WO2021187533A1 - ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 - Google Patents

３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 Download PDF

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匡平 磯部
河村　健司
山田　勝成
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東レ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified microorganism that highly produces 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid, and a method for producing 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid using the genetically modified microorganism.
  • 3-Hydroxyadipic acid (IUPAC name: 3-hydroxyhexanedioic acid) and ⁇ -hydromucon acid (IUPAC name: (E) -hex-2-enedioic acid) are dicarboxylic acids having 6 carbon atoms. These can be used as polyesters by polymerizing with polyhydric alcohols and as raw materials for polyamides by polymerizing with polyvalent amines. Further, a compound obtained by adding ammonia to these terminals to form a lactam can also be used as a raw material for the polyamide.
  • Patent Document 1 describes a poly having excellent activity of catalyzing the reduction reaction from 3-oxoadipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Methods for producing 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid using peptides have been described, and 3-oxoadipyl-CoA is converted to 3-hydroxyadipyl-CoA as a biosynthetic pathway for these substances. There is a description that it goes through an enzymatic reaction that reduces.
  • Patent Document 2 describes a method for producing a dicarboxylic acid using a bacterium having an increased expression level of the dicarboxylic acid excretion carrier genes yjjP, yjjB, yeA and ynfM, and succinic acid is used as a dicarboxylic acid having 4 carbon atoms.
  • Adipic acid is exemplified as an acid and a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms.
  • 3-oxoadipyl-CoA reductase gene is introduced, or the dicarboxylic acid excretion carrier is further modified based on a gene-modified microorganism in which the expression of the gene is enhanced and the enzyme activity is enhanced. It is an object of the present invention to provide a gene-modified microorganism for producing hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid in a high yield, and a method for producing a substance using the modified microorganism.
  • a genetically modified microorganism lacking or reducing the function of a dicarboxylic acid efflux carrier is 3-hydroxyadic acid and / or ⁇ -, contrary to the expectation from the prior art. They have found that they have an excellent ability to produce hydromuconic acid, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • An enzyme that has the ability to produce 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid and catalyzes the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • a genetically modified microorganism with enhanced activity that lacks or reduces the function of a dicarboxylic acid excretion carrier.
  • a method for producing 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid which comprises the step of culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (7).
  • the genetically modified microorganism can produce 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid in a higher yield than the parent strain microorganism in which the dicarboxylic acid excretion carrier gene has not been modified.
  • 3-hydroxyadipic acid may be abbreviated as 3HA and ⁇ -hydromuconic acid may be abbreviated as HMA.
  • 3-oxoadipyl-CoA may be abbreviated as 3OA-CoA
  • 3-hydroxyadipyl-CoA may be abbreviated as 3HA-CoA
  • 2,3-dehydroadipyl-CoA may be abbreviated as HMA-CoA.
  • an enzyme that catalyzes the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA may be described as "3-oxoadipyl-CoA reductase".
  • the yjjP and yjjB genes when the yjjP and yjjB genes form an operon in the presence of a single promoter, it may be described as yjjPB.
  • the proteins encoded by the yjjP and yjjB genes may be described as YjjP and YjjB, respectively, and their complexes may be described as YjjPB.
  • the protein encoded by the yeA gene may be described as YeeA
  • the protein encoded by the ynfM gene may be described as YnfM.
  • the microorganism of the present invention has a gene modified so that the function of the dicarboxylic acid excretion carrier is deleted or reduced.
  • Defecting or reducing the function of a dicarboxylic acid efflux carrier means deficient or reducing the dicarboxylic acid efflux activity.
  • the method for deleting or reducing the function is not particularly limited, but for example, a dicarboxylic acid excretion carrier gene or a homologous gene thereof (hereinafter, these are collectively referred to as “dicarboxylic acid excretion carrier gene”), or a promoter or terminator of the gene.
  • partial or total deletion treatment of the base sequence by site-specific mutation method, introduction of frame shift mutation into the base sequence, to the base sequence This can be done by disrupting or deleting the gene by inserting a stop codon or the like.
  • the gene can be removed by removing all or part of the base sequence of the dicarboxylic acid excretion gene or the base sequence of the promoter or terminator region of the gene, or by substituting with another base sequence. Can be destroyed or lost.
  • a method of deleting a part or the whole of the base sequence of the dicarboxylic acid excretion carrier gene is preferable.
  • the target dicarboxylic acid efflux carrier gene whose function is deleted or reduced in the present invention is, for example, NCBI (National Center for Biotechnology Information) or KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes) using the amino acid sequence of a known dicarboxylic acid efflux carrier as a query sequence. It can be easily obtained by performing a BLAST (National Center for Biotechnology Information) search on a public database such as Genemes) and referring to the gene encoding the applicable sequence. It can also be obtained by PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence of a known dicarboxylic acid excretion carrier gene as a primer and genomic DNA of another organism as a template.
  • the amino acid sequence identity between the known dicarboxylic acid efflux carrier and the homologous protein of the carrier is specifically 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more. Especially preferably, it is 95% or more.
  • sequence identity means all amino acid sequences that overlap in the optimum alignment when a gap is introduced into two amino acid sequences or base sequences or when they are aligned without introducing a gap. It means the ratio (percentage) of the same amino acid or base to (including the amino acid serving as the translation starting point) or the base sequence (including the starting codon), and is calculated by the formula (1).
  • the shorter sequence length to be compared is 100 amino acids or 300 bases or more, and if it is less than 100 amino acids or 300 bases, sequence identity is not defined. Sequence identity can be easily examined using default parameters, for example in BLAST. Sequence identity can also be examined using similar functions built into software such as Genetyx.
  • Sequence identity (%) number of matches (gaps are not counted) / shorter sequence length (length not including gaps at both ends) x 100 ... Equation (1).
  • the dicarboxylic acid efflux carrier whose function is deleted or reduced in the present invention is preferably YjjP or its homolog, YjjB or its homolog, YeA or its homolog, and / or YnfM or its homolog.
  • YjjP and YjjB are proteins presumed to be putative succinate exporters, and specifically, Escherichia coli str. K-12 substr.
  • YjjP NCBI Protein ID: NP_418784, SEQ ID NO: 2
  • YjjB NCBI Protein ID: NP_4187883, SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 6 YjjP homolog
  • SEQ ID NO: 6 from Serratia Grimesii NBRC13537 strain
  • Examples of genes encoding these proteins include Escherichia coli str. K-12 substr.
  • YjjP NCBI GeneID: 948812, SEQ ID NO: 1
  • yjjB NCBI GeneID: 948811, SEQ ID NO: 3
  • yjjP homolog SEQ ID NO: 5
  • Serratia grimesi NBRC13537 strain derived from Serratia grimesi NBRC13537 strain
  • yjjB homolog SEQ ID NO: 5
  • yjjB homolog can be mentioned.
  • sequence identity between the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 6 is calculated using the function of Genetyx (% Identity Matrix) according to the above formula (1), it is 71.1%. Further, the sequence identity between the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 and 8 is calculated to be 75.8%.
  • YjjP and YjjB are known to have a dicarboxylic acid efflux activity in the coexistence of both (Bioscii Biotechnol Biochem 2017 Sep; 81 (9): 1837-1844).
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-216881 describes that the dicarboxylic acid-producing ability of the bacterium can be improved by modifying the bacterium so that the expression of the dicarboxylic acid excretion carrier genes yjjP and yjjB is increased. Has been done.
  • the dicarboxylic acid to be produced succinic acid having 4 carbon atoms, adipic acid having 6 carbon atoms and the like are described.
  • YjjP and YjjB derived from Escherichia coli and Enterobacter aerogenes of Enterobacteriaceae actually have dicarboxylic acid excretion activity. Therefore, if a person skilled in the art lacks or reduces the dicarboxylic acid efflux activity in a microorganism capable of producing a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms, the ability of the microorganism to produce a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms will decrease. I think I expect it.
  • the production capacity of 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid which are dicarboxylic acids having 6 carbon atoms, is improved by deleting the functions of YjjP and YjjB.
  • 3-Hydroxyadipic acid and / or if the dicarboxylic acid excretion activity is deficient or reduced in a microorganism capable of producing ⁇ -hydromuconic acid contrary to the expectation of those skilled in the art, 3-hydroxyadipic acid and / or The production capacity of ⁇ -hydromuconic acid can be increased.
  • YeA is a protein presumed to be putative transporter, and specifically, Escherichia coli str. K-12 substr.
  • YeA NCBI Protein ID: NP_416512, SEQ ID NO: 91
  • derived from the MG1655 strain can be mentioned, and as a gene encoding these proteins, Escherichia coli str. K-12 substr.
  • YeA NCBI GeneID: 946545, SEQ ID NO: 90) derived from the MG1655 strain can be mentioned.
  • YnfM is a protein presumed to be a putative membrane transport protein, and specifically, Escherichia coli str. K-12 substr. YnfM (NCBI Protein ID: NP_416113, SEQ ID NO: 93) derived from the MG1655 strain can be mentioned, and as a gene encoding these proteins, Escherichia coli str. K-12 substr. YnfM (NCBI GeneID: 946138, SEQ ID NO: 92) derived from the MG1655 strain can be mentioned.
  • YeA and YnfM are known to have dicarboxylic acid efflux activity (Bioscii Biotechnol Biochem 2017 Sep; 81 (9): 1837-1844).
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-216881 describes that the dicarboxylic acid-producing ability of the bacterium can be improved by modifying the bacterium so that the expression of the dicarboxylic acid excretion carrier gene, yeA or ynfM, is increased. Has been done.
  • the dicarboxylic acid to be produced succinic acid having 4 carbon atoms, adipic acid having 6 carbon atoms and the like are described.
  • YeA and YnfM derived from Pantoea ananatis and Enterobacter aerogenes of Enterobacteriaceae actually have dicarboxylic acid excretion activity. Therefore, if a person skilled in the art lacks or reduces the dicarboxylic acid efflux activity in a microorganism capable of producing a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms, the ability of the microorganism to produce a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms will decrease. I think I expect it.
  • the production capacity of 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid which are dicarboxylic acids having 6 carbon atoms, is improved by deleting the functions of YeA and YnfM. , 3-Hydroxyadipic acid and / or if the dicarboxylic acid excretion activity is deficient or reduced in a microorganism capable of producing ⁇ -hydromuconic acid, contrary to the expectation of those skilled in the art, 3-hydroxyadipic acid and / or The production capacity of ⁇ -hydromuconic acid can be increased.
  • the YjjP homolog, the YjjB homolog, the YeA homolog, or the YnfM homolog of the subject whose function is deleted or reduced in the present invention has succinic acid excretion activity.
  • the fact that the protein has succinic acid excretion activity means that, for example, the homolog gene is introduced into Escherichia coli AFP184 strain (WO2005 / 116227) having succinic acid-producing ability, and it is verified that succinic acid productivity is improved. You can confirm by that.
  • these enzymes are encoded.
  • examples thereof include a method of introducing a gene into a host microorganism, increasing the number of copies of the gene, and modifying the promoter region and ribosome binding sequence upstream of the coding region of the gene. These methods may be performed alone or in combination.
  • the method for introducing the gene is not particularly limited, and a method for incorporating the gene into an expression vector capable of autonomous replication in the microorganism and introducing the gene into the host microorganism, a method for incorporating the gene into the genome of the microorganism, and the like can be used.
  • the gene to be introduced may be one type or multiple types.
  • gene transfer and enhancement of expression may be combined.
  • the expression vector or genome integration nucleic acid is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a gene coding region, and a transcription termination sequence. Is preferable. It may also contain a gene that controls promoter activity.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it can express an enzyme in a host microorganism, and examples thereof include a gap promoter, a trp promoter, a lac promoter, a tac promoter, and a T7 promoter.
  • the expression vector used for introducing a gene or enhancing expression in the present invention is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the microorganism, but for example, pBBR1MCS vector, pBR322 vector, pMW vector, pET vector, pRSF vector, etc.
  • Examples include the pCDF vector, the pACYC vector, and derivatives of the above vectors.
  • the method of partial homologous recombination is not particularly limited, but for example, a method using ⁇ Red recombinase and FLP recombination (Proc Natl Acad Sci USA 2000 Jun 6; 97 (12): 6640-6645.), ⁇ Red recombinase and sacB gene. (Biosci Biotechnol Biochem. 2007 Dec; 71 (12): 2905-11.) Can be mentioned.
  • the method for introducing the expression vector or the nucleic acid for genome integration is not particularly limited as long as it is a method for introducing the nucleic acid into the microorganism, and for example, the calcium ion method (Journal of Molecular Biology, 53,159 (1970)), the electroporation method ( NM Calvin, PC Hanawalt. J. Vector, 170 (1988), pp. 2996-2801) and the like can be mentioned.
  • Reaction scheme 1 shows an example of the reaction pathway required to produce 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid.
  • reaction A shows a reaction for producing 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • reaction B shows a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Reaction C shows a reaction that produces 2,3-dehydroadipyl-CoA from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • reaction D shows a reaction for producing 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • reaction E shows a reaction that produces ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • the microorganism When the microorganism has the ability to produce 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid, it has at least an enzyme that catalyzes reaction A in the biosynthetic pathway shown in reaction scheme 1 above. It is known (WO2019 / 107516, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-535203, US Patent Application Publication No. 2011/0124911A1).
  • the host microorganisms of the genetically modified microorganism include acetyl-CoA and succinyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme.
  • reaction A ability to produce enzyme A
  • reaction B ability to reduce 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA
  • reaction D ability to have the ability to generate
  • the genetically modified microorganism of the present invention has an ability to produce ⁇ -hydromuconic acid
  • the host microorganism of the genetically modified microorganism includes 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • reaction A Ability to produce A (reaction A), ability to reduce 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA (reaction B), ability to produce 2,3-dehydroadipyl from 3-hydroxyadipyl-CoA It is preferable to have the ability to produce -CoA (reaction C) and the ability to produce ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA (reaction E).
  • Microorganisms having these biosynthetic pathways lack or reduce the function of YjjP or its homologue, YjjB or its homologue, YeA or its homologue, and / or YnfM or its homologue to the host microorganism, and 3-oxoadipyl-.
  • YjjP or its homologue YjjB or its homologue
  • YeA or its homologue a genetically modified microorganism that highly produces 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid. Can be done.
  • Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Escherichia coli.
  • Serratia grimesii Serratia ficiaria, Serratia phonticola, Serratia odorifera, Serratia primutica, Serratia entomophila or Serratia genus Serratia.
  • Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • the genus Psuedomonas, such as aureofaciens.
  • Hafnia genus such as Hafnia alvei.
  • Corynebacterium such as Corynebacterium glutamicium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicenes, and Corynebacterium glutamicum.
  • Bacillus genus such as Bacillus badius, Bacillus magatorium, Bacillus roseus.
  • the genus Streptomyces such as Streptomyces vinaceus, Streptomyces karnatekensis, Streptomyces olivaceus.
  • the genus Cupriavidus such as Cupriavidus metallicidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus oxalaticus.
  • Acinetobacter genus such as Acinetobacter baylyi, Acinetobacter radioretters.
  • Alcaligenes genus such as Alcaligenes faecalis.
  • the genus Nocardioides such as Nocardioides albus.
  • Brevibacterium genus such as Brevibacterium iodinum.
  • the genus Delftia such as Delftia acidovorans.
  • the genus Simwellia such as Simwellia blattae.
  • the genus Enterobacter such as Enterobacter cloacae.
  • Rhizobium genus such as Rhizobium radiobacter.
  • Serratia grimesii Serratia ficiaria, Serratia phonticola, Serratia odorifera, Serratia primutica, Serratia entomophila or Serratia genus Serratia.
  • the microorganisms belonging to the genus Escherichia or the genus Serratia are preferably used in the present invention.
  • microorganisms that are presumed to originally have the ability to produce ⁇ -hydromucon acid include the following microorganisms.
  • Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Escherichia coli.
  • Serratia grimesii Serratia ficiaria, Serratia phonticola, Serratia odorifera, Serratia primutica, Serratia entomophila or Serratia genus Serratia.
  • Pseudomonas fluororescens Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • the genus Psuedomonas, such as aureofaciens.
  • Hafnia genus such as Hafnia alvei.
  • Bacillus genus such as Bacillus.
  • the genus Cupriavidus such as Cupriavidus metallicidurans, Cupriavidus numazuensis, Cupriavidus oxalaticus.
  • Acinetobacter genus such as Acinetobacter baylyi, Acinetobacter radioretants.
  • Alcaligenes genus such as Alcaligenes faecalis.
  • the genus Delftia such as Delftia acidovorans.
  • the genus Simwellia such as Simwellia blattae.
  • the microorganisms belonging to the genus Escherichia or the genus Serratia are preferably used in the present invention.
  • a nucleic acid encoding an enzyme that catalyzes reactions A, B, and D is appropriately combined and introduced into the microorganism. By doing so, these production abilities can be imparted, and if the ability to produce ⁇ -hydromucon acid is not originally possessed, an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, and E is encoded. These production abilities can be imparted by introducing the nucleic acids to be produced into a microorganism in an appropriate combination.
  • the microorganism that can be used as a host for obtaining the genetically modified microorganism in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of genetic modification, but the genus Escherichia, the genus Serratia, the genus Hafnia, the genus Psuedomonas, the genus Corynebacterium, and Bacillus.
  • genus Streptomyces genus Cupriavidus genus Acinetobacter spp, Alcaligenes sp., Brevibacterium spp, Delftia genus Shimwellia genus Aerobacter genus Rhizobium genus Thermobifida spp, Clostridium spp., Schizosaccharomyces spp., Kluyveromyces genus is a microorganism belonging to the genus Pichia and genus Candida
  • microorganisms belonging to the genera Escherichia, Serratia, Hafnia, Pseudomonas are more preferable, and microorganisms belonging to the genus Escherichia or Serratia are particularly preferable.
  • the enzyme that catalyzes the reaction B that reduces 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA include the polypeptides described in (a) to (c) below.
  • Polypeptide having enzymatic activity that catalyzes the reaction to be produced (c) Has 70% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, and 22. And a polypeptide having the activity of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • enzymes classified as EC1.1.1.135 as 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and enzymes classified as EC1.1.1.1157 as 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase are also 3-oxoadipyl-. It can be used as an enzyme having CoA reductase activity.
  • PaaH NCBI ProteinID: NP_745425.1 derived from Pseudomonas putida KT2440 strain, Escherichia coli str. K-12 substr.
  • PaaH derived from the MG1655 strain (NCBI ProteinID: NP_415913.1), Acinetobacter baylyi ADP1 derived from the strain of DcaH (NCBI ProteinID: CAG68533.1), Serratia plymuthica from NBRC102599 share PaaH (NCBI ProteinID: WP_063197120), derived from Serratia nematodiphila DSM21420 shares Polypeptide (NCBI Protein ID: WP_033633399.1) is also mentioned as an enzyme that catalyzes the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • the polypeptides described in (a) to (c) above are preferable.
  • amino acids in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, and 22 used in the present invention are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, and 22 used in the present invention.
  • the range of "1 or several" is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, and particularly preferably 4 or less. Most preferably, it is 1 or 2 or less.
  • conservative substitution when an amino acid is substituted, it is highly possible that the activity of the polypeptide is maintained when the amino acid is substituted with an amino acid having similar properties (so-called conservative substitution).
  • the 20 kinds of amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having a low polar side chain (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro) and neutral amino acids having a hydrophilic side chain (Asn). , Grn, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp).
  • the properties of the polypeptide do not change if they are substituted between them.
  • sequence identity is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably. Is 99% or more.
  • polypeptides set forth in SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, and 22 in (a) above are all amino acid residues 15 to 38 from the N-terminal side (hereinafter, for convenience, the N-terminal side).
  • the amino acid residue from the N-terminal may be represented by "a.a.”. Therefore, for example, the 15th to 38th amino acid residues from the N-terminal side are simply represented by "15 to 38a.a.”
  • Xaa is an arbitrary amino acid residue, but 13a. a. Is preferably phenylalanine or leucine, 15a. a.
  • Common sequence 1 corresponds to NAD + binding residue and amino acid residues around it. The NAD + binding residue is described in Biochimie. 2012 Feb; 94 (2): 471-8. As shown in, the 24th amino acid residue of the common sequence 1 is aspartic acid, but the common sequence 1 is characterized by being asparagine.
  • the polypeptides of SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 are believed to exhibit excellent enzymatic activity as 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide according to (a) to (c) of the present invention may contain a sequence such that an additional peptide or protein is added to the N-terminal and / or C-terminal of the polypeptide. ..
  • Examples of such peptides or proteins include those containing a secretory signal sequence, a transport protein, a binding protein, a tag peptide for purification, a fluorescent protein and the like.
  • those skilled in the art can select peptides or proteins having a function to be added and add them to the polypeptide of the present invention, depending on the purpose.
  • the sequence identity of the amino acid sequence does not include such peptides or proteins.
  • Nucleic acids encoding the polypeptides set forth in SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 can be translated into the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22.
  • Such a base sequence is not particularly limited, and can be determined with reference to the codon (standard genetic code) corresponding to each amino acid. At that time, the base sequence may be redesigned with codons commonly used for the host microorganism used in the present invention.
  • nucleic acids encoding the polypeptides having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, and 22 are SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, and 17, respectively. , 19 and 21.
  • whether or not the polypeptide encoded by a certain nucleic acid has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity is determined by preparing the following transformants A and B, and as a result of a culture test, a culture solution. If 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid can be confirmed in the nucleic acid, it is determined that the nucleic acid encodes a polypeptide having 3-oxoadipyl-CoA reductase activity. The determination method will be described using the biosynthetic pathway shown in the above reaction scheme 1.
  • Transformant A has an enzyme that catalyzes Reaction A, Reaction D and Reaction E.
  • Transformant B has an enzyme that catalyzes Reaction A, Reaction C, Reaction D and Reaction E.
  • transformant A is prepared.
  • a plasmid expressing an enzyme that catalyzes Reaction A, Reaction D, and Reaction E is prepared.
  • the reactions D and E can be catalyzed by the same enzyme.
  • the plasmid is introduced into the Escherichia coli BL21 (DE3) strain, which is a microbial strain incapable of producing either 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid.
  • An expression plasmid in which a nucleic acid encoding a polypeptide to be examined for enzyme activity is incorporated downstream of an appropriate promoter is introduced into the obtained transformant to obtain transformant A.
  • Transformant A is cultivated, and it is confirmed whether or not 3-hydroxyadipic acid is contained in the culture broth after culturing.
  • Transformant B is prepared.
  • Transformant B is obtained by preparing and introducing a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reaction C into transformant A.
  • Transformant B is cultivated, and it is confirmed whether or not ⁇ -hydromuconic acid is contained in the culture broth after culturing. If it can be confirmed that the culture solution after culturing contains ⁇ -hydromuconic acid, the 3-hydroxyadipic acid produced by transformant A and the ⁇ -hydromuconic acid produced by transformant B are 3-hydroxy. Since it can be seen that it was produced via adipyl-CoA, it is judged that the target polypeptide has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity.
  • the activity value of 3-oxoadipyl-CoA reductase is 3-hydroxyadipyl produced using purified 3-oxoadipyl-CoA reductase using 3-oxoadipyl-CoA prepared by an enzymatic reaction from 3-oxoadipic acid as a substrate. It can be calculated by measuring CoA.
  • the specific method is as follows.
  • 3-oxoadipic acid can be prepared by a known method (for example, the method described in Reference Example 1 of WO2017 / 099209).
  • PCR is performed using the genomic DNA of Pseudomonas putida KT2440 strain as a template, and the total length of the nucleic acids encoding CoA transferase (pcaI and pcaJ, NCBI GeneID: 1046613 and 1046612) is amplified. ..
  • the base sequences of the primers used in this PCR are, for example, SEQ ID NOs: 24 and 25.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Merck Millipore), which is an expression vector for Escherichia coli, so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution. Using the solution, prepare an enzyme reaction solution for preparing 3-oxoadipyl-CoA having the following composition, react at 25 ° C. for 3 minutes, and then use a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore). The enzyme is removed by treatment, and the obtained permeate is prepared as a 3-oxoadipyl-CoA solution.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the BamHI site of the expression vector pACYCtuet-1 for Escherichia coli (manufactured by Merck Millipore) so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution. -Oxoadipyl-CoA reductase solution is obtained.
  • the 3-oxoadipyl-CoA reductase activity can be confirmed by preparing an enzyme reaction solution having the following composition using this enzyme solution and measuring the amount of 3-hydroxyadipyl-CoA produced at 25 ° C.
  • acyltransferase ⁇ -ketothiolase
  • the acyltransferase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC 23.1.
  • Examples of the classified enzyme, acetyl-CoA C-acyltransferase include an enzyme classified into EC 2.3.1.16.
  • Escherichia coli str. K-12 substr. PaaJ NCBI ProteinID: NP_415915
  • PcaF NCBI ProteinID: NP_734536
  • Pseudomonas putida KT2440 strain and the like can be preferably used.
  • acyltransferase can produce 3-oxoadipyl-CoA using succinyl-CoA and acetyl-CoA as substrates depends on the 3-oxoadipyl-CoA production reaction by the purified acyltransferase and 3-oxoadipyl-CoA as the substrate. It can be confirmed by combining the reduction reaction with the purified 3-oxoadipyl-CoA reductase and measuring the amount of decrease in NADH associated with the reducing group of 3-oxoadipyl-CoA.
  • the specific measurement method is as follows, for example.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template to amplify the total length of the nucleic acid encoding the acyltransferase.
  • the amplified fragment is inserted into the SacI site of the expression vector pACYCDuet-1 for Escherichia coli (manufactured by Merck Millipore) so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution to carry out acylation. Obtain a transferase solution. Acyltransferase activity can be confirmed by preparing an enzyme reaction solution having the following composition using the enzyme solution and measuring a decrease in 340 nm absorption associated with oxidation of NADH at 30 ° C.
  • Whether or not the enzyme possessed by the microorganism has acyltransferase activity can be confirmed by performing the above-mentioned measurement using CFE instead of purified acyltransferase.
  • Specific measurement methods for Escherichia coli are as follows, for example.
  • EFE Escherichia coli MG1655 strain to be measured for activity was inoculated into 5 mL of a medium adjusted to pH 7 (medium composition: tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L), and 30 Shake and incubate at ° C for 18 hours.
  • Medium medium composition: tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, ferulic acid 2.5 mM, p-coumaric acid 2.5 mM, benzoic acid 2.
  • Tris-HCl buffer consisting of 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM dithiothreitol, glass beads ( ⁇ 0.1 mm) were added to the obtained suspension, and an ultrasonic crusher was used. Crush the cells at 4 ° C.
  • 0.5 mL of the supernatant obtained by centrifuging the cell disruption solution is passed through a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10K, manufactured by Merck Millipore) to remove the permeate, and then 0.4 mL of Tris-HCl buffer is added. After removing low molecular weight impurities by repeating the addition three times, the solution is resuspended in Tris-HCl buffer to make the liquid volume 0.1 mL, which is defined as CFE. Instead of the purified enzyme, 0.05 mL of the CFE is added to a total volume of 0.1 mL of the enzyme reaction solution, and the enzyme activity is confirmed.
  • enoyl-CoA hydratase As the enzyme that catalyzes the reaction C that produces 2,3-dehydroadipyl-CoA, for example, enoyl-CoA hydratase or the like can be used.
  • the enoyl-CoA hydratase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC number 4.2.1. Enoyl-CoA hydratase classified into-is preferable, and specific examples thereof include enzymes classified into EC 4.2.1.17 as enoyl-CoA hydratase or 2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase. Among these, Escherichia coli str. K-12 substr.
  • PaaF (NCBI ProteinID: NP_415911) derived from the MG1655 strain
  • PaaF (NCBI ProteinID: NP_745427) derived from the Pseudomonas putida KT2440 strain, and the like can be preferably used.
  • enoyl-CoA hydratase catalyzes the reaction produced by 2,3-dehydroadipyl-CoA using 3-hydroxyadipyl-CoA as a substrate.
  • enoyl-CoA hydratase catalyzes the reaction produced by 2,3-dehydroadipyl-CoA using 3-hydroxyadipyl-CoA as a substrate.
  • the specific measurement method is as follows, for example.
  • ⁇ -hydromucon acid is prepared by the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199858.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Pseudomonas putida KT2440 strain as a template, and the nucleic acids encoding CoA transferase (pcaI and pcaJ, NCBI GeneID: 1046613 and 1046612) were subjected to PCR. Amplify the total length.
  • the base sequences of the primers used in this PCR are, for example, SEQ ID NOs: 24 and 25.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Merck Millipore), which is an expression vector for Escherichia coli, so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution for preparing 2,3-dehydroadipyl-CoA having the following composition is prepared using the solution, and after reacting at 30 ° C. for 10 minutes, a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10 K, Merck Millipore) The enzyme is removed by treatment with (manufactured by), and the obtained permeate is prepared as a 2,3-dehydroadipyl-CoA solution.
  • Enzyme reaction solution for 2,3-dehydroadipyl-CoA preparation 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM MgCl 2 0.4 mM succinyl-CoA 2 mM ⁇ -hydromonic acid sodium salt 20 ⁇ g / mL CoA transferase.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template to amplify the total length of the nucleic acid encoding enoyl-CoA hydratase.
  • the amplified fragment is inserted into the NdeI site of the expression vector pET-16b for Escherichia coli (manufactured by Merck Millipore) so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), and the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, followed by purification using a histidine tag from the culture solution, and enoyl.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • For enoyl-CoA hydratase activity prepare an enzyme reaction solution having the following composition using the solution, react at 30 ° C. for 10 minutes, and then treat with a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10K, manufactured by Merck Millipore). This can be confirmed by removing the enzyme and detecting 3-hydroxyadipyl-CoA in the obtained permeate with a high performance liquid chromatography tandem mass analyzer (LC-MS / MS) (Agient). ..
  • Whether or not the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has enoyl-CoA hydratase activity is determined by adding 0.05 mL of CFE instead of purified enoyl-CoA hydratase to a total amount of 0.1 mL of the enzyme reaction solution. It can be confirmed by adding and performing the above-mentioned measurement. Specific examples of the method for preparing CFE for Escherichia coli are as described in the method for confirming acyltransferase activity.
  • CoA transferase or acyl-CoA hydrolase can be used, but CoA transferase is preferable.
  • CoA transferase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC number 2.8.3. CoA transferases classified into ⁇ are preferable, and specific examples thereof include enzymes classified into EC2.8.3.6 as CoA transferases or acyl-CoA transferases.
  • CoA transferase means an enzyme having catalytic activity (CoA transferase activity) of a reaction for producing carboxylic acid and succinyl-CoA using acyl-CoA and succinic acid as substrates.
  • PcaI and PcaJ (NCBI Protein ID: NP_74681 and NP_746082) derived from Pseudomonas putida KT2440 strain are preferably used as the enzyme that catalyzes the reaction D that produces 3-hydroxyadipic acid and the reaction E that produces ⁇ -hydromuconic acid. Can be done.
  • the CoA transferase activity using 3-hydroxyadipyl-CoA or 2,3-dehydroadipyl-CoA as a substrate is a reversible reaction of this enzyme reaction, so 3-hydroxyadipolic acid and succinyl-CoA, or ⁇ It can be confirmed by detecting 3-hydroxyadipyl-CoA or 2,3-dehydroadipyl-CoA produced by using purified CoA transferase using -hydromuconic acid and succinyl-CoA as substrates.
  • the specific measurement method is as follows, for example.
  • 3-Hydroxyadipic acid is prepared by the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199856.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding CoA transferase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Merck Millipore), which is an expression vector for Escherichia coli, so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution having the following composition is prepared using the solution, reacted at 30 ° C. for 10 minutes, and then treated with a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore) to remove the enzyme.
  • a UF membrane Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore
  • ⁇ -hydromucon acid is prepared by the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199858.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template to amplify the total length of the nucleic acid encoding the CoA transferase.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Merck Millipore), which is an expression vector for Escherichia coli, so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution having the following composition is prepared using the solution, reacted at 30 ° C. for 10 minutes, and then treated with a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore) to remove the enzyme. , 3,3-Dehydroadipyl-CoA in the permeate can be confirmed by detecting it with a high performance liquid chromatography tandem mass analyzer (LC-MS / MS) (Agilent).
  • LC-MS / MS high performance liquid chromatography tandem mass analyzer
  • nucleic acid When a nucleic acid encoding any of acyltransferase, 3-oxoadipyl-CoA reductase, enoyl-CoA hydratase, and CoA transferase is introduced into a host microorganism in the present invention, the nucleic acid is based on the amino acid sequence of the enzyme existing in the database. It may be artificially synthesized or separated from nature. In the case of artificial synthesis, the frequency of use of codons corresponding to each amino acid may be changed according to the host microorganism to be introduced.
  • the organism that is the source of the gene is not particularly limited. Bacillus badius, Bacillus magaterium, Bacillus genus, such as Bacillus roseus, Brevibacterium genera such as Brevibacterium iodinum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium species such as Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus numazuensis, Cupriavidus such as Cupriavidus oxalaticus spp., Delftia genus such as Delftia acidovorans, Escherichia coli, Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Hafnia genus, such as Hafnia alvei, Microbacter
  • the microorganism of the present invention lacks the function of pyruvate kinase in order to enhance the production ability of 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromucon acid.
  • Pyruvate kinase is classified as EC2.7.1.40 and is an enzyme that catalyzes the reaction of dephosphorylating phosphoenolpyruvate and converting it to pyruvate and ATP.
  • Escherichia coli str. K-12 substr. PykF NCBI Protein ID: NP_416191, SEQ ID NO: 27
  • PykA NCBI Protein ID: NP_416368, SEQ ID NO: 28
  • PykF SEQ ID NO: 30
  • the microorganism used in the present invention has two or more genes encoding pyruvate kinase, it is preferable to delete the functions of all pyruvate kinases.
  • the polypeptide encoded by the gene of the microorganism used in the present invention is pyruvate kinase may be subjected to a BLAST search on a public database such as NCBI or KEGG.
  • the microorganism of the present invention has enhanced activity of phosphoenolpyruvate carboxykinase in order to enhance the production ability of 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid.
  • Phosphoenolpyruvate carboxykinase is classified as EC4.1.1.49 and is an enzyme that catalyzes the reaction of producing oxaloacetate and ATP from phosphoenolpyruvate, carbon dioxide and ADP.
  • Phosphoenolpyruvate carboxykinase is physiologically responsible for the major reaction in the production of glucose from fatty acids in gluconeogenesis.
  • the reaction catalyzed by phosphoenolpyruvate carboxykinase is a reversible reaction, but in the production of 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid, the reaction is directed to convert phosphoenolpyruvate and carbon dioxide to oxaloacetate. Proceed to.
  • the genetically modified microorganism of the present invention is cultured in a medium containing a carbon source that can be used by ordinary microorganisms as a fermentation raw material, preferably in a liquid medium.
  • a medium containing a nitrogen source, an inorganic salt and, if necessary, an organic micronutrient such as an amino acid or a vitamin is used. As long as it contains the above nutrient source, it can be used in either a natural medium or a synthetic medium.
  • Fermentation raw material is a raw material that can be metabolized by the genetically modified microorganism.
  • “Metabolism” refers to the conversion of a chemical compound that is taken from outside the cell by a microorganism or generated from another chemical compound inside the cell into another chemical compound by an enzymatic reaction.
  • saccharides can be preferably used as the carbon source. Specific examples of saccharides include monosaccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, mannose, xylose, and arabinose, disaccharides and polysaccharides to which these monosaccharides are bound, and starch saccharified liquid containing these, sugar honey, and cellulose. Examples include the contained biomass saccharified liquid.
  • the carbon sources listed above may be used alone or in combination, but it is particularly preferable to culture in a medium containing glucose.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited and can be appropriately set according to the type of the carbon source and the like.
  • the preferred concentration of glucose is 5 to 300 g / L.
  • Examples of the nitrogen source used for culturing the genetically modified microorganism include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other auxiliary organic nitrogen sources such as oil cakes and soybean hydrolysate. Casein degradation products, other amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and their hydrolysates can be used.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 50 g / L.
  • inorganic salts used for culturing the genetically modified microorganism for example, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be appropriately added and used.
  • the culture conditions of the genetically modified microorganism for producing 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid include the medium, culture temperature, stirring rate, pH, aeration amount, inoculation amount, etc. of the component composition. It is appropriately adjusted or selected and set according to the type of modified microorganism and external conditions.
  • the pH range in the culture is not particularly limited as long as the genetically modified microorganism can grow, but is preferably pH 5 to 8, more preferably pH 5.5 to 6.8.
  • the range of aeration conditions in the culture is not particularly limited as long as 3-hydroxyadipic acid and / or ⁇ -hydromuconic acid can be produced, but in order to grow the microbial mutant well, the culture vessel is at least at the start of the culture. It is preferable that oxygen remains in the liquid phase or the gas phase inside.
  • a defoaming agent such as mineral oil, silicone oil and a surfactant can be appropriately added to the medium.
  • the produced product can be recovered.
  • the recovery for example, isolation of the produced product can be carried out according to a general method in which the culture is stopped when the accumulated amount is appropriately increased and the fermentation product is collected from the culture. .. Specifically, after separating the cells by centrifugation, filtration, etc., the product is isolated from the culture by column chromatography, ion exchange chromatography, activated charcoal treatment, crystallization, membrane separation, distillation, etc. be able to.
  • a method of adding an acid component to the salt of the product to recover the precipitate, and a concentration operation of the culture using a reverse osmosis membrane or an evaporator to remove water to remove the concentration of the product After that, the product and / or the salt crystal of the product is precipitated by cooling crystallization or adiabatic crystallization, and the salt crystal of the product and / or the product is obtained by centrifugation or filtration.
  • examples thereof include a method of obtaining the product, a method of adding alcohol to the culture to obtain the product as an ester, recovering the ester of the product by a distillation operation, and then hydrolyzing the product to obtain the product. It is not limited. In addition, these recovery methods can be appropriately selected and optimized depending on the physical characteristics of the product and the like.
  • Reference example 1 An enzyme that catalyzes the reaction that produces 3OA-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), the reaction that produces 3HA-CoA from 3OA-CoA (reaction B), and 3 from 3HA-CoA.
  • reaction A an enzyme that catalyzes the reaction that produces 3OA-CoA and succinyl-CoA
  • reaction B the reaction that produces 3HA-CoA from 3OA-CoA
  • 3 3HA-CoA.
  • Vector pBBR1MCS-2 that can autonomously replicate in Escherichia coli.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 / XhoI were ligated using "In-Fusion HD Cloning Kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant Escherichia coli strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: Pgap.
  • pBBR1MCS-2 :: Pgap was cleaved with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI.
  • a primer for PCR amplification of the entire length of the acyltransferase gene pcaF (NCBI GeneID: 1041755, SEQ ID NO: 38) using the genomic DNA of the Pseudomonas putida KT2440 strain as a template was used.
  • Designed SEQ ID NOs: 39, 40
  • PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI were ligated using "In-Fusion HD Cloning Kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: AT.
  • pBBR1MCS-2 :: AT was cleaved with HpaI to obtain pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI.
  • CoA transferase genes pcaI and pcaJ (NCBI GeneID: 1046613, 1046612; SEQ ID NOs: 41, 42) using the genomic DNA of the Pseudomonas putida KT2440 strain as a template to amplify the genes encoding the enzymes that catalyze Reactions D and E.
  • Primers for PCR amplification of contiguous sequences including the full length were designed (SEQ ID NOs: 43 and 44), and the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI were ligated using an In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • PBBR1MCS-2 ATCT was cleaved with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: ATCT / ScaI.
  • a primer for amplifying the nucleic acid of SEQ ID NO: 9 was designed using the genomic DNA of the Serratia marcescens ATCC13880 strain as a template (SEQ ID NOs: 45 and 46). , The PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: ATCT / ScaI were ligated using "In-Fusion HD Cloning Kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: ATCTL.
  • Reference example 2 3 Preparation of plasmid for expressing the enzyme that catalyzes the reaction (Reaction C) that produces HMA-CoA from HA-CoA
  • the expression vector pMW119 (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) capable of autonomous replication in Escherichia coli was cleaved with SacI and pMW119 / Obtained SacI.
  • a primer for PCR amplification of the upstream region 200b (SEQ ID NO: 35) of gapA (NCBI GeneID: NC_000913.3) was designed (SEQ ID NO: 47, 48), and the PCR reaction was carried out according to a conventional method. rice field.
  • the obtained fragment and pMW119 / SacI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant Escherichia coli strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pMW119 :: Pgap. Subsequently, pMW119 :: Pgap was cleaved with SphI to obtain pMW119 :: Pgap / SphI.
  • Example 1 Preparation of Serratia microbial variant lacking YjjPB homolog function In order to delete the YjjPB homolog function of Serratia microorganism, a Serratia microbial variant lacking the yjjPB homolog gene was prepared.
  • PCR was performed using the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 52 and 53 as primers using pKD4 containing the canamycin resistance gene used as a marker at the time of gene deletion and the FRT (FLP recognition target) sequence used for dropping the canamycin resistance gene as a template, and yjjPB.
  • a PCR fragment with a sequence length of 1.6 kb was obtained for homologue gene deletion.
  • the ⁇ -red recombinase expression plasmid, pKD46 was introduced into the Serratia grimesi NBRC13537 strain to obtain an ampicillin-resistant strain.
  • the obtained strain was inoculated into 5 mL of LB medium containing 500 ⁇ g / mL of ampicillin and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 50 mL of LB medium containing 500 ⁇ g / mL of ampicillin and 50 mM of arabinose, and cultivated in rotation at 30 ° C. for 2 hours. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 5 ⁇ L of PCR fragments, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes. After electroporation was performed using "Gene pulper" (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 2 hours. The whole amount was applied to LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and incubated at 30 ° C. for 1 day.
  • Colony direct PCR was performed using the obtained kanamycin-resistant strain, and deletion of the target gene and insertion of the kanamycin resistance gene were confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 54 and 56.
  • the kanamycin-resistant strain was inoculated into 5 mL of LB medium, and pKD46 was shed by subculturing twice at 37 ° C. to obtain an ampicillin-sensitive strain.
  • the FLP recombinase expression plasmid, pCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain to obtain an ampicillin-resistant strain again. After subculturing the obtained strain twice at 40 ° C., colony direct PCR was performed, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 55 and 56. Since the obtained strain was sensitive to ampicillin, it was confirmed that pCP20 was shed.
  • the obtained strain was designated as Sg ⁇ yjjPB.
  • Example 2 Preparation of Serratia microbial mutant in which the function of YjjPB homolog is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E is introduced. Each of the prepared plasmids was introduced to prepare a microbial variant of the genus Serratia.
  • Sg ⁇ yjjPB was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking.
  • the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pBBR1MCS-2 :: ATCTL, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • Example 3 Production test of 3-hydroxyadipic acid using a Serratia microbial variant introduced with a plasmid expressing an enzyme that lacks the function of YjjPB homolog and catalyzes reactions A, B, D and E.
  • a production test of 3-hydroxyadipic acid was carried out using a microbial variant of the genus Serratia.
  • HPLC Quantitative analysis of organic acids by HPLC ⁇
  • HPLC LC-10A (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • Mobile phase 5 mM p-toluenesulfonic acid reaction solution: 5 mM p-toluenesulfonic acid, 0.1 mM EDTA, 20 mM Bis-Tris
  • Flow velocity 0.8 mL / min
  • HPLC Quantitative analysis of sugars and alcohols by HPLC ⁇
  • HPLC Shimadzu Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • Comparative Example 1 Production test of 3-hydroxyadipic acid using a Serratia microbial variant introduced with a plasmid that does not lack the function of YjjPB and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E.
  • the mutant prepared in Reference Example 3 was cultured in the same manner.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 1 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the results.
  • Example 4 Preparation of Escherichia microbial variant lacking YjjPB function In order to delete the YjjPB function of Escherichia microorganism, an Escherichia microbial variant lacking the yjjPB gene was prepared.
  • PCR was performed using pKD4 as a template and oligo DNAs of SEQ ID NOs: 57 and 58 as primers to obtain a PCR fragment having a sequence length of 1.6 kb for yjjPB deficiency.
  • the FRT recombinase expression plasmid, pKD46 was used in Escherichia coli str. K-12 substr. It was introduced into the MG1655 strain to obtain an ampicillin-resistant strain. The obtained strain was inoculated into 5 mL of LB medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 50 mL of LB medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin and 50 mM of arabinose, and cultivated in rotation at 37 ° C. for 2 hours. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol. The washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 5 ⁇ L of PCR fragments, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • the kanamycin-resistant strain was inoculated into 5 mL of LB medium, and pKD46 was shed by subculturing twice at 40 ° C. to obtain an ampicillin-sensitive strain.
  • PCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain, and an ampicillin-resistant strain was obtained again.
  • colony direct PCR was performed, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 59 and 60. Since the obtained strain was sensitive to ampicillin, it was confirmed that pCP20 was shed.
  • the obtained strain was designated as Ec ⁇ yjjPB.
  • Example 5 Preparation of Escherichia microbial mutant in which the function of YjjPB is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E is introduced. Each of these plasmids was introduced to prepare a microbial variant of the genus Escherichia.
  • Ec ⁇ yjjPB was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 day. 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured at 37 ° C. for 2 hours with shaking. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol. The washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pBBR1MCS-2 :: ATCTL, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • Example 6 Production test of 3-hydroxyadipic acid using a microbial variant of the genus Escherichia in which the function of YjjPB is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E is introduced. The same method as in Example 3. In, the mutant prepared in Example 5 was cultured. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 2 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Comparative Example 2 Production test of 3-hydroxyadipic acid using a microbial variant of the genus Escherichia into which a plasmid that does not lack the function of YjjPB and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E is introduced.
  • the mutant prepared in Reference Example 4 was cultured in the same manner.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 2 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Example 7 Preparation of Serratia microbial mutant prepared in Example 2 in which the function of YjjPB homolog is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E is introduced. Then, the plasmid pMW119 :: EH prepared in Reference Example 2 was introduced to prepare a microbial variant of the genus Serratia.
  • Sg ⁇ yjjPB / 3HA was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pMW119 :: EH, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes. After electroporation was performed using "Gene pulper" (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 1 hour. 50 ⁇ L was applied to LB agar medium containing 500 ⁇ g / mL of ampicillin and 25 ⁇ g / mL of kanamycin and incubated at 30 ° C. for 1 day. The obtained strain was designated as Sg ⁇ yjjPB / HMA.
  • Example 8 Production of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using Serratia microbial variants introduced with plasmids that lack the function of the YjjPB homolog and express enzymes that catalyze reactions A, B, C, D and E. Test The mutant prepared in Example 7 was cultured in the same manner as in Example 3 except that a medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and 500 ⁇ g / mL of ampicillin was used. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Comparative Example 3 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromucon using a Serratia microbial variant introduced with a plasmid that does not lack the function of the YjjPB homolog and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E.
  • Acid production test The mutant prepared in Reference Example 5 was cultured in the same manner as in Example 8. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 3 shows the yields of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Example 9 Preparation of Escherichia microbial mutant prepared in Example 5 in which the function of YjjPB is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E is introduced.
  • the plasmid pMW119 :: EH prepared in Reference Example 2 was introduced to prepare a variant of the genus Escherichia.
  • Ec ⁇ yjjPB / 3HA was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pMW119 :: EH, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes. After electroporation was performed using "Gene pulper" (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. 50 ⁇ L was applied to LB agar medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin and 25 ⁇ g / mL of kanamycin and incubated at 37 ° C. for 1 day. The obtained strain was designated as Ec ⁇ yjjPB / HMA.
  • Example 10 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using Escherichia microbial mutants in which the function of YjjPB is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E is introduced.
  • the mutant prepared in Example 9 was cultured in the same manner as in Example 6 except that a medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and 100 ⁇ g / mL of ampicillin was used.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Comparative Example 4 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a microbial variant of the genus Escherichia into which a plasmid that does not lack the function of YjjPB and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E has been introduced.
  • Production test The mutant prepared in Reference Example 6 was cultured in the same manner as in Example 10. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 4 shows the yields of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Example 11 Preparation of Serratia microbial mutants in which the YjjPB homolog and pyruvate kinase function is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E is introduced.
  • a microbial variant of the genus Serratia was prepared by deleting the genes pykF and pykA, which are deficient in the function of pyruvate kinase.
  • Preparation of pykF-deficient Serratia microbial variant Sg ⁇ yjjPB was used as a target for pykF deficiency, and oligo DNAs of SEQ ID NOs: 61 and 62 were used as primers for obtaining a PCR fragment for pykF (SEQ ID NO: 29) deficiency.
  • Sequence to colony direct PCR to confirm pykF deficiency and insertion of canamycin resistance gene use of oligo DNA of SEQ ID NOs: 54 and 64 for colony direct PCR, and confirmation of omission of canamycin resistance gene.
  • Gene recombination was carried out in the same manner as in Example 1 except that the oligo DNAs of Nos. 63 and 64 were used.
  • the obtained strains were designated as Sg ⁇ yjjPB and pykF.
  • Gene recombination was carried out in the same manner as in Example 1 except that the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 68 and 69 were used.
  • the obtained strains were designated as Sg ⁇ yjjPB and pykFA.
  • Reference example 7 Preparation of Serratia microbial mutants in which the YjjPB homolog function is not deficient, the pyruvate kinase function is deficient, and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E is introduced. Genetic recombination was carried out in the same manner as in Example 11 except that Serratia plasmid NBRC13537 was used as a target for deficiency of pyratia and pyratia. The obtained strain was designated as Sg ⁇ pykFA / HMA.
  • Example 12 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ - using Serratia microbial variants that lacked the function of YjjPB homologues and pyruvate kinases and were introduced with plasmids expressing enzymes that catalyze reactions A, B, C, D and E.
  • Hydromuconic acid production test The mutant prepared in Example 11 was cultured in the same manner as in Example 8. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 5 shows the yields of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Example 13 Preparation of Escherichia genus microbial variant lacking YjjPB and pyruvate kinase function
  • Escherichia microbial variant lacking pyruvate kinase function by deleting pykF and pykA, which are genes encoding pyruvate kinase of Escherichia genus microorganism was produced.
  • Reference example 8 Preparation of Escherichia microbial mutants in which the function of YjjPB is not deficient, the function of pyruvate kinase is deficient, and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E is introduced.
  • Example 14 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromucon using Escherichia microbial variants that lack the function of YjjPB and pyruvate kinase and have been introduced with a plasmid that expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E.
  • Acid production test The mutant prepared in Example 13 was cultured in the same manner as in Example 10. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 6 shows the yields of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Comparative Example 6 A microbial variant of the genus Escherichia was used in which the function of YjjPB was not deleted, the function of pyruvate kinase was deleted, and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E was introduced.
  • -Hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid production test The mutant prepared in Reference Example 8 was cultured in the same manner as in Example 14. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 6 shows the yields of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Reference example 9 Preparation of plasmid for enhancing the function of YjjPB
  • An expression vector pCDF-1b (manufactured by Merck Millipore) capable of autonomous replication in Escherichia coli was cleaved with HindIII and XbaI to obtain pCDF-1b / HindIII and XbaI.
  • pCDF-1b manufactured by Merck Millipore
  • yjjP, yjjB and their promoter regions Escherichia coli str. K-12 substr.
  • Primers for PCR amplification of yjjP, yjjB and its promoter region were designed using the genomic DNA of MG1655 strain as a template (SEQ ID NOs: 80 and 81), and the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • the obtained fragments and pCDF-1b / HindIII, XbaI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant Escherichia coli strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pCDF :: yjjPB.
  • Reference example 10 Preparation of Escherichia microbial variant prepared by introducing a plasmid that enhances the function of YjjPB and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E.
  • the plasmid pCDF :: yjjPB prepared in Reference Example 9 or pCDF-1b as a control was introduced to prepare a variant of the genus Escherichia.
  • Ec / HMA was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and 100 ⁇ g / mL of ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and 100 ⁇ g / mL of ampicillin, and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pCDF :: yjjPB or pCDF-1b, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes. After electroporation was performed using "Gene pulper" (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour.
  • "Gene pulper" manufactured by Bio-rad
  • Reference example 11 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using Escherichia microbial mutant introduced with a plasmid that enhances the function of YjjPB and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D and E.
  • the mutant prepared in Reference Example 10 was cultured in the same manner as in Example 10 except that a medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin, 100 ⁇ g / mL of ampicillin and 50 ⁇ g / mL of streptomycin was used.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 7 shows the yields of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Example 15 Preparation of Escherichia microbial variant lacking the function of YeA In order to delete the function of YeA of the Escherichia microorganism, a microbial variant of the genus Escherichia lacking the yeA gene was prepared.
  • the oligo DNAs of SEQ ID NOs: 82 and 83 were used as primers used for amplification of the canamycin resistance gene and FRT sequence using pKD4 as a template, and the primers of SEQ ID NOs: 54 and 85 were used for confirming the introduction of the canamycin resistance gene.
  • the same method as in Example 4 was carried out except that oligo DNA was used and oligo DNA of SEQ ID NOs: 84 and 85 was used as a primer used for confirming the loss of the canamycin resistance gene.
  • the obtained strain was designated as Ec ⁇ yeeA.
  • Example 16 Preparation of Escherichia microbial mutant in which the function of YeA was deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E was introduced.
  • the plasmid prepared in Reference Example 1 was introduced into Ec ⁇ yeAA to prepare a microbial variant of the genus Escherichia.
  • the obtained strain was designated as Ec ⁇ yeA / 3HA.
  • Example 17 Production test of 3-hydroxyadipic acid using a microbial variant of the genus Escherichia, which lacks the function of YeA and introduces a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E. The same method as in Example 6. In, the mutant prepared in Example 16 was cultured. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 8 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.
  • Example 18 Preparation of Escherichia microbial variant lacking YnfM function In order to delete the YnfM function of Escherichia microorganism, an Escherichia microbial variant lacking the YnfM gene was prepared.
  • oligo DNAs of SEQ ID NOs: 86 and 87 were used as primers used for amplification of the canamycin resistance gene and FRT sequence using pKD4 as a template, and SEQ ID NOs: 54 and 89 were used as primers for confirming the introduction of the canamycin resistance gene.
  • the same method as in Example 4 was carried out except that oligo DNA was used and oligo DNAs of SEQ ID NOs: 88 and 89 were used as primers used for confirming the loss of the canamycin resistance gene.
  • the obtained strain was designated as Ec ⁇ ynfM.
  • Example 19 Preparation of Escherichia microbial mutant in which the function of YnfM is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E is introduced.
  • the plasmid prepared in Reference Example 1 was introduced into Ec ⁇ ynfM to prepare a microbial variant of the genus Escherichia.
  • the obtained strain was designated as Ec ⁇ ynfM / 3HA.
  • Example 20 Production test of 3-hydroxyadipic acid using a microbial variant of the genus Escherichia, which lacks the function of YnfM and is introduced with a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, D and E. The same method as in Example 6. In, the mutant prepared in Example 19 was cultured. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Table 9 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and succinic acid calculated using the formula (2) based on the values.

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Abstract

３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を高い収率で生産することが可能な遺伝子改変微生物及び当該遺伝子改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法が開示されている。遺伝子改変微生物は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有し、かつ、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の活性が強化された遺伝子改変微生物であり、さらにジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させたものである。

Description

３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
　本発明は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を高生産する遺伝子改変微生物、および当該遺伝子改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法に関する。
　３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）およびα－ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）－ｈｅｘ－２－ｅｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化した化合物もポリアミドの原料として用いることができる。
　微生物を利用した炭素数６のジカルボン酸の製造に関連する文献として、特許文献１には、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応を触媒する優れた活性を示すポリペプチドを用いた３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造方法が記載されており、これら物質の生合成経路として、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する酵素反応を経由するとの記載がある。また、特許文献１において改変する遺伝子はいずれも細胞内における前記生合成経路上の反応に限られ、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の細胞外への輸送についての記載はない。
　また、特許文献２には、ジカルボン酸排出担体遺伝子ｙｊｊＰ、ｙｊｊＢ、ｙｅｅＡおよびｙｎｆＭの発現量を増大させた細菌を用いたジカルボン酸の製造方法が記載されており、炭素数４のジカルボン酸としてコハク酸、炭素数６のジカルボン酸としてアジピン酸が例示されている。
ＥＰ　３７１９１２１　Ａ１ 特開２０１７－２１６８８１号公報
　本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子を導入、または当該遺伝子の発現を増強して当該酵素活性を強化した遺伝子改変微生物を基に、さらにジカルボン酸排出担体を改変することで、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を高い収率で製造するための遺伝子改変微生物、および当該改変微生物を用いた物質製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は上記目的を達成するため鋭意検討した結果、従来技術からの予想に反して、ジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させた遺伝子改変微生物が３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の優れた生産能を持つことを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有し、かつ、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の活性が強化された遺伝子改変微生物であって、ジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させた、遺伝子改変微生物。
（２）前記ジカルボン酸排出担体の機能の欠損または低下が、ＹｊｊＰもしくはそのホモログおよび／またはＹｊｊＢもしくはそのホモログの機能の欠損または低下により引き起こされる、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（３）ｙｊｊＰ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子および／またはｙｊｊＢ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子が破壊または欠損された（２）記載の遺伝子改変微生物。
（４）前記ジカルボン酸排出担体の機能の欠損または低下が、ＹｅｅＡもしくはそのホモログおよび／またはＹｎｆＭもしくはそのホモログの機能の欠損または低下により引き起こされる、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（５）ｙｅｅＡ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子および／またはｙｎｆＭ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子が破壊または欠損された、（４）に記載の遺伝子改変微生物。
（６）前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物である、（１）～（５）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（７）３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子が導入された、（１）～（６）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（８）（１）～（７）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法。
　前記遺伝子改変微生物は、ジカルボン酸排出担体遺伝子を改変していない親株の微生物と比較して、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を高い収率で生産することができる。
　以下、本明細書では３－ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、α－ヒドロムコン酸をＨＭＡと略すことがある。また、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３ＯＡ－ＣｏＡ、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを３ＨＡ－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡをＨＭＡ－ＣｏＡと略すことがある。また、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素を「３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ」と記載する場合がある。また、単一プロモーターの存在下でｙｊｊＰおよびｙｊｊＢ遺伝子がオペロンを形成している場合、ｙｊｊＰＢと記載することがある。また、ｙｊｊＰおよびｙｊｊＢ遺伝子がコードするタンパク質をそれぞれＹｊｊＰおよびＹｊｊＢと記載し、それらの複合体をＹｊｊＰＢと記載することがある。また、ｙｅｅＡ遺伝子がコードするタンパク質をＹｅｅＡ、ｙｎｆＭ遺伝子がコードするタンパク質をＹｎｆＭと記載することがある。
　本発明の微生物は、ジカルボン酸排出担体の機能が欠損または低下するように遺伝子を改変されている。ジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させるとは、ジカルボン酸排出活性を欠損または低下させることである。機能を欠損または低下させる方法は特に限定されないが、例えば、ジカルボン酸排出担体遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子（以下、これらを総称して「ジカルボン酸排出担体遺伝子」という。）、あるいは当該遺伝子のプロモーターもしくはターミネーター領域の塩基配列への、遺伝子変異剤、紫外線照射などによる遺伝子変異処理、部位特異的変異法等による塩基配列の一部や全部の欠損処理、塩基配列へのフレームシフト変異の導入、塩基配列へのストップコドンの挿入等により遺伝子を破壊または欠損させることにより行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いて、ジカルボン酸排出遺伝子の塩基配列あるいは当該遺伝子のプロモーターもしくはターミネーター領域の塩基配列の全部又は一部を除去したり、他の塩基配列と置換したりすることでも遺伝子の破壊または欠損を行うことができる。これらの中で好ましくはジカルボン酸排出担体遺伝子の塩基配列の一部もしくは全体を欠損させる方法が好ましい。
　本発明で機能を欠損または低下させる対象のジカルボン酸排出担体遺伝子は、例えば、公知のジカルボン酸排出担体のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などにおける公開データベース上でＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）検索を行い、当てはまる配列をコードする遺伝子を参照することで容易に取得できる。また、公知のジカルボン酸排出担体遺伝子の塩基配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の生物のゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲによっても取得できる。
　公知のジカルボン酸排出担体と、当該担体のホモログのタンパク質とのアミノ酸配列同一性は、具体的には５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
　なお、本発明で「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。式（１）において、比較する短い方の配列長は１００アミノ酸または３００塩基以上であり、１００アミノ酸または３００塩基未満の場合には配列同一性は定義されない。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴにおいてデフォルトのパラメーターを用いて容易に調べることができる。また、配列同一性はＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウェアに搭載されている同様の機能を用いても調べることができる。
　配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士はカウントしない）／短い方の配列長（両端のギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）。
　本発明で機能を欠損または低下させる対象のジカルボン酸排出担体は、ＹｊｊＰもしくはそのホモログ、ＹｊｊＢもしくはそのホモログ、ＹｅｅＡもしくはそのホモログ、および／またはＹｎｆＭもしくはそのホモログが好ましい。
　ＹｊｊＰおよびＹｊｊＢはｐｕｔａｔｉｖｅ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ｅｘｐｏｒｔｅｒと推定されるタンパク質であり、具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＹｊｊＰ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１８７８４、配列番号２）およびＹｊｊＢ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１８７８３、配列番号４）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のＹｊｊＰホモログ（配列番号６）、ＹｊｊＢホモログ（配列番号８）が挙げられ、これらタンパク質をコードする遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｙｊｊＰ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４８８１２、配列番号１）およびｙｊｊＢ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４８８１１、配列番号３）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のｙｊｊＰホモログ（配列番号５）、ｙｊｊＢホモログ（配列番号７）が挙げられる。なお、前記式（１）に従い、Ｇｅｎｅｔｙｘの機能（％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　Ｍａｔｒｉｘ）を用いて配列番号２および６のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、７１．１％となる。また、配列番号４および８のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、７５．８％となる。
　ＹｊｊＰおよびＹｊｊＢは、両者の共存下においてジカルボン酸排出活性を有することが知られている（Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２０１７　Ｓｅｐ；８１（９）：１８３７－１８４４）。特に、特開２０１７－２１６８８１号公報では、ジカルボン酸排出担体遺伝子であるｙｊｊＰおよびｙｊｊＢの発現が増大するように細菌を改変することにより、当該細菌のジカルボン酸生産能を向上させることができると記載されている。また、生産するジカルボン酸として、炭素数４のコハク酸、炭素数６のアジピン酸等が記載されている。さらに、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のＹｊｊＰおよびＹｊｊＢが実際にジカルボン酸排出活性を有することが記載されている。従って、当業者であれば、炭素数６のジカルボン酸を製造する能力を有する微生物においてジカルボン酸排出活性を欠損または低下させた場合は、当該微生物の炭素数６のジカルボン酸の生産能は低下すると予想すると考える。しかしながら、本願明細書の実施例で示されるとおりＹｊｊＰおよびＹｊｊＢの機能を欠損させることにより炭素数６のジカルボン酸である３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産能が向上しており、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物においてジカルボン酸排出活性を欠損または低下させた場合は、当業者の予想に反して、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産能を高めることができる。
　ＹｅｅＡはｐｕｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒと推定されるタンパク質であり、具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＹｅｅＡ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６５１２、配列番号９１）が挙げられ、これらタンパク質をコードする遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｙｅｅＡ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４６５４５、配列番号９０）が挙げられる。
　ＹｎｆＭはｐｕｔａｔｉｖｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｐｒｏｔｅｉｎと推定されるタンパク質であり、具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＹｎｆＭ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６１１３、配列番号９３）が挙げられ、これらタンパク質をコードする遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｙｎｆＭ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４６１３８、配列番号９２）が挙げられる。
　ＹｅｅＡおよびＹｎｆＭは、ジカルボン酸排出活性を有することが知られている（Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２０１７　Ｓｅｐ；８１（９）：１８３７－１８４４）。特に、特開２０１７－２１６８８１号公報では、ジカルボン酸排出担体遺伝子であるｙｅｅＡまたはｙｎｆＭの発現が増大するように細菌を改変することにより、当該細菌のジカルボン酸生産能を向上させることができると記載されている。また、生産するジカルボン酸として、炭素数４のコハク酸、炭素数６のアジピン酸等が記載されている。さらに、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）であるＰａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のＹｅｅＡおよびＹｎｆＭが実際にジカルボン酸排出活性を有することが記載されている。従って、当業者であれば、炭素数６のジカルボン酸を製造する能力を有する微生物においてジカルボン酸排出活性を欠損または低下させた場合は、当該微生物の炭素数６のジカルボン酸の生産能は低下すると予想すると考える。しかしながら、本願明細書の実施例で示されるとおりＹｅｅＡおよびＹｎｆＭの機能を欠損させることにより炭素数６のジカルボン酸である３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産能が向上しており、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物においてジカルボン酸排出活性を欠損または低下させた場合は、当業者の予想に反して、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産能を高めることができる。
　本発明で機能を欠損または低下させる対象のＹｊｊＰのホモログ、ＹｊｊＢのホモログ、ＹｅｅＡのホモログ、またはＹｎｆＭのホモログは、コハク酸の排出活性を有することが好ましい。上記タンパク質がコハク酸排出活性を有することは、例えば、上記ホモログ遺伝子を、コハク酸生産能を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＦＰ１８４株（ＷＯ２００５／１１６２２７号）に導入し、コハク酸生産性が向上することを検証することで確かめることができる。
　本発明で３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素（３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ）の活性を強化する方法としては、これらの酵素をコードする遺伝子を宿主微生物へと導入したり、当該遺伝子のコピー数を増加させたり、当該遺伝子のコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変させたりする方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。遺伝子を導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該遺伝子を組み込み宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該遺伝子を組み込む方法などを用いることができる。
　導入する遺伝子は１種類でも複数種類でもよい。また遺伝子の導入と発現の増強を組み合わせてもよい。
　本発明で発現させる酵素をコードする遺伝子を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸は、プロモーター、リボソーム結合配列、遺伝子のコーディング領域、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で酵素を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。
　本発明で遺伝子の導入や発現の増強を行う際に用いる発現ベクターは、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。
　本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて遺伝子の導入や発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入することができる。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ　Ｒｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅおよびＦＬＰ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを用いる方法（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；９７（１２）：６６４０-６６４５．）、λ　Ｒｅｄ　レコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７　Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５－１１．）が挙げられる。
　発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９　（１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０　（１９８８），ｐｐ．２７９６-２８０１）などが挙げられる。
　下記反応スキーム１は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するために必要な反応経路の例を示している。ここで、反応Ａは、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応を示す。反応Ｂは、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｄは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｅは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　微生物が、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有している場合、上記反応スキーム１に示す生合成経路のうち、少なくとも反応Ａを触媒する酵素を有していることが知られている（ＷＯ２０１９／１０７５１６号、特表２０１３－５３５２０３号公報、米国特許出願公開第２０１１／０１２４９１１Ａ１号明細書）。
　３－オキソアジピルＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸を生成する反応については、反応スキーム１に示す生合成経路を有していることが好ましい。つまり、本発明の遺伝子改変微生物が、３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を有している場合、遺伝子改変微生物の宿主微生物としては、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｂ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｄ）する能力を有していることが好ましい。また、本発明の遺伝子改変微生物が、α－ヒドロムコン酸を製造する能力を有している場合、遺伝子改変微生物の宿主微生物としては、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｂ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成（反応Ｅ）する能力を有していることが好ましい。
　これらの生合成経路を有する微生物を宿主微生物に対して、ＹｊｊＰもしくはそのホモログ、ＹｊｊＢもしくはそのホモログ、ＹｅｅＡもしくはそのホモログ、および／またはＹｎｆＭもしくはそのホモログの機能を欠損または低下させ、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の活性を強化すれば、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を高生産する遺伝子改変微生物を取得することができる。
　３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を元来有する微生物としては、以下の微生物が挙げられる。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
　Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属。
　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
　Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属。
　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
　Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
　Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属。Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　前記３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を元来有する微生物の中でも、本発明ではＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物が好ましく利用される。
　α－ヒドロムコン酸を製造する能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の微生物が挙げられる。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
　Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
　Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
　Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
　前記α－ヒドロムコン酸を製造する能力を元来有する微生物の中でも、本発明では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物が好ましく利用される。
　本発明の遺伝子改変微生物が、３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｂ、Ｄを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの製造能を付与することができ、また、α－ヒドロムコン酸を製造する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
　本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、遺伝子改変が可能な微生物であれば特に制限はないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物が特に好ましい。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｂを触媒する酵素の具体例としては、以下（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド
　さらに、３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．１．１．３５に分類される酵素、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．１．１．１５７に分類される酵素も、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素として用いることができる。具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２５．１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１３．１）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３３．１）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＷＰ＿０６３１９７１２０）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株由来のポリペプチド（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＷＰ＿０３３６３３３９９．１）も３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素として挙げられる。これらの中でも、上記（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドが好ましい。
　本発明で用いる、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドついて、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個又は２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（いわゆる保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。すなわち、アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多いので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。
　本発明で用いる、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドについて、配列同一性の好ましい範囲は、８０％以上が好ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　前記（ａ）の配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２に記載のポリペプチドは、いずれもＮ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目（以下、便宜的にＮ末端側から何番目のアミノ酸残基を、「ａ．ａ．」で表すことがある。したがって、例えば、Ｎ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目は、単に「１５～３８ａ．ａ．」と表すことがある。）において配列番号２３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。共通配列１において、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であるが、１３ａ．ａ．は好ましくはフェニルアラニンまたはロイシンであり、１５ａ．ａ．は好ましくはロイシンまたはグルタミンであり、１６ａ．ａ．は好ましくはリシンまたはアスパラギンであり、１７ａ．ａ．はグリシンまたはセリン、より好ましくはグリシンであり、１９ａ．ａ．は好ましくはプロリンまたはアルギニンであり、２１ａ．ａ．は好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである。共通配列１は、ＮＡＤ＋結合残基およびその周辺のアミノ酸残基にあたる。ＮＡＤ＋結合残基は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．２０１２　Ｆｅｂ；９４（２）：４７１－８．で示されているように、共通配列１の２４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるが、共通配列１ではアスパラギンである点が特徴である。共通配列１を有することによって、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２に記載のポリペプチドは、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼとしての優れた酵素活性を示すと考える。
　前記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドについても、１～２００ａ．ａ．以内に配列番号２３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有していることが好ましい。より好ましい共通配列の位置は、１～１５０ａ．ａ．以内であり、さらに好ましくは、１～１００ａ．ａ．以内である。
　本発明の（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸は、当該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にさらなるペプチド又はタンパク質が付加されるような配列を含んでいてもよい。このようなペプチド又はタンパク質としては、例えば、分泌シグナル配列、輸送タンパク質、結合タンパク質、精製用のタグペプチド、蛍光タンパク質等を含むものが例示できる。こうしたペプチド又はタンパク質に関しては、当業者が目的に応じて、付加する機能を有するペプチド又はタンパク質を選択して、本発明のポリペプチドに付加することができる。なお、アミノ酸配列の配列同一性には、このようなペプチド又はタンパク質は含まれない。
　配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２に記載のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２に記載のアミノ酸配列に翻訳されうるような塩基配列であれば特に限定されず、各アミノ酸に対応するコドン（標準遺伝暗号）を参考に決定することができる。その際、本発明に使用する宿主微生物にとってよく使用されているコドンで塩基配列を再設計してもよい。
　配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の具体例としては、それぞれ、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１に記載の塩基配列が挙げられる。
　本発明において、ある核酸がコードするポリペプチドが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、以下の形質転換株Ａと形質転換株Ｂを作製し、培養試験の結果、培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸を確認することができれば、当該核酸が３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードしていると判断する。判断方法を上記反応スキーム１に示す生合成経路を用いて説明する。
　形質転換株Ａは、反応Ａ，反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素を有する。形質転換株Ｂは、反応Ａ、反応Ｃ、反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素を有する。
　まず、形質転換株Ａを作製する。反応Ａ、反応Ｄおよび反応Ｅをそれぞれ触媒する酵素を発現するプラスミドを作製する。なお、反応ＤとＥは同一の酵素で反応を触媒することが可能である。当該プラスミドを、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸のいずれも生産する能力のない微生物株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入する。得られた形質転換株に対し、酵素活性の有無を調べる対象となるポリペプチドをコードする核酸を適当なプロモーターの下流に組み込んだ発現プラスミドを導入し、形質転換株Ａを得る。形質転換株Ａを培養し、培養後の培養液に３－ヒドロキシアジピン酸が含まれているかどうかを確認する。３－ヒドロキシアジピン酸が培養液中に確認できた場合、次に形質転換株Ｂを作製する。形質転換株Ｂは、形質転換株Ａに対し、反応Ｃを触媒する酵素を発現するプラスミドを作製して導入することで得る。形質転換株Ｂを培養し、培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれているかどうかを確認する。培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれることを確認することができれば、形質転換株Ａが生産した３－ヒドロキシアジピン酸および形質転換株Ｂが生産したα－ヒドロムコン酸は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成されたことがわかるため、対象となるポリペプチドが３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有していると判断する。
　上記における具体的な方法としては、例えば、ＷＯ２０１９／１０７５１６号に記載された方法を用いることができる。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性の値は、３－オキソアジピン酸から酵素反応で調製した３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質として、精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを測定することで算出できる。具体的な方法は、以下の通りである。
　３－オキソアジピン酸は公知の方法（例えば、ＷＯ２０１７／０９９２０９号の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号２４および２５である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液とする。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
５ｍＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２μＭ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＢａｍＨＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃における３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡの生成量を測定することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
１５０μＬ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
　続いて、反応Ａ、Ｃ～Ｅを触媒する酵素の具体例を示す。３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ａを触媒する酵素は、例えば、アシルトランスフェラーゼ（β－ケトチオラーゼ）などを用いることができる。アシルトランスフェラーゼとしてはＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ２．３．１．－に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体的には３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼとしてＥＣ２．３．１．１７４に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡ　Ｃ－アセチルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．９に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡ　Ｃ－アシルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．１６に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＪ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４３５３６）などを好ましく用いることができる。
　上記のアシルトランスフェラーゼが、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを基質として、３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成できるかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼによる３－オキソアジピル－ＣｏＡ生成反応と、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼによる還元反応を組み合わせ、３－オキソアジピル－ＣｏＡの還基に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　アシルトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い、対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＳａｃＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、アシルトランスフェラーゼ溶液を得る。アシルトランスフェラーゼ活性は、当該酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭ　ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μｇ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
５μｇ／ｍＬ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　微生物が有する酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼの代わりにＣＦＥを用いて上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象とした具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　ＣＦＥの調製：ｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに活性測定の対象となる大腸菌ＭＧ１６５５株を一白金耳植菌し、３０℃で１８時間振とう培養する。得られた培養液をｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、フェルラ酸２．５ｍＭ、ｐ－クマル酸２．５ｍＭ、安息香酸２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、３ＯＡ２．５ｍＭ、３－ヒドロキシアジピン酸２．５ｍＭ、α－ヒドロムコン酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルエチルアミン２．５ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養する。
　得られた培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄後の菌体をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭからなるＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁し、得られた懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、超音波破砕機を用い４℃で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心して得られる上清のうち０．５ｍＬをＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通し、透過液を除去したのちＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー０．４ｍＬを添加することを３回繰り返すことで低分子量の夾雑物を除去した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーで再懸濁して液量を０．１ｍＬとしたものをＣＦＥとする。精製酵素の代わりに当該ＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加し、酵素活性の確認を行う。
　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｃを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡヒドラターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号４．２．１．－に分類されるエノイル－ＣｏＡヒドラターゼが好ましく、具体的にはエノイル－ＣｏＡヒドラターゼまたは２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡヒドラターゼとしてＥＣ４．２．１．１７に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２７）などを好ましく用いることができる。
　エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが触媒する反応は一般的に可逆反応であることから、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを基質として２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが生成する反応を触媒する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　α－ヒドロムコン酸の調製：α－ヒドロムコン酸はＷＯ２０１６／１９９８５８号の参考例１に記載された方法により調製する。
　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号２４および２５である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液とする。
２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性の確認：常法に従い、対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＮｄｅIサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡ　ヒドラターゼ活性は、当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ　２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ　ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｄ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｅを触媒する酵素は、例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼあるいはアシル－ＣｏＡヒドロラーゼなどを用いることができるが、ＣｏＡトランスフェラーゼが好ましい。
　ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号２．８．３．－に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼが好ましく、具体的にはＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡトランスフェラーゼとしてＥＣ２．８．３．６に分類される酵素などが挙げられる。
　本発明において、「ＣｏＡトランスフェラーゼ」とは、アシル－ＣｏＡおよびコハク酸を基質としてカルボン酸およびスクシニル－ＣｏＡを生成する反応の触媒活性（ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有する酵素を意味する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｄ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｅを触媒する酵素には、中でもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８１およびＮＰ＿７４６０８２）等を好ましく用いることができる。
　３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、または２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質とするＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、本酵素反応が可逆反応であることから、３－ヒドロキシアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、またはα－ヒドロムコン酸およびスクシニル－ＣｏＡを基質として、精製ＣｏＡトランスフェラーゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、または２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　３－ヒドロキシアジピン酸の調製：３－ヒドロキシアジピン酸はＷＯ２０１６／１９９８５６号の参考例１に記載された方法により調製する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　３－ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　α－ヒドロムコン酸の調製：α－ヒドロムコン酸はＷＯ２０１６／１９９８５８号の参考例１に記載された方法により調製する。
　α－ヒドロムコン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い、対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製ＣｏＡトランスフェラーゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　本発明においてアシルトランスフェラーゼ、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する場合、当該核酸はデータベース上に存在する当該酵素のアミノ酸配列を基に人工的に合成してもよいし、天然から分離してもよい。人工的に合成する場合、導入する宿主微生物に合わせて各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を変更してもよい。
　当該酵素をコードする核酸を天然から分離する場合、遺伝子源となる生物は特に限定されないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　などのＥｕｇｌｅｎａ　属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられ、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属である。
　本発明の微生物は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産能を増強するためにピルビン酸キナーゼの機能が欠損していることが好ましい。
　ピルビン酸キナーゼはＥＣ２．７．１．４０に分類され、ホスホエノールピルビン酸を脱リン酸化し、ピルビン酸およびＡＴＰに変換する反応を触媒する酵素である。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＰｙｋＦ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６１９１、配列番号２７）、ＰｙｋＡ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６３６８、配列番号２８）、およびＳｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のＰｙｋＦ（配列番号３０）、ＰｙｋＡ（配列番号３１）などが挙げられる。本発明で用いる微生物がピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を２個以上有する場合は、全てのピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることが好ましい。本発明で用いる微生物が有する遺伝子がコードするポリペプチドがピルビン酸キナーゼであるかどうかは、ＮＣＢＩやＫＥＧＧなどにおける公共データベース上でＢＬＡＳＴ検索を行えばよい。
　本発明の微生物は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産能を増強するためにホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの活性が強化されていることが好ましい。
　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼはＥＣ４．１．１．４９に分類され、ホスホエノールピルビン酸、二酸化炭素およびＡＤＰからオキサロ酢酸およびＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素である。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＰｃｋ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１７８６２、配列番号３２）、およびＳｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のＰｃｋＡ＿１（配列番号３３）、ＰｃｋＡ＿２（配列番号３４）などが挙げられる。
　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、生理的には糖新生において脂肪酸からグルコースを生産する際の主要な反応を担っている。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが触媒する反応は可逆反応であるが、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産において、当該反応はホスホエノールピルビン酸および二酸化炭素をオキサロ酢酸に変換する方向に進行する。
　本発明で用いる酵素遺伝子がコードするポリペプチドがホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼであるかどうかは、ＮＣＢＩやＫＥＧＧなどのウェブサイトでＢＬＡＳＴ検索を行えばよい。　本発明の遺伝子改変微生物は、通常の微生物が利用し得る炭素源を発酵原料として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。当該遺伝子改変微生物が利用し得る炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
　発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学化合物より生じたある化学化合物が、酵素反応により別の化学化合物へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。
　上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよいが、特にグルコースを含む培地で培養することが好ましい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができる。グルコースの好ましい濃度は、５～３００ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１～５０ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。
　培養におけるｐＨの範囲は当該遺伝子改変微生物が生育することができれば特に制限はないが、好ましくはｐＨ５～８、より好ましくはｐＨ５．５～６．８である。
　培養における通気条件の範囲は３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産することができれば特に制限はないが、当該微生物変異体を良好に生育させるために、少なくとも培養開始時において培養容器内の液相あるいは気相に酸素が残存していることが好ましい。
　液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
　前記微生物の培養物中に、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
参考例１
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３ＯＡ－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、３ＯＡ－ＣｏＡから３ＨＡ－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｂ）、および３ＨＡ－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｄ）かつＨＭＡ－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応（反応Ｅ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ　Ｋｏｖａｃｈ，（１９９５），Ｇｅｎｅ　１６６：　１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号３５）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３６、３７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩ　を得た。反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：　１０４１７５５、配列番号３８）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３９、４０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２；配列番号４１、４２）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４３、４４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを得た。配列番号１０のポリペプチドをコードする核酸を増幅するために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４５、４６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲとした。
参考例２
３ＨＡ－ＣｏＡからＨＭＡ－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＳａｃＩで切断し、ｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号３５）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４７、４８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＭＷ１１９：：ＰｇａｐをＳｐｈＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを得た。反応Ｃを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：　１０４６９３２、配列番号４９）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号５０、５１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ１１９：：ＥＨとした。
実施例１
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のＹｊｊＰＢホモログの機能を欠損させるために、ｙｊｊＰＢホモログ遺伝子を欠損させたＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を作製した。
　ｙｊｊＰＢホモログ遺伝子の欠損方法は、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；９７（１２）：６６４０-６６４５．に記載の方法に従った。
　遺伝子欠損時にマーカーとして用いるカナマイシン耐性遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子の脱落に用いるＦＲＴ(ＦＬＰ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｔａｒｇｅｔ)配列を含むｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号５２および５３のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｙｊｊＰＢホモログ遺伝子欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。λ－ｒｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン５００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン５００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号５４および５６のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いて当該カナマイシン耐性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にＦＬＰ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を４０℃で２回継代培養した後にコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号５５および５６のオリゴＤＮＡを使用した。得られた株がアンピシリン感受性であることからｐＣＰ２０が脱落したことを確認した。得られた株をＳｇΔｙｊｊＰＢとした。
実施例２
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　実施例１で作製したＳｇΔｙｊｊＰＢに対して、参考例１で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を作製した。
　ＳｇΔｙｊｊＰＢを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＳｇΔｙｊｊＰＢ／３ＨＡとした。
参考例３
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　実施例２と同様の方法にて、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７にｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲを導入した。得られた株をＳｇ／３ＨＡとした。
実施例３
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例２で作製したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いて、３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験を行った。
　ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に、実施例２で作製した変異体を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃で静置培養した。
基質および生成物の定量分析
　当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の方法で分析することで培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に以下の式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびコハク酸の収率を表１に示す。
　収率（％）＝生成物の生成量（ｍｏｌ）／糖の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（２）。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：１２６０ＤＡＤ　ＶＬ＋（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
ＨＰＬＣによる有機酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：ＬＣ－１０Ａ（島津製作所製）
カラム：　Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（島津ジーエルシー社製）、長さ２５０ｍｍ、内径７．８ｍｍ、粒径８μｍ
Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０１Ｈ（島津ジーエルシー社製）長さ２５０ｍｍ、内径７．８ｍｍ、粒径１０μｍ
移動相：　５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４５℃
検出器：ＣＤＤ－１０Ａｖｐ（島津製作所製）。
ＨＰＬＣによる糖およびアルコールの定量分析
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００　ｍｍ、内径８　ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩＤ－１０Ａ（島津製作所製）。
比較例１
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例３と同様の方法にて、参考例３で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびコハク酸の収率を表１に示す。
　比較例１の結果と実施例３の結果を比較すると、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のＹｊｊＰＢホモログの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４
ＹｊｊＰＢの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｊｊＰＢの機能を欠損させるために、ｙｊｊＰＢ遺伝子を欠損させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
　ｙｊｊＰＢ遺伝子の欠損方法は、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；９７（１２）：６６４０-６６４５に記載の方法に従った。
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号５７および５８のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｙｊｊＰＢ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。ＦＲＴ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号５４および６０のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いて当該カナマイシン耐性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、４０℃にて２回継代培養することでｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を４３℃で２回継代培養した後にコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号５９および６０のオリゴＤＮＡを使用した。得られた株がアンピシリン感受性であることからｐＣＰ２０が脱落したことを確認した。得られた株をＥｃΔｙｊｊＰＢとした。
実施例５
ＹｊｊＰＢの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　実施例４で作製したＥｃΔｙｊｊＰＢに対して、参考例１で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
　ＥｃΔｙｊｊＰＢを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１日インキュベートした。得られた株をＥｃΔｙｊｊＰＢ／３ＨＡとした。
参考例４
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　実施例５と同様の方法にて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５にｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲを導入した。得られた株をＥｃ／３ＨＡとした。
実施例６
ＹｊｊＰＢの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例３と同様の方法にて、実施例５で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびコハク酸の収率を表２に示す。
比較例２
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例３と同様の方法にて、参考例４で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびコハク酸の収率を表２に示す。
　比較例２の結果と実施例６の結果を比較すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｊｊＰＢの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例７
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　実施例２で作製したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体に対して、参考例２で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入し、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を作製した。
　ＳｇΔｙｊｊＰＢ／３ＨＡを、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＭＷ１１９：：ＥＨと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをアンピシリン５００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をＳｇΔｙｊｊＰＢ／ＨＭＡとした。
参考例５
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　実施例７と同様の方法にて、Ｓｇ／３ＨＡにｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をＳｇ／ＨＭＡとした。
実施例８
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン５００μｇ／ｍＬを含む培地を用いた以外は実施例３と同様の方法にて、実施例７で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なお、α－ヒドロムコン酸の定量はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用い、３－ヒドロキシアジピン酸と同様の条件にて行った。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表３に示す。
比較例３
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例８と同様の方法にて、参考例５で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表３に示す。
　比較例３の結果と実施例８の結果を比較すると、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のＹｊｊＰＢホモログの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例９
ＹｊｊＰＢの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　実施例５で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体に対して、参考例２で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属変異体を作製した。
　ＥｃΔｙｊｊＰＢ／３ＨＡを、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＭＷ１１９：：ＥＨと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で１時間振とう培養した。５０μＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１日インキュベートした。得られた株をＥｃΔｙｊｊＰＢ／ＨＭＡとした。
参考例６
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　実施例９と同様の方法にて、Ｅｃ／３ＨＡにｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をＥｃ／ＨＭＡとした。
実施例１０
ＹｊｊＰＢの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む培地を用いた以外は実施例６と同様の方法にて、実施例９で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なお、α－ヒドロムコン酸の定量はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用い、３－ヒドロキシアジピン酸と同様の条件にて行った。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表４に示す。
比較例４
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例１０と同様の方法にて、参考例６で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表４に示す。
　比較例４の結果と実施例１０の結果を比較すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｊｊＰＢの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例１１
ＹｊｊＰＢホモログおよびピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を作製した。
ｐｙｋＦを欠損したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　ｐｙｋＦを欠損させる対象としてＳｇΔｙｊｊＰＢを用いたこと、ｐｙｋＦ（配列番号２９）欠損のためのＰＣＲ断片を得るためのプライマーとして配列番号６１および６２のオリゴＤＮＡを用いたこと、ｐｙｋＦ欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号５４および６４のオリゴＤＮＡを用いたこと、およびカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号６３および６４のオリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法にて遺伝子組換えを行った。得られた株をＳｇΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦとした。
ｐｙｋＡを欠損したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　ｐｙｋＡを欠損させる対象としてＳｇΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦを用いたこと、ｐｙｋＡ（配列番号６５）欠損のためのＰＣＲ断片を得るためのプライマーとして配列番号６６および６７のオリゴＤＮＡを用いたこと、ｐｙｋＡ欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号５４および６８のオリゴＤＮＡを用いたこと、およびカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号６８および６９のオリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様の方法にて遺伝子組換えを行った。得られた株をＳｇΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦＡとした。
反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　実施例２と同様の方法にて、ＳｇΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦＡに対して参考例１で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲを導入した。次に、得られた株に対して、実施例７と同様の方法にてｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をＳｇΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦＡ／ＨＭＡとした。
参考例７
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損しておらず、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体の作製
　ｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させる対象としてＳｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７を用いたこと以外は、実施例１１と同様の方法にて遺伝子組み換えを行った。得られた株をＳｇΔｐｙｋＦＡ／ＨＭＡとした。
実施例１２
ＹｊｊＰＢホモログおよびピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例８と同様の方法にて、実施例１１で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表５に示す。
比較例５
ＹｊｊＰＢホモログの機能が欠損しておらず、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例１２と同様の方法にて、参考例７で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表５に示す。
　比較例５の結果と実施例１２の結果を比較すると、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のＹｊｊＰＢホモログおよびピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例１３
ＹｊｊＰＢおよびピルビン酸キナーゼの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
ｐｙｋＦを欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　ｐｙｋＦを欠損させる対象としてＥｃΔｙｊｊＰＢを用いたこと、ｐｙｋＦ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４６１７９、配列番号２６）欠損のためのＰＣＲ断片を得るためのプライマーとして配列番号７０および７１のオリゴＤＮＡを用いたこと、ｐｙｋＦ欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号５４および７３のオリゴＤＮＡを用いたこと、およびカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号７２および７３のオリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例４と同様の方法にて遺伝子組換えを行った。得られた株をＥｃΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦとした。
ｐｙｋＡを欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　ＰｙｋＡを欠損させる対象としてＥｃΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦを用いたこと、ｐｙｋＡ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４６５２７、配列番号７４）欠損のためのＰＣＲ断片を得るためのプライマーとして配列番号７５および７６のオリゴＤＮＡを用いたこと、ｐｙｋＡ欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに配列番号５４および７８のオリゴＤＮＡを用いたこと、およびカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認するためのコロニーダイレクトＰＣＲに７７および７８のオリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例４と同様の方法にて遺伝子組換えを行った。得られた株をＥｃΔｙｊｊＰＢ，ｐｙｋＦＡとした。
参考例８
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　ｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させる対象としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５を用いたこと以外は、実施例１３と同様の方法にて遺伝子組み換えを行った。得られた株をＥｃΔｐｙｋＦＡ／ＨＭＡとした。
実施例１４
ＹｊｊＰＢおよびピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例１０と同様の方法にて、実施例１３で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表６に示す。
比較例６
ＹｊｊＰＢの機能が欠損しておらず、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例１４と同様の方法にて、参考例８で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表６に示す。
　比較例６の結果と実施例１４の結果を比較すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｊｊＰＢおよびピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
参考例９
ＹｊｊＰＢの機能を増強するためのプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＣＤＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、ｐＣＤＦ－１ｂ／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩを得た。ｙｊｊＰ、ｙｊｊＢおよびそのプロモーター領域を組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてｙｊｊＰ、ｙｊｊＢおよびそのプロモーター領域（配列番号７９）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号８０、８１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ－１ｂ／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ：：ｙｊｊＰＢとした。
参考例１０
ＹｊｊＰＢの機能を増強し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　参考例６で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体に対して、参考例９で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｙｊｊＰＢ、またはコントロールとしてｐＣＤＦ－１ｂを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属変異体を作製した。
　Ｅｃ／ＨＭＡを、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＣＤＦ：：ｙｊｊＰＢまたはｐＣＤＦ－１ｂと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＥｃ／ＨＭＡ，ｙｊｊＰＢ、Ｅｃ／ＨＭＡ，ｐＣＤＦとした。
参考例１１
ＹｊｊＰＢの機能を増強し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含む培地を用いた以外は実施例１０と同様の方法にて、参考例１０で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびコハク酸の収率を表７に示す。
　参考例１１の結果を比較すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｊｊＰＢの機能を増強することにより、コハク酸の収率が向上し、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が減少することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例１５
ＹｅｅＡの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｅｅＡの機能を欠損させるために、ｙｅｅＡ遺伝子を欠損させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
　ｙｅｅＡ遺伝子の欠損は、ｐＫＤ４を鋳型としたカナマイシン耐性遺伝子およびFRT配列の増幅に用いるプライマーとして配列番号８２および８３のオリゴＤＮＡを用い、カナマイシン耐性遺伝子の導入確認に用いるプライマーとして配列番号５４および８５のオリゴＤＮＡを用い、カナマイシン耐性遺伝子の脱落確認に用いるプライマーとして配列番号８４および８５のオリゴＤＮＡを用いた以外は実施例４と同様の方法にて行った。得られた株をＥｃΔｙｅｅＡとした。
実施例１６
ＹｅｅＡの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　実施例５と同様の方法にて、実施例１５で作製したＥｃΔｙｅｅＡに対して、参考例１で作製したプラスミドを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃΔｙｅｅＡ／３ＨＡとした。
実施例１７
ＹｅｅＡの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例６と同様の方法にて、実施例１６で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびコハク酸の収率を表８に示す。
　比較例２の結果と実施例１７の結果を比較すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｅｅＡの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例１８
ＹｎｆＭの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｎｆＭの機能を欠損させるために、ＹｎｆＭ遺伝子を欠損させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
　ｙｎｆＭ遺伝子の欠損は、ｐＫＤ４を鋳型としたカナマイシン耐性遺伝子およびFRT配列の増幅に用いるプライマーとして配列番号８６および８７のオリゴＤＮＡを用い、カナマイシン耐性遺伝子の導入確認に用いるプライマーとして配列番号５４および　　８９のオリゴＤＮＡを用い、カナマイシン耐性遺伝子の脱落確認に用いるプライマーとして配列番号８８および８９のオリゴＤＮＡを用いた以外は実施例４と同様の方法にて行った。得られた株をＥｃΔｙｎｆＭとした。
実施例１９
ＹｎｆＭの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　実施例５と同様の方法にて、実施例１８で作製したＥｃΔｙｎｆＭに対して、参考例１で作製したプラスミドを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃΔｙｎｆＭ／３ＨＡとした。
実施例２０
ＹｎｆＭの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例６と同様の方法にて、実施例１９で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびコハク酸の収率を表９に示す。
　比較例２の結果と実施例２０の結果を比較すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｎｆＭの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010

Claims (8)

  1. 　３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有し、かつ、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の活性が強化された遺伝子改変微生物であって、ジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させた、遺伝子改変微生物。
  2. 　前記ジカルボン酸排出担体の機能の欠損または低下が、ＹｊｊＰもしくはそのホモログおよび／またはＹｊｊＢもしくはそのホモログの機能の欠損または低下により引き起こされる、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  3. 　ｙｊｊＰ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子および／またはｙｊｊＢ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子が破壊または欠損された請求項２に記載の遺伝子改変微生物。
  4. 　前記ジカルボン酸排出担体の機能の欠損または低下が、ＹｅｅＡもしくはそのホモログおよび／またはＹｎｆＭもしくはそのホモログの機能の欠損または低下により引き起こされる、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  5. 　ｙｅｅＡ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子および／またはｙｎｆＭ遺伝子もしくはそのホモログ遺伝子が破壊または欠損された、請求項４に記載の遺伝子改変微生物。
  6. 　前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  7. 　３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子が導入された、請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111386339A (zh) * 2017-11-30 2020-07-07 东丽株式会社 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸及/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学产品的制造方法
WO2023182322A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015005406A1 (ja) * 2013-07-09 2015-01-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
WO2019107516A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3467113B1 (en) * 2016-05-31 2023-06-07 Toray Industries, Inc. Method for producing a-hydromuconic acid
BR112018074477A2 (pt) * 2016-05-31 2019-05-28 Toray Industries método de produção de ácido 3-hidroxiadípico e micro-organismo pertencente ao gênero serratia capaz de produzir ácido 3-hidroxiadípico

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015005406A1 (ja) * 2013-07-09 2015-01-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
WO2019107516A1 (ja) * 2017-11-30 2019-06-06 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111386339A (zh) * 2017-11-30 2020-07-07 东丽株式会社 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸及/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学产品的制造方法
CN111386339B (zh) * 2017-11-30 2024-05-10 东丽株式会社 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸及/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学产品的制造方法
WO2023182322A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

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