KR102335689B1 - o-아미노벤조에이트를 생산하는 재조합 균주, 및 2-아미노벤조산을 통한 재생 가능 자원으로부터의 아닐린의 발효적 생산 - Google Patents

o-아미노벤조에이트를 생산하는 재조합 균주, 및 2-아미노벤조산을 통한 재생 가능 자원으로부터의 아닐린의 발효적 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 추가로, a) 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효시킴으로써 o-아미노벤조에이트를 생산하는 단계 (여기서, 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온을 포함한다); b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계, c) 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시키거나 또는 침전시킴으로써 회수하는 단계, 및 d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계를 포함하는, 아닐린의 생산 방법을 제공한다.

Description

o-아미노벤조에이트를 생산하는 재조합 균주, 및 2-아미노벤조산을 통한 재생 가능 자원으로부터의 아닐린의 발효적 생산 {RECOMBINANT STRAIN PRODUCING O-AMINOBENZOATE AND FERMENTATIVE PRODUCTION OF ANILINE FROM RENEWABLE RESOURCES VIA 2-AMINOBENZOIC ACID}
본 발명은 적합한 미생물 숙주를 이용한 다음 중간 생성물을 아닐린으로 화학적으로 전환시킴으로써, 재생 가능 자원, 예컨대 예를 들어 바이오매스(biomass)의 원료로부터 아닐린을 생산하는 분야에 관한 것이다.
아닐린은 현재, 예를 들어 폴리우레탄을 생산하기 위하여, 화석 원료로부터 매년 수백만 톤씩 생산되고 있다. 화석 자원에 의존하지 않기 위해서는 "바이오아닐린"으로 부르기도 하는, 재생 가능 자원에 근거한 아닐린 공급원이 화학 산업에 강력히 요망된다. 보다 중요하게는, 화학적 공정에 대해서뿐만 아니라 상기 원료 내의 재생 가능 자원의 사용을 증가시킴으로써 야기되는 이산화탄소 (CO2) 배출을 감소시키는 것이 상당히 요망된다. 바이오아닐린은 CO2 배출을 감소시켜줄 수 있는 높은 잠재력을 지니고 있다.
본 발명은 추가로, 미생물을 조작하고 그로부터 방향족 화합물을 생산하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 적합한 재조합 미생물 숙주에서 재생 가능 공급원, 예컨대 예를 들어 바이오매스로부터 o-아미노벤조에이트 (oAB)를 생산하는 분야에 관한 것이다. 전형적으로, 상당 비율의 발효성 당을 함유하는 공급원이 사용된다. 이들 당은 폴리사카라이드, 예컨대 디사카라이드, 예를 들어 슈크로스, 또는 트리사카라이드, 예를 들어 케스토스 뿐만 아니라 C-6 모노사카라이드, 예컨대 글루코스, 프럭토스 또는 만노스 및 C-5 모노사카라이드, 예컨대 크실로스 및 아라비노스를 포함할 수 있다. 당을 o-아미노벤조에이트 (2-아미노벤조에이트, 오르토-아미노벤조에이트, o-아미노벤조에이트, oAB)로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 균주는 사탕무 및 사탕수수, 전분 함유 식물, 예컨대 옥수수, 밀 및 호밀뿐만 아니라 예를 들어, 짚(straw), 목재 또는 바가스(bagasse)로부터의 리그노셀룰로스를 포함한 광범위한 재생 가능 자원으로부터 o-아미노벤조에이트의 생산을 가능하게 해줄 것이다.
현재에는, o-아미노벤조에이트 또는 상응하는 시판용 산의 재생 가능하거나 또는 생물학적으로 유래된 공급원이 없고, o-아미노벤조에이트를 생물학적으로 대규모 생산하는 것으로 공지된 예도 전혀 보고된 바 없다. o-아미노벤조에이트는 시키메이트 산 경로의 자연 중간체이고, 방향족 아미노산 L-트립토판의 생합성을 위한 전구체이다. o-아미노벤조에이트에 대한 생합성 경로는 원핵 생물과 진핵 생물 둘 다에서 비교적 널리 이해되고 있다. o-아미노벤조에이트를 아닐린으로 화학적으로 전환시키는 것이 달성될 수 있다. 현재의 아닐린 생산 방법은 석유-유래 원료로부터의 화학적 합성에 의존하고 있다. 이러한 석유-유래 원료는 재생 가능한 원료, 예를 들어 재생 가능 자원 "바이오매스"와는 반대로 재생 가능하지 않다. 상기 화학적 합성에 관여하는 몇 가지 화학적 단계들로 인해, 화학물질의 생산 비용이 커지게 된다. 아닐린의 종래의 화학적 합성은 환경에 상당한 충격을 줄 수 있는 위험한 중간체, 용매 및 폐기물과 연관될 수 있다. 방향족 환에 대한 비-특이적 부반응으로 인해, 생산물 수율이 감소된다. 석유-유래 원료는 글로벌 석유 가격으로부터 비롯되는 비용 변동에 의해 영향을 받는다.
WO 2013/103894 A1에는 생물학적으로 유래된 p-아미노벤조산 (4-아미노벤조에이트)를 통하여 방향족 아민을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 문헌에는 이. 콜라이 (E. coli) 또는 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae)에서 p-아미노벤조산을 생산하는 것이 개시되어 있지만, 숙주로서의 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 여러 이점을 인식하지는 못하였다. 또한, 상기 문헌에는 생물학적으로 유래된 p-아미노벤조산을 방향족 아민으로 전환시키는 하류 화학 공정을 발효 공정과 성공적으로 조합하는 방법이 개시되어 있지 않다.
최종 반응 단계로서 생체 내에서 안트라닐레이트를 효소적으로 탈카르복실화하여 아닐린을 수득하는 것을 포함한 생합성 경로에 근거한 경우에는, 1-단계 전환으로서 당을 아닐린으로 직접적으로 발효시키는 것이 비용면에서 가장 효율적인 것으로 생각되었다. 아미노벤조에이트 데카르복실라제는 단백질 공학을 통하여 성공적으로 확인되거나 또는 발생될 수 없었기 때문에, 안트라닐레이트를 탈카르복실화 반응시켜 아닐린을 수득하는 것은 순수한 효소적 수단에 의해 수행될 수 없었다. 이러한 1-단계 공정은 기술적으로 실현 가능하지 않았기 때문에, 최종 반응 단계로서 안트라닐레이트를 탈카르복실화하여 아닐린을 수득하는 최종 반응 단계를 수행하는 공정 대안이, 예를 들어 효소적 단계와 대조적인 화학적 단계에 의해 고려되었다.
따라서, 본 발명의 기술적 문제는 기존의 발효 및 화학적 방법보다 탁월하고, 이산화탄소 배출을 상당히 감소시키며, 화석 자원에 의존하지 않고, 이미 확립된 석유-기반 생산 공정과 비교해서 생산 비용이 유사하거나 저렴한, 재생 가능 자원에 근거한 아닐린 생산 방법을 제공하는 것이었다.
본 발명은 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공함으로써 상기 문제를 해결하였다.
본 발명은
a) 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는, 본원에 기재된 바와 같고 청구범위에 청구된 바와 같은 본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효시킴으로써 o-아미노벤조에이트를 생산하는 단계 (여기서, 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온을 포함한다);
b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계,
c) 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시키거나 또는 침전시킴으로써 회수하는 단계, 및
d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계
를 포함하는, 아닐린의 생산 방법을 제공함으로써 상기 문제를 추가로 해결하였다.
재생 가능 자원, 예를 들어 바이오매스 또는 발효성 탄소 공급원에 근거한 아닐린 생산으로의 변화는 CO2 배출을 상당히 감소시키는 이점을 제공하고, 화석 자원에 의존하지 않게 해줄 수 있으며, 생산 비용 상의 절감을 가능하게 해준다. 본 발명의 추가 이점은 위험한 화학물질의 사용과 이에 따른 폐기물을 최소로 줄일 수 있다는 것이다. 추가로, 환경에 대한 전반적인 충격이 훨씬 덜한 공정으로, 생물학적으로 유래된 o-아미노벤조에이트를 생산할 수 있고 이를 아닐린으로 전환시킬 수 있다.
특히, 본 발명은 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공한다. 이러한 본 발명에 따르는 재조합 미생물 숙주는 재생 가능 공급원, 예컨대 예를 들어 바이오매스로부터 o-아미노벤조에이트를 발효적 생산하기 위한 유전적으로 조작된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 발효성 탄소 공급원으로부터 o-아미노벤조에이트를 효율적으로 발효적 생산하는 데 적합한 바이오촉매로서의 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전적으로 조작된 균주를 제공한다.
코리네박테리움 글루타미쿰은 토양에서 서식하는 그램-양성 박테리아이다. 이는 고 GC 함량의 그램-양성 악티노박테리아(actinobacteria)에 속한다. 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)은 아미노산, 주로 L-글루타메이트 및 L-리신의 연간 생산량이 2백만 톤을 초과하는, 생명공학적으로 가장 중요한 박테리아 종 중 하나이다. 이러한 엄청난 산업적 중요성으로 인해, 씨. 글루타미쿰은 1956년에 그를 발견한 직후부터 시작하여 이미 광범위하게 연구되어 왔다. 씨. 글루타미쿰의 게놈을 서열 분석하였고, 그것이 2003년에 공개되었다 (Ikeda M, Nakagawa S, Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62:99.; Kalinowski J, Bathe B, Bartels D, Bischoff N, Bott M, Burkovski A, Dusch N, Eggeling L, Eikmanns BJ, Gaigalat L, Goesmann A, Hartmann M, et al., J Biotechnol, 2003, 104:5). 씨. 글루타미쿰은 아미노산뿐만 아니라 다른 화학물질을 생산하는 미생물 공장으로서의 수많은 이상적인 본질적 속성을 나타낸다. 코리네박테리아 생리학에 대한 깊은 기초 지식과, 조합 접근 방식으로 합성 경로를 설계하거나 또는 공정을 모델링하기 위한 포스트게놈(postgenomic) 도구가, 효율적이면서 다양한 코리네박테리아 바이오리파이너리(biorefinery)를 설계하기 위한 기초적 근거를 구성한다. oAB를 초래하는 씨. 글루타미쿰의 생합성 경로가 광범위하게 연구되어 왔고, 이는 다음 3가지 주요 섹션으로 분류될 수 있다: 중앙 대사, 공통의 방향족 경로, 및 L-트립토판 분지 경로. oAB는 L-트립토판 생합성의 중간체이다 (도 1). 그러나, 아미노산 생산을 위하여 균주를 개선시키고자 한 기존의 시도들은 주로, 고전적인 무작위 돌연변이 유발과 스크리닝 과정에 의존하였는데, 이는 상기 생합성 경로에서 경쟁적 경로를 제거하고 피드백 조절을 없애는 것을 목적으로 한다. 상기 고전적 접근 방식은 조절성 단계를 완전히 탈조절시키고 적당한 생합성 효소 활성을 증강시키는 것이 달성하기 어렵기 때문에, 제한된 유용성을 갖고 있다. 더욱이, 무작위 돌연변이 유발로 인해, 목적하는 돌연변이와 함께 게놈 내의 일부 위치에서 예상치 못한 돌연변이가 종종 야기된다. 이들 미확인 돌연변이의 영향을 확인하는 것이 어렵기 때문에, 추가의 균주 개선에 악영향을 미칠 것이다. 이들 문제점은 무작위 돌연변이 유발에 의해 구축된 산업용 균주에 광범위하게 존재한다. 주로 지난 10여 년 동안 보고된 문헌을 근거로 하면, 고전적 접근 방식에 의해 생성된 균주를 이용한 현재의 당 생산율은 L-트립토판의 경우에는 대략 20 내지 23 wt%이고, L-페닐알라닌의 경우에는 약 25 wt%이다. 이와는 달리, 당에 대한 훨씬 더 높은 생산율 (wt%)이 다른 많은 아미노산에 대하여, 예를 들어, L-리신, 40-50; L-글루타메이트, 45-55; L-아르기닌, 30-40; L-트레오닌, 40-50; L-발린, 30-40; 및 L-알라닌, 45-55인 것으로 보고되었다 (Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K, Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69:1.; Ikeda M, Nakagawa S, Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62:99).
당으로부터 L-트립토판 (및 oAB)을 초래하는 생합성 경로의 기능성을 이해하는 데 있어서 그리고 분자 생물학에서 이루어진 최근의 이점들을 근거로 하여, 본 발명은 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공하고, 보다 구체적으로는, 유도 돌연변이 유발과 대사 공학 접근 방식에 근거한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 oAB 생산자를 제공한다. oAB 생산자를 생성하는 대사 공학을 위한 특정 유전자 표적은 oAB를 초래하고 연속해서 L-트립토판을 초래하는 방향족 생합성 경로에 위치한다 (도 1). L-트립토판의 생합성은 씨. 글루타미쿰 내의 몇 가지 단계에서 엄격하게 제어된다. 따라서, oAB를 과다생산하기 위해서는, 공통의 방향족 경로와 L-트립토판 분지 둘 다에 존재하는 대사 제어를 유전적으로 제거할 필요가 있다. 또한, 방향족 경로를 개시하는 DAHP 신타제(synthase)를 증폭시키는 것이, 본 발명의 추가 실시양태로서 상기 공통의 경로 아래의 순 탄소 흐름을 증가시키는 데 중요한 전략이었다. 이들 돌연변이를 방향족 아미노산 브래디트로프(bradytroph) 균주의 발생과 조합하여, 방향족 아미노산을 지속적으로 보충시켜야 할 필요성을 회피하였다. 글루코스로부터 oAB 1 mol을 생합성하기 위해서는 출발 전구체로서 1 mol의 에리트로스-4-포스페이트 (E4P)와 2 mol의 포스포에놀피루베이트 (PEP)가 필요하고, 또한 그의 경로 상에서 1 mol의 L-글루타민을 소모하며 1 mol의 피루베이트를 방출하는 것을 고려하면, 생성물의 효율적인 생산을 달성하기 위하여 전구체를 균형있게 공급하는 것에 역점을 두었다.
다음에, 본 발명자들은 o-아미노벤조에이트를 생물학적으로 생산하기 위한 재조합 미생물 균주로서의 코리네박테리움 글루타미쿰에 초점을 두었다. 따라서, 본 발명은 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공한다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 바람직하게는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 가장 바람직하게는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 trpD 유전자 [Cgl3032, 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1]의 유전적 변형을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 유전적 변형은 바람직하게는, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 및 서열식별번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들 모두는 트립토판 영양요구성 균주를 산출하기 위하여 trpD 유전자의 발현 저하 효과를 갖는다. 전술된 유전적 변형 중 단지 하나만으로도 이미, o-아미노벤조에이트 (oAB)를 생산하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주가 초래되었다.
다음에, 본 발명을 설명하기 위하여 사용된 몇 가지 용어가 정의된다.
본 발명에 따르는 용어 "바이오아닐린"은 재생 가능 자원으로부터의 원료, 예컨대 사탕무, 사탕 수수, 전분-함유 식물, 바람직하게는 옥수수, 밀 및 호밀, 및 리그노셀룰로스, 바람직하게는 짚, 목재 및 바가스, 글리세롤 및 C1-화합물, 바람직하게는 CO, 또는 예컨대 발효성 당, 바람직하게는 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 트리사카라이드 (여기서, C-5 모노사카라이드는 바람직하게는 크실로스 및 아라비노스이고, C-6 모노사카라이드는 바람직하게는 글루코스, 프럭토스 또는 만노스이며, 디사카라이드는 바람직하게는 사카로스이고, 트리사카라이드는 바람직하게는 케스토스이다)에 근거하는 아닐린을 지칭한다.
본 발명에 따르는 "o-아미노벤조에이트"는 오르토-아미노벤조에이트 (o-아미노벤조에이트, "oAB")를 지칭한다. o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온, C6H4COO-, 및 적합한 양이온, 예컨대 NH4 + 또는 Na+를 포함하는 안트라닐레이트 염의 형태로 존재하거나, 또는 쯔비터 이온 C6H4COO- NH3 + 및 C6H4COO- NH2인 안트라닐산으로서 존재할 수 있다. "o-아미노벤조에이트" ("oAB")는, o-아미노벤조에이트 ("oAB")의 경우에서의 C2-위치 (오르토)와는 대조적으로 벤젠 환에 아미노 기가 C4-위치 (파라)에서 부착된다는 점에서 "4-아미노벤조에이트" ("pAB")와 상이하다.
본 발명의 의미 내에서의 용어 "숙주"는 자연적으로, 또는 "재조합 미생물 숙주"로서의 형질전환 후에만, 발효에 의해 o-아미노벤조에이트를 생산할 수 있거나, 또는 자연적으로 존재하는 o-아미노벤조에이트 이외에도, 형질전환 후에 안트라닐레이트 음이온의 형태로 또는 안트라닐산으로서의 o-아미노벤조에이트를 생산할 수 있는 임의의 숙주를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 "미생물 숙주"는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 숙주는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 여기서 상기 박테리아는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 균주, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 균주 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 균주이고, 상기 코리네박테리움 균주는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이며, 상기 슈도모나스 균주는 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)이다. 바람직하게는, 상기 미생물 숙주는 재조합 미생물 숙주일 수 있다. 이러한 재조합 미생물 숙주는 실시 예 1에 나타낸 바와 같은 이. 콜라이 W3110 trpD9923일 수 있다. 상기 재조합 숙주는 실시예 4에 나타낸 바와 같은 슈도모나스 푸티다 KT2440일 수 있다. 상기 재조합 숙주는 또한, 실시예 3에 나타낸 바와 같은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032일 수 있다.
본 발명의 의미 내에서의 용어 "유전적 변형"은 야생형 서열과 비교해서 미생물 숙주의 소정의 유전자의 핵산 서열 상의 변화를 지칭한다. 이러한 유전적 변형은 하나 이상의 데옥시리보핵산의 삽입뿐만 아니라 결실을 포함할 수 있다. 상기 유전적 변형은 미생물 숙주의 게놈 내로의 형질전환에 의해 도입된 삽입뿐만 아니라 부분적 또는 완전한 결실을 포함할 수 있다. 상기 유전적 변형은 재조합 미생물 숙주를 생성시킬 수 있는데, 여기서 상기 유전적 변형은 각각의 미생물 숙주의 야생형 서열과 비교해서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 단일 뉴클레오티드의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전적 변형은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 단일 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입일 수 있거나, 또는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 단일 뉴클레오티드의 형질전환일 수 있다. 본 발명에 따르는 유전적 변형은, 예를 들어 각각의 유전자의 발현 저하 효과, 또는 각각의 유전자의 발현 증강 효과를 가질 수 있다. 상기 본 발명에 따르는 유전적 변형의 한 예에서, 재조합 미생물 숙주, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰은 효소 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 trpD 유전자 (Cgl3032, 서열식별번호: 1)의 유전적 변형을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 유전적 변형은 이로써 변형된 trpD 유전자의 발현 저하 효과를 가질 수 있다. 이와 같이 변형된 trpD 유전자는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 및 서열식별번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전술된 유전적 변형 중 단지 하나만으로도 이미, o-아미노벤조에이트 (oAB)를 생산하는, 상기 변형된 trpD 유전자의 발현 저하를 나타내는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주가 초래되었다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 상기 유전적 변형은 또한, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD에서와 같이, trpD 유전자의 결실일 수 있다.
본 발명의 의미 내에서의 용어 "배치식 발효"는 규정된 출발점과 규정된 종결점을 갖는 단일 발효 반응을 지칭한다. 배치식 발효는 연속식 발효 방식으로는 미생물의 생산율을 높은 비율로 유지할 수 없는 경우에 본 발명에 따르는 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서의 용어 "유가식 발효"는 하나 이상의 영양분 (기질)을 배양 동안 바이오반응기에 공급하고 반응 수행이 종결될 때까지 그 생성물(들)을 바이오반응기 내에 유지시켜 두는 생명공학적 과정에 있어서의 운영상의 기술을 지칭한다. "유가식 발효"는 연속식 발효 방식으로는 미생물의 생산율을 높은 비율로 유지할 수 없는 경우에 본 발명에 따르는 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서의 용어 "연속식 발효"는 본 발명에 따르는 방법의 단계 a)에서의 발효 동안, 기질을 부가하고 그 생성물 (즉, o-아미노벤조에이트, oAB)을 연속적으로 제거하는 발효 방법을 지칭한다.
다음에, 본 발명은 보다 상세히 기재된다.
본 발명은 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트 (oAB)로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공한다.
상기 미생물 숙주 세포는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 여기서 상기 박테리아는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 균주, 코리네박테리움 균주 또는 슈도모나스 균주이고, 상기 코리네박테리움 균주는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이며, 상기 슈도모나스 균주는 바람직하게는 슈도모나스 푸티다, 보다 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 KT2440이다.
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 추가 실시양태에서, 재조합 미생물 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 본 발명의 보다 구체적 실시양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032가 o-아미노벤조에이트를 생산하는 데 바람직한 재조합 미생물 숙주인데, 이는 상기 유기체가 o-아미노벤조에이트에 대한 높은 내성을 갖고 있는 반면, 다른 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 K12의 경우에는, 이미 저 농도의 o-아미노벤조에이트가 독성이라는 사실을 본 발명자들이 관찰하였기 때문이다.
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 추가 실시양태에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 trpD 유전자의 유전적 변형을 포함할 수 있다 (도 3).
안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 trpD 유전자 (Cgl3032, 서열식별번호: 1)의 상기 유전적 변형은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 및 서열식별번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 상기 유전적 변형은 trpD 유전자의 발현 저하 효과를 갖는다. 보다 구체적으로, 전술된 서열 내에서의 돌연변이는 trpD 유전자의 리보솜 결합 부위와 출발 코돈 사이의 스페이서 영역을 변화시킬 수 있다. 또한, trpD 유전자의 자연 출발 코돈을 교환하면, trpD의 번역 저하가 초래될 수 있고, 이에 따라 L-트립토판을 보충하지 않고서도 멀티 그램 규모로 o-아미노벤조에이트를 생산하는 L-트립토판에 대한 브래디트로프 균주가 초래될 수 있다. 이러한 유형의 균주가 본 발명에 따르는 재조합 미생물 숙주로서 특히 바람직하다는 결론이 나온다.
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 추가 실시양태에서, 이러한 미생물 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032일 수 있는데, 여기서 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032는 코리스메이트 무타제를 코딩하는 csm 유전자 (Cgl0853, 서열식별번호: 9)의 유전적 변형을 포함할 수 있는데 (도 3), 여기서 상기 유전적 변형은 바람직하게는 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15 및 서열식별번호: 16으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 유전적 변형은 csm 유전자의 발현 저하 효과를 갖는다. 특히, csm 유전자는 L-페닐알라닌 및 L-티로신 생산율을 최소한으로 감소시킴으로써 o-아미노벤조에이트 생산율을 추가로 개선시키도록 조작할 수 있다.
csm 유전자의 발현을 저하시키는 효과는 L-티로신 및 L-페닐알라닌을 보충시키지 않고서도 멀티 그램 규모로 o-아미노벤조에이트를 생산하는, L-티로신 및 L-페닐알라닌에 대한 브래디트로프 균주가 생성된다는 것이다. 이로써, L-티로신 및/또는 L-페닐알라닌이 보충된 L-티로신 및 L-페닐알라닌 영양요구성 균주에서 가능한 바와 같이, L-티로신 및/또는 L-페닐알라닌에 의한 방향족 산 경로에서의 반응을 촉매하는 효소의 피드백-억제에 기인한 o-아미노벤조에이트 생산의 감소를 피할 수 있게 된다. 이러한 유형의 균주가 본 발명에 따르는 재조합 미생물 숙주로서 특히 바람직하다는 결론이 나온다. 상기 효과로 인해, o-아미노벤조에이트가 보다 많이 생산될 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 추가 실시양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주 세포, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032는 hpr (Cgl1937 - 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18), ptsG (Cgl1537 - 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20), pepco (Cgl1523 - 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22), pyk (Cgl2089 - 서열식별번호: 23 또는 서열식별번호: 24), 및 gpi (Cgl0851 - 서열식별번호: 27 또는 서열식별번호: 28)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 결실을 추가로 포함할 수 있다.
유전자 hpr (Cgl1937 - 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18) 및 유전자 ptsG (서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20): 이들 유전자 각각은 다효소 복합체 PEP-포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)의 단위를 코딩한다 (도 1, 2). 씨. 글루타미쿰의 PTS, Hpr 및 PtsG의 양 단위를 조작할 수 있고, 이들을 실 시예 3에 나타낸 바와 같이, 성장, 세포 생존 능력뿐만 아니라 oAB 생산에 대한 효과에 관하여 비교하였다.
유전자 pepco (Cgl1523 - 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22)는 효소 포스포에놀피루베이트-카르복실라제를 코딩한다. 포스포에놀피루베이트-카르복실라제는 이를 옥살로아세테이트로 변환시킴으로써 PEP (포스포에놀피루베이트)를 소모한다 (도 1, 2). 이러한 반응은 산소 고갈 하의 주요 보충 대사 반응(anaplerotic reaction)인 반면, 표준의 충분한 산소 공급 하에서는 피루베이트 키나제가 대부분의 PEP를 소모하여, 하나의 ATP의 획득 하에 피루베이트를 생성시킨다. 씨. 글루타미쿰의 유전자 pepco를 조작할 수 있고, 이를 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 성장, 세포 생존 능력뿐만 아니라 oAB 생산에 대한 효과에 관하여 다른 씨. 글루타미쿰 균주들과 비교하였다.
유전자 pyk (Cgl2089 - 서열식별번호: 23 또는 서열식별번호: 24)는 효소 피루베이트 키나제를 코딩한다. 피루베이트 키나제는 피루베이트 및 ATP를 생성함으로써 PEP (포스포에놀피루베이트)를 소모한다 (도 1, 2). 이러한 반응은 씨. 글루타미쿰에서의 당분해의 일부이다. 씨. 글루타미쿰의 게놈에 주석이 달린 Pyk-코딩 유전자가 실시예 3에 기재된 바와 같이 결실되었다.
유전자 gpi (Cgl0851 - 서열식별번호: 27 또는 서열식별번호: 28)는 효소 글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩한다. 이러한 효소는 글루코스-6-포스페이트를 프럭토스-6-포스페이트로 당분해 변환시키는 첫 번째 단계를 촉매한다 (도 1, 2).
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 보다 구체적 실시양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주 세포, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032는 galP (서열식별번호: 30), iolT2 (서열식별번호: 31), ppgk (서열식별번호: 32), pps (서열식별번호: 33-35), ppk (서열식별번호: 36), zwf1 (서열식별번호: 37), opcA (서열식별번호: 38-39), tktCg (서열식별번호: 40), tktEc (서열식별번호: 41), talCg (서열식별번호: 42), talEc (서열식별번호: 43), TrpEGS38F를 코딩하는 유전자 (trpEG S38F , 서열식별번호: 50), TrpEGS38R을 코딩하는 유전자 (trpEG S38R , 서열식별번호: 51), TrpEGS40R을 코딩하는 유전자 (trpEG S40R , 서열식별번호: 52), TrpEGS40F를 코딩하는 유전자 (trpEG S40F , 서열식별번호: 53), AroGD146N을 코딩하는 유전자 (aroG D146N , 서열식별번호: 55), 에스케리키아 콜라이 LJ110의 aroL (서열식별번호: 93), aroK (서열식별번호: 94), glnA (서열식별번호: 95), 및 qsuA (서열식별번호: 96)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자들 중 하나 이상을 추가로 과발현할 수 있다.
피드백-저항성 trpEG 유전자 (안트라닐레이트 신타제 유전자), TrpEGS38F를 코딩하는 유전자 (trpEG S38F , 서열식별번호: 50), TrpEGS38R을 코딩하는 유전자 (trpEG S38R , 서열식별번호: 51), TrpEGS40R을 코딩하는 유전자 (trpEG S40R , 서열식별번호: 52), TrpEGS40F를 코딩하는 유전자 (trpEG S40F , 서열식별번호: 53)가 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 발현되는 것이, 단독으로 또는 본 발명의 다른 유전적 변형들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 이들 유전자 모두는 o-아미노벤조에이트 및 L-글루타메이트의 형성 하에 피루베이트 분자를 방출하는 안트라닐레이트 신타제 단위의 돌연변이된 버전을 코딩한다는 점에서 공통의 특징을 공유하고 있다 (도 3). 이들은 TrpEG의 피드백-저항성 버전인데, 이것이 왜 상응하는 돌연변이된 유전자가 trpEG fbr 로서 지칭되는 지의 이유이다. 피드백 저항성 aroG 유전자 (3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타제 유전자), 예컨대 AroGD146N을 코딩하는 유전자 (aroG D146N - 서열식별번호: 55)가 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 과발현되는 것이, 단독으로 또는 본 발명의 다른 유전적 변형들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태이다. AroGD146N을 코딩하는 유전자 (aroG D146N - 서열식별번호: 55)는 에스케리키아 콜라이에서 에리트로스-4-포스페이트 (E4P)에서 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 (DAHP)로의 반응을 촉매하는 효소인 AroG의 돌연변이된 버전을 코딩한다 (도 3).
유전자 galP (Cgl2409 - 서열식별번호: 30)는 효소 갈락토퍼미아제를 코딩한다. 글루코스 흡수는 갈락토퍼미아제의 발현에 의한 PTS 붕괴 후에 복원될 수 있다 (도 1, 2). 씨. 글루타미쿰에서 특정 유전자가 확인되었고, 이를 갈락토퍼미아제로서 주석을 달았으므로, 이는 상기 발현에 대한 좋은 후보이다. 이러한 후보 유전자는 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 붕괴된 PTS와 함께 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현된다.
유전자 iolT2 (Cgl3058 - 서열식별번호: 31)는 이노시톨퍼미아제 T2 단위를 코딩한다. 글루코스 흡수는 이노시톨퍼미아제 T2 단위의 발현에 의한 PTS 붕괴 후에 복원될 수 있다 (도 1, 2). 씨. 글루타미쿰에서 PTS 붕괴 후 글루코스-흡수를 복원하기 위한 갈락토퍼미아제의 과발현에 대한 대체 접근 방식으로서, 이노시톨퍼미아제의 이노시톨퍼미아제 T2 단위의 과발현을 수행한다. 이로써 생성되는 균주 특징을 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 갈락토퍼미아제를 과발현하는 균주의 특징과 비교한다.
유전자 ppgk (Cgl1910 - 서열식별번호: 32)는 효소 폴리포스포글루코키나제를 코딩한다. 갈락토퍼미아제 뿐만 아니라 이노시톨퍼미아제 T2 단위는 단지 글루코스를 흡수할 수 있지만, 이들이 상기 당 분자를 인산화할 수는 없다 (도 1, 2). 그러나, 이러한 인산화는 글루코스 분자의 대사를 가능하게 하는 데 필수적이다. 따라서, 상이한 퍼미아제들의 발현을 글루코스 인산화 효소의 발현과 조합한다. 상기 Ppgk는 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 상이한 퍼미아제-발현성 PTS 결핍성 균주에서 공동-발현된다.
유전자 pps (Cgl0551 및 Cgl0552 - 서열식별번호: 33-35)는 효소 PEP (포스포에놀피루베이트) 신타제를 코딩한다. PEP를 소모하는 반응의 붕괴를 제외하고는, PEP의 생성을 초래하는 생합성 단계들이 증진된다. PEP 신타제는 씨. 글루타미쿰에서 글루코스신합성의 일부로서, 피루베이트 재순환과 ATP에서 AMP로의 소모에 의해 PEP의 형성을 촉매한다 (도 1, 2). pps 유전자를 과발현시키면, 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 씨. 글루타미쿰 균주 내에 oAB 풀이 증가된다.
유전자 ppk (Cgl2862 - 서열식별번호: 36)는 효소 PEP 카르복시키나제를 코딩한다. 글리옥실레이트 경로의 일부로서, 옥살로아세테이트가 PEP 카르복시키나제에 의해 PEP로 재순환될 수 있다 (도 1, 2). 상기 유전자를 과발현시키는 것이 실시예 3에 기재되는 바와 같이, oAB 생합성을 위해 이용 가능한 보다 큰 PEP 풀에 대한 또 다른 경로일 수 있다.
유전자 zwf1 (Cgl1576 - 서열식별번호: 37) 및 유전자 opcA (Cg1577 - 서열식별번호: 38-39)는 효소 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩한다 (도 1, 2). 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)의 첫 번째 반응 (글루코스-6-포스페이트로부터 리불로스-5-포스페이트의 형성)을 촉매하는 상기 효소의 생산 증강으로 인해 (도 1, 2), 프럭토스-6-포스페이트 (Frc-6-P) 생산을 통하여 보다 다량의 E4P의 생산을 초래하는 PPP 내로의 유동이 증가될 수 있고, 더욱이 세포 PEP 풀이 증가될 수 있으므로, 최종적으로 씨. 글루타미쿰 균주에서 oAB 풀이 증가될 수 있다. 이러한 효과는 상기 조작이 씨. 글루타미쿰 균주에 적용되고, Zop 효소의 발현이 실 시예 3에 기재되는 바와 같이 수행되는 경우에 달성된다.
유전자 tktCG (Cgl1574 - 서열식별번호: 40) 및 유전자 tktEC (ECDH10B_3110 - 서열식별번호: 41)는 효소 트랜스케톨라제를 코딩한다. PPP를 통한 유동 증강과 E4P 풀의 증가, 및 심지어 oAB와 방향족 아미노산의 생산 증가가, 씨. 글루타미쿰 균주에서의 트랜스케톨라제의 발현에 의해 관찰된다 (도 1, 2). 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 이. 콜라이로부터의 트랜스케톨라제 유전자 뿐만 아니라 씨. 글루타미쿰에서 코딩된 트랜스케톨라제가 과발현되었다.
유전자 talCG (Cgl1575 - 서열식별번호: 42) 및 유전자 talEC (ECDH10B_2629 - 서열식별번호: 43)는 효소 트랜스알돌라제를 코딩한다. 트랜스케톨라제 과발현에 의해서와 거의 동등한 수준의, E4P 생산에 대한 유리한 효과가, 이. 콜라이에서의 트랜스알돌라제의 과발현에 대해서 관찰될 수 있다 (도 1, 2). 이. 콜라이 트랜스알돌라제의 서열과 씨. 글루타미쿰 트랜스알돌라제의 서열이 상당히 상이하기 때문에, 본 발명자들은 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 씨. 글루타미쿰 균주에서 자연 씨. 글루타미쿰 유전자 및 상기 언급된 이. 콜라이 유전자를 발현하는 것을 계속해서 진행하였다. 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 코딩 유전자를 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 하나의 벡터 상에서 조합하고 씨. 글루타미쿰 균주에서 공동-발현시켜 oAB 생산자 균주 특징들을 추가로 증강시킨다.
유전자 qsuA (Cgr0492 - 서열식별번호: 96)는 약물 내성 수송체 단백질 QsuA를 코딩한다. 상기 유전자를 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현시키면, 실시예 3에 기재되는 바와 같이, oAB 수송이 최적화된다.
에스케리키아 콜라이 LJ110으로부터의 유전자 aroL (B0388 - 서열식별번호: 93)은 에스케리키아 콜라이에서 시키메이트 (SHI)에서 시키메이트-3-포스페이트 (SHI3P)로의 반응을 촉매하는 효소를 코딩한다. 이. 콜라이로부터의 aroL 유전자는 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현된다.
유전자 aroK (Cgl1622 - 서열식별번호: 94)는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 시키메이트 (SHI)에서 시키메이트-3-포스페이트 (SHI3P)로의 반응을 촉매하는 효소를 코딩한다 (도 3). 이러한 aroK 유전자는 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현된다.
유전자 glnA (Cgl2214 - 서열식별번호: 95)는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 효소 글루타민 신테타제를 코딩한다 (도 3). 이러한 glnA 유전자는 실시예 3에 기재되는 바와 같이, 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물 숙주 세포는 실시예 3 및 표 4에 추가로 기재되는 바와 같은, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD::trpD5, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δpepco, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD ::trpD5Δgpi, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δpyk, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD::trpD5/pEKEx2-trpEG S40F , 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pEKEx2-aroG D146N , 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pEKEx2 - aroG D146N - trpEG S40F , 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD::trpD5/pEKEx2-aroL, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pSB072, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD::trpD5/pSB073, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pSB074, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD:: trpD5 / pSB075, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pSB076, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD:: trpD5 / pSB077, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pSB078, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD:: trpD5 / pSB085, 또는 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 / pSB096일 수 있다.
다음에, 본 발명의 추가의 재조합 미생물 숙주가 기재되어 있다.
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 또한 또 다른 실시양태에서, 미생물 숙주 세포는 슈도모나스 푸티다, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 KT2440일 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 추가 실시양태에서, 상기 슈도모나스 푸티다, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 KT2440은 실시예 4에 기재되는 바와 같이, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 및 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제를 코딩하는 trpDC 유전자의 결실 (PP_0421 및 PP_0422 - 서열식별번호: 63-64), 또는 코리스메이트 무타제 및 프레페네이트 데히드라타제를 코딩하는 pheA 유전자의 결실 (PP_1769 -서열식별번호: 65-66), 또는 둘 다를 포함할 수 있다 (도 4).
본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 추가 실시양태에서, 상기 슈도모나스 푸티다, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 KT2440은 TrpEGS40F를 코딩하는 유전자 (trpEG S40F - 서열식별번호: 53) 및 AroGD146N을 코딩하는 유전자 (aroG D146N - 서열식별번호: 55)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자들 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (도 4). 본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포의 특정 실시양태에서, 상기 언급된 하나 이상의 발현된 유전자는 실시예 4에 기재되는 바와 같이, 플라스미드 형질전환 또는 염색체 형질전환에 의해 상기 피. 푸티다 (P. putida) 미생물 숙주 세포 내로 통합될 수 있다.
재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생물학적으로 o-아미노벤조에이트 (oAB)로 전환되는 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료는 사탕무, 사탕 수수, 전분-함유 식물, 바람직하게는 옥수수, 밀 및 호밀, 및 리그노셀룰로스, 바람직하게는 짚, 목재 및 바가스, 글리세롤 및 C1-화합물, 바람직하게는 CO로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 상기 원료 내에 포함되는 발효성 탄소 기질은 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 트리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 여기서 C-5 모노사카라이드는 바람직하게는 크실로스 및 아라비노스이고, C-6 모노사카라이드는 바람직하게는 글루코스, 프럭토스 또는 만노스이며, 디사카라이드는 바람직하게는 사카로스이고, 트리사카라이드는 바람직하게는 케스토스이다.
본 발명은
a) 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는, 본원에 기재된 바와 같고 청구범위에 청구된 바와 같은 재조합 미생물 숙주 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효시킴으로써 o-아미노벤조에이트를 생산하는 단계 (여기서, 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온을 포함한다);
b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계,
c) 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시키거나 또는 침전시킴으로써 회수하는 단계, 및
d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계
를 포함하는, 아닐린의 생산 방법을 제공함으로써 상기 문제를 추가로 해결하였다.
본 발명에 따르는 방법은 화석 자원에 근거하는 방법과 비교해서 CO2 배출을 상당히 감소시켜 주고, 이러한 화석 자원에 의존하지 않게 해줄 뿐만 아니라 이미 확립된 석유-기반의 아닐린 생산 공정과 비교해서 유사하거나 또는 더 낮은 생산 비용을 달성하면서, 아닐린을 생산하는 기술적 이점을 제공한다.
본 발명에 따르는 방법은 2개의 주요 부분을 포함하며, 첫 번째 부분인 단계 a)는 발효-기반 (생명공학적)이고, 적합한 재조합 미생물 숙주에 의한 발효에 의해 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 o-아미노벤조에이트로 전환시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온 (C6H4COO- NH2)을 포함한다.
두 번째 부분은 보다 화학적 성질이고 단계 a)의 하류를 따라가며, 다음 단계 a) 내지 d), 및 임의로 e)를 포함한다:
b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계,
c) 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시키거나 또는 침전시킴으로써 회수하는 단계, 및
d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계.
요약하면, 따라서 본 발명은 첫 번째 생명공학적 발효 단계 a)를, 적어도 단계 b), c) 및 d)를 임의 단계 e)와 함께 포함하는 후속 하류, 화학 공정과 조합하는, 아닐린의 생산 방법을 제공한다.
다음에, 본 발명이 추가로 상세히 기재되어 있다. 본 발명에 따르는 방법의 전반적인 개념은 도 5에 묘사되고, 보다 상세한 개요는 도 6에 제시되어 있다.
본 발명은 추가로,
a) 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는, 본원에 기재된 바와 같고 청구범위에 청구된 바와 같은 재조합 미생물 숙주 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효시킴으로써 o-아미노벤조에이트를 생산하는 단계 (여기서, 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온을 포함한다);
b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계,
c) 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시키거나 또는 침전시킴으로써 회수하는 단계, 및
d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계
를 포함하는, 아닐린의 생산 방법을 제공한다.
단계 a)의 발효는 배치식 발효, 유가식 발효 또는 연속식 발효일 수 있다. 단계 a)에서 연속식 발효의 경우에는, 세포 보유 장치를 사용하여 숙주를 발효 단계 a)에 사용된 수상으로부터 분리시키고, 숙주를 단계 a)를 수행하기 위하여 사용된 발효기에 보유할 수 있다. 세포 보유 장치를 상기 발효기에 혼입시킬 수 있거나, 또는 바람직한 옵션으로서, 이를 별도의 장치로서 발효기 외부에 위치시킬 수 있다. 이러한 분리는, 예를 들어 디스크 분리기 또는 경사 분리기에서의 원심분리에 의해, 침강 장치에서의 중력에 의해, 또는 여과 기술, 예컨대 직교류 여과에 의해 달성될 수 있다. 숙주, 예를 들어 박테리아, 효모 및 진균의 세포가 발효기의 외부에서 제한된 시간을 보내고, 그들이 분리 장치 내에 있는 동안에 성장하거나 또는 안트라닐레이트를 생산할 수 있는 능력을 상실하지 않도록 제한된 보유 시간을 이용하여 상기와 같은 분리를 설계할 수 있다. 세포 보유를 수반한 연속식 발효는 발효 단계 a)가 높은 세포 밀도로 수행될 수 있도록 해주므로, 높은 공간 시간 수율을 허용해준다. 보다 중요하게, 단계 a)에서의 발효는 극히 낮은 성장률로 수행될 수 있다. 이로써, 전반적인 생산물 수율 (원료 1 g당 생산물 g)이 보다 높아지는데, 이는 바이오매스를 생산하는 데 더 적은 양의 당이 사용되고 oAB를 생산하는 데 더 많은 양이 사용되기 때문이다.
배치식 발효에 비해 연속식 발효의 추가 이점은 발효기의 소위 "정지 시간"이 최소한으로 감소될 수 있다는 것이다. 연속식 발효는 배치식 발효보다 훨씬 더 긴 생산기를 가지므로, 클리닝, 멸균, 충전 및 수확하는 데 걸리는 시간이 이에 비례하여 훨씬 더 단축된다. 이러한 측면은 공간 시간 수율을 증가시키는 데 기여하므로, 본 발명에 따르는 방법을 수행하기 위해 사용되는 소정의 공장 설비 능력에 대한 투자 비용이 감소된다.
상기 방법의 단계 a)가 배치식 또는 유가식 발효로서 수행되는 경우, 총 발효 용량은 여러 개의 발효기로 나눌 수 있고, 브레이크 탱크를 이용하여, 단계 a)의 발효 물질을 단계 b) 내지 d), 또는 심지어 e)를 포함하는 하류 섹션으로 연속적으로 공급할 수 있게 해준다. 배치식 또는 유가식 발효는, 연속식 발효 방식으로는 미생물의 생산율을 높은 비율로 유지할 수 없는 경우에 본 발명에 따르는 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 단계 a)는 숙주, 바람직하게는 발효에 의해 당을 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 숙주를 이용하여, 발효성 당을 포함하는 원료를 발효함으로써 안트라닐레이트 음이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 숙주를 포함하는 발효 반응기에 탄소 공급원, 예를 들어 옥수수 시럽, 사탕수수 즙, 당밀 등, 및 질소 공급원, 예를 들어 암모니아 가스, 수산화암모늄 용액, 황산암모늄, 질산암모늄, 옥수수 침지액 등 뿐만 아니라 미생물의 생존에 필요한 각각의 미량 영양소를 부가하면서, 이를 배양한다. 단계 a)의 발효에서의 pH는 3 내지 9의 범위, 바람직하게는 pH 4 내지 8, 가장 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 값을 유지할 수 있다. 단계 a)에서의 pH는, 예를 들어 염기, 예를 들어, 암모니아 가스, 수산화암모늄 또는 수산화나트륨을 부가함으로써 조정할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 적어도 발효에 의해 o-아미노벤조에이트를 생산하는 단계 a)와, 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계 b)를 연속적으로 수행할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 단계 a)가 수행되는 발효기는 연속적으로 작동되는데, 여기서, 단계 a)에서 생성된 발효 브로쓰를 연속적으로 빼낸 다음, 특정 밀도로 성장된 숙주를 포함하는 바이오매스를 분리하기 위한 장치, 예를 들어 필터, 원심분리기, 막 등을 통하여 처리할 수 있다. 상기 바이오매스를, 재조합 미생물 숙주를 포함하는 바이오매스의 적은 부분을 퍼징한 후 단계 a)의 발효에 사용된 발효기로 재순환시킬 수 있다. 상기 바이오매스로부터의 퍼지 스트림은 바이오매스 축적을 피하는 데 유용할 수 있다. 따라서, 발효기 내에서 크게 증가되는 미생물 숙주 세포의 특정 부분과 사멸 세포는, 발효 단계 a)의 반응기 내에서의 살아있는 숙주 세포의 농도를 규정된 한계치 내로, 가장 바람직하게는 일정하게 유지하도록 제거할 수 있다. 이는 재조합 숙주 세포와 발효 생산물(들)이 수행이 종결될 때까지 바이오반응기 내에 유지되는 (따라서 연속식 발효가 아니라, 유가식 발효이다) 유가식 발효의 경우와 상이할 수 있다. 충분한 산소를 순수 산소로서, 공기로서 또는 풍부해진 공기로서, 단계 a)에 사용된 반응기에 부가할 수 있다. 발효 단계 a)의 세포 무함유 발효 브로쓰는 본질적으로, 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 반대 양이온, 예컨대 NH4 + 또는 Na+를 포함하는 안트라닐레이트 염의 용액일 수 있다. 발효 단계 a)에서 생성된 안트라닐레이트 용액은 농도 5 g/L 내지 500 g/L, 바람직하게는 20 g/L 내지 200 g/L, 가장 바람직하게는 50 g/L 내지 150 g/L의 안트라닐레이트 염을 가질 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 단계 a)의 발효에 사용된 재조합 미생물 숙주는 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계 b)를 수행하기에 앞서 제거한다. 바람직하게는, 이와 같이 제거된 재조합 미생물 숙주는 단계 a)의 발효에 재공급된다. 이는 연속식 발효 공정을 허용하는 기술적 이점을 지니고 있는데, 이는 특히 효율적이고 비용 면에서 효과적일 수 있다.
o-아미노벤조에이트 (oAB)는 아미노산이므로; 그의 이온화 상태, 및 수중 용해도는 pH에 좌우되며; 쯔비터이온이 최소 가용성 형태이다. 발효 단계 a)에 사용될 수 있는 발효기에 만연한 pH 7에서는, oAB가 양이온, 예컨대 Na+ 또는 NH4 +로 완충된 음이온으로서 존재한다. 따라서, pH가 등전점으로 떨어질 때까지 산, 예컨대 HCl를 부가하면, oAB 결정의 침전이 유발된다. 따라서, 본 발명에 따르는 방법의 방법 단계 b)는 산 양성자부가에 의해 안트라닐레이트 음이온을 안트라닐산으로 전환시킴으로써 안트라닐산 결정을 포함하는 침전물을 형성하는 것을 포함한다. 이러한 이유 때문에, 방법 단계 b)는 "결정화"로서 지칭될 수도 있다. 구체적으로 언급하면, 단계 a)의 안트라닐레이트 용액을 산, 바람직하게는 HCl과 혼합할 수 있다. 따라서, pH는 2 내지 4, 바람직하게는 3.2 내지 3.6의 값으로 낮출 수 있다. 이로써, 용해도 상의 변화가 유발되고, 안트라닐레이트 결정이 침전된다. 이러한 안트라닐레이트 결정은 후속 단계 c)에서, 바람직하게는 여과에 의해 회수할 수 있다 ("회수"). 상기와 같이 침전된 안트라닐레이트 결정 ("케이크") 중의 잔류 수분과 무기 염 함량은 고체 액체 분리 작동에 좌우된다.
방법 단계 b)를 수행하는 경우, 발효 단계 a)에서 생성된 세포 무함유 수성 발효 브로쓰 내의 안트라닐레이트 염을 먼저, 보다 강산, 바람직하게는 HCl과 반응시킴으로써 양성자 부가하여 안트라닐산을 수득하는데, 여기서 이러한 안트라닐산은 침전되고 방법 단계 c)에서 고체 물질로서 후속 회수된다 ("회수"). 이어서, 안트라닐산을 열 탈카르복실화에 의해 후속 방법 단계 d)에서 아닐린으로 전환시킨다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 실시양태에서, 방법 단계 b)에서 산 양성자부가에 의해 o-아미노벤조에이트를 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 것은 HCl을 첨가하여, 바람직하게는 2.5 내지 4.5의 pH, 보다 바람직하게는 3 내지 4의 pH, 가장 바람직하게는 3.2 내지 3.6의 pH가 되도록 함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 방법 단계 c)에서 침전시킴으로써 안트라닐산을 회수하는 것은 여과함으로써, 상기 회수된 안트라닐산을 포함하는 슬러리를 생성시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 회수된 안트라닐산을 포함하는 슬러리는 바람직하게는, 유기 용매에 용해시킨다. 바람직하게는, 이러한 단계에 사용된 유기 용매는 아닐린 또는 1-도데칸올 또는 그의 혼합물이다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 안트라닐산을 방법 단계 c)에서 유기 용매에 용해시킴으로써 상기 안트라닐산을 회수하는 것은 상기 유기 용매, 바람직하게는 아닐린 또는 1-도데칸올 또는 그의 혼합물을 상기 안트라닐산에 첨가하여, 이러한 안트라닐산이 상기 유기 용매 중의 용질로서 회수되도록 하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 방법의 회수 단계 c)에 이어, 단계 d)의 열 탈카르복실화를 수행하기에 앞서 상기 회수된 안트라닐산 침전물을 세척 및 건조시킬 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 열 탈카르복실화 단계 d)는 특정 촉매의 존재 하에 수행할 수 있다. 이러한 바람직한 촉매는 제올라이트 촉매일 수 있는데, 여기서 상기 제올라이트 촉매는 바람직하게는 제올라이트 H-Y [예를 들어, 제올리스트 인터내셔날(Zeolyst International)로부터 수득되는 바와 같음; 카탈로그 번호 CBV600]이다. 산 촉매 제올라이트 H-Y (SiO2/Al2O3은 5 내지 7일 수 있고, 바람직하게는 5.5이다)는 특히 높은 산성 특질을 가지며; 예를 들어, 강한 산성 특질을 보유하기도 하지만 보다 작은 공극 크기 (0.5 nm)를 가지므로, AA 분자가 산성 촉매의 활성 부위 내로 효과적으로 침투할 수 없고 결과적으로 이러한 활성 부위에 용이하게 접근하지 못함으로써, 그의 유효성이 저하되는 ZSM5-27 [예를 들어, 클라리언트 수에드케미(Clariant SuedChemie)로부터 수득된 바와 같음; 카탈로그 번호 MFI-27, SiO2/Al2O3 = 27] 보다 더 넓은 공극 크기 (0.7-0.8 nm)를 갖고 있다.
방법 단계 d)는 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 단계 c)의 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 것을 포함한다. 잔류 수분을 수반하거나 수반하지 않는, 예를 들어 안트라닐레이트 결정 형태의 안트라닐산은, 바람직하게는 단계 d)가 수행될 수 있는 탈카르복실화 반응기에 상기 안트라닐산을 공급함으로써, 열 탈카르복실화한다. 단계 d)의 열 탈카르복실화는 150℃ 내지 250℃, 바람직하게는 160℃ 내지 220℃, 보다 바람직하게는 180℃ 내지 200℃의 온도에서 작동될 수 있다. 단계 d)의 열 탈카르복실화는 안트라닐산이 반응하여 아닐린으로 되기에 충분한 시간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 단계 d)는 0.5시간 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.
열 탈카르복실화 단계 d)는 열 탈카르복실화의 가속화를 위하여 산 촉매의 존재 하에 수행될 수 있다.
열 탈카르복실화 단계 d)는 용매, 예컨대 물, 아닐린, 또는 1-도데칸올, 바람직하게는 1-도데칸올, 또는 1-도데칸올과 아닐린의 혼합물에서 수행될 수 있다.
추가로, 열 탈카르복실화 단계 d)는 특정 반응기 내에서 수행될 수 있는데, 여기서 이러한 반응기 내의 압력은 반응 동안 얼마나 많은 액체 상이 증발되고, 탈카르복실화의 생성물인 이산화탄소 (CO2)와 함께 반응기를 떠나는지의 함수로서 선택될 수 있다.
추가로, 열 탈카르복실화 단계 d)는 아닐린 유기 용매 혼합물을 생성할 수 있는데, 이어서 이에 동반되거나 용해된 임의의 물 및 아닐린으로 증류할 수 있다. 회수 단계 c)에 사용된 임의의 유기 용매는 "오버헤드(overhead) 생성물"로서 회수될 수 있다. 이어서, 상기 용매를 냉각시키고, 증류를 위해 재순환시킬 수 있다. 이어서, 아닐린을 함유하는 오버헤드 스트림을 증류 단계, 예를 들어 이질공비혼합물성(heteroazeotropic) 증류에 공급할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 열 탈카르복실화 단계 d)에 이어, 바람직하게는 증류에 의해 아닐린을 정제하는 추가 단계 e)를 수행할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 한 실시양태에서, 회수 단계 c) 이후, 용액 ("모액")은 여전히 3 내지 10 g/l 이하의 안트라닐레이트를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 회수 단계 c) 이후, 잔류 안트라닐레이트 음이온을 이온 교환 수지 또는 활성 탄소 물질 또는 제올라이트, 바람직하게는 Fe3+ 또는 Ca2 +로 변형된 제올라이트, 바람직하게는 예를 들어, 실시예 6에 기재되는 바와 같이, 시판용 제올라이트 H-Y (예를 들어, 제올리스트 인터내셔날로부터 수득된 바와 같음 - CBV600)의 이온 교환에 의해 생성될 수 있는 Fe-Y 제올라이트, 예컨대 Fe-Y에 흡착시킨 다음, 회수된 안트라닐레이트 음이온을 탈착시키고, 상기 안트라닐레이트 음이온을 산 양성자부가를 위하여 전환 단계 b)에 재공급함으로써 회수할 수 있다. 상기 회수된 안트라닐레이트 음이온을 탈착시키는 것은 바람직하게는, 5 내지 10의 pH에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 탈착은 5 내지 10의 pH를 갖는 물을 이용하여 수행할 수 있는데, 예를 들어 중성 또는 알칼리성 pH를 갖는 물을 이용할 수 있다. 탈착 후의 용액을 전환 단계 b)에서 산 부가의 상류 및 발효 단계 a) 후의 바이오매스 제거의 하류에 재순환시킬 수 있다.
회수 단계 c) 이후, 잔류 안트라닐레이트 음이온을 이온 교환 수지 또는 활성 탄소 물질 또는 제올라이트에 흡착시킴으로써 회수할 수 있다. 바람직한 제올라이트는 Fe3 + 또는 Ca2 +로 변형되고, 바람직하게는 Fe-Y 제올라이트이다. 이러한 Fe-Y는 실시예 6에 기재되는 바와 같이 제조될 수 있다. 잔류 안트라닐레이트 음이온을 흡착시킨 후, 회수된 안트라닐레이트 음이온을 액체 상 내로 탈착시키는 것을 수행한다. 회수된 안트라닐레이트 음이온의 상기 탈착은 유기 용매 상 내로 또는 수 상에서 일어날 수 있다. 도 7은 제올라이트 Fe-Y 상에 흡착된 AA 분해의 질량 프로파일을 도시한 것이다. 도 8은 제올라이트 Fe-Y로부터 유기 용매 1-도데칸올 [이는 그 내부에서의 AA의 높은 용해도와 수중 낮은 혼화성 (0.004 g/L)으로 인해 바람직한 유기 용매이다] 내로의 AA의 탈착을 도시하 것이다. 도 9는 흡착제로부터 액체 상 내로의 안트라닐산 (AA)의 탈착을 도시한 것이다.
상기와 같이 회수되고 탈착된 잔류 안트라닐레이트 음이온은 산 양성자부가에 의해 이러한 안트라닐레이트 음이온을 안트라닐산으로 전환시키기 위한 전환 단계 b)에 적어도 부분적으로 재공급하는 것이 바람직하다. 이는 상기 방법의 효율을 개선시켜, 심지어 이와 연관된 경제적 이득을 추가로 초래하는 기술적 이점을 갖고 있다.
본 발명에 따르는 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 회수 단계 c) 이후 흡착에 의해 잔류 안트라닐레이트 음이온을 회수한 다음, 흡착된 안트라닐레이트 음이온이 고갈된 수 스트림을 단계 a)의 발효에 적어도 부분적으로 재공급할 수 있다. 또한, 이는 상기 방법의 효율을 심지어 추가로 개선시키는 기술적 이점을 갖고 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 a) 내지 d)는 통합된 공정으로서 연속적으로 수행될 수 있다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 단계 a) 내지 e)는 통합된 공정으로서 연속적으로 수행될 수 있다. 이러한 통합되고 연속된 공정에서, 단계 a)의 발효는 세포 보유와 함께 연속적으로 수행하고, 단계 a)의 발효에서 발효 브로쓰로부터 안트라닐레이트를 연속적으로 제거한 다음, 후속 단계 b) 내지 d), 또는 b) 내지 e)에서 열 탈카르복실화함으로써 연속적으로 처리하여 아닐린을 수득할 수 있다. 따라서 본 발명에 따르는 방법은 통합되고 연속되는 공정일 수 있는데, 이는 생산 비용 면에서 최적화된다. 따라서 본 발명에 따르는 방법은 비-연속적 방식으로 수행되는 보다 전통적인 최첨단 방법과 비교해서, 상응하는 경제적 이득을 수반하면서 보다 고 수율의 아닐린을 초래하는 상당한 기술적 이점을 제공한다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 발효 단계 a)의 원료는 사탕무, 사탕 수수, 전분-함유 식물, 바람직하게는 옥수수, 밀 및 호밀, 및 리그노셀룰로스, 바람직하게는 짚, 목재 및 바가스, 글리세롤 및 C1-화합물, 바람직하게는 CO로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 발효 단계 a)의 상기 발효성 탄소 기질은 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 트리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 여기서 C-5 모노사카라이드는 바람직하게는 크실로스 및 아라비노스이고, C-6 모노사카라이드는 바람직하게는 글루코스, 프럭토스 또는 만노스이며, 디사카라이드는 바람직하게는 사카로스이고, 트리사카라이드는 바람직하게는 케스토스이다.
본 발명에 따르는 방법의 추가 실시양태에서, 발효 단계 a)의 상기 재조합 미생물 숙주는 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 상기 박테리아는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 균주, 코리네박테리움 균주 또는 슈도모나스 균주이고, 여기서 상기 코리네박테리움 균주는 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이며, 상기 슈도모나스 균주는 바람직하게는 슈도모나스 푸티다, 보다 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 KT2440이다. 본질적으로, 상기 언급된 본 발명의 재조합 미생물 숙주 세포 중 임의의 것이 본 발명에 따르는 방법의 발효 단계 a)에 사용될 수 있다.
본 발명의 상이한 실시양태에서,
a) o-아미노벤조에이트를 제공하는 단계 (여기서, 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함한다),
b) 특정 촉매의 존재 또는 부재하에 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐레이트 음이온을 아닐린으로 전환시키는 단계,
c) 단계 b)에서 생성된 아닐린을 유기 용매에서 적어도 1회 추출하는 단계, 및
d) 단계 b) 및 c)에서 생성된 아닐린을 증류에 의해 정제하는 단계 (이러한 증류로 인해 아닐린 및 수 상이 생성된다)
를 포함하는, 아닐린을 생산하는 추가의 방법이 제공된다.
이러한 실시양태에서, 단계 a)에서의 o-아미노벤조에이트는 화학적으로 제공되거나 또는 생물학적으로 생산될 수 있는데, 바람직하게는 이는 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효에 의해 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효시킴으로써 생물학적으로 생산되는데, 여기서 상기 o-아미노벤조에이트는 안트라닐레이트 음이온 및 적합한 양이온을 포함한다.
상기 단계 a)의 발효는 배치식 발효, 유가식 발효 또는 연속식 발효일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 a) 내지 단계 d)는 연속적으로 수행될 수 있다. 단계 a)의 적합한 양이온은 NH4 + 또는 Na+일 수 있다. 단계 a)의 재조합 미생물 숙주는 단계 b)에서 열 탈카르복실화에 의해 상기 안트라닐레이트 음이온을 아닐린으로 후속 전환시키기에 앞서 제거할 수 있는데, 여기서 이와 같이 제거된 재조합 미생물 숙주는 바람직하게는, 단계 a)의 발효에 재공급될 수 있다. 이러한 본 발명의 실시양태에 사용된 촉매는 이질적 산 촉매, 바람직하게는 제올라이트, 가장 바람직하게는 제올라이트 H-Y일 수 있다. 그러나, 상기 촉매는 또한, 이질적 염기 촉매, 바람직하게는 층을 이룬 이중 수산화물, 가장 바람직하게는 Mg-Al 히드로탈사이트일 수 있다.
본 발명에 따르는 추가 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서 유기 용매에서 아닐린을 추출하는 것은 증류에 앞서 아닐린을 추가로 미리 농축시키기 위하여 2회 이상 수행할 수 있다.
본 발명에 따르는 추가 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 단계 c)의 추출에 사용된 유기 용매를 회수하는 것을 포함할 수 있는데, 여기서 이러한 회수는 바람직하게는, 증류에 의해 수행될 수 있고, 상기 회수된 유기 용매는 바람직하게는, 단계 c)에 재공급되어, 단계 b)에서 생성된 아닐린을 추출하기 위하여 다시 재사용될 수 있다. 상기 유기 용매는 알콜, 페놀, 아미드, 에테르 및 방향족 탄화수소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 여기서 상기 알콜은 바람직하게는 1-도데칸올이다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 본 발명의 추가 방법은 단계 a)의 발효에 단계 c)에서 수행된 추출의 수 상을 재공급하고/하거나 단계 d)에서 수행된 증류의 수 상을 재공급하는 추가 단계 e)를 포함할 수 있다. NH4 + 양이온은 단계 d)의 증류에 이어서 NH3으로서 회수될 수 있고, 단계 a)의 발효에 재공급될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 따라서 생성된 아닐린의 용도를 제공하는데, 여기서 단계 d) 및/또는 e)에서 생성된 아닐린은 물 및 촉매의 존재하에 포름알데히드를 이용하여 메틸렌디아닐린 (MDA)으로 추가로 전환시킨다. 이러한 방식으로 생성된 MDA는 포스겐을 이용하여 메틸렌디이소시아네이트 (MDI)로 추가로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 방법 및 재조합 숙주 균주에 대한 각종 변형이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 이러한 변형 및 변이를 포괄하는데, 단 이들은 첨부된 청구범위 및 그들의 등가의 범위 내에 있어야 한다.
도 1은 중앙 대사로부터 전구체 공급을 증가시키는 전략을 보여주는, 씨. 글루타미쿰에서 글루코스에서 oAB (안트라닐레이트)로의 생합성 경로의 도식적 개요 디스플레이를 나타낸다 (PTS: 포스포트랜스퍼라제 시스템; PEP: 포스포에놀피루베이트; TCA: 트리카르본산; IolT2: 이노시톨퍼미아제 단위 T2; PorA/H: PorA와 PorH의 포린 복합체; MFS: 메이어 설비 시스템). 두꺼운 화살표는 증강되는 생합성 단계를 표시하고, X 표는 중단되는 생합성 단계를 표시한다.
도 2는 씨. 글루타미쿰에서의 중앙 탄소 대사의 도식적 개요이다. 글루코스 흡수를 위한 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS), 당분해, 펜토스 포스페이트 경로 및 관련 보충 대사 반응들이 도시되어 있다. TCA (트리카르본산)-사이클 및 시킴산 경로는 이들 경로의 위치 설정 및 이들 경로 내로의 전이를 설명하기 위해 표시된다 (GAPDH = 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제; G6PDH = 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제; 6PGD = 포스포글루코네이트 데히드로게나제; PEP = 포스포에놀피루베이트).
도 3은 씨. 글루타미쿰에서 전구체 분자에서 방향족 아미노산으로의 시킴산 경로의 도시적 개요이다. 중앙 중간체의 구조식이 제공된다.
도 4는 피. 푸티다 KT2440에서 방향족 아미노산 생합성의 유전적 배경을 도시한 것이다. 수행된 유전적 조작이 회색으로 강조된다.
도 5는 발효 단계에서 원료를 안트라닐레이트로 전환시킨 다음, 화학적으로 전환시키고 하류 프로세싱에서 아닐린이 되도록 정제하는 것을 포함하는 본 발명에 따르는 방법의 전반적 개념을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명에 따르는 방법의 전반적 개념을 보다 상세히 도시한 것이다. NaOH와 NH3 둘 다가 발효기에서 완충제로서 사용될 수 있다.
도 7은 100 내지 550℃의 온도 범위에서 Fe-Y 상에 흡착된 안트라닐산 분해물의 질량 프로파일을 도시한 것이다.
도 8은 안트라닐산을 Fe-Y로부터 1-도데칸올 내로 탈착시키는 것을 도시한 것이다. 이 실험은 10.8 mg 안트라닐산을 함유하는 0.2 g Fe-Y를 2 mL 1-도데칸올에 현탁시킴으로써 수행하였다. 슬러리를 25 내지 120℃의 온도 범위에서 0.5 h 동안 교반시켰다. 그 탈착 결과가 도 2에 도시되는데, 여기서 최대 27.8% 안트라닐산이 120℃에서 1-도데칸올 상 내로 탈착될 수 있었다.
도 9는 흡착제로부터 액체 상 내로의 안트라닐산의 탈착을 도시한 것이다. Fe-Y로부터 물 내로의 안트라닐산의 탈착 시험 결과, 수성 용액 중에서 금속-교환된 제올라이트에 의한 안트라닐산의 흡착이 가역적인 것으로 밝혀졌다. 유기 용매 내로의 안트라닐산의 탈착을 시험하였다. 1-도데칸올을 유기 용매로서 선택하였는데, 이는 이러한 유기 용매에서의 안트라닐산의 용해도가 높고 그의 수중 혼화성은 극히 낮기 때문이다 (0.004 g/L).
도 10은 특정 촉매를 이용하여 유기 매질 중에서의 안트라닐산의 분해를 도시한 것이다. 160℃ 및 180℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 1-도데칸올에 3 wt%로 용해된 안트라닐산의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다. 안트라닐산 (3 wt%)이 1-도데칸올에 용해되었다. 이러한 농도에서는 상기 산이 심지어 실온에서도 유기 용매에 완전히 가용성이었다. 이어서, 80 mL의 상기 용액을 160 mL의 오토클레이브 내로 옮기고, 1.5 g의 제올라이트 촉매를 가하며 160℃ 또는 180℃로 가열한다. 비교를 위하여, 촉매를 수반하지 않은 블랭크 시험 (블랭크)과 알칼리성 히드로탈사이트 (HTC), H-ZSM5, 나트륨 도핑된 제올라이트 Y (NaY), 제올라이트 Y 암모늄 형태 (NH4-Y)를 수반한 시험을 또한 시험하였다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하고, 아닐린 형성률을 결정하기 위하여 HPLC 방법에 의해 분석하였다.
도 11은 pH 5에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MES 완충제를 수반함)을 33 h에 걸쳐 추적한 (삼중 결정), 균주 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 및 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다. 씨. 글루타미쿰을 pH 7에서 부가적으로 배양하였다 (MOPS 완충제가 보충됨).
도 12는 pH 7에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 25 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 및 사카로마이세스 세레비지아에의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 13은 3 g/L oAB가 보충된 pH 7에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 25 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 및 사카로마이세스 세레비지아에의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 14는 전혀 보충되지 않았거나 (흑색) 또는 3 g/L oAB가 보충된 (회색) pH 7에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 25 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 15는 전혀 보충되지 않았거나 (흑색) 또는 3 g/L oAB가 보충된 (회색) pH 7의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 25 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 슈도모나스 푸티다의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 16은 3 g/L pAB가 보충된 pH 7에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 27 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 에스케리키아 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 슈도모나스 푸티다, 및 사카로마이세스 세레비지아에의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 17은 0.1 g/L 옥탄올이 보충된 (흑색과 회색이 이중으로) pH 7에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 25 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 18은 0.1 g/L 옥탄올이 보충된 (흑색과 회색이 이중으로) pH 7에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 (MOPS 완충제를 수반함)을 25 h에 걸쳐 추적한 (이중 결정), 균주 슈도모나스 푸티다의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 19는 pH 7에서 100-mL-진탕 플라스크 배양물을 25 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다 (그래프에 나타낸 바와 같이 보충됨; 이중).
도 20은 pH 5에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물을 25 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다 (그래프에 나타낸 바와 같이 보충됨; 이중).
도 21은 pH 7 (MOPS) 및 pH 5 (MES)에서의 100-mL-진탕 플라스크 배양물을 28 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다 (그래프에 나타낸 바와 같이 보충됨; 이중).
도 22는 0 g/L 보충물 (사각형), 7 g/L oAB (원형), 7 g/L pAB (X표), 40 mg/L 도데칸올 (삼각형)의 최종 농도가 되도록 3, 4, 및 5 h 후에 보충된 pH 7에서의 발효 배양물을 50 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 23은 2 h (oAB로 보충하기 전), 5 h (7 g/L oAB로 보충한 후), 25 h, 및 49.5 h 후 7 g/L oAB를 수반한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효의 배양 상등액의 254 nm에서의 HPLC-크로마토그램을 도시한 것이다. + oAB 표준.
도 24는 0 g/L 보충물 (사각형), 15 g/L oAB (삼각형), 35 g/L pAB (X표), 및 80 g/L oAB (원형)의 최종 농도가 되도록 3, 4, 5, 6 및 7 h 후에 보충된 pH 7에서의 발효 배양물을 58 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 25는 35 g/L oAB의 최종 농도가 되도록 3, 4, 5, 6 및 7 h 후에 보충된 pH 7에서의 발효 배양물을 58 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 26은 80 g/L oAB의 최종 농도가 되도록 3, 4, 5, 6 및 7 h 후에 보충된 pH 7에서의 발효 배양물을 58 h에 걸쳐 추적한, 코리네박테리움 글루타미쿰의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 도시한 것이다.
도 27은 벡터 시스템 pEMG에 근거한 녹아웃 과정의 도식을 나타낸다.
도 28은 피. 푸티다 KT2440 trpEGDC 클러스터의 유전자 지도 (위) 및 피. 푸티다 KT2440 trpDC 결실의 유전자 지도 (아래)를 도시한 것이다 (gph: 포스포글리콜레이트 포스파타제 (부분); trpE: 안트라닐레이트 신타제 성분 I; GDSL: GDSL 계열 리파제 (L-트립토판 생합성과 무관함); hyp: 가설 단백질; trpG: 안트라닐레이트 신타제 성분 II; crg: cAMP-조절성 단백질 (부분); TS1: 결실 플랭크 1; TS2: 결실 플랭크 2).
도 29는 피. 푸티다 KT2440 serCpheAtyrA 클러스터의 유전자 지도 (위) 및 둘쑥날쑥한 피. 푸티다 KT2440 pheA 결실의 유전자 지도 (아래)를 도시한 것이다 (gyrA: DNA 자이라제 소단위 A (부분); serC: 포스포세린 아미노트랜스퍼라제; pheA: 코리스메이트 무타제 / 프레페네이트 데히드라타제; tyrA: 프레페네이트 데히드로게나제 / 3-포스포시키메이트 1-카르복시비닐트랜스퍼라제; cmk: 시티딜레이트 키나제; TS1: 결실 플랭크 1; TS2: 결실 플랭크 2).
도 30은 1 L 실험실 규모 바이오반응기에서 세포 보유를 수반하면서 연속식 발효하기 위한 직교류 한외여과 모듈 (750 kDa의 값의 컷)의 통합을 도시한 것이다.
도 31은 1 L 실험실 규모 바이오반응기에서 세포 보유를 수반하면서 연속식 발효하기 위한 원심분리기 [센트리텍 랩(Centritech Lab) III]의 통합을 도시한 것이다.
도 32는 1 L의 배양 용적, 희석 속도 0.05 L/h, 1 M NH4OH로 제어된 pH 7에서의 배양 온도 30℃, 통기를 위한 공기 유속 0.2 L/min, 교반기 속도를 200 내지 1200 rpm으로 조정함으로써 30% 공기 포화하에 제어된 pO2를 이용하여 배치식 및 연속식 동안 oAB를 생산하기 위한 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD의 발효를 도시한 것이다. 세포 보유는 직교류 한외여과에 의해 달성되었다.
도 33은 1 L의 배양 용적, 희석 속도 0.01 L/h, 1 M NH4OH 및 1 M HCl로 제어된 pH 7에서의 배양 온도 30℃, 통기를 위한 공기 유속 0.2 L/min, 교반기 속도를 200 내지 1400 rpm으로 조정함으로써 30% 공기 포화하에 제어된 pO2를 이용하여 배치식 및 연속식 동안 oAB를 생산하기 위한 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δgpi의 발효를 도시한 것이다. 세포 보유는 원심분리에 의해 달성되었다.
도 34는 1 L의 배양 용적, 본 다이아그램에 언급된 바와 같은 희석 속도 0.025 L/h 또는 0.05 L/h, 1 M NH4OH로 제어된 pH 7에서의 배양 온도 30℃, 통기를 위한 공기 유속 0.2 L/min, 교반기 속도를 200 내지 1200 rpm으로 조정함으로써 30% 공기 포화하에 제어된 pO2를 이용하여 oAB를 연속적으로 생산하기 위한 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD의 발효를 도시한 것이다. 세포 보유는 직교류 한외여과에 의해 달성되었다.
도 35는 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 160℃, 180℃ 및 200℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
도 36은 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 200℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린 및 10% 물-90% 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
도 37은 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 180℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
도 38은 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 180℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
도 39는 신선하게 제조된 H-Y 촉매, 및 가수분해된 옥수수 전분으로부터 단리된 AA를 이용하여 상기와 같은 반응 후의 것의 IR 스펙트럼을 도시한 것이다. 아닐린에 대한 특유의 밴드가 표시된다. 이러한 고도의 염기성 종의 흡수가 일어난다. OH 영역이 또한 강조된다. OH 시그널의 감소는, 존재하는 미량 원소와 함께 일어날 수 있었던 일부 부분 이온 교환과 화합성이지만, OH 기는 상기 촉매에서 활성이 아닌 것으로 여겨지고, Al-O-Si 브릿지가 그 책임이 있는 것으로 예상된다.
표의 목록
표 1은 본 발명의 연구에 사용되고/되거나 생성된 벡터 및 플라스미드를 나타낸다.
표 2는 본 발명의 연구에 사용되고/되거나 생성된 박테리아 균주를 나타낸다.
표 3은 본 발명의 연구에 사용된 프라이머를 나타낸다.
표 4는 본 발명의 연구에 사용되고/되거나 생성된 박테리아 균주의 oAB 생산에 대한 특징을 나타낸다 (CDW: 세포 건조 중량; Y: 수율; μmax: 최대 성장률; STY: 공간 시간 수율).
표 5는 TrpEG 활성에 대한 TrpEG의 상이한 변이체를 생산하는 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD 조 추출물의 생화학적 특징을 나타낸다.
표 6은 실시예 6에 기재되는 바와 같이, HAP, 제올라이트 Y (GO257 및 GO55) 및 ZSM5 (ZSM5-27 및 ZSM5-55)에 의한 수중 AA 0.5%의 흡착을 나타낸다.
표 7은 실시예 6에 기재되는 바와 같이, 10분 및 60분 후 증류수 및 완충된 수용액 중에서 금속-교환된 제올라이트 GO257의 AA 흡착 용량 (g AA/kg 흡착제)을 나타낸다.
실시예
실시예 1 - 이. 콜라이를 이용한 o- 아미노벤조에이트의 생산
균주 이. 콜라이 W3110 trpD9923 (에스케리키아 콜라이::trpD9923; 표 2)을 예일 대학의 이. 콜라이 유전 자원 센터로부터 구입하였다. 상기 균주는 무작위 돌연변이 유발시킴으로써 창출시켰고, 이는 trpD9923으로 불리는 돌연변이된 trpD 유전자를 함유하였다. 상기 효소의 불활성화는 트랜스퍼라제 활성 코딩 영역에서의 넌센스 돌연변이를 초래하는, 관련 유전자에서의 무작위 점 돌연변이 (G→T)에 의해 달성되었다. 그 결과로서, 본래의 트랜스퍼라제 도메인의 7개 아미노산만이 번역된다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). trpD9923 유전자의 관련된 말단절단된 효소는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제의 반응을 촉매할 수 있는 그의 능력을 상실하지만, 그의 안트라닐레이트 신타제 활성은 유지하고 있다. 따라서, 상기 균주는 안트라닐레이트를 합성할 수 있지만, 그를 L-트립포판으로 추가로 대사할 수 없으므로, L-트립포판 영양요구 균주이다. 이로써 안트라닐레이트가 축적된다.
상기 균주를 140 rpm 하의 28℃에서 10 mL 배양 용적을 갖는 50 mL 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 사용된 배지는 20 mg/L L-트립토판을 수반한 미네랄 배지 M9 [1 g/L (NH4)2Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.05 g/L 티아민, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.247 g/L MgSO4·7H2O (머크 (Merck; 독일 다름슈타트)), 0.015 g/L CaCl2, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다]였다. 상기 균주는 HPLC-DAD (254 nm)에 의해 측정된 바와 같이 25.5 h 후에 60 mg/L 안트라닐레이트를 생산하였다 (표 4 및 실시예 3). 녹아웃 결실을 이용하여 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)을 불활성화함으로써 상기 균주를 추가로 최적화하였다. 따라서, 이로써 생성되는 PTS-결핍성 균주 에스케리키아 콜라이::trpD9923Δhpr (표 2)을 생성시키고, 글루코스 상에서 성장하도록 적응시키며, 10 mL의 배양 용적을 이용하여 150 rpm 하의 37℃에서 25 mL 진탕 플라스크 발효를 이용하여 안트라닐레이트 생산에 관하여 시험하였다. pts 양성 균주에 대해서와 동일한 배지를 사용하였다. 이는 HPLC-DAD (254 nm)에 의해 측정된 바와 같이 25시간 후에 69 mg/L의 안트라닐레이트를 생산하였다 (표 4 및 실시예 3).
실시예 2 - o- 아미노벤조에이트를 생산하는 미생물 균주를 발생시키기 위한 균주 선별
생명공학 산업에 흔히 사용되고 있는 몇 가지 균주를 대상으로 하여, oAB에 대한 및 나중의 생성물 추출을 위한 해당 유기 용매 (예를 들어, 1-도데칸올 또는 옥탄올)에 대한 그들의 자연 내성에 관하여 조사하였다. 더욱이, 사용된 pH 값의 영향을 조사하였다. 기존의 실험으로부터, 적어도 이. 콜라이의 경우에는, 방향족 화합물의 독성이 pH 값에 상당히 좌우되는데, 이는 아마도, 양성자 부가된 산이 세포막을 훨씬 더 효율적으로 침투할 수 있으므로, 이에 따라 그들의 독성이 심각하게 증가하기 때문인 것으로 공지되어 있다. 유기 상에서 oAB를 추출하는 것이 oAB의 등전점에 근접한 낮은 pH 값에서 가장 잘 작동하는 것으로 추정된다. 가장 관련이 있는 것으로 고려되는 숙주 균주는 다음과 같다: 에스케리키아 콜라이 K12, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 20300 (= ATCC 13032), 슈도모나스 푸티다 KT2440, 바실루스 서브틸리스 아종 168, 사카로마이세스 세레비지아에 DSM 70449, 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) X33 (DSM 70382).
상기 선택된 균주를 대상으로 하여 상기 언급된 특징에 관하여 조사하기 위하여, 진탕 플라스크 및 소규모 발효 실험을 수행하였고, 유기체를 상이한 농도, 상이한 pH 값의 독성 물질 (아미노벤조에이트, 용매)로 보충하였으며, 이들 균주의 거동을 연구하였다.
상기 유기체 [DSMZ (미생물 및 세포 배양물의 독일 컬렉션; 독일 브라운슈바이크)에서 주문하여 상업적으로 수득함]들을 먼저, 진탕 플라스크 및 맞춤형의 공개된 표준 최소 배지 중의 이들 각각에서 배양하여 표준 배양 조건하에서의 그들의 성장을 명확히 규명하였다 [씨. 글루타미쿰: 예비배양물: BHI 배지 (37 g/L; 뇌-심장 침출액; 벡톤 디켄슨 앤 캄파니 (Becton Dickenson and Company; 독일 하이델베르크)); 주 배양물 pH 7: CGXII-MOPS 배지 (42 g/L MOPS 완충제, 20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific; 독일 슈베르테)), 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.01 g/L CaCl2, 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨))]. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다. 다음 성분들을 멸균성 여과 후에 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.01 g/L MnSO4·H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.01 g/L FeSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.02 mg/L NiCl2·6H2O (머크; 독일 다름슈타트), 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산 [아크로스 오가닉스 (Acros Organics; 독일 니데라우)]; 주 배양물 pH 5: CGXII-MES 배지 [39 g/L MES 완충제, 20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아 (피셔 사이언티픽; 독일 슈베르테), 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.01 g/L CaCl2, 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)]. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 5로 조정하였다. 다음 성분들을 멸균성 여과 후에 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.01 g/L MnSO4·H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.01 g/L FeSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.02 mg/L NiCl2·6H2O (머크; 독일 다름슈타트), 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산 (아크로스 오가닉스; 독일 니데라우); 이. 콜라이: 예비배양물: LB 배지 [루리아-베트타니(Luria-Bertani); 로스 (Roth; 독일 칼스루에)]; 주 배양물 pH 7: M9 배지 [1 g/L (NH4)2Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.05 g/L 티아민 클로라이드, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.247 g/L MgSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.015 g/L CaCl2, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다]; 주 배양물 pH 5: M9-MES 배지 [19.5 g/L MES 완충제, 1 g/L (NH4)2Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.05 g/L 티아민 클로라이드, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.247 g/L MgSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.015 g/L CaCl2, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다]; 비. 서브틸리스 (B. subtilis): 예비배양물: LB 배지; 주 배양물 pH 7: M9-SL 배지 [1 g/L (NH4)2Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.05 g/L 티아민, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.247 g/L MgSO4·7H2O, 0.015 g/L CaCl2, 1.0 mg/L MnCl·H2O, 1.35 mg/L FeCl·6H2O, 1.7 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.04 mg/L CuCl·2H2O, 0.06 mg/L CoCl2·6H2O, 0.06 mg/L Na2MoO4·2H2O, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다]; 주 배양물 pH 5: M9-SL-MES 배지 [19.5 g/L MES 완충제, 1 g/L (NH4)2Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.05 g/L 티아민, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.247 g/L MgSO4·7H2O, 0.015 g/L CaCl2, 1.0 mg/L MnCl·H2O, 1.35 mg/L FeCl·6H2O, 1.7 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.04 mg/L CuCl·2H2O, 0.06 mg/L CoCl2·6H2O, 0.06 mg/L Na2MoO4·2H2O, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 5로 조정하였다]; 피. 푸티다: 예비배양물: LB 배지; 주 배양물 pH 7: 브루너(Brunner) 배지 [0.5 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.05 g/L CaCl2, 5.0 mg/L EDTA, 2.0 mg/L FeSO4·7H2O, 0.03 mg/L MnCl·H2O, 0.1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.01 mg/L CuCl·2H2O, 0.2 mg/L CoCl2·6H2O, 0.03 mg/L Na2MoO4·2H2O, 0.3 mg/L H3BO3, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다]; 주 배양물 pH 5: 브루너-MES 배지 [19.5 g/L MES 완충제, 0.5 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.2 g/L MgSO4·7H2O, 0.05 g/L CaCl2, 5.0 mg/L EDTA, 2.0 mg/L FeSO4·7H2O, 0.03 mg/L MnCl·H2O, 0.1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.01 mg/L CuCl·2H2O, 0.2 mg/L CoCl2·6H2O, 0.03 mg/L Na2MoO4·2H2O, 0.3 mg/L H3BO3, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O, 및 10 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 5로 조정하였다]; 에스. 세레비지아에: 예비배양물: YPD 배지 [10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 펩톤, 20 g/L 글루코스]; 주 배양물 pH 5: SCM 배지 [5 g/L (NH4)2SO4, 3 g/L KH2PO4, 2.5 g/L MgSO4·7H2O, 0.5 g/L NaCl, 20 mg/L 이노시톨, 5 mg/L 티아민, 1.32 mg/L 리보플라빈, 17.8 mg/L 칼슘 판토테네이트, 18.4 mg/L 니코틴산, 5.16 mg/L 피리독신-HCl, 0.18 mg/L 바이오틴, 0.12 mg/L 엽산, 40.6 mg/L FeCl3·6H2O, 6.0 mg/L ZnCl2·4H2O, 3.0 mg/L CaCl2·2H2O, 5.76 mg/L CuSO4·5H2O, 6.0 mg/L CoCl2·6H2O, 6.0 mg/L Na2MoO4·2H2O, 1.56 mg/L H3BO3, 및 5 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 5로 조정하였다] (Sambrock J; Fritsch, EF, and Maniatis, T: Molecular Cloning - a laboratory manual. Cold Spring Larbor Laboratory Press; 1989; New York; Harwood CR, Cutting SM: Molecular biological methods for Bacillus. Chichester, England: John Wiley & Sons Ltd; 1990; Keilhauer, C, Eggeling, L, Sahm, H: J Bacteriol, 1993, 175(17): 5595). 이들 실험을 pH 7 및 pH 5의 배지로 수행하여 낮은 pH 값에서 아미노벤조에이트의 독성 상의 차이를 평가하였다. 효모 균주는 단지 7 아래의 pH 값 (5.5 및 3.5)에서 조사하였다. 상이한 pH 값은 상이한 완충제 시스템 (MOPS, MES)을 부가함으로써 안정화시켰다.
상기 균주의 100-mL-진탕 플라스크 배양물 [pH 5 (MES 완충제를 수반함)]을 33 h 동안 인큐베이션하고, 시간 경과에 따라 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 측정함으로써 그 성장을 추적하였다 (삼중 결정). 씨. 글루타미쿰을 pH 7에서 부가적으로 배양하였다 (MOPS 완충제를 수반함). 도 11은 그 결과를 나타낸다.
수집된 데이터는 씨. 글루타미쿰이 조사된 모든 유기체의 pH 5에서 가장 우수한 성장을 나타낸다는 사실을 보여주었다. 이. 콜라이, 피. 푸티다, 및 에스. 세레비지아에는 pH 5에서 극도로 약하게 성장하였다. 그럼에도 불구하고, 일부 배양물에서는, 대사 활성으로 인해 상기 pH가 부가적으로 4 아래로 떨어졌다. 대사 활성으로 인한 성장 효과를 배제하기 위하여, pH 자동 조절기가 부착된 발효기에서 상기 실험을 수행하였다. 예상된 바와 같이, 낮은 pH에서 배양하면 시험된 모든 유기체의 성장률이 감소되는 것으로 이미 관찰되었다. 그러나, pH 7하에서의 표준 배양 조건 하에 고려된 모든 유기체의 성장을 비교하기 위하여, MOPS 완충제로 보충된 모든 최소 배지를 이용하여 상기 실험을 반복하였다. 부가적으로, 유사한 배양물에 oAB를 보충시켰다 [3 g/L의 최종 농도; 지수 성장기를 시작할 때 3회 분량으로 나누어 (2, 3, 4 h 인큐베이션 시간 후) 부가하였다]. 3 g/L oAB로 보충되거나 보충되지 않은, pH 7하에서의 상기 균주의 100-mL-진탕 플라스크 배양물을 25 h 동안 인큐베이션하고, 시간 경과에 따라 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)를 측정함으로써 그 성장을 추적하였다 (이중 결정) (도 12 및 도 13). 씨. 글루타미쿰은 선택된 배양 조건하에서 가장 높은 OD600 값에 도달하였고, 더욱이 그의 성장은 3 g/L oAB의 부가에 의해 억제되지 않은 반면, 다른 유기체, 예를 들어 비. 서브틸리스의 성장은 3 g/L oAB에서 이미 강력하게 저하되었다. 이들 결과로부터, 씨. 글루타미쿰이 pH 7에서 oAB 생산을 위한 바람직한 후보로서 확인되었다 (도 14 및 도 15).
파라-아미노벤조에이트 (pAB) 및 용매 (옥탄올 및 1-도데칸올)에 대항하는 것으로 간주된 균주의 저항성을 조사하기 위하여, 이들 균주를 앞서 기재된 바와 같이 pH 7에서 (에스. 세레비지아에는 pH 5.5에서) 배양하고 3 g/L pAB로 보충시켰다 (도 16). 씨. 글루타미쿰, 이. 콜라이, 피. 푸티다, 및 피. 파스토리스 (P. pastoris)의 성장은 이들 조건하에 pAB에 의해 억제되지 않은 반면, 에스. 세레비지아에 및 비. 서브틸리스의 성장은 심각하게 저하되었다. 추출 용매 옥탄올의 독성을 조사하였다. 옥탄올의 수중 용해도는 약 0.1 g/L이므로, 배양물을 상기 옥탄올 양으로 보충시켰고 또한 3 g/L의 양으로 보충시켰다. 이미 0.1 g/L에서도 모든 유기체가 성장할 수 없었지만, 3 g/L 옥탄올에서는 그것이 더욱 분명해진 것으로 밝혀졌다. 피. 푸티다 만이 옥탄올 부가 후에 미미한 수준의 성장 활성을 나타냈다 (도 17 및 도 18).
수행된 모든 실험에서와 같이, 씨. 글루타미쿰은 가장 높은 세포 밀도와 가장 우수한 저항성 능력을 나타냈고, 이러한 균주는 pH 5 및 pH 7에서 각각 5 g/L oAB 및 5 g/L pAB와 함께 유사하게 배양하였다. 이들 조건하에서는 성장 억제가 전혀 검출되지 않았다 (도 19 및 도 20). pH 5에서, 세포 밀도가 반으로 줄었으므로, 상기 발효는 pH 7에서 수행하는 것이 보다 바람직하다는 결론에 이르렀다.
도데칸올을 대체 추출 용매로서 조사하였다. 도데칸올은 약 40 mg/L의 수중 용해도를 나타낸다. 씨. 글루타미쿰을, 40 mg/L 1-도데칸올을 보충시키면서 pH 5 및 7하에서 상기 언급된 바와 같이 배양하였다. 도데칸올은 이들 조건하에서 상기 균주의 성장에 영향을 미치지 못하였다 (도 19 및 도 20 참조).
씨. 글루타미쿰을 이용하여 진탕 플라스크 실험에서 수득된 결과를 소규모 발효기에서 재현하였다 (도 21). pH 7에서 아미노벤조에이트 및 1-도데칸올 스트레스에 대항한 씨. 글루타미쿰의 저항성을 추가로 명확히 규명하기 위하여, 조절된 pH, 진탕, 산소 공급, 온도 및 글루코스 공급을 수반하는 1 L-4배-발효 유닛 [하이텍창(HiTecZang)]을 이용하여 상기 유기체의 소규모 발효를 수행하였다. 글루코스 공급으로, 상기 균주는 보다 높은 세포 밀도로 성장할 수 있었다.
최소 배지 pH 7 (상기 언급된 바와 같지만, MOPS, 바이오틴, 프로토카테쿠아트(protocathecuat) 및 우레아를 부가하지 않는다)에서 씨. 글루타미쿰을 이용하고, 하나의 발효기에 아무것도 보충하지 않고 (양성 대조군), 하나의 발효기에 7 g/L oAB를 보충하며, 하나의 발효기에 7 g/L pAB를 보충하고 하나의 발효기에 40 mg/L 1-도데칸올을 보충하면서 발효 실험을 수행하였다. 이로써 생성된 성장 곡선은 씨. 글루타미쿰의 성장이 부가된 1-도데칸올에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 이는 진탕 플라스크에서 수득된 결과를 확증시켜 주었다 (도 22 참조). oAB 및 pAB로 각각 보충시키면, 장기간의 지체기가 초래되었지만, 최종적으로는 동일한 세포 밀도에 도달하였다 (도 22 참조). 1-도데칸올이 적합한 oAB 추출 용매라고 결론지었다.
아미노벤조에이트의 농도를 추가로 증가시켜, 이것이 씨. 글루타미쿰의 성장을 상당히 억제시키는 그 경계를 발견하였다. 아미노벤조에이트가 상기 유기체에 의해 분해되었으므로, 그 성장이 장기간의 지체기 후에 복원된다는 사실을 배제시켜야만 한다. 발효기 내에서 아미노벤조에이트 안정성을 조사하기 위하여, 발효 동안 배양 상등액 샘플을 수집하고, 이를 HPLC-DAD (254 nm)에 의해 분석하였다. (도 23 및 실시예 3 참조). 배양 동안에는 아미노벤조에이트가 상당히 분해되지 않았다.
추가 실험에서는, oAB의 농도를 증가시켜 씨. 글루타미쿰 균주에 대한 효과를 조사하였다. 지금까지 4개의 발효기에 0 g/L, 15 g/L, 35 g/L 및 80 g/L의 oAB를 보충하였다. pH 7하에서 상기 고 농도에서의 산의 가용성을 달성하기 위하여, 상기 산을 수산화암모늄으로 적정하여 스톡 용액 중에 oAB의 상응하는 암모늄 염을 형성하였는데, 이는 나중에 5회 분량으로 나누어 5 h에 걸쳐 발효기에 부가하였다 (3, 4, 5, 6, 및 7 h의 배양 후). 나머지 배양 조건은 상기 언급된 바와 같이 유지하였다. 80 g/L oAB를 부가하면, 54시간에 걸쳐 세포가 사멸하였고 (용해), 35 g/L oAB를 부가하면, 성장이 억제되었다 (도 24, 도 25, 및 도 26 참조). 배양물에 15 g/L oAB를 보충하면, 성장이 회복되고 세포가 지수기로 들어가기 전에 34 내지 48시간에 걸쳐 광범위한 지체기가 나타났다 (도 24 참조). 발효 동안의 oAB 분해는 배양 상등액을 HPLC 측정함으로써 다시 배제되었다 (데이터는 제시되지 않음).
취합해 보면, oAB의 생산은 가장 바람직하게는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주를 이용하여 수행해야 한다는 결론이 났다. 더욱이, 발효 공정은 바람직하게는 pH 5 내지 7에서 수행해야 하고, 보다 바람직하게는 pH 7에서 수행해야 하며, 추출 (필요한 경우)은 바람직하게는, 추출 용매로서 1-도데칸올을 이용하여 수행해야 한다는 결론이 났다. 옥탄올은 적합한 추출 용매가 아니었다.
실시예 3 - 씨. 글루타미쿰을 이용한 o- 아미노벤조에이트의 생산
g/L 규모로 안트라닐레이트를 생산하는 박테리아 균주를 개발하였다. 이러한 작업은 (예를 들어, 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰에서) 트립토판 생산자를 유전적으로 조작하는 것에 근거하였고, 안트라닐레이트 (oAB) 생산자를 획득하기 위하여 중앙 대사, 공통의 방향족 생합성 및 L-트립토판 분지 경로를 유전적으로 조작하는 전략을 개발하고 실행하는 것을 포함하였다. 상기 언급된 결과에 근거하여, 대사 공학은 바람직하게는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 근거하였다.
에스케리키아 콜라이 DH5α 기반 균주의 일반적 배양
다르게 표시하지 않는 한, 모든 화학물질은 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich; 독일 슈테른하임)로부터 획득하였고, 적용된 모든 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs; 독일 슈발바흐)로부터 획득하였다. 이. 콜라이 균주를 37℃하에 LB 배지 (루리아-베르타니; 루스; 독일 칼스루에)에서 또는 LB-한천 (Abcr GmbH & Co. Kg; 독일 칼스루에) 판 상에서 멸균성 조건하에 배양하였다. 항생제 (100 mg/L 암피실린 나트륨 염; 50/25 mg/L 카나마이신 술페이트; 100 mg/L 스펙티노마이신 술페이트)를 부가함으로써 선택적 배양을 달성하였다. 플라스미드 제조를 위하여, 상기 균주를 3 mL LB 배지에서 200 rpm으로 일정하게 진탕시키고 37℃하에 항생제 선택하면서 14시간 내지 16시간 동안 15 mL-튜브에서 배양하였다 [쿠흐너 쉐이커(Kuhner Shaker) ISF-4-W; 아돌프 쿠흐너 아게 (Adolf Kuhner AG; 스위스 바젤)].
일반적 분자 생물학 방법
약 50 ng PCR 주형 및 10 pmol의 반응하는 프라이머 쌍 (표 3 참조)을 이용하고 플래티늄 (Platinum®) Taq DNA 폴리머라제 [5 U/μL; 라이프 테크놀로지 (Life technologies; 독일 다름슈타트)]를 사용하여, PCR 반응을 일반적으로 수행하였다. PCR 조건: 98℃ 5 min, 98℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 1 min/kb, 30x, 16℃ 유지 [마스터사이클러 넥서스(Mastercycler® nexus) - 사이클러; 에펜도르프 (Eppendorf; 독일 함부르크)]. 제조업자의 지시에 따라서 뉴클레오스핀(NucleoSpin®) 플라스미드 퓨어 키트 [마세레이 앤 나겔 (Macherey & Nagel; 독일 뒤렌)]를 사용하여 플라스미드 DNA 정제를 수행하였다. 플라스미드 DNA 소화를, 5 U의 관련 제한 효소(들) 및 완충제 중의 약 1 μg 플라스미드 DNA (효소 공급업자에 의해 권장됨)를 이용하여 20 μL 규모로 수행하고, 37℃하에 약 2시간 동안 인큐베이션한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 1xTAE 전기영동 완충제 [프로메가 (Promega; 미국 피치버그)]에 용해된 1% 아가로스 (Abcr GmbH & Co. Kg; 독일 칼스루에)를 이용하여 아가로스 겔을 만들었다. 공급된 전기장은 90 V 내지 120 V [EPS300; 파르마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech); VWR 인터내셔날 게엠베하 (VWR International GmbH; 독일 다름슈타트)]였고, 에티듐 브로마이드 (0.3 내지 0.5 mg/L) 또는 미도리 그린(Midori Green) [미도리 그린 어드밴스 DNA 균주; 일본 제네틱스 유럽 게엠베하 (NIPPON Genetics EUROPE GmbH; 독일 뒤렌)]을 통하여 상기 DNA를 검출하였다. 겔 문서화: 진 제니우스(Gene Genius®); VWR; 독일 다름슈타트. 아가로스 겔 DNA 추출을 위하여, 뉴클레오스핀® 겔 및 PCR 클린-업 키트 (마세레이 앤 나겔; 독일 뒤렌)를 제조업자에 의해 명시된 바와 같이 사용하였다. DNA 라이게이션을 위하여, T4-DNA 리가제 (20 U)를 제조업자에 의해 공급된 완충제에 사용하였다. 사용된 삽입물 대 플라스미드 질량비는 4:1이었다. 이 혼합물을 16℃하에 약 15시간 동안 인큐베이션한 후, 65℃하에 10분 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드 및 라이게이션 반응물을 전기-적격한 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포 [일렉트로맥스(ElectroMAX™) DH5α-E™ 적격 세포; 라이프 테크놀로지; 독일 다름슈타트] 내로 도입하였다. 진 펄서 엑스셀(Gene Pulser Xcell) 시스템 [바이오래드 (BioRad; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스)]을 이용하여 0.2 cm 갭 전기천공 큐벳 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스)에서 전기-형질전환 (조건: 약 20 ms 기하급수적으로 소멸하는 펄스, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω) 후, 800 μL LB 회수 배지를 즉시 부가하고, 현탁액을 1.5 mL 미소원심분리용 튜브 내로 옮겼다. 37℃ 하에 1 h 후, 세포 현탁액을 LB 한천 판 상으로 확산시키고, 적당한 항생제를 보충시키며, 37℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 클론을 수집하고, 제한 분석, 집락 PCR 및/또는 서열 분석을 통하여 정확한 형질전환을 확증하였다. 집락들을 집락 PCR 분석하기 위하여, 특정 집락을 멸균성 이쑤시개로 잡고, 별도의 판 (마스터 판)으로 옮기며, 1 μL DMSO에 용해시키고, 98℃에서 10분 동안 비등시킨 후, 이를 표준 PCR 혼합물 내로 부가하였다. 모든 플라스미드의 정확한 클로닝 및 관련 돌연변이체의 생성은 PCR 및/또는 DNA 서열 분석에 의해 입증되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반 균주의 일반적 배양
씨. 글루타미쿰 균주를 30℃하에 BHI 배지 (37 g/L; 뇌-심장 침출액; 벡톤 디켄슨 앤 캄파니; 독일 하이델베르크) 튜브, 진탕 플라스크에서 또는 한천 판 상에서 멸균성 조건하에 배양하였다. 항생제 (15 mg/L 카나마이신 술페이트; 100 mg/L 스펙티노마이신 술페이트)를 부가함으로써 선택적 배양을 달성하였다.
균주 성상 확인을 위하여, 첫 번째 예비배양물을 단리된 집락으로부터 시작하고, 4 mL BHI 배지에서 400 rpm로 일정하게 진탕시키면서 10시간 동안 배양하며, 균주에 따라서 적합한 항생제 또는 방향족 아미노산으로 보충시켰다. 두 번째 예비배양물을 50 mL CGXII-MOPS 배지 [42 g/L MOPS 완충제, 20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아 (피셔 사이언티픽; 독일 슈베르테), 3.7 g/L 뇌-심장 침출액, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.01 g/L CaCl2, 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)]에서 성장시켰다. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다. 1 mL의 상기 첫 번째 예비-배양물을 접종한 후 250 mL 진탕 플라스크에서 다음 성분들을 멸균성 여과 후에 부가하고, 400 rpm으로 일정하게 진탕시키면서 16시간 내지 18시간 동안 배양하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.01 g/L MnSO4·H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.01 g/L FeSO4·7H2O (머크; 독일 다름슈타트), 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O (머크; 독일 다름슈타트), 0.02 mg/L NiCl2·6H2O (머크; 독일 다름슈타트), 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산 (아크로스 오가닉스; 독일 니데라우). 발효 배양물을 100 mL CGXII 배지 [20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2, 100 μL/L 폴리프로필렌글리콜 (별도로 오토클레이빙됨), 및 18 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)]에서 성장시켰다. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다. 다음 성분들을 멸균성 여과 후에 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O, 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 각 바이오반응기 (DasBox, 에펜도르프; 독일 함부르크)에 두 번째 예비-배양물을 접종하여 0.5의 최종 OD600이 되도록 하였다. 초기 교반 속도를 100 rpm으로 설정하였고, 공기를 2.2 L/h [0.37 V/(V*min)]으로 공급하였다. 용존 산소를 연속적으로 모니터링하였고 [OxyFermFDA 120; 해밀톤 (Hamilton; 스위스 보나두즈)], 교반 속도를 자동으로 조정함으로써 30% 공기 포화를 유지하였다. pH를 측정하였고 [EasyFermPlus K8 120; 해밀톤 (스위스 보나두즈)], 1 M NaOH를 자동으로 부가함으로써 7로 유지하였으며, 온도를 30℃로 유지하였다. 기포 형성을 방지하기 위하여, 발효 브로쓰 위의 전도도를 측정하는 전도도 센서에 의해 10% 폴리프로필렌 글리콜 용액을 자동적으로 부가하였다. 발효를 반복되는 배치식 공정으로서 수행하였다. 18 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 3회 더 공급하였다. 발효 동안 세포 건조 중량 (BDW), 글루코스 농도, 및 안트라닐레이트 농도를 1.5 mL 발효기 샘플로부터 오프라인에서 측정하였다. 각 샘플의 1 mL 분취액을 가중된 반응 튜브 내에서 16000 x g로 5분 동안 원심분리하였다 (5415R; 에펜도르프; 독일 함부르크). 세포 건조 중량을 결정하기 위하여, 상기 펠릿을 60℃에서 적어도 72시간 동안 건조시켰다 [혼성화 오븐; 애플리진 온코르 라이프스크린 (Appligene Oncor Lifescreen; 영국 왓퍼드)]. 그 후, 정확한 펠릿 중량을 결정하기 위하여 분석적 천칭 [La 230 S; 사토리우스 아게 (Satorius AG; 독일 괴팅겐)]을 사용하였다. HPLC-DAD [1100; 애질런트 테크놀로지 (Agilent Technologies; 미국 산타 클라라)] 및 YSI [YSI-Select 2700; 크라이엔바움 네오사이언스 게넴베하 (Kreienbaum Neoscience GmBH; 독일 랑겐펠트)]를 통하여 상등액을 분석하였다. 수집된 데이터가 표 4에 제시되어 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 일반적 조작
플라스미드 DNA를 전기천공에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 내로 전이시켰다. 형질전환을 위하여, 세포를 원심분리 [4000 g, 10 min, 4℃ (5810R; 에펜도르프; 독일 함부르크)]에 의해 지수 성장기 (OD600 = 1.75-2.0)로 BHI 배지에서 성장한 200 mL 배양물로부터 채취하고, 20 mL 빙냉 TG 완충제 (1 mM Tris-HCl, 10% 글리세린, pH 7.0)로 3회 세척하였다. 펠릿을 2 mL 10% 글리세린 용액에 재현탁시키고 형질전환을 위해 직접 사용하거나 또는 사용할 때까지 -80℃ 하에 저장하였다. 형질전환을 위하여, 플라스미드 DNA (약 1 μg)를 먼저, 빙냉 0.2 cm 갭 전기천공 큐벳에 피펫팅한 다음, 150 μL 세포 현탁액에 피펫팅하였다. 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 전기천공을 수행하였다 (조건: 약 20 ms 기하급수적으로 소멸하는 펄스, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω). 상기 현탁액을 500 μL 예열된 (46℃) BHI-배지를 수반한 반응 튜브 내로 옮기고, 400 rpm으로 일정하게 진탕시키면서 30℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를, 상응하는 항생제를 함유하는 BHI 배지 한천 판 상에 확산시켰다.
지명된 표적 유전자의 발현을 위하여, 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEKEx2를 이용하였다 (Eikmanns BJ, Kleinertz E, Liebl W, Sahm H, Gene, 1991, 102:93). 8.16 kb 벡터는 벡터 pU18로부터 유래되고, 카나마이신-내성-카세트, 씨. 글루타미쿰에서의 복제를 위한 pBL1 기점 V (oriV), 이. 콜라이에서의 복제를 위한 pU18 oriV, 강력한 tac-프로모터 (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)-유도성), 및 lacIQ 유전자를 코딩한다. 또 다른 한편으론, pEKEx2와의 공동-형질전환에 대하여 화합성인 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pCRB210을 이용하였다 (Yukawa H, Inui M, US20130302860(A1), 2013). 4.96 kb 벡터는 스펙티노마이신-내성-카세트, 씨. 글루타미쿰에서의 복제를 위한 pCASE1 기점 V (oriV), 이. 콜라이에서의 복제를 위한 oriV, 및 구성적 유전자 발현을 위한 gapA-프로모터를 코딩한다. 씨. 글루타미쿰 또는 그의 돌연변이체에서 과발현하기 위해 선택된 유전자-단편은, 단일 뉴클레오티드 교환 (침묵 돌연변이)에 의한 모든 자연 발생적 SbfI, BamHI, BglII, NcoI, 및 NdeI 제한 부위의 제거하에 및 [PCR에 의해 그의 자연 유전자 자리로부터 증폭된 aroG, aroK, glnA, 및 aroL의 유전자 서열과는 별도로; 프라이머 (표 3) 참조] 상응하는 ORF의 상류에 리보솜 결합 부위를 삽입하면서 MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였다. trpEG 및 aroG 유전자의 경우에는, 단일 뉴클레오티드 교환을 유전자 내로 포함시켜, 관련 효소들의 피드백-저항성 버전에 접근하였다. 이로써 생성된 서열을 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션(re-ligation)을 통하여 pEKEx2 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. glnA 유전자 서열과는 별도로, NcoI 제한 및 리라이게이션을 통하여 상기 서열을 pCRB210 벡터 내로 클로닝하여 pCRB-glnA를 산출하였다 (표 1). 이와 같이 합성된 유전자 단편은 기본적으로 구조 "SbfI-BglII-RBS-유전자-BamHI"를 갖는다. 이로써, 단수의 BamHI 제한 부위를 통하여 상기 벡터 내로 표적 유전자 (BglII-BamHI-단편으로서)를 반복적으로 라이게이션할 수 있다. 상기 플라스미드를 서열 분석하여 정확한 클로닝과 서열을 확증하였다. 씨. 글루타미쿰 (및 그의 돌연변이체) 형질전환체를 대상으로 하여 항생제 내성에 관하여 스크리닝하였고, 관련 돌연변이체의 정확한 발생은 PCR에 의해 입증하였다.
표적 유전자를 결실시키기 위해서뿐만 아니라 유전자 또는 다른 서열 단편을 씨. 글루타미쿰의 게놈 내로 삽입하기 위하여, 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하였다 (Schaefer A, Tauch A, Jaeger W, Kalinowski J, Thierbach G, Puehler A, Gene, 1994, 145:69). 5.72 kb 벡터는 벡터 pU18로부터 유래되고, 카나마이신-내성-카세트, 씨. 글루타미쿰에서의 복제를 위한 기점 없음, 이. 콜라이에서의 복제를 위한 pU18 oriV, lacZα 유전자, 및 sacB 유전자를 코딩한다. 표적 서열은, 단일 뉴클레오티드 교환 (침묵 돌연변이)에 의하여 모든 자연 발생적 HindIII 및 EcoRI 제한 부위를 제거하면서 [특이적 프라이머 (표 3)를 이용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 게놈으로부터 PCR 증폭시킨 trpD 및 csm과는 별도로] MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였고, 이를 HindIII 및 EcoRI 제한 및 리라이게이션을 통하여 상기 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 유전자 결실 (또는 통합)의 경우에는, 상기 클로닝된 DNA 서열이 표적 유전자의 5'-플랭킹 영역 (유전자의 첫 번째 6개 코돈 포함)의 300 내지 500 bp, 외래 미스센스-서열 (또는 게놈 내로 통합될 서열)의 21 bp, 및 표적 유전자의 3'-플랭킹 영역 (관심 유전자의 마지막 6개 코돈 포함)의 300 내지 500 bp로 이루어진다. 씨. 글루타미쿰 형질전환체를 대상으로 하여, 카나마이신-선별에 의해 상기 플라스미드를 게놈 내로 통합시키는 단일 교차 현상에 관하여 스크리닝하였는데, 이는 이로써 생성되는 플라스미드가 그것만으로는 씨. 글루타미쿰에서 증식할 수 없기 때문이다. 형질전환체를 수반하는 BHI 배지 한천 판 (15 mg/L 카나마이신 함유)을 30℃ 하에 1 내지 7일 동안 배양하였다. 그 후, 단리된 클론을 대상으로 하여, 슈크로스를 이용한 선별에 의해, 표적 유전자의 인 프레임(in frame) 결실을 초래하여, 외래 미스센스 서열 (또는 대신 게놈 내로 통합될 서열)의 21 bp 만이 잔존하는 이중-교차 현상에 관하여 스크리닝하였다 [집락들을 5 mL BHI 배지에서 4시간 내지 6시간 동안 배양한 다음, 10% (w/v) 슈크로스를 함유하는 BHI 배지 한천 판 상의 2가지 상이한 희석물 (1:100 및 1:10,000)에 플레이팅하였다]. 상기 벡터 상의 sacB 유전자는 슈크로스를 치사 생성물로 형질전환시키고, 그 결과로서, 그들의 게놈 내에 상기 플라스미드 서열을 여전히 수반하는 모든 클론의 성장을 방지시키는 레반수크라제(levansucrase)를 코딩한다. 슈크로스 함유 판 상에서 성장한 모든 집락을, 15 mg/L 카나마이신이 보충된 BHI 배지 한천 판뿐만 아니라 BHI 배지 한천 판 상에서 공동-전이시킴으로써 분석하였고, 30℃ 하에 1 내지 7일 동안 배양하였다. 카나마이신을 보충하지 않은 판 상에서만 성장한 집락은 집락 PCR에 의해 분석하여 정확한 재조합을 확증하였다. 모든 플라스미드의 정확한 클로닝 및 관련 돌연변이체의 발생은 PCR 및/또는 DNA-서열 분석에 의해 입증하였다.
고 성능 액체 크로마토그래피
애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC-DAD 시스템 (다이오드 어레이 검출기가 장착됨; 애질런트 테크놀로지; 미국 산타 클라라)을 사용하여 배양 상등액 중에서의 oAB 농도를 정량화하였다. 정지 상으로서, C18 칼럼 루나(Luna®) HPLC-칼럼 [4.6 x 250 mm; 3 μm; 페노메넥스(Phenomenex)]을 20℃ 하에 사용하였는데, 메탄올 (용매 B) 및 0.1% 포름산을 함유하는 물 (용매 A)로 이루어진 2원 용매 시스템을 사용하였다. 10 μL의 희석된 배양 상등액을 주사하였다. 다음 구배를 0.5 mL/min의 유속으로 적용하였다: 0-1 min, 2% B; 1-2 min, 2-10% B; 2-12 min, 10-70% B; 12-23 min, 70-90% B; 23-25 min, 90-98% B, 25-27 min, 98% B; 27-27.5 min, 98%-2% B; 27.5-30 min, 2% B. 외부 보정 곡선을 이용하여 254 nm에서의 시그널 통합 (체류 시간: 18.9 min)으로부터 oAB 농도를 결정하였다.
씨. 글루타미쿰 균주에서 trpD 유전자의 조작
이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하여 trpD 유전자 (안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩함; Cgl3032; 서열식별번호: 1)를 인 프레임 결실시킴으로써 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD (표 2 참조)를 창출시켰다. trpD 개방 판독 프레임의 5'-플랭킹 영역 (유전자의 첫 번째 7개 코돈 포함) 및 표적 유전자의 3'-플랭킹 영역 (trpD 개방 판독 프레임의 마지막 8개 코돈 포함)을, 프라이머 쌍 Del-trpD-1과 Del-trpD-2, 및 Del-trpD-3과 Del-trpD-4 (표 3, 서열식별번호: 66-69)를 각각 사용하여 PCR함으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 단리된 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이로써 생성된 2개의 단편을, 프라이머 쌍 Del-trpD-1과 Del-trpD-4를 사용하여 교차 PCR함으로써 조합하였다. 이로써 생성된 단편을 SmaI 제한 및 리라이게이션을 통하여 pK19mobsacB 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈으로부터 trpD의 인 프레임 결실에 적용하였고, 24 bp 외래 미스센스-서열을 상기 게놈 내로 인 프레임 도입하였는데, 이는 교차 PCR에 이용되었다 (trpD 유전자 자리에 생성된 서열: 서열식별번호: 2). 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 정확한 유전자 결실을 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, oAB 축적을 수반하는 L-트립토판 영양요구체 균주가 산출되었다. 이러한 균주는, 0.1 mM L-트립토판 또는 0.1 mM 인돌을 부가하면서 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조).
trpD 유전자의 6가지 버전을, 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하였다. 주형으로서 씨. 글루타미쿰 게놈 DNA를 이용하여 PCR함으로써, 상이한 출발 코돈, 및 trpD의 출발 코돈과 리보솜 결합 부위 사이의 스페이서 길이를 이용하여 trpD 유전자의 6가지 상이한 버전 (서열식별번호: 3-8)을 생성하였다. 상기 6개 단편 생성을 위해 적용된 프라이머는 각 버전에 대하여 변화되지 않은 역배향 프라이머 (Ex-trpD-rev, 표 2, 서열식별번호: 76)와 함께, 변화된 출발 코돈 및 리보솜 결합 부위와 출발 코돈 사이의 스페이서를 포함한 정배향 프라이머 (Ex-trpD-1 내지 -6, 표 2, 서열식별번호: 70-75)였다. 이러한 방법은 상기 생성된 균주에서의 TrpD 단백질 번역의 저하를 달성하기 위하여 선택되었다. 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD (표 2)를 상기 생성된 플라스미드 (표 1)로 형질전환시켰고, 이로써 생성된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD / pEKEx2 - trpD1 -6 (표 2)은 L-트립토판의 부가 없이 성장하였으므로, 25 mg/L 카나마이신 및 1 μM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 배지에 보충시킨 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 또한, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD / pEKEx2 - trpD5 -6은 바이오매스 형성을 가능하게 하기에 충분한 L-트립토판을 생산하였으므로; 이들은 상당한 양의 oAB를 축적하였다 (표 4). trpD 유전자의 버전 trpD1 -3, trpD5, 및 trpD6을 추가로, 상기 언급된 바와 같은 pK19mobsacB 벡터를 이용하여 상동 재조합함으로써 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD (표 2)의 게놈 내로 각각 통합시켰다. 상기 trpD 유전자 버전의 5'-플랭킹 영역 및 표적 유전자의 3'-플랭킹 영역을, 프라이머 쌍 Del-trpD-1과 Ko-trpD-1 뿐만 아니라 Del-trpD-3과 Del-trpD-4 (표 3, 서열식별번호: 66, 77, 68, 및 69)를 각각 사용하여 PCR함으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 단리된 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이로써 생성된 2개의 단편을, 프라이머 쌍 Ex-trpD-1-3, -5 또는 -6 및 Ko-trpD-2 (표 3, 서열식별번호: 70-72, 74, 75, 및 78)를 이용하여 교차 PCR함으로써 상이한 trpD 변이체와 조합하였다. 이로써 생성된 5개 단편을, SmaI 제한 및 리라이게이션을 통하여 pK19mobsacB 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 플라스미드 (표 1)는, 상기 6개 trpD 버전을 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD의 게놈 내로 도입하기 위하여 적용하였다. 부가적으로, 10개의 외래 뉴클레오티드 (GCCCTGCAGG, 서열식별번호: 92)를, 클로닝 과정의 결과로서 trpD 유전자의 리보솜 결합 부위의 상류에 있는, 교차 PCR에 이용된 게놈 내로 통합하였다. 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, trpD 영역을 서열 분석함으로써 그 통합을 검증하였다. 이로써 생성된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD1 -3, trpD5, 또는 trpD6 (표 2)은 L-트립토판 또는 카나마이신의 부가 없이 성장하였으므로, 추가의 배지 보충물을 수반하지 않는 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조).
유전자 결실을 수행하는 것 대신에, 유전자 발현 저하에 대한 상기 언급된 방법을 다른 유전자에 대하여 적용할 수 있다.
씨. 글루타미쿰 균주에서 csm 유전자의 조작
이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하여 csm 유전자 (코리스메이트 무타제를 코딩함; Cgl0853)를 인 프레임 결실시킴으로써 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 Δcsm, 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpDΔcsm, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δcsm (표 2)을 창출시켰다. csm 개방 판독 프레임의 5'-플랭킹 영역 (유전자의 첫 번째 6개 코돈 포함) 및 표적 유전자의 3'-플랭킹 영역 (csm 개방 판독 프레임의 마지막 6개 코돈 포함)을, 프라이머 쌍 Del-csm-1과 Del-csm-2, 및 Del-csm-3과 Del-csm-4 (표 3, 서열식별번호: 79-82) 각각을 이용하여 PCR함으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 단리된 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이로써 생성된 2개의 단편을, 프라이머 쌍 Del-csm-1과 Del-csm-4를 이용하여 교차 PCR함으로써 조합하였다. 이로써 생성된 단편을 상기 언급된 바와 같이 SmaI 제한 및 리라이게이션을 통하여 pK19mobsacB 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 이로써 생성된 벡터를, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈, 씨. 글루타미쿰 Δ trpD::trpD5, 및 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔtrpD 각각로부터의 csm의 인 프레임 결실에 적용하였고, 24 bp 외래 미스센스-서열을 상기 게놈 내로 인 프레임 도입하였는데, 이는 교차 PCR에 이용되었다 (csm 유전자 자리에 생성된 서열: 서열식별번호: 10). 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 정확한 유전자 결실을 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, L-티로신 및 L-페닐알라닌 영양요구체 균주 씨. 글루타미쿰 Δcsm 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δcsm 뿐만 아니라 L-티로신, L-페닐알라닌, 및 L-트립토판 영양요구체 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpDΔcsm이 산출되었다. 균주들을 대상으로 하여, 씨. 글루타미쿰 Δcsm 균주의 경우에는 배지에 0.1 mM L-티로신 및 0.1 mM L-페닐알라닌을 보충시키고 씨. 글루타미쿰 ΔtrpDΔcsm 균주의 경우에는 배지에 0.1 mM L-티로신, 0.1 mM L-페닐알라닌, 및 0.1 mM L-트립토판을 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자 균주로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 2). 이로써 생성된 균주는 야생형 균주 뿐만 아니라 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD와 비교해서 손상된 성장률을 가지며, 표준 배양 조건하에서 이들은 상당한 양의 oAB를 축적하지 못하였다 (표 4).
csm 유전자의 6개 버전을, 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하였다. 주형으로서 씨. 글루타미쿰 게놈 DNA를 이용하여 PCR함으로써, 상이한 출발 코돈, 및 csm의 출발 코돈과 리보솜 결합 부위 사이의 스페이서 길이를 이용하여 csm 유전자의 6가지 상이한 버전 (서열식별번호: 11-16)을 생성하였다. 상기 6개 단편 생성을 위해 적용된 프라이머는 각 버전에 대하여 변화되지 않은 역배향 프라이머 (Ex-csm-rev, 표 3, 서열식별번호: 89)와 함께, 변화된 출발 코돈 및 리보솜 결합 부위와 출발 코돈 사이의 스페이서를 포함한 정배향 프라이머 (Ex-csm-1 내지 -6)였다. 이러한 방법은 상기 생성된 균주에서의 Csm 단백질 번역의 저하를 달성하기 위하여 선택되었다. 균주 씨. 글루타미쿰 Δcsm (표 2)을 상기 생성된 플라스미드 (표 1)로 형질전환시켰고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 Δcsm / pEKEx2 - csm1 -6 (표 2)은 L-티로신, L-페닐알라닌, 및 L-트립토판의 부가 없이 성장하였으므로, 25 mg/L 카나마이신 및 1 μM IPTG를 배지에 보충시킨 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δcsm (표 2)을 빈 벡터 대조군 pEKEx2로 형질전환시키고 (표 1), 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δcsm / pEKEx2 (표 2)는 L-트립토판의 부가 없이 성장하였으므로, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4). 이로써 생성된 균주는 바이오매스 형성을 가능하게 하기에 충분한 방향족 아미노산을 생산하였지만, 표준 배양 조건 하에서는 이들이 상당한 양의 oAB를 축적하지 못하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주의 공통의 방향족 경로 및 L-트립토판 분지의 조작
씨. 글루타미쿰 균주에서 trpEG 유전자의 조작
씨. 글루타미쿰의 방향족 생합성 경로가 밝혀졌고, oAB의 생합성을 위한 효소를 코딩하는 것과 관련된 유전자는 공지되어 있다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). oAB는 L-트립토판 생합성 경로의 중간체이고; 아미도트랜스퍼라제 (TrpE; 공여자: L-글루타민) 및 안트라닐레이트 신타제 단위 (TrpEG)로 이루어진 안트라닐레이트 신타제에 의해 코리스메이트 (CHO)로부터 유래되는데, 이는 oAB 및 L-글루타메이트의 형성하에 피루베이트 분자를 방출시킨다. TrpEG-코딩 유전자의 발현 증가가 에스케리키아 콜라이 균주에서 L-트립토판의 축적을 초래하는 것으로 밝혀졌다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 그럼에도 불구하고, 상기 효소는 L-트립토판에 의해 강력하게 피드백-억제되는 것으로 보고되었는데 (문헌 [Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615]), 이로써 TrpEG 단백질의 피드백-저항성 버전을 적용할 수 있었다. TrpEG 단백질의 피드백-저항성 버전은 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) (씨. 글루타미쿰), 이. 콜라이 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)으로부터의 trpEG 서열에 근거하는 것으로 보고되었다 (Calguri et al., J Bio Chem, 1991, 8328-8335; Kwak et al., J Biochem Mol Bio, 1999, 20-24, Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615 and Matsui et al., J Bac, 1987, 5330-5332). 이. 콜라이 유전자에 근거한 가장 선호되는 trpEG 버전이 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현되었을 뿐만 아니라, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 자연 TrpEG 단백질의 trpEG 서열 상에서의 선택된 아미노산 교환이 이행되었고 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현되었다. 취합해 보면, 4개의 피드백-저항성 TrpEG 단백질 [이. 콜라이 TrpEG: TrpEGS40R 및 TrpEGS40F (서열식별번호: 50-51)에 근거함; 및 씨. 글루타미쿰 TrpEG: TrpEGS38R 및 TrpEGS38F (서열식별번호: 52-53)에 근거함]을, 씨. 글루타미쿰의 자연 TrpEG 단백질과 비교하여 명확히 규명하였다. trpEG 유전자의 5개 버전을 유로핀스(Eurofins) MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였고, 이를 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하였으며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 (표 2)를, 상기 생성된 플라스미드 (표 3)로 형질전환시켰고 (씨. 글루타미쿰 Δ trpD::trpD5는 플라스미드 pEKEx2 - trpEG S40F 만을 사용하였다), 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰/pEKEx2-trpEG, 씨. 글루타미쿰/pEKEx - trpEG S38F , 씨. 글루타미쿰/pEKEx2-trpEG S38R , 씨. 글루타미쿰/pEKEx2 - trpEG S40F , 씨. 글루타미쿰/pEKEx2 -trpEG S40R , 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pEKEx2 - trpEG S40F (표 2)를, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 부가적으로, pEKEx2-trpEG 변이체를 수반하는 5개의 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD-기반 균주의 세포 용해물을 대상으로 하여, 문헌 [Caliguri and Bauerle (1991)]에 따라서, 안트라닐레이트 신타제 활성에 관하여 분석하였다. 25 mg/L 카나마이신 및 1 mM IPTG를 보충시키고 150 rpm으로 진탕시키면서 30℃하에 성장시킨 (최종 OD600 4) 30 mL BHI 배지를 수반한 300 mL-진탕 플라스크 중에서, pEKEx2-trpEG 변이체를 수반하는 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD-기반 균주의 30 mL 배양물로부터 생성된 세포 펠릿으로부터 세포 용해물을 생성하였다. 상기 세포 펠릿을, 0.1 mm 지르코니아(zirconia) 비드 [자이모 리서치 코포레이션 (Zymo Research Coperation; 미국 캘리포니아주 어바인)]를 이용하여 용해시켰고, 이를 25℃ 하에 문헌 [Caliguri and Bauerle (1991)]에 따라서 검정 완충제 (50 mM KH2PO4/K2HPO4, 20 mM L-글루타민, 10 mM MgCl2, 및 25 μM 코리메이트)에 재현탁시켰다. 분광형광계를 이용하여 390 nm 하에서의 방출을 측정하였다 (여기: 390 nm). 시험된 모든 변이체는 자연 씨. 글루타미쿰 TrpEG 단백질을 수반한 세포 용해물과 비교해서 안트라닐레이트 신타제 활성에 대한 보다 높은 특이 활성을 나타내었다. 3개의 생물학적 복제물을 측정에 사용하였다. 양 이. 콜라이 TrpEG 단백질 변이체는 씨. 글루타미쿰 TrpEG 단백질 변이체와 비교해서 더 높은 활성과 더 낮은 KM을 갖고 있었다 [KM 및 vmax 값의 결정은 그래프패드 프리즘 (Graphpad Prism; 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 이용하여 수행하였다]. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD / pEKEx2 - trpEG S40F 의 세포 용해물이 가장 우수한 성능을 나타내었다 (표 5 참조).
<표 5>
TrpEG 활성에 대한 TrpEG의 상이한 변이체를 생산하는 씨. 글루타미쿰 Δ trpD 조 추출물의 생화학적 특징
Figure 112016088905843-pct00001

씨. 글루타미쿰 균주에서 aroG 유전자의 조작
씨. 글루타미쿰과 이. 콜라이 둘 다에서는, 코리스메이트까지의 공통의 방향족 경로를 통한 탄소 플럭스가 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타제의 첫 번째 반응에서 주로 제어된다고 보고되었다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 씨. 글루타미쿰에서는, 상이한 소단위 크기를 갖는 2가지 유형의 DS가 존재한다. 하나는 39 kDa의 예측 분자량을 갖는 L-티로신-감수성 DS (유형 I-DS; aro 생성물; Cgl0950)이고, 다른 하나는 51 kDa의 예측 분자량을 갖는 L-페닐알라닌- 및 L-티로신-감수성 DS (유형 II-DS; aroII 생성물; Cgl2098)이다. 유형 II-DS는 코리스메이트를 프레페네이트로 전환시키는 코리스메이트 무타제와 폴리펩티드 복합체를 형성한다. 유형 II-DS는 그 자체만으로 자신의 활성을 나타내지만, CM 활성은 유형 II-DS 단백질의 존재를 필요로 한다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 피드백-저항성 AroI DS가 보고되었다 (AroIS187C) (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 방향족 아미노산에 의해 억제되지 않는, AroII의 피드백-저항성 등가물 DS인, 이. 콜라이로부터의 AroGfbr (AroGD146N; 서열식별번호: 55)를 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현시켜, CHO 및 oAB에 대한 공통의 방향족 경로를 통한 탄소 플럭스를 증강시켰다. 상기 언급된 바와 같은 제한 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한, 프라이머 Ex-aroG-1 및 Ex-aroG-2 (표 3, 서열식별번호: 109-110)를 이용하여 PCR함으로써 aroG D146N 유전자를 증폭시켰다. 이로써 생성된 DNA 단편을, 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하였고, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 (표 2)를 상기 생성된 플라스미드 (표 1)로 형질전환시키고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 Δ trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N (표 2)를, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조).
씨. 글루타미쿰 균주에서 trpEG 및 aroG 유전자의 조작
씨. 글루타미쿰 균주에서 AroGD146N과 TrpEGS40F의 조합된 발현의 영향을 조사할 수 있도록, 이들 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 pEKEx2 벡터 상으로 융합시켰다. aroG D146N 서열을 pEKEx2-trpEG S40F 와 융합시켜 pEKEx2-trpEG S40F - aroG D146N (표 1)를 수득하였고, 유전자 trpEG S40F 를 플라스미드 pEKEx2-aroG D146N 와 융합시켜 pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F (표 1)를 수득하였는데, 둘 다는 상기 언급된 바와 같은 BglII 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 이루어지며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 (표 2)를 상기 생성된 플라스미드 각각으로 형질전환시키고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 Δ trpD::trpD5/pEKEx2-aroG D146N -trpEG S40F 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pEKEx2 -trpEG S40F -aroG D146N (표 2)을, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 부가적으로, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δcsm (표 2)을 플라스미드 pEKEx2-aroG D146N - trpEG S40F 로 형질전환시켰고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δcsm/pEKEx2 - aroG D146N - trpEG S40F (표 2)를, 25 mg/L 카나마이신, 0.1 mM L-티로신, 0.1 mM L-페닐알라닌, 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조).
씨. 글루타미쿰 균주에서 aroK 및 aroL 유전자의 조작
씨. 글루타미쿰 균주의 공통의 방향족 아미노산 생합성 경로에서 중간체의 축적을 방지하기 위하여, 씨. 글루타미쿰으로부터의 유전자 aroK (시키메이트 키나제를 코딩함; Cgl1622; 서열식별번호: 94) 및 이. 콜라이로부터의 유전자 aroL (시키메이트 키나제를 코딩함; CP000948; 서열식별번호: 93)을 조사하였다. 이러한 aroK 및 aroL 유전자를, 프라이머 Ex-aroK-1과 Ex-aroK-2 (표 3, 서열식별번호: 101-102) 및 Ex-aroL-1과 Ex-aroL-2 (표 3, 서열식별번호: 99-100)를 각각 사용하여 PCR함으로써 별도로 증폭시켰다. 이들 프라이머는 상기 언급된 바와 같은 제한 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함하였다. 이로써 생성된 DNA 단편을, 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 별도로 통합시켜 플라스미드 pEKEx2-aroK 및 pEKEx2-aroL을 산출하였고, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5 (표 2)를 상기 생성된 플라스미드 (표 3)로 형질전환시켰고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD::trpD5/pEKEx2-aroL 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pEKEx2 - aroK (표 2)를, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pEKEx2 - aroL에서는, 배양 상등액을 HPLC-DAD 분석한 결과, 시키메이트 및 3-데히드로시키메이트의 유의적 축적이 전혀 검출되지 않았다.
씨. 글루타미쿰 균주에서 glnA 유전자의 조작
씨. 글루타미쿰 균주에 의한 oAB의 생산에 대한 L-글루타민 신테타제 (GlnA; Cgl2214, 서열식별번호: 95) 활성의 강한 영향력을 분석하기 위하여, L-글루타민 신테타제 유전자인 glnA를 씨. 글루타미쿰 균주에서 발현시켰다. 이러한 glnA 유전자를, 상기 언급된 바와 같은 제한 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한, 프라이머 Ex-glnA-1 및 Ex-glnA-2 (표 3, 서열식별번호: 97-98)를 이용하여 PCR함으로써 증폭시켰다. 이로써 생성된 DNA 단편을, 상기 언급된 바와 같은 NcoI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pCRB210 내로 클로닝하였고, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 생성된 플라스미드 (표 3)로 형질전환시켰고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 Δ trpD::trpD5/pCRB-glnA (표 2)를, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 대조군으로서, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD를 빈(empty) 벡터 대조군 pCRB210으로 형질전환시켰고 (표 1), 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pCRB210 (표 2)을, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4 참조). 균주의 성장이 저하되긴 하였지만, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5의 안트라닐레이트 축적에 대한 유리한 효과를 관찰할 수 없었다. 그것이 이. 콜라이에서 관찰되었기 때문에, GlnA의 증가된 활성이 보다 진행된 oAB 생산자 균주에서 안트라닐레이트의 축적을 증가시킬 것이란 사실을 배제할 수 없다 (Sun et al., Appl Environ Microbiol, 2013, 4024-4030).
씨. 글루타미쿰 균주의 중앙 대사의 조작
씨. 글루타미쿰 균주에서 pyk 유전자의 조작
피루베이트 키나제 (Pyk)는 피루베이트와 ATP를 생산함으로써 포스페놀피루베이트를 소모한다. 씨. 글루타미쿰 균주에서 pyk 유전자 (서열식별번호: 23)의 인 프레임 결실의 효과를 조사하였다. 상기 언급된 바와 같은 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하여 pyk 유전자 (피루베이트 키나제를 코딩함; Cgl2089)를 인 프레임 결실시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δpyk (표 2)를 창출시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pSB082 (표 1)를 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5의 게놈으로부터 pyk 유전자의 인 프레임 결실에 적용하였고, 24 bp 외래 미스센스-서열을 상기 게놈 내로 인 프레임 도입하였다 (pyk 유전자 자리에서 생성된 서열: 서열식별번호: 24). 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 정확한 유전자 결실을 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δpyk가 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 gpi 유전자의 조작
펜토스 포스페이트 경로에 대한 탄소 플럭스를 지시하기 위하여, 씨. 글루타미쿰 균주에서 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 (Gpi) 코딩 유전자 (서열식별번호: 27)의 인 프레임 결실의 효과를 조사하였다. 상기 언급된 바와 같은 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하여 gpi 유전자 (글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩함; Cgl0851)를 인 프레임 결실시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δgpi (표 2)를 창출시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pSB064 (표 1)를 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5의 게놈으로부터 gpi 유전자의 인 프레임 결실에 적용하였고, 24 bp 외래 미스센스-서열을 상기 게놈 내로 인 프레임 도입하였다 (gpi 유전자 자리에서 생성된 서열: 서열식별번호: 28). 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 정확한 유전자 결실을 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δgpi가 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 pepco 유전자의 조작
포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (Pepco)는 PEP를 옥살로아세테이트로 변환시킴으로써 PEP를 소모한다. 증가된 PEP 풀에 접근하기 위하여, 씨. 글루타미쿰 균주에서 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 코딩 유전자 (서열식별번호: 21)의 인 프레임 결실을 조사하였다. 상기 언급된 바와 같은 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하여 pepco 유전자 (포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩함; Cgl1585)를 인 프레임 결실시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD::trpD5Δpepco (표 2)를 창출시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pSB061 (표 1)을 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5의 게놈으로부터 pepco 유전자의 인 프레임 결실에 적용하였고, 24 bp 외래 미스센스-서열을 상기 게놈 내로 인 프레임 도입하였다 (pepco 유전자 자리에서 생성된 서열: 서열식별번호: 22). 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 (1% 아세테이트를 BHI 배지 한천 판에 부가적으로 보충시킴) 단리하였고, 정확한 유전자 결실을 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δpepco가 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 ptsG 및 hpr 유전자의 조작
씨. 글루타미쿰의 글루코스 및 프럭토스 흡수는 주로, 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 의해 활용된다. 이러한 다효소 복합체는 세포질 막을 가로질러 글루코스-6-포스페이트로의 글루코스 인산화와 동시에 포스포에놀피루베이트에 의해 매개된 인산화 캐스케이드를 통하여 글루코스의 전위를 수행한다 (Siebold et al. 2001). 상기 시스템은 2가지 가용성 성분 효소 I 및 히스티딘 풍부 단백질 (Hpr) 및 막 결합된/회합된 효소 복합체로 이루어진다 (Tanaka et al. 2008). 상기 언급된 바와 같은 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pK19mobsacB를 이용하여, hpr 유전자 (히스티딘 풍부 단백질을 코딩함; Cgl1937, 서열식별번호: 17) 및 ptsG 유전자 (포스포트랜스퍼라제 시스템 단위 G를 코딩함; Cgl1360, 서열식별번호: 19) 각각을 인 프레임 결실시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δ hpr 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5ΔptsG (표 2)를 창출시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pSB060 및 pSB079 (표 1)를 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5의 게놈으로부터 hpr 유전자 및 ptsG 유전자 각각의 인 프레임 결실에 적용하였고, 24 bp 외래 미스센스-서열을 상기 게놈 내로 인 프레임 도입하였다 (hpr / ptsG 유전자 자리에서 생성된 서열: 서열식별번호: 18; ptsG 유전자 자리: 20). 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 (5 g/L 리보스를 BHI 배지 한천 판에 부가적으로 보충시킴) 단리하였고, 정확한 유전자 결실을 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δhpr 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5ΔptsG가 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4). 양 균주는 상기 언급된 바와 같은 표준 발효 조건 하에서 유의적 성장을 나타내지 않았고, 그 결과로서 oAB를 축적하지 않았다.
씨. 글루타미쿰 균주에서 ppk 유전자의 조작
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 (Ppk)는 글리옥실레이트 경로의 일부로서, 옥살로아세테이트를 PEP 내로 재순환시킬 수 있다. 증가된 PEP 풀에 접근하기 위하여, 씨. 글루타미쿰 균주에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 코딩 유전자 (Cgl2862; 서열식별번호: 36)의 플라스미드-기반 발현을 조사하였다. ppk 유전자를 유로핀스 MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였고, 이를 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하면, 플라스미드 pSB072 (표 1)가 생성되었으며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 언급된 바와 같이, 플라스미드 pSB072로 형질전환시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB072 (표 2)를 창출하였다. 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 표적 유전자를 이용한 성공적인 형질전환은 집락 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB072가 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같이, oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 pps 유전자의 조작
포스포에놀피루베이트 신타제 (Pps)는 글루코스신합성의 일부로서, 피루베이트 재순환에 의한 PEP의 형성, 및 ATP에서 AMP로의 소모를 촉매한다. 증가된 PEP 풀에 접근하기 위하여, 씨. 글루타미쿰 균주에서 PEP 신타제 결합성 도메인 코딩 유전자와 함께 포스포에놀피루베이트 신타제 코딩 유전자 (Cgl0551 및 Cgl0552; 서열식별번호: 33-35)의 플라스미드-기반 발현을 조사하였다. 이들 pps 유전자를 유로핀스 MWG 오페론 GmbH에 의해 함께 합성하였고, 이들을 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하면, 플라스미드 pSB073이 생성되었으며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 언급된 바와 같이, 플라스미드 pSB073으로 형질전환시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB073 (표 2)을 창출하였다. 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 표적 유전자를 이용한 성공적인 형질전환은 집락 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB073이 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같이, oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 opcA 유전자와 함께 zwf1 유전자의 조작
자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) 및 이. 콜라이에서, 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)의 첫 번째 반응 [글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제에 의한 글루코스-6-포스페이트로부터 리불로스-5-포스페이트의 형성 (Zwf1 및 OpcA)]을 촉매하는 효소의 생산이 증강되면, PPP 내로의 탄소 플럭스가 증가되어, 그 결과로서 에리트로스-4-포스페이트 (E4P) 풀이 증가되는 것으로 보고되었다. 증가된 E4P 풀에 접근하기 위하여, 씨. 글루타미쿰 균주에서 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 코딩 유전자 [zwf1 (Cgl1576) 및 opcA (Cgl1577); 서열식별번호: 37-39]의 플라스미드-기반 발현을 조사하였다. 이들 유전자를 유로핀스 MWG 오페론 GmbH에 의해 함께 합성하였고, 이들을 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 클로닝하면, 플라스미드 pSB078 (표 1)이 생성되었으며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 언급된 바와 같이, 플라스미드 pSB078로 형질전환시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB078 (표 2)을 창출하였다. 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 표적 유전자를 이용한 성공적인 형질전환은 집락 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD ::trpD5/pSB078이 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같이, oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 tal 및 tkt 유전자의 조작
PPP를 통한 증강된 탄소 플럭스와 증가된 E4P 풀은 이. 콜라이에서 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 증강된 발현에 의해 설명되었다. 이. 콜라이의 트랜스케톨라제 (Tkt) 및 트랜스알돌라제 (Tal) 코딩 유전자 [tktEC (ECDH10B_3110) 및 talEC (ECDH10B_2629); 서열식별번호: 41 및 43] 뿐만 아니라 씨. 글루타미쿰의 등가 유전자 [tktCG (Cgl1574) 및 talCG (Cgl1575); 서열식별번호: 40 및 42]를 씨. 글루타미쿰 균주에서 플라스미드-기반 발현시켰다. 상기 4개의 서열을 유로핀스 MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였고, 이들을 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 별도로 통합시키면, 플라스미드 pSB074-pSB077 (표 1)이 생성되었고, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 언급된 바와 같은 각각의 플라스미드로 형질전환시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB074 - pSB077 (표 2)을 창출하였다. 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 표적 유전자를 이용한 성공적인 형질전환은 집락 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB074 - pSB077이 산출되었는데, 이들을 상기 언급된 바와 같이, oAB 생산자 균주로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 트랜스케톨라제와 트랜스알돌라제의 조합된 발현의 효과를 조사할 수 있도록, 이들 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 pEKEx2 벡터 상으로 융합시켰다. talCG 서열을 pSB075와 융합시켜 pSB085 (표 1)를 수득하였고, 유전자 talEC를 플라스미드 pSB077과 융합시켜 pSB086 (표 1)을 수득하였는데, 둘 다는 상기 언급된 바와 같은 BglII 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 이루어지며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 생성된 플라스미드 각각으로 형질전환시키고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB085 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD ::trpD5/pSB086 (표 2)을, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
씨. 글루타미쿰 균주에서 galP , iolT2 및 ppgk 유전자의 조작
Pts-결핍성 씨. 글루타미쿰 균주에서 효율적인 글루코스 흡수를 회복하도록, 씨. 글루타미쿰 균주에서 폴리포스포글루코키나제 (글루코스 인산화 효소) 코딩 유전자 [ppgk (Cg1910); 서열식별번호: 32]와 조합한 갈락토퍼미아제 코딩 유전자 (galP, Cgl2409; 서열식별번호: 30)의 플라스미드-기반 발현을 조사하였다. 더욱이, 씨. 글루타미쿰 균주에서 폴리포스포글루코키나제 코딩 유전자 [ppgk (Cg1910); 서열식별번호: 32]와 조합한 (이노시톨퍼미아제의) 이노시톨퍼미아제 T2 단위 코딩 유전자 (iolT2, Cgl3058; 서열식별번호: 31)를 조사하였다. 상기 4개의 유전자를 유로핀스 MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였고, 이들 각각을 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 통합시키면, 플라스미드 pSB068, pSB070, 및 pSB071 (표 1)이 생성되었고, 정확한 통합을 서열 분석에 의해 검증하였다. ppgk 서열을 galP 서열 및 iolT2 각각과 함께, pEKEx2 벡터 상으로 융합시켰다. galP 서열을 pSB071과 융합시켜 pSB083 (표 1)을 수득하고, 유전자 iolT2를 플라스미드 pSB071과 융합시켜 pSB084 (표 1)를 수득하였는데, 둘 다는 상기 언급된 바와 같은 BglII 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 이루어지며, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5ΔptsG 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δhpr (표 2) 각각을 플라스미드 pSB083 및 pSB084로 각각 형질전환시켰고, 이로써 생성된 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5ΔptsG/pSB083, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δ ptsG/pSB084, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δhpr/pSB083, 및 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD ::trpD5Δhpr/pSB084 (표 2)를, 25 mg/L 카나마이신 및 0.1 mM IPTG를 배지에 보충시킨, 상기 언급된 바와 같은 oAB 생산자 균주로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4). 균주 ΔtrpD :: trpD5Δhpr/pSB083은 상기 언급된 바와 같은 표준 발효 조건 하에서 유의적 성장을 나타내지 않았고, 그 결과로서 oAB를 축적하지 않았다.
씨. 글루타미쿰 균주로부터 oAB 외수송의 조작
oAB의 생산율이 증가됨에 따라, 생산 세포로부터의 생산물의 외수송은 용이하게 생산 제한 단계가 될 수 있다. 더욱이, oAB의 세포내 축적이 세포에 상당한 독성 효과를 나타낼 가능성이 높을 수 있다. 지금까지, oAB 외수송 인자에 관해서는 전혀 보고된 바가 없었다. 최근에, 씨. 글루타미쿰에서 시키메이트 및 퀴네이트의 내수송을 촉진시켜 주는, 주요 촉진인자 시스템 계열에 속하는 시키메이트 퍼미아제 (QsuA)가 문헌 ([Kubota et al., Molecular Microbiol, 2014, 92(2), 356])에 보고되었다. 씨. 글루타미쿰 균주에서 oAB의 세포내 및 세포외 농도에 대한 시키메이트 퍼미아제의 효과를 시험하기 위하여, 관련 유전자 (qsuA, Cgl0492; 서열식별번호: 96)를 유로핀스 MWG 오페론 GmbH에 의해 합성하였고, 이를 상기 언급된 바와 같은 SbfI 및 BamHI 제한 및 리라이게이션을 통하여 벡터 pEKEx2 내로 통합시키면, 플라스미드 pSB096 (표 1)이 생성되었고, 정확한 클로닝을 서열 분석에 의해 검증하였다. 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5를 상기 언급된 바와 같은 플라스미드 pSB096으로 형질전환시킴으로써 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD ::trpD5/pSB096 (표 2)을 창출하였다. 정확한 돌연변이체를 상기 언급된 바와 같이 단리하였고, 표적 유전자를 이용한 성공적인 형질전환은 집락 PCR에 의해 입증하였다. 이로써, 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5/pSB096이 산출되었는데, 이를 상기 언급된 바와 같이, oAB 생산자 균주로서의 그의 특성에 관하여 명확히 규명하였다 (표 4).
실시예 4 - 피. 푸티다를 이용한 o- 아미노벤조에이트의 생산
oAB를 생산하는, 슈도모나스 푸티다 KT2440으로부터 유래된 균주를 개발하였다. 피. 푸티다 균주에 의해 oAB 축적을 달성하기 위하여, 안트라닐레이트 포스포리보실트랜스퍼라제 및 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제를 코딩하는 trpDC 유전자 (PP_0421 및 PP_0422; 서열식별번호: 63)를 선택하여 슈도모나스 푸티다 KT2440에서 붕괴되도록 하였다. 녹아웃 플라스미드 pEMG-Del-trpDC (표 1)에 근거한, 결실 돌연변이체 피. 푸티다 ΔtrpDC의 구축은, 벡터 pEMG를 이용하여 문헌 (Martinez-Garcia et al., Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702)에 기재된 방법에 의해 접근하였다. 이러한 접근 방식으로, 잔류 클로닝 자국이나 마커 없이 유전자 서열 (관심 유전자, GOI)이 제거된다. 상기 방법의 개념이 도 27에 도시되어 있다. 단계 A - B에서는, 붕괴 플랭크 TS1 및 TS2, 카나마이신 마커 및 I-SceI 부위를 보유하고 있는, 상기 지명된 녹아웃 벡터 pEMG를 피. 푸티다의 게놈 내로 통합시킨다. 단계 C에서는, 메가뉴클레아제 I-SceI 유전자를 보유하고 있는 제2 플라스미드 (pSW-2)를 형질전환시킴으로써 이중 가닥 브레이크를 유도한다. 이러한 브레이크를 TS1 또는 TS2 영역의 상동 재조합에 의해 생체 내에서 복원시키면, 피. 푸티다 야생형 또는 피. 푸티다 ΔtrpDC가 생성된다 (단계 D). 단계 E는 상이한 균주를 구별하고 단리하는 데 필요한 PCR 스크리닝을 보여준다. 이웃하는 유전자들을 무손상으로 유지시키면서 유전자의 개방 판독 프레임을 제거하도록 결실 플랭크를 선택하였다 (도 28). 이러한 전략으로 인해, 장기간 연속적으로 배양하는 데 있어서 보다 큰 균주 안정성이 초래될 수 있다. 800 bp 붕괴 플랭크 TS1 및 TS2를, 푸션 (Phusion®) 고 성능 DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 이용하여 증폭시켰다. 이러한 푸션 PCR은 제조업자의 매뉴얼 [25 주기, 61.8℃ (TS1), 70.2℃ (TS2) 1:30 분]에 따라서 수행하였다. PCR 단편 TS1을 BamHI 및 XhoI로 소화시키고, PCR 단편 TS2를 XhoI 및 SbfI로 소화시켰다. 플라스미드 pEMG 및 융합된 TS1-TS2 PCR 생성물을 BamHI 및 SbfI로 소화시켰다. 모든 제한 혼합물을, 고 순도 PCR 생성물 정제 키트 [로슈(Roche)]를 이용하여 정제하였다. 개개의 플랭크 TS1 및 TS2를 이용하여 pEMG-Del-trpDC를 라이게이션하는 것은 제조업자의 지시에 따라서 T4 DNA 리가제 [더모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)]로 수행하였다. 이러한 라이게이션 혼합물을 화학적으로 적격한 이. 콜라이 DH5α λpir 균주 내로 형질전환시켰다. 2개의 개개의 플랭크 및 상기 소화된 벡터 pEMG로 이루어진 3개 점 라이게이션 혼합물로부터의 양성 플라스미드를 제한 분석함으로써 확인하였고, 서열 분석함으로써 검증하였는데, 이로써 pEMG-Del-trpDC (표 1)의 성공적인 구축이 확증되었다. 녹아웃 벡터 pEMG-Del-trpDC를, 수용자 균주 피. 푸티다, 공여자 균주 이. 콜라이 DH5α λpir/pEMG-Del-trpDC 및 헬퍼(helper) 균주 이. 콜라이 HB101 pRK2013을 이용하여 3부모 교배함으로써 피. 푸티다의 게놈 내로 통합시켰다 (도 27, 단계 A-B) (Martinez-Garcia et al., Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702). 50 mg/L 카나마이신을 수반한 세트리미드 한천 판을 이용함으로써 상기 세포 혼합물로부터 피. 푸티다/pEMG-Del-trpDC를 단리하고, 단일 집락을 LB-카나마이신 판 상에서 재스트리킹하였다. 녹아웃 벡터의 게놈 통합은 집락 PCR을 통하여 단일 집락에서 확증하였다. 이중 가닥 파손을 게놈 내에 도입하기 위하여 (도 27, 단계 C), I-SceI 메가뉴클레아제 유전자를 보유하고 있는 제2 플라스미드 (pSW-2)를 새로이 구축된 균주 내로 형질전환시켰다. 따라서, 전기 적격한 피. 푸티다/pEMG-Del-trpDC 세포를 문헌 ([Choi et al., J Microbiol Methods, 2005, 64(3), 391])에 따라서 수득하였다. 바이오래드 진 펄서 엑스셀 전기천공기 (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)를 이용하여 전기천공을 수행하였고, 세포 현탁액을 LB-젠타마이신 (30 mg/L) 및 LB-카나마이신-젠타마이신 판 (각각 30 mg/L 및 50 mg/L) 상으로 플레이팅하였다. 문헌 (Martinez-Garcia et al.)에 기재된 녹아웃 과정의 프로토콜을 수행한 후, I-SceI 메가뉴클레아제를 유도시키는 것이 필요하다. 그러나, 이러한 단계는 I-SceI 메가뉴클레아제의 누출성 발현을 암시하는 실제적 경험으로 인해 생략되었다. 목적하는 피. 푸티다 ΔtrpDC 녹아웃 균주를 피. 푸티다 및 피. 푸티다/pEMG-Del-trpDC 균주와 구별하기 위하여, 단일 집락을 LB 및 LB-카나마이신 판 상으로 스크리킹하였다. 상기 언급된 바와 같은 집락 PCR을 통하여 카나마이신 감수성 집락을 체크하였다. 또한, 카나마이신 감수성 집락을 대상으로 하여, 20 mM 글루코스를 수반하고 0.1 mM L-트립토판을 수반한 및 수반하지 않은 최소 배지 판 상에서 L-페닐알라닌 영양요구성에 관하여 체크하였다. 유전자 결실을 PCR 분석 및 서열 분석에 의해 검증하였다. 이로써 생성된 균주 피. 푸티다 Δ trpDC (표 2)는 L-트립토판을 보충하지 않은 최소 배지 상에서는 성장할 수 없었다.
또한, 코리스메이트 무타제를 코딩하는 pheA 유전자 (PP_1769, 서열식별번호: 64)를 슈도모나스 푸티다 ΔtrpDC 균주에서 붕괴시켰다. 이러한 pheA 유전자는 안트라닐레이트 생성과 경쟁하는 것으로 예상되는, L-페닐알라닌 및 L-티로신 생합성의 첫 번째 단계를 코딩한다. 녹아웃 플라스미드 pEMG-Del-pheA에 근거한, 결실 돌연변이체 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA의 구축은 상기 언급된 바와 같은 벡터 pEMG를 이용하여 문헌 ([Martinez-Garcia et al., Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702])에 기재된 방법에 의해 접근하였다. 이웃하는 유전자들을 무손상으로 유지시키면서 유전자의 개방 판독 프레임을 제거하도록 결실 플랭크를 선택하였다 (도 29). 이러한 전략으로 인해, 장기간 연속적으로 배양하는 데 있어서 보다 큰 균주 안정성이 초래될 수 있다. pheA의 경우에는, 유전자의 8개 5' 뉴클레오티드가 serC 유전자와의 중복으로 인해 잔존하였다는 것을 의미한다. 800 bp 붕괴 플랭크 TS1 및 TS2를 구축하기 위하여, 다음 프라이머를 사용하였다: JK038f, JK039r, JK040f, 및 JK041r (표 3, 서열식별번호: 103-106). PCR 단편 TS1을 BamHI 및 XhoI로 소화시켰고, PCR 단편 TS2를 XhoI 및 SbfI로 소화시켰다. 플라스미드 pEMG 및 융합된 TS1-TS2 PCR 생성물을 BamHI 및 SbfI로 소화시켰다. 모든 제한 혼합물을, 고 순도 PCR 생성물 정제 키트 (로슈)를 이용하여 정제하였다. 개개의 플랭크 TS1 및 TS2를 이용하여 pEMG-Del-pheA를 라이게이션하는 것은 제조업자의 지시에 따라서 T4 DNA 리가제 (더모 피셔 사이언티픽)로 수행하였다. 이러한 라이게이션 혼합물을 화학적으로 적격한 이. 콜라이 DH5α λpir 균주 내로 형질전환시켰다. 2개의 개개의 플랭크 및 상기 소화된 벡터 pEMG로 이루어진 3개 점 라이게이션 혼합물로부터의 양성 플라스미드를 제한 분석함으로써 확인하였고, 서열 분석함으로써 검증하였는데, 이로써 pEMG-Del-pheA (표 1)의 성공적인 구축이 확증되었다. 녹아웃 벡터 pEMG-Del-pheA를, 수용자 균주 피. 푸티다 ΔtrpDC, 공여자 균주 이. 콜라이 DH5α λpir/pEMG-Del-pheA 및 헬퍼 균주 이. 콜라이 HB101 pRK2013을 이용하여 3부모 교배함으로써 피. 푸티다 ΔtrpDC의 게놈 내로 통합시켰다 (도 27, 단계 A-B) (Martinez-Garcia et al., Environ Microbiol, 2011, 13(10), 2702). 50 mg/L 카나마이신을 수반한 세트리미드 한천 판을 이용함으로써 상기 세포 혼합물로부터 피. 푸티다 ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA를 단리하고, 단일 집락을 LB-카나마이신 판 상에서 재스트리킹하였다. 녹아웃 벡터의 게놈 통합은 집락 PCR을 통하여 단일 집락에서 확증하였다. 이중 가닥 파손을 게놈 내에 도입하기 위하여 (도 27, 단계 C), I-SceI 메가뉴클레아제 유전자를 보유하고 있는 제2 플라스미드 (pSW-2)를 새로이 구축된 균주 내로 형질전환시켰다. 따라서, 전기 적격한 피. 푸티다 ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA 세포를 문헌 ([Choi et al., J Microbiol Methods, 2005, 64(3), 391])에 따라서 수득하였다. 바이오래드 진 펄서 엑스셀 전기천공기 (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)를 이용하여 전기천공을 수행하였고, 세포 현탁액을 LB-젠타마이신 (30 mg/L) 및 LB-카나마이신-젠타마이신 판 (각각 30 mg/L 및 50 mg/L) 상으로 플레이팅하였다. 문헌 (Martinez-Garcia et al.)에 기재된 녹아웃 과정의 프로토콜을 수행한 후, I-SceI 메가뉴클레아제를 유도시키는 것이 필요하다. 그러나, 이러한 단계는 I-SceI 메가뉴클레아제의 누출성 발현을 암시하는 실제적 경험으로 인해 생략되었다. 목적하는 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA (표 2) 녹아웃 균주를 피. 푸티다 ΔtrpDC 및 피. 푸티다 ΔtrpDC/pEMG-Del-pheA 균주와 구별하기 위하여, 단일 집락을 LB 및 LB-카나마이신 판 상으로 스크리킹하였다. 상기 언급된 바와 같은 집락 PCR을 통하여 카나마이신 감수성 집락을 체크하였다. 또한, 카나마이신 감수성 집락을 대상으로 하여, 20 mM 글루코스, 0.1 mM L-트립토판을 수반하고, 1 mM L-페닐알라닌을 수반한 및 수반하지 않은 최소 배지 판 상에서 L-페닐알라닌 영양요구성에 관하여 체크하였다. 유전자 결실을 PCR 분석 및 서열 분석에 의해 검증하였다. 피. 푸티다 KT2440은 L-페닐알라닌을 L-티로신으로 전환시키는 L-페닐알라닌-4-히드록실라제 (PheA)를 보유하고 있기 때문에, L-페닐알라닌을 부가함으로써 L-티로신-영양요구성이 구제되었다. L-트립토판 영양요구성과 L-페닐알라닌 영양요구성 둘 다가 단일 유전자 붕괴에 의해 수득되었기 때문에, 대체 효소를 코딩하는 중복 유전자는 피. 푸티다 KT2440에 전혀 존재하지 않는 것으로 추정되었다.
방향족 아미노산 생합성 경로의 첫 번째 전용 반응은 DAHP 신타제 동위효소에 의해 촉매된다. 상기 효소의 피드백-비감수성 돌연변이체를 과발현시키면, 방향족 생합성 경로를 통한 플럭스 증가가 초래되는 것으로 몇 가지 유기체에서 밝혀졌다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 따라서, 안트라닐레이트 생성을 증가시키기 위하여, aroG D146N 유전자 (서열식별번호: 55)에 의해 코딩된 피드백-비감수성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트 7-포스페이트 (DAHP) 신타제를, 벡터 pSEVA234 (lacI q -Ptrc 시스템의 제어 하에; 카나마이신 내성 및 pBBR1 복제 기점을 코딩함)를 통하여 균주 피. 푸티다 KT2440, 피. 푸티다 ΔtrpDC 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA에서 발현시켰다 (Silva-Rocha et al., Nucleic Acids Research, 2013, D666-75). 상기 aroG D146N 유전자를, 상기 언급된 바와 같은 (실시 예 3) EcoRI 및 BamHI 제한 효소 및 표준 조건을 이용하여 공여자 플라스미드 (pCAS-2JF-aroG D146N )로부터 제한하면, 1117 bp 단편이 생성되었다. 벡터 pSEVA234를 동일한 효소로 제한하였다. 그 단편을, 고 순도 PCR 생성물 정제 키트 (로슈)를 이용하여 정제하였다. 상기 단편을 라이게이션하여 pSEVA234-aroG D146N (표 1)를 획득하는 것은, 제조업자의 지시에 따라서 T4 DNA 리가제 (더모 피셔 사이언티픽)로 수행하였다. 이러한 라이게이션 혼합물을 전기 적격한 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포 (일렉트로맥스™ DH5α-E™ 적격 세포; 라이프 테크놀로지; 독일 다름슈타트) 내로 도입하였다. 진 펄서 엑스셀 시스템 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스)을 이용하여 0.2 cm 갭 전기천공 큐벳 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스)에서 전기-형질전환 (조건: 약 20 ms 기하급수적으로 소멸하는 펄스, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω) 후, 800 μL LB 회수 배지 (루리아-베르타니; 루스; 독일 칼스루에)를 즉시 부가하고, 현탁액을 1.5 mL 미소원심분리용 튜브 내로 옮겼다. 37℃ 하에 1 h 후, 세포 현탁액을 LB 한천 판 (Abcr GmbH & Co. Kg; 독일 칼스루에) 상으로 확산시키고, 50 mg/L 카나마이신을 보충시키며, 37℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 클론을 수집하고, 제한 분석 및 서열 분석을 통하여 정확한 형질전환을 확증하였다. 플라스미드 제조를 위하여, 상기 균주를 3 mL LB 배지에서 200 rpm으로 일정하게 진탕시키고 37℃ 하에 50 mg/L 카나마이신과 함께 14시간 내지 16시간 동안 15 mL-튜브에서 배양하였다 [쿠흐너 쉐이커 ISF-4-W; 아돌프 쿠흐너 아게 (스위스 바젤)]. 제조업자의 지시에 따라서 뉴클레오스핀® 플라스미드 퓨어 키트 (마세레이 앤 나겔; 독일 뒤렌)를 사용하여 플라스미드 DNA 정제를 수행하였다. 전기 적격한 피. 푸티다 KT2440, 피. 푸티다 ΔtrpDC, 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA 세포를 문헌 ([Choi et al., J Microbiol Methods, 2005, 64(3):391])에 따라서 수득하였다. 바이오래드 진 펄서 엑스셀 전기천공기 (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)를 이용하여 전기천공을 수행하였고, 세포 현탁액을, 50 m/L 카나마이신이 보충된 LB-한천 판 상으로 플레이팅하였다. 이로써, 균주 피. 푸티다 KT2440/pSEVA234-aroG D46N , 피. 푸티다 ΔtrpDC/pSEVA234 - aroG D46N , 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234-aroG D46N (표 2)가 생성되었다. 부가적으로, 빈 벡터 pSEVA234를 균주 피. 푸티다 ΔtrpDC 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA 내로 형질전환시켜 균주 피. 푸티다 ΔtrpDC/pSEVA234, 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234 (표 2)를 획득하였다.
oAB는 L-트립토판 생합성 경로의 중간체이고; 아미도트랜스퍼라제 (TrpE; 공여자: L-글루타민) 및 안트라닐레이트 신타제 단위 (TrpEG)로 이루어진 안트라닐레이트 신타제에 의해 코리스메이트로부터 유래되는데, 이는 oAB 및 L-글루타메이트의 형성하에 피루베이트 분자를 방출시킨다. TrpEG-코딩 유전자의 발현 증가가 에스케리키아 콜라이 균주에서 L-트립토판의 축적을 초래하는 것으로 밝혀졌다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 그럼에도 불구하고, 상기 효소는 L-트립토판에 의해 강력하게 피드백-억제되는 것으로 보고되었는데, 이로써 TrpEG 단백질의 피드백-저항성 버전을 적용할 수 있었다. TrpEG 단백질의 피드백-저항성 버전은 살모넬라 티피무리움으로부터의 trpEG 서열에 근거하는 것으로 보고되었다 (Ikeda M, Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 69:615). 에스. 티피무리움 (S. typhimurium) 유전자에 근거한, 가장 선호되는 trpEG 버전인 trpEG S40F (서열식별번호: 53)를 피. 푸티다 균주에서 발현시켰다. trpEG 유전자의 피드백-억제-저항성 버전을 피. 푸티다 벡터 pSEVA234 내로 클로닝하여 균주 피. 푸티다 KT2440, 피. 푸티다 ΔtrpDC, 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA에서의 플라스미드-기반 발현을 가능하게 하였다 (lacI q -Ptrc 시스템의 제어 하에; 카나마이신 내성 및 pBBR1 복제 기점을 코딩함) (Silva-Rocha et al., Nucleic Acids Research, 2013, D666-75). trpEG S40F 유전자를, 상기 언급된 바와 같은 (실시예 3) BglII 및 BamHI 제한 효소 및 표준 조건을 이용하여 공여자 플라스미드로부터 제한하면, 2200 bp 단편이 생성되었다. 벡터 pSEVA234를 BamHI로 제한하면, 4550 bp 단편이 생성되었다. 그 단편을, 고 순도 PCR 생성물 정제 키트 (로슈)를 이용하여 정제하였다. 상기 단편을 라이게이션하여 pSEVA234-trpEG S40F (표 1)를 획득하는 것은 제조업자의 지시에 따라서 T4 DNA 리가제 (더모 피셔 사이언티픽)로 수행하였다. 이러한 라이게이션 혼합물을 전기 적격한 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포 (일렉트로맥스™ DH5α-E™ 적격 세포; 라이프 테크놀로지; 독일 다름슈타트) 내로 도입하였다. 진 펄서 엑스셀 시스템 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스)을 이용하여 0.2 cm 갭 전기천공 큐벳 (바이오래드; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스)에서 전기-형질전환 (조건: 약 20 ms 기하급수적으로 소멸하는 펄스, 2.5 kV/cm, 25 F, 200 Ω) 후, 800 μL LB 회수 배지 (루리아-베르타니; 루스; 독일 칼스루에)를 즉시 부가하고, 현탁액을 1.5 mL 미소원심분리용 튜브 내로 옮겼다. 37℃ 하에 1 h 후, 세포 현탁액을 LB 한천 판 (Abcr GmbH & Co. Kg; 독일 칼스루에) 상으로 확산시키고, 50 mg/L 카나마이신을 보충시키며, 37℃ 하에 밤새 인큐베이션하였다. 클론을 수집하고, 제한 분석 및 서열 분석을 통하여 정확한 형질전환을 확증하였다. 플라스미드 제조를 위하여, 상기 균주를 3 mL LB 배지에서 200 rpm으로 일정하게 진탕시키고 37℃ 하에 50 mg/L 카나마이신과 함께 14시간 내지 16시간 동안 15 mL-튜브에서 배양하였다 [쿠흐너 쉐이커 ISF-4-W; 아돌프 쿠흐너 아게 (스위스 바젤)]. 제조업자의 지시에 따라서 뉴클레오스핀® 플라스미드 퓨어 키트 (마세레이 앤 나겔; 독일 뒤렌)를 사용하여 플라스미드 DNA 정제를 수행하였다. 전기 적격한 피. 푸티다 KT2440, 피. 푸티다 ΔtrpDC, 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA 세포를 문헌 ([Choi et al., J Microbiol Methods, 2005, 64(3):391])에 따라서 수득하였다. 바이오래드 진 펄서 엑스셀 전기천공기 (2.5 kV, 200 ohm, 25 μF)를 이용하여 전기천공을 수행하였고, 세포 현탁액을, 50 m/L 카나마이신이 보충된 LB-한천 판 상으로 플레이팅하였다. 이로써, 균주 피. 푸티다 KT2440/pSEVA234 - trpEG S40F , 피. 푸티다 ΔtrpDC/pSEVA234-trpEG S40F , 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA / pSEVA234 - trpEG S40F (표 2)가 생성되었다.
이로써 생성된 모든 피. 푸티다 균주 (피. 푸티다 KT2440, 피. 푸티다 Δ trpDC/pSEVA234, 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234, 피. 푸티다/pSEVA234 -aroG D146N , 피. 푸티다/pSEVA234 - trpEG S40F , 피. 푸티다 ΔtrpDC/pSEVA234 - aroG D146N , 피. 푸티다 ΔtrpDC/pSEVA234 - trpEG S40F , 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA/pSEVA234 -aroG D146N , 및 피. 푸티다 ΔtrpDCΔpheA / pSEVA234 - trpEG S40F ) (표 2)를, 진탕-플라스크 배양물에서 oAB 생산자로서의 그들의 특성에 관하여 명확히 규명하였다. 균주를, 30℃ 하에 250 rpm으로 진탕시키면서 문헌 ([Wierckx et al., AEM, 2005, 71:8221])에 따라서 최소 배지에서 성장시켰다. 최소 배지의 조성은 다음과 같다: 2 g/L (NH4)2SO4, 1.63 g/L NaH2PO4, 3.88 g/L K2HPO4, 0.1 g/L MgSO4·7H2O, 1.0 mg/L CaCl2, 10 mg/L EDTA, 5.0 mg/L FeSO4·7H2O, 1.0 mg/L MnCl·H2O, 2.0 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.4 mg/L CoCl2·6H2O, 0.2 mg/L Na2MoO4·2H2O, 및 5 g/L 글루코스. 5 mol/L 수산화나트륨 용액을 이용하여 pH를 7로 조정하였다. 상기 균주를 최소 배지에서 예비-배양하였고, 이를 500 mL-진탕 플라스크 중의 50 mL의 주 배양물 내로 대략 0.1의 OD600로 접종하였다. 플라스미드-수반 균주의 배양물을 50 mg/L 카나마이신으로 보충하였다. trpDC 유전자의 붕괴를 수반한 균주의 배양물을 부가적으로, 0.1 mM L-트립토판으로 보충시키고, pheA 유전자의 붕괴를 수반한 균주의 배양물을 부가적으로, 1 mM L-페닐알라닌으로 보충시켰다. 1 mM IPTG를 부가하여 oAB 생산을 가능하게 함으로써 lacI q 시스템을 중간 지수기의 시작시 유도시켰다. oAB 생산자로서의 상기 균주의 특징을, 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다. 배양 동안, OD600, 글루코스 농도, 및 안트라닐레이트 농도를 1.5 mL 배양 샘플로부터 오프라인 측정하였다. 광도계를 이용하여 OD600 측정한 후, 각 샘플의 1 mL 분취액을 반응 튜브 내에서 16000 x g로 5분 동안 원심분리하였다 (5415R; 에펜도르프; 독일 함부르크). 상등액을, HPLC-DAD (1100; 애질런트 테크놀로지; 미국 산타 클라라) 및 YSI [YSI-셀렉트(Select) 2700; 크라이엔바움 네오사이언스 게엠베하 (Kreienbaum Neoscience GmBH; 독일 랑겐펠트)]를 통하여 분석하였다. 실시예 3 및 실시예 4의 수집된 데이터가 표 4에 제시되어 있다.
<표 1>
본 발명에 사용되고/되거나 생성된 벡터 및 플라스미드
Figure 112016088905843-pct00002

Figure 112016088905843-pct00003

Figure 112016088905843-pct00004

<표 2>
본 발명에 사용되고/되거나 생성된 박테리아 균주
Figure 112016088905843-pct00005

Figure 112016088905843-pct00006

Figure 112016088905843-pct00007

Figure 112016088905843-pct00008

<표 3>
본 발명에 사용된 프라이머
Figure 112016088905843-pct00009

Figure 112016088905843-pct00010

<표 4>
본 발명에 사용되고/되거나 생성된 박테리아 균주의 oAB 생산에 대한 특징 (CDW: 세포 건조 중량; Y: 수율; μ max : 최대 성장률; STY: 공간 시간 수율).
Figure 112016088905843-pct00011

Figure 112016088905843-pct00012

Figure 112016088905843-pct00013

Figure 112016088905843-pct00014

실시예 5 - 세포 보유를 수반한 연속 발효기에서 씨. 글루타미쿰 균주의 배양
연속식 발효를 안트라닐레이트의 생산에 사용하여 최적화 공간-시간 수율을 달성하였다. 세포 보유 시스템을 연속식 발효 동안 적용하여, 공급 용액의 글루코스 농도를 증가시키지 않고서도 바이오매스 농도를 증가시켰다. 2가지 상이한 시스템을 실험실 규모의 세포 보유 실험에 사용하였다: 750 kDa의 값의 컷을 수반한, JM 물 분리로부터의 중공 섬유 여과 모듈 [워터셉 테크놀로지 코포레이션 (WaterSep Technology Corporation; 미국 매사추세츠주 말버러)] 및 뉴마틱 스케일 앤젤러스(Pneumatic Scale Angelus) [알렌 로드 (Allen Road; 미국 오하이오주 스토우)]로부터의 일회용 원심분리기 (센트리텍 랩 III). 양 시스템을 1 L 실험실 규모 바이오반응기 [옴니페름, 하이텍 창 (OmniFerm, HiTec Zang; 독일 헤르조겐라트)]에 연결시킨다. 상기 여과 모듈의 통합이 도 30에 도시되어 있고, 원심분리기의 통합이 도 31에 도시되어 있다.
균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD의 연속식 발효
37 g/L 뇌-심장 침출액 (BHI) 및 91 g/L 소르비톨을 함유하는 50 mL 멸균성 BHIS 배지로 충전시킨 멸균성 250 mL 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크를 이용하여, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD (표 2 참조)의 예비배양물을 제조하였다. 140 rpm의 진탕 주파수로 28℃ 하에 24시간 동안 인큐베이션하면, 6.0의 OD600이 야기되었다. 9 mL의 배양물 용적을, 42 g/L MOPS 완충제, 20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아, 3.7 g/L 뇌-심장 침출액, 9.1 g/L 소르비톨, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 91 mL 신선한 CGXII-MOPS 유래 배지 내로 옮겼다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.1 mM L-트립토판, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 100 mL 배양물 용적을 140 rpm의 진탕 주파수로 28℃ 하에 24시간 동안 500 mL 에를렌마이어 플라스크에서 인큐베이션하면, 18.7의 OD600이 야기되었다. 27 mL의 배양물 용적을 원심분리시키고, 상등액을 경사 제거하며, 펠릿을 25 mL 멸균성 등장성 PBS 완충제에 재현탁시켰다. 이 현탁액을, 20 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2, 100 μL/L 폴리프로필렌글리콜 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 1 L 멸균성 CGXII 유래 배지를 수반한 발효기 내로 주사하였다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.1 mM L-트립토판, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 연속식 작동 동안 공급을 위하여 상기와 동일한 배지를 사용하였다. 교반기 속도를 200 내지 1200 rpm으로 조정함으로써, 용존 산소 농도를 30%로 제어하였다. 통기를 위하여 0.2 l/h 공기의 일정한 기체 유속을 조정하였고, 1 M NH4OH를 이용하여 pH를 7로 제어하였다. 그 발효 결과가 도 32에 도시되어 있다. 처음 24시간 내의 배치식 단계 동안에는, 글루코스가 소모되었고, 바이오매스 및 oAB가 생산되었다. 50 mL/h 멸균성 배지를 공급하고 바이오매스 및 oAB를 포함한 발효 브로쓰를 50 mL/h로 퍼징함으로써 24시간의 배양 시간 후에, 발효기를 연속식 작동으로 전환시켰다. 연속식 배양 동안에는 oAB가 일정하게 생산되었다. 100 h의 배양 시간 후, 도 30에 명시된 바와 같이 직교류 한외여과를 이용하여 세포 보유를 시작하였다. 건조 세포 중량의 증가는 도 32에 도시된 바와 같은 세포 보유에 의해 달성되었다.
균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δgpi의 연속식 발효
37 g/L 뇌-심장 침출액 (BHI) 및 91 g/L 소르비톨을 함유하는 50 mL 멸균성 BHIS 배지로 충전시킨 멸균성 250 mL 에를렌마이어 플라스크를 이용하여, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD :: trpD5Δgpi (표 2)의 예비배양물을 제조하였다. 140 rpm의 진탕 주파수로 28℃ 하에 24시간 동안 인큐베이션하면, 8.2의 OD600이 야기되었다. 10 mL의 배양물 용적을, 42 g/L MOPS 완충제, 20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아, 3.7 g/L 뇌-심장 침출액, 9.1 g/L 소르비톨, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 90 mL CGXII-MOPS 유래 배지 내로 옮겼다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 100 mL 배양물 용적을 300 rpm의 진탕 주파수로 30℃ 하에 24시간 동안 2개의 250 mL 에를렌마이어 플라스크에서 인큐베이션하면, 20.5의 OD600이 야기되었다. 55 mL 배양물 브로쓰의 용적을, 20 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2, 100 μL/L 폴리프로필렌글리콜 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 1 L CGXII 유래 배지를 수반한 발효기 내로 주사하였다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 20 g/L (NH4)2SO4, 10 g/L KH2PO4, 10 g/L K2HPO4, 2.5 g/L MgSO4·7H2O, 0.1 g/L CaCl2, 2 mL/L 폴리프로필렌글리콜 및 100 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 고 농축 배지를 공급에 사용하였다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 20 mg/L 바이오틴, 0.1 g/L MnSO4·H2O, 0.1 g/L FeSO4·7H2O, 10 mg/L ZnSO4·7H2O, 2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.2 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.3 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 교반기 속도를 200 내지 1400 rpm으로 조정함으로써, 용존 산소 농도를 30%로 제어하였다. 통기를 위하여 0.2 l/h 공기의 일정한 기체 유속을 조정하였고, 1 M NH4OH 및 1 M HCl을 이용하여 pH를 7로 제어하였다. 그 발효 결과가 도 33에 도시되어 있다. 처음 40시간 내의 배치식 단계 동안에는, 글루코스가 소모되었고, 바이오매스 및 oAB가 생산되었다. 10 mL/h 배지를 공급하고 바이오매스 및 oAB를 포함한 발효 브로쓰를 10 mL/h로 퍼징함으로써 40시간의 배양 시간 후에, 발효기를 연속식 작동으로 전환시켰다. 연속식 작동의 시작시, 바이오매스 농도는 도 33에 도시된 바와 같은 반응기에서 글루코스의 축적을 초래하는, 공급 용액 중에 부가된 글루코스를 완전히 소모하기에 충분히 높지 않았다. 136 h 후, 세포 농도는 부가된 글루코스를 완전히 소모하기에 충분히 높았다. 도 31에 도시된 바와 같이, 원심분리기를 이용하여 184 h 후에 세포 보유를 시작하였다. 건조 세포 중량의 증가는 도 33에 도시된 바와 같이 세포 재순환에 의해 달성되었다. 400 h 연속식 발효 동안 oAB의 연속적 생산이 달성되었다.
복합 탄소 공급원을 이용한 균주 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD의 연속식 발효
37 g/L 뇌-심장 침출액 및 91 g/L 소르비톨을 함유하는 50 mL 멸균성 BHIS 배지로 충전시킨 멸균성 250 mL 에를렌마이어 플라스크를 이용하여, 씨. 글루타미쿰 ΔtrpD (표 2)의 예비배양물을 제조하였다. 140 rpm의 진탕 주파수로 28℃ 하에 24시간 동안 인큐베이션하면, 7.53의 OD600이 야기되었다. 7 mL의 배양물 용적을, 42 g/L MOPS 완충제, 20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 우레아, 3.7 g/L 뇌-심장 침출액, 9.1 g/L 소르비톨, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 93 mL 신선한 CGXII-MOPS 유래 배지 내로 옮겼다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.1 mM L-트립토판, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 100 mL 배양물 용적을 140 rpm의 진탕 주파수로 28℃ 하에 24시간 동안 500 mL 에를렌마이어 플라스크에서 인큐베이션하면, 21.3의 OD600이 야기되었다. 25 mL의 배양물 용적을 원심분리시키고, 상등액을 경사 제거하며, 펠릿을 25 mL 멸균성 등장성 PBS 완충제에 재현탁시켰다. 이 현탁액을, 20 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.01 g/L CaCl2, 100 μL/L 폴리프로필렌글리콜 2000 및 10 g/L 글루코스 (별도로 오토클레이빙됨)를 함유하는 1 L 멸균성 CGXII 유래 배지를 수반한 발효기 내로 주사하였다. 멸균성 여과 후에 다음 성분을 부가하였다: 2 mg/L 바이오틴, 0.1 mM L-트립토판, 0.01 g/L MnSO4·H2O, 0.01 g/L FeSO4·7H2O, 1 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.2 mg/L CuSO4·5H2O, 0.02 mg/L NiCl2·6H2O 및 0.03 g/L 3,4-디히드록시벤조산. 연속식 작동의 처음 772시간 동안 공급을 위하여 상기와 동일한 배지를 사용하였다 (공급 배지 1). 772 시간 후, 공급 조성물을, 40 g/L (NH4)2SO4, 0.5 g/L KH2PO4, 5 mL/L 옥수수 침지액 (시그마 알드리히, C4648, 로트 번호: MKBP5720V), 1 mL/L 폴리프로필렌글리콜, 267 g/L 글루코스 시럽 [카르길(Cargill) C*Sweet D02767, 로트 번호: 03285882; 별도로 오토클레이빙됨]을 함유하는 공급 배지 2로 변화시켜, 공급 용액 중의 최종 글루코스 농도 200 g/L, 및 0.1 mM L-트립토판 (오토클레이빙 후에 멸균성 여과되고 부가됨)를 달성하였다. 교반기 속도를 200 내지 1200 rpm으로 조정함으로써, 용존 산소 농도를 30%로 제어하였다. 통기를 위하여 0.2 l/h 공기의 일정한 기체 유속을 조정하였고, 1 M NH4OH를 이용하여 pH를 7로 제어하였다. 공급 배지 2를 이용한 연속식 발효 결과가 도 34에 도시되어 있다. 공급 배지 1을 이용한 연속식 발효의 선행 772시간은 도시되지 않는다. 도 30에 명시된 바와 같이 직교류 한외여과에 의해 연속적 세포 보유를 달성하였고, 도 34에 도시된 바와 같은 배양 동안에 안트라닐레이트의 연속적 생산이 달성되었다. 연속식 작동은 글루코스의 축적으로 인해 도 34에서의 정지 상으로써 표시된 바와 같이 일시적으로 중단되었다. 글루코스 수준이 감소된 후에는 공급과 수확이 재개되었다.
실시예 6 - 안트라닐산 (AA)의 흡착/탈착
안트라닐산 (AA)을 얻기 위하여, 흡착-탈착 작동을 수행함으로써, 보다 고 농도의 AA를 수반한 용액을 수성 용액에서 유기 용매 내로 옮겼다. 그렇게 하기 위하여, 상이한 유형의 흡착제 상에서 AA의 흡착 용량을 시험하였다.
제올라이트 Y (제올리스트 인터내셔날, 카탈로그 번호 CBV600) 및 ZSM5 [수에드-케미에/클라리언트(Sued-Chemie/Clariant) 카탈로그 번호 H-MFI-27]를, 상이한 분자에 대한 분자 체로서 기능하는 제올라이트로서 선택하였다. 히드록시아파타이트 (Ca10(PO4)6(OH)2)(시그마-알드리히 카탈로그 번호 289396)를, 상이한 용매 중에서 AA 및 일부 다른 유사한 화합물의 흡착에 있어서의 그의 능력에 기인하여 시험하였다.
흡착 시험: 흡착제를 300℃ 하에 3 h 동안 미리 하소시켜 잔존하는 어떠한 수분도 방출시켰다. 수중 AA (0.5 wt%)의 용액을 준비하였다. 이러한 용액 20 mL를, 0.2 g 흡착제를 함유하는 50 mL 플라스크로 옮겼다. 특정 기간 동안 교반시킨 후, 수중 AA의 농도를 HPLC에 의해 분석하였다. 수중 AA의 농도 감소가 흡착된 AA로서 간주되었다.
금속-교환된 제올라이트의 합성: 문헌 (W. H. Goodman, US 4910336, 1990)에 따라서 Ca-혼입된 제올라이트의 개선된 흡착 용량을 고려해 볼 때, AA의 흡착에서 시험하고자 하는 Ca-교환된 제올라이트를 이온 교환에 의해 제조하였다 (S. M. Seo, S. Y. Coi, J. M. Suh, K. J. Jung, N. H. Heo and W. T. Lim, Bull. Korean Chem. Soc. 2009, 30:1703). 분말로서 3 g의 제올라이트를 Ca(NO3)2·4H2O (0.5 M)의 용액에 가하였다. 이러한 슬러리를 4시간 동안 교반시킨 다음, 용액을 신선한 것으로 대체시키고, 이 과정을 2회 더 반복하였다. 최종적으로, 고형물을 원심분리시킴으로써 분리하였고, 80℃ 하에 건조하며 300℃ 하에 3 h 동안 하소하였다. 상기 설명된 바와 동일한 방법을 이용하여, K, Na, Mg 및 Fe를 사용하여 4개의 다른 금속-교환된 제올라이트 Y 샘플을 제조하였다. 이어서, 이들 샘플을 K-Y, Na-Y, Ca-Y, Mg-Y 및 Fe-Y로 표지시켰다. 제올라이트 H-ZSM5의 공극 크기는 0.4 내지 0.6 nm의 범위, 바람직하게는 0.5 nm일 수 있다. 제올라이트 H-Y의 공극 크기는 0.6 nm 내지 0.9 nm의 범위, 바람직하게는 0.7 내지 0.9 nm일 수 있다 (예를 들어, 제올리스트 인터내셔날로부터 수득된 바와 같음, 카탈로그 번호 CBV600).
상기 언급된 흡착제를 이용하여 AA의 흡착 시험을 수행하였다. 이들 시험의 결과가 표 6에 제시되어 있다.
<표 6>
AA 0.5%의 흡착
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제올라이트 Y는 수성 용액으로부터 AA를 흡착시키는 데 있어서 가장 높은 능력을 나타내었다. Ca 교환된 제올라이트 Y는 AA의 흡착을 거의 50% 정도 개선시킬 수 있었다. Fe 교환된 제올라이트 Y는 AA의 흡착을 거의 2배로 개선시킬 수 있었다. 상기 시험은 증류수 중의 AA 용액을 이용하고 또한, (NH4)2SO4 (20 g/L), Na2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (1 g/L) 및 MgSO4 (0.25 g/L)를 함유하는 완충제 용액 중의 AA 용액을 이용하여 수행하였다. 나중에, MgSO4를 상기 완충제 용액으로부터 제거하였는데, 이는 이것이 불용성 마그네슘 안트라닐레이트 염의 형성을 유발시켰기 때문이다. 상기 금속-교환된 제올라이트 중에서, Fe-Y가 가장 높은 AA 흡착 용량 (50 g AA/ kg Fe-Y 보다 높음)을 나타내었다. 다행히도, 상기 완충제 용액 성분은 AA의 흡착에 영향을 미치지 않았고, 흡착 용량은 증류수에서의 것과 유사하였다. 흡착 시험 후 Fe-Y 샘플의 IR 스펙트럼은 AA의 일부 특징적 피크를 나타냈는데, 이는 아마도 거의 Fe와 킬레이트화되는 Fe-Y의 표면 상에 AA가 존재한다는 명백한 증거일 수 있다.
<표 7>
10분 및 60분간 접촉시킨 후 증류수 및 완충 수성 용액 중에서의 금속-교환된 제올라이트 Y의 AA 흡착 용량 a
Figure 112016088905843-pct00016

a g AA/ kg 흡착제.
흡착 시험 후의 Fe-Y, 및 신선한 Fe-Y 샘플을 ICP-MS에 의해 분석하였다. 이러한 분석은 양 샘플에서의 Fe/Al 비가 각각 1.25 및 1.3이었고, 서로 매우 근접하다는 사실을 나타내었다. 따라서, 누출되는 Fe의 양은 무시할만한 수준이었다. Ca-Y의 경우에는, 흡착 시험 후 64% Ca 누출이 검출되었다.
Fe-Y 상에 탈착된 AA의 분해는 질량 분석기 (TGA-MS)가 장착된 열 중량측정 분석기를 이용하여 550℃ 이하의 온도에서 연구하였다. 도 7에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 400℃ 미만의 온도에서는 ANL이 전혀 형성되지 않았다. 400℃ 보다 높은 온도에서는, AA가 폴리아닐린으로 직접 분해되었는데, 이는 샘플 홀더(holder) 상에서 암색 물질로서 관찰되었다. 소량의 ANL이 400℃ 보다 높은 온도에서 검출되었다. 따라서, 흡착제 상에 흡착된 AA가 ANL로 직접적인 열 전환되는 것은 성공적이지 못하였다.
흡착제로부터 액체 상으로의 AA의 탈착
Fe-Y로부터 물로의 AA의 탈착 시험은 수성 용액 중에서 금속-교환된 제올라이트에 의한 AA의 흡착이 가역적이란 사실을 나타내었다. 연속해서, 유기 용매 내로의 AA의 탈착을 시험하였다. 1-도데칸올을 유기 용매로서 선택하였는데, 이는 이러한 유기 용매에서의 AA의 용해도가 높고 그의 수중 혼화성은 극히 낮기 때문이다 (0.004 g/L). 게다가, 그의 비점 (259℃)은 아닐린 (183℃) 및 물 보다 훨씬 더 높으므로, 그를 최종 혼합물로부터 분리하는 것이 더 편리하였다. Fe-Y로부터 1-도데칸올 내로의 AA의 탈착은 10.8 mg AA를 함유하는 0.2 g Fe-Y를 2 mL 1-도데칸올에 현탁시킴으로써 수행하였다. 이러한 슬러리를 25 내지 120℃의 온도 범위에서 0.5 h 동안 교반시켰다. 그 탈착 결과가 도 8에 도시되었는데, 최대 27.8% AA가 120℃에서 1-도데칸올 상 내로 탈착될 수 있었다.
실시예 7 - 유기 용매 중에서 열 탈카르복실화함으로써 안트라닐산을 아닐린으로 탈카르복실화하는 반응 역학
1- 도데칸올에 용해된 AA의 탈카르복실화
160℃ 하에서 1-도데칸올에 용해된 AA 3 wt%의 탈카르복실화를 시험하였다. 상이한 특질을 갖는 촉매를 스크리닝하였다. 그 결과가 도 9에서 관찰될 수 있다. 어떠한 촉매도 수반하지 않은 블랭크 시험은 단지 1.4% 전환을 나타냈지만, 제올라이트 Y (CBV600, "GO257")의 존재하에서는 1시간 내에 70% 초과가 ANL로 전환되었다.
제올라이트 Y (CBV600, "GO257")에 비해 높은 AA 전환은 그의 고도의 산성 특질과 또한 공극 크기 (0.7 내지 0.8 nm)에 기인할 수 있다. ZSM5 (MFI-27)는 산성 특질을 보유하고 있음에도 불구하고, 보다 작은 공극 크기 (0.5 nm)를 가지므로, AA 분자가 그들 내로 침투할 수 없고, 결과적으로 활성 부위에 접근하지 못한다. 히드로탈사이트 (HTC, Mg6Al2(CO3)(OH)16·4H2O)는 염기성 특질을 가지며, AA의 낮은 전환은 염기성 부위가 AA의 탈카르복실화에 있어서의 산성 부위와 같이 활성적이지 않다는 것을 표시한다. Na를 제올라이트 H-Y ("GO257")에 부가하면, 그의 산성 특질이 저하되므로, AA의 낮은 전환이 달성되었다. 암모니아 형태 (CBV500, "GO55")가 또한, H-Y (CBV600, "GO257")보다 더 적은 수의 산성 부위를 갖고 있다.
도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 160℃ 및 180℃ 하에 1-도데칸올에서의 AA 프로파일의 탈카르복실화는 AA 전환과 ANL 형성이 영차(zero order) 역학을 따른다는 사실을 보여주었다. 160℃ 및 180℃ 하에서의 반응을 위한 모의 모델은 속도 계수 (k)를 각각 0.235 mol.L- 1.h-1 및 0.522 mol.L- 1.h-1로서 계산하였다. ANL에 대한 이들 반응의 선택도는 100%였고, 95 내지 110% (평균 100.4%)의 질량 밸런스가 관찰되었다.
아닐린에 용해된 AA의 탈카르복실화
아닐린은 AA에 대하여, 도데칸올 보다 훨씬 더 우수한 용매이고, 또한 탈카르복실화의 생성물이므로, 그의 사용은 1-도데칸올과 비교해서 상당한 이점을 제시하였다. 본 발명자들은 실온 (20℃) 하에서는 30% 이하의 AA가 아닐린에 용해될 수 있었고, 50℃ 하에서는 40% 이하의 AA가 아닐린에 용해될 수 있었으며, 90℃ 하에서는 50% 이하의 AA가 아닐린에 용해될 수 있었다는 사실을 밝혀내었다.
160, 180 및 200℃ 하에서 아닐린에 용해된 AA 40 wt%의 탈카르복실화를 시험하였다. 어떠한 촉매도 수반하지 않은 블랭크 시험은 앞서와 같이 무시할 만한 수준의 전환을 나타냈지만, 제올라이트 Y (CBV600, "GO257")의 존재하에서는 2시간 내에 99% 초과가 ANL로 전환되었다. 그 결과가 도 35에 도시되어 있다. 본 발명자들은 또한, 그 데이터를 단순 역학 모델에 따라서 피팅할 수 있었다:
Figure 112016088905843-pct00017

상기식에서, "r"은 시간당 촉매 g당 아닐린 g의 반응 속도이고, "k0"은 또한, 시간당 촉매 g당 아닐린 g의 역학 상수이며, "Ea"는 반응 활성화 에너지 (kJ/mol)이고, "R"은 8.31 J / K mol의 이상적 기체 상수이며, "T"는 온도 (K)이고, "AA"는 AA의 농도이며, "n"은 반응 차수이다. 도 35는 또한, 상이한 온도 하에서의 상기 반응 모델의 피팅을 도시한 것이다. 그 피팅 결과가 다음과 같이 요약될 수 있다:
k0=55492 g AN / g CAT h
Ea=37.4 kJ/mol
n= 0.16
도 35는 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 160℃, 180℃ 및 200℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
안트라닐산 (40 wt%)을 아닐린에 용해시켰다. 일단 약 50℃로 가열되면, 상기 농도에서 상기 산은 유기 용매에 완벽하게 가용성이었다. 이어서, 상기 용액 80 mL를 160 mL의 오토클레이브 내로 옮기고, 1.5 g의 제올라이트 촉매를 가하며 160℃, 180℃ 또는 200℃로 가열하였다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하고, HPLC 방법에 의해 분석하여, 아닐린 형성 속도를 결정하였다.
물의 존재하에 아닐린에 용해된 AA의 탈카르복실화
결정화 공정으로부터 분리된 안트라닐산에 일부 잔류 수분 (대략 10%)이 존재할 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 물의 존재하에서의 반응 역학을 검토하기로 결정하였다. 바로 전의 것과 유사한 실험을 수행하였는데, 단 반응 혼합물에 대하여 의도적으로 10 wt% 물을 부가하였다. 본 발명자들은 전반적인 역학과 반응 프로파일이 변하지 않은 채로 있다는 사실을 밝혀내었다. 반응 온도 200℃에 대한 결과가 도 36에 제시된다.
도 36은 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 200℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린 및 10% 물-90% 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
안트라닐산 (40 wt%)을 아닐린에 용해시켰다. 일단 약 50℃로 가열되면, 상기 농도에서 상기 산은 유기 용매에 완벽하게 가용성이었다. 이어서, 상기 용액 80 mL를 160 mL의 오토클레이브 내로 옮긴 다음, 10% (8 g)의 물을 가하고, 1.5 g의 제올라이트 촉매를 가하며 160℃, 180℃ 또는 200℃로 가열하였다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하고, HPLC 방법에 의해 분석하여, 아닐린 형성 속도를 결정하였다.
상이한 유기 공급원으로부터 아닐린에 용해된 AA의 탈카르복실화
본 발명에 따라서, 안트라닐산은 상이한 당 배지의 발효에 의해 생물학적으로 생산될 수 있었다. 상이한 배지에 존재하는 미량 원소 (즉, 가수분해된 옥수수 전분, 사탕 수수즙 또는 글루코스)에 있어서의 차이가 안트라닐산 (이는 아닐린으로 추가로 탈카르복실화되어야 한다)에 영향을 미칠 수 있는 것으로 예상할 수 있다. 이들 차이가 촉매 및 탈카르복실화 반응을 방해할 수 있었는지를 검증하기 위하여, 상이한 성장 배지로부터의 결정화에 의해 분리된 상이한 안트라닐산을 시험하였다. 그 비교는 실험실 공급업자 시그마 알드리히에 의해 구입한 화학적으로 순수한 안트라닐산에 대항하여 항상 수행하였다.
상이한 AA를, 180℃ 하에 아닐린 중의 AA의 40% 용액으로부터 출발하여 바로 앞서의 시험과 동일한 조건에서 시험하였다. 그 결과가 도 37에 요약되어 있다. 모든 AA 공급원은 90분 미만 내에 아닐린으로 완전히 전환되었다. 가장 신속한 전환은 순수 화학물질 (알드리히)에 의해 제시되었다. 이는 화학적으로 순수한 글루코스의 발효에 의해 생산된 물질 (VN35)과 거의 동등한 수준이었다. 약간 더 느리게 전환되는 것은 가수분해된 옥수수 전분으로부터 단리된 물질 (VN32 및 33)이고, 그 다음이 사탕 수수즙으로부터 단리된 물질 (VN34)이다. 이러한 순서는 사용된 배지의 정련 정도를 따른다. 가장 순수한 당 공급원은, 그로부터 단리된 AA의 보다 신속한 분해를 초래하였다. 이는 제올라이트 촉매를 방해할 수 있었던 철 또는 미네랄과 같은 미량 원소의 존재에 의해 설명될 수 있었다. 그러나, 그 효과는 탈카르복실화 반응을 방해하지 못할 정도로 제한적인데, 이는 AA의 공급원과 완전히 독립적으로 매우 신속하게 진행된다.
도 37은 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 180℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
안트라닐산은 화학적으로 순수한 글루코스, 가수분해된 옥수수 전분 및 사탕 수수즙과 같은 상이한 당 배지로부터 결정화시킴으로써 수득하였다. 이로써 생성된 단리된 안트라닐산 (40 wt%)을 아닐린에 용해시켰다. 일단 약 50℃로 가열되면, 상기 농도에서 상기 산은 유기 용매에 완벽하게 가용성이었다. 이어서, 상기 용액 80 mL를 160 mL의 오토클레이브 내로 옮기고, 1.5 g의 제올라이트 촉매를 가하며 180℃로 가열하였다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하고, HPLC 방법에 의해 분석하여, 아닐린 형성 속도를 결정하였다.
가수분해된 옥수수 전분으로부터 아닐린에 용해된 AA의 탈카르복실화에 대한 촉매 안정성
앞서 관찰된 미량 원소의 효과를 고려하여, 본 발명자들은 몇 차례의 수행 전반에 걸친 촉매 안정성을 시험하였다. 본 발명자들은 앞서 기재된 반응 과정에 따라서, 촉매를 재순환시키고, 이를 임의의 세척 단계 없이 다음 단계에 사용함으로써 이를 수행하였다. 그 결과가 도 38에 제시된다. 신선하게 제조된 촉매와 재사용된 촉매 간의 활성 상의 차이는 최소한이다. 재사용된 것은 신선한 시스템 보다 훨씬 더 신속하거나 더 우수한 것으로 보인다. 이는 촉매에 대한 미량 원소의 독성 또는 억제 효과가 전혀 없으며, 탈카르복실화 반응에서 여전히 활성이란 사실을 나타내었다. 그것을 추가로 확증하기 위하여, 본 발명자들은 촉매를 사후 분석하였고, 이를 신선하게 제조된 것과 비교하였다. 2개 촉매의 IR 스펙트럼이 도 39에 도시되어 있다. 일부 흡수된 아닐린 종 외에도, OH 시그널이 적은 수준으로만 감소되었다. 이러한 OH는 다른 이온 (미량 원소)으로의 교환 후에 켄칭할 수 있었지만, 그들은 촉매에 대한 활성 부위가 아닌 것으로 예상되는데, 이는 제올라이트의 강력한 산성이 Al-O-Si 브릿지로부터 비롯되기 때문이다.
도 38은 특정 촉매를 이용하여 아닐린 중에서의 2-아미노벤조산 (안트라닐산, AA)의 분해를 도시한 것이다. 180℃에서 제올라이트 Y의 존재하에 아닐린에 40 wt%로 용해된 안트라닐산 (AA)의 탈카르복실화의 역학이 도시되어 있다.
안트라닐산은 가수분해된 옥수수 전분으로부터 결정화시킴으로써 수득하였다. 이로써 생성된 단리된 안트라닐산 (40 wt%)을 아닐린에 용해시켰다. 일단 약 50℃로 가열되면, 상기 농도에서 상기 산은 유기 용매에 완벽하게 가용성이었다. 이어서, 상기 용액 80 mL를 160 mL의 오토클레이브 내로 옮기고, 1.5 g의 제올라이트 촉매를 가하며 180℃로 가열하였다. 촉매를 단리하고, 추가의 처리 또는 세척없이 후속 반응을 위해 재순환시켰다. 샘플을 상이한 시간 간격으로 취하고, HPLC 방법에 의해 분석하여, 아닐린 형성 속도를 결정하였다.
도 39는 신선하게 제조된 H-Y 촉매, 및 가수분해된 옥수수 전분으로부터 단리된 AA를 이용하여 상기와 같은 반응 후의 것의 IR 스펙트럼을 도시한 것이다. 아닐린에 대한 특유의 밴드가 표시된다. 이러한 고도의 염기성 종의 흡수가 정말로 일어난다. OH 영역이 또한 강조된다. OH 시그널의 감소는, 존재하는 미량 원소와 함께 일어날 수 있었던 일부 부분 이온 교환과 화합성이지만, OH 기는 상기 촉매에서 활성이 아닌 것으로 여겨지고, Al-O-Si 브릿지가 그 책임이 있는 것으로 예상된다.
실시예 8 발효 브로쓰로부터 oAB의 용해 및 결정화
산업용 당 공급원을 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효에 사용하였다. 21.5 g/L 글루코스, 3.7 g/L 락테이트의 성분을 갖는 브로쓰 100 ml를 250 ml 실험실 반응기 내에서 10 g 안트라닐산과 혼합하였다. 이 슬러리는 4.7의 pH-값을 갖고 있었다. oAB의 용해도는 pH 4.5의 실온에서 약 4.5 g/L였다. 그 후, 용액이 존재할 때까지 9.12 g NaOH (32%)를 4회 분량으로 나누어 부가하였다. 용액은 8.3의 pH-값을 갖고 있었다. 그 후, 7 g HCl (37%)을 1시간 이내에 부가하였다. HCl을 투여함으로써, 첫 번째 핵생성이 5.8의 pH-값으로부터 일어났다. 투여 동안에는 결정의 수가 증가하였다. 투여가 끝날 무렵, 현탁액은 3.6의 pH-값을 갖고 있었다. 그 후, 슬러리를 1시간 동안 교반시켰다. 최종적으로 슬러리를 여과하였다.
여과:
0.2 바 및 12.6 ㎠의 필터 면적에서 VDI 가이드라인 "VDI 2762"에 따라서 여과를 수행하였다. 125 g 현탁액을 여과하고 25 g 물로 세척하였다. 91 g 모액 및 23.1 g 습윤 고형물을 측정하였다. "VDI 2762"에 따라서 결정되는 필터 케이크의 저항성은 5 x 1010 1/m2인 것으로 간주되었다. 상기 필터 케이크를 건조로에서 건조하였다. 건조한 후, 9.1 g의 건조 고형물을 측정하였는데, 91%의 수율에 상응하였다.
모액 중에 존재하는 안트라닐산의 비율은 0.72%였다. 고형물의 회분 함량은 안트라닐산의 염 함량에 대한 지표로서 결정되었다. 이러한 회분 함량은 0.55%인 것으로 결정되었다.
실시예 9 - 1- 도데칸올 중에서의 oAB의 용해도
온도를 증가시키면서 1-도데칸올 중에서의 oAB의 용해도를 시험하였다.
SLE = 고체 액체 평형
Figure 112016088905843-pct00018

온도가 상승함에 따라 1-도데칸올 중에서의 oAB의 용해도가 증가하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer MaterialScience AG <120> Recombinant strain producing o-aminobenzoate and fermentative production of aniline from renewable resources via 2-aminobenzoic acid <130> BMS131142 WO <150> EP14155936.9 <151> 2014-02-20 <160> 110 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1047 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgacttctc cagcaacact gaaagttctc aacgcctact tggataaccc cactccaacc 60 ctggaggagg caattgaggt gttcaccccg ctgaccgtgg gtgaatacga tgacgtgcac 120 atcgcagcgc tgcttgccac catccgtact cgcggtgagc agttcgctga tattgccggc 180 gctgccaagg cgttcctcgc ggcggctcgt ccgttcccga ttactggcgc aggtttgcta 240 gattccgctg gtactggtgg cgacggtgcc aacaccatca acatcaccac cggcgcatcc 300 ctgatcgcag catccggtgg agtgaagctg gttaagcacg gcaaccgttc ggtgagctcc 360 aagtccggct ccgccgatgt gctggaagcg ctgaatattc ctttgggcct tgatgtggat 420 cgtgctgtga agtggttcga agcgtccaac ttcaccttcc tgttcgcacc tgcgtacaac 480 cctgcgattg cgcatgtgca gccggttcgc caggcgctga aattccccac catcttcaac 540 acgcttggac cattgctgtc 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tgcggcaacc tggggtgtat ctaatcgttc tgcgctggtt 960 cgtgttccta cctaccgttt gaataaggag gagtcgcgcc gggtggaggt gcgtcttcct 1020 gataccgctt gtaacccata tttggcgttt tcagtgatgc tcggcgctgg tttgaaaggc 1080 attaaagaag gttatgagct cgacgagcca gctgaggacg atatctccaa cttgagcttc 1140 cgggaacgtc gcgctatggg ctacaacgat ctgccaagca gccttgatca ggcactgcgc 1200 caaatggaaa agtcagagct tgttgctgac atcctcggtg agcacgtttt tgagtttttc 1260 ttgcgcaata agtggcgtga atggcgtgac taccaagagc agatcactcc gtgggagctc 1320 cgaaacaatc ttgattacta g 1341 <210> 63 <211> 1880 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 63 atggatatca agagtgcgtt gagccgtatc gtcgggcagt tggacctgac taccgaagaa 60 atgcgcgagg tcatgcgcca gatcatgacc ggtcagtgca gcgaggcgca gataggcgct 120 ttcctgatgg gcatgcgcat gaaaagcgaa agcatcgacg aaatcgtcgg tgcggtgtcg 180 gtgatgcgtg agctggccga aaaggtcgag ctgcaaagcc tcgatggtgt cgtcgatatt 240 gtcgggaccg gtggtgatgg cgccaacatc ttcaacgtgt ccaccgcttc gtccttcgtc 300 ctggcggcgg cgggttgccc ggtggccaag catggtaacc gcgcagtctc gggcaagagc 360 ggcagtgccg acctgctgga agctgccggc atctacctga acctgacgcc aactcaagtg 420 gcacgctgca tcgacagcct gggcatcggc ttcatgttcg cgcaaagtca ccactcggcc 480 atgaaacatg ccgctggccc acgtcgagaa ctggggttgc gcaccctgtt caatatgctc 540 ggcccgctta cgaatccggc cggagtgaag caccaggtgg tcggtgtgtt cgcgcaaacc 600 ctttgccgcc cgctggctga ggtgctgcag cgcctgggga gcaagcatgt gctggtcgtg 660 cactcgaagg atggtctgga cgagttcagc ctggctgcac ccaccttcgt cgccgaactg 720 aaaaatgacg aaatcactga atattgggtc gagccggaag acctcggcat gaagagtcag 780 agccttcatg gcctggctgt cgagagcccg caggcttcgc tggagttgat ccgcgatgcg 840 ctgggccggc gcaagaccga gaacggtcag aaggccgccg agatgatcgt gcttaatgct 900 ggcgcggcac tgtatgcagc cgaccatgcc atgagcctga aagccggtgt agaactggcc 960 catgatgtac tgcacaccgg cctggcctgg gaaaagctgc aggaattggg tgcctttact 1020 gcagtattca aggtggagaa cgaagcatga gtgtgccgac ggtgctggaa aggatcattg 1080 cccgcaagtt tcaggaagtg gccgagcgca gtgcgcacgt cagcctcgcc gaactggagg 1140 gcctggccaa ggccgctgac gccccgcgag gcttcgccaa cgcgctgatc gagcaggcca 1200 agcgcaagca gcccgcggtg attgccgaaa tcaagaaagc ttcgccaagc aagggcgtga 1260 tccgcgagca cttcgtgcca gcggaaatcg cggtcagcta cgagaagggc ggggccacct 1320 gcctgtcggt gttgaccgat gtcgattatt tccagggtgc cgatgagtac ttgcagcagg 1380 cccgcgcggc ggtttcgctg ccggtgatcc gcaaggactt catggtcgac ccttaccaga 1440 tcgtcgaagc ccgggccctg ggggcagatt gcgtactgct gatcgtgtcg gcgctggatg 1500 acgtgaagat ggctgaactg gccgccactg ccaaggacgt cggcctcgac gtgctggtgg 1560 aagtgcacga tggcgatgaa ctggagcgcg cgctgaaaac cctggatacg ccgctggtgg 1620 gggtgaacaa ccgcaacctg cacaccttcg aggtcagcct ggaaaccacc cttgacctgc 1680 tgccgcgcat tccgcgtgac cgtctggcga ttaccgaaag cggtattctc aaccgggccg 1740 atgtggagct gatggcaatc aacgaggttt actcgttcct ggtgggtgag gcgttcatgc 1800 gcgccgagca gcctggcctg gaattacagc ggctgttctt ccccgagcag gtgaagaaga 1860 ctgttcagca actggactga 1880 <210> 64 <211> 1104 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 64 atggctgaca tgtccgaaca ggagctcaag gcgctgcgcg tacgcatcga cagcctcgac 60 gagaaaattc tcgagctgat cagcgaccgc gcccgctgcg ccgaagaagt ggcccgggtc 120 aagactgcct cgctgaaaga aggcgagaag ccggtgttct accgtcccga gcgtgaagct 180 gcggtgctca agcgcgtgat ggaacgcaac aagggcccgc tgggcaacga agagatggcg 240 cggctgttcc gcgaaatcat gtcgtcgtgc ctggccctgg aagagccgct gaaaatcgcc 300 tacctcggcc ctgaaggtac cttcacccag gcggcggcca tgaagcactt cggccacgcg 360 gtgatcagtc ggccgatggc ggccatcgac gaagtgttcc gtgaagtggc ggccggtgcc 420 gtcaacttcg gtgtggtgcc ggtggaaaac tccactgaag gtgcggtcag ccacaccctg 480 gacagcttcc tcgagcatga catggtgatt tgcggtgagg tcgagctgcg tatccaccac 540 cacctgctgg tgggcgagaa caccaagacc gacagcatca cccgcatcta ctcccacgcc 600 cagtcgctgg cccagtgccg aaagtggctg gacgctcact acccgaacgt ggagcgcgtg 660 gccgtttcga gcaatgccga agcggccaag cgggtcaagg gtgagtggaa ctcggcggcg 720 atcgccggcg atatggcggc caacctgtac ggcctgaccc gtctggccga gaagatcgaa 780 gaccgcccgg acaactccac gcgcttcctg atgatcggta accaggaagt accgccgacc 840 ggcgacgaca agacctcgat catcgtttcg atgagcaaca agccaggtgc gttgcatgag 900 ttgctggtgc cgttctatca gaacggcatc gacctgaccc gcatcgagac ccgcccgtcg 960 cgcagcggca agtggaccta cgtgttcttc atcgacttcg tcggccacca ccgcgacccg 1020 ctgatcaagg cggtgctcga gcagatcagc caggaggctg tggcgctgaa ggtgctgggc 1080 tcttatccga aggcggtgct ttga 1104 <210> 65 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 65 atggctga 8 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 66 tatgccgtgt tgaatgccat t 21 <210> 67 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 67 cccgggatcc actaaactta aacacagtgt tgctggagaa gtcat 45 <210> 68 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 68 tgtttaagtt tagtggatcc cggggaaaag gagtcttcca atgactag 48 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 69 ccagatcgac gttttcctgg c 21 <210> 70 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 70 gccctgcagg taaaaaaagg atttgattca tgacttctcc agcaacactg 50 <210> 71 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 71 gccctgcagg taaaaaaagg atttgattcg tgacttctcc agcaacactg 50 <210> 72 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 72 gccctgcagg taaaaaaagg atttgattct tgacttctcc agcaacactg 50 <210> 73 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 73 gccctgcagg taaaaaaagg attatgactt ctccagcaac actg 44 <210> 74 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 74 gccctgcagg taaaaaaagg attatgactt ctccagcaac actg 44 <210> 75 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 75 gccctgcagg taaaaaaagg attttgactt ctccagcaac actg 44 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 76 cccgggatcc ctagtcattg gaagactcct t 31 <210> 77 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 77 aatccttttt ttacctgcag ggcttagttc gcgagaagct gttcg 45 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 78 aaggagtctt ccaatgacta g 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 79 gtctccccaa tcaaatcatc a 21 <210> 80 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 80 cccgggatcc actaaactta aacagtcacc tgcattagtc at 42 <210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 81 tgtttaagtt tagtggatcc cgggcgcgga aaactcggat aa 42 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 82 tgatgatgtg cccgtccaca g 21 <210> 83 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 83 gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgca tgactaatgc aggtgac 47 <210> 84 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 84 gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgcg tgactaatgc aggtgac 47 <210> 85 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 85 gccctgcagg acgtggcaga atagtgtgct tgactaatgc aggtgac 47 <210> 86 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 86 gccctgcagg acgtggcaga atagatgact aatgcaggtg ac 42 <210> 87 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 87 gccctgcagg acgtggcaga ataggtgact aatgcaggtg ac 42 <210> 88 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 88 gccctgcagg acgtggcaga atagttgact aatgcaggtg ac 42 <210> 89 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 89 cccgggatcc ttatccgagt tttccgcgtc c 31 <210> 90 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 90 aatccttttt ttacctgcag ggcttagttc gcgagaagct gttcg 45 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 91 aaggagtctt ccaatgacta g 21 <210> 92 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence, synthetic <400> 92 agccctgcag g 11 <210> 93 <211> 525 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 93 atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac ggtcggaatg 60 gcccttgccg attcgcttaa ccgtcggttt gtcgataccg atcagtggtt gcaatcacag 120 ctcaatatga cggtcgcgga gatcgtcgaa agggaagagt gggcgggatt tcgcgccaga 180 gaaacggcgg cgctggaagc ggtaactgcg ccatccaccg ttatcgctac aggcggcggc 240 attattctga cggaatttaa tcgtcacttc atgcaaaata acgggatcgt ggtttatttg 300 tgtgcgccag tatcagtcct ggttaaccga ctgcaagctg caccggaaga agatttacgg 360 ccaaccttaa cgggaaaacc gctgagcgaa gaagttcagg aagtgctgga agaacgcgat 420 gcgctatatc gcgaagttgc gcatattatc atcgacgcaa caaacgaacc cagccaggtg 480 atttctgaaa ttcgcagcgc cctggcacag acgatcaatt gttga 525 <210> 94 <211> 573 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 94 atggagcgta atgaagtgaa tgatcaaatt cacttagatc atcaatcaga tgacacctct 60 gaatgctcct gcccgatcgt ggttcttgtg ggtttgccag gagctggaaa atccaccatt 120 ggacgtcgat tagcgcgcgc cttaaacact gaactcgtcg actccgacga actgattgag 180 cgcgccaccg gaaaagcctg tggcgccgtg ttcagcgagc tcggcgagcc agccttccgc 240 gagctcgagg ccatccacgt ggccgaagca ctgaaatcct ccggagtggt gagcttggga 300 ggcggatctg tgctgacaga atccacccgt gaactgctca aaggccagga cgtggtctgg 360 atcgacgtgc cagtagaaga aggcatcagg cgcaccgcaa acgagcgttc ccgccccgtg 420 ctgcaagccg ccgaccccgc cgagcactac cgcaacctgg tgaaagtgcg caccccgttg 480 tacgaagagg tggcaaccta ccgacttcgc accaacaacc gcagccccca gcaagtggtg 540 gcagcagtgt tgcatcatct agaaatcgat taa 573 <210> 95 <211> 1434 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 95 gtggcgtttg aaaccccgga agaaattgtc aagttcatca aggatgaaaa cgtcgagttc 60 gttgacgttc gattcaccga ccttcccggc accgagcagc acttcagcat cccagctgcc 120 agcttcgatg cagatacaat cgaagaaggt ctcgcattcg acggatcctc gatccgtggc 180 ttcaccacga tcgacgaatc tgacatgaat ctcctgccag acctcggaac ggccaccctt 240 gatccattcc gcaaggcaaa gaccctgaac gttaagttct tcgttcacga tcctttcacc 300 cgcgaggcat tctcccgcga cccacgcaac gtggcacgca aggcagagca gtacctggca 360 tccaccggca ttgcagacac ctgcaacttc ggcgccgagg ctgagttcta cctcttcgac 420 tccgttcgct actccaccga gatgaactcc ggcttctacg aagtagatac cgaagaaggc 480 tggtggaacc gtggcaagga aaccaacctc gacggcaccc caaacctggg cgcaaagaac 540 cgcgtcaagg gtggctactt cccagtagca ccatacgacc aaaccgttga cgtgcgcgat 600 gacatggttc gcaacctcgc agcttccggc ttcgctcttg agcgtttcca ccacgaagtc 660 ggtggcggac agcaggaaat caactaccgc ttcaacacca tgctccacgc ggcagatgat 720 atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgctcgcc tccacggcaa ggctgcaacc 780 ttcatgccta agccactggc tggcgacaac ggttccggca tgcacgctca ccagtccctc 840 tggaaggacg gcaagccact cttccacgat gagtccggct acgcaggcct gtccgacatc 900 gcccgctact acatcggcgg catcctgcac cacgcaggcg ctgttctggc gttcaccaac 960 gcaaccctga actcctacca ccgtctggtt ccaggcttcg aggctccaat caacctggtg 1020 tactcacagc gcaaccgttc cgctgctgtc cgtatcccaa tcaccggatc caacccgaag 1080 gcaaagcgca tcgaattccg cgctccagac ccatcaggca acccatacct gggctttgca 1140 gcgatgatga tggccggcct cgacggcatc aagaaccgca tcgagccaca cgctccagtg 1200 gacaaggacc tctacgaact accaccagag gaagctgcat ccattccaca ggcaccaacc 1260 tccctggaag catccctgaa ggcactgcag gaagacaccg acttcctcac cgagtctgac 1320 gtcttcaccg aggatctcat cgaggcgtac atccagtaca agtacgacaa cgagatctcc 1380 ccagttcgcc tgcgcccaac cccgcaggaa ttcgaattgt acttcgactg ctaa 1434 <210> 96 <211> 1857 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 96 atgcgtacat ccattgccac tgtttgtttg tccggaactc ttgctgaaaa gctgcgcgca 60 gctgcagatg ctggatttga tggtgtggaa atcttcgagc aggacttggt ggtttccccg 120 cattcggcag agcagattcg tcagcgggct caggatttgg gattaaccct ggatctgttc 180 cagccgtttc gagatttcga aggtgtggaa gaagagcagt ttctgaagaa tctgcaccgc 240 ttggaagaga agttcaagct gatgaacagg cttggcattg agatgatctt gttgtgttcc 300 aatgtgggca ccgcgaccat caatgatgat gaccttttcg tggagcagtt gcatcgtgca 360 gcagatttgg ctgagaagta caacgtcaag attgcttatg aagcgttggc gtggggcaag 420 tttgtcaatg attttgagca tgcgcatgca cttgtggaga aggtgaatca caaggcgctg 480 ggaacctgct tggatacgtt ccatattctt tcccgtggtt gggaaaccga cgaggtggaa 540 aacatcccgg cggagaagat tttctttgtt cagttggcgg atgcaccgaa gctgagcatg 600 gacattttgt cctggtcgcg tcaccaccgt gttttccctg gtgaaggcga tttcgatctg 660 gtgaaattca tggttcatct ggccaagacg ggttatgatg gcccgatttc tttggaaatc 720 ttcaacgatt ccttccgcaa ggccgaggtt ggtcgcaccg cgattgatgg gttgcgttct 780 ttgcgttggt tggaagatca gacctggcat gcgctaaatg ctgaggatcg tccaagcgca 840 ctagagctgc gtgcacttcc tgaggtcgcg gaacctgaag gcgttgattt cattgagatc 900 gccactggac gtttgggtga gaccattcgg gttcttcatc aattgggttt ccgcttgggt 960 ggtcatcact gcagtaagca ggattaccag gtatggaccc agggcgatgt gcgcattgtg 1020 gtgtgtgatc gtggggccac cggggctcca accacgatct ctgcgatggg ctttgacacc 1080 cctgatccag aagccgcgca tgcccgtgcg gaattgctgc gggctcagac aattgatcgt 1140 ccccacatcg agggtgaagt tgaccttaaa ggtgtgtacg cgccggatgg ggtggagctg 1200 tttttcgcgg ggccgagccc cgatggaatg cccgagtggc tgccggagtt cggcgtcgaa 1260 aagcaagaag ctggtctcat tgaagccatc gaccacgtca atttcgccca gccgtggcaa 1320 cattttgatg aggcagtgct gttttacacc gcgctgatgg cgttagagac tgtgcgtgag 1380 gatgagttcc cgagcccaat tggtttggtg cgcaatcagg tgatgcgttc gccgaatgat 1440 gcggtgcggt tgctgctcag cgtggcgccg gaggacggtg agcagggaga tttcctcaac 1500 gcggcctacc cggagcacat tgcgttggcc acggcggaca tcgtggcggt ggctgaacgt 1560 gcgcgcaaac gaggcctgga tttcttgccc gtcccagaga attactacga cgatgtgcag 1620 gcgcgttttg atttgccgca ggagttcttg gacacactca aggaaaacca cctgctttac 1680 gactgcgacg agaacggcga gttcctccac ttttacaccc gcacgttggg cacgctgttc 1740 ttcgaagtgg tggaacgccg cggcggtttt gcaggttggg gcgaaacaaa cgctccggtg 1800 cggttagcgg cgcagtatcg tgaggtgcgg gacctcgagc ggggaatccc caactag 1857 <210> 97 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 ttagaggaga caccatatgg cgtttgaaac cccggaaga 39 <210> 98 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-glnA-2 <400> 98 gaaccatggg ctagcctcga gttagcagtc gaagtacaat tc 42 <210> 99 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-aroL-1 <400> 99 ggccctgcag ggaaaggagg cccttcagat gacacaacct ctttttctga 50 <210> 100 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-aroL-2 <400> 100 cccgggatcc tcaacaattg atcgtctgtg c 31 <210> 101 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-aroK-1 <400> 101 ggccctgcag ggaaaggagg cccttcagat gaatgatcaa attcacttag 50 <210> 102 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-aroK-2 <400> 102 cccgggatcc ttaatcgatt tctagatgat gc 32 <210> 103 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer JK038f <400> 103 attcgagctc ggtacccggg gatccactac atcgaaaccg gcatc 45 <210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer JK039r <400> 104 ctgaactcga gtcagccatg ctccttctc 29 <210> 105 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer JK040f <400> 105 gcatggctga ctcgagttca ggggccttgg ggct 34 <210> 106 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer JK041r <400> 106 tagaagcttg catgcctgca ggcagtgagt cgaccaggcc aaag 44 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ko-csm-1 <400> 107 cttgccgacg agcgtagaaa t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ko-csm-2 <400> 108 gttgaggact accttgactt g 21 <210> 109 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-aroG-1 <400> 109 gccctgcagg agatctgaaa ggaggccctt cagatgaatt atcagaacga cgat 54 <210> 110 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Ex-aroG-2 <400> 110 cccgggatcc ttacccgcga cgcgctttta c 31

Claims (24)

  1. 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속에 속하는 재조합 미생물 숙주 세포로서, 여기서 상기 숙주 세포는 서열식별번호: 1에 의해 정의되는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 코딩하는 trpD 유전자의 유전적 변형을 갖는 것이며, trpD 유전자의 발현 저하 효과를 갖는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물 숙주 세포가 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  3. 제1항에 있어서, trpD 유전자의 유전적 변형이 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 및 서열식별번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  4. 제2항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰이 코리스메이트 무타제를 코딩하는 csm 유전자 (서열식별번호: 9)의 유전적 변형을 추가로 포함하며, csm 유전자의 발현 저하 효과를 갖는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  5. 제2항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주 세포가 hpr (서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 18), ptsG (서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20), pepco (서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22), pyk (서열식별번호: 23 또는 서열식별번호: 24), 및 gpi (서열식별번호: 27 또는 서열식별번호: 28)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  6. 제2항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주 세포가 galP (서열식별번호: 30), iolT2 (서열식별번호: 31), ppgk (서열식별번호: 32), pps (서열식별번호: 33-35), ppk (서열식별번호: 36), zwf1 (서열식별번호: 37), opcA (서열식별번호: 38-39), tktCG (서열식별번호: 40), tktEC (서열식별번호: 41), talCG (서열식별번호: 42), talEC (서열식별번호: 43), qsuA (서열식별번호: 96), trpEGS38F (서열식별번호: 50), trpEGS33R (서열식별번호: 51), trpEGS40R (서열식별번호: 52), trpEGS40F (서열식별번호: 53), aroGD146N (서열식별번호: 55), aroL (서열식별번호: 93), aroK (서열식별번호: 94), 및 glnA (서열식별번호: 95)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자들 중 하나 이상을 추가로 과발현하는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 과발현된 유전자가 플라스미드 형질전환에 의해 또는 염색체 형질전환에 의해 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 숙주 세포 내로 통합되는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 원료가 사탕무, 사탕 수수, 전분-함유 식물, 리그노셀룰로스, 글리세롤 및 C1-화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 발효성 탄소 기질이 C-5 모노사카라이드, C-6 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 트리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 미생물 숙주 세포.
  10. a) 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 생물학적으로 o-아미노벤조에이트로 전환시킬 수 있는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 미생물 숙주 세포를 이용하여 적어도 하나의 발효성 탄소 기질을 포함하는 원료를 발효시킴으로써, 안트라닐레이트 음이온을 포함하는 o-아미노벤조에이트를 생산하는 단계;
    b) 산 양성자부가에 의해 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계,
    c) 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시키거나 또는 침전시킴으로써 회수하는 단계, 및
    d) 유기 용매에서 열 탈카르복실화함으로써 상기 안트라닐산을 아닐린으로 전환시키는 단계
    를 포함하는, 아닐린의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 a)의 발효가 배치식 발효, 유가식 발효 또는 연속식 발효인 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 적어도 단계 a) 및 단계 b)가 연속적으로 수행되는 것인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 재조합 미생물 숙주가 상기 o-아미노벤조에이트를 상기 안트라닐레이트 음이온에서 안트라닐산으로 전환시키는 단계 b)를 수행하기에 앞서 제거되며, 여기서 상기 제거된 재조합 미생물 숙주가 단계 a)의 발효에 재공급되는 것인, 방법.
  14. 제10항에 있어서, 단계 b)의 산 양성자부가가, HCl을 첨가하여 수행되는 것인, 방법.
  15. 제10항에 있어서, 단계 c)에서 침전시킴으로써 상기 안트라닐산을 회수하는 것이, 여과함으로써, 상기 회수된 안트라닐산을 포함하는 슬러리를 생성시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 회수된 안트라닐산을 포함하는 상기 슬러리가 아닐린 또는 1-도데칸올 또는 그의 혼합물에 용해되는 것인, 방법.
  16. 제10항에 있어서, 단계 c)에서 상기 안트라닐산을 유기 용매에 용해시킴으로써 회수하는 것이, 아닐린 또는 1-도데칸올 또는 그의 혼합물을 유기 용매로서 상기 안트라닐산에 첨가하여, 상기 안트라닐산이 상기 유기 용매 중의 용질로서 회수되도록 하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  17. 제10항에 있어서, 단계 c)에 이어, 단계 d)의 열 탈카르복실화를 수행하기에 앞서 상기 회수된 안트라닐산 침전물을 세척 및 건조시키는 것인, 방법.
  18. 제10항에 있어서, 단계 d)가 제올라이트 촉매의 존재 하에 수행되는 것인, 방법.
  19. 제10항에 있어서, 단계 c) 이후, 잔류 안트라닐레이트 음이온을 이온 교환 수지 또는 활성 탄소 물질 또는 제올라이트에 흡착시킴으로써 회수한 다음, 상기 회수된 안트라닐레이트 음이온을 탈착시키는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 c) 이후 흡착에 의해 잔류 안트라닐레이트 음이온을 회수한 다음, 흡착된 안트라닐레이트 음이온이 고갈된 수 스트림을 단계 a)의 발효에 적어도 부분적으로 재공급하는 것인, 방법.
  21. 물 및 촉매의 존재하에 포름알데히드를 이용하여 제10항의 단계 d)에서 생성된 아닐린을 메틸렌디아닐린 (MDA)으로 추가로 전환시키 것에 의한 MDA의 생산 방법.
  22. 포스겐을 이용하여 제21항의 방법에 따라 생산된 MDA를 메틸렌디이소시아네이트 (MDI)로 추가로 전환시키는 것의 의한 MDI의 생산 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
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