KR20150038857A - 세포 표면 발현 기술을 이용한 gaba의 대량 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GABA의 생산을 증대시키기 위해 Pyrococcus 유래의 글루타메이트 탈카르복시효소 gadB와 대장균의 외막단백질인 ompC의 일부를 절단한 후 융합하여 세포표면에서 과발현시킨 후에 전구체를 추가한 배지에서 배양하여 생물전환하는 방법을 제공하며 본 발명의 또 다른 목적은 형질전환된 벡터 및 미생물을 제공하는 데에 있다.

Description

세포 표면 발현 기술을 이용한 GABA의 대량 생산방법{Method of GABA production using cell surface display system}

본 발명은 대장균의 표면 발현 기술을 이용하여 감마 아미노부틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)이라고도 하는 4-아미노부틸산은 인간의 뇌에서 신경전달물질 억제효과에 의한 저혈압 및 진통효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 현재 식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). 또한 폴리이미드(polyamide; nylon 4)를 생산할 수 있는 모노머로서 필롤리돈(pyrrolidone)으로 전환될 수 있어 많은 관심을 받고 있다.

이러한 GABA는 글루타메이트를 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 제조될 수 있는데, 현재까지 다양한 글루타메이트 디카르복실라아제가 보고되어 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci. Biotechnol. Biochem. 66(12): 2600-2605, 2002).

한편, 이러한 효소반응을 이용한 GABA의 생산에는 여러 가지 문제점이 발생하고 있는데, 이를 해결하기 위해 락토바실러스 등을 이용하여 바이오매스에서 생산된 글루탐산나트륨을 이용한 GABA를 고농도로 전환하는 공정이 개발되어 나일론 4의 모노머로 이용될 수 있는 GABA의 경제적인 제조 공정 기술이 개발된 바 있다. 하지만, 글루탐산나트륨으로부터 GABA를 생산하기 위해서는 기질인 글루탐산나트륨을 코리네박테리움 같은 미생물의 발효공정을 통해 슈가(sugar)로부터 생산하여야 하며, 글루탐산나트륨이 GABA로 전환될 때 이산화탄소가 방출되기 때문에 탄소 수율이 낮아지는 단점이 있다.

또한, 최근 연구 결과에 의하면 GABA가 풍부한 발아현미는 면역반응을 증진시키고 암세포의 분화를 억제시키는 것으로 알려지고 있고, 따라서 GABA의 산업적 중요성 때문에 많은 gadB(glutamate decarboxylases: 글루타메이트 탈카르복시효소)가 GABA의 생산 증대를 위한 용도로 활용되고 있다. 특히 gadB는 GABA의 생산증대를 위해 다양한 박테리아에서 과발현시켜 수득하고 있는데, 예를 들면, Lactobacillus sakei B2-16에서 Lactobacillus plantarum ATCC 14917의 글루타메이트 탈카르복시효소가 과발현되어 1.35배의 GABA농도를 얻을 수 있었으며, 쌀의 글루타메이트 탈카르복시효소가 Bifidobacterium longum에서 과발현 되었으며, MSG(monosodium glutamate) 30 g/l을 포함하는 배지에서 GABA의 최종농도는 0.1 g/l에 도달하는 것으로 보고된 바 있다. 또한 Bacillus subtilis에서 Lactobacillus brevis의 글루타메이트 탈카르복시효소가 과발현 되어 MSG 30 g/l에서 0.4 g/l의 GABA를 생산할 수 있었다. 또 다른 예로는 대장균 BL21(DE3)에서 L. brevis BH2의 글루타메이트 탈카르복시효소가 성공적으로 과발현 되어 GABA생산을 증진한 경우와 GABA aminotransferase 돌연변이가 발생한 대장균에서 gadB와 gadC(glutamate/GABA antiporter: glutamate/GABA 역수송체)가 함께 과발현 되어, 10 g/l의 MSG에서 최종농도 5.46 g/l의 GABA을 얻은 예가 있었다.

그러나 아직까지 개발된 이러한 방법의 경우, GABA를 효율적으로 수득할 수 있는 방법에는 그 효과가 미비하다고 할 수 있는 바, GABA의 생산 효율을 증진시킬 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 글루타메이트 탈카르복실효소(glutamate decarboxylase) 유전자와 세포 표면발현 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 형질전환체를 촉매로 이용하여, 배양액에 존재하는 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산의 유도체를 상기 형질전환체의 세포 표면에서 GABA(gamma-aminobutyric acid)로 생물전환(bioconversion)시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 형질전환체; 및 글루타민산 또는 글루타민산 유도체를 포함하는 GABA 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 형질전환체를 포함하는 용액에 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산 유도체를 처리하는 단계를 포함하는, GABA 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 글루타메이트 탈카르복실효소(glutamate decarboxylase) 유전자와 세포 표면발현 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루타메이트 탈카르복실효소는 피로코코스 쇼리코쉬(Pyrococcus horikoshii) 유래의 글루타메이트 탈카르복실효소 gadB일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표면발현 단백질은 ompC(Outer membrane protein C)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루타메이트 탈카르복실효소(glutamate decarboxylase) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ompC 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 도 5로 표시되는 벡터 지도를 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체를 촉매로 이용하여, 배양액에 존재하는 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산의 유도체를 상기 형질전환체의 세포 표면에서 GABA(gamma-aminobutyric acid)로 생물전환(bioconversion)시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루타민산은 MSG(monosodium glutamate)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산의 유도체는 상기 배양액 내에 5g/l 내지 35g/l의 농도로 함유하고 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양액의 pH는 1.0 내지 3.0일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체; 및 글루타민산 또는 글루타민산 유도체를 포함하는 GABA 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체를 포함하는 용액에 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산 유도체를 처리하는 단계를 포함하는, GABA 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 Pyrococcus 유래의 글루타메이스 탈카르복시효소 gadB와 대장균의 외막단백질인 ompC의 일부를 절단한 후 융합하여 세포표면에서 과발현시켜 글루탐산나트륨으로부터 감마 아미노부틸산 생산함으로써 효소 자체를 사용하는 것보다 경제성 높으면서도 온도나 pH에 안정된 효과를 얻을 수 있으며 효소의 수명을 증가 시킬 수 있다. 또한 세포주기에 상관없이 안정적으로 효소의 발현이 가능하여 높은 수율로 생물전환할 수 있으며 세포에서 별도로 효소의 분리과정이 불필요하여 효소가 실활될 위험을 줄일 수 있다.

도 1은 Pyrococcus 유래의 gadB와 ompCt를 클로닝하여 본 발명의 세포 표면 발현 재조합 벡터를 제조하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 ompCt-gadB의 세포내 과발현 여부를 SDS-PAGE를 통해서 확인한 것으로서,
M은 마커단백질이며, Lane 1은 형질전환되지 않은 균주, Lane 2는 pHOCBP (ompCt-gadB)를 포함하는 균주이다.
도 3은 pH가 각각 2.5 (●), pH3 (▼), pH3.5 (■), pH4 (◆), pH4.5 (▲), pH5 (○)인 경우, 시간에 따른 GABA의 농도의 변화를 도시한 것이다.
도 4는 MSG의 처리농도에 따른 GABA 수율을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 제조한 pHOCBP 벡터의 지도를 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"유전자"는 유전적 기능이 관련되어 있는 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등)의 뉴클레오티드 서열이다. 유전자는, 예를 들어, 유기체의 게놈 내의 특정 물리적 위치("유전자좌")를 차지하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 포유동물의 DNA 서열)을 포함하는, 유기체의 유전 단위이다. 유전자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 발현 생산물을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 폴리펩티드 코딩 서열과 같은 코딩 서열 및 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)과 같은 비코딩 서열을 포함한다. 다수의 진핵생물 유전자가 "인트론"(비코딩 서열)이 개재되어 있는 "엑손"(코딩 서열)을 갖는다.

"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

"벡터" 또는 "플라스미드"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내 및/또는 사이로 전달하는 핵산 분자, 바람직하게는 자가-복제성 핵산 분자이다. 이 용어는 1차적으로 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입을 위해 기능하는 벡터,1차적으로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 기능하는 벡터의 복제물, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한, 하나 초과의 상기 기능을 제공하는 벡터도 포함된다. "발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때 폴리펩티드(들)로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 대체로 요구되는 발현 생산물을 생산하도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 의미한다.

"효소 반응 조건"이란 효소가 기능하도록 허용하는 환경에서 이용가능한 임의의 필수적인 조건(즉, 온도, pH, 물질 비저해)과 같은 요인을 의미한다. 효소 반응 조건은 시험관에서와 같은 시험관내, 또는 세포내와 같은 생체내일 수 있다.

"기질"은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나 전환되게 되어있는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 단일 화합물뿐만 아니라 용제, 혼합물 및 최소한 하나의 기질을 포함하는 다른 재료와 같은 화합물의 조합 및 이들의 유도체를 포괄한다. 게다가, 용어 "기질"은 바이오매스(biomass) 유도된 설탕과 같은 출발 재료로서 사용하기 적합한 탄소 공급원을 제공하는 화합물뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 대사 조작 미생물과 연관된 경로에서 사용되는 중간생성물과 최종 대사산물을 포괄한다. 미생물에 의해 통상적으로 사용되는 적합한 탄소 기질을 포괄한다.

"~로부터 얻은" 또는 "~유래의" 이란 예를 들어, 소정 유기체, 전형적으로 미생물과 같은 특정 공급원으로부터 단리 되거나, 이로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 추출물 또는 폴리펩티드 추출물 등과 같은 샘플을 의미한다. 또한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 특정 유기체 또는 미생물로부터 단리 되거나, 이로부터 유도된 상황도 의미할 수 있다.

"재조합" 미생물은 전형적으로, 예컨대 플라스미드 또는 벡터에 하나 이상의 외래 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 재조합 미생물을 이용하여 감마 아미노부틸산(GABA)을 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 Pyrococcus 유래의 glutamate decarboxylase gadB(글루타메이트 탈카르복시효소)의 유전자와 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질인 Ompt(352aminoacids) 유전자를 융합한 재조합 벡터를 미생물에 형질전환 시킨 후, glutamate decarboxylase gadB(글루타메이트 탈카르복시효소)를 세포 표면에 발현시켜 감마 아미노부틸산(GABA)을 세포 표면 상에서 대량으로 생물전환시켜 GABA를 생산하는 새로운 기술에 관한 것이다.

본 발명은 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여, 특정 효소를 코딩하는 유전자를 기본 벡터에 삽입하여 형질전환시킨 재조합미생물을 배양함으로써 구현할 수 있다. 따라서, 본 발명은 감마 아미노부틸산과 같은 범용 화학물질로 전환시키는 방법, 효소, 재조합 미생물 및 미생물 시스템을 포함한다.

한편, 아미노부틸산(amino butyric acid, amino butyrate, 4-amino butyric acid, gamma-amino butyric acid, 2-amino butyric acid)은 아민기와 카르복시기가 있는 탄소수 4개의 아미노산의 일종이며 아민기의 위치에 따라 2, 3, 4-아미노부틸산으로 불린다.

"대사 경로"로도 지칭되는 용어 "(생)합성 경로"는 하나의 화학종을 다른 종으로 전환(transmuting)시키기 위한 동화(anabolic) 또는 이화(catabolic) 생화학 작용의 세트를 지시한다. 유전자 산물은 병렬로 또는 직렬로 동일 기질에 작용하여 동일 산물을 생산하거나, 또는 동일 기질과 대사 최종 산물 사이의 대사 중간생성물(즉, 대사 산물)에 작용하거나 또는 이를 생산하면, 동일한 "대사 경로"에 속한다.

본 발명에는 고세균(archaeon)에 속하는 Pyrococcus horikoshii의 Glutamate decarboxylase가 사용되었으며, 넓은 기질 특이성을 갖고, 최적 pH 8.0 최적 온도 97 ℃이상의 특성을 보인다. 또한 대장균(그람음성세균)의 세포 표층에 있는 외막을 구성하는 단백질을 코드하는 유전자의 총칭으로 ompA, ompC, ompF 등이 대표적이다. 특히 OmpC, OmpF 단백질은 친수성 저분자물질에 대한 투과공(孔)을 형성하고 있어, 그 합성은 배지삼투압에 의해 조절되고 있다. 또한 ompC, ompF의 발현은 삼투압감지기(EnuZ)와 유전자활성화인자(OmpR)에 의해 조절되며, 특히 히스티딘인산화효소 EnuZ는 세포내 신호전달을 조절하고 세균의 단백질인산화효소의 대표적인 예가 된다. OmpR은 아스파르트산잔기가 인산화수식을 받아 활성화되며, omp유전자 발현을 양으로 조절한다. 본 발명에서는 ompC 유전자 중 세포표면발현에 필요한 부분만으로 단축시켜(truncated) 352개의 아미노산 서열만을 이용했으며, 이하 ompC_t라 한다. 또한 바람직하게는 사용하는 재조합 미생물(균주)이 상기 유전자들을 함유하고 있는 것이 좋다.

본 발명에 사용되는 효소를 인코딩하는 적합한 폴리뉴클레오티드는 이를 제공하는 임의의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있고, 이의 동족체는 다양한 자료베이스를 참조하여 확인될 수 있다.

생합성 효소를 인코딩하는 고유 DNA서열은 본 발명의 구체예를 단순히 예시하기 위하여 본 명세서에서 언급되고, 본 발명은 본 발명의 방법에 활용되는 효소의 폴리펩티드 및 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 서열의 DNA 화합물을 포함한다. 유사한 방식으로, 폴리펩티드는 전형적으로, 원하는 활성의 손실이나 중대한 손실 없이, 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 허용할 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 단백질의 효소적 동화 또는 이화 활성을 갖는다면, 상기 기준 폴리펩티드(reference polypeptide)와 상이한 아미노산 서열을 갖는 변형되거나 변이된 폴리펩티드 역시 포함한다. 더 나아가, 본 명세서에 도시된 DNA 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 단지 본 발명의 구체예를 예시한다.

본 명세서에 열거된 각 유전자와 폴리펩티드/효소에 대한 서열은 인터넷에서 이용 가능한 자료베이스를 사용하여 용이하게 확인할 수 있다( http:(//)eecoli.kaist.ac.kr/main.html). 이에 더하여, 이들 아미노산 서열과 핵산 서열은 당분야에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(BLAST 등)을 이용하여 동일성에 대하여 용이하게 비교할 수 있다.

또한, 본 발명에서 벡터(vector)는 적합한 미생물 내에서 상기 유전자들의 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　

벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.　적당한 숙주 미생물로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로 본 발명에서 플라스미드(plasmid)와 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다.　

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다.　바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.　발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

"작동 가능하게 연결된"이란 언급된 구성요소들이 그 일반적 기능을 수행하도록 구성되어 있는 요소들의 배열을 말한다. 따라서, 코딩 서열(예를 들어, 관심있는 항원을 코딩하는 서열)에 작동 가능하게 연결된 특정 프로모터는 조절 단백질 및 적절한 효소가 존재할 경우 코딩 서열의 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 경우, 특정 조절요소가 이들이 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 할 수 있는 한 코딩 서열에 인접할 필요는 없다.

전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질 전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다.　적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

통상적으로, 하나 이상의 제한 효소로 DNA 서열 및 벡터를 절단하고 단편들을 함께 결찰하여 최종적으로 발현될 DNA 서열을 벡터에 결합시킨다. 제한 효소 소화처리 및 결찰은 당업자들에게 익히 알려졌다.

본 발명은 다른 태양으로, 상기 감마 아미노부틸산(GABA) 생산을 위한 생화학 경로를 포함하는 대사 조작 미생물(재조합 미생물 또는 재조합 균주)에 관한 것이다. 또한 표준 절차에 따라 수용성세포(competent cell)를 준비한 후에 필요할 때까지 -80 °C에 보관하였다.

본 발명의 대사 조작 미생물은 생물의 게놈 내에서 또는 생물 내에서 게놈 외부에 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를포함한다. 이러한 미생물은 야생형 생물체에서 발견되는 유전자의 감소(reduction), 파괴(disruption) 또는 적중(knockout) 및/또는 이종(heterologous) 폴리뉴클레오티드의 도입(introduction)을 포함한다.

본 발명은 일 구체예로서, Pyrococcus 유래의 글루타메이트 탈카르복시효소 gadB과 대장균 유래의 ompCt을 클로닝은 로슈사(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)의 Expand high-fidelity PCR(polymerase chain reaction)을 사용하여 증폭하였다.

적합한 미생물 숙주는, 이에 제한되지는 않지만, 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 버크홀데리아(Burkholderia), 올리고트로파(Oligotropha), 클렙시엘라(Klebsiella), 피치아(Pichia), 칸디아(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 속에 속하는 미생물을 사용할 수 있다. 이 중, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 클루이베로마이세스 마시아누스(Kluyveromyces marxianus) 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Sccharomyces cerevisiae)가 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 에스케리키아 콜리(E. coli, 대장균)를 사용하였다.

특히, 본 발명의 바람직한 미생물은 GabT 및 PuuE의 구별되는 유전자를 모두 함유하고 있는 것이 좋다. 따라서, 가장 바람직한 미생물로서 대장균을 들 수 있다. 본 발명의 탄소 기질의 GABA 전환을 위한 효소 경로를 코딩할 필요한 유전자를 포함하는 재조합 유기체를 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 제작할 수 있다.

박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 분자 생물학 분야에서 일반적이며 잘 알려져 있다. 예를 들어, 당해 유전자의 서열이 공지되어 있는 경우, 적합한 게놈 라이브러리가 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성될 수 있으며, 원하는 유전자 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 일단 당해 서열이 단리되면, 그 DNA는 표준 프라이머-유도 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용하여 증폭되어 적절한 벡터를 이용한 형질전환에 적합한 양의 DNA가 얻어질 수 있다. 이종 숙주에서의 발현을 위한 코돈 최적화 도구는 쉽게 이용가능하다. 코돈 최적화를 위한 일부 도구는 숙주 유기체의 GC 함량을 기반으로 하여 이용가능하다. 일단 관련 경로 유전자가 동정되어 단리되면, 이 유전자는 당업계에 잘 알려진 수단에 의해 적합한 발현 숙주를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection))은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자 폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 비롯한 다수의 수단 중에서 하나에 의해 달성될 수 있다

"재조합 미생물" 및 "재조합 균주"라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 본 발명의 특정 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하거나 과다 발현하기 위하여 유전적으로 변형된 미생물을 지칭한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

피로코코스 ( Pyrococcus ) 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제 gadB 를 발현하는 플라스미드 제조

본 실험에서 사용한 박테리아 균주 및 플라스미드는 하기 표 1에 기재하였다. 또한 숙주(host)로는 대장균 XL1-Blue(XB)를 사용하였고, DNA 클로닝(cloning)을 위해서는 pGEMT vector (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였으며, 발현 플라스미드를 구축하기 위해서 pMAL-p4X (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA)를 사용하였다.

또한, 화학적 처리에 의한 형질전환용 세포(competent cell)들은 Sambrook, J. and D.W. Russell, Molecularcloning : alaboratorymanual ,3 rded .2001,ColdSpringHarbor,N.Y:ColdSpringHarborLaboratory Press에 개시된 방법으로 제조한 후, -80℃의 온도에서 보관하였다. 또한, 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 선별하기 위해서 100 μg/ml의 암피실린 나트륨염을 추가한 Luria-Bertani (LB) broth (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l bacto-yeast extract, 5 g/l 염화나트륨)에서 37 °C, 250 rpm으로 대장균을 배양하였으며, 대장균은 암피실린 나트륨염 100 μg/ml이 첨가된 LB (Luria-Bertani) broth (bacto-tryptone 10 g/l, bacto-yeast extract5 g/l 및 염화나트륨 5 g/l)에서 37 °C, 250 rpm으로 배양하였다.

피로코코스 유래의 gadB 유전자와 대장균 유래의 ompCt은 로슈사(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)의 Expand high-fidelity PCR(polymerase chain reaction)을 사용하여 유잔자를 각각 증폭하였으며, 이때 사용한 프라이머를 하기 표 2에 기재하였다. PCR 산물은 GENEALL PCR 정제키트(General Biosystem, Seoul, Korea)를 사용하여 분리한 후, pGEMT 벡터에 클로닝 하였다. 이후 다음으로 ompCt-gadB의 융합된 유전자를 BamHI 와 HindIII 제한효소를 이용하여 pET21 a(+) 벡터로 클로닝 하여, 재조합 벡터인 pHOCBP를 제조하였다(표 1 참조). 참고로 본 발명의 방법으로 재조합 벡터인 pHOCBP를 제조하는 과정을 도 1에 모식도로 나타내었다.

< 실시예 2>

글루타메이트 디카르복실라아제 gadB 의 대장균 표면 발현유도

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 발현 벡터를 사용하여 글루타메이트 디카르복실라아제 gadB를 발현시켜 발현 여부를 조사하였다.

이를 위해, 제조합 발현 벡터를 포함하는 XB 균주를 100 ml의 LB를 포함하는 250 ml 플라스크에서 37 °C 온도 및 250 rpm의 속도로 배양하였으며, OD 600이 1.2에 도달하면, 0.5 mM의 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)을 이용해서 18시간 동안 30 °C에서 유전자 발현을 유도시켰다. 이후 세포 배양액을 초음파 처리하여 세포를 파쇄 하였는데, 상기 초음파는 30초 동안 처리하고 1분간 정지하는 과정을 3회 반복 수행하였다.

이후, 파쇄된 세포 용액을 13,000 rpm 4 °C에서 30분 원심분리 한 후 상등액을 수득하여 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 통해 gadB의 발현정도를 분석하였다.

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 재조합 발현 벡터를 통해 글루타메이트 디카르복실라아제 gadB가 대장균의 표면에서 과발현 되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

세포 표면 발현 시스템을 통한 GABA 생산에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 GABA 생산에 미치는 요소를 분석하였다.

또한, 하기 실시예 <3-1> 및 <3-2>에서 GABA 생산정도를 분석하는 방법은 OptimaPak C18(4.6 x 150 mm; RS tech Corporation, Daejeon, Korea)을 이용한 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 통해서 GABA 생물전환된 양을 정량분석 하였다.

즉, 하기 실시예에서 반응이 완료된 샘플을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후에 상청액 100 μl을 Eppendorf 튜브에 넣은 다음 1ml의 반응 혼합물을 만들기 위해 pH 9.8의 1M (sodium bicarbonate) 용액 200 μl에 600 μl의 이중증류수(double distilled)를 첨가하였다. 혼합물은 80 °C에서 40분 동안 배양한 다음 반응을 중단시키기 위해 20 μl/ml의 아세트산을 100 μl 첨가하였다. 혼합물을 12,000 rpm에서 5분동안 원심분리한 후 상청액은 0.22 μm 밀리포어 필터를 이용해 여과하고, HPLC와 UV검출이 가능한 Agilent 시스템을 이용하여 분석하였다. 이때 용매(eluent) A [tetrahydrofuran/methanol/ 50 mM sodium acetate pH 6.2 (5:75:420, by vol.)] 및 용매(eluent) B (methanol)로 2진법의 비선형의 변화도(binary nonlinear gradient)를 이용하여 유도화된 샘플의 분리를 수행하였다.

컬럼의 온도는 30 ℃로 설정하고, 용리 조건은 다음과 같이 수행하였다: 평형 (6 분, 20% B), 그레디언트 (20 분, 20~80% B) 및 클리닝 (3 분, 100% B). 이동상의 유속은 1 ml/min 이고 샘플은 UV 286 nm에서 검출되었다. 8개의 표준 용액 : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 g/l GABA (Sigma, Missouri, USA)에 대한 동일 절차를 이용하여 GABA 에 대한 표준 곡선을 작성하였다.

<3-1> pH 가 미치는 영향 분석

GABA의 생물전환(bioconversion)에 미치는 pH의 영향을 분석하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주(대장균)를 250 ml 플라스크에서 100 μg/ml의 암피실린 나트륨염을 포함하는 LB 100 ml를 사용하여 37 °C, 250 rpm에서 배양하였다. 이후 OD₆₀₀가 1.2에 도달하면, 원심분리하고 MSG 10 g/l을 포함하는 100 ml LB를 250 ml 플라스크에 넣고 세포를 재현탁하였으며, GABA 유전자 발현은 0.5 mM의 IPTG를 사용하여 유도한 후, pH를 각각 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5로 조정하여, 30 °C 250 rpm에서 48시간 동안 배양하였더. 이후 GABA의 생물전환양은 배양 중 매 12시간마다 측정하였고, GABA 생산에 대해서 하기 표 3과 도 3에 나타내었다.

분석 결과, pH가 2.5에서 3으로 증가시킨 경우, GABA 농도도 증가하는 것으로 나타났다. 한편, GABA의 농도 증가는 pH가 3으로 증가할 때까지 나타났으며, 그 이상의 pH 조건에서는 GABA 농도가 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 세포 표면 발현 시스템을 통해 GABA 생산량을 극대화 시킬 수 있는 조건으로 발현 유도 조건 하에서 pH를 3.0으로 조절하는 경우 5.23 g/l의 최대 GABA 생산량을 얻을 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<3-2> GABA 생물전환에 대한 MSG 농도의 영향

나아가 본 발명자들은 GABA 생산에 MSG의 농도가 미치는 영향을 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주(대장균)를 100 μg/ml의 암피실린 나트륨염을 포함하는 100 ml LB를 이용하여 250 ml의 플라스트로 37 °C 250 rpm에서 배양하였다.

OD₆₀₀이 1.2에 도달하면, 세포를 원심분리한 후 MSG가 각각 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g/l의 농도로 각각 포함된 100 ml의 LB를 250 ml 플라스크에 첨가하여 상기 세포와 재현탁 하였으며, 0.5 mM의 IPTG를 사용하여 유전자 발현을 유발한 후 pH를 3.0으로 조정한 후, 30 ℃, 250 rpm에서 48시간 동안 배양하였다. GABA 생산량의 측정은 배양 중 매 12시간 마다 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.

분석 결과, MSG가 포함되지 않은 배지에서는 GABA의 생성이 측정되지 않았으며, MSG 농도가 증가할수록 GABA 농도가 높아졌으나, MSG 농도의 농도가 20 g/l을 초과하는 경우부터는 점차 GABA 농도가 감소하는 것으로 나타났다.

특히, MSG의 농도가 20 g/l일 때 최대 GABA 수율인 90.98 %을 나타내었고, 이는 GABA 농도가 11.1 g/l에 해당한다.

즉, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 세포 표면 발현 기술을 통해 GABA의 생성율을 향상시키는 방법으로서, MSG 농도가 20 g/l일 때 가장 높은 생성량을 얻을 수 있다는 것을 알 수 있었으며, 상기 농도를 초과하는 경우, GABA의 생성량은 점차 감소하는 것으로 나타남에 따라, 높은 농도로 기질이 존재하는 경우 기질저해 현상으로 인해 GABA의 생성이 오히려 감소된다는 것을 알 수 있었다.

또한, 이전의 연구 결과에 따를 때 Lactobacillus sakei B2-16 중 락토바실러스 플란타럼 ATCC 14917 의 글루탐산 디카르복시라아제 과발현에 의해 70 g/l MSG로부터 수득되는 27.4 g/l의 GABA를 수득한 바 있다. 또한 Bacillus subtilis에서 Lactobacillus brevis 유래의 glutamate decarboxylase를 과별현 시켜 30 g/l의 MSG를 첨가하여 0.4 g/l의 GABA를 생산하여 2.2%의 GABA 수율을 얻은 바 있으며 또한 Bifidobacterium longum에 쌀의 glutamate decarboxylase를 과발현 시켜 30 g/l의 MSG를 포함한 배지에서 0.1 g/l 의 GABA 최종농도를 얻은 바 있다.

이러한 결과는 Pyrococcus의 gadB을 대장균 표면에 과발현 시킨 경우 10 g/l of MSG를 첨가하여 GABA 수율 83 %에 해당하는 5.04 g/l 의 GABA를 얻을 수 있었으며, 배지에 1.7 g/l의 GABA가 남아 있었으며, 배지에 20 g/l의 MSG를 첨가하여 대장균 표면에서 gadB 과발현 되어 11.1 g/l의 GABA농도에 해당하는 90.98 %의 최대 GABA 수율을 얻었으며, 배지에 1.75 g/l의 MSG 농도가 남아 있었다. 따라서 본 발명에 의한 접근방법이 GABA 생산을 위한 산업적 활용에서 큰 가치가 있을 것으로 사료된다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 대장균의 세포 표면에서 GABA를 발현시켜 생산하는 기술은 종래 GABA 생산 대비 그 효율이 우수하다고 할 수 있으며, 세포 표면 발현시 그 효과를 최대화 할 수 있는 최적 조건을 확립하였기에 확립된 조건 하에서 GABA를 효율적으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Method of GABA production using cell surface display system <130> PN1305-159 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glutamate decarboxylase gene <400> 1 gaattcatga agtttcccag aattggactt cctaaggaaa aagttataga acttattaat 60 gaaaaaacca agaaggattt aacgtttagc tctggcaaaa tccttggctc gatgtgcact 120 atgccgcacg atcttgcaat cgaagtgtac acaaaatata tcgaccgcaa tctaggtgat 180 cctgggttac atcctgggac tagaaaaatt gaggaagagg taatcgagat gatctccgat 240 ctgttacatc ttgagaaggg tcatggccac atagtttctg gaggtacaga agcaaacatc 300 ctcgccgttc gtgccttccg caatctttca gatgtcgaga agccggaatt gattctaccg 360 aagagtgctc atttctcatt tataaaagcc ggtgagatgc tgggggttaa gttagtatgg 420 gccgagttga atcctgacta taccgttgac gtacgtgatg ttgaagctaa aatcagtgat 480 aataccattg gtatagtcgg catcgctggc accaccggtc tgggagttgt ggatgacata 540 ccagcactta gcgatttggc tcgcgattat ggcattcccc tccacgtgga cgcagcgttt 600 ggaggttttg tgataccgtt cgccaaagag cttggctatg aactgccgga ctttgatttt 660 aaacttaaag gggtgcagag tataactata gacccgcaca agatggggat ggcacccata 720 ccagcgggcg gcatagtgtt tcgtcgtaag aagtacttaa aggcgataag cgtgcttgct 780 ccataccttg cgggggggaa agtatggcaa gccacgataa cgggcacaag gccgggagcg 840 agcgtaatcg ccgtttgggc attaattaag catctgggct tcgagggcta tatgcgtatt 900 gtggaacggg cgatgaagtt gtcacgctgg tttgcggagg agattaagaa gatcaacaac 960 gcatggcttg tgcgagagcc aatgttgaat atagtctcct tccagacaaa gaacctgaag 1020 aaggtcgagc gggaactcaa gagtcgcggt tgggggatat cggctcatcg tggatatata 1080 cgcatcgtct tcatgccgca tgttacccgg gaaatgattg aggagtttct taaagatctg 1140 aaagaggtct tatcttaagg tacc 1164 <210> 2 <211> 1056 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide Sequences Encoding ompC Proteins <400> 2 atgaaagtta aagtactgtc cctcctggtc ccagctctgc tggtagcagg cgcagcaaac 60 gctgctgaag tttacaacaa agacggcaac aaattagatc tgtacggtaa agtagacggc 120 ctgcactatt tctctgacaa caaagatgta gatggcgacc agacctacat gcgtcttggc 180 ttcaaaggtg aaactcaggt tactgaccag ctgaccggtt acggccagtg ggaatatcag 240 atccagggca acagcgctga aaacgaaaac aactcctgga cccgtgtggc attcgcaggt 300 ctgaaattcc aggatgtggg ttctttcgac tacggtcgta actacggcgt tgtttatgac 360 gtaacttcct ggaccgacgt actgccagaa ttcggtggtg acacctacgg ttctgacaac 420 ttcatgcagc agcgtggtaa cggcttcgcg acctaccgta acactgactt cttcggtctg 480 gttgacggcc tgaactttgc tgttcagtac cagggtaaaa acggcaaccc atctggtgaa 540 ggctttacta gtggcgtaac taacaacggt cgtgacgcac tgcgtcaaaa cggcgacggc 600 gtcggcggtt ctatcactta tgattacgaa ggtttcggta tcggtggtgc gatctccagc 660 tccaaacgta ctgatgctca gaacaccgct gcttacatcg gtaacggcga ccgtgctgaa 720 acctacactg gtggtctgaa atacgacgct aacaacatct acctggctgc tcagtacacc 780 cagacctaca acgcaactcg cgtaggttcc ctgggttggg cgaacaaagc acagaacttc 840 gaagctgttg ctcagtacca gttcgacttc ggtctgcgtc cgtccctggc ttacctgcag 900 tctaaaggta aaaacctggg tcgtggctac gacgacgaag atatcctgaa atatgttgat 960 gttggtgcta cctactactt caacaaaaac atgtccacct acgttgacta caaaatcaac 1020 ctgctggacg acaaccagtt cactcgtgac gctggc 1056

Claims (14)

1. 글루타메이트 탈카르복실효소(glutamate decarboxylase) 유전자와 세포 표면발현 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 글루타메이트 탈카르복실효소는 피로코코스 쇼리코쉬(Pyrococcus horikoshii) 유래의 글루타메이트 탈카르복실효소 gadB인 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터.
3. 제1항에 있어서,
   상기 표면발현 단백질은 ompC(Outer membrane protein C)인 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터.
4. 제1항에 있어서,
   상기 글루타메이트 탈카르복실효소(glutamate decarboxylase) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터.
5. 제3항에 있어서,
   상기 ompC 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터.
6. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 도 5로 표시되는 벡터 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 표면 발현용 재조합 벡터.
7. 제1항의 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
8. 제7항에 있어서,
   상기 형질전환체는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
9. 제7항의 형질전환체를 촉매로 이용하여, 배양액에 존재하는 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산의 유도체를 상기 형질전환체의 세포 표면에서 GABA(gamma-aminobutyric acid)로 생물전환(bioconversion)시키는 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 글루타민산은 MSG(monosodium glutamate)인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제9항에 있어서,
    상기 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산의 유도체는 상기 배양액 내에 5g/l 내지 35g/l의 농도로 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제9항에 있어서,
    상기 배양액의 pH는 1.0 내지 3.0인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제7항의 형질전환체; 및 글루타민산 또는 글루타민산 유도체를 포함하는 GABA 생산용 조성물.
14. 제7항의 형질전환체를 포함하는 용액에 글루타민산(glutamic acid) 또는 글루타민산 유도체를 처리하는 단계를 포함하는, GABA 생산 방법.

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