。
基因iolT2 (Cgl3058 – SEQ ID NO:31)编码肌醇通透酶T2单元。可以通过表达肌醇通透酶T2单元在PTS破坏后恢复葡萄糖摄入（图1、2）。作为过表达肌醇通透酶以在谷氨酸棒杆菌中PTS破坏后恢复葡萄糖摄入的替代方法，进行肌醇通透酶的肌醇通透酶T2单元的过表达。将所产生的菌株特征与过表达半乳糖通透酶的菌株比较，如在实施例3中所示。
基因ppgk(Cgl1910 – SEQ ID NO:32)编码酶聚磷酸葡萄糖激酶。半乳糖通透酶以及肌醇通透酶T2单元仅能摄入葡萄糖，但它们无法将糖分子磷酸化（图1、2）。然而，磷酸化对于能够代谢葡萄糖分子是必需的。因此，将不同通透酶的表达与葡萄糖磷酸化酶的表达组合。该Ppgk在本发明的不同的表达通透酶且PTS缺失菌株中共表达。
基因pps (Cgl0551和Cgl0552 – SEQ ID NO:33-35)编码酶PEP（磷酸烯醇丙酮酸）合成酶。与消耗PEP的反应破坏分开后，促进了导致生成PEP的生物合成步骤。PEP合成酶催化PEP的形成，其通过丙酮酸回收和消耗ATP为AMP，作为谷氨酸棒杆菌中糖异生的部分（图1、2）。pps基因的过表达导致谷氨酸棒杆菌菌株中的oAB库增加，如实施例3中所述。
基因ppk (Cgl2862 – SEQ ID NO:36)编码酶PEP羧激酶。作为乙醛酸途径的部分，草酰乙酸可以通过PEP羧激酶再循环为PEP（图1、2）。过表达基因可以是通向oAB生物合成可用的更大的PEP库的另一途径，如实施例3中所述。
基因zwf1 (Cgl1576 – SEQ ID NO:37)和基因(opcA (Cg1577 – SEQ ID NO:38-39)编码酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（图1、2）。催化戊糖磷酸途径（PPP）的第一反应（从葡萄糖-6-磷酸形成核酮糖-5-磷酸）的酶的产量提高可以导致向PPP的流增加，导致产生更高量的E4P并经果糖-6-磷酸（Frc-6-P）产生且可以进一步增加细胞PEP库，最终导致谷氨酸棒杆菌菌株中oAB库的增加。当将该操作应用于谷氨酸棒杆菌菌株并且进行Zop酶的表达时，实现该效果，如实施例3中所述。
基因tktCG (Cgl1574 – SEQ ID NO:40)和基因tktEC (ECDH10B_3110 – SEQ IDNO:41)编码酶转酮酶。经PPP增强的流和增加的E4P库、和甚至oAB和芳香族氨基酸增加的产生由在谷氨酸棒杆菌菌株中表达转酮酶而观察到（图1、2）。来自大肠杆菌的转酮酶以及谷氨酸棒杆菌中编码的转酮酶进行过表达，如实施例3中所述。
基因talCG (Cgl1575 – SEQ ID NO:42)和基因talEC (ECDH10B_2629 – SEQ IDNO:43)编码酶转醛醇酶。如通过转酮酶过表达的对E4P产生的相当的有利作用可以对于在大肠杆菌中过表达转醛醇酶而观察到（图1、2）。由于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌转醛醇酶的序列差异显著，因此本发明人继续在本发明的谷氨酸棒杆菌菌株中表达描述的大肠杆菌基因和天然谷氨酸棒杆菌基因，如实施例3中所述。将编码转醛醇酶和转酮酶的基因合并在一个载体上并共表达于谷氨酸棒杆菌菌株中以进一步增强oAB生产菌株特征，如实施例3中所述。
基因qsuA (Cgr0492 – SEQ ID NO:96)编码药物抗性转运蛋白QsuA。在谷氨酸棒杆菌菌株中表达该基因导致oAB转运的优化，如实施例3中所述。
基因aroL (B0388 – SEQ ID NO:93)来自大肠杆菌LJ110，编码在大肠杆菌中催化从莽草酸（SHI）至莽草酸-3-磷酸（SHI3P）的反应的酶。在谷氨酸棒杆菌菌株中表达来自大肠杆菌的aroL基因，如实施例3中所述。
基因aroK (Cgl1622 – SEQ ID NO:94)编码催化在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中从莽草酸（SHI）至莽草酸-3-磷酸（SHI3P）的反应的酶。在谷氨酸棒杆菌菌株中表达aroK基因，如实施例3中所述。
基因glnA(Cgl2214 – SEQ ID NO:95)编码谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的酶谷氨酰胺合成酶（图3）。在谷氨酸棒杆菌菌株中表达glnA基因，如实施例3中所述。
在本发明的特别优选的实施方案中，重组微生物宿主细胞可以是谷氨酸棒杆菌∆trpD、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5、谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆pepco、谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆gpi、谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆pyk、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-trpEG S40F、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2- aroG D146N 、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F 、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroL、 谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB072、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB073, C.glutamicum ∆trpD::trpD5/pSB074、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB075、谷氨酸棒杆 菌∆trpD::trpD5/pSB076、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB077、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB078、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB085或谷氨酸棒杆菌∆∆trpD::trpD5/pSB096，如实施例3和表4中进一步所述。
在下文中，描述了本发明的另外的重组微生物宿主。
在本发明的重组微生物宿主细胞的又另一个的实施方案中，微生物宿主细胞可以为恶臭假单胞菌，优选为恶臭假单胞菌KT2440。
在本发明的重组微生物宿主细胞的另外的实施方案中，所述恶臭假单胞菌（优选恶臭假单胞菌KT2440）可以包含编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶和吲哚-3-甘油磷酸合成酶(PP_0421和PP_0422 – SEQ ID NO: 63-64)的trpDC基因的缺失、或编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(PP_1769 –SEQ ID NO: 65-66)的pheA基因的缺失、或两者，如实施例4中所述（图4）。
在本发明的重组微生物宿主细胞的另外的实施方案中，所述恶臭假单胞菌，优选恶臭假单胞菌KT2440，其中所述恶臭假单胞菌或恶臭假单胞菌KT2440可以表达一个或多个选自编码TrpEGS40F的基因 (trpEG S40F – SEQ ID NO: 53)和编码AroGD146N的基因(aroG D146N – SEQ ID NO: 55)的基因（图4）。在本发明的重组微生物宿主细胞的某些实施方案中，上述的一个或多个表达的基因可以通过质粒转化或通过染色体转化而整合入所述恶臭假单胞菌微生物宿主细胞中，如实施例4中所述。
由重组微生物宿主细胞生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐（oAB）的包含可发酵碳底物的原料可以选自糖用甜菜、糖用甘蔗、含淀粉的植物、优选玉米、小麦和黑麦，和木质纤维素，优选麦秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1化合物，优选CO。
在本发明另外的实施方案中，包含于原料中的可发酵碳底物可以选自C-5单糖、C6-单糖、二糖和三糖，其中所述C-5单糖优选为木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6单体优选为葡萄糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖优选为蔗糖，且其中所述三糖优选为蔗果三糖。
本发明已通过提供生产苯胺的方法进一步解决了以上问题，所述方法包括以下步骤：
a) 使用如本文所述且如权利要求中要求保护的重组微生物宿主细胞，通过发酵包含至少一种可发酵的碳底物的原料来生产邻氨基苯甲酸和/或盐，所述重组微生物宿主细胞能够将所述包含至少一种可发酵的碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐，其中所述邻氨基苯甲酸和/或盐包含邻氨基苯甲酸阴离子，
b) 通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸和/或盐，
c) 通过沉淀或通过溶解于有机溶剂回收所述邻氨基苯甲酸，以及
d) 通过在有机溶剂中的热脱羧反应将所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。
根据本发明的方法提供相比于基于化石资源的方法在产生苯胺同时实现CO2排放中的大量降低法技术优点，不依赖于此类化石资源，以及相比于成熟的基于石油的苯胺生产方法实现相似的或更低的生产成本。
根据本发明的方法包括两个主要部分，其中第一部分步骤a）基于发酵（生物技术）且包括通过合适的重组微生物宿主通过发酵将包含至少一种可发酵碳底物的原料转化为邻氨基苯甲酸和/或盐，其中所述邻氨基苯甲酸和/或盐包含邻氨基苯甲酸阴离子(C6H4COO-NH2)。
第二部分更具化学性质且在步骤a）的下游，并且包括以下步骤a）至d），且任选e）：
b）通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸，
c）通过沉淀或通过溶解于有机溶剂回收所述邻氨基苯甲酸，以及
d）通过在有机溶剂中的热脱羧反应将所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。
综上，本发明因此提供了生产苯胺的方法，其结合了第一生物技术发酵步骤a）与随后下游的、包括至少步骤b）、c）和d）且任选步骤e）的化学方法。
在下文中，进一步详细描述了本发明。根据本发明的方法的总体概念描绘于图5中，且更详尽的概览呈现于图6中。
本发明还提供了生产苯胺的方法，其包括步骤：
a）使用如本文所述且如权利要求中要求保护的重组微生物宿主细胞，通过发酵包含至少一种可发酵的碳底物的原料来生产邻氨基苯甲酸和/或盐，所述重组微生物宿主细胞能够将所述包含至少一种可发酵的碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐，其中所述邻氨基苯甲酸和/或盐包含邻氨基苯甲酸阴离子，
b）通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸，
c）通过沉淀或通过溶解于有机溶剂回收所述邻氨基苯甲酸，以及
d）通过在有机溶剂中的热脱羧反应将所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。
步骤a）的发酵可以是分批发酵、补料分批发酵或连续发酵。在步骤a）中连续发酵的情况下，细胞保留装置可以用于从发酵步骤a）中使用的水相中分离宿主且保留宿主在用于进行步骤a）的发酵罐中。细胞保留装置可以整合在此类发酵罐中，或者，作为优选选项，其可以位于发酵罐外作为分开的装置。此类分离可以通过离心实现，例如在碟式分离器或倾析器中，通过沉降装置中的重力，或者通过过滤技术诸如错流过滤。分离可以设计成具有有限的保留时间，使得当处于分离装置中时，宿主（例如细菌、酵母和真菌的细胞）在发酵罐外耗费有限的时间且不会损失其生长或产生邻氨基苯甲酸的能力。具有细胞保留的连续发酵允许发酵步骤a）以高细胞密度和因此高空间时间产率来运行。更重要的是，步骤a）中的发酵可以非常低的生长速率运行。这导致更高的总体产率（g产物/g原料），这是因为更少的糖用于产生生物质而更多用于产生oAB。
连续发酵相对于分批发酵的另外的优点在于所谓的发酵罐的“停止时间(downtime)”可以降至最低。连续发酵具有比分批发酵长得多的生产期，因此耗费在清洁、灭菌、填充和收获上的时间也成比例地短得多。这一方面有助于增加空间时间产率且因此降低对于给定工厂容量的投资成本（其用于运行根据本发明的方法）。
如果方法的步骤a）作为分批或补料分批发酵来运行，总发酵能力可以分散在若干发酵罐中，且断流罐(break tank)可用于实现步骤a）的发酵材料向包括步骤b）至d）或甚至e）的下游部分的连续供应。在其中微生物的生产速率无法在持续发酵模式下维持高速率的情况下，分批或补料分批发酵也可以用于根据本发明的方法的步骤a）中。
根据本发明的方法的步骤a）通过使用宿主（优选能够通过发酵将糖转化至邻氨基苯甲酸和/或盐的重组宿主）通过发酵包含可发酵糖的原料提供邻氨基苯甲酸和/或盐。优选地，包含此类宿主的发酵反应器用添加碳源（例如玉米糖浆、甘蔗汁、糖蜜等）和氮源（例如氨气、氢氧化铵溶液、硫酸铵、硝酸铵、玉米浆等）以及微生物存活所需的各种微量元素来培养。步骤a）的发酵中的pH可以在3-9的范围内，优选pH4-8，最优选保持在6.5-7.5的值。步骤a）的pH可以例如通过添加碱（例如氨气、氢氧化铵或氢氧化钠）来调节。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，至少通过发酵产生邻氨基苯甲酸和/或盐的步骤a）和通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸的步骤b）可以持续运行。在该实施方案中，其中进行步骤a）的发酵罐持续操作，其中步骤a）中产生的发酵液可以持续抽出且经设备（例如过滤器、离心机、膜等）加工以分离包含生长至某一密度的宿主的生物质。该生物质可以在清洗小部分包含重组微生物宿主的生物质后回收至在步骤a）的发酵中使用的发酵罐。来自生物质的此类清洗流可用以避免生物质积累。因此可以移除在发酵罐中复制的微生物宿主细胞的一部分以及死细胞以保持发酵步骤a）的反应器中活宿主细胞的浓度在确定限值内，最优选是恒定的。这可能在补料分批发酵的情况中是不同的，其中重组宿主细胞和发酵产物保持在生物反应器中直至运行结束，其因此不是持续发酵而是补料分批发酵。足够的氧可以纯氧、空气、或富集空气形式添加至步骤a）中使用的反应器。发酵步骤a）的无细胞发酵液可以基本上为包含邻氨基苯甲酸阴离子和合适的抗衡阳离子（诸如NH4 +或Na+）的邻氨基苯甲酸盐的溶液。发酵步骤a）中产生的邻氨基苯甲酸溶液可以具有5 g/L-500 g/L、优选20 g/L-200 g/L、最优选50 g/L-150 g/L的邻氨基苯甲酸盐的浓度。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，步骤a）的发酵中使用的重组微生物宿主在进行将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸的步骤b）之前被去除。优选地，将去除的重组微生物宿主重新补料至步骤a）的发酵中。这具有允许持续发酵过程的技术优点，其可能是特别有效且成本节约的。
邻氨基苯甲酸和/或盐（oAB）是氨基酸；因此其离子化状态和在水中的溶解度取决于pH；其中两性离子是最不可溶的形式。在pH 7（其在可能用于发酵步骤a）中的发酵罐中处于主流），oAB作为用阳离子（诸如Na+或NH4 +）缓冲的阴离子存在。添加酸，诸如HCl，直至pH降至等电点，因此引起oAB晶体的沉淀。因此，根据本发明的方法的方法步骤b）包含通过酸质子化由此形成包含邻氨基苯甲酸晶体的沉淀来将邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸。为此原因，方法步骤b）也称为“结晶”。具体地，步骤a）的邻氨基苯甲酸溶液可以与酸优选HCl混合。因此，pH可以降低至2-4的值，优选3.2-3.6。这引起溶解度的改变且导致邻氨基苯甲酸晶体的沉淀。邻氨基苯甲酸晶体可以被回收，优选在随后的步骤c）（“回收”）中通过过滤进行。沉淀的邻氨基苯甲酸晶体（“饼”）中的残余水分和无机盐浓度取决于固液分离操作。
当进行方法步骤b）时，发酵步骤a）中产生的无细胞含水发酵液中的邻氨基苯甲酸盐首先通过与更强的酸（优选HCl）反应而质子化为邻氨基苯甲酸，其中邻氨基苯甲酸沉淀且随后作为方法步骤c）（“回收”）中的固体材料回收。邻氨基苯甲酸随后在随后的方法步骤d）中通过热脱羧转化为苯胺。
在根据本发明的方法的优选实施方案中，在方法步骤b）中通过酸质子化从邻氨基苯甲酸阴离子将邻氨基苯甲酸和/或盐转化为邻氨基苯甲酸可以通过添加HCl，优选2.5-4.5的pH，更优选3-4的pH、最优选3.2-3.6的pH来完成。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，在方法步骤c）中通过沉淀回收邻氨基苯甲酸包括过滤，由此产生包含所述回收的邻氨基苯甲酸的浆液，其中所述包含所述回收的邻氨基苯甲酸的浆液优选溶解于有机溶剂中。优选地，用于该阶段中的有机溶剂为苯胺或1-十二烷醇或其混合物。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，通过在方法步骤c）中溶解所述邻氨基苯甲酸于有机溶剂中回收邻氨基苯甲酸包括添加所述有机溶剂，优选苯胺或1-十二烷醇或其混合物至所述邻氨基苯甲酸，使得所述邻氨基苯甲酸作为有机溶剂中的溶质回收。
优选地，根据本发明的方法的回收步骤c）可以随后为在进行步骤d）的热脱羧前洗涤和干燥经回收的邻氨基苯甲酸沉淀。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，热脱羧步骤d）可以在催化剂存在的情况下进行。优选的此类催化剂可以为沸石催化剂，其中所述沸石催化剂优选为沸石H-Y（例如获自Zeolyst International, 目录号CBV600）。酸催化剂沸石H-Y（SiO2/Al2O3 可以为5-7，优选其为5.5）具有特别高的酸特征且具有比例如ZSM5-27 (例如，如获自ClariantSuedChemie, 目录号MFI-27, SiO2/Al2O3 = 27)更宽的孔径（0.7-0.8 nm），其也具有强酸特征，但其具有更小的孔径（0.5 nm），因此AA分子无法有效渗透入它们且因此无法容易接近酸催化剂的活性部位，由此降低其有效性。
方法步骤d）包括通过在有机溶剂中的热脱羧反应将步骤c）的所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。将邻氨基苯甲酸（例如呈邻氨基苯甲酸晶体形式，具有或不具有残余水分）热脱羧，优选通过将邻氨基苯甲酸加入到脱羧反应器中，在其中可以进行步骤d）。步骤d）的热脱羧可以在150 ℃-250 ℃、优选160 ℃-220 ℃、更优选180 ℃-200 ℃的温度下操作。步骤d）的热脱羧可以运行足够的时间以将邻氨基苯甲酸反应为苯胺。优选地，步骤d）可以运行0.5小时至3小时。
热脱羧步骤d）可以在酸催化剂存在的情况下进行以加速热脱羧。
热脱羧步骤d）可以在溶剂诸如水、苯胺中、或在1-十二醇、优选在1-十二醇中、或在1-十二醇和苯胺的混合物中运行。
另外，热脱羧步骤d）可以在反应器中进行，其中反应器中的压力可以选择为在反应过程中允许多少液相蒸发的函数并且反应器保留作为脱羧产物的二氧化碳(CO2)。
另外，热脱羧步骤d）可以产生苯胺有机溶剂混合物，其可以随后用苯胺和其中携带或溶解的任何水来蒸馏。回收步骤c）中使用的任何有机溶剂可以回收为“塔顶馏出物(overhead product)”。溶剂可以随后冷却并再循环用于蒸馏。包含苯胺的塔顶馏出物流(overhead stream)可以随后加入到蒸馏步骤中，例如，不均匀非共沸的蒸馏(heteroazeotropic distillation)。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，热脱羧步骤d）可以后接纯化苯胺（优选通过蒸馏）的另外的步骤e）。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，回收步骤c）之后，溶液（“母液”）可以仍具有高至3-10 g/l邻氨基苯甲酸。因此，在根据本发明的方法的另外的实施方案中，回收步骤c）之后，残余邻氨基苯甲酸阴离子可以如下回收，通过吸附至离子交换树脂或活性碳材料或沸石，优选用Fe3+或Ca2+修饰的沸石，优选可以通过离子交换可商购的沸石H-Y（例如，如获自Zeolyst International – CBV600）产生的Fe-Y沸石，例如如实施例6中所述，诸如Fe-Y，随后经回收的邻氨基苯甲酸阴离子的解吸附，并将所述邻氨基苯甲酸阴离子再加入至转化步骤b）用于酸质子化。回收的邻氨基苯甲酸阴离子的解吸附可以优选在5-10的pH下进行。例如，解吸附可以用pH 5-10的水进行，例如可以使用具有中性或碱性pH的水。解吸附后的溶液可以在步骤b）中酸添加的上游或者发酵步骤a）后去除生物质的下游进行循环。
回收步骤c）之后，残余邻氨基苯甲酸阴离子可以通过吸附至离子交换树脂或活性炭材料或沸石上来回收。优选的沸石用Fe3+或Ca2+修饰，优选为Fe-Y沸石。此类Fe-Y可以如实施例6中所述制备。吸收残余的邻氨基苯甲酸阴离子后，进行经回收的邻氨基苯甲酸阴离子解吸附入液相。经回收的邻氨基苯甲酸阴离子的此类解吸附可以进入有机溶剂相或水相。图7显示沸石Fe-Y上吸附的AA解吸附的质量概况。图8显示AA从沸石Fe-Y解吸附入有机溶剂1-十二烷醇，其由于AA在其中的高溶解度以及其在水中的低可混合性(0.004 g/L)而是优选的有机溶剂。图9显示邻氨基苯甲酸（AA）从吸附剂解吸附入液相。
优选将经回收和解吸附的残余邻氨基苯甲酸阴离子至少部分地再补料到转化步骤b）用于通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸。这具有改进方法的效率甚至导致相关的经济益处的技术优势。
在根据本发明的方法的特别优选的实施方案中，回收步骤c）后通过吸附回收残余的邻氨基苯甲酸阴离子后，没有被吸附的邻氨基苯甲酸阴离子的水流可以至少部分地再补料入步骤a）的发酵中。同样地，这具有甚至进一步改进方法的效率的技术优势。
在本发明的优选的实施方案中，步骤a）至d）可以作为整体过程连续运行。在本发明的进一步优选的实施方案中，步骤a）至e）可以作为整体过程连续运行。在此类整体和连续过程中，步骤a）的发酵可以用细胞保留和从步骤a）的发酵中的发酵液中连续去除邻氨基苯甲酸，随后通过在之后的步骤b）至d）或b）至e）中热脱羧连续加工为苯胺而连续运行。根据本发明的方法可以因此是整体和连续过程，其针对生产成本进行了优化。根据本发明的方法因此相比于以非连续方式运行的更传统的现有技术方法，提供了导致苯胺更高产率与相应的经济益处的显著的技术优势。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，发酵步骤a）的原料可以选自甜菜、甘蔗、含淀粉的植物，优选玉米、小麦和黑麦，和木质纤维素，优选麦秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1-化合物，优选CO。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，发酵步骤a）的所述可发酵的碳底物可以选自C-5单糖、C-6单糖、二糖和三糖，其中所述C-5单糖优选为木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6单糖优选为葡萄糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖优选为蔗糖，且其中所述三糖优选为蔗果三糖。
在根据本发明的方法的另外的实施方案中，发酵步骤a）的所述重组微生物宿主可以选自细菌、酵母和真菌，其中所述细菌优选为大肠杆菌菌株、棒杆菌菌株或假单胞菌菌株，且其中所述棒杆菌菌株优选为谷氨酸棒杆菌，更优选为谷氨酸棒杆菌ATCC13032，且其中所述假单胞菌菌株优选为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），更优选为恶臭假单胞菌KT2440。本质上，上述本发明的任何重组微生物宿主细胞均可以用于根据本发明的方法的发酵步骤a）中。
在本发明的不同的实施方案中，提供了用于生产苯胺的另一种方法，其包括步骤：
a) 提供邻 -氨基苯甲酸盐，其中所述邻 -氨基苯甲酸盐包含邻氨基苯甲酸阴离子和合适的阳离子，
b） 通过存在或不存在催化剂的情况下热脱羧将所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为苯胺，
c) 在有机溶剂中萃取步骤b）中产生的苯胺至少一次，以及
d） 通过蒸馏纯化步骤b）和c）中产生的苯胺，其中所述蒸馏产生苯胺和水相。
在该实施方案中，步骤a）中的所述邻 -氨基苯甲酸盐可以化学提供或者生物学产生，优选其使用能够通过发酵将所述包含可发酵碳底物的原料转化为邻 -氨基苯甲酸盐的重组微生物宿主细胞通过发酵包含至少一种可发酵碳底物的原料来生物学产生，其中所述邻 -氨基苯甲酸盐包含邻氨基苯甲酸阴离子和合适的阳离子。
步骤a）的所述发酵可以是分批发酵、补料分批发酵或连续发酵。在优选的实施方案中，步骤a）可以连续运行。步骤a）的合适的阳离子可以是NH4 + 或Na+。步骤a）的重组微生物宿主可以在步骤b）中通过热脱羧随后转化所述邻氨基苯甲酸阴离子为苯胺之前被去除，其中所述去除的重组微生物宿主优选可以再补料入步骤a）的发酵中。本发明的该实施方案中使用的催化剂可以是异质的酸催化剂，优选沸石，最优选沸石H-Y。然而，所述催化剂也可以是异质的碱催化剂，优选层状双氢氧化物，最优选镁铝水滑石。
在根据本发明的另一种方法的优选实施方案中，步骤c）中有机溶剂中苯胺的萃取可以进行不止一次，用于在蒸馏之前进一步预浓缩苯胺。
在根据本发明的另一种方法的优选实施方案中，所述方法可以包括回收步骤c）的萃取中使用的有机溶剂，其中所述回收可以优选通过蒸馏来完成，其中所述经回收的有机溶剂优选可以再补料入步骤c）中以再次重新用于萃取步骤b）中产生的苯胺。所述有机溶剂可以选自醇类、酚类、酰胺类、醚和芳香烃，其中所述醇优选为1-十二烷醇。在另一个实施方案中，本发明的该另一种方法可以包括将步骤c）中进行的萃取的水相再补料和/或步骤d）中进行的蒸馏的水相再补料入步骤a）的发酵中的另外的步骤e）。NH4 +阳离子可以在步骤d）的蒸馏后以NH3形式回收并且可以再补料入步骤a）的发酵中。
最后，本发明还提供了根据本发明的方法生产的苯胺的用途，其中步骤d）和/或e）中产生的苯胺进一步在水和催化剂存在的情况下用甲醛转化为亚甲基二苯胺（MDA）。以这种方式产生的MDA可以进一步用光气转化为亚甲基二异氰酸酯（MDI）。
对于本领域技术人员显而易见的是可以对本发明的方法和重组宿主菌株进行各种修改。因此，本发明旨在覆盖此类修改和变化，只要它们在所附权利要求及其等同方案的范围之内。
附图和表格
附图列表
图1显示谷氨酸棒杆菌中从葡萄糖到oAB（邻氨基苯甲酸和/或盐）的生物合成途径的概览展示，显示了增加来自中心代谢的前体供应的策略（PTS: 磷酸转移酶系统；PEP: 磷酸烯醇丙酮酸；TCA：三羧酸；IolT2：肌醇通透酶单元T2；PorA/H：猪PorA和PorH的复合体；MFS：主要促进系统(mayor facilating system)）粗箭头展示被增强的生物合成步骤，而十字交叉标记被阻断的生物合成步骤。
图2 谷氨酸棒杆菌中中心碳代谢的概览。显示了葡萄糖摄入的磷酸转移酶系统（PTS）、糖酵解、磷酸戊糖途径和相关的回补反应。展示TCA（三羧酸）循环和莽草酸途径来解释进入这些途径的位置和转变（GAPDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶；G6PDH=葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；6PGD=磷酸葡萄糖酸脱氢酶；PEP=磷酸烯醇丙酮酸）。
图3 谷氨酸棒杆菌中从前体分子至芳香族氨基酸的莽草酸途径的概览。给出了中心中间体的结构式。
图4显示恶臭假单胞菌KT2440中芳香族氨基酸生物合成的遗传背景。进行的遗传操作用灰色突出显示。
图5显示根据本发明的方法的总体概念，所述方法包括在发酵步骤中将原料转化为邻氨基苯甲酸，随后在下游处理中化学转化和纯化为苯胺。
图6更详细地显示根据本发明的方法的总体概念。NaOH和NH3两者均可用作发酵罐中的缓冲液。
图7显示100-550 ℃温度范围内Fe-Y上吸附的邻氨基苯甲酸分解的质量概况。
图8显示邻氨基苯甲酸从Fe-Y解吸附至1-十二烷醇。通过将包含10.8 mg邻氨基苯甲酸的0.2 g Fe-Y悬浮在2 mL 1-十二烷醇中进行实验。将浆料在25-120 ℃温度范围下搅拌0.5 h。解吸附结果显示于图2中，其中120 ℃下最多27.8％邻氨基苯甲酸可以被吸附至1-十二烷醇相中。
图9显示邻氨基苯甲酸从吸附剂解吸附入液相。邻氨基苯甲酸从Fe-Y进入水中的解吸附测试显示水溶液中通过金属交换的沸石的邻氨基苯甲酸的吸附是可逆的。测试了邻氨基苯甲酸解吸附入有机溶剂。选择1-十二烷醇作为有机溶剂，这是由于邻氨基苯甲酸在其中的高溶解度以及其在水中非常低的可混合性 (0.004 g/L)。
图10显示邻氨基苯甲酸在含催化剂的有机培养基中的分解。显示了在160 ℃和180 ℃下存在沸石Y的情况下3 wt%溶解于1-十二烷醇中的邻氨基苯甲酸的脱羧动力学。将邻氨基苯甲酸（3 wt%）溶解于1-十二烷醇。在该浓度下，酸甚至在室温下也完全地可溶于有机溶剂中。随后将80 mL以上溶液转移至160 mL的高压灭菌器中，加入1.5 g沸石催化剂并加热至160 ℃-180 ℃。对于比较，还测试了不具有催化剂（空白）和具有碱性水滑石（HTC）、H-ZSM5、掺入钠的沸石Y (NaY)、沸石Y铵形式(NH4-Y)的空白测试。以不同时间间隔取样并通过HPLC方法分析以测定苯胺形成的速率。
图11显示了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌和酿酒酵母菌株的pH5下100-mL摇瓶培养物（具有MES缓冲液）经33 h（三次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。谷氨酸棒杆菌在pH 7（补充有MOPS缓冲液）下另外培养。
图12显示了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌和酿酒酵母菌株的pH7下100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经25 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图13显示了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌和酿酒酵母菌株的pH7下补充有3 g/L oAB的100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经25 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图14显示谷氨酸棒杆菌菌株的pH7下未补充（黑色）或补充有3 g/L oAB（灰色）的100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经25 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图15显示恶臭假单胞菌菌株的pH7下未补充（黑色）或补充有3 g/L oAB（灰色）的100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经25 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图16显示了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌和酿酒酵母菌株的pH7下补充有3 g/L pAB的100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经27 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图17显示谷氨酸棒杆菌菌株的pH7下补充有0.1 g/L辛醇（黑色和灰色中一式两份）的100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经25 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图18显示恶臭假单胞菌菌株的pH7下补充有0.1 g/L辛醇（黑色和灰色中一式两份）的100-mL摇瓶培养物（具有MOPS缓冲液）经25 h（两次测定）后在600 nm的光密度(OD600)。
图19显示谷氨酸棒杆菌的pH7下100-mL摇瓶培养物（如图中所示补充的；一式两份）经25 h后在600 nm的光密度(OD600)。
图20显示谷氨酸棒杆菌的pH5下100-mL摇瓶培养物（如图中所示补充的；一式两份）经25 h后在600 nm的光密度(OD600)。
图21显示谷氨酸棒杆菌的pH 7 (MOPS)和pH 5（MES）下100-mL摇瓶培养物（如图中所示补充的；一式两份）经28 h后在600 nm的光密度(OD600)。
图22显示3、4和5 h后补充至 0 g/L补充剂(方形)、7 g/L oAB (圆形)、7 g/L pAB(十字)、40 mg/L十二烷醇(三角形)的终浓度的谷氨酸棒杆菌在pH 7下的发酵培养物经50h后在600 nm的光密度(OD600)。
图23显示2 h（补充oAB之前）、5 h（补充7 g/L oAB之后）、25 h和49.5 h之后用7g/L oAB的谷氨酸棒杆菌发酵的培养上清液在254 nm处的HPLC层析图。加上oAB标准品。
图24显示3、4、5、6和7 h后补充至 0 g/L补充剂(方形)、15 g/L oAB (三角形)、35g/L oAB (十字)和80 g/L oAB (圆形)的终浓度的谷氨酸棒杆菌在pH 7下的发酵培养物经58 h后在600 nm的光密度(OD600)。
图25显示3、4、5、6和7 h后补充至35 g/L oAB的终浓度的谷氨酸棒杆菌在pH 7下的发酵培养物经58 h后在600 nm的光密度(OD600)。
图26显示3、4、5、6和7 h后补充至80 g/L oAB的终浓度的谷氨酸棒杆菌在pH 7下的发酵培养物经58 h后在600 nm的光密度(OD600)。
图27显示基于载体系统pEMG的敲除程序图示。
图28显示恶臭假单胞菌KT2440 trpEGDC簇的遗传图(上面)和恶臭假单胞菌KT2440 trpDC缺失的遗传图(下面) (gph: 磷酸乙醇酸磷酸酶(部分的); trpE: 邻氨基苯甲酸合成酶组分I; GDSL: GDSL家族脂肪酶(与 l-色氨酸生物合成无关); hyp: 假定蛋白; trpG: 邻氨基苯甲酸合成酶组分II; crg: cAMP-调控蛋白(分布的); TS1: 缺失侧翼1; TS2: 缺失侧翼2)。
图29显示恶臭假单胞菌KT2440 serCpheAtyrA簇的遗传图(上面)和恶臭假单胞菌KT2440 pheA缺失的遗传图(下面)(gyrA: DNA 旋转酶亚基A(部分的); serC: 磷酸丝氨酸氨基转移酶; pheA: 分支酸变位酶/预苯酸脱水酶; tyrA: 预苯酸脱氢酶/ 3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶;cmk: 胞苷酸激酶; TS1: 缺失侧翼1; TS2: 缺失侧翼2)。
图30显示在1 L实验室规模生物反应器中具有细胞保留的连续发酵的切向流超滤模块（750 kDa的截止值）的集成。
图31显示在1 L实验室规模生物反应器中具有细胞保留的连续发酵的离心机(Centritech Lab III)的集成。
图32显示使用1 L培养体积、稀释速率0.05 L/h、培养温度30 ℃以1 M NH4OH控制的pH 7、通气的空气流速0.2 L/min、通过调节搅拌器速度200-1200 rpm将pO2控制在30％空气饱和，在分批和连续模式过程中谷氨酸棒杆菌∆trpD发酵生产oAB。细胞保留通过切向流超滤实现。
图33显示使用1 L培养体积、稀释速率0.01 L/h、培养温度30 ℃以1 M NH4OH控制的pH 7、通气的空气流速0.2 L/min、通过调节搅拌器速度200-1400 rpm以将pO2控制在30％空气饱和，在分批和连续模式过程中谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆gpi发酵生产oAB。细胞保留通过离心实现。
图34显示使用1 L培养体积、如图中所示0.025 L/h或0.05 L/h的稀释速率、培养温度30 ℃、以1 M NH4OH控制的pH 7、通气的空气流速0.2 L/min、通过调节搅拌器速度200-1200 rpm将pO2控制在30％空气饱和，谷氨酸棒杆菌∆trpD发酵连续生产oAB。细胞保留通过切向流超滤实现。
图35显示用催化剂2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。显示了在160 ℃、180 ℃和200℃下存在沸石Y的情况下40 wt%溶解于苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
图36显示用催化剂2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。显示了在200℃下存在沸石Y的情况下40 wt%溶解于苯胺和10% 水-90%苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
图37显示用催化剂2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。显示了在180℃下存在沸石Y的情况下40 wt%溶解于苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
图38显示用催化剂2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）在苯胺中的分解。显示了在180℃下存在沸石Y的情况下40 wt%溶解于苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
图39显示新鲜制备的H-Y催化剂和如上使用从水解玉米淀粉中分离的AA的反应后的H-Y催化剂的IR谱。标记苯胺的典型带。发生这种高度碱性种类的吸附。将OH区也突出显示。OH信号减少与可以在存在痕量元素情况下发生的一些部分离子交换相容，但OH基团似乎在催化中无活性，但可能是Al-O-Si桥键的作用。
表格列表
表1显示本研究中使用和/或生成的载体和质粒。
表2显示本研究中使用和/或生成的细菌菌株。
表3显示本研究中使用的引物。
表4显示针对本研究中使用和/或生成的细菌菌株的oAB生产的特征（CDW：细胞干重；Y：产率；µmax: 最大生长速率；STY：时空产率）。
表5显示产生针对TrpEG活性的TrpEG不同变体的谷氨酸棒杆菌∆trpD粗提取物的生物化学特征。
表6显示如实施例6中所述，AA 0.5％在水中被HAP、沸石Y (GO257和GO55)和ZSM5(ZSM5-27和ZSM5-55)的吸附。
表7显示如实施例6中所述，10和60分钟后在蒸馏水和缓冲的水溶液中以g AA/kg吸附剂计的金属交换的沸石GO257的AA吸附能力。
实施例
实施例1-用大肠杆菌产生氨基苯甲酸
大肠杆菌W3110 trpD9923 (大肠杆菌::trpD9923; 表2)购自Yale University的大肠杆菌Genetic Resource Center。菌株已通过随机诱变产生并包含称为trpD9923的突变的trpD基因。酶的失活通过在相关基因中随机点突变 (G T) 导致转移酶活性编码区中无义突变来实现。结果是，仅原始转移酶结构域中的七个氨基酸被翻译(Ikeda M, ApplMicrobiol Biotechnol, 2006, 69:615)。trpD9923基因的相关截短的酶失去其催化邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的反应的能力，但保留其邻氨基苯甲酸合成酶的活性。因此菌株可以合成邻氨基苯甲酸，但无法将其进一步代谢为l-色氨酸并因此为l-色氨酸营养缺陷型。这导致邻氨基苯甲酸的积累。
将菌株在具有10 mL培养体积的50 mL摇瓶中在28 ℃下以140 rpm生长。所用的培养基为含有20 mg/L l-色氨酸的矿物培养基M9 (1 g/L (NH4)2Cl、0.5 g/L NaCl、0.05 g/L硫铵、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.247 g/L MgSO4∙7H2O (Merck, Darmstadt)、0.015 g/L CaCl2、和10 g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。）。菌株在25.5 h后产生如通过HPLC-DAD (254 nm)测量的60 mg/L邻氨基苯甲酸（表4和实施例3）。将菌株通过使用敲除缺失将磷酸转移酶系统（PTS）失活来进一步优化。因此，产生了得到的PTS缺乏菌株大肠杆菌::trpD9923∆hpr (表2)并且适于使用25 mL摇瓶发酵以10 mL培养体积在37 ℃下以150 rpm在葡萄糖上生长并测试邻氨基苯甲酸产量。对于pts阳性菌株使用相同的培养基。其在25 h后产生如通过HPLC-DAD (254 nm)测量的69 mg/L邻氨基苯甲酸（表4和实施例3）。
实施例2-开发产生邻氨基苯甲酸和/或盐的微生物菌株的菌株选择
研究了工业生物技术中通常使用的若干菌株关于其对oAB和对所讨论的后期产物提取的有机溶剂（例如1-十二烷醇或辛醇）的天然耐受性。此外，研究了所用的pH值的影响。从之前实验中已知至少对于大肠杆菌而言，芳香化合物的毒性主要取决于pH值，可能是由于质子化的酸可以有效得多地渗透细胞膜并因此其毒性严重提高。假定oAB在有机相中的提取在低pH值（接近oAB的等电点）工作最佳。所考虑的最相关的宿主菌株为：大肠杆菌K12、谷氨酸棒杆菌DSM 20300 （=ATCC 13032）、恶臭假单胞菌KT2440、枯草芽孢杆菌亚种168、酿酒酵母DSM 70449和巴斯德毕赤酵母X33 (DSM 70382)。
为了针对所述特性研究所选菌株，进行摇瓶和小规模发酵实验并且以不同浓度、不同pH值向生物体添加有毒物质（氨基苯甲酸，溶剂），并且研究菌株行为。
将生物体（商业获得自订购自DSMZ，德国微生物和细胞培养物中心，Braunschweig）首先在摇瓶且其每一种在合适的公开的标准基本培养基中培养，以在标准培养条件下表征其生长(谷氨酸棒杆菌：预培养: BHI 培养基(37 g/L; 脑心浸出物;Becton Dickenson and Company, Heidelberg); 主要培养pH 7: CGXII-MOPS 培养基(42g/L MOPS 缓冲液、20 g/L (NH4)2SO4、5g/L 尿素(Fisher Scientific、Schwerte)、1 g/LKH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O (Merck, Darmstadt)、0.01 g/L CaCl2、和10g/L 葡萄糖(分开高压灭菌)。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L 生物素、0.01 g/L MnSO4·H2O (Merck, Darmstadt)、0.01 g/L FeSO4·7H2O(Merck、Darmstadt)、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/L CuSO4·5H2O (Merck, Darmstadt)、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O (Merck, Darmstadt)、和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸 (AcrosOrganics, Nidderau); 主要培养 pH 5:CGXII-MES 培养基 (39 g/L MES缓冲液、20 g/L(NH4)2SO4、5g/L 尿素 (Fisher Scientific, Schwerte)、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O (Merck, Darmstadt)、0.01 g/L CaCl2、和10 g/L 葡萄糖(分开高压灭菌)。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至5。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L 生物素、0.01 g/L MnSO4·H2O (Merck、Darmstadt)、0.01 g/L FeSO4·7H2O (Merck, Darmstadt)、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/L CuSO4·5H2O (Merck, Darmstadt)、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O(Merck, Darmstadt)、和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸 (Acros Organics, Nidderau); 大肠杆菌:预培养：LB 培养基 (Luria-Bertani; Roth, Karlsruhe); 主要培养 pH 7:M9 培养基(1 g/L (NH4)2Cl、0.5 g/L NaCl、0.05 g/L 氯化硫胺、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.247 g/L MgSO4∙7H2O (Merck, Darmstadt)、0.015 g/L CaCl2、和10 g/L 葡萄糖。用5mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。）；主要培养 pH 5：M9-MES 培养基(19.5 g/L MES缓冲液，1 g/L (NH4)2Cl、0.5 g/L NaCl、0.05 g/L 氯化硫胺、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.247 g/L MgSO4∙7H2O (Merck, Darmstadt)、0.015 g/L CaCl2、和10 g/L 葡萄糖。用5mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。）；枯草芽孢杆菌：预培养：LB 培养基；主要培养pH 7:M9-SL 培养基 (1 g/L (NH4)2Cl、0.5 g/L NaCl、0.05 g/L 硫铵、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.247 g/L MgSO4∙7H2O、0.015 g/L CaCl2、1.0 mg/L MnCl·H2O、1.35 mg/L FeCl·6H2O、1.7 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.04 mg/L CuCl·2H2O、0.06 mg/L CoCl2∙6H2O、0.06 mg/L Na2MoO4∙2H2O、和10 g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。）；主要培养 pH 5：M9-SL-MES 培养基 (19.5 g/L MES缓冲液，1 g/L (NH4)2Cl、0.5 g/L NaCl、0.05 g/L 硫铵、1 g/LKH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.247 g/L MgSO4∙7H2O、0.015 g/L CaCl2、1.0 mg/L MnCl·H2O、1.35mg/L FeCl·6H2O、1.7 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.04 mg/L CuCl·2H2O、0.06 mg/L CoCl2∙6H2O、0.06 mg/L Na2MoO4∙2H2O、和10 g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至5。）；恶臭假单胞菌：预培养：LB 培养基；主要培养pH 7:Brunner培养基 (0.5 g/L (NH4)2SO4、1 g/LKH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4∙7H2O、0.05 g/L CaCl2、5.0 mg/L EDTA、2.0 mg/LFeSO4·7H2O、0.03 mg/L MnCl·H2O、0.1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.01 mg/L CuCl·2H2O、0.2mg/L CoCl2∙6H2O、0.03 mg/L Na2MoO4∙2H2O、0.3 mg/L H3BO3、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O、和10g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。）；主要培养 pH 5：Brunner-MES培养基(19.5 g/L MES缓冲液，0.5 g/L (NH4)2SO4、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4∙7H2O、0.05 g/L CaCl2、5.0 mg/L EDTA、2.0 mg/L FeSO4·7H2O、0.03 mg/L MnCl·H2O、0.1mg/L ZnSO4∙7H2O、0.01 mg/L CuCl·2H2O、0.2 mg/L CoCl2∙6H2O、0.03 mg/L Na2MoO4∙2H2O、0.3 mg/L H3BO3、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O、和10 g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至5。）；酿酒酵母：预培养：YPD培养基 (10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖); 主要培养 pH 5:SCM 培养基 (5 g/L (NH4)2SO4、3 g/L KH2PO4、2.5 g/L MgSO4∙7H2O、0.5 g/L NaCl、20 mg/L 肌醇、5 mg/L 硫铵、1.32 mg/L 核黄素、17.8 mg/L 泛酸钙、18.4 mg/L 盐酸、5.16 mg/L 吡哆醇-HCl、0.18 mg/L 生物素、0.12 mg/L 叶酸、40.6 mg/LFeCl3·6H2O、6.0 mg/L ZnCl2·4H2O、3.0 mg/L CaCl2∙2H2O、5.76 mg/L CuSO4·5H2O、6.0mg/L CoCl2∙6H2O、6.0 mg/L Na2MoO4∙2H2O、1.56 mg/L H3BO3、和5 g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至5。）(Sambrock J; Fritsch, EF, and Maniatis, T:MolecularCloning - a laboratory manual.Cold Spring Larbor Laboratory Press; 1989; NewYork; Harwood CR, Cutting SM:Molecular biological methods forBacillus.Chichester, England:John Wiley & Sons Ltd; 1990; Keilhauer, C,Eggeling, L, Sahm, H:J Bacteriol, 1993, 175(17):5595)。这些实验用pH 7和pH 5的培养基进行以评价氨基苯甲酸在低pH值下的毒性中的差异。酵母菌株仅在低于7（5.5和3.5）的pH值下研究。通过添加不同的缓冲系统（MOPS、MES）稳定不同的pH值。
将菌株的100-mL摇瓶培养物（pH 5（与MES缓冲液）温育33 h并且通过随时间测量在600 nm的光密度(OD600)来跟踪生长（三次测定）。谷氨酸棒杆菌另外在pH 7下（与MOPS缓冲液）培养。图11显示结果。
收集的数据显示在所有研究的生物体中谷氨酸棒杆菌在pH5表现出最佳生长。大肠杆菌、恶臭假单胞菌和酿酒酵母的确在pH5下生长非常差。尽管如此，在一些培养物中，由于代谢活性，pH额外下降低于4。为了排除由于代谢活性的生长影响，实验在具有自动pH调节的发酵罐中进行。如预期地，已经可见的是在低pH下的培养降低了所有测试的生物体的生长速率。然而，为了比较所有考虑的生物体在pH 7下标准培养条件下的生长，用添加有MOPS缓冲液的所有基本培养基进行重复实验。另外，类似的培养物添加有oAB（终浓度3 g/L，分三次在指数生长期开始时添加（2、3、4h温育时间后））。将菌株的100-mL摇瓶培养物（pH7（添加或不添加3 g/L oAB）温育25 h并且通过随时间测量在600 nm的光密度(OD600)来跟踪生长（两次测定）（图12和图13）。谷氨酸棒杆菌在所选的培养条件下达到最高的值，并且此外其生长不受添加3 g/L oAB的抑制，而其他生物体例如枯草芽孢杆菌的生长在3 g/LoAB下已经强烈降低。从这些结果中，将谷氨酸棒杆菌鉴定为在pH 7下oAB生产的优选候选者（图14和图15）。
为了研究所考虑的菌株针对对氨基苯甲酸（pAB）和溶剂（辛醇和1-十二烷醇）的耐受性，将菌株如之前所述在pH7下培养（酿酒酵母于pH5.5）并添加有3 g/L pAB（图16）。谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌和巴斯德毕赤酵母的生长在这些条件下不受pAB的抑制，而酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的生长严重降低。研究了提取溶剂辛醇的毒性。辛醇在水中的溶解度约为0.1 g/L，因此将培养物添加有这样的辛醇量和额外添加3 g/L。显示在0.1g/L辛醇下所有生物体已经无法生长，但在3 g/L辛醇下更为明显。仅恶臭假单胞菌在添加辛醇后显示出最小的生长活性（图17和图18）。
如在所有进行的实验中，谷氨酸棒杆菌显示最高的细胞密度和最佳的耐受性能力，该菌株用5 g/L oAB 和5 g/L pAB分别在pH 5和pH 7下类似地培养。在这些条件下没有检测到生长抑制（图19和图20）。在pH5下，细胞密度减半，导致结论为：发酵应该更优选在pH7下进行。
研究十二烷醇作为替代的提取溶剂。十二烷醇在水中具有约40 mg/L的溶解度。谷氨酸棒杆菌如上所述在pH5和7下在补充有40 mg/L 1-十二烷醇的情况下进行培养。十二烷醇没有影响所述菌株在这些条件下的生长（参见图19和图20）。
在小规模发酵罐中重复在摇瓶实验中用谷氨酸棒杆菌获得的结果（图21）。为了进一步表征谷氨酸棒杆菌针对氨基苯甲酸和1-十二烷醇应激的耐受性，在pH7下使用具有受调节的pH、搅拌、氧供应、温度的1L-4倍发酵单元(HiTecZang)和在葡萄糖补料下进行生物体的小规模发酵。葡萄糖补料允许菌株生长至更高的细胞密度。
用谷氨酸棒杆菌在基本培养基pH7（如上所述但不添加MOPS、生物素、儿茶酸和尿素）中进行发酵实验，且一个发酵罐不补充任何物质（阳性对照），一个发酵罐补充有7 g/LoAB，一个发酵罐补充有7 g/L pAB且一个发酵罐补充有40 mg/L 1-十二烷醇。所得到的生长曲线显示谷氨酸棒杆菌的生长不受所添加的1-十二烷醇的影响。这证实了在摇瓶中获得的结果（参见图22）。分别补充oAB和pAB导致延长的滞后期但最终达到相同的细胞密度（参见图22）。结论是：1-十二烷醇是合适的oAB提取溶剂。
进一步增加氨基苯甲酸的浓度以寻找其显著抑制谷氨酸棒杆菌生长的边界。需要排除氨基苯甲酸被生物体降解并因此在延长的滞后期之后恢复生长。为了研究在发酵罐中氨基苯甲酸的稳定性，在发酵过程中收集培养物上清液样品并通过HPLC-DAD（254 nm）分析（参见图23和实施例3）。在培养过程中氨基苯甲酸没有显著降解。
在进一步的实验中，增加oAB的浓度以研究对谷氨酸棒杆菌的作用。四个发酵罐至此补充有0 g/L、15 g/L、35 g/L和80 g/L的oAB。为了实现酸在pH7以这样的高浓度的溶解度，将酸用氢氧化铵滴定以形成oAB在储存溶液中相应的铵盐，其随后在5h内分五次添加至发酵罐（在培养3、4、5、6和7h之后）。其余的培养条件保持如上所述。添加80 g/L oAB导致细胞在54小时内死亡（裂解）并且35 g/L oAB导致生长抑制（参见图24、图25和图26）。添加有15 g/L oAB的培养物已显示34-48 h的延长的滞后期，之后恢复生长并且细胞进入指数期（参见图24）。发酵过程中oAB降解再次通过HPLC测量培养物上清液来排除（数据未显示）。
总之，结论是：oAB的产生应该最优选用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株来完成。此外，结论是：发酵过程应优选在pH 5-7下进行，且更优选在pH7下进行并且提取（如需要）应优选用1-十二烷基作为提取溶剂来进行。辛醇不是合适的提取溶剂。
实施例3-用谷氨酸棒杆菌产生邻氨基苯甲酸和/或盐
开发了以g/L规模计产生邻氨基苯甲酸的细菌菌株。该工作基于色氨酸生产者（例如在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中）的遗传操作，并且包括开发和实现这样的策略以遗传操作中心代谢、共同芳香族生物合成和l-色氨酸分支途径以获得邻氨基苯甲酸和/或盐（oAB）生产者。基于上述结果，代谢工程优选基于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
基于大肠杆菌DH5α菌株的一般培养
如果未另行指明，所有化学品均获自Sigma-Aldrich (Sternheim)并且所有酶均来自New England Biolabs (Schwalbach)。大肠杆菌在无菌条件下在LB培养基(Luria-Bertani; Roth, Karlsruhe)或在LB-琼脂(Abcr GmbH & Co. Kg, Karlsruhe)板在37 ℃下进行培养。通过添加抗生素(100 mg/L氨苄青霉素钠盐; 50/25 mg/L硫酸卡那霉素; 100mg/L 硫酸壮观霉素)来实现选择性培养。对于质粒制备，菌株已在15 mL管中在3 mL LB培养基和选择性抗生素中在37 ℃下以200 rpm恒定摇动培养14h-16h (Kuhner Shaker ISF-4-W; Adolf Kühner AG, Basel (Switzerland))。
一般分子生物学方法
PCR反应通常使用 Platinum® Taq DNA Polymerase (5 U/µL; Life technologies,Darmstadt)用约50 ng PCR模板和10 pmol相应的引物对（参见表3）来进行。PCR条件：98 ℃5 min, 98 ℃ 30 sec, 56 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 min/kb, 30x, 16 ℃保持(Mastercycler® nexus – Cycler; Eppendorf, Hamburg)。使用NucleoSpin® PlasmidPure 试剂盒(Macherey & Nagel, Düren)按照制造商说明书进行质粒DNA纯化。质粒DNA消化以20 µL规模用5 U相关的限制酶和约1 µg质粒DNA在由酶供应商推荐的缓冲液中完成并在37 ℃下温育约2 h，随后通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。琼脂糖凝胶用溶解于1xTAE电泳缓冲液(Promega, Fitchburg USA)中的1%琼脂糖(Abcr GmbH & Co. Kg, Karlsruhe)制备。提供的电场为90 V-120 V (EPS300; Pharmacia Biotech; VWR International GmbH,Darmstadt)并且DNA经溴化乙锭(0.3-0.5 mg/L) 或Midori Green (Midori GreenAdvance DNA Strain; NIPPON Genetics EUROPE GmbH, Düren)来检测。凝胶文件：GeneGenius®; VWR; Darmstadt。对于琼脂糖凝胶DNA提取，如制造商所说明使用NucleoSpin®Gel and PCR Clean-up (Macherey & Nagel, Düren)试剂盒。对于DNA连接，在由制造商提供的缓冲液中使用T4-DNA连接酶（20 U）。所用的插入片段与质粒的重量比为4:1。将混合物在16 ℃下温育约15 h，随后在65 ℃下温育10 min。将质粒和连接反应物引入电感受态大肠杆菌DH5α细胞(ElectroMAX™ DH5α-E™ Competent Cells; Lfe Technologies,Darmstadt)。使用Gene Pulser Xcell System (BioRad, Hercules, CA)在0.2 cm缝隙的电击杯(BioRad, Hercules, CA)中电转化(条件: ~20 ms 指数式衰变脉冲, 2.5 kV/cm,25 F, 200 Ω)后，将800 µL LB回收培养基立即加入并且将悬浮液转移至1.5 mL微量离心管中。在37 ℃下1h后，将细胞悬浮液铺至添加有合适抗生素的LB琼脂板上，并在37 ℃下温育过夜。收集克隆并经限制性分析、菌落PCR和/或测序验证正确的转化。对于菌落的菌落PCR分析，用无菌牙签挑取菌落，转移至单独的平板（主平板），溶解于1 µL DMSO并在98 ℃下煮10 min，随后添加至标准PCR混合物中。通过PCR和/或DNA测序验证所有专利的正确克隆和相关突变体的产生。
基于谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的一般培养
将谷氨酸棒杆菌在无菌条件下在BHI培养基(37 g/L; 脑心浸出物; BectonDickenson and Company, Heidelberg)管、摇瓶或在琼脂板上在30 ℃下培养。通过添加抗生素(15 mg/L硫酸卡那霉素；100 mg/L 硫酸壮观霉素)实现选择性培养。
对于菌株表征，第一预培养物从分离的菌落开始并且在4 mL BHI培养基中用恒定摇动以400 rpm培养10h，并且取决于菌株，补充有合适的抗生素或芳香族氨基酸。第二预培养物在50 mL CGXII-MES 培养基中生长 (42 g/L MOPS缓冲液、20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素 (Fisher Scientific, Schwerte)、3.7 g/L 脑心浸出物、1 g/L KH2PO4、1 g/LK2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O (Merck, Darmstadt)、0.01 g/L CaCl2、和10 g/L 葡萄糖(分开高压灭菌)。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。无菌过滤后在用1 mL第一预培养物接种后在250 mL摇瓶中加入以下组分：2 mg/L 生物素、0.01 g/L MnSO4·H2O (Merck、Darmstadt)、0.01 g/L FeSO4·7H2O (Merck、Darmstadt)、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/LCuSO4·1H2O (Merck, Darmstadt)、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O (Merck, Darmstadt)、和0.03g/L 3.4-二羟基苯甲酸 (Acros Organics, Nidderau))，并以400 rpm恒定摇动培养16h-18h。发酵培养物在100 mL CGXII培养基(20 g/L (NH4)2SO4、5g/L 尿素、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O、0.01 g/L CaCl2、100 µL/L 聚丙二醇(分开高压灭菌)和18g/L葡萄糖(分开高压灭菌)中生长。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/L CuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O、和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸)。将每一生物反应器(DasBox, Eppendorf, Hamburg)用第二预培养物接种至0.5的终OD600。将初始搅拌速度设定为100 rpm并且以2.2 L/h (0.37 V/(V*min)供应空气。持续监测溶解氧(OxyFermFDA 120; Hamilton, Bonaduz (Switzerland))并且通过自动调节搅拌速度来维持30%空气饱和。测量pH (EasyFermPlus K8 120; Hamilton, Bonaduz (Switzerland))并且通过自动添加1 M NaOH来维持在7，且温度保持在30 ℃。为了防止泡沫产生，通过测量发酵液上的电导率的电导率传感器来自动添加10%聚丙二醇的添加。将发酵作为重复的分批过程来进行。进行用18 g/L葡萄糖（分开高压灭菌）的额外补料三次。在发酵过程中，从1.5mL发酵罐样品中离线测量发酵细胞干重（BDW）、葡萄糖浓度和邻氨基苯甲酸浓度。将1 mL等分试样的每一样品在称重的反应管中以16000 x g (5415R; Eppendorf, Hamburg)离心5min。为了测定细胞干重，将沉淀在60 ℃下 (杂交炉; Appligene Oncor Lifescreen,Watford (UK))干燥至少72h。随后使用分析天平(La 230 S; Satorius AG, Göttingen)来测定准确的沉淀重量。经HPLC-DAD (1100; Agilent Technologies, Santa Clara (USA))和YSI (YSI-Select 2700; Kreienbaum Neoscience GmBH, Langenfeld)分析上清液。收集的数据显示于图4中。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的一般操作
通过电穿孔将质粒DNA转移入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中。对于转化，将细胞通过离心(4000 g, 10 min, 4 ℃ (5810R; Eppendorf, Hamburg))从生长在BHI培养基且在指数生长期(OD600 = 1.75-2.0)的200 mL培养物中收获并且用20 mL冰冷的TG缓冲液(1 mM Tris-HCl, 10 % 甘油, pH 7.0)洗涤三次。将沉淀重悬于2 mL 10%的甘油溶液并且直接用于转化或者在-80 ℃下储存直至使用。对于转化，将质粒DNA (约1 µg)首先吸取到冰冷的0.2cm缝隙的电击杯随后为150 µL细胞悬浮液。冰上温育5min后，进行电穿孔（条件：~20 ms指数式衰变脉冲, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω)。将悬浮液转移至具有500 µL 预热(46 ℃)的BHI培养基并且在30 ℃下以400 rpm恒定摇动温育1h。将细胞铺在含有相应抗生素的BHI培养基琼脂板上。
对于指定靶基因的表达，采用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEKEx2(Eikmanns BJ, Kleinertz E, Liebl W, Sahm H, Gene, 1991, 102:93)。8.16 kb载体来源于载体pU18并且编码卡那霉素抗性盒、用于在谷氨酸棒杆菌中增殖的起点V（oriV）的pBL1点、用于在大肠杆菌中增殖的pU18 oriV、强tac-启动子(异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)-诱导的)和lacIQ基因。可选地，采用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pCRB210(Yukawa H, Inui M, US20130302860(A1), 2013)，其适合于用pEKEx2共转化。4.96 kb载体编码壮观霉素抗性盒、用于在谷氨酸棒杆菌中复制的起点V（oriv）的pCASE1点、用于在大肠杆菌中复制的oriV和用于组成型基因表达的gapA启动子。选择用于在谷氨酸棒杆菌或其突变体中过表达的基因片段通过MWG Operon GmbH合成，通过单核苷酸交换（沉默突变）去除了所有天然存在的SbfI、BamHI、BglII、NcoI和NdeI限制性位点并且在相应的ORF上游插入核糖体结合位点（与aroG、aroK、glnA和aroL的基因序列分开，其通过PCR从其天然位点上扩增，参见引物（表3））。在trpEG和aroG基因的情况下，将单核苷酸交换包括到基因中以获得相关酶的反馈抗性形式。将所得的序列经SbfI和BamHI限制性切割和再连接而克隆入pEKEx2载体的多克隆位点。与glnA基因序列分开，将其经限制性切割和再连接而克隆入pCRB210载体，产生pCRB-glnA（表1）。合成的基因片段基本上具有结构：“SbfI-BglII-RBS-基因-BamHI”。这允许靶基因(作为BglII-BamHI-片段)经单一BamHI限制性位点反复连接入载体。测序质粒以验证正确的克隆和序列。对谷氨酸棒杆菌（及其变体）转化子进行抗生素抗性筛选并且通过PCR验证相关的突变体的正确产生。
对于靶基因的缺失，以及基因或其他序列片段插入谷氨酸棒杆菌的基因组中，采用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB (Schäfer A, Tauch A, Jäger W,Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A, Gene, 1994, 145:69)。5.72 kb载体来源于载体pU18并且编码卡那霉素抗性盒、没有在谷氨酸棒杆菌中复制的起点、用于在大肠杆菌中增殖的pU18 oriV、acZα基因和sacB 基因。通过MWG Operon GmbH合成靶序列 (与trpD和csm分开, 其用特异性引物从谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中PCR扩增（表3）），且通过单核苷酸交换（沉默突变）去除所有天然存在的HindIII和EcoRI限制性位点，并将其经HindIII和EcoRI限制性切割和再连接而克隆入载体的多克隆位点中。对于基因缺失（或整合），克隆的DNA序列由靶基因的300-500 bp的5'侧翼区（包含基因的前6个密码子）、21 bp的外源错义序列（或者待整合入基因组中的序列）、和靶基因的300-500 bp的3'侧翼区（包含目标基因的最后6个密码子）组成。通过卡那霉素选择筛选谷氨酸棒杆菌转化子的将质粒整合入基因组的单交换事件，因为所得的质粒自身无法在谷氨酸棒杆菌中复制。将携带转化子的BHI培养基琼脂板（包含15 mg/L卡那霉素）在30 ℃下培养1-7天。随后通过用蔗糖选择（将克隆在5 mL BHI培养基中培养4h-6h，并随后以两个不同的稀释度(1:100和1:10000)铺板在包含10%(w/v)蔗糖的BHI培养基琼脂板上）来筛选分离的克隆的双交换事件，其导致框内缺失靶基因，仅留下后面的21 bp的外源无义序列（或待整合入基因组的代替序列）。载体上的 sacB基因编码果聚糖蔗糖酶，其将蔗糖转化为致死性产物，而结果是防止其基因组中仍携带质粒序列的所有克隆生长。在含蔗糖平板上生长的所有菌落通过共转移至补充有15 mg/L卡那霉素的BHI培养基琼脂板以及BHI培养基琼脂板上来分析并且在30 ℃下培养1-7天。通过菌落PCR分析仅在没有补充卡那霉素的平板上生长的菌落以确认正确重组。通过PCR和/或DNA测序验证所有质粒的正确克隆和相关突变体的生成。
高效液相色谱
使用Agilent 1100系列HPLC-DAD 系统(具有二极管阵列检测器；AgilentTechnologies, Santa Clara (USA))来定量培养上清液中oAB浓度。在20 ℃下使用C18柱Luna® HPLC-柱(4.6 × 250 mm; 3 µm; Phenomenex)作为固定相，并且使用由甲醇（溶剂B）和包含0.1%甲酸的水（溶剂A）组成的双元溶剂。注射10 µL的稀释的培养上清液。应用具有0.5 mL/min流速的以下梯度：0-1 min, 2 % B; 1-2 min, 2-10 % B; 2-12 min, 10-70% B; 12-23 min, 70-90 % B; 23-25 min, 90 -98 % B, 25-27 min, 98 % B; 27-27.5min, 98 %-2 % B; 27.5-30 min, 2 % B。使用外部校准曲线从在254 nm（保留时间：18.9min）的信号整合测定oAB浓度。
谷氨酸棒杆菌菌株中trpD基因的工程改造
通过使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB框内缺失trpD基因（编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶; Cgl3032; SEQ ID NO: 1）产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD(参见表2)。trpD 开放阅读框的5'侧翼区（包括基因的前7个密码子）和靶基因的3'侧翼区（包括trpD 开放阅读框的最后8个密码子）通过PCR分别使用引物对Del-trpD-1和Del-trpD-2、以及Del-trpD-3和Del-trpD-4(表3, SEQ ID NO: 66-69)从分离自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA扩增。所得到的两个片段通过交换PCR使用引物对Del-trpD-1和Del-trpD-4进行组合。将所得的片段经SmaI限制性和再连接克隆入pK19mobsacB载体的多克隆位点。所得载体应用于从谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中框内缺失trpD 并且框内 引入24 bp外源无义序列入基因组,其用于交换PCR（trpD位点中的所得序列：SEQ ID No.2）。正确突变体如上所述进行分离并且正确基因缺失通过PCR验证。这产生具有oAB积累的l-色氨酸营养缺陷型菌株。将该菌株针对其在添加0.1 mM l-色氨酸或0.1 mM吲哚的情况下如上所述作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。
将trpD基因的六种形式经如上所述的SbfI和BamHI限制性切割和再连接而克隆入载体pEKEx2。trpD基因的六种不同形式通过PCR使用谷氨酸棒杆菌基因组DNA作为模板用不同的起始密码子以及核糖体结合位点和trpD 的起始密码子之间的间隔序列长度(SEQ IDNo. 3-8)产生。用于六种片段产生的引物为正向引物(Ex-trpD-1至-6, 表2, SEQ ID No.70-75)，其包括改变的起始密码子以及核糖体结合位点和起始密码子之间的间隔序列，连同每一形式未改变的反向引物(Ex-trpD-rev, 表2, SEQ ID No. 76)。选择该方法以实现产生的菌株中TrpD蛋白翻译的降低。用所得质粒（表1）转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD (表2)，并且所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpD1-6 (表2)在没有添加l-色氨酸的情况下生长，且因此，针对其如上所述在向培养基补充25 mg/L卡那霉素和1 µM IPTG (异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。而且菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpD5-6 生产足够的l-色氨酸以实现生物质形成；它们积累显著量的oAB（表4）。trpD 基因的形式trpD1-3、trpD5和trpD6 此外通过同源重组使用如上所述的pK19mobsacB载体各自整合入菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD（表2）的基因组。trpD基因形式的5'侧翼区和靶基因的3'侧翼区通过PCR分别使用引物对Del-trpD-1和Ko-trpD-1以及Del-trpD-3和Del-trpD-4 (表3, SEQ ID No. 66、77、68和69)从分离自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA扩增。通过交换PCR使用引物对Ex-trpD-1-3、-5或-6和Ko-trpD-2(表3, SEQ ID No. 70-72、74、75和78)将所得的两个片段与不同的trpD变体组合。将所得的五个片段经SmaI限制性和再连接克隆入pK19mobsacB载体的多克隆位点。将所得的质粒（表1）应用于将六个trpD形式引入到菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD的基因组中。此外，将10个外源核苷酸(GCCCTGCAGG, SEQ ID NO: 92)整合到基因组中，由于克隆程序，其位于trpD基因的核糖体结合位点上游，其应用于交换PCR。如上所述分离正确的突变体并通过测序trpD区域验证整合。所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD1-3、trpD5或trpD6 (表2)在不添加l-色氨酸或卡那霉素的情况下生长且因此，针对其如上所述在没有其他培养基补充剂的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。
可以将用于降低基因表达的上述方法应用于其他基因，而不进行基因缺失。
谷氨酸棒杆菌菌株中csm基因的工程改造
使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB通过csm基因(编码分支酸变位酶；Cgl0853)的框内缺失产生菌株谷氨酸棒杆菌∆csm、谷氨酸棒杆菌∆trpD∆csm，和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm (表2)。csm开放阅读框的5'侧翼区（包括基因的前6个密码子）和靶基因的3'侧翼区（包括csm开放阅读框的最后6个密码子）通过PCR分别使用引物对Del-csm-1和Del-csm-2，和Del-csm-3和Del-csm-4(表3, SEQ ID NO: 79-82)从分离自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA扩增。所得到的两个片段通过交换PCR使用引物对Del-csm-1和Del-csm-4进行组合。如上所述，将所得的片段经SmaI限制性切割和再连接而克隆入pK19mobsacB载体的多克隆位点。将所得载体分别应用于从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5和菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD的基因组框内缺失csm，并且框内引入24 bp外源无义序列入基因组,其用于交换PCR（csm位点中的所得序列：SEQ ID No.10）。正确突变体如上所述进行分离并且通过PCR验证正确的基因缺失。这产生l-酪氨酸和l-苯丙氨酸营养缺陷型菌株谷氨酸棒杆菌∆csm和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm，以及l-酪氨酸、l-苯丙氨酸和l-色氨酸营养缺陷型菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD∆csm。对于谷氨酸棒杆菌∆csm菌株，将菌株针对其如上所述在向培养基补充0.1 mM l-酪氨酸和0.1 mM l-苯丙氨酸的情况下作为oAB生产者的特性进行表征，对于谷氨酸棒杆菌∆trpD∆csm菌株，将菌株针对在向培养基补充0.1 mM l-酪氨酸、0.1 mM l-苯丙氨酸和0.1 mM l色氨酸的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（表2）。与野生型菌株以及菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD相比，所产生的菌株均有受损的生长速率，并且在标准培养条件下它们没有积累显著量的oAB(表4)。
将csm基因的六种形式经如上所述的SbfI和BamHI限制性切割和再连接而克隆入载体 pEKEx2。 csm基因的六种不同形式通过PCR使用谷氨酸棒杆菌基因组DNA作为模板用不同的起始密码子以及核糖体结合位点和csm的起始密码子之间的间隔序列长度(SEQ IDNo. 11-16)产生。用于六种片段产生的应用引物为正向引物(Ex-csm-1至-6)，其包括改变的起始密码子以及核糖体结合位点和起始密码子之间的间隔序列，连同每一形式未改变的反向引物(Ex-csm-rev, 表3, SEQ ID No. 89)。选择该方法以实现产生的菌株中Csm蛋白翻译的降低。用所得质粒（表1）转化菌株谷氨酸棒杆菌∆csm (表2)，并且所得菌株谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2-csm1-6 (表2)在没有添加l-酪氨酸、l-苯丙氨酸和l-色氨酸的情况下生长，且因此，针对其如上所述在向培养基补充25 mg/L卡那霉素和1 µM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。用空载体pEKEx2（表1）转化菌株谷氨酸钠棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm (表2)并且所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm/pEKEx2(表2)在没有添加l-色氨酸的情况下生长，并且因此针对其如上所述在向培养基补充25mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（表4）。生成的菌株产生足够的芳香族氨基酸以实现生物质形成，但在标准培养条件下它们没有积累显著量的oAB（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株的共同芳香族途径和l-色氨酸分支的工程改造
谷氨酸棒杆菌菌株中trpEG基因的工程改造
谷氨酸棒杆菌的芳香族生物合成途径已经阐明并且与编码oAB生物合成相关的基因是已知的(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)。oAB是L-色氨酸生物合成途径的中间体且通过邻氨基苯甲酸合成酶（由酰胺转移酶(TrpE; 供体：L-谷氨酰胺)和邻氨基苯甲酸合成酶单元（TrpEG）组成）来源于分支酸（CHO），其在形成oAB和L-谷氨酰胺时释放丙酮酸分子。编码TrpEG的基因的表达增加已显示导致大肠杆菌菌株中积累L-色氨酸(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)。尽管如此，据报道，该酶受L-色氨酸的强烈反馈抑制 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)，导致应用TrpEG蛋白的反馈抗性形式。基于来自乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)（谷氨酸棒杆菌）、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的trpEG序列已经报道了TrpEG蛋白的反馈抗性形式(Calguri 等人, J Bio Chem,1991, 8328-8335;Kwak 等人, J Biochem Mol Bio, 1999, 20-24, Ikeda M, Appl MicrobiolBiotechnol, 2006, 69:615 and Matsui 等人, J Bac, 1987, 5330-5332)。基于大肠杆菌基因的最有利的trpEG形式在谷氨酸棒杆菌菌株中表达，以及谷氨酸棒杆菌ATCC13032的天然TrpEG蛋白的trpEG序列上的所选的氨基酸交换在谷氨酸棒杆菌菌株中实现并表达。总之，相比于谷氨酸棒杆菌的天然TrpEG蛋白，表征了四种反馈抗性TrpEG蛋白（基于大肠杆菌TrpEG：TrpEGS40R和TrpEGS40F (SEQ ID No. 50-51)；和基于谷氨酸棒杆菌TrpEG:TrpEGS38R和TrpEGS38F) (SEQ ID No. 52-53）。五种形式的trpEG基因通过Eurofins MWGOperon GmbH合成并且经SbfI和BamHI限制性切割和再连接而克隆入载体 pEKEx2，并且通过测序验证正确克隆。用所得质粒（表3）转化菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 (表2)(谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5仅具有质粒pEKEx2- trpEG S40F)，并且所得菌株谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG、谷氨酸棒杆菌/pEKEx-trpEG S38F、谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG S38R、谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG S40F、谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG S40R、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-trpEG S40F (表2)针对其如上所述在向培养基补充25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IP的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。另外，根据Caliguri和Bauerle (1991)对携带pEKEx2-trpEG 变体的五种基于谷氨酸棒杆菌∆trpD的菌株的细胞裂解物的邻氨基苯甲酸合成酶活性进行分析。从在具有补充有25 mg/L卡那霉素和1 mM IPTG的30 mL BHI培养基的300 mL摇瓶中且在30 ℃下以150 rpm摇动生长（终OD600 4）的来自30 mL基于携带pEKEx2-trpEG 变体的谷氨酸棒杆菌∆trpD的菌株的培养物产生的细胞沉淀产生细胞裂解物。将细胞沉淀使用0.1 mm氧化锆珠粒(Zymo ResearchCoperation, Irvine, CA)裂解并且根据Caliguri 和Bauerle (1991)于25 ℃下重悬于测定缓冲液(50 mM KH2PO4/K2HPO4, 20 mM l-谷氨酰胺，10 mM MgCl2和25 µM分支酸)。使用荧光分光计（激发：390 nm）在390 nm处测量发射。所有测试的变体相对于具有天然谷氨酸棒杆菌TrpEG蛋白的细胞裂解物显示更高的邻氨基苯甲酸合成酶的比活性。使用了三个生物学重复用于测量。相比于谷氨酸棒杆菌TrpEG蛋白变体大肠杆菌TrpEG蛋白变体具有更高的活性和更低的KM（KM 和 vmax 值的测定用Graphpad Prism (La Jolla, CA)进行）。菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpEG S40F 的细胞裂解物已显示最佳性能（参见表5）。
表5 产生TrpEG的不同变体的谷氨酸棒杆菌∆trpD 粗提取物对于TrpEG活性的生物化学表征
菌株 KM (µmol) Vmax (mU/mg)
谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpEG 11.4 12.7
谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpEG S38F 16.2 68.8
谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpEG S38R 21.6 231.2
谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpEG S40F 1.9 427.5
谷氨酸棒杆菌∆trpD/pEKEx2-trpEG S40R 1.9 317.9
谷氨酸棒杆菌菌株中aroG基因的工程改造
在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌两者中，已报道经共同芳香族途径直至分支酸的碳流(carbon flux)主要在3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸合成酶的第一反应处受到控制(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)。在谷氨酸棒杆菌中，存在具有不同亚基大小的两种类型的DS。一个是具有39 kDa预测分子量的L-酪氨酸敏感的DS（I型-DS; aro 产物; Cgl0950），而另一个为具有51 kDa预测分子量的L-苯丙氨酸-和L-酪氨酸-敏感的DS (II型-DS; aroII 产物; Cgl2098)。II型-DS与将分支酸转化为预苯酸的分支酸变位酶形成多肽复合体。II型-DS通过其自身展示出活性，而CM活性需要存在II型-DS蛋白(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)。已经描述了反馈抗性的AroIDS (AroIS187C) (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)。将来自大肠杆菌的AroII的反馈抗性等同物DS AroGfbr (AroGD146N; SEQ ID No. 55)（其不受芳香族氨基酸的抑制）在谷氨酸棒杆菌菌株中表达以增强经共同芳香族途径向CHO和oAB的碳流。使用引物Ex-aroG-1和Ex-aroG-2 (表3, SEQ ID No. 109-110)通过PCR扩增 aroG D146N 基因，所述引物包含如上所述的限制性位点和核糖体位点。将所得的DNA片段如上所述经SbfI和BamHI 限制性切割和再连接而克隆入载体pEKEx2，并且通过测序验证正确的克隆。用所得质粒（表1）转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 (表2)并且所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N (表2)对其如上所述在向培养基补充有25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中trpEG和aroG 基因的工程改造
为了允许研究AroGD146N和TrpEGS40F在谷氨酸棒杆菌菌株中组合表达的影响，将编码这些蛋白的DNA序列融合入pEKEx2载体上。将aroG D146N 序列融合入pEKEx2-trpEG S40F 以获得pEKEx2-trpEG S40F-aroG D146N （表1）并且将基因trpEG S40F融合入质粒pEKEx2-aroG D146N 以获得pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F (表1)，其如上所述均通过BglII和BamHI 限制性切割和再连接，且通过测序验证正确克隆。用每一所得的质粒转化谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5（表2）并将所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-trpEG S40F-aroG D146N (表2)针对其如上所述在向培养基补充有25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。另外，用质粒pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F 转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm (表2)并且将所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm /pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F (表2)针对其如上所述在向培养基补充 25 mg/L卡那霉素、0.1 mM l-酪氨酸、0.1 mM l-苯丙氨酸和0.1mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中aroK和aroL基因的工程改造
为了防止谷氨酸棒杆菌菌株的共同芳香族氨基酸生物合成途径中中间体的积累，研究了来自谷氨酸棒杆菌的基因aroK (编码莽草酸激酶；Cgl1622; SEQ ID No. 94)和来自大肠杆菌的基因aroL (编码莽草酸激酶；CP000948; SEQ ID No. 93)。aroK和aroL基因单独通过PCR分别使用引物Ex-aroK-1和Ex-aroK-2 (表3, SEQ ID No. 101-102)和Ex-aroL-1和Ex-aroL-2 (表3, SEQ ID No. 99-100)进行扩增。引物包含如上所述的限制性位点和核糖体结合位点。将所得DNA片段单独经SbfI和BamHI限制性和再连接整合入载体pEKEx2，如上所述，以产生质粒pEKEx2-aroK和pEKEx2-aroL，并通过测序验证正确克隆。用所得质粒（表3）转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 (表2)并且将所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroL和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroK(表2）针对其如上所述在向培养基补充有25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。在菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroL中，通过HPLC-DAD分析培养上清液无法检测到莽草酸和3-脱羟基莽草酸的显著积累。
谷氨酸棒杆菌菌株中glnA基因的工程化
为了分析L-谷氨酰胺合成酶(GlnA; Cgl2214, SEQ ID No. 95)活性对由谷氨酸棒杆菌生产oAB的影响，在菌株谷氨酸棒杆菌菌株中表达L-谷氨酰胺合成酶基因 glnA。使用引物Ex-glnA-1和Ex-glnA-2 (表 3, SEQ ID No. 97-98)通过PCR扩增glnA基因，所述引物包含如上所述的限制性位点和核糖体位点。将所得的DNA片段如上所述经NcoI限制性和再连接克隆入载体pCRB210，并且通过测序验证正确的克隆。用所得质粒（表3）转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5并且所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pCRB-glnA(表2)对其如上所述在向培养基补充有25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。作为对照，用空载体对照pCRB210（表1）转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD 并且所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pCRB210(表2)对其如上所述在向培养基补充有25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（参见表4）。尽管菌株生长降低，但无法观察到对谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5的邻氨基苯甲酸积累的有益效果。不能排除GlnA增加的活性将在更高级的oAB生产者菌株中增加邻氨基苯甲酸的积累，因为其已在大肠杆菌(Sun等人, Appl Environ Microbiol, 2013,4024-4030)中观察到。
谷氨酸棒杆菌的中心代谢的工程改造
谷氨酸棒杆菌菌株中pyk基因的工程改造
丙酮酸激酶（Pyk）通过产生丙酮酸和ATP消耗磷酸烯醇丙酮酸。研究了框内缺失pyk基因(SEQ ID NO: 23)在谷氨酸棒杆菌菌株中的影响。如上所述使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB通过框内缺失pyk基因（编码丙酮酸激酶；Cgl2089）产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆pyk (表2)。所得质粒pSB082（表1）应用于从谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5的基因组中框内缺失pyk基因并且向基因组内框内引入24 bp外源错义序列（pyk基因座中的所得序列：SEQ ID No. 24）。正确突变体如上所述进行分离并且正确基因缺失通过PCR验证。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆pyk，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中gpi基因的工程改造
为了将碳流导向磷酸戊糖途径，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中框内缺失葡萄糖-6-磷酸异构酶（Gpi）编码基因(SEQ ID NO: 27)的影响。如上所述使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB通过框内缺失gpi基因（编码葡萄糖-6-磷酸异构酶；Cgl0851）产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆gpi(表2)。所得质粒pSB064（表1）应用于从谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5的基因组中框内缺失gpi基因并且向基因组内框内引入24 bp外源错义序列（gpi基因座中的所得序列：SEQ ID No. 28）。正确突变体如上所述进行分离并且正确基因缺失通过PCR验证。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆gpi，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中pepco基因的工程改造
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Pepco）通过将PEP转化为草酰乙酸而将其消耗。为了获得增加的PEP池，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中框内缺失磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因(SEQ IDNO: 21)。如上所述使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB通过框内缺失pepco基因（编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；Cgl1585）产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆pepco(表2)。所得质粒pSB061（表1）应用于从谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5的基因组中框内缺失pepco基因并且向基因组内框内引入24 bp外源错义序列（pepco基因座中的所得序列：SEQ ID No. 22）。如上所述分离正确突变体（向BHI培养基琼脂板上额外补充1%乙酸）并且通过PCR验证正确基因缺失。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆pepco，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中ptsG和hpr基因的工程改造
谷氨酸棒杆菌的葡萄糖和果糖摄取主要通过磷酸转移酶系统（PTS）利用。该多酶复合体经由磷酸烯醇丙酮酸介导的磷酸化级联进行葡萄糖的易位，并伴随跨过细胞膜的葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸(Siebold 等人 2001)。所述系统由两个可溶组分酶I和组氨酸富含蛋白（Hpr）以及膜结合/相关酶复合体组成(Tanaka 等人2008)。如上所述，使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pK19mobsacB，通过框内缺失hpr 基因(编码组氨酸富含蛋白;Cgl1937, SEQ ID NO: 17)和ptsG基因(编码磷酸转移酶系统单元G; Cgl1360, SEQ IDNO: 19)产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆hpr和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆ptsG（表2）。所得质粒pSB060和pSB079（表1）分别应用于从谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5的基因组中框内缺失hpr基因和ptsG基因并且向基因组内框内引入24 bp外源错义序列（hpr/ ptsG基因座中的所得序列：SEQ ID No.18; ptsG基因座:20)。如上所述分离正确突变体（向BHI培养基琼脂板上额外补充5 g/L核糖）并且通过PCR验证正确基因缺失。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆hpr 和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆ptsG，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。两种菌株在标准发酵条件下均未显示显著生长，如上所述，且结果是没有积累oAB。
谷氨酸棒杆菌菌株中ppk基因的工程改造
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Ppk）作为乙醛酸途径的部分可以将草酰乙酸再循环为PEP。为了获得增加的PEP池，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中基于质粒表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因(Cgl2862; SEQ ID NO: 36)。ppk基因通过Eurofins MWG Operon GmbH合成并且经SbfI和BamHI 限制性切割和再连接而克隆入载体pEKEx2，如上所述，产生质粒pSB072（表1），且通过测序验证正确克隆。通过用质粒pSB072转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB072（表2），如上所述。正确突变体如上所述进行分离并且通过菌落PCR验证含靶基因的成功转化。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB072，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中pps基因的工程改造
磷酸烯醇丙酮酸合成酶（Pps）作为糖异生的部分通过丙酮酸再循环和消耗ATP为AMP来催化PEP形成。为了获得增加的PEP池，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中基于质粒表达磷酸烯醇丙酮酸合成酶编码基因连同PEP合成酶结合结构域编码基因(Cgl0551和Cgl0552; SEQ IDNO: 33-35)。pps基因一起通过Eurofins MWG Operon GmbH合成并且经SbfI和BamHI 限制性和再连接克隆入载体pEKEx2，如上所述，产生质粒pSB073，且通过测序验证正确克隆。通过用质粒pSB073转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB073（表2），如上所述。正确突变体如上所述进行分离并且通过菌落PCR验证含靶基因的成功转化。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB073，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中zwf1连同opcA基因的工程改造
在运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）和大肠杆菌中，催化戊糖磷酸途径(PPP)的第一个反应（核酮糖-5-磷酸从葡萄糖-6-磷酸通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的形成(Zwf1和OpcA)）的酶的增强产生被报道导致碳流入PPP增加，且因而导致赤藓糖-4-磷酸(E4P)池增加。为了获得增加的E4P池，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中基于质粒表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因(zwf1 (Cgl1576)和opcA (Cgl1577; SEQ ID NO: 37-39)。基因通过EurofinsMWG Operon GmbH合成并且经SbfI和BamHI 限制性切割和再连接而克隆入载体pEKEx2，如上所述，产生质粒pSB078（表1），且通过测序验证正确克隆。通过用质粒pSB078转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB078（表2），如上所述。正确突变体如上所述进行分离并且通过菌落PCR验证含靶基因的成功转化。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB078，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中tal和tkt基因的工程改造
经PPP的增加的碳流和增加的E4P池已通过大肠杆菌中转酮醇酶和转醛醇酶的表达增加来描述。将大肠杆菌的转酮醇酶（Tkt）和转醛醇酶（Tal）编码基因(tktEC (ECDH10B_3110)和talEC (ECDH10B_2629); SEQ ID NO: 41和43)以及谷氨酸棒杆菌的等同基因(tktCG (Cgl1574)和talCG (Cgl1575); SEQ ID NO: 40和42)在谷氨酸棒杆菌中进行基于质粒的表达。四个基因通过Eurofins MWG Operon GmbH合成并且经SbfI和BamHI 限制性切割和再连接而单独整合入载体pEKEx2，如上所述，产生质粒pSB074-pSB077（表1），且通过测序验证正确克隆。通过用每种质粒转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB074 - pSB077（表2），如上所述。正确突变体如上所述进行分离并且通过菌落PCR验证含靶基因的成功转化。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB074 - pSB077，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
为了允许研究转酮醇酶和转醛醇酶在谷氨酸棒杆菌菌株中组合表达的影响，将编码这些蛋白的DNA序列融合入pEKEx2载体上。将talCG序列融合入pSB075以获得pSB085（表1）并且将基因talEC融合入质粒pSB077以获得pSB086（表1），均经过BglII和BamHI限制性切割和再连接，如上所述，并且通过测序验证正确克隆。用每种所得质粒转化菌株谷氨酸棒杆菌 ∆trpD::trpD5并且将所得菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB085和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB086(表2）针对其如上所述在向培养基补充有25 mg/L卡那霉素和0.1mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（表4）。
谷氨酸棒杆菌菌株中galP、iolT2和ppgk基因的工程改造
为了恢复Pts缺陷谷氨酸棒杆菌菌株中有效的葡萄糖摄入，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中半乳糖通透酶编码基因(galP, Cgl2409; SEQ ID NO: 30)与聚磷酸葡萄糖激酶(葡萄糖磷酸化酶)编码基因(ppgk (Cg1910; SEQ ID NO: 32)的组合的基于质粒的表达。此外，研究了谷氨酸棒杆菌菌株中（肌醇通透酶的）肌醇通透酶T2单元编码基因(iolT2, Cgl3058;SEQ ID NO: 31)与聚磷酸葡萄糖激酶编码基因(ppgk (Cg1910; SEQ ID NO: 32)的组合。四个基因通过Eurofins MWG Operon GmbH合成并且各自经SbfI和BamHI 限制性切割和再连接而整合入载体pEKEx2，如上所述，产生质粒pSB068、pSB070和pSB071（表1），且通过测序验证正确克隆。将ppgk序列分别融合至pEKEx2载体上的galP序列和iolT2。将galP序列融合入pSB071以获得pSB083（表1）并且将基因iolT2融合入质粒pSB071以获得pSB084（表1），均经过BglII和BamHI限制性切割和再连接，如上所述，并且通过测序验证正确克隆。将谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆ptsG 和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆hpr (表2)各自分别用质粒pSB083和pSB084转化，并且将所得菌株∆trpD::trpD5∆ptsG/pSB083 、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆ptsG/pSB084、谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆hpr/pSB083和谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆hpr/pSB084 (表2)针对其如上所述在向培养基补充25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG的情况下作为oAB生产者的特性进行表征（表4）。菌株∆trpD::trpD5∆hpr/pSB083在标准发酵条件下没有显示显著生长，如上所述，且结果是没有积累oAB。
谷氨酸棒杆菌菌株的oAB输出的工程改造
随着oAB生产速率增加，从生产细胞输出产物可能容易地成为生产限速步骤。此外，oAB的胞内积累非常容易地可能对细胞具有显著的毒性作用。目前尚未描述任何oAB输出蛋白。近期，属于主要促进者系统(mayor facilator systme)家族的莽草酸通透酶（QsuA）由Kubota等人描述，所述酶促进谷氨酸棒杆菌中莽草酸和奎尼酸的输出(Kubota 等人,Molecular Microbiol, 2014, 92(2), 356)。为了测试莽草酸通透酶对谷氨酸棒杆菌菌株中oAB的胞内和胞外浓度的影响，由Eurofins MWG Operon GmbH合成了相关基因(qsuA,Cgl0492; SEQ ID NO: 96)并且经SbfI和BamHI限制性切割和再连接而整合入载体pEKEx2，如上所述，产生质粒pSB096（表1），并且通过测血验证正确克隆。通过用质粒pSB096转化菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB096（表2），如上所述。正确突变体如上所述进行分离并且通过菌落PCR验证含靶基因的成功转化。这产生菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB096，其如上所述针对其作为oAB生产者菌株的特性进行表征（表4）。
实施例4-用恶臭假单胞菌产生邻氨基苯甲酸和/或盐
开发了来源自恶臭假单胞菌KT2440的菌株，其产生oAB。为了实现由恶臭假单胞菌菌株的oAB积累，选择编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶和吲哚-3-甘油磷酸合成酶的trpDC基因(PP_0421和PP_0422; SEQ ID NO: 63)在恶臭假单胞菌KT2440中进行破坏。通过Martinez-Garcia 等人 (Martinez-Garcia 等人, Environ Microbiol, 2011, 13(10),2702)中描述的方法使用载体pEMG进行基于敲除质粒pEMG-Del-trpDC (表1)的缺失突变体恶臭假单胞菌 ∆trpDC的构建。该方法导致去除基因序列（目标基因，GOI）而没有残余克隆印记(scars)或标志物。该方法的概念显示在图27中。在步骤A-B中，将携带破坏侧翼TS1和TS2、卡那霉素标志物和I-SceI位点的设计的敲除载体整合入恶臭假单胞菌的基因组中。在步骤C中，通过转化携带大核酸酶I-SceI基因的第二质粒(pSW-2)诱导双链断裂。通过TS1或TS2区域的同源重组体内修复断裂，产生恶臭假单胞菌野生型或恶臭假单胞菌ΔtrpDC（步骤D）。步骤E显示分辨和分离不同菌株所需的PCR筛选。选择缺失侧翼使得去除基因的开放阅读框同时保持邻近基因完整（图28）。该策略可以导致在长期持续培养中更高的菌株稳定性。使用Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)扩增800 bp的破坏侧翼TS1和TS2。根据制造商手册进行Phusion PCR (25个循环, 61,8℃ (TS1), 70,2℃ (TS2) 1:30分钟)。用BamHI 和XhoI消化PCR片段TS1并且用XhoI和SbfI消化PCR片段TS2。用BamHI和SbfI消化质粒pEMG和融合的TS1-TS2 PCR产物。所有限制性混合物使用HighPure PCR Product Purification Kit (Roche)进行纯化。使用单独侧翼TS1和TS2连接pEMG-Del-trpDC使用T4 DNA连接酶(Thermo Fisher Scientific)根据制造商说明书进行。将连接混合物转化入化学感受态大肠杆菌DH5α λpir 菌株。来自由两个单独侧翼和经消化的载体pEMG组成的三个点连接混合物的阳性质粒通过限制性分析鉴定并通过测序验证，其证实pEMG-Del-trpDC的成功构建（表1）。将敲除载体pEMG-Del-trpDC通过三亲本杂交使用受体菌株恶臭假单胞菌、供体菌株大肠杆菌DH5α λpir/pEMG-Del-trpDC和辅助菌株大肠杆菌HB101 pRK2013整合入恶臭假单胞菌的基因组(图27, 步骤A-B) (Martinez-Garcia 等 人, Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702)。通过使用具有50 mg/L卡那霉素的西曲溴铵琼脂板从细胞混合物分离恶臭假单胞菌/ pEMG-Del-trpDC 并且将单菌落再次在LB-卡那霉素平板上划线。经菌落PCR验证单菌落中敲除载体的基因组整合。为了在基因组中引入双链断裂（图27，步骤C），将携带I-SceI大核酸酶基因的第二质粒（pSW-2）转化入新构建的菌株中。因此，根据Choi 等人 (Choi 等人, J Microbiol Methods, 2005, 64(3),391)获得电感受态恶臭假单胞菌/ pEMG-Del-trpDC细胞。使用Biorad Gene Pulser XcellElectroporator (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)进行电穿孔并且将细胞悬浮液铺板到LB-庆大霉素（30 mg/L）和LB-卡那霉素-庆大霉素平板（分别30 mg/L和50 mg/L）上。按照Martinez-Garcia等人中描述的敲除程序的方案，诱导I-SceI大核酸酶是必需的。然而，由于实际情况显示出I-SceI大核酸酶的泄露表达，因此取消了该步骤。为了区分期望的恶臭假单胞菌ΔtrpDC敲除菌株与恶臭假单胞菌和恶臭假单胞菌/pEMG-Del-trpDC菌株，将单一菌落在LB和LB-卡那霉素平板上划线。经如上所述的菌落PCR检查卡那霉素敏感的菌落。此外，在含有20 mM葡萄糖和含有或不含有0.1 mM l-色氨酸的基本培养基上检查卡那霉素敏感菌落的 l-苯丙氨酸营养缺陷型。通过PCR分析和测序验证基因缺失。所得菌株恶臭假单胞菌ΔtrpDC (表2)无法在不含l-色氨酸补充的基本培养基上生长。
此外，破坏恶臭假单胞菌 ∆trpDC菌株中编码分支酸变位酶的pheA基因(PP_1769, SEQ ID NO: 64)。pheA基因编码l-苯丙氨酸和l-酪氨酸生物合成的第一步，其可能与邻氨基苯甲酸的生产发生竞争。通过Martinez-Garcia 等人 (Martinez-Garcia 等人, Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702)中描述的方法使用载体pEMG如上所述进行给予敲除质粒pEMG-Del-pheA的缺失突变体恶臭假单胞菌∆trpDCΔpheA的构建。选择缺失侧翼使得去除基因的开放阅读框同时保持邻近基因完整（图29）。该策略可以导致在长期持续培养中更高的菌株稳定性。在pheA的情况下，这意指由于与serC基因的重叠而保留基因的八个5'核苷酸。为了构建800 bp的破坏侧翼TS1和TS2，使用以下引物JK038f、JK039r、JK040f和JK041r (表3, SEQ ID NO: 103-106)。用BamHI 和XhoI消化PCR片段TS1并且用XhoI和SbfI消化PCR片段TS2。用BamHI和SbfI消化质粒pEMG和融合的TS1-TS2 PCR产物。所有限制性混合物使用High Pure PCR Product Purification Kit (Roche)进行纯化。使用单独侧翼TS1和TS2连接pEMG-Del-pheA使用T4 DNA连接酶(Thermo Fisher Scientific)根据制造商说明书进行。将连接混合物转化入化学感受态大肠杆菌DH5α λpir 菌株。来自由两个单独侧翼和经消化的载体pEMG组成的三个点连接混合物的阳性质粒通过限制性分析鉴定并通过测序验证，其证实pEMG-Del-pheA的成功构建（表1）。将敲除载体pEMG-Del-pheA通过三亲本杂交使用受体菌株恶臭假单胞菌ΔtrpDC、供体菌株大肠杆菌DH5α λpir/pEMG-Del-pheA和辅助菌株大肠杆菌HB101 pRK2013整合入恶臭假单胞菌ΔtrpDC的基因组(图27, 步骤A-B) (Martinez-Garcia 等人, Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702)。通过使用具有50 mg/L卡那霉素的西曲溴铵琼脂板从细胞混合物分离恶臭假单胞菌ΔtrpDC/ pEMG-Del-pheA并且将单菌落再次在LB-卡那霉素平板上划线。经菌落PCR验证单菌落中敲除载体的基因组整合。为了在基因组中引入双链断裂（图27，步骤C），将携带I-SceI大核酸酶基因的第二质粒（pSW-2）转化入新构建的菌株中。因此，根据Choi 等人 (Choi 等人, JMicrobiol Methods, 2005, 64(3), 391)获得电感受态恶臭假单胞菌ΔtrpDC / pEMG-Del-pheA细胞。使用Biorad Gene Pulser Xcell Electroporator (2.5 kV, 200 ohm, 25μF)进行电穿孔并且将细胞悬浮液铺板到LB-庆大霉素（30 mg/L）和LB-卡那霉素-庆大霉素平板（分别30 mg/L和50 mg/L）上。按照Martinez-Garcia等人中描述的敲除程序的方案，诱导I-SceI大核酸酶是必需的。然而，由于实际情况显示出I-SceI大核酸酶的泄露表达，因此取消了该步骤。为了分辨期望的恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA (表2)敲除菌株与恶臭假单胞菌ΔtrpDC和恶臭假单胞菌ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA 菌株，将单菌落在LB和LB-卡那霉素平板上划线。经如上所述的菌落PCR检查卡那霉素敏感的菌落。此外，在含有20 mM葡萄糖、0.1 mM l-色氨酸和含有或不含有1 mM l-苯丙氨酸的基本培养基上检查卡那霉素敏感菌落的 l-苯丙氨酸营养缺陷型。通过PCR分析和测序验证基因缺失。由于恶臭假单胞菌KT2440具有l-苯丙氨酸-4-羟化酶(PheA)（其转化l-苯丙氨酸为 l-酪氨酸），因此通过添加l苯丙氨酸来拯救l-色氨酸-营养缺陷型。由于l-色氨酸和l-苯丙氨酸营养缺陷型均通过单基因破坏获得，因此假定在恶臭假单胞菌KT2440中不存在编码替代酶的冗余基因。
芳香族氨基酸生物合成途径的第一专属反应由DAHP合成酶同工酶催化。在若干生物体中已显示该酶的反馈不敏感突变体的过表达导致经芳香族生物合成途径的流增加(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615)。因此，为了提高邻氨基苯甲酸产量，将由aroGD146N基因(SEQ ID NO: 55)编码的反馈不敏感的3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸(DAHP)合成酶经载体pSEVA234在菌株恶臭假单胞菌KT2440、恶臭假单胞菌ΔtrpDC 和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA 中表达（在lacI q -Ptrc系统的控制下；编码卡那霉素抗性和pBBR1复制起点）(Silva-Rocha 等人, Nucleic Acids Research, 2013, D666-75)。使用EcoRI和BamHI 限制酶和标准条件如上所述（实施例3）从供体质粒(pCAS-2JF- aroGD146N)将aroGD146N基因限制化，产生1117 bp片段。用相同的酶将载体pSEVA234限制性切割。使用HighPure PCR Product Purification Kit (Roche)纯化片段。根据制造商说明书用T4 DNA 连接酶(Thermo Fisher Scientific)进行片段连接以获得pSEVA234-aroG D146N （表1）。将连接混合物引入电感受态大肠杆菌DH5α细胞 (ElectroMAX™ DH5α-E™ Competent Cells;Life Technologies, Darmstadt)。使用Gene Pulser Xcell System (BioRad, Hercules,CA)在0.2 cm缝隙的电击杯(BioRad, Hercules, CA)中电转化(条件: ~20 ms 指数式衰变脉冲, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω)后，将800 µL LB回收培养基(Luria-Bertani; Roth,Karlsruhe)立即加入并且将悬浮液转移至1.5 mL微量离心管中。在37 ℃下1h后，将细胞悬浮液铺至添加有50 mg/L卡那霉素的LB琼脂板(Abcr GmbH & Co. Kg, Karlsruhe)上，并在37 ℃下温育过夜。收集克隆并经限制性分析和测序验证正确的转化。对于质粒制备，菌株在15 mL管中在3 mL LB培养基和50 mg/L卡那霉素中在37 ℃下以200 rpm恒定摇动培养14h-16h (Kuhner Shaker ISF-4-W; Adolf Kühner AG, Basel (Switzerland))。使用NucleoSpin® Plasmid Pure 试剂盒(Macherey & Nagel, Düren)按照制造商说明书进行质粒DNA纯化。根据Choi 等人 (Choi 等人, J Microbiol Methods, 2005, 64(3):391)获得电感受态恶臭假单胞菌KT2440、恶臭假单胞菌ΔtrpDC和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA细胞。使用Biorad Gene Pulser Xcell Electroporator (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)进行电穿孔并且将细胞悬浮液铺板到补充有50 mg/L卡那霉素的LB琼脂板上。这导致产生菌株恶臭假单胞菌KT2440/ pSEVA234-aroG D46N 、恶臭假单胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-aroG D46N 和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-aroG D46N (表2)。另外，将空载体pSEVA234转化入菌株恶臭假单胞菌ΔtrpDC和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA 以获得菌株恶臭假单胞菌ΔtrpDC/pSEVA234和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234 (表2)。
oAB是L-色氨酸生物合成途径的中间体并且通过邻氨基苯甲酸合成酶来源于分支酸，所述邻氨基苯甲酸合成酶由酰胺转移酶（TrpE；供体：L-谷氨酰胺）和邻氨基苯甲酸合成酶单元（TrpEG）组成，其在形成oAB和L-谷氨酸时释放丙酮酸分子。编码TrpEG的基因的表达增加已显示导致大肠杆菌菌株中积累L-色氨酸(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol,2006, 69:615)。尽管如此，据报道，该酶受L-色氨酸的强烈反馈抑制，导致应用TrpEG蛋白的反馈抗性形式。TrpEG蛋白的反馈抗性形式已基于来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 的trpEG序列进行报道(Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006,69:615)。基于鼠伤寒沙门氏菌基因，将最有利的trpEG形式trpEGS40F (SEQ ID No. 53)在恶臭假单胞菌菌株中进行表达。将trpEG基因的反馈抑制抗性形式克隆入恶臭假单胞菌载体pSEVA234以实现在菌株恶臭假单胞菌KT2440、恶臭假单胞菌ΔtrpDC和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA 中基于质粒的表达(在lacI q -Ptrc 系统的控制下；编码卡那霉素抗性和pBBR1复制起点) (Silva-Rocha 等人, Nucleic Acids Research, 2013, D666-75)。使用BglII和BamHI限制酶和标准条件如上所述（实施例3）从供体质粒将trpEGS40F基因限制性切割，产生2200 bp片段。将载体pSEVA234用BamHI限制性切割，产生4550 bp片段。使用HighPure PCR Product Purification Kit (Roche)纯化片段。根据制造商说明书用T4 DNA 连接酶(Thermo Fisher Scientific)进行片段连接以获得pSEVA234-trpEG S40F（表1）。将连接混合物引入电感受态大肠杆菌DH5α细胞 (ElectroMAX™ DH5α-E™ Competent Cells;Life Technologies, Darmstadt)。使用Gene Pulser Xcell System (BioRad, Hercules,CA)在0.2 cm缝隙的电击杯(BioRad, Hercules, CA)中电转化(条件: ~20 ms 指数式衰变脉冲, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω)后，将800 µL LB回收培养基(Luria-Bertani; Roth,Karlsruhe)立即加入并且将悬浮液转移至1.5 mL微量离心管中。在37 ℃下1h后，将细胞悬浮液铺至添加有50 mg/L卡那霉素的LB琼脂板(Abcr GmbH & Co. Kg, Karlsruhe)上，并在37 ℃下温育过夜。收集克隆并经限制性分析和测序验证正确的转化。对于质粒制备，菌株在15 mL管中在3 mL LB培养基和50 mg/L卡那霉素中在37 ℃下以200 rpm恒定摇动培养14h-16h (Kuhner Shaker ISF-4-W; Adolf Kühner AG, Basel (Switzerland))。使用NucleoSpin® Plasmid Pure 试剂盒(Macherey & Nagel, Düren)按照制造商说明书进行质粒DNA纯化。根据Choi 等人 (Choi 等人, J Microbiol Methods, 2005, 64(3):391)获得电感受态恶臭假单胞菌KT2440、恶臭假单胞菌ΔtrpDC和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA细胞。使用Biorad Gene Pulser Xcell Electroporator (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)进行电穿孔并且将细胞悬浮液铺板到补充有50 mg/L卡那霉素的LB琼脂板上。这导致产生菌株恶臭假单胞菌KT2440/ pSEVA234-trpEG S40F、恶臭假单胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-trpEG S40F和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-trpEG S40F (表2)。
将所产生的恶臭假单胞菌菌株(恶臭假单胞菌 KT2440、恶臭假单胞菌ΔtrpDC/ pSEVA234、恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234、恶臭假单胞菌/pSEVA234-aroG D146N、恶臭假单胞菌/pSEVA234-trpEG S40F、恶臭假单胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-aroG D146N、恶臭假单胞菌ΔtrpDC/pSEVA234-trpEG S40F、恶臭假单胞菌 ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-aroG D146N、和恶臭假单胞菌ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-trpEG S40F (表2)针对其在摇瓶培养中作为oAB生产者的特性进行表征。根据Wierckx 等人 (Wierckx 等人, AEM, 2005, 71:8221)菌株在30℃下且以250 rpm摇动生长在基本培养基。基本培养基的组成为：2 g/L (NH4)2SO4, 1.63g/L NaH2PO4, 3.88 g/L K2HPO4, 0.1 g/L MgSO4∙7H2O, 1.0 mg/L CaCl2, 10 mg/L EDTA,5.0 mg/L FeSO4·7H2O, 1.0 mg/L MnCl·H2O, 2.0 mg/L ZnSO4∙7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.4 mg/L CoCl2∙6H2O, 0.2 mg/L Na2MoO4∙2H2O和5 g/L葡萄糖。用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7。将菌株在基本培养基中预培养并且以约0.1的OD600接种至500 mL摇瓶中50 mL的主培养物中。将携带质粒菌株的培养物补充50 mg/L卡那霉素。破坏trpDC基因的菌株的培养物另外补充有0.1 mM l-色氨酸和破坏pheA基因的菌株的培养物另外补充有1 mMl-苯丙氨酸。在中指数期开始时通过加入1 mM IPTG诱导lacI q 系统以实现oAB产生。菌株作为oAB生产者的特征如实施例3中所述进行测量。在培养过程中，从1.5 mL培养样品中离线测量发酵OD600、葡萄糖浓度和邻氨基苯甲酸浓度。使用光度计进行OD600测量后，将每一样品的1 mL等分试样在反应管中以16000 x g (5415R; Eppendorf, Hamburg)离心5min。经HPLC-DAD (1100; Agilent Technologies, Santa Clara (USA))和YSI (YSI-Select2700; Kreienbaum Neoscience GmBH, Langenfeld)分析上清液。实施例3和实施例4的收集的数据显示于表4。
表1 本发明中使用和/或生成的载体和质粒
表2 本发明中使用和/或生成的细菌菌株
名称 描述和相关基因型 来源/参考
大肠杆菌 菌株DH5α; supE44, DlacU169 (f80 lacZDM15), hsdR17 (rk-mk+), recA1, endA1, thi1, gyrA, relA Hanahan and Meselson, 1983
大肠杆菌::trpD9923 菌株W3110具有trpD9923突变 E. coli Genetic Resource Center (YaleUniversity)
大肠杆菌::trpD9923∆hpr 框内缺失trpD9923 菌株中的hpr Balderas-Hernandez 等人, 2009
谷氨酸棒杆菌 菌株ATCC 13032 DSMZ
谷氨酸棒杆菌/pEKEx2 菌株ATCC 13032具有空表达载体pEKEx2 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD 框内缺失trpD (Cgl3032) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm 框内缺失csm (Cgl0853) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD∆csm 框内缺失trpD 和csm 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD1 整合trpD1至谷氨酸棒杆菌∆trpD 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD2 整合trpD2至谷氨酸棒杆菌∆trpD 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD3 整合trpD3至谷氨酸棒杆菌∆trpD 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5 整合trpD5至谷氨酸棒杆菌∆trpD 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD6 整合trpD6至谷氨酸棒杆菌∆trpD 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2 ∆trpD::trpD5 菌株具有空表达载体pEKEx2 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm ∆trpD::trpD5∆csm 菌株具有空表达载体pEKEx2 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆ptsG ∆trpD::trpD5菌株中框内缺失ptsG (Cgl1360) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆hpr ∆trpD::trpD5菌株中框内缺失hpr (Cgl1937) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆pepco ∆trpD::trpD5菌株中框内缺失pepco (Cgl1585) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆gpi ∆trpD::trpD5菌株中框内缺失gpi (Cgl0851) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆pyk ∆trpD::trpD5菌株中框内缺失pyk (Cgl2089) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD /pEKEx2-trpD1 ∆trpD菌株中表达trpD1 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD /pEKEx2-trpD2 ∆trpD菌株中表达trpD2 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD /pEKEx2-trpD3 菌∆trpD 株中表达trpD3 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD /pEKEx2-trpD4 ∆trpD菌株中表达trpD4 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD /pEKEx2-trpD5 ∆trpD菌株中表达trpD5 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD /pEKEx2-trpD6 ∆trpD菌株中表达trpD6 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2-csm1 ∆csm菌株中表达csm1 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2- csm2 ∆csm菌株中表达csm2 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2- csm3 ∆csm菌株中表达csm3 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2- csm4 ∆csm 菌株中表达csm4 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2-csm5 ∆csm菌株中表达csm5 本研究
谷氨酸棒杆菌∆csm/pEKEx2-csm6 ∆csm菌株中表达csm6 本研究
谷氨酸棒杆菌/pEKEx2- trpEG ATCC 13032菌株中表达trpEG (Cgl3029/31) 本研究
谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG S38F ATCC 13032 菌株中表达trpEG S38F 本研究
谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG S38R ATCC 13032 菌株中表达trpEG S38R 本研究
谷氨酸棒杆菌 /pEKEx2-trpEG S40F ATCC 13032 菌株中表达trpEG S40F 本研究
谷氨酸棒杆菌/pEKEx2-trpEG S40R ATCC 13032 菌株中表达trpEG S40R 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-trpEG S40F ∆trpD::trpD5 菌株中表达trpEG S40F 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N ∆trpD::trpD5菌株中表达aroG D146N (CP000948) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F ∆trpD::trpD5菌株中表达aroG D146N 和trpEG S40F 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-trpEG S40F-aroG D146N ∆trpD::trpD5菌株中表达trpEG S40F和aroG D146N 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆csm pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F ∆trpD::trpD5∆csm菌株中表达aroG D146N 和trpEG S40F 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroK ∆trpD::trpD5菌株中表达aroK (Cgl1622) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pEKEx2-aroL ∆trpD::trpD5菌株中表达aroL (CP000948) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pCRB210 菌株∆trpD::trpD5具有空表达载体pCRB210 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pCRB-glnA ∆trpD::trpD5菌株中表达glnA (Cgl2214) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆ptsG/pSB084 ∆trpD::trpD5∆ptsG 菌株中表达ppgk (Cgl1910)和iolT2 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆ptsG/pSB083 ∆trpD::trpD5∆ptsG菌株中表达ppgk 和galP (Cgl2409) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆hpr/pSB084 ∆trpD::trpD5∆hpr菌株中表达ppgk和iolT2 (Cgl3058) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD ::trpD5∆hpr/pSB083 ∆trpD::trpD5∆hpr菌株中表达ppgk和galP 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB072 ∆trpD::trpD5菌株中表达ppk (Cgl2862) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB073 ∆trpD::trpD5菌株中表达pps (Cgl0552/1) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB074 ∆trpD::trpD5菌株中表达talCG (Cgl1575) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB075 ∆trpD::trpD5菌株中表达tktCG (Cgl1574) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB076 ∆trpD::trpD5菌株中表达talEC (ECDH10B_2629) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB077 ∆trpD::trpD5菌株中表达tktEC (ECDH10B_3110) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB078 ∆trpD::trpD5菌株中表达zwf1 (Cgl1576)和opcA (Cgl1577) 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB085 ∆trpD::trpD5菌株中表达tktCG和talCG 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/ pSB086 ∆trpD::trpD5菌株中表达tktEC和talEC 本研究
谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5/pSB096 ∆trpD::trpD5菌株中表达qsuA (CgR0492) 本研究
恶臭假单胞菌 菌株KT2440 mt-2衍生物 恢复TOL质粒pWW0 Bagdasarian等人, 1981
恶臭假单胞菌 ∆trpDC/pSEVA234 框内缺失trpDC (PP_0422)具有空表达载体pSEVA234 本研究
恶臭假单胞菌 ∆trpDC∆pheA/pSEVA234 框内缺失pheA (PP_1769)具有空表达载体pSEVA234 本研究
恶臭假单胞菌/pSEVA234-aroG D46N KT2440菌株中表达aroG D46N 本研究
恶臭假单胞菌/pSEVA234-trpEG S40F KT2440菌株中表达trpEG S40F 本研究
恶臭假单胞菌 ∆trpDC/ pSEVA234-aroG D46N ∆trpDC菌株中表达aroG D46N 本研究
恶臭假单胞菌 ∆trpDC/ pSEVA234-trpEG S40F ∆trpDC 菌株中表达trpEG S40F 本研究
恶臭假单胞菌 ∆trpDC∆pheA/ pSEVA234-aroG D46N ∆trpDC∆pheA菌株中表达aroG D146N 本研究
恶臭假单胞菌 ∆trpDC∆pheA/pSEVA234-trpEG S40F ∆trpDC∆pheA菌株中表达trpEG S40F 本研究
表3 本发明中使用的引物
表4 针对本发明中使用和/或生成的细菌菌株的oAB生产的表征（CDW：细胞干重；Y：产率；µmax:最大生长速率；STY: 时空产率）。
实施例5-在具有细胞保留的连续发酵罐中培养谷氨酸棒杆菌
使用连续发酵用于生产邻氨基苯甲酸以实现优化的时空产率。在连续发酵过程中应用细胞保留系统以增加生物质浓度而不增加补料溶液的葡萄糖浓度。使用两种不同的系统用于实验室规模的细胞保留：来自JM Water Separations (WaterSep TechnologyCorporation, Marlborough, MA, USA)的具有750 kDa的截止值的空纤维过滤模块和来自Pneumatic Scale Angelus (Allen Road, Stow, OH, USA)的一次性离心机(CentritechLab III)。两种系统均连接至1 L实验室规模生物反应器(OmniFerm, HiTec Zang,Herzogenrath, Germany)。过滤模块的整合显示于图30且离心机的整合显示于图31。
菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD的连续发酵
使用填充有50 mL无菌BHIS培养基（其含有37 g/L心脑浸出物（BHI）和91 g/L山梨醇）的无菌250 mL Erlenmeyer瓶制备谷氨酸棒杆菌∆trpD（参见表2）的预培养物。在28℃下以140 rpm摇动频率温育24h导致6.0的OD600 。将9 mL的培养体积转移至91 mL新鲜CGXII-MOPS来源的培养基，所述培养基包含42 g/L MOPS缓冲剂、20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、3.7 g/L 脑心浸出物、9.1 g/L山梨醇、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O、0.01 g/L CaCl2和10 g/L葡萄糖（分开高压灭菌）。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.1 mM l-色氨酸、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/L CuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。在500 mLErlenmeyer瓶中在28℃下以140 rpm的摇动频率温育100 mL培养体积产生18.7的OD600。将27 mL的培养体积离心，丢弃上清液并将沉淀重悬于25 mL无菌等渗PBS缓冲液中。将悬浮液用1 L无菌CGXII来源培养基注射入发酵罐中，所述CGXII培养基包含20 g/L (NH4)2SO4, 1g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4∙7H2O, 0.01 g/L CaCl2, 100 µL/L 聚丙二醇和10 g/L葡萄糖(分开高压灭菌)。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.1 mM l-色氨酸、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/LCuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。在连续操作过程中对补料使用相同培养基。通过调节搅拌器速度为200-1200 rpm将溶解氧浓度控制在30%。对于充气调节0.2 l/h空气的恒定气流速率并且用1 M NH4OH将pH控制在pH7。发酵结果显示于图32中。在前24h内的批次时期过程中，消耗葡萄糖和产生生物质和oAB。24 h的培养时间后通过给料50 mL/h无菌培养基并清除50 mL/h包含生物质和oAB的发酵液将发酵罐切换至连续操作。在连续培养过程中实现oAB的恒定生产。100 h的培养时间后，使用图30中说明的切向流超滤开始细胞保留。通过如图32中显示的细胞保留实现干细胞重的增加。
菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆gpi的连续发酵
使用填充有50 mL无菌BHIS培养基（其含有37 g/L脑心浸出物（BHI）和91 g/L山梨醇）的无菌250 mL Erlenmeyer瓶制备谷氨酸棒杆菌∆trpD::trpD5∆gpi（表2）的预培养物。在28℃下以140 rpm摇动频率温育24h得到8.2的OD600 。将10 mL的培养体积转移至90 mLCGXII-MOPS来源的培养基，所述培养基包含42 g/L MOPS缓冲剂、20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、3.7 g/L 脑心浸出物、9.1 g/L山梨醇、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O、0.01 g/L CaCl2和10 g/L葡萄糖（单独高压灭菌）。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/LCuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O、和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。在两个250 mLErlenmeyer瓶中在30℃下以300 rpm的摇动频率温育100 mL培养体积产生20.5的OD600。将55 mL培养液体积用1 L无菌CGXII来源培养基注射入发酵罐中，所述CGXII培养基包含20g/L (NH4)2SO4、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O、0.01 g/L CaCl2、100 µL/L 聚丙二醇和10 g/L葡萄糖(单独高压灭菌)。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/L CuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O、和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。将包含20 g/L (NH4)2SO4、10 g/LKH2PO4、10 g/L K2HPO4、2.5 g/L MgSO4∙7H2O、0.1 g/L CaCl2、2 mL/L 聚丙二醇和100 g/L葡萄糖(单独高压灭菌)的高浓缩培养基用于补料。无菌过滤后加入以下组分：20 mg/L生物素、0.1 g/L MnSO4·H2O、0.1 g/L FeSO4·7H2O、10 mg/L ZnSO4∙7H2O、2 mg/L CuSO4·5H2O、0.2 mg/L NiCl2∙6H2O、和0.3 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。通过调节搅拌器速度为200-1400rpm将溶解氧浓度控制在30%。对于充气调节0.2 l/h空气的恒定气流速率并且用1 M NH4OH和1 M HCl将pH控制在pH7。发酵结果显示于图33中。在前40h内的批次时期过程中，消耗葡萄糖和产生生物质和oAB。40 h的培养时间后通过给料10 mL/h培养基并清除10 mL/h包含生物质和oAB的发酵液将发酵罐切换至连续操作。在连续操作开始时，生物质浓度没有高至足以完全消耗补料溶液中添加的葡萄糖，导致如图33中显示的反应器中葡萄糖的积累。136h后，细胞浓度高至足以完全消耗添加的葡萄糖。184 h后使用离心机开始细胞保留，如图31中所示。通过如图33中图示的细胞循环实现干细胞重的增加。在400 h连续发酵过程中实现oAB的恒定生产。
菌株谷氨酸棒杆菌∆trpD用复杂碳源的连续发酵
使用填充有50 mL无菌BHIS培养基（其含有37 g/L心脑浸出物（BHI）和91 g/L山梨醇）的无菌250 mL Erlenmeyer瓶制备谷氨酸棒杆菌∆trpD（表2）的预培养物。在28℃下以140rpm摇动频率温育24h得到7.53的OD600 。将7 mL的培养体积转移至93 mL新鲜CGXII-MOPS来源的培养基，所述培养基包含42 g/L MOPS缓冲剂、20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、3.7 g/L脑心浸出物、9.1 g/L山梨醇、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O、0.01 g/LCaCl2和10 g/L葡萄糖（单独高压灭菌）。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.1 mMl-色氨酸、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/LCuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。在500 mLErlenmeyer瓶中在28℃下以140 rpm的摇动频率温育100 mL培养体积产生21.3的OD600。将25 mL的培养体积离心，丢弃上清液并将沉淀重悬于25 mL无菌等渗PBS缓冲液中。将悬浮液用1 L无菌CGXII来源培养基注射入发酵罐中，所述CGXII培养基包含20 g/L (NH4)2SO4、1g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4∙7H2O、0.01 g/L CaCl2、100 µL/L 聚丙二醇2000和10 g/L葡萄糖(单独高压灭菌)。无菌过滤后加入以下组分：2 mg/L生物素、0.1 mM l-色氨酸、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.01 g/L FeSO4·7H2O、1 mg/L ZnSO4∙7H2O、0.2 mg/LCuSO4·5H2O、0.02 mg/L NiCl2∙6H2O和0.03 g/L 3.4-二羟基苯甲酸。相同培养基用于在连续操作的前772小时过程中补料（补料培养基1）。772小时后，将补料组合物改变为补料培养基2，其包含40 g/L (NH4)2SO4、0,5 g/L KH2PO4、5 mL/L玉米浆(Sigma Aldrich、C4648,批号: MKBP5720V)、1 mL/L聚丙二醇、267 g/L葡萄糖浆(Cargill C*Sweet D02767, 批号:03285882)（单独高压灭菌，以实现补料溶液中200 g/L的终葡萄糖浓度）和0.1 mM l-色氨酸（高压灭菌后无菌过滤和添加）。通过调节搅拌器速度为200-1200 rpm将溶解氧浓度控制在30%。对于充气调节0.2 l/h空气的恒定气流速率并且用1 M NH4OH将pH控制在pH7。用补料培养基2连续发酵的结果显示于图34中。用补料培养基1连续进行的772 h没有显示。连续细胞保留通过如图30中说明的切向流超滤实现并且在如图34中所示的培养过程中实现邻氨基苯甲酸的连续生产。由于葡萄糖的积累，连续操作如通过图34中的停止期所示临时中断。待葡萄糖水平降低后重启补料和收获。
实施例6-邻氨基苯甲酸（AA）的吸附/解吸附
为了获得邻氨基苯甲酸（AA），具有更高浓度的溶液，通过进行吸附-解吸附操作将AA从水溶液中转移至有机溶剂中。为此，测试了AA对不同类型的吸附剂的吸附能力。
选择Zeolite Y (Zeolyst International, 目录号CBV600) and ZSM5 (Süd-Chemie/Clariant 目录号H-MFI-27)作为沸石，其作为不同分子的分子筛起作用。由于羟磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2) (Sigma-Aldrich 目录号289396)吸附AA和不同溶剂中的一些其他类似化合物的能力而对其进行测试。
吸附测试：将吸附剂在300 ℃下煅烧3 h以释放任何残留水分。制备AA在水中（0.5wt%）的溶液。将20 mL的该溶液转移至包含0.2 g吸附剂的50 mL瓶中。搅拌下的某一段时期后，通过HPLC分析AA在水中的浓度。水中AA浓度的降低被视为经吸附的AA。
金属交换的沸石的合成：给定包含Ca的沸石的改进的吸附能力(根据 W. H.Goodman, US 4910336, 1990)，通过例子交换制备Ca交换的沸石以在AA吸附中测试(S. M.Seo, S. Y. Coi, J. M. Suh, K. J. Jung, N. H. Heo and W. T. Lim, Bull. KoreanChem. Soc. 2009, 30:1703)。将3 g作为粉末的沸石加入到Ca(NO3)2.4H2O (0.5 M)溶液中。将浆液搅拌4h并随后通过新鲜的溶液将溶液进行置换并将该程序再重复两次。最后，通过离心分离固体并在80 ℃下干燥并在300 ℃下焙烧3h。用如上所述的相同方法制备使用K、Na、Mg和Fe的四种其他金属交换的沸石Y。随后将样品标记为K-Y、Na-Y、Ca-Y、Mg-Y 和Fe-Y。沸石H-ZSM5的孔径可以在0.4-0.6 nm的范围内，优选0.5nm。沸石H-Y的孔径可以在0.6nm -0.9 nm范围内，优选0.7-0.9 nm (例如，如获自 Zeolyst International, 目录号CBV600)。
使用上文提及的吸附剂进行AA的吸附测试。这些测试的结果显示于表6中。
表6：AA 0.5%的吸附
吸附剂 HAP H-ZSM5 H-Y Na-Y K-Y Mg-Y Ca-Y Fe-Y
吸附能力（gAA/kg吸附剂） 10.8 g/kg 11.6 g/kg 24.8 g/kg 25.0 g/kg 27.4 g/kg 27.6 g/kg 36.8 g/kg 51.2 g/kg
沸石Y在从水溶液吸附AA上显示出最高能力。Ca交换的沸石Y可以改进AA的吸附至接近50%。Fe交换的沸石Y可以改进AA的吸附至接近翻倍。利用在蒸馏水中以及在包含(NH4)2SO4 (20 g/L)、Na2HPO4 (1 g/L)、KH2PO4 (1 g/L)和MgSO4 (0.25 g/L)的缓冲液中的AA溶液进行测试。稍后，从缓冲液中消除MgSO4，因为其引起不溶性邻氨基苯甲酸镁盐的形成。在上述金属交换的沸石中，Fe-Y显示出最高的AA吸附能力（高于50 g AA/ kg Fe-Y）。幸运地是，缓冲液内容物不影响AA的吸附并且吸附能力与在蒸馏水中的那些类似。吸附测试后Fe-Y样品的IR谱显示AA的一些特征峰，其可以是在最可能与Fe螯合的Fe-Y表面上存在AA的证据。
表7：在蒸馏水和缓冲水溶液中接触10和60分钟后金属交换的沸石Y的AA吸附能力a。
吸附剂 Na-Y K-Y Mg-Y Ca-Y Fe-Y
蒸馏水（10 min） 24.2 29.6 29.2 36.2 50.6
蒸馏水（60 min） 22.6 31.6 34 42.2 54.2
缓冲溶液（10 min） 25 27.4 27.6 36.8 51.2
缓冲溶液（60 min） 25.9 22.3 22.8 25.6 45.3
ag AA/ kg 吸附剂。
通过ICP-MS分析吸附测试后的Fe-Y和新鲜的Fe-Y样品。该分析显示在两种样品中Fe/Al比率分别为1.25和1.3，其彼此非常接近。因此，Fe浸出的量是可忽略的。在Ca-Y的情况下，吸附测试后检测到64% Ca浸出。
使用装备有质量分析仪的热重量分析仪(TGA-MS)在高至550 ℃的温度下研究在Fe-Y上解吸附的AA的分解。如图7中可见，在低于400 ℃的温度下没有形成ANL。在高于400℃下，AA直接分解为聚苯胺，其作为样品架上的黑色材料被观察到。在高于400 ℃下检测到小量的ANL。因此，吸附剂上吸附的AA直接热转化为ANL是不成功的。
AA从吸附剂解吸附至液相
AA从Fe-Y至水中的解吸附测试显示通过金属交换的沸石在水溶液中吸附AA是可逆的。随后，测试AA解吸附进入有机溶剂中。选择1-十二烷醇作为有机溶剂，这是由于AA在其中的高溶解度以及其在水中非常低的可混合性(0.004 g/L)。此外，其沸点(259 ℃)比苯胺(183℃)和水高得多，从而其从最终混合物中分离更为方便。通过将包含10.8 mg AA的0.2 gFe-Y悬浮在2 mL 1-十二烷醇中进行AA从Fe-Y解吸附至1-十二烷醇。将浆料在25-120 ℃温度范围下搅拌0.5 h。解吸附结果显示于图8中，其中最多27.8% AA可以在120 ℃下解吸附至1-十二烷醇相中。
实施例7-通过在有机溶剂中热脱羧的邻氨基苯甲酸脱羧为苯胺的反应动力学
溶解于1-十二烷醇的AA的脱羧
测试160 ℃下溶解于1-十二烷醇中的AA 3 wt%的脱羧。筛选具有不同特征的催化剂。结果可见于图9中。没有任何催化剂的空白测试显示仅1.4%转化，而在沸石Y(CBV600,“GO257”)存在的情况下导致在1h内超过70%转化为ANL。
经沸石Y (CBV600, “GO257”)的高AA转化可能是由于其高度的酸性特征以及孔径(0.7-0.8 nm)。尽管具有酸性特征，但ZSM5 (MFI-27)具有更小的孔径（0.5 nm）从而AA分子无法渗透入它们并且因此无法接近活性位点。铝碳酸镁(HTC, Mg6Al2(CO3)(OH)16. 4H2O)具有碱性特征并且AA的低转化表明碱性位点在AA脱羧中不像酸性位点一样有活性。向沸石H-Y (“GO257”)添加Na降低其酸性特征并且因此实现AA的低转化。氨形式(CBV500, “GO55”)也比H-Y (CBV600, “GO257”)具有更低数目的酸性位点。
如图10中可见，在160 ℃和180 ℃下1-十二烷醇中AA脱羧概况显示AA转化和ANL形成遵循零级动力学。在160 ℃和180 ℃下反应的模拟模型可以计算速率系数分别为0.235 mol L-1.h-1和0.522 mol.L-1.h-1。这些反应至ANL的选择性为100%且观察到95-110%(平均值为100.4%)的质量平衡。
溶解于苯胺的AA的脱羧
苯胺对于AA是比十二烷醇好得多的溶剂并且也是脱羧的产物，相比于1-十二烷醇，其使用具有大的优势。我们发现高至30% AA可以在室温(20℃)下溶解于苯胺中，高至40% AA可以在50℃下溶解于苯胺中，且高至50% AA可以在90℃下溶解。
测试160、180和200℃下溶解于苯胺中的AA 40 wt%的脱羧。没有任何催化剂的空白测试如之前显示出可忽略的转化，而在沸石Y(CBV600, “GO257”)存在的情况下导致在2h内超过99%转化为ANL。结果显示于图35中。我们还可以根据简单动力学模型拟合数据：
其中“r”为以g苯胺/g催化剂/小时计的反应速率，“k0”为也以g苯胺/g催化剂/小时计的动力学常数，“Ea”为以kJ/mol计的反应活化能，“R”为8.31 J / K mol的理想气体常数，“T”为以K计的温度，“AA”为AA的浓度，而“n”为反应级数。图35还显示在不同温度下拟合该反应模型。拟合结果可以概述如下：
k0=55492 g AN / g CAT h
Ea=37.4 kJ/mol
n= 0.16。
图35显示在含催化剂的苯胺中2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）的分解。显示了在160 ℃、180 ℃和200℃下在沸石Y存在的情况下40 wt%溶解于苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
将邻氨基苯甲酸（40 wt%）溶解于苯胺中。在该浓度，酸一旦加热至约50℃则完全可溶于有机溶剂。将80 mL上述溶液随后转移至160 mL的高压灭菌器中，加入1.5 g沸石催化剂并加热至160 ℃、180 ℃或200℃。以不同时间间隔取样并且通过HPLC方法分析以确定苯胺形成速率。
在水存在的情况下溶解于苯胺的AA的脱羧
由于从结晶过程中分离的邻氨基苯甲酸可能存在一些残留水分（约10%），我们决定在存在水的情况下看看反应动力学。进行与之前类似的实验，例外是目的性地向反应混合物中加入10 wt%水。我们发现总体动力学和反应概况保持不变。反应温度200℃的结果显示于图36中。
图36显示在含催化剂的苯胺中2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）的分解。显示了在200℃下在沸石Y存在的情况下40 wt%溶解于苯胺中和10%水-90%苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
将邻氨基苯甲酸（40 wt%）溶解于苯胺中。在该浓度，酸一旦加热至约50℃则完全可溶于有机溶剂。将80 mL上述溶液随后转移至160 mL的高压灭菌器中，随后加入10% (8g)的水，加入1.5 g沸石催化剂并加热至160 ℃、180 ℃或200℃。以不同时间间隔取样并且通过HPLC方法分析以确定苯胺形成速率。
来自不同有机来源的溶解于苯胺的AA的脱羧
根据本发明，可以通过发酵不同糖培养基生物产生邻氨基苯甲酸。可以预期不同培养基中存在的痕量元素（即水解玉米淀粉、甘蔗汁或葡萄糖）中的差异可能影响应该进一步脱羧为苯胺的邻氨基苯甲酸。为了验证这些差异是否干扰催化剂和脱羧反应，测试通过结晶从不同生长培养基中分离的不同邻氨基苯甲酸。比较始终针对由实验室供应商SigmaAldrich购买的化学纯的邻氨基苯甲酸来进行。
不同AA在相同条件中如之前测试来进行测试，在180℃从40% AA的苯胺溶液开始。结果概述于图47中。所有AA来源在低于90分钟内完全转化为苯胺。最快的转化由纯化学品材料(Aldrich)显示。这与由化学纯的葡萄糖（VN35）发酵产生的材料是相当的。略微更低的是分离自水解玉米淀粉（VN32和33）的材料，随后是分离自甘蔗汁（VN 34）的材料。该顺序遵循所用培养基的精炼程度。最纯的糖源导致从中分离的AA更快地分解。这可以通过存在痕量元素如铁或矿物质来解释，其能够干扰沸石催化剂。然而，该影响如此有限以至于无法干扰脱羧反应，其迅速进行至完成而与AA来源无关。
图37显示在含催化剂的苯胺中2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）的分解。显示了在180℃下在沸石Y存在的情况下40 wt%溶解于苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
通过结晶从不同的糖培养基（如化学纯的葡萄糖、水解玉米淀粉和甘蔗汁）获得邻氨基苯甲酸。将所分离的邻氨基苯甲酸（40 wt%）溶解于苯胺中。在该浓度，酸一旦加热至约50℃则完全可溶于有机溶剂。将80 mL上述溶液随后转移至160 mL的高压灭菌器中，加入1.5 g沸石催化剂并加热至180 ℃。以不同时间间隔取样并且通过HPLC方法分析以确定苯胺形成速率。
来自水解玉米淀粉的溶解于苯胺中的AA脱羧的催化剂稳定性
考虑之前观察的痕量元素的影响，我们测试了若干运行中的催化剂稳定性。我们这样进行：通过循环催化剂并且通过将其用于以下反应而无任何洗涤步骤，随后为之前所述的反应程序。结果显示于图38中。新鲜制备的催化剂和重复使用的催化剂之间的活性差异很小。重复使用的似乎比新鲜系统甚至更快或更好。这显示痕量元素对催化剂没有毒性或抑制影响，所述催化剂在脱羧基反应中保持活性。为了进一步验证，我们事后分析了催化剂并将其与新鲜制备的催化剂进行了比较。2种催化剂的IR谱显示于图39中。除了一些被吸收的苯胺种类，仅存在OH信号的小幅降低。该OH可以在与其他离子（痕量元素）交换后淬灭，然而它们可能不是用于催化反应的活性位点，因为沸石的强酸性来自Al-O-Si桥键。
图38显示在含催化剂的苯胺中2-氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸，AA）的分解。显示了在180℃下在沸石Y存在的情况下40 wt%溶解于苯胺中的邻氨基苯甲酸（AA）的脱羧动力学。
通过从水解玉米淀粉结晶获得邻氨基苯甲酸。将所分离的邻氨基苯甲酸（40 wt%）溶解于苯胺中。在该浓度，酸一旦加热至约50℃则完全可溶于有机溶剂。将80 mL上述溶液随后转移至160 mL的高压灭菌器中，加入1.5 g沸石催化剂并加热至180 ℃。分离催化剂并在没有进一步处理或洗涤的情况下再循环用于后续的反应。以不同时间间隔取样并且通过HPLC方法分析以确定苯胺形成速率。
图39显示了新鲜制备的H-Y催化剂的IR谱和如上使用分离自水解的玉米淀粉的AA的反应后的催化剂的IR谱。标记苯胺的典型条带。的确发生了这种高度碱性种类的吸收。也凸显了OH区。OH信号的减少与一些部分离子交换一致，其利用存在的痕量元素发生，然而，OH组似乎在催化反应中没有活性，但可能是Al-O-Si桥键的作用。
实施例8 来自发酵液的oAB的溶解和结晶
将工业糖源用于谷氨酸棒杆菌的发酵。将具有21.5 g/L葡萄糖、3.7 g/L乳酸含量的100 ml培养基与10g邻氨基苯甲酸在250 ml实验室反应器中混合。浆料具有4.7的pH值。oAB室温下在pH4.5的溶解度约为4.5 g/L。随后，将9.12 g NaOH （32%）分4次加入直至形成溶液。溶液具有8.3的pH值。随后，在1小时内加入7 g HCl (37%)。通过添加HCl，第一次成核从5.8的pH值发生。添加过程中晶体数目增加。添加结束时，悬浮液具有3.6的pH值。随后，将浆料搅拌1小时。最后，过滤浆料。
过滤：
根据VDI指南“VDI 2762”在0.2 bar和12.6 cm2的滤器面积进行过滤。将125 g悬浮液过滤并用25 g水洗涤。测量91 g的母液和23.1 g湿固体。根据“VDI 2762”测定的滤饼阻抗计算为5 x 1010 1/m²。将滤饼在干燥炉中干燥。干燥后，测量到9.1 g干固体，对应于91%的产率。
母液中的邻氨基苯甲酸的分数为0.72%。测定固体的灰分含量作为邻氨基苯甲酸的盐含量的指示。测定的灰分含量为0.55%。
实施例9-oAB在1-十二烷醇中的溶解度
用渐增温度测试oAB在十二烷醇中的溶解度。
SLE = 固液平衡
oAB在1-十二烷醇中的溶解度随温度升高而增加。
序列表
<110> Bayer MaterialScience AG
<120> 生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2-氨基苯甲酸从可再生资源发酵生产苯胺
<130> BMS131142 WO
<150> EP14155936.9
<151> 2014-02-20
<160> 110
<170> PatentIn 版本n 3.5
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 1
atgacttctc cagcaacact gaaagttctc aacgcctact tggataaccc cactccaacc 60
ctggaggagg caattgaggt gttcaccccg ctgaccgtgg gtgaatacga tgacgtgcac 120
atcgcagcgc tgcttgccac catccgtact cgcggtgagc agttcgctga tattgccggc 180
gctgccaagg cgttcctcgc ggcggctcgt ccgttcccga ttactggcgc aggtttgcta 240
gattccgctg gtactggtgg cgacggtgcc aacaccatca acatcaccac cggcgcatcc 300
ctgatcgcag catccggtgg agtgaagctg gttaagcacg gcaaccgttc ggtgagctcc 360
aagtccggct ccgccgatgt gctggaagcg ctgaatattc ctttgggcct tgatgtggat 420
cgtgctgtga agtggttcga agcgtccaac ttcaccttcc tgttcgcacc tgcgtacaac 480
cctgcgattg cgcatgtgca gccggttcgc caggcgctga aattccccac catcttcaac 540
acgcttggac cattgctgtc cccggcgcgc ccggagcgtc agatcatggg cgtggccaat 600
gccaatcatg gacagctcat cgccgaggtc ttccgcgagt tgggccgtac acgcgcgctt 660
gttgtgcatg gcgcaggcac cgatgagatc gcagtccacg gcaccacctt ggtgtgggag 720
cttaaagaag acggcaccat cgagcattac accatcgagc ctgaggacct tggccttggc 780
cgctacaccc ttgaggatct cgtaggtggc ctcggcactg agaacgccga agctatgcgc 840
gctactttcg cgggcaccgg ccctgatgca caccgtgatg cgttggctgc gtccgcaggt 900
gcgatgttct acctcaacgg cgatgtcgac tccttgaaag atggtgcaca aaaggcgctt 960
tccttgcttg ccgacggcac cacccaggca tggttggcca agcacgaaga gatcgattac 1020
tcagaaaagg agtcttccaa tgactag 1047
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 2
atgacttctc cagcaacact gtgtttaagt ttagtggatc ccggggaaaa ggagtcttcc 60
aatgactag 69
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 3
gccctgcagg taaaaaaagg atttgattca tg 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 4
gccctgcagg taaaaaaagg atttgattcg tg 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 5
gccctgcagg taaaaaaagg atttgattct tg 32
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 6
gccctgcagg taaaaaaagg attatg 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 7
gccctgcagg taaaaaaagg attgtg 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 8
gccctgcagg taaaaaaagg attttg 26
<210> 9
<211> 312
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 9
gtgtgcatga ctaatgcagg tgacaacttc gagatcagga tgccttctgg cacggatgac 60
ccattgtccg atgcggagat ccaaaagtat cgcgaggaga tcaaccgctt ggaccgcgaa 120
atcctcgatg cggtgaaacg ccgcacgaag atttcccaaa ccatcggaaa aacacgcatg 180
agctcgggcg gaacacgtct cgtgcacacc cgagaagtag caatcatcaa ccaattccgt 240
gaagagatcg gcgaggaagg ccctgccctc gctggaattt tgctgcgcat gggacgcgga 300
aaactcggat aa 312
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<400> 10
atgactaatg caggtgactg tttaagttta gtggatcccg ggcgcggaaa actcggataa 60
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgca tg 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgcg tg 32
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgct tg 32
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
gccctgcagg acgtggcaga atagatg 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 15
gccctgcagg acgtggcaga ataggtg 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 16
gccctgcagg acgtggcaga atagttg 27
<210> 17
<211> 270
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 17
atggcttcca agactgtaac cgtcggttcc tccgttggcc tgcacgcacg tccagcatcc 60
atcatcgctg aagcggctgc tgagtacgac gacgaaatct tgctgaccct ggttggctcc 120
gatgatgacg aagagaccga cgcgtcctct tccctcatga tcatggcgct gggcgcagag 180
cacggcaacg aagttaccgt cacctccgac aacgctgaag ctgttgagaa gatcgctgcg 240
cttatcgcac aggaccttga cgctgagtaa 270
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 18
atggcttcca agactgtaac ctgtttaagt ttagtggatg ggcaggacct tgacgctgag 60
taa 63
<210> 19
<211> 2052
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 19
atggcgtcca aactgacgac gacatcgcaa catattctgg aaaaccttgg tggaccagac 60
aatattactt cgatgactca ctgtgcgact cgccttcgct tccaagtgaa ggatcaatcc 120
attgttgatc aacaagaaat tgactccgac ccatcagttc ttggcgtagt accccaagga 180
tccaccggta tgcaggtggt gatgggtgga tctgttgcaa actattacca agaaatcctc 240
aaacttgatg gaatgaagca cttcgccgac ggtgaagcta cagagagttc atccaagaag 300
gaatacggcg gagtccgtgg caagtactcg tggattgact acgccttcga gttcttgtct 360
gatactttcc gaccaatcct gtgggccctg cttggtgcct cactgattat taccttgttg 420
gttcttgcgg atactttcgg tttgcaagac ttccgcgctc caatggatga gcagcctgat 480
acttatgtat tcctgcactc catgtggcgc tcggtcttct acttcctgcc aattatggtt 540
ggtgccaccg cagctcgaaa gctcggcgca aacgagtgga ttggtgcagc tattccagcc 600
gcacttctta ctccagaatt cttggcactg ggttctgccg gcgataccgt cacagtcttt 660
ggcctgccaa tggttctgaa tgactactcc ggacaggtat tcccaccgct gattgcagca 720
attggtctgt actgggtgga aaagggactg aagaagatca tccctgaagc agtccaaatg 780
gtgttcgtcc cattcttctc cctgctgatt atgatcccag cgaccgcatt cctgcttgga 840
cctttcggca tcggtgttgg taacggaatt tccaacctgc ttgaagcgat taacaacttc 900
agcccattta ttctttccat cgttatccca ttgctctacc cattcttggt tccacttgga 960
ttgcactggc cactaaacgc catcatgatc cagaacatca acaccctggg ttacgacttc 1020
attcagggac caatgggtgc ctggaacttc gcctgcttcg gcctggtcac cggcgtgttc 1080
ttgctctcca ttaaggaacg aaacaaggcc atgcgtcagg tttccctggg tggcatgttg 1140
gctggtttgc tcggcggcat ttccgagcct tccctctacg gtgttctgct ccgattcaag 1200
aagacctact tccgcctcct gccgggttgt ttggcaggcg gtatcgtgat gggcatcttc 1260
gacatcaagg cgtacgcttt cgtgttcacc tccttgctta ccatcccagc aatggaccca 1320
tggttgggct acaccattgg tatcgcagtt gcattcttcg tttccatgtt ccttgttctc 1380
gcactggact accgttccaa cgaagagcgc gatgaggcac gtgcaaaggt tgctgctgac 1440
aagcaggcag aagaagatct gaaggcagaa gctaatgcaa ctcctgcagc tccagtagct 1500
gctgcaggtg cgggagccgg tgcaggtgca ggagccgctg ctggcgctgc aaccgccgtg 1560
gcagctaagc cgaagctggc cgctggggaa gtagtggaca ttgtttcccc actcgaaggc 1620
aaggcaattc cactttctga agtacctgac ccaatctttg cagcaggcaa gcttggacca 1680
ggcattgcaa tccaaccaac tggaaacacc gttgttgctc cagcagacgc tactgtcatc 1740
cttgtccaga aatctggaca cgcagtggca ttgcgcttag atagcggagt tgaaatcctt 1800
gtccacgttg gattggacac cgtgcaattg ggcggcgaag gcttcaccgt tcacgttgag 1860
cgcaggcagc aagtcaaggc gggggatcca ctgatcactt ttgacgctga cttcattcga 1920
tccaaggatc tacctttgat caccccagtt gtggtgtcta acgccgcgaa attcggtgaa 1980
attgaaggta ttcctgcaga tcaggcaaat tcttccacga ctgtgatcaa ggtcaacggc 2040
aagaacgagt aa 2052
<210> 20
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 20
atggcgtcca aactgacgac gtgtttaagt ttagtggatg gggtcaacgg caagaacgag 60
taa 63
<210> 21
<211> 2760
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 21
atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60
gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120
gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180
ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240
gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300
ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360
gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420
gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480
cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540
gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600
cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660
gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720
ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780
aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840
ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900
atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960
agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020
acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080
ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140
gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200
agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260
gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320
gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380
ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440
gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500
tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560
aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620
ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680
ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740
ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800
tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860
ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920
gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980
cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040
gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100
aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160
acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220
acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280
gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcattag agcagtggat tggcgaaggg 2340
gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccatttttc 2400
acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460
ctctacgcag acctgatccc agatacggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccgc 2520
gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580
gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640
aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700
tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cgctgcgcaa ctccggctag 2760
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 22
atgactgatt ttttacgcga ttgtttaagt ttagtggatg gggcgctgcg caactccggc 60
tag 63
<210> 23
<211> 1414
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 23
atgggcgtgg atagacgaac taagattgta tgtaccctag gcccagcggt ggctagtgca 60
gatggaattc tgcgtttggt agaagacggc atggatgttg ctcgcctcaa cttctcccat 120
ggtgaccacc cagatcatga gcaaaactac aagtgggtcc gcgaggcggc ggagaagact 180
ggccgtgcag tcggtattct cgcagacctc caaggaccga agatccgtct tggccgtttc 240
actgacggcg caaccgtgtg ggaaaacggc gagaccattc ggatcaccgt tgacgatgta 300
gagggaacgc acgatcgtgt gtccaccacc tacaagaatc tggcaaaaga cgcgaagcca 360
ggcgaccgcc tgctcgttga tgacggcaag gttggcctcg tctgcgtttc cgtcgaaggt 420
aacgacgtca tctgtgaggt tgttgagggc ggaccagtct ccaacaacaa gggtgtttcc 480
ctgccaggta tggatatttc cgtacctgca ctgtccgaaa aggatatccg tgacctgcgc 540
ttcgccctga agctcggcgt ggactttatt gcactgtcct tcgtacgttc cccagcagat 600
gctgaactcg ttcacaagat catggacgaa gaaggtcgtc gtgttcctgt gatcgccaag 660
ctggaaaagc cagaggctgt cacctccctc gagccaatcg tgttggcatt cgacgccgtc 720
atggttgctc gtggtgacct cggcgttgag gttcctctgg aggaggttcc actggttcag 780
aagcgcgcaa tccagattgc ccgtgagaac gcaaagccag ttatcgtggc aacccagatg 840
ctggattcca tgattgagaa ctcccgccca acccgtgcgg aagcttctga cgtggcaaac 900
gctgtgctcg atggcgcaga tgctgtcatg ctttctggtg aaacttcagt gggcaaagat 960
ccgcacaacg ttgtgcgcac catgtctcgc attgttcgct tcgctgaaac cgacggtcgc 1020
gtcccagacc tgacccacat ccctcgcact aagcgtggcg ttatttccta ctctgcacgt 1080
gatatcgccg agcgcctcaa cgctcgtgca ttggttgcgt tcaccacctc tggtgatacc 1140
gcaaagcgtg tggctcgtct gcacagccac ctgccactgc tcgtgttcac tccaaatgag 1200
gcagttcgct ctgagctggc gctgacctgg ggtgcaacca ccttcctgtg tccacctgtc 1260
agcgataccg atgacatgat gcgcgaagtc gaccgtgctc ttttagcaat gcctgagtac 1320
aacaagggtg acatgatggt tgttgttgca ggttcccctc ctggtgttac cggtaacacc 1380
aacatgattc acgtccacct tcttggtgat ctaa 1414
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 24
atgggcgtgg atagacgaac ttgtttaagt ttagtggatg ggacaaggat tgcaaagctc 60
taa 63
<210> 25
<211> 1860
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 25
atgaatgagt ttgaccagga cattctccag gagatcaaga ctgaactcga cgagttaatt 60
ctagaacttg atgaggtgac acaaactcac agcgaggcca tcgggcaggt ctccccaacc 120
cattacgttg gtgcccgcaa cctcatgcat tacgcgcatc ttcgcaccaa agacctccgt 180
ggcctgcagc aacgcctctc ctctgtggga gctacccgct tgactaccac cgaaccagca 240
gtgcaggccc gcctcaaggc cgcccgcaat gttatcggag ctttcgcagg tgaaggccca 300
ctttatccac cctcagatgt cgtcgatgcc ttcgaagatg ccgatgagat tctcgacgag 360
cacgccgaaa ttctccttgg cgaaccccta ccggatactc catcctgcat catggtcacc 420
ctgcccaccg aagccgccac cgacattgaa cttgtccgtg gcttcgccaa aagcggcatg 480
aatctagctc gcatcaactg tgcacacgac gatgaaaccg tctggaagca gatgatcgac 540
aacgtccaca ccgttgcaga agaagttggc cgggaaatcc gcgtcagcat ggacctcgcc 600
ggaccaaaag tacgcaccgg cgaaatcgcc ccaggcgcag aagtaggtcg cgcacgagta 660
acccgcgacg aaaccggaaa agtactgacg cccgcaaaac tgtggatcac cgcccacggc 720
tccgaaccag tcccagcccc cgaaagcctg cccggtcgcc ccgctctgcc gattgaagtc 780
accccagaat ggttcgacaa actagaaatc ggcagcgtca tcaacgtccc agacacccgc 840
ggatcccgcc gagcattcac cgtgaccagg gtttttgatg gcgcggtcct cgccgaaggc 900
ccacaaaaag cctacatctc caacggcacc ctcctggaac acaactacga ccgctcccgg 960
gtctacggca tccccgccgt agttcagcgc atcaacctca aagtcggcga ccgcctcatc 1020
cttaccgacg aagaactcac ctacgatcca tccctcggat ccggccgcac accacgcatc 1080
agctgcaccc ttccacaagc agtcgatgca attaaagtcg ggcaccgcgt gcttttcgac 1140
gacggagcca tcgccgcagt ctgcatcgac aagacctcca ctgccgacgg ccacaacgac 1200
gtagaattgg aagtcaccca cgcccgccca caaggcgtaa acctggccgc atacaaggga 1260
atcaacctcc cagactccga acttccactc ccaagcctca ctgaagaaga cctccaacac 1320
ctgcgctttg tcgtcaaata cgccgacatc gcagccatct ccttcatccg aaacgtcgcc 1380
gacgtggaat acctcctcca agcactcgcc gacatcggag atccagtagc cgtcgaacgc 1440
cttggcctcg tccttaaaat cgagaccatc ccaggctacg aaggcctcgc ccaaatcctc 1500
ctgaccggca tgcgccacga aaacttcggc atcatgatcg cccgcggaga cctcgccgtc 1560
gaactcggct tcgaccgcat ggcagaagtc ccccaactga tcatggccct tgccgaagcc 1620
gcccacgtcc caaccatctt ggccacccaa gtcctggaaa acatggccaa aaacggactc 1680
ccatctcgcg cagaaatcac cgacgcagca atggcacttc gcgctgaatg cgtcatgctg 1740
aacaagggac cacacatcaa cgacgccatc aaggtcctca ccgaaatgag ccgcaaactt 1800
ggtgcatccc aacgaaagag taggctgctg ctgcgcaagg tgaagagctg ggaagagtaa 1860
<210> 26
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 26
atgaatgagt ttgaccagga ctgtttaagt ttagtggatg gggtgaagag ctgggaagag 60
taa 63
<210> 27
<211> 1603
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 27
atggcggaca tttcgaccac ccaggtttgg caagacctga ccgatcatta ctcaaacttc 60
caggcaacca ctctgcgtga acttttcaag gaagaaaacc gcgccgagaa gtacaccttc 120
tccgcggctg gcctccacgt cgacctgtcg aagaatctgc ttgacgacgc caccctcacc 180
aagctccttg cactgaccga agaatctggc cttcgcgaac gcattgacgc gatgtttgcc 240
ggtgaacacc tcaacaacac cgaagaccgc gctgtcctcc acaccgcgct gcgccttcct 300
gccgaagctg atctgtcagt agatggccaa gatgttgctg ctgatgtcca cgaagttttg 360
ggacgcatgc gtgacttcgc tactgcgctg cgctcaggca actggttggg acacaccggc 420
cacacgatca agaagatcgt caacattggt atcggtggct ctgacctcgg accagccatg 480
gctacgaagg ctctgcgtgc atacgcgacc gctggtatct cagcagaatt cgtctccaac 540
gtcgacccag cagacctcgt ttctgtgttg gaagacctcg atgcagaatc cacattgttc 600
gtgatcgctt cgaaaacttt caccacccag gagacgctgt ccaacgctcg tgcagctcgt 660
gcttggctgg tagagaagct cggtgaagag gctgtcgcga agcacttcgt cgcagtgtcc 720
accaatgctg aaaaggtcgc agagttcggt atcgacacgg acaacatgtt cggcttctgg 780
gactgggtcg gaggtcgtta ctccgtggac tccgcagttg gtctttccct catggcagtg 840
atcggccctc gcgacttcat gcgtttcctc ggtggattcc acgcgatgga tgaacacttc 900
cgcaccacca agttcgaaga gaacgttcca atcttgatgg ctctgctcgg tgtctggtac 960
tccgatttct atggtgcaga aacccacgct gtcctacctt attccgagga tctcagccgt 1020
tttgctgctt acctccagca gctgaccatg gaatcaaatg gcaagtcagt ccaccgcgac 1080
ggctcccctg tttccactgg cactggcgaa atttactggg gtgagcctgg cacaaatggc 1140
cagcacgctt tcttccagct gatccaccag ggcactcgcc ttgttccagc tgatttcatt 1200
ggtttcgctc gtccaaagca ggatcttcct gccggtgagc gcaccatgca tgaccttttg 1260
atgagcaact tcttcgcaca gaccaaggtt ttggctttcg gtaagaacgc tgaagagatc 1320
gctgcggaag gtgtcgcacc tgagctggtc aaccacaagg tcatgccagg taatcgccca 1380
accaccacca ttttggcgga ggaacttacc ccttctattc tcggtgcgtt gatcgctttg 1440
tacgaacaca tcgtgatggt tcagggcgtg atttgggaca tcaactcctt cgaccaatgg 1500
ggtgttgaac tgggcaaaca gcaggcaaat gacctcgctc cggctgtctc tggtgaagag 1560
gatgttgact cgggagattc ttccactgat tcaaaatagg tag 1603
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 28
atggcggaca tttcgaccac ctgtttaagt ttagtggatg ggtggtaccg cgcaaatagg 60
tag 63
<210> 29
<211> 975
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 29
atgagcaccg ccgtagtttc acagaagaag tccacaacgg catccaaaat tggacattgg 60
atgctcaata acggtgcgtt ggtggggctg attgcactgt gtgttggact ttttattgca 120
acaccccact ttctcaccat tcctaacctg atcaacatcg gtatccaatc ggcgacggtg 180
gcgatcctgg cgttcggcat gaccttcgtc atcgttaccg caggcattga tttgtctgtg 240
ggatcagtgg ctgcgttggg tgcgatgacc tcggcgtatt tcttcgcgga agttggtttg 300
ccgggctgga tcacgctgct gattggcctg ttcatcggat tgttggcggg tgcgatctct 360
ggcatttcta ttgcttatgg caagttgcct gcgtttattg ccaccttggc catgatgtcg 420
atcgccaggg gaatcacctt ggtcatttcc caaggctcac caattcccag tgcaccagct 480
gtgaacgctt tggggcgcac ctactttggc atcccgatgc cgattctgat gatggcactg 540
gctggcattg tgtgttggtt tattttgagc cgcaccgtgc tgggacggtc catgtacgcc 600
attggcggaa acatggaagc agcccgacta tctggtctgc cagtgaagaa aatcctggtc 660
atggtctatg cactggctgg tgtgtatgca gcacttgcgg gtctggtcat gacgggacgc 720
ttgtcgtccg cgcagccgca ggcaggcgtg ggatacgaac tcgatgcgat tgccgccgtg 780
gtcattggtg gtgcgtcact tgctggcgga accggaaaag caacgggcac tttgattggt 840
gccatcttgt tggccgtgat ccgcaatggc ttgaacattt tgaacgtgtc ctcgttctgg 900
cagcagattg tcatcggttg tgtcatcgcg cttgcggtgg gcttcgatgt catccgaaac 960
aaaacctcta agtaa 975
<210> 30
<211> 1383
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 30
atgacaatgt gcgattactt cacaagctca aggagaattt ctgtggcttc ccaaatttct 60
ggcggctggc aaagtgccaa acaccgcacc actgtttaca tggtcctcgt agttgtgggc 120
atttctattc tttttgacgg ctacgatcta gtgatctacg gcgccgtgct gtcaacacta 180
cttgaagatc caacccagat cggtgcgctc agcccagcag tcgccggcac ccttggttcc 240
tacgccatga tcggcgtgat gatcggtgct ctatctgcag gtgccgttgg tgaccgcctt 300
ggtcgtcgca aagttatgct caccgcaatc gtctggttct ctgtgggcat ggcgctgacc 360
gcgttcgcgt cctcgattgc gctgttcggt ttcttgcgct tcctcaccgg acttggcgtg 420
ggcatgatcg ttgcaaccgg cggcgcaatc atcgcggagt tcgctccagc gaataggcgc 480
aacttgttca acgcaatcgt gtactccggt gtcccagccg gtggcgtgct ggcttctatc 540
cttgcactgc tctttgaaga tgtcatcggc tggcgcggac tcttcctcat cggtggttcc 600
ccactactgt tcctcctgcc acttgcatac ttcttcctcc cagagtcccc gcgctggctc 660
acctcccgcg gccgtgctgc ggacgccaaa gccctctgcg cacgctatgg gctgccgacg 720
gaggaatttg tcgtcgaaaa gcagcaggaa acaaagggca ccggattcgc tggaattttc 780
tcctccaagt acctcatggg caccattctc atcggcgcaa tgagcttcat cgggctgctt 840
tcgacctacg gcctgaacac ctggttgcca aagatcatgg aatccaacgg cgcaacctca 900
catgattccc tgtactccct gctgttcctc aacggcggcg cagtgttcgg tggcctcatc 960
gcatcctggt tcgctgaccg catcggcgcg aagaccgtga tcacctccac cttcgctctc 1020
gccgcgatct gcctcggagt cctgccaaac atctcctcct ggccaatgat gtacaccgca 1080
atcgcattcg caggcgtcgg cgtcctgggc acccaggttc tcacctacgg cctgacctcg 1140
aacttcttcg gaaccgaatg ccgcgcagcg ggagttgcat ggtgtgcagg attcggccga 1200
ctcggcggaa tcgtcggacc agcaatcggt ggcctgatca tcggcgcagg attcggacca 1260
agctccgcat tcctcatctt cgcagcagct gccgcaatcg gcgcggtctg caccttgctg 1320
atcccgcgct ccccagcaga agtagaggtc aaggtcgcgc aggaaccact tgcacgtgtc 1380
taa 1383
<210> 31
<211> 1527
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 31
atgacggaca tcaaggccac atcaagtaca tcggccacta cagcaccaac agcaggccga 60
ccagcgcgtc gacttggaca aatttccctc gtcgcctgtc tcggcggact tctcttcggc 120
tatgacaccg gtgtcgccaa cggcgccgaa ggccacatgg cacaagaact cggactcaac 180
gtgctgcagc tcggcgttgt catcagttca ctggttttcg ctgcagcctt tggcgcgctg 240
ttcgctgggc gtatctcgga cgaaatcggg cgtcgaaaag caattatcac tttgtccgtg 300
ctgttcttcc tcggatcaat cctcgtcgta ttctcccccg ccggtgagct ggggcagttc 360
tacggaccag gatttgccac cttggtcacc gggcgcatca tgttgggtct cgcggttggc 420
ggcgcctcca cagtagttcc ggtgtacctc gctgaactcg caccactaga aatccgcggc 480
tccctgaccg gccgaaacga gcttgctatc gtcaccggcc agctgcttgc cttcgtgatc 540
aacgcgctta tcgccgtcac cctacacgga gttattgatg gaatctggcg catcatgttc 600
gccgtctgtg ccctccctgc cgtcgccctc ttcctcggca tgctgcggat gccggaatca 660
ccacgctggc tggtcaacca ggggcgttac gacgacgccc gccgcgtcat ggagaccgtc 720
cgtacccctg agcgtgcgaa agccgaaatg gatgaaatca tcgcggtgca ctctgaaaac 780
aatgcggcac ttcctggtgt taagcagtct tcgggccagg cttcaggcca ggtttctagc 840
aagcacaccc acatgtccat cggcgaagtc ctcagcaaca aatggctggt tcgtctgctc 900
atcgccggca tcggtgttgc agttgcccag cagctcaccg gcatcaacgc catcatgtac 960
tacggaaccc gcgtcctcga ggaatccggc atgagcgcag aaatggctgt ggttgccaac 1020
attgctttcg gtgccgttgc cgtcatcggt ggactgatcg cactgcgcaa catggaccgc 1080
ctggatcgcc gcaccacctt catcatcggc ctgtcactga ccaccacctt ccaccttttg 1140
atcgcagctg ccggcactct ccttccagaa ggtaactcca ttcgaccatt cgccatcatg 1200
atccttgttg ttgggttcgt gctctccatg cagactttcc tcaacgttgc agtgtgggtg 1260
tggctggcgg aaatcttccc agtccgaatg aagggtatcg gcaccggtat ttcggtattc 1320
tgcggttggg gcatcaatgg cgtcctagcg ttgttcttcc cagcactggt ctccggcgtg 1380
ggtatcacct tctccttcct tatcttcgca gtcgtcggag tcattgccct ggcgttcgtc 1440
accaagtttg ttcctgaaac ccgtggccgc tcacttgaag aactcgatca cgcagcattc 1500
accggccaga ttttcaagaa ggcttaa 1527
<210> 32
<211> 753
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 32
atgactgaga ctggatttgg aattgatatt ggtggctccg gcatcaaagg cgcccgcgtt 60
aaccttaaga ccggtgagtt tattgatgaa cgcataaaaa tcgccacccc taagccagca 120
accccagagg ctgtcgccga agtagtcgca gagattattt ctcaagccga atgggagggt 180
ccggtcggaa ttaccctgcc gtcggtcgtt cgcgggcaga tcgcgctatc cgcagccaac 240
attgacaagt cctggatcgg caccgatgtg cacgaacttt ttgaccgcca cctaaatggc 300
cgagagatca ccgttctcaa tgacgcagac gccgccggca tcgccgaagc aacctttggc 360
aaccctgccg cacgcgaagg cgcagtcatc ctgctgaccc ttggtacagg tattggttcc 420
gcattccttg tggatggcca actgttcccc aacacagaac tcggtcacat gatcgttgac 480
ggcgaggaag cagaacacct tgcagcagca tccgtcaaag aaaacgagga tctgtcatgg 540
aagaaatggg cgaagcacct gaacaaggtg ctgagcgaat acgagaaact tttctcccca 600
tccgtcttca tcatcggtgg cggaatttcc agaaagcacg aaaagtggct tccattgatg 660
gagctagaca ctgacattgt cccagctgag ctgcgcaatc gagccggaat cgtaggagct 720
gctatggcag taaaccaaca cctcacccca taa 753
<210> 33
<211> 1083
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 33
atgaacatcc cgtttgtcca gcgcttcgat gaaggcctgg accctgttct agaagtactc 60
ggtggcaagg gcgcttcact agtcaccatg acagatgctg gaatgcccgt tccacctgga 120
tttgtggtca ctactgccag ctttgatgag ttcatccgtg aagcaggggt tgctgaacac 180
atcgataaat tcctaaacga tctcgatgca gaagatgtta aggaagtgga tcgagtttct 240
gcgatcatcc gcgatgagct gtgcagtctt gacgttccag agaatgctcg tttcgcagtg 300
caccaggctt atcgcgatct catggaacga tgcggtggcg acgtcccggt tgctgtccgg 360
tcatcggcca ctgccgaaga cctgcccgat gcttccttcg cagggcaaca ggacacctat 420
ctgtggcaag tcggtttgag cgctgtcact gaacacatcc gtaaatgctg ggcttcgctg 480
ttcacttccc gtgccattat ctaccgtctg aaaaacaaca tccccaatga gggcctctcg 540
atggcggtag ttgttcaaaa aatggtcaac tctcgtgtcg caggcgtggc aatcactatg 600
aatccttcca acggcgaccg ctcgaagatc accatcgatt cctcatgggg tgttggtgaa 660
atggtggtct caggtgaagt gacaccagac aatatcttgc tggacaagat cacgctgcag 720
gttgtctccg aacacattgg aagcaaacac gctgaactca tccccgatgc caccagtgga 780
agcctcgtgg aaaagcccgt tgatgaagaa cgcgcaaacc gccgcagtct gactgatgag 840
gaaatgctcg ctgtggcaca aatggctaag cgtgcagaaa aacactacaa gtgcccacaa 900
gatatcgaat gggcgctgga cgctgatctg ccagatggag aaaaccttct gttattgcaa 960
tcccgcccgg aaactatcca ctccaacggt gtgaagaagg aaaccccaac tccgcaggct 1020
gccaaaacca taggcacctt cgatttcagc tcaatcaccg tcgcaatgac cggcacgaag 1080
taa 1083
<210> 34
<211> 1743
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 34
atgttcaagc cttttgaaac tatcggtggt gagttcgctg taaagtgcct cggccaatac 60
aacgctcggc atttgatgat cccgaatgcc aatggcatcg agttccgcgt gcatctggga 120
tacctctata tgtcccctat tccagtgcct gaagatcaga ttgcggaacg cgtccccatg 180
ttccaggaac gcatcacgca ctacttccaa aactgggagc caatgctggc aaattggaag 240
gagcgagtat taggaaccat caatgagctg gaatctctag agttcaagcc actgcctgac 300
tacgtgccta tcgatgatat tgtctccgga aaagccaaag acggcaccga agtactcatg 360
gaaaacttcg atcggctcat tcagctcgcc taccaaaact ggcaatacca ctttgagttc 420
ctcaacttgg gttacatcgc ttacctagat ttcttcaatt tctgcaagga agtcttccca 480
gatatccctg atcaatcaat ttcgatgatg gttcagggcg tggatatgga gctgttccgc 540
cccgatgatg aactaaagat tctggcacag ctagcggtcg accttggcct gcaaactcac 600
tttgccaacc cggatgatcc gcaagctacc ttggctgcta tcgcaaaggc agaaggcggc 660
gcgacatgga tagcgcgctg ggaagaagca caagatccgt ggttcaactt caccgtcggt 720
aatggcttct acggtcacga taaatactgg atcgagcacc tggaacttcc actggggtac 780
atcgcggatt acatccgccg cctagatgaa ggccaaacca tctcccgccc gaaagatgaa 840
ctcatcgcag aaaaggaacg cgtggtggaa gaataccgcg accttttgga tggagaacaa 900
ctcgcgcagt ttgatgctaa atgcggcctc gctgctactg cataccccta tgtggaaaac 960
cataacttct acatcgagca ctggaccatg tcagtatttt ggcgcaaagt acgcgaactt 1020
tcccgcactc tccagggcta cggtttctgg gagaacgagg atgacatgtt gtacctcaac 1080
cgcactgaag tccgcgatgt cctcttcgac ctggctactg cgtggggtgt cggcgcaccc 1140
ggtggtccaa ttggcacgat catttggccg gaagaaattg agcgaagaaa agcaattgtc 1200
accgctttga aaactgcccg accagcgcca gctcttaaca ctcctccaga gtccatcacc 1260
gaacctttca cccgcatgct ctggggaatc accaccgaac aggtgcaatc atggttgggc 1320
aatgacgagg atgccgaaga aggaaccctt aaaggcatgg ctgcatcccc tggtgtggtg 1380
gaaggctacg ctcgagtaat tctcagcgca gatgaccttt cagaaatcca gcaggatgaa 1440
atcctcgttg cccctgtaac agcaccttct tggggcccaa tctttggcaa aatcaaggca 1500
acagtcactg atattggtgg catgatgagc catgctgcga tcgtgtgccg cgaatacggc 1560
ttgccggctg ttactggaac tggcgctgca tccaccacca tcaaaaccgg cgattacctc 1620
aaggtcgatg gaaccaaggg caaggttgtc attgttgatc cagatgcgcc acgcatcgaa 1680
ggacccggcg cgcacagcca tgcgcactca gtagcagcac atggggtgga tacacatgcc 1740
tag 1743
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 35
aaccaccgaa aggaggccct tcag 24
<210> 36
<211> 1833
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 36
atgactactg ctgcaatcag gggccttcag ggcgaggcgc cgaccaagaa taaggaactg 60
ctgaactgga tcgcagacgc cgtcgagctc ttccagcctg aggctgttgt gttcgttgat 120
ggttcccagg ctgagtggga tcgcatggcg gaggatcttg ttgaagccgg taccctcatc 180
aagctcaacg aggaaaagcg tccgaacagc tacctagctc gttccaaccc atctgacgtt 240
gcgcgcgttg agtcccgcac cttcatctgc tccgagaagg aagaagatgc tggcccaacc 300
aacaactggg ctccaccaca ggcaatgaag gacgaaatgt ccaagcatta cgctggttcc 360
atgaaggggc gcaccatgta cgtcgtgcct ttctgcatgg gtccaatcag cgatccggac 420
cctaagctcg gtgtgcagct cactgactcc gagtacgttg tcatgtccat gcgcatcatg 480
acccgcatgg gtattgaagc gctggacaag atcggcgcga acggcagctt cgtcaggtgc 540
ctccactccg ttggtgctcc tttggagcca ggccaggaag acgttgcatg gccttgcaac 600
gacaccaagt acatcaccca gttcccagag accaaggaaa tttggtccta cggttccggc 660
tacggcggaa acgcaatcct ggcaaagaag tgctacgcac tgcgtatcgc atctgtcatg 720
gctcgcgaag aaggatggat ggctgagcac atgctcatcc tgaagctgat caacccagag 780
ggcaaggcgt accacatcgc agcagcattc ccatctgctt gtggcaagac caacctcgcc 840
atgatcactc caaccatccc aggctggacc gctcaggttg ttggcgacga catcgcttgg 900
ctgaagctgc gcgaggacgg cctctacgca gttaacccag aaaatggttt cttcggtgtt 960
gctccaggca ccaactacgc atccaaccca atcgcgatga agactatgga accaggcaac 1020
accctgttca ccaacgtggc actcaccgac gacggcgaca tctggtggga aggcatggac 1080
ggcgacgccc cagctcacct cattgactgg atgggcaacg actggacccc agagtccgac 1140
gaaaacgctg ctcaccctaa ctcccgttac tgcgtagcaa tcgaccagtc cccagcagca 1200
gcacctgagt tcaacgactg ggaaggcgtc aagatcgacg caatcctctt cggtggacgt 1260
cgcgcagaca ccgtcccact ggttacccag acctacgact gggagcacgg cactatggtt 1320
ggtgcactgc tcgcatccgg tcagaccgca gcttccgcag aagcaaaggt cggcacactc 1380
cgccacgacc caatggcaat gctcccattc attggctaca acgctggtga atacctgcag 1440
aactggattg acatgggtaa caagggtggc gacaagatgc catccatctt cctggtcaac 1500
tggttccgcc gtggcgaaga tggacgcttc ctgtggcctg gcttcggcga caactctcgc 1560
gttctgaagt gggtcatcga ccgcatcgaa ggccacgttg gcgcagacga gaccgttgtt 1620
ggacacaccg ctaaggccga agacctcgac ctcgacggcc tcgacacccc aattgaggat 1680
gtcaaggaag cactgaccgc tcctgcagag cagtgggcaa acgacgttga agacaacgcc 1740
gagtacctca ctttcctcgg accacgtgtt cctgcagagg ttcacagcca gttcgatgct 1800
ctgaaggccc gcatttcagc agctcacgct taa 1833
<210> 37
<211> 1455
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 37
atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat 60
gatctagcaa accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc 120
gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt 180
acggagttcc gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc 240
aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa 300
acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca 360
gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc 420
cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag 480
ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag 540
gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg 600
aactccaact acgttgacca cgtccagatc acaatggctg aagatattgg cttgggtgga 660
cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc 720
cagctcttgg ctctggttgc tatggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag 780
gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc 840
gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa 900
gaagatggct tcaaccctga gtccaccact gagacttttg cggcttgtac cttagagatc 960
acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc 1020
cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa gacgcaccac accagccttt cgacggcgac 1080
atgactgtat cccttggcca aaacgccatc gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg 1140
ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt tctgctatgg aagtccgtga cgtcaacatg 1200
gacttctcct actcagaatc cttcactgaa gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt 1260
ttggatgcgc tgttagatga atccagcctc ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc 1320
tggaagattc tggacccaat tcttgaagca tgggatgccg atggagaacc agaggattac 1380
ccagcgggta cgtggggtcc aaagagcgct gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc 1440
tggcgcaggc cataa 1455
<210> 38
<211> 960
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 38
atgatctttg aacttccgga taccaccacc cagcaaattt ccaagaccct aactcgactg 60
cgtgaatcgg gcacccaggt caccaccggc cgagtgctca ccctcatcgt ggtcactgac 120
tccgaaagcg atgtcgctgc agttaccgag tccaccaatg aagcctcgcg cgagcaccca 180
tctcgcgtga tcattttggt ggttggcgat aaaactgcag aaaacaaagt tgacgcagaa 240
gtccgtatcg gtggcgacgc tggtgcttcc gagatgatca tcatgcatct caacggacct 300
gtcgctgaca agctccagta tgtcgtcaca ccactgttgc ttcctgacac ccccatcgtt 360
gcttggtggc caggtgaatc accaaagaat ccttcccagg acccaattgg acgcatcgca 420
caacgacgca tcactgatgc tttgtacgac cgtgatgacg cactagaaga tcgtgttgag 480
aactatcacc caggtgatac cgacatgacg tgggcgcgcc ttacccagtg gcggggactt 540
gttgcctcct cattggatca cccaccacac agcgaaatca cttccgtgag gctgaccggt 600
gcaagcggca gtacctcggt ggatttggct gcaggctggt tggcgcggag gctgaaagtg 660
cctgtgatcc gcgaggtgac agatgctccc accgtgccaa ccgatgagtt tggtactcca 720
ctgctggcta tccagcgcct ggagatcgtt cgcaccaccg gctcgatcat catcaccatc 780
tatgacgctc atacccttca ggtagagatg ccggaatccg gcaatgcccc atcgctggtg 840
gctattggtc gtcgaagtga gtccgactgc ttgtctgagg agcttcgcca catggaccca 900
gatttgggct accagcacgc actatccggc ttgtccagcg tcaagctgga aaccgtctaa 960
<210> 39
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 39
tttaggggca aaaa 14
<210> 40
<211> 2031
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 40
atggacacca aggctgtaga cactgttcgt gtcctcgctg cagacgctgt agaaaactgt 60
ggctccggcc acccaggcac cgcaatgagc ctggctcccc ttgcatacac cttgtaccag 120
cgggttatga acgtagatcc acaggacacc aactgggcag gccgtgaccg cttcgttctt 180
tcttgtggcc actcctcttt gacccagtac atccagcttt acttgggtgg attcggcctt 240
gagatggatg acctgaaggc tctgcgcacc tgggattcct tgaccccagg acaccctgag 300
taccgccaca ccaagggcgt tgagatcacc actggccctc ttggccaggg tcttgcatct 360
gcagttggta tggctatggc tgctcgtcgt gagcgtggcc tattcgaccc aaccgctgct 420
gagggcgaat ccccattcga ccaccacatc tacgtcattg cttctgatgg tgaccttcag 480
gaaggtgtca cctctgaggc atcctccatc gctggcaccc agcagctggg caacctcatc 540
gtgttctggg atgacaaccg catctccatc gaagacaaca ctgagatcgc tttcaacgag 600
gacgttgttg ctcgttacaa ggcttacggc tggcagacca ttgaggttga ggctggcgag 660
gacgttgcag caatcgaagc tgcagtggct gaggctaaga aggacaccaa gcgacctacc 720
ttcatccgcg ttcgcaccat catcggcttc ccagctccaa ctatgatgaa caccggtgct 780
gtgcacggtg ctgctcttgg cgcagctgag gttgcagcaa ccaagactga gcttggattc 840
gatcctgagg ctcacttcgc gatcgacgat gaggttatcg ctcacacccg ctccctcgca 900
gagcgcgctg cacagaagaa ggctgcatgg caggtcaagt tcgatgagtg ggcagctgcc 960
aaccctgaga acaaggctct gttcgatcgc ctgaactccc gtgagcttcc agcgggctac 1020
gctgacgagc tcccaacatg ggatgcagat gagaagggcg tcgcaactcg taaggcttcc 1080
gaggctgcac ttcaggcact gggcaagacc cttcctgagc tgtggggcgg ttccgctgac 1140
ctcgcaggtt ccaacaacac cgtgatcaag ggctcccctt ccttcggccc tgagtccatc 1200
tccaccgaga cctggtctgc tgagccttac ggccgtaacc tgcacttcgg tatccgtgag 1260
cacgctatgg gctccatcct caacggcatt tccctccacg gtggcacccg cccatacggc 1320
ggaaccttcc tcatcttctc cgactacatg cgtcctgcag ttcgtcttgc agctctcatg 1380
gagaccgacg cttactacgt ctggacccac gactccatcg gtctgggcga agatggccca 1440
acccaccagc ctgttgaaac cttggctgca ctgcgcgcca tcccaggtct gtccgtcctg 1500
cgtcctgcag atgcgaacga gaccgcccag gcttgggctg cagcacttga gtacaaggaa 1560
ggccctaagg gtcttgcact gacccgccag aacgttcctg ttctggaagg caccaaggag 1620
aaggctgctg aaggcgttcg ccgcggtggc tacgtcctgg ttgagggttc caaggaaacc 1680
ccagatgtga tcctcatggg ctccggctcc gaggttcagc ttgcagttaa cgctgcgaag 1740
gctctggaag ctgagggcgt tgcagctcgc gttgtttccg ttccttgcat ggattggttc 1800
caggagcagg acgcagagta catcgagtcc gttctgcctg cagctgtgac cgctcgtgtg 1860
tctgttgaag ctggcatcgc aatgccttgg taccgcttct tgggcaccca gggccgtgct 1920
gtctcccttg agcacttcgg tgcttctgcg gattaccaga ccctgtttga gaagttcggc 1980
atcaccaccg atgcagtcgt ggcagcggcc aaggactcca ttaacggtta a 2031
<210> 41
<211> 1992
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 41
atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60
aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120
tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180
gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240
gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300
ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360
gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420
ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480
ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540
ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600
accgcaatgc gtttcgaagc atacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660
gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720
ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780
cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840
tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900
caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc atatccgcag 960
gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020
gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080
tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg agttcctcgg cggttctgct 1140
gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200
gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260
atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320
gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380
cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440
tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500
gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560
cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620
tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680
gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740
gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800
ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860
aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920
gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980
gaactgctgt aa 1992
<210> 42
<211> 1083
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 42
atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga cgacctctcc 60
cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc tgtagtcggt 120
gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc ctacgacgct 180
cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta cgccatgagc 240
atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc ctccaacggc 300
tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg cgacgcaacc 360
ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat gatcaagatc 420
cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg catcagcgtt 480
aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc gttcatcgag 540
ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc tgtggcttcc 600
ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat cggctccgat 660
gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc ttacgctgtg 720
tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca gcgcccactg 780
tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt ttccgagctg 840
gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt tctggagcag 900
ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc tgtgttctcc 960
cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga gaccgagggt 1020
gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ctatggaagc tcgcctgaag 1080
tag 1083
<210> 43
<211> 951
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 43
atgaacgagt tagacggcat caaacagttc accactgtcg tggcagacag cggcgatatt 60
gagtccattc gccattatca tccccaggat gccaccacca atccttcgct gttactcaaa 120
gctgccggat tatcacaata tgagcattta atagacgatg ctatcgcctg gggtaaaaaa 180
aatggcaaga cccaggaaca acaggtggtc gcagcgtgtg acaaactggc ggtcaatttc 240
ggtgctgaaa tcctcaaaat cgtacccggt cgcgtgtcaa cagaagttga tgcacgcctc 300
tcttttgata aagaaaagag tattgagaag gcgcgccatc tggtggactt gtatcagcaa 360
caaggcgttg agaaatcacg cattctgatc aagctggctt cgacctggga aggtattcgc 420
gcggcagaag agctggaaaa agaaggtatt aactgcaacc tgacgctgct gttttctttt 480
gcacaggcac gggcctgtgc ggaagcaggc gtttttctga tttcgccgtt tgtcgggcgt 540
atttatgact ggtatcaggc acgcaagccg atggacccgt atgtggtgga agaagatccg 600
ggcgttaaat cggtgcgcaa tatctacgac tactataagc aacaccacta tgaaaccatt 660
gtgatgggcg cgagcttccg tcgcaccgaa caaatcctcg ccttaaccgg ctgcgatcga 720
ctgactatcg caccgaattt actgaaggag ctgcaggaaa aagtttcgcc agtggtacgt 780
aaattaatcc caccttctca gacgttccca cgcccagctc ccatgagcga agcggagttc 840
cgttgggagc acaatcagga tgcgatggcg gtagaaaaac tgtctgaagg cattcgtctg 900
ttcgccgttg atcaacgcaa actggaagac cttcttgccg ccaaactata a 951
<210> 44
<211> 1452
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 44
atgtcttaca catcttttaa aggcgatgat aaagccctca tcggcatagt tttatcagtt 60
ctcacatttt ggctttttgc tcagtcaacc ctaaatatcg gcccagatat ggcaactgat 120
ttagggatga gcgatggcac catgaacata gctgtcgtgg ccgccgcgtt attctgtgga 180
acatttatcg tcgcagccgg cggcatcgca gatgtctttg gccgagtacg aatcatgatg 240
attggcaaca tccttaacat cctgggatct ctcctcatcg ccacggcaac gacttcttta 300
gccacccaaa tggtgatcac cggccgagtt ctccaaggac tggcagcagc ggccatcatg 360
tctgcatccc tagcattagt taagacatat tggttaggta ctgaccgcca acgagcagtc 420
tccatttggt ccattggttc atggggtggc accggattct gcgcgctttt cgcgggtctt 480
gttgtagcaa gcccctttgg ttggagagga atcttcgccc tctgcgcgat cgtctccatc 540
gttgctattg cccttacccg ccacatcccg gaatcccgtc cggctcaatc cattggcatg 600
catttggatt ggagtggcat catcgttctt gccctcagtg ttctatctct tgaattgttt 660
attacccaag gtgaatcact tggctggacg cactggatga cctggactct ccttgccgtt 720
tctttgacat ttcttgcagt tttcgtcttc attgaacgca tcgccagctg gccagttctc 780
gacttcaacc ttttcaaaga ccacgccttc agcggtgcga ccatcaccaa cttcattatg 840
agcgctactg gcggagtagt tgccgttgtc atgtgggttc agcaaatggg atggggtgtc 900
tccccaacaa tctcgggact caccagcatc ggcttcgcag cctttgtcat ccttttcatt 960
cgagttggag aaaaggccat gcagaaagtt ggcgcccgag cagtgatcat caccgctggc 1020
atcttggtag cgaccgcgac cgccctccta atgatcaccg cggtcagcga gtcaacgtac 1080
atcgtcatct ccctcgccgg cttctccctt tatggccttg gcctcggact cttcgccacc 1140
ccagtcaccg atactgcgct tggaacactt cccaaagacc gtaccggcgc tggtgcaggt 1200
gtattcaaga tgtcctcttc cctcggcgca gcactcggca tcgcaatctc cacttcagtg 1260
ttcctcgcac ttcgcgacgg cacctccatc aactccgacg tcgcactcgc cggaacagtt 1320
tcacttggca tcaacgttgt attcgcagca acagccacca tcaccgcagc agtccttatt 1380
ccaaaagccg ctggcaaagt ctcacaaacc agcatcaccc ttcctgagcc agctatcgct 1440
gtaaaaatct aa 1452
<210> 45
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 45
atggatcttt cccttctcaa ggaaaccctc ggcaactacg agaccttcgg tggcaacatc 60
ggtaccgctc ttcagagcat cccaaccctg ctcgattcca tccttaactt cttcgacaac 120
ttcggagacc tcgctgacac caccggcgag aatctggata acttctcttc ctaa 174
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 46
gagaaatcct gaaaggaggc ccttcag 27
<210> 47
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
atggaaaacg tttacgagtt ccttggaaac cttgatgtcc tttccggctc cggcctcatc 60
ggctacgtct tcgacttcct cggcgcttcc agcaagtggg ctggcgcagt tgctgacctc 120
atcggtctgc ttggctaa 138
<210> 48
<211> 1209
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 48
atgaaaaata ttattgcatt gtcttctgtc ccgcttgtga tgacactcgg gaactccatg 60
ctgattcctg ttcttccgat gatggagaaa aagctgtctg tgacttcatt tcaagtatct 120
ttaatcatta ctgtatattc agtagtagca attatttgca ttccgattgc cggatatttg 180
tcggatcgtt tcgggagaaa aaaaatattg cttccatgcc tcctcattgc aggattgggg 240
ggagccgtag ctgcttttgc ctcgacctat atgaaaaatc cttatgctat gatcttggcg 300
gggcgggttc ttcaaggcat tggttctgca ggtgccgctc cgattgtcat gccgtttatc 360
ggcgacctgt ttaaaggaga cgatgaaaag gtcagcgcgg gtcttggcga tattgaaacc 420
gccaacacgt cagggaaggt actgagtccc atacttggag ccttactggc ttcttggtat 480
tggtttgtac cgttttggtt tattccgttt ttctgtttga tcagcttttt gctcgtattg 540
tttttggtgg ccaagcctga agaagatgaa gatgcgcctg ctgtttctga gtttattaag 600
agtgtgaaga aaatttttaa acaggatggt cgctggcttt atacggtctt cattatcggg 660
tgtgtcatta tgtttttgtt atttggcgta ttattttatt tatcagatac gctggagaac 720
aagtatgcta ttgacggagt agctaaaggc ggattactgg caatcccact tttgtttttg 780
tcaaccagtt cttttatagc tggcaaaaag atcggtaaag ataaaggccg aatgaaattt 840
tgcgttgtta caggaatgat tctgttaacc ctttcgttta ttgccttgtg gtggaaccac 900
agtttttatt ttttatttgt ctttttaagc tttggcggga ttgggattgg aatggctctt 960
cctgctttag atgcattgat aaccgaaggg attgaaagtg aacaatgcgg aaccatttcc 1020
tccttttaca atagcatgcg ctttatagga gtagctctcg gtccacctgt ttttgctgca 1080
ttaatgtcta atgcaaactg gattattttc atactctcgg cgttttgcag catcgtttct 1140
ttatttttag tgctctttac tgtagatgct aaaaaaagtg aagaagaaaa aaacttaggg 1200
acggtctag 1209
<210> 49
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 针对谷氨酸棒杆菌密码子优化的ymfD BSU16825
<400> 49
atgaagaaca tcattgcgct gtcctctgtg ccactcgtta tgacccttgg caactctatg 60
ctgatccccg ttctccccat gatggagaag aaactctcag tcacttcgtt tcaggtgtcc 120
ctcatcatca ccgtgtattc tgtcgttgcc atcatctgca ttcccatcgc tggctacctt 180
tcagatcgct tcggtcgcaa gaagattctg ctcccttgct tgctgatcgc tggccttggc 240
ggagctgtcg cagcattcgc atctacgtac atgaagaacc cgtatgctat gatccttgcg 300
ggtcgtgtcc ttcaaggcat cggctctgct ggtgctgccc cgattgtaat gccgttcatt 360
ggtgacctct ttaagggcga tgatgagaaa gtatcagctg gcctgggaga tattgaaacc 420
gccaatacgt ccgggaaagt gcttagccca attctcggag cccttttggc tagctggtat 480
tggtttgtcc cgttttggtt catccctttc ttctgcctta tttccttcct tctggtgctc 540
tttctggtgg ccaaacctga agaggacgaa gatgccccag cagttagcga gttcatcaaa 600
tcggtcaaga aaatcttcaa gcaggatggc cgatggctgt acaccgtgtt catcatcggg 660
tgtgtcatta tgttccttct cttcggggta ctgttttacc tgagcgacac cctggaaaac 720
aagtacgcaa tcgacggtgt tgcgaagggt ggtttgctgg caattccact gctcttcctg 780
tccacatcct cctttatcgc tggtaagaaa atcggtaaag acaagggccg catgaagttt 840
tgcgttgtga ccggaatgat cctgctcaca ttgtccttca tcgcactgtg gtggaatcac 900
agcttctact tcttgttcgt gttcctgtct tttggcggaa tcggcattgg catggcgttg 960
cctgcgttgg atgccctcat taccgaaggg atcgaatcgg agcagtgtgg aaccatttcc 1020
tccttctaca actcaatgcg gttcatcgga gtcgctctgg gtccaccagt ctttgcagcc 1080
ctgatgtcca atgcgaactg gatcatcttt atcctgtcgg cattctgctc cattgtttcc 1140
ctgttcttgg tgctgttcac tgttgacgca aagaagtccg aagaggagaa gaacttgggc 1200
actgtttaa 1209
<210> 50
<211> 2180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 50
atgagcacga atccccatgt tttctcccta gatgtccgct atcacgagga tgcttctgca 60
ttgtttgccc acttgggtgg cacaaccgca gatgatgcag ccctgttgga attcgctgat 120
atcaccacca agaatggtat ttcttccctc gcggtgttga agagttcggt gcgcattacg 180
tgcacgggca acacggtggt aacgcagccg ctgacggact cgggtagggc agtggttgcg 240
cgcctaacgc agcagcttgg ccagtacaac accgcagaga acacctttag cttccccgcc 300
tcagatgcgg ttgatgagcg cgagcgcctc accgcaccaa gcaccatcga agtgctgcgc 360
aagttgcagt tcgagtccgg ctacagcgac gcgtccctgc cactgctcat gggcggtttc 420
gcgtttgatt tcttagaaac ctttgaaacg ctccccgctg tcgaggagag cgtcaacact 480
taccccgatt accagttcgt cctcgcggaa atcgtcctgg acatcaatca ccaggaccag 540
accgccaaac tcgccggcgt ctccaacgcc ccaggcgagc tcgaggccga gctcaacaag 600
ctttcattgc ttatcgacgc cgccctcccc gcaaccgaac acgcctacca aaccacccct 660
cacgacggcg acactcttcg cgttgtggct gatattcccg atgctcagtt ccgcacccag 720
atcaatgagc tgaaagaaaa catttacaac ggtgacatct accaagttgt cccggcgcgc 780
actttcaccg caccatgtcc tgatgcattc gctgcttatc tgcagctgcg tgccaccaac 840
ccgtcgccgt acatgttcta tatccgtggc ctcaacgaag gccgctccta tgaacttttt 900
ggcgcatccc ctgagtccaa cctcaagttc accgctgcta accgtgagct gcagctgtac 960
ccaatcgcag gtacccgccc ccgtggactc aacccagatg gctccatcaa cgatgagcta 1020
gatatccgca atgagttgga tatgcgcact gatgccaaag agatcgcgga gcacaccatg 1080
cttgtcgatc tcgcccgcaa cgacctggcc cgcgtctcgg tcccagcgtc gcgccgggtt 1140
gcggatcttt tgcaggtgga tcgctattcc cgcgtgatgc acttggtgtc ccgtgtgacg 1200
gcgacgttgg acccagagct tgatgctttg gacgcctatc gggcgtgcat gaatatgggc 1260
acgttgaccg gcgctccgaa gttgcgcgct atggagctgt tgcgcggcgt cgaaaagcgc 1320
aggcgtggtt cttatggtgg ggcagtgggg tacctgcgcg gcaatggcga tatggataat 1380
tgcattgtta ttcgttcggc gtttgtccag gatggtgtgg ctgctgtgca ggctggtgct 1440
ggtgtggtcc gcgattctaa tcctcaatct gaagccgatg agacgttgca caaggcgtat 1500
gccgtgttga atgccattgc gcttgctgct ggttccactt tggaggtcat ccgatgacac 1560
acgttgttct cattgataat cacgattctt ttgtctacaa cctggtggat gcgttcgccg 1620
tggccggtta taagtgcacg gtgttccgca atacggtgcc agtggaaacc attttggcag 1680
ccaacccgga cctgatctgc ctttcacctg gacctggtta ccctgccgat gcgggcaaca 1740
tgatggcgct gatcgagcgc acactcggcc agattccttt actgggtatt tgcctcggct 1800
accaggcact catcgaatac cacggcggca aggttgagcc ttgtggccct gtgcacggca 1860
ccaccgacaa catgatcctt actgatgcag gtgtgcagag ccctgttttt gcaggtcttg 1920
ccactgatgt tgagcctgat catccagaaa tcccaggccg caaggttcca attggccgtt 1980
atcactcact gggctgcgtg gttgccccag acggtattga atcactaggt acctgttcct 2040
cggagattgg tgatgtcatc atggcggcac gcaccaccga tggaaaggcc attggcctgc 2100
agtttcaccc tgagtcagtg ctaagcccaa cgggtcctgt cattttgtcc cgctgtgtcg 2160
aacagcttct cgcgaactaa 2180
<210> 51
<211> 2180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 51
atgagcacga atccccatgt tttctcccta gatgtccgct atcacgagga tgcttctgca 60
ttgtttgccc acttgggtgg cacaaccgca gatgatgcag ccctgttgga acgcgctgat 120
atcaccacca agaatggtat ttcttccctc gcggtgttga agagttcggt gcgcattacg 180
tgcacgggca acacggtggt aacgcagccg ctgacggact cgggtagggc agtggttgcg 240
cgcctaacgc agcagcttgg ccagtacaac accgcagaga acacctttag cttccccgcc 300
tcagatgcgg ttgatgagcg cgagcgcctc accgcaccaa gcaccatcga agtgctgcgc 360
aagttgcagt tcgagtccgg ctacagcgac gcgtccctgc cactgctcat gggcggtttc 420
gcgtttgatt tcttagaaac ctttgaaacg ctccccgctg tcgaggagag cgtcaacact 480
taccccgatt accagttcgt cctcgcggaa atcgtcctgg acatcaatca ccaggaccag 540
accgccaaac tcgccggcgt ctccaacgcc ccaggcgagc tcgaggccga gctcaacaag 600
ctttcattgc ttatcgacgc cgccctcccc gcaaccgaac acgcctacca aaccacccct 660
cacgacggcg acactcttcg cgttgtggct gatattcccg atgctcagtt ccgcacccag 720
atcaatgagc tgaaagaaaa catttacaac ggtgacatct accaagttgt cccggcgcgc 780
actttcaccg caccatgtcc tgatgcattc gctgcttatc tgcagctgcg tgccaccaac 840
ccgtcgccgt acatgttcta tatccgtggc ctcaacgaag gccgctccta tgaacttttt 900
ggcgcatccc ctgagtccaa cctcaagttc accgctgcta accgtgagct gcagctgtac 960
ccaatcgcag gtacccgccc ccgtggactc aacccagatg gctccatcaa cgatgagcta 1020
gatatccgca atgagttgga tatgcgcact gatgccaaag agatcgcgga gcacaccatg 1080
cttgtcgatc tcgcccgcaa cgacctggcc cgcgtctcgg tcccagcgtc gcgccgggtt 1140
gcggatcttt tgcaggtgga tcgctattcc cgcgtgatgc acttggtgtc ccgtgtgacg 1200
gcgacgttgg acccagagct tgatgctttg gacgcctatc gggcgtgcat gaatatgggc 1260
acgttgaccg gcgctccgaa gttgcgcgct atggagctgt tgcgcggcgt cgaaaagcgc 1320
aggcgtggtt cttatggtgg ggcagtgggg tacctgcgcg gcaatggcga tatggataat 1380
tgcattgtta ttcgttcggc gtttgtccag gatggtgtgg ctgctgtgca ggctggtgct 1440
ggtgtggtcc gcgattctaa tcctcaatct gaagccgatg agacgttgca caaggcgtat 1500
gccgtgttga atgccattgc gcttgctgct ggttccactt tggaggtcat ccgatgacac 1560
acgttgttct cattgataat cacgattctt ttgtctacaa cctggtggat gcgttcgccg 1620
tggccggtta taagtgcacg gtgttccgca atacggtgcc agtggaaacc attttggcag 1680
ccaacccgga cctgatctgc ctttcacctg gacctggtta ccctgccgat gcgggcaaca 1740
tgatggcgct gatcgagcgc acactcggcc agattccttt actgggtatt tgcctcggct 1800
accaggcact catcgaatac cacggcggca aggttgagcc ttgtggccct gtgcacggca 1860
ccaccgacaa catgatcctt actgatgcag gtgtgcagag ccctgttttt gcaggtcttg 1920
ccactgatgt tgagcctgat catccagaaa tcccaggccg caaggttcca attggccgtt 1980
atcactcact gggctgcgtg gttgccccag acggtattga atcactaggt acctgttcct 2040
cggagattgg tgatgtcatc atggcggcac gcaccaccga tggaaaggcc attggcctgc 2100
agtttcaccc tgagtcagtg ctaagcccaa cgggtcctgt cattttgtcc cgctgtgtcg 2160
aacagcttct cgcgaactaa 2180
<210> 52
<211> 2177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 52
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaattc 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagctt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcaca tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgaaatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagggatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tgatggctga cattctgctg ctcgataata tcgactcttt tacgtacaac ctggcagatc 1620
agttgcgcag caatgggcat aacgtggtga tttaccgcaa ccatattccg gcgcaaacct 1680
taattgaacg cctggcgacc atgagcaatc cggtgctgat gctttctcct ggccccggtg 1740
tgccgagcga agccggttgt atgccggaac tcctcacccg cttgcgtggc aagctgccca 1800
ttattggcat ttgcctcgga catcaggcga ttgtcgaagc ttacgggggc tatgtcggtc 1860
aggcgggcga aattctccac ggtaaagcct ccagcattga acatgacggt caggcgatgt 1920
ttgccggatt aacaaacccg ctgccggtgg cgcgttatca ctcgctggtt ggcagtaaca 1980
ttccggccgg tttaaccatc aacgcccatt ttaatggcat ggtgatggca gtacgtcacg 2040
atgcggatcg cgtttgtgga ttccagttcc atccggaatc cattctcacc acccagggcg 2100
ctcgcctgct ggaacaaacg ctggcctggg cgcagcagaa actagagcca gccaacacgc 2160
tgcaaccgat tctgtaa 2177
<210> 53
<211> 2177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 53
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaattc 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagctt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcaca tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgaaatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagggatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tgatggctga cattctgctg ctcgataata tcgactcttt tacgtacaac ctggcagatc 1620
agttgcgcag caatgggcat aacgtggtga tttaccgcaa ccatattccg gcgcaaacct 1680
taattgaacg cctggcgacc atgagcaatc cggtgctgat gctttctcct ggccccggtg 1740
tgccgagcga agccggttgt atgccggaac tcctcacccg cttgcgtggc aagctgccca 1800
ttattggcat ttgcctcgga catcaggcga ttgtcgaagc ttacgggggc tatgtcggtc 1860
aggcgggcga aattctccac ggtaaagcct ccagcattga acatgacggt caggcgatgt 1920
ttgccggatt aacaaacccg ctgccggtgg cgcgttatca ctcgctggtt ggcagtaaca 1980
ttccggccgg tttaaccatc aacgcccatt ttaatggcat ggtgatggca gtacgtcacg 2040
atgcggatcg cgtttgtgga ttccagttcc atccggaatc cattctcacc acccagggcg 2100
ctcgcctgct ggaacaaacg ctggcctggg cgcagcagaa actagagcca gccaacacgc 2160
tgcaaccgat tctgtaa 2177
<210> 54
<211> 2177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 54
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaatcc 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagctt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcaca tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttacgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgaaatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagggatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tgatggctga cattctgctg ctcgataata tcgactcttt tacgtacaac ctggcagatc 1620
agttgcgcag caatgggcat aacgtggtga tttaccgcaa ccatattccg gcgcaaacct 1680
taattgaacg cctggcgacc atgagcaatc cggtgctgat gctttctcct ggccccggtg 1740
tgccgagcga agccggttgt atgccggaac tcctcacccg cttgcgtggc aagctgccca 1800
ttattggcat ttgcctcgga catcaggcga ttgtcgaagc ttacgggggc tatgtcggtc 1860
aggcgggcga aattctccac ggtaaagcct ccagcattga acatgacggt caggcgatgt 1920
ttgccggatt aacaaacccg ctgccggtgg cgcgttatca ctcgctggtt ggcagtaaca 1980
ttccggccgg tttaaccatc aacgcccatt ttaatggcat ggtgatggca gtacgtcacg 2040
atgcggatcg cgtttgtgga ttccagttcc atccggaatc cattctcacc acccagggcg 2100
ctcgcctgct ggaacaaacg ctggcctggg cgcagcagaa actagagcca gccaacacgc 2160
tgcaaccgat tctgtaa 2177
<210> 55
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 55
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcacatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcaatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 56
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 56
atgagttctc cagtctcact cgaaaacgcg gcgtcaacca gcaacaagcg cgtcgtggct 60
ttccacgagc tgcctagccc tacagacctc atcgccgcaa acccactgac accaaagcag 120
gcttccaagg tggagcagga tcgccaggac atcgctgata tcttcgctgg cgacgatgac 180
cgcctcgttg tcgttgtggg accttgctca gttcacgatc ctgaagcagc catcgattac 240
gcaaaccgcc tggctccgct ggcaaagcgc cttgatcagg acctcaagat tgtcatgcgc 300
gtgtacttcg agaagcctcg caccatcgtc ggatggaagg gattgatcaa tgatcctcac 360
ctcaacgaaa cctacgacat cccagagggc ttgcgcattg cgcgcaaagt gcttatcgac 420
gttgtgaacc ttgatctccc agtcggctgc gaattcctcg aaccaaacag ccctcagtac 480
tacgccgaca ctgtcgcatg gggagcaatc ggcgctcgta ccaccgaatc tcaggtgcac 540
cgccagctgg cttctgggat gtgtatgcca attggtttca agaacggaac tgacggaaac 600
atccaggttg cagtcgacgc ggtacaggct gcccagaacc cacacttctt cttcggaacc 660
tccgacgacg gcgcgctgag cgtcgtggag accgcaggca acagcaactc ccacatcatt 720
ttgcgcggcg gtacctccgg cccgaatcat gatgcagctt cggtggaggc cgtcgtcgag 780
aagcttggtg aaaacgctcg tctcatgatc gatgcttccc atgctaactc cggcaaggat 840
catatccgac aggttgaggt tgttcgtgaa atcgcagagc agatttctgg cggttctgaa 900
gctgtggctg gaatcatgat tgagtccttc ctcgttggtg gcgcacagaa ccttgatcct 960
gcgaaattgc gcatcaatgg cggtgaaggc ctggtgtacg gacagtctgt gaccgataag 1020
tgcatcgata ttgacaccac catcgatttg ctcgctgagc tggccgcagc agtaagggaa 1080
cgccgagcag cagccaagta a 1101
<210> 57
<211> 1089
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 57
atggagagga ttgtcgttac tctcggggaa cgtagttacc caattaccat cgcatctggt 60
ttgtttaatg aaccagcttc attcttaccg ctgaaatcgg gcgagcaggt catgttggtc 120
accaacgaaa ccctggctcc tctgtatctc gataaggtcc gcggcgtact tgaacaggcg 180
ggtgttaacg tcgatagcgt tatcctccct gacggcgagc agtataaaag cctggctgta 240
ctcgataccg tctttacggc gttgttacaa aaaccgcatg gtcgcgatac tacgctggtg 300
gcgcttggcg gcggcgtagt gggcgatctg accggcttcg cggcggcgag ttatcagcgc 360
ggtgtccgtt tcattcaagt cccgacgacg ttactgtcgc aggtcgattc ctccgttggc 420
ggcaaaactg cggtcaacca tcccctcggt aaaaacatga ttggcgcgtt ctaccaacct 480
gcttcagtgg tggtggatct cgactgtctg aaaacgcttc ccccgcgtga gttagcgtcg 540
gggctggcag aagtcatcaa atacggcatt attcttgacg gtgcgttttt taactggctg 600
gaagagaatc tggatgcgtt gttgcgtctg gacggtccgg caatggcgta ctgtattcgc 660
cgttgttgtg aactgaaggc agaagttgtc gccgccgacg agcgcgaaac cgggttacgt 720
gctttactga atctgggaca cacctttggt catgccattg aagctgaaat ggggtatggc 780
aattggttac atggtgaagc ggtcgctgcg ggtatggtga tggcggcgcg gacgtcggaa 840
cgtctcgggc agtttagttc tgccgaaacg cagcgtatta taaccctgct caagcgggct 900
gggttaccgg tcaatgggcc gcgcgaaatg tccgcgcagg cgtatttacc gcacatgctg 960
cgtgacaaga aagtccttgc gggagagatg cgcttaattc ttccgttggc aattggtaag 1020
agtgaagttc gcagcggcgt ttcgcacgag cttgttctta acgccattgc cgattgtcaa 1080
tcagcgtaa 1089
<210> 58
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 58
atgagcgcag tgcagatttt caacaccgtc cacgtcaatg gatcttcccc ctatgatgtc 60
cacattggtt ccggcctcaa cgagctcatt gttcagcgcg cagcggaatc aggcgcggag 120
caggtagcga ttttgcacca gcccagcatg gatgacattg catccgagtt ggatgcagca 180
ctagtcgctg ctggtttgaa ggtcctgcac cttaatgttc ccgatgcgga aaacggcaag 240
tccttggaag tagcggggca gtgctgggat gaattgggtg gcgcagcatt cggccgccgc 300
gatatcgtca tcggacttgg tggcggtgct gccacagacc tcgcgggatt cgtcgctgct 360
gcatggatgc gtggcgtgcg cgtcattcag gttccaacca ccttgttggc tatggtggac 420
gctgcggtgg gcggcaagac tggcatcaat accgccgcag gcaagaacct tgtgggcgcg 480
ttccacgagc ctgacgcagt attcattgac accgatcgcc tagccaccct gcctgacgcg 540
gaaatcatcg cgggttccgc cgaaatcatc aaaactggtt tcatcgccga cccagaaatc 600
ctgcgccttt acgaaactga tcccgcagcc tgcctgaaga aagaagtcga aggctcccac 660
ctacctgaac tgatttggcg ctccgtcacc gtcaagggct ccgtggtcgg ccaagacctc 720
aaagaatcta gcctgcgcga aatcctcaac tacggacaca cctttgccca cgccgtcgaa 780
ctccgcgaaa acttccgctg gcgccacggc aatgccgttg cagtgggcat gatgttcatc 840
gccaacctct cccacaagct cgggcttatc gacgcgcccc tcctcgagcg ccaccgctca 900
atcctggcgg ccatcggtct gcccacttcc tacgaaggcg gagccttcga cgagctttac 960
gacggtatga cccgcgacaa gaaaaaccgc gacggcaaca tccgcttcgt cgcactgacc 1020
gccgtgggcg aggttacccg cattgagggg ccctcaaaac aagatttaca gagtgcttat 1080
gaggcaatca gccactaa 1098
<210> 59
<211> 525
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 59
atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac ggtcggaatg 60
gcccttgccg attcgcttaa ccgtcggttt gtcgataccg atcagtggtt gcaatcacag 120
ctcaatatga cggtcgcgga gatcgtcgaa agggaagagt gggcgggatt tcgcgccaga 180
gaaacggcgg cgctggaagc ggtaactgcg ccatccaccg ttatcgctac aggcggcggc 240
attattctga cggaatttaa tcgtcacttc atgcaaaata acgggatcgt ggtttatttg 300
tgtgcgccag tatcagtcct ggttaaccga ctgcaagctg caccggaaga agatttacgg 360
ccaaccttaa cgggaaaacc gctgagcgaa gaagttcagg aagtgctgga agaacgcgat 420
gcgctatatc gcgaagttgc gcatattatc atcgacgcaa caaacgaacc cagccaggtg 480
atttctgaaa ttcgcagcgc cctggcacag acgatcaatt gttga 525
<210> 60
<211> 573
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 60
atggagcgta atgaagtgaa tgatcaaatt cacttagatc atcaatcaga tgacacctct 60
gaatgctcct gcccgatcgt ggttcttgtg ggtttgccag gagctggaaa atccaccatt 120
ggacgtcgat tagcgcgcgc cttaaacact gaactcgtcg actccgacga actgattgag 180
cgcgccaccg gaaaagcctg tggcgccgtg ttcagcgagc tcggcgagcc agccttccgc 240
gagctcgagg ccatccacgt ggccgaagca ctgaaatcct ccggagtggt gagcttggga 300
ggcggatctg tgctgacaga atccacccgt gaactgctca aaggccagga cgtggtctgg 360
atcgacgtgc cagtagaaga aggcatcagg cgcaccgcaa acgagcgttc ccgccccgtg 420
ctgcaagccg ccgaccccgc cgagcactac cgcaacctgg tgaaagtgcg caccccgttg 480
tacgaagagg tggcaaccta ccgacttcgc accaacaacc gcagccccca gcaagtggtg 540
gcagcagtgt tgcatcatct agaaatcgat taa 573
<210> 61
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 61
gtggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60
gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120
agcttcgatg cagatacaat cgaagaaggt ctcgcattcg acggctcctc gatccgtggc 180
ttcaccacga tcgacgaatc tgacatgaat ctcctgccag acctcggaac ggccaccctt 240
gatccattcc gcaaggcaaa gaccctgaac gttaagttct tcgttcacga tcctttcacc 300
cgcgaggcat tctcccgcga cccacgcaac gtggcacgca aggcagagca gtacctggca 360
tccaccggca ttgcagacac ctgcaacttc ggcgccgagg ctgagttcta cctcttcgac 420
tccgttcgct actccaccga gatgaactcc ggcttctacg aagtagatac cgaagaaggc 480
tggtggaacc gtggcaagga aaccaacctc gacggcaccc caaacctggg cgcaaagaac 540
cgcgtcaagg gtggctactt cccagtagca ccatacgacc aaaccgttga cgtgcgcgat 600
gacatggttc gcaacctcgc agcttccggc ttcgctcttg agcgtttcca ccacgaagtc 660
ggtggcggac agcaggaaat caactaccgc ttcaacacca tgctccacgc ggcagatgat 720
atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780
ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840
tggaaggacg gcaagccact cttccacgat gagtccggct acgcaggcct gtccgacatc 900
gcccgctact acatcggcgg catcctgcac cacgcaggcg ctgttctggc gttcaccaac 960
gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt ccaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020
tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc aaacccgaag 1080
gcaaagcgca tcgaattccg cgctccagac ccatcaggca acccatacct gggctttgca 1140
gcgatgatga tggccggcct cgacggcatc aagaaccgca tcgagccaca cgctccagtg 1200
gacaaggacc tctacgaact accaccagag gaagctgcat ccattccaca ggcaccaacc 1260
tccctggaag catccctgaa ggcactgcag gaagacaccg acttcctcac cgagtctgac 1320
gtcttcaccg aggatctcat cgaggcgtac atccagtaca agtacgacaa cgaaatctcc 1380
ccagttcgcc tgcgcccaac cccgcaggaa ttcgaattgt acttcgactg ctaa 1434
<210> 62
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 62
atgaacagcg aacaggaatt tgtactcagc gccattgaag aacgcgacat taagtttgtg 60
cgtctatggt tcactgacat tcttggccac ttgaagtcag tggttgtggc tcctgcagaa 120
ctagagtctg cgttggaaga aggcatcgga ttcgatggct cagccattga gggctacgcg 180
cgtatctcgg aagcggacac cattgcccgc ccagatccat cgacattcca ggtcctccca 240
ctagaagcgg gcatctcaaa actgcaggca gcacgcctgt tttgcgatgt cacgatgcca 300
gacggacagc catctttttc tgacccgcgc caagtgctgc gcaggcaggt ccaactagct 360
gcagatgaag gcttgacctg catgatctca ccagagattg agttctattt ggtgcaaagc 420
cttcgcacca acggactgcc acctgtgccc actgacaacg gcggatattt cgaccaagcc 480
acattcaatg aggcgccgaa tttccgtcga aacgcgatgg tagcgctgga ggaactcggc 540
atccctgtcg agttctccca ccatgaaact gcacctggcc agcaagaaat cgatttacgc 600
catgcggatg cgctcactat ggccgacaac atcatgacct tccgctacat catgaaacag 660
gtggcaaggg accaaggcgt cggggcatca tttatgccca agccattcca agaacatgca 720
ggctccgcca tgcacacgca catgtcctta tttgagggcg ataccaacgc gttccacgat 780
ccagacgatt cttacatgct gtccaaaacc gcaaaacagt tcatcgctgg aatcttgcat 840
cacgctccag aattcaccgc tgtgaccaac cagtgggtca attcctacaa acgcatcgtg 900
tacggaaacg aagctccaac tgcggcaacc tggggtgtat ctaatcgttc tgcgctggtt 960
cgtgttccta cctaccgttt gaataaggag gagtcgcgcc gggtggaggt gcgtcttcct 1020
gataccgctt gtaacccata tttggcgttt tcagtgatgc tcggcgctgg tttgaaaggc 1080
attaaagaag gttatgagct cgacgagcca gctgaggacg atatctccaa cttgagcttc 1140
cgggaacgtc gcgctatggg ctacaacgat ctgccaagca gccttgatca ggcactgcgc 1200
caaatggaaa agtcagagct tgttgctgac atcctcggtg agcacgtttt tgagtttttc 1260
ttgcgcaata agtggcgtga atggcgtgac taccaagagc agatcactcc gtgggagctc 1320
cgaaacaatc ttgattacta g 1341
<210> 63
<211> 1880
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 63
atggatatca agagtgcgtt gagccgtatc gtcgggcagt tggacctgac taccgaagaa 60
atgcgcgagg tcatgcgcca gatcatgacc ggtcagtgca gcgaggcgca gataggcgct 120
ttcctgatgg gcatgcgcat gaaaagcgaa agcatcgacg aaatcgtcgg tgcggtgtcg 180
gtgatgcgtg agctggccga aaaggtcgag ctgcaaagcc tcgatggtgt cgtcgatatt 240
gtcgggaccg gtggtgatgg cgccaacatc ttcaacgtgt ccaccgcttc gtccttcgtc 300
ctggcggcgg cgggttgccc ggtggccaag catggtaacc gcgcagtctc gggcaagagc 360
ggcagtgccg acctgctgga agctgccggc atctacctga acctgacgcc aactcaagtg 420
gcacgctgca tcgacagcct gggcatcggc ttcatgttcg cgcaaagtca ccactcggcc 480
atgaaacatg ccgctggccc acgtcgagaa ctggggttgc gcaccctgtt caatatgctc 540
ggcccgctta cgaatccggc cggagtgaag caccaggtgg tcggtgtgtt cgcgcaaacc 600
ctttgccgcc cgctggctga ggtgctgcag cgcctgggga gcaagcatgt gctggtcgtg 660
cactcgaagg atggtctgga cgagttcagc ctggctgcac ccaccttcgt cgccgaactg 720
aaaaatgacg aaatcactga atattgggtc gagccggaag acctcggcat gaagagtcag 780
agccttcatg gcctggctgt cgagagcccg caggcttcgc tggagttgat ccgcgatgcg 840
ctgggccggc gcaagaccga gaacggtcag aaggccgccg agatgatcgt gcttaatgct 900
ggcgcggcac tgtatgcagc cgaccatgcc atgagcctga aagccggtgt agaactggcc 960
catgatgtac tgcacaccgg cctggcctgg gaaaagctgc aggaattggg tgcctttact 1020
gcagtattca aggtggagaa cgaagcatga gtgtgccgac ggtgctggaa aggatcattg 1080
cccgcaagtt tcaggaagtg gccgagcgca gtgcgcacgt cagcctcgcc gaactggagg 1140
gcctggccaa ggccgctgac gccccgcgag gcttcgccaa cgcgctgatc gagcaggcca 1200
agcgcaagca gcccgcggtg attgccgaaa tcaagaaagc ttcgccaagc aagggcgtga 1260
tccgcgagca cttcgtgcca gcggaaatcg cggtcagcta cgagaagggc ggggccacct 1320
gcctgtcggt gttgaccgat gtcgattatt tccagggtgc cgatgagtac ttgcagcagg 1380
cccgcgcggc ggtttcgctg ccggtgatcc gcaaggactt catggtcgac ccttaccaga 1440
tcgtcgaagc ccgggccctg ggggcagatt gcgtactgct gatcgtgtcg gcgctggatg 1500
acgtgaagat ggctgaactg gccgccactg ccaaggacgt cggcctcgac gtgctggtgg 1560
aagtgcacga tggcgatgaa ctggagcgcg cgctgaaaac cctggatacg ccgctggtgg 1620
gggtgaacaa ccgcaacctg cacaccttcg aggtcagcct ggaaaccacc cttgacctgc 1680
tgccgcgcat tccgcgtgac cgtctggcga ttaccgaaag cggtattctc aaccgggccg 1740
atgtggagct gatggcaatc aacgaggttt actcgttcct ggtgggtgag gcgttcatgc 1800
gcgccgagca gcctggcctg gaattacagc ggctgttctt ccccgagcag gtgaagaaga 1860
ctgttcagca actggactga 1880
<210> 64
<211> 1104
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 64
atggctgaca tgtccgaaca ggagctcaag gcgctgcgcg tacgcatcga cagcctcgac 60
gagaaaattc tcgagctgat cagcgaccgc gcccgctgcg ccgaagaagt ggcccgggtc 120
aagactgcct cgctgaaaga aggcgagaag ccggtgttct accgtcccga gcgtgaagct 180
gcggtgctca agcgcgtgat ggaacgcaac aagggcccgc tgggcaacga agagatggcg 240
cggctgttcc gcgaaatcat gtcgtcgtgc ctggccctgg aagagccgct gaaaatcgcc 300
tacctcggcc ctgaaggtac cttcacccag gcggcggcca tgaagcactt cggccacgcg 360
gtgatcagtc ggccgatggc ggccatcgac gaagtgttcc gtgaagtggc ggccggtgcc 420
gtcaacttcg gtgtggtgcc ggtggaaaac tccactgaag gtgcggtcag ccacaccctg 480
gacagcttcc tcgagcatga catggtgatt tgcggtgagg tcgagctgcg tatccaccac 540
cacctgctgg tgggcgagaa caccaagacc gacagcatca cccgcatcta ctcccacgcc 600
cagtcgctgg cccagtgccg aaagtggctg gacgctcact acccgaacgt ggagcgcgtg 660
gccgtttcga gcaatgccga agcggccaag cgggtcaagg gtgagtggaa ctcggcggcg 720
atcgccggcg atatggcggc caacctgtac ggcctgaccc gtctggccga gaagatcgaa 780
gaccgcccgg acaactccac gcgcttcctg atgatcggta accaggaagt accgccgacc 840
ggcgacgaca agacctcgat catcgtttcg atgagcaaca agccaggtgc gttgcatgag 900
ttgctggtgc cgttctatca gaacggcatc gacctgaccc gcatcgagac ccgcccgtcg 960
cgcagcggca agtggaccta cgtgttcttc atcgacttcg tcggccacca ccgcgacccg 1020
ctgatcaagg cggtgctcga gcagatcagc caggaggctg tggcgctgaa ggtgctgggc 1080
tcttatccga aggcggtgct ttga 1104
<210> 65
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
atggctga 8
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
tatgccgtgt tgaatgccat t 21
<210> 67
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
cccgggatcc actaaactta aacacagtgt tgctggagaa gtcat 45
<210> 68
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
tgtttaagtt tagtggatcc cggggaaaag gagtcttcca atgactag 48
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
ccagatcgac gttttcctgg c 21
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
gccctgcagg taaaaaaagg atttgattca tgacttctcc agcaacactg 50
<210> 71
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
gccctgcagg taaaaaaagg atttgattcg tgacttctcc agcaacactg 50
<210> 72
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
gccctgcagg taaaaaaagg atttgattct tgacttctcc agcaacactg 50
<210> 73
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
gccctgcagg taaaaaaagg attatgactt ctccagcaac actg 44
<210> 74
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
gccctgcagg taaaaaaagg attatgactt ctccagcaac actg 44
<210> 75
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 75
gccctgcagg taaaaaaagg attttgactt ctccagcaac actg 44
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 76
cccgggatcc ctagtcattg gaagactcct t 31
<210> 77
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 77
aatccttttt ttacctgcag ggcttagttc gcgagaagct gttcg 45
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 78
aaggagtctt ccaatgacta g 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 79
gtctccccaa tcaaatcatc a 21
<210> 80
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 80
cccgggatcc actaaactta aacagtcacc tgcattagtc at 42
<210> 81
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 81
tgtttaagtt tagtggatcc cgggcgcgga aaactcggat aa 42
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 82
tgatgatgtg cccgtccaca g 21
<210> 83
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 83
gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgca tgactaatgc aggtgac 47
<210> 84
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 84
gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgcg tgactaatgc aggtgac 47
<210> 85
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 85
gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgct tgactaatgc aggtgac 47
<210> 86
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 86
gccctgcagg acgtggcaga atagatgact aatgcaggtg ac 42
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 87
gccctgcagg acgtggcaga ataggtgact aatgcaggtg ac 42
<210> 88
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 88
gccctgcagg acgtggcaga atagttgact aatgcaggtg ac 42
<210> 89
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 89
cccgggatcc ttatccgagt tttccgcgtc c 31
<210> 90
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 90
aatccttttt ttacctgcag ggcttagttc gcgagaagct gttcg 45
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 91
aaggagtctt ccaatgacta g 21
<210> 92
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列, 合成的
<400> 92
agccctgcag g 11
<210> 93
<211> 525
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 93
atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac ggtcggaatg 60
gcccttgccg attcgcttaa ccgtcggttt gtcgataccg atcagtggtt gcaatcacag 120
ctcaatatga cggtcgcgga gatcgtcgaa agggaagagt gggcgggatt tcgcgccaga 180
gaaacggcgg cgctggaagc ggtaactgcg ccatccaccg ttatcgctac aggcggcggc 240
attattctga cggaatttaa tcgtcacttc atgcaaaata acgggatcgt ggtttatttg 300
tgtgcgccag tatcagtcct ggttaaccga ctgcaagctg caccggaaga agatttacgg 360
ccaaccttaa cgggaaaacc gctgagcgaa gaagttcagg aagtgctgga agaacgcgat 420
gcgctatatc gcgaagttgc gcatattatc atcgacgcaa caaacgaacc cagccaggtg 480
atttctgaaa ttcgcagcgc cctggcacag acgatcaatt gttga 525
<210> 94
<211> 573
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 94
atggagcgta atgaagtgaa tgatcaaatt cacttagatc atcaatcaga tgacacctct 60
gaatgctcct gcccgatcgt ggttcttgtg ggtttgccag gagctggaaa atccaccatt 120
ggacgtcgat tagcgcgcgc cttaaacact gaactcgtcg actccgacga actgattgag 180
cgcgccaccg gaaaagcctg tggcgccgtg ttcagcgagc tcggcgagcc agccttccgc 240
gagctcgagg ccatccacgt ggccgaagca ctgaaatcct ccggagtggt gagcttggga 300
ggcggatctg tgctgacaga atccacccgt gaactgctca aaggccagga cgtggtctgg 360
atcgacgtgc cagtagaaga aggcatcagg cgcaccgcaa acgagcgttc ccgccccgtg 420
ctgcaagccg ccgaccccgc cgagcactac cgcaacctgg tgaaagtgcg caccccgttg 480
tacgaagagg tggcaaccta ccgacttcgc accaacaacc gcagccccca gcaagtggtg 540
gcagcagtgt tgcatcatct agaaatcgat taa 573
<210> 95
<211> 1434
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 95
gtggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60
gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120
agcttcgatg cagatacaat cgaagaaggt ctcgcattcg acggatcctc gatccgtggc 180
ttcaccacga tcgacgaatc tgacatgaat ctcctgccag acctcggaac ggccaccctt 240
gatccattcc gcaaggcaaa gaccctgaac gttaagttct tcgttcacga tcctttcacc 300
cgcgaggcat tctcccgcga cccacgcaac gtggcacgca aggcagagca gtacctggca 360
tccaccggca ttgcagacac ctgcaacttc ggcgccgagg ctgagttcta cctcttcgac 420
tccgttcgct actccaccga gatgaactcc ggcttctacg aagtagatac cgaagaaggc 480
tggtggaacc gtggcaagga aaccaacctc gacggcaccc caaacctggg cgcaaagaac 540
cgcgtcaagg gtggctactt cccagtagca ccatacgacc aaaccgttga cgtgcgcgat 600
gacatggttc gcaacctcgc agcttccggc ttcgctcttg agcgtttcca ccacgaagtc 660
ggtggcggac agcaggaaat caactaccgc ttcaacacca tgctccacgc ggcagatgat 720
atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780
ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840
tggaaggacg gcaagccact cttccacgat gagtccggct acgcaggcct gtccgacatc 900
gcccgctact acatcggcgg catcctgcac cacgcaggcg ctgttctggc gttcaccaac 960
gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt ccaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020
tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc caacccgaag 1080
gcaaagcgca tcgaattccg cgctccagac ccatcaggca acccatacct gggctttgca 1140
gcgatgatga tggccggcct cgacggcatc aagaaccgca tcgagccaca cgctccagtg 1200
gacaaggacc tctacgaact accaccagag gaagctgcat ccattccaca ggcaccaacc 1260
tccctggaag catccctgaa ggcactgcag gaagacaccg acttcctcac cgagtctgac 1320
gtcttcaccg aggatctcat cgaggcgtac atccagtaca agtacgacaa cgagatctcc 1380
ccagttcgcc tgcgcccaac cccgcaggaa ttcgaattgt acttcgactg ctaa 1434
<210> 96
<211> 1857
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 96
atgcgtacat ccattgccac tgtttgtttg tccggaactc ttgctgaaaa gctgcgcgca 60
gctgcagatg ctggatttga tggtgtggaa atcttcgagc aggacttggt ggtttccccg 120
cattcggcag agcagattcg tcagcgggct caggatttgg gattaaccct ggatctgttc 180
cagccgtttc gagatttcga aggtgtggaa gaagagcagt ttctgaagaa tctgcaccgc 240
ttggaagaga agttcaagct gatgaacagg cttggcattg agatgatctt gttgtgttcc 300
aatgtgggca ccgcgaccat caatgatgat gaccttttcg tggagcagtt gcatcgtgca 360
gcagatttgg ctgagaagta caacgtcaag attgcttatg aagcgttggc gtggggcaag 420
tttgtcaatg attttgagca tgcgcatgca cttgtggaga aggtgaatca caaggcgctg 480
ggaacctgct tggatacgtt ccatattctt tcccgtggtt gggaaaccga cgaggtggaa 540
aacatcccgg cggagaagat tttctttgtt cagttggcgg atgcaccgaa gctgagcatg 600
gacattttgt cctggtcgcg tcaccaccgt gttttccctg gtgaaggcga tttcgatctg 660
gtgaaattca tggttcatct ggccaagacg ggttatgatg gcccgatttc tttggaaatc 720
ttcaacgatt ccttccgcaa ggccgaggtt ggtcgcaccg cgattgatgg gttgcgttct 780
ttgcgttggt tggaagatca gacctggcat gcgctaaatg ctgaggatcg tccaagcgca 840
ctagagctgc gtgcacttcc tgaggtcgcg gaacctgaag gcgttgattt cattgagatc 900
gccactggac gtttgggtga gaccattcgg gttcttcatc aattgggttt ccgcttgggt 960
ggtcatcact gcagtaagca ggattaccag gtatggaccc agggcgatgt gcgcattgtg 1020
gtgtgtgatc gtggggccac cggggctcca accacgatct ctgcgatggg ctttgacacc 1080
cctgatccag aagccgcgca tgcccgtgcg gaattgctgc gggctcagac aattgatcgt 1140
ccccacatcg agggtgaagt tgaccttaaa ggtgtgtacg cgccggatgg ggtggagctg 1200
tttttcgcgg ggccgagccc cgatggaatg cccgagtggc tgccggagtt cggcgtcgaa 1260
aagcaagaag ctggtctcat tgaagccatc gaccacgtca atttcgccca gccgtggcaa 1320
cattttgatg aggcagtgct gttttacacc gcgctgatgg cgttagagac tgtgcgtgag 1380
gatgagttcc cgagcccaat tggtttggtg cgcaatcagg tgatgcgttc gccgaatgat 1440
gcggtgcggt tgctgctcag cgtggcgccg gaggacggtg agcagggaga tttcctcaac 1500
gcggcctacc cggagcacat tgcgttggcc acggcggaca tcgtggcggt ggctgaacgt 1560
gcgcgcaaac gaggcctgga tttcttgccc gtcccagaga attactacga cgatgtgcag 1620
gcgcgttttg atttgccgca ggagttcttg gacacactca aggaaaacca cctgctttac 1680
gactgcgacg agaacggcga gttcctccac ttttacaccc gcacgttggg cacgctgttc 1740
ttcgaagtgg tggaacgccg cggcggtttt gcaggttggg gcgaaacaaa cgctccggtg 1800
cggttagcgg cgcagtatcg tgaggtgcgg gacctcgagc ggggaatccc caactag 1857
<210> 97
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
ttagaggaga caccatatgg cgtttgaaac cccggaaga 39
<210> 98
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-glnA-2
<400> 98
gaaccatggg ctagcctcga gttagcagtc gaagtacaat tc 42
<210> 99
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-aroL-1
<400> 99
ggccctgcag ggaaaggagg cccttcagat gacacaacct ctttttctga 50
<210> 100
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-aroL-2
<400> 100
cccgggatcc tcaacaattg atcgtctgtg c 31
<210> 101
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-aroK-1
<400> 101
ggccctgcag ggaaaggagg cccttcagat gaatgatcaa attcacttag 50
<210> 102
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-aroK-2
<400> 102
cccgggatcc ttaatcgatt tctagatgat gc 32
<210> 103
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 JK038f
<400> 103
attcgagctc ggtacccggg gatccactac atcgaaaccg gcatc 45
<210> 104
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 JK039r
<400> 104
ctgaactcga gtcagccatg ctccttctc 29
<210> 105
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 JK040f
<400> 105
gcatggctga ctcgagttca ggggccttgg ggct 34
<210> 106
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 JK041r
<400> 106
tagaagcttg catgcctgca ggcagtgagt cgaccaggcc aaag 44
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ko-csm-1
<400> 107
cttgccgacg agcgtagaaa t 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ko-csm-2
<400> 108
gttgaggact accttgactt g 21
<210> 109
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-aroG-1
<400> 109
gccctgcagg agatctgaaa ggaggccctt cagatgaatt atcagaacga cgat 54
<210> 110
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 Ex-aroG-2
<400> 110
cccgggatcc ttacccgcga cgcgctttta c 31

Claims (24)

1.重组微生物宿主细胞，其能够将包含可发酵碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐。
2.权利要求1的重组微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞选自细菌、酵母和真菌，其中所述细菌优选为大肠杆菌（Escherichia coli）菌株、棒杆菌（Corynebacterium）菌株或假单胞菌（Pseudomonas）菌株，且其中所述棒杆菌菌株优选为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），更优选为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，且其中所述假单胞菌菌株优选为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），更优选为恶臭假单胞菌KT2440。
3.权利要求1或权利要求2的重组微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞为谷氨酸棒杆菌，优选为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，其中所述谷氨酸棒杆菌包含编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的trpD基因(SEQ ID NO: 1)的遗传修饰，其中所述遗传修饰优选自SEQID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8，且其中所述遗传修饰具有降低trpD基因表达的作用。
4.权利要求1至3的重组微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞为谷氨酸棒杆菌，优选为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，其中所述谷氨酸棒杆菌包含编码分支酸变位酶的csm基因(SEQ ID NO: 9)的遗传修饰，其中所述遗传修饰优选自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO:16，且其中所述遗传修饰具有降低csm基因表达的作用。
5.权利要求2至4的重组微生物宿主细胞，其中所述谷氨酸棒杆菌微生物宿主细胞还包含选自以下的一个或多个缺失：hpr (SEQ ID NO:17或SEQ ID NO: 18)、ptsG (SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)、pepco (SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22)、pyk (SEQ ID NO: 23或SEQID NO: 24)和gpi (SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 28)。
6.权利要求2至5的重组微生物宿主细胞，其中所述谷氨酸棒杆菌微生物宿主细胞还过表达选自以下的一个或多个基因：galP (SEQ ID NO: 30)、iolT2 (SEQ ID NO: 31)、ppgk(SEQ ID NO: 32)、pps (SEQ ID NO: 33-35)、ppk (SEQ ID NO: 36)、zwf1 (SEQ ID NO:37)、opcA (SEQ ID NO: 38-39)、tktCG (SEQ ID NO: 40)、tktEC(SEQ ID NO: 41)、talCG(SEQ ID NO: 42)、talEC (SEQ ID NO: 43)、qsuA(SEQ ID NO: 96)、trpEG S38F (SEQ ID NO:50)、trpEG S33R (SEQ ID NO: 51)、trpEG S40R (SEQ ID NO: 52)、trpEG S40F (SEQ ID NO:53)、aroG D146N (SEQ ID NO: 55)、aroL (SEQ ID NO: 93)、aroK (SEQ ID NO: 94) 和glnA(SEQ ID NO: 95)。
7.权利要求1或权利要求2的重组微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞为恶臭假单胞菌，优选恶臭假单胞菌KT2440，其中所述恶臭假单胞菌包含编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的trpDC基因(SEQ ID NO: 63和SEQ ID NO: 65)的缺失、或编码分支酸变位酶的pheA基因(SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 65)的缺失、或两者皆有。
8.权利要求1至2和7的重组微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞为恶臭假单胞菌，优选恶臭假单胞菌KT2440，其中所述恶臭假单胞菌过表达选自以下的一个或多个基因：trpEG S40F (SEQ ID NO: 53)和aroG D146N (SEQ ID NO: 55)。
9.权利要求6或8的重组微生物宿主细胞，其中所述一个或多个过表达的基因通过质粒转化或通过染色体转化被整合入所述谷氨酸棒杆菌微生物宿主细胞或所述恶臭假单胞菌微生物宿主细胞。
10.权利要求1至9的重组微生物宿主细胞，其中所述原料选自甜菜、甘蔗、含淀粉的植物，优选玉米、小麦和黑麦，以及木质纤维素，优选麦秸、木材和甘蔗渣，甘油和C1-化合物，优选CO。
11.权利要求1至10的重组微生物宿主细胞，其中所述可发酵的碳底物选自C-5单糖、C-6单糖、 二糖和三糖，其中所述C-5 单糖优选为木糖和阿拉伯糖，且其中所述C-6单糖优选为葡萄糖、果糖或甘露糖，且其中所述二糖优选为蔗糖，且其中所述三糖优选为蔗果三糖。
12.生产苯胺的方法，其包括步骤：
a) 使用权利要求1至10中任一项的重组微生物宿主细胞，通过发酵包含至少一种可发酵的碳底物的原料来生产邻氨基苯甲酸和/或盐，所述重组微生物宿主细胞能够将所述包含至少一种可发酵的碳底物的原料生物转化为邻氨基苯甲酸和/或盐，其中所述邻氨基苯甲酸和/或盐包含邻氨基苯甲酸阴离子，
b） 通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸，
c） 通过沉淀或通过溶解于有机溶剂回收所述邻氨基苯甲酸，以及
d) 通过在有机溶剂中的热脱羧反应将所述邻氨基苯甲酸转化为苯胺。
13.权利要求12的方法，其中所述步骤a）的发酵为分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。
14.权利要求12或13的方法，其中至少步骤a）和步骤b）连续运行。
15.权利要求12至14的方法，其中所述重组微生物宿主在进行将所述邻氨基苯甲酸和/或盐从所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸的步骤b）之前被去除，其中所述经去除的重组微生物宿主优选地被再补料至步骤a）的发酵中。
16.权利要求12至15的方法，其中步骤b）的所述酸质子化通过添加HCl，优选至2.5-4.5的pH，更优选至3-4的pH来完成。
17.权利要求12至16的方法，其中在步骤c）中，所述通过沉淀回收所述邻氨基苯甲酸包括过滤，从而生成包含所述经回收的邻氨基苯甲酸的浆料，其中所述包含所述经回收的邻氨基苯甲酸的浆料优选溶解于有机溶剂，其中所述有机溶剂优选为苯胺或1-十二烷醇或其混合物。
18.权利要求12至17的方法，其中在步骤c）中，通过将所述邻氨基苯甲酸溶解于有机溶剂的所述回收包括添加所述有机溶剂，优选苯胺或1-十二烷醇或其混合物至所述邻氨基苯甲酸，使得所述邻氨基苯甲酸作为所述有机溶剂中的溶质回收。
19.权利要求12至18的方法，其中步骤c）之后是在进行步骤d）的热脱羧前洗涤和干燥经回收的邻氨基苯甲酸沉淀物。
20.权利要求12至19的方法，其中步骤d）在催化剂存在的情况下进行，其中所述催化剂优选为沸石催化剂，其中所述沸石催化剂优选为沸石H-Y，且其中所述热脱羧步骤d）优选后接纯化苯胺优选通过蒸馏的另外的步骤e）。
21.权利要求12至20的方法，其中步骤c）之后，残余的邻氨基苯甲酸阴离子通过吸附至离子交换树脂或活性炭材料或沸石，优选用Fe3+或Ca2+修饰的沸石，优选Fe-Y沸石，来回收，随后为经回收的邻氨基苯甲酸阴离子的解吸附，且优选随后为至少部分地将所述邻氨基苯甲酸阴离子再补料至步骤b）用于通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸阴离子转化为邻氨基苯甲酸。
22.权利要求21的方法，其中在步骤c）后通过吸附回收残余的邻氨基苯甲酸阴离子后，将没有被吸附的邻氨基苯甲酸阴离子的水流至少部分地再补料入步骤a）的发酵中。
23.根据权利要求12至22生产的苯胺在生产亚甲基二苯胺（MDA）上的用途，其中在存在水和催化剂的情况下用甲醛将步骤d）和/或e）中产生的苯胺进一步转化为亚甲基二苯胺（MDA）。
24.权利要求23的用途，其中用光气将所述产生的MDA进一步转化为亚甲基二异氰酸酯（MDI）。
CN201580019598.1A 2014-02-20 2015-02-19 生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2‑氨基苯甲酸从可再生资源发酵生产苯胺 Pending CN106414714A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14155936.9 2014-02-20
EP14155936 2014-02-20
EP14196432.0 2014-12-05
EP14196432 2014-12-05
PCT/EP2015/053526 WO2015124687A1 (en) 2014-02-20 2015-02-19 Recombinant strain producing o-aminobenzoate and fermentative production of aniline from renewable resources via 2-aminobenzoic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106414714A true CN106414714A (zh) 2017-02-15

Family

ID=52477815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580019598.1A Pending CN106414714A (zh) 2014-02-20 2015-02-19 生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2‑氨基苯甲酸从可再生资源发酵生产苯胺

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10731187B2 (zh)
EP (1) EP3108015A1 (zh)
KR (1) KR102335689B1 (zh)
CN (1) CN106414714A (zh)
CA (1) CA2939194A1 (zh)
TW (1) TW201546275A (zh)
WO (1) WO2015124687A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734002A (zh) * 2014-12-10 2016-07-06 中粮集团有限公司 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用
CN111212915A (zh) * 2017-10-12 2020-05-29 科思创德国股份有限公司 在中性pH下在碱金属离子存在下微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性
CN112513002A (zh) * 2018-07-27 2021-03-16 科思创知识产权两合公司 制备苯胺或苯胺衍生产物的方法
CN112534057A (zh) * 2018-06-07 2021-03-19 科思创知识产权两合公司 制备氨基苯甲酸或氨基苯甲酸反应产物的方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2939945T3 (es) * 2015-11-20 2023-04-28 Covestro Intellectual Property Gmbh & Co Kg Procedimiento de preparación del ácido aminobenzoico o de un derivado del ácido aminobenzoico
BR112018012444B1 (pt) 2015-12-18 2024-02-20 Covestro Deutschland Ag Método para produzir ácido orto-aminobenzoico
JP6564929B2 (ja) * 2016-02-26 2019-08-21 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４−アミノ安息香酸又はその塩の製造方法
EP3438245B1 (en) * 2016-03-28 2023-01-11 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Transformant, and method for producing protocatechuic acid or salt thereof using same
US10703709B2 (en) 2016-06-29 2020-07-07 Covestro Deutschland Ag Method for producing aniline or an aniline conversion product
WO2018033536A1 (de) 2016-08-17 2018-02-22 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung eines isocyanats und mindestens eines weiteren chemischen produkts in einem produktionsverbund
CA3047450A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Covestro Deutschland Ag Process for preparing aminobenzoic acid or an aminobenzoic acid conversion product
CA3072310A1 (en) 2017-10-12 2020-02-06 Covestro Deutschland Ag Methods for increasing the tolerance of microbial cells towards anthranilic acid by limiting the amount of ammonia in the culture medium
KR102223521B1 (ko) * 2019-02-26 2021-03-05 한국과학기술원 안트라닐산 메틸 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 안트라닐산 메틸의 제조방법
CN113046282A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
KR20230091921A (ko) * 2020-10-28 2023-06-23 삘리 안트라닐산을 생산하는 재조합 숙주 세포
US20240018097A1 (en) 2020-12-10 2024-01-18 Covestro Deutschland Ag Process for preparing a polyisocyanate, polyisocyanate, its use and polyaddition products prepared therefrom
WO2022253890A1 (de) 2021-06-02 2022-12-08 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung von anilin oder eines anilinfolgeproduktes
EP4198137A1 (de) 2021-12-17 2023-06-21 Covestro Deutschland AG Mischungen von glucose und xylose zur fermentativen herstellung von ortho-aminobenzoesäure
EP4198123A1 (de) 2021-12-17 2023-06-21 Covestro Deutschland AG Besonders geeignete 3-desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-synthase zur fermentativen herstellung von ortho-aminobenzoesäure
WO2023117756A1 (de) 2021-12-20 2023-06-29 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur gewinnung von aminobenzoesäure aus einer wässrigen mutterlauge
WO2023194110A1 (de) 2022-04-06 2023-10-12 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung von anilin oder eines anilinfolgeproduktes
WO2024003032A1 (de) 2022-06-30 2024-01-04 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur gewinnung von organischen säuren aus einer wässrigen mutterlauge

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110097767A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Priti Pharkya Microorganisms for the production of aniline

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH084514B2 (ja) * 1988-11-16 1996-01-24 高砂香料工業株式会社 アントラニル酸の製造方法
US4910336A (en) 1988-11-25 1990-03-20 Uop Process for separating phenylalanine from salts
JPH0594A (ja) * 1991-04-19 1993-01-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるアントラニル酸の製造法
FR2685345B1 (fr) * 1991-12-20 1994-04-01 Pernod Ricard Procede de production d'acide anthranilique et d'anthranilate de methyle par emploi de mutants de saccharomyces cerevisiae et utilisation de ces mutants dans l'elaboration de boissons fermentees.
WO1996034961A1 (en) * 1995-05-05 1996-11-07 Genencor International, Inc. Application of glucose transport mutants for production of aromatic pathway compounds
PT1960346E (pt) * 2005-12-08 2011-05-23 Huntsman Int Llc Processo para preparar diaminodifenilmetanos
US20130302860A1 (en) * 2010-12-28 2013-11-14 Sumitomo Rubber Industries, Ltd. Coryneform Bacterium Transformant and Process for Producing Aniline Using The Same
US20140371418A1 (en) 2012-01-05 2014-12-18 Paromatics, Llc Biological synthesis of p-aminobenzoic acid, p-aminophenol, n-(4-hydroxyphenyl)ethanamide and derivatives thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110097767A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Priti Pharkya Microorganisms for the production of aniline

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASATO IKEDA: "Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and otheraromatics by metabolic engineering", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
VÍCTOR E BALDERAS-HERNÁNDEZ等: "Metabolic engineering for improving anthranilate synthesis from glucose in Escherichia coli", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734002A (zh) * 2014-12-10 2016-07-06 中粮集团有限公司 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用
CN105734002B (zh) * 2014-12-10 2019-06-25 中粮集团有限公司 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用
CN111212915A (zh) * 2017-10-12 2020-05-29 科思创德国股份有限公司 在中性pH下在碱金属离子存在下微生物细胞对邻氨基苯甲酸的耐受性
CN112534057A (zh) * 2018-06-07 2021-03-19 科思创知识产权两合公司 制备氨基苯甲酸或氨基苯甲酸反应产物的方法
CN112513002A (zh) * 2018-07-27 2021-03-16 科思创知识产权两合公司 制备苯胺或苯胺衍生产物的方法
CN112513002B (zh) * 2018-07-27 2023-11-17 科思创知识产权两合公司 制备苯胺或苯胺衍生产物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170152535A1 (en) 2017-06-01
TW201546275A (zh) 2015-12-16
KR20160123351A (ko) 2016-10-25
CA2939194A1 (en) 2015-08-27
BR112016019081A8 (pt) 2021-07-13
BR112016019081A2 (pt) 2017-08-15
US10731187B2 (en) 2020-08-04
EP3108015A1 (en) 2016-12-28
WO2015124687A1 (en) 2015-08-27
KR102335689B1 (ko) 2021-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106414714A (zh) 生产邻氨基苯甲酸和/或盐的重组菌株和经2‑氨基苯甲酸从可再生资源发酵生产苯胺
Georgi et al. Lysine and glutamate production by Corynebacterium glutamicum on glucose, fructose and sucrose: roles of malic enzyme and fructose-1, 6-bisphosphatase
CN101688176B (zh) 具有羧基的酸性物质的生产方法
Zhou et al. Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAfbr and aroFwt
JP2010517519A (ja) カダベリンの発酵による製造方法
CN109890960B (zh) 用于生产醛的方法
KR20220139351A (ko) 엑토인의 개선된 생산을 위한 변형된 미생물 및 방법
CA2484379A1 (en) A process for the microbial production of aromatic amino acids and othermetabolites of the aromatic amino acid biosynthetic pathway
EP3498854B1 (en) Method for the fermentative production of l-lysine
WO2015117916A1 (en) Improved microorganisms for succinic acid production
CN113795589A (zh) 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学品的制造方法
US10301657B2 (en) Amino acid-producing microorganisms and methods of making and using
US20050089974A1 (en) Fermentative production of d-hydroxyphenylglycine and d-phenylglycine
EP3599282B1 (en) Method for the fermentative production of l-lysine
JP6989746B2 (ja) 変異型２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素
CN113166787A (zh) 使用具有完全或部分缺失的whiB4基因的物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
WO2021187533A1 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
CN111334534A (zh) 使用具有突变的Kup转运蛋白的谷氨酸棒杆菌菌株发酵生产L-赖氨酸的方法
CN111471631A (zh) 发酵产生l-赖氨酸的方法
CN113260706A (zh) 棒状细菌转化体以及使用其的2-苯基乙醇的制造方法
CN110714034A (zh) 发酵生产l-赖氨酸的方法
Xu et al. Expression of the Escherichia Coli TdcB gene encoding threonine dehydratase in L-isoleucine-overproducing Corynebacterium Glutamicum Yilw
CN112074599A (zh) 棒状细菌的转化体和使用其的有用化合物的制造方法
BR112016019081B1 (pt) Célula hospedeira microbiana recombinante e método para a produção de anilina
AU2021420802A1 (en) Novel promoter and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination