CN109790557B - 控制生物膜分散以产生氨基酸或氨基酸衍生产物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供遗传修饰成过表达生物膜分散多肽以提高微生物的赖氨酸和赖氨酸衍生物产生的微生物，产生这类微生物的方法，以及用遗传修饰的微生物产生赖氨酸和赖氨酸衍生物的方法。

Description

控制生物膜分散以产生氨基酸或氨基酸衍生产物
发明背景
分子出入细胞的能力可对分子胞内浓度产生显著影响。例如，若分子是营养物，则减缓分子移入细胞会抑制生长(Herbert,D&HL Kornberg,Biochem.J.156(2),477-480,1976)。若分子是毒素，则减缓分子移出细胞会抑制生长。若分子是反应的底物，则减缓分子移入细胞会减慢反应速率。若分子是一系列反应的中间物，则减缓分子移出细胞和允许其在细胞内积累可能会导致反馈抑制(Kikuchi等,FEMS Microbiology Letters 173:211-215,1999；Ogawa-Miyata等,Biosci.Biotechnol.Biochem.65:1149-1154,2001)。
先前关于产生氨基酸如赖氨酸和氨基酸衍生产物如尸胺的研究聚焦于涉及细胞代谢的基因过表达或衰减。这些修饰增加引起所需产物生成的通量，并减少引起副产物或对形成所需产物不需要的其它代谢物生成的通量。然而，需要增加氨基酸和其衍生产物产生的额外方法。
发明内容
本公开部分基于以下意外发现：通过降低二-(3’-5’)-环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)胞内浓度来增加生物膜分散影响氨基酸如赖氨酸和其衍生产物如尸胺的生成。尽管多种基因显示水解c-di-GMP和增加生物膜分散活性(如来自大肠杆菌(E.coli)的bdcA或yahA；来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的rapA、fleN、rocR或bifA；来自霍乱弧菌(V.cholerae)的vieA或mbaA；和来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的rmdAB)，通过降低胞内c-di-GMP浓度来增加生物膜分散活性对氨基酸或其衍生物产生的任何影响未知。因此，一方面，本发明提供遗传修饰的微生物，其中生物膜分散多肽相对于相同菌株的不含所述遗传修饰的对应微生物过表达。在一些实施方式中，所述微生物通过向微生物中引入表达载体来遗传修饰，所述表达载体包含编码生物膜分散多肽的核酸序列。在一些实施方式中，通过引入多拷贝的内源生物膜分散多肽编码基因到基因组内和/或用异源启动子增加内源基因表达，所述微生物被遗传修饰为过表达所述内源生物膜分散多肽。
一方面，本发明提供遗传修饰的的宿主细胞，其包含编码生物膜分散多肽的异源核酸，其中所述宿主细胞过表达生物膜分散多肽且相对于未修饰对应宿主细胞具有增加的氨基酸或其衍生物产生。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽是BdcA或YahA多肽。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的生物膜分散多肽序列具有至少70％相同性或者至少75％、80％、85％、90％或95％相同性。在一些实施方式中，编码所述生物膜分散多肽的异源核酸由引入细胞的表达载体编码，其中所述表达载体包括与启动子可操作连接的所述异源核酸。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽对宿主细胞而言是内源的。在一些实施方式中，所述异源核酸整合入宿主染色体。在一些实施方式中，所述遗传修饰的宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶和/或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞过表达TetA多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。在一些实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽是BdcA或YahA多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞过表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC或TetA多肽。在一些实施方式中，所述氨基酸是赖氨酸且氨基酸衍生物是尸胺。
另一方面，本发明提供产生氨基酸或其衍生物的方法，所述方法包括在生物膜分散多肽过表达的条件下，培养本文所述(如前面段落所述)遗传修饰的宿主细胞。在一些实施方式中，所述氨基酸是赖氨酸且氨基酸衍生物是尸胺。
另一方面，本发明提供改造宿主细胞以增加氨基酸或其衍生物产生的方法，所述方法包括向宿主细胞引入编码生物膜分散多肽的异源核酸，并在表达异源生物膜分散多肽的条件下培养宿主细胞，其中相对于未修饰对应对照宿主细胞，生物膜分散多肽的表达增加赖氨酸或赖氨酸衍生物的产生。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽是BdcA或YahA多肽。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽与具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示序列的生物膜分散多肽具有至少70％相同性或者至少75％、80％、85％、90％或95％相同性。在一些实施方式中，编码所述生物膜分散多肽的异源核酸由引入细胞的表达载体编码，其中表达载体包括与启动子可操作连接的所述异源核酸。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽对宿主细胞而言是内源的。在一些实施方式中，所述异源核酸整合入宿主染色体。在一些实施方式中，所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶和/或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞过表达TetA多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属。在一些实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒状杆菌。在一些实施方式中，所述生物膜分散多肽是BdcA或YahA多肽。在一些实施方式中，所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶多肽和LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC；或TetA多肽。在一些实施方式中，所述氨基酸是赖氨酸且氨基酸衍生物是尸胺。
发明详述
描述本发明前，应理解本发明不限于所述特定实施方式，因为这当然可能变化。也应理解本文所用术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不意在限制。
除非另有说明，本文所用全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的任何方法与材料能用于实践或测试本发明，现在描述优选的方法与材料。本文提及的所有出版物和登录号通过引用纳入本文以结合引用的出版物来公开及描述方法和/或材料。
术语
本文所用的术语“生物膜”指形成含有活细胞的覆盖层(coating)的细菌聚集物，所述覆盖层在生物或非生物表面形成。形成生物膜的细胞通过胞外基质连接在一起，所述基质包括多种物质，包括多糖、脂质、蛋白或DNA。生物膜发展包括多个步骤：细胞移至界面，细胞与界面初始可逆附着，与界面不可逆附着，形成小聚集物，生物膜成熟和生物膜分散。
本文所用的术语“生物膜分散”指生物膜发展周期的最后阶段，其中细胞从生物膜分散到环境中。生物膜分散是可由多种内部和外部信号引起的被调节的过程。一些触发生物膜分散的信号是营养不足、氧耗竭和细胞所产生毒性化合物浓度突然增加。
如本公开上下文所用，“生物膜分散多肽”指减少胞内c-di-GMP水平的多肽。这种多肽可通过隔绝化合物或代谢c-di-GMP来降低胞内c-di-GMP水平。当由遗传修饰成相较野生型对应宿主细胞过表达生物膜分散多肽的宿主细胞生成时，根据本公开减少胞内c-di-GMP水平的多肽通常使水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％或更多，所述野生型对应宿主细胞未遗传修饰成过表达生物膜分散多肽。
术语“生物膜分散多肽”涵盖本文所述特定多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。编码生物膜分散多肽的核酸指基因、前体mRNA、mRNA等，包括编码本文所述特定氨基酸序列的变体、等位基因、突变体和种间同源物的核酸。
一种调节生物膜分散的第二信使是二-(3’-5’)-环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)，c-di-GMP能结合多种蛋白以调节其转录、翻译、酶活性和与其它蛋白的相互作用。已鉴定具有催化c-di-GMP水解成二核苷酸5’-pGpG的磷酸二酯酶活性的生物膜分散多肽(参见例如Karatan和Watnick,2009的综述)。这些具有磷酸二酯酶活性的多肽的一类保守结构特征是EAL(也称为DUF2)蛋白结构域，所述结构域包含许多保守的酸性氨基酸残基且表征为特征性基序谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸(参见例如Schmidt等,2005)。EAL结构域包含结合c-di-GMP的共有多肽序列基序EAL(谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸)。具有结合c-di-GMP能力的蛋白中所见另一蛋白结构域是PilZ结构域，如大肠杆菌YcgR中所发现的(Benach等,EMBO J.26,5153-5166,2007)。PilZ结构域中结合c-di-GMP的多肽序列基序是RXXXR(精氨酸-三个氨基酸-精氨酸)和(D/N)XSXXG(天冬氨酸/天冬酰胺-氨基酸-丝氨酸-两个氨基酸-甘氨酸)。YahA被注释为具有EAL蛋白结构域且证实对c-di-GMP具有磷酸二酯酶活性(Sundruyal等,J.Biol.Chem.289,6978-6990,2014)。尽管BdcA未注释为具有EAL结构域或PilZ结构域，但BdcA包含与结合c-di-GMP的蛋白相关的EAL和RXXXR基序。另外，BdcA包含与PelZ(D/N)XSXXG c-di-GMP结合基序类似的IGSXXG(异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-两个氨基酸-甘氨酸)多肽序列。IGSXXG多肽序列也在来自大肠杆菌的lon蛋白酶(Lon)中与RXXXR结合基序一起发现。尽管Lon也未注释为具有EAL或PelZ蛋白结构域，由于其多肽序列中存在上面的多肽基序，预测其结合c-di-GMP。也确认Lon确实结合c-di-GMP(Osbourne DO等.Bioengineered5:4,1-5,2014)。Ma等,Environ Microbiol 13,631-642,2011也用HPLC显示结合c-di-GMP的BdcA，但用差示扫描荧光法同样观察到BdcA确实不结合c-di-GMP以及另一辅因子NADPH(Lord等.PLOS One 9:9,e105751,2014)。BdcA显示生物膜分散活性的能力通过其在异源宿主中的表达来进一步证实，其中其也引起生物膜分散(Ma等.BMC Research Notes 4:447,1-10,2011)。因此，EAL、RXXXR或IGSXXG多肽序列基序是蛋白是否结合c-di-GMP或作用于与c-di-GMP相互作用途径的重要决定因子。在SEQ ID NO:4中EAL、RXXXR和IGSXXG基序带下划线，在SEQ ID NO:6中注释的EAL结构域带下划线且EAL基序以粗体显示。因此，在一个实施方式中，本公开所述生物膜分散多肽结合c-di-GMP。在一些实施方式中，本公开所述生物膜分散多肽具有磷酸二酯酶活性。在一些实施方式中，本公开所述生物膜分散多肽是BdcA或YahA。
“BdcA”多肽指具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的大肠杆菌BdcA多肽，或其生物活性变体。生物活性变体包括大肠杆菌BdcA多肽的等位基因、突变体和种间同源物。来自其它物种的说明性BdcA多肽包括鲍氏志贺菌(Shigella boydii)蛋白序列登录号EIQ22376.1；弗氏志贺菌(Shigella flexneri)蛋白序列登录号WP_000500714.1；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)蛋白序列登录号CDK74929.1；和肠杆菌(Enterobacteriaceaesp)蛋白序列登录号WP_004203956.1。“BdcA”多肽与SEQ ID NO:4的BdcA多肽具有至少60％氨基酸序列相同性，通常至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸序列相同性，优选在SEQ ID NO:4的BdcA多肽至少约50、100、150或200或更多个氨基酸的区域上，或在SEQ ID NO:4的BdcA多肽的长度上。本文所用的“BdcA多核苷酸”指编码BdcA多肽的多核苷酸。例如当在实施例章节所述的双质粒系统中测试时，生物活性变体能提高氨基酸如赖氨酸或氨基酸衍生物如尸胺的产生。
“YahA”多肽指具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的大肠杆菌YahA多肽，或其具有磷酸二酯酶活性的生物活性变体。生物活性变体包括大肠杆菌YahA多肽的等位基因、突变体和种间同源物。来自其它物种的说明性YahA多肽包括肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)蛋白序列登录号WP_052944055.1；肺炎克雷伯菌蛋白序列登录号EOY80439.1；宋内志贺菌(Shigella sonnei)蛋白序列登录号CSQ46493.1；和艾伯特埃希菌(Escherichiaalbertii)蛋白序列登录号WP_00432879.1。“YahA”多肽与SEQ ID NO:6的YahA多肽具有至少60％氨基酸序列相同性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸序列相同性，优选在SEQ ID NO:6的YahA多肽至少约50、100或更多个氨基酸的区域上，或在SEQ ID NO:6的YahA多肽长度上。本文所用的“YahA多核苷酸”指编码YahA多肽的多核苷酸。
关于生物膜分散多肽的术语“增加表达”和“过表达”在本文中可互换使用，指遗传修饰的细胞(已经引入编码生物膜分散多肽的表达构建体的细胞)中的生物膜分散多肽量相较没有所述遗传修饰的对应细胞(即相同菌株的没有修饰的细胞)的生物膜分散多肽量增加。与对应未修饰细胞相比，用于本申请目的的表达水平增加是至少5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。未修饰细胞不需要表达生物膜分散多肽。因此，术语“过表达”也包括实施方式，其中生物膜分散多肽在天然不表达所述生物膜分散多肽的宿主细胞中表达。生物膜分散多肽表达增加能通过许多测定评价，包括但不限于测量从生物膜分散多肽基因转录的RNA水平、生物膜分散多肽水平和/或生物膜分散多肽活性水平。
生物膜分散多肽变体如YahA多肽变体的磷酸二酯酶活性包括但不限于使c-di-GMP水解成二核苷酸5’-pGpG的能力。磷酸二酯酶活性能用任何方法测量。例如，磷酸二酯酶活性可如下测定：在缓冲液如75mM Tris,250mM NaCl,25mM KCl和10mM MgCl2中用[32P]c-di-GMP孵育纯化蛋白。然后，反应的等分样品能点样在PEI-纤维素上并允许干燥。核苷酸用含TLC在1.5M KH2PO4分离并用磷酸成象呈现。或者，磷酸二酯酶活性可用带放射性标记c-di-GMP通过HPLC评价，如Schmidt等,J.Bacteriol.187,4774-4781,2005所述。相较天然YahA，本发明的YahA变体通常具有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的磷酸二酯酶活性。
本公开的生物膜分散多肽的活性如YahA或BdcA生物膜分散多肽变体的活性，能用反映生物膜分散活性的任何功能测定评价，包括提高氨基酸或氨基酸衍生物产生。实施例章节提供说明性测定。
如本文所用，在产生氨基酸如赖氨酸或赖氨酸衍生物如尸胺的上下文中的术语“提高”指遗传修饰的宿主细胞的赖氨酸或衍生物产生相较对照对应细胞(如野生型菌株细胞或不具有增加氨基酸或氨基酸衍生物产生的遗传修饰的相同菌株的细胞)增加。氨基酸或其衍生物产生相较对照细胞提高至少5％，通常至少0％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。
术语“编号参照于”或“对应于”或“参照……确定”在用于编号给定氨基酸或多核苷酸序列的上下文时，指给定氨基酸或多核苷酸序列与指定参照序列相比较时，所述参照序列的残基的编号。例如，BdcA多肽变体或同源物中的残基“对应于”SEQ ID NO:4某一位置的氨基酸，其中在SEQ ID NO:4与所述同源物或变体的最大对齐的比较中，该残基与该氨基酸对齐。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用并指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物，从5'读到3'末端。用于本发明的核酸一般包含磷酸二酯键，尽管在一些情况中，可使用核酸类似物，其可具有替代主链，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺酯连接(参见Eckstein,《寡核苷酸和类似物：实用方法》(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach),牛津大学出版社(OxfordUniversity Press))；正电荷主链；非离子型主链和非核糖主链。核酸或多核苷酸也可包括允许聚合酶正确通读的修饰核苷酸。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括核酸的有义和反义链，作为个体单链或在双链体中。如本领域技术人员所理解，单链的描述也定义互补链的序列；因而本文所述序列也提供序列互补物。除非另有说明，特定核酸序列还隐含其变体(如简并密码子取代)和互补序列，以及明确显示的序列。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸可包含脱氧核糖-核苷酸和核糖-核苷酸的组合，以及碱基组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。
用于2种核酸或多肽上下文的术语“基本相同”指与参照序列有至少40％、45％或50％序列相同性的序列。相同性百分比可以是50％-100％的任何整数。一些实施方式包括用本文所述程序的相较于参照序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；所述程序优选用标准参数的BLAST，如下所述。
如果就下述以最大对应性对齐时，2种核酸序列或多肽序列中核苷酸或氨基酸残基的序列分别相同，2种序列被称为“相同”。在2种或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“相同性”指2种或更多序列或子序列，当在比较窗口中就最大对应性比较和对齐(如用一种以下序列比较算法或手动对齐和肉眼观察所测)时，其相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。当涉及蛋白或肽使用序列相同性百分比时，认识到不相同的残基位置通常差异在于保守型氨基酸取代，其中氨基酸残基取代化学性质相似(如电荷或疏水性)的其它氨基酸并因而不改变分子的功能特性。序列的差异在于保守性取代时，序列相同性百分比可上调以针对取代的保守性质进行校正。作出这种调整的方式为本领域技术人员熟知。通常，这涉及将保守取代作为部分错配而不是完全错配打分，从而增加序列相同性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸给予1分且非保守取代给予零分时，保守取代给予0至1之间的分数。
对于序列比较，通常一种序列用作参照序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试和参照序列输入计算机，若需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或能指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数来计算测试序列相对于参照序列的序列相同性百分比。
一种可用于确定生物膜分散多肽是否与SEQ ID NO:4或6或另一多肽参照序列有序列相同性的算法是BLAST算法，其描述于Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215:403-410，所述内容通过引入纳入本文。进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心公开可得(万维网网址为ncbi.nlm.nih.gov/)。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。其它可使用的程序包括Needleman-Wunsch程序,J.MoI.Biol.48:443-453(1970),采用BLOSUM62，空位起始罚分7和空位延伸罚分1；缺口BLAST 2.0(参见Altschul等.1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)。
本文所用的“比较窗口”包括选自下组的任何数目连续位置的区段：20-600，通常约50-约200，更常约100-约150，其中2种序列最优对齐后，序列可与具有相同数目连续位置的参照序列作比较。对齐序列以比较的方法为本领域熟知。可实施序列最优对齐以比较，例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性对齐算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package(Genetics Computer Group，威斯康星州麦迪逊科学路575号)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机实施，或通过手动对齐和目测。
与参照序列基本相同的核酸或蛋白序列包括“保守修饰变体”。对于特定核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或如果核酸不编码氨基酸序列，指基本相同序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置，该密码子能变成所述任意对应密码子，而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一个种类。编码多肽的本文每种核酸序列也描述核酸的每种可能沉默变异。技术人员会认识到，核酸的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)能修饰成产生功能相同分子。因此，编码多肽的核酸中的每个沉默变异隐含于各所述序列。
对于氨基酸序列，技术人员会认识到，改变编码序列内单一氨基酸或小部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列中个体取代是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表为本领域熟知。以此方式定义的氨基酸组示例可包括：“带电荷/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳香或环组”，包括Pro(脯氨酸或P)、Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)和Trp(色氨酸或W)；和“脂肪族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。各组内，还可鉴定亚组。例如，带电荷/极性氨基酸组可细分成亚组，包括：含Lys、Arg和His的“带正电亚组”；含Glu和Asp的“带负电亚组”；以及含Asn和Gln的“极性亚组”。另一个示例中，芳香或环组可细分成亚组，包括：含Pro、His和Trp的“氮环亚组”；含Phe和Tyr的“苯基亚组”。另外一个示例中，脂肪族组可细分成亚组，包括：含Val、Leu和Ile的“大脂肪族非极性亚组”；含Met、Ser、Thr和Cys的“脂肪族小极性亚组”；以及含Gly和Ala的“小残基亚组”。保守突变示例包括上面亚组内氨基酸的氨基酸取代，例如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，从而能维持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，从而能维持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，从而能维持游离--OH；以及Gln取代Asn或反之亦然，从而能维持游离--NH2。下列6组各包含进一步提供彼此间说明性保守取代的氨基酸。1)Ala、Ser、Thr；2)Asp、Glu；3)Asn、Gln；4)Arg、Lys；5)Ile、Leu、Met、Val；和6)Phe、Try、和Trp(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
本文所用的术语“启动子”指能驱动DNA序列在细胞中转录的多核苷酸序列。因此，用于本发明多核苷酸构建体的启动子包括参与调节或调控基因转录时间和/或速度的顺式和反式作用转录控制元件以及调节序列。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、抑制子结合序列等。这些顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子相互作用以完成(开/关、调节、调控等)基因转录。核心启动子序列最常位于翻译起始位点的1-2kb内，更常在翻译起始位点的1kbp内且通常在500bp或200bp或更少之内。根据惯例，启动子序列通常作为其控制的基因编码链上的序列提供。在本申请的上下文中，启动子一般以其天然调节表达的基因名称提及。用于本发明表达构建体的启动子由基因名称提及。通过名称提及启动子包括野生型、天然启动子以及保留诱导表达能力的启动子变体。通过名称提及启动子不限于特定物种，而且也涵盖来自其它物种对应基因的启动子。
本发明上下文中的“组成型启动子”指能在大部分条件下(例如在没有诱导分子的情况下)起始细胞中转录的启动子。“诱导型启动子”在诱导物分子存在情况下起始转录。
如果其源自外来物种，或如果其来自同一物种而从其原始形式修饰，则多核苷酸对生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，当编码多肽序列的多核苷酸被称为可操作连接异源启动子时，意味着编码多肽的多核苷酸编码序列衍生自一种物种，而启动子序列衍生自另一不同物种；或如果两者都衍生自同一物种，编码序列天然不与启动子相关联(例如遗传改造的编码序列，如来自同一物种的不同基因，或来自不同生态型或品种的等位基因)。类似地，如果天然野生型宿主细胞不产生多肽，则多肽对宿主细胞是“异源的”。
术语“外源”一般指在野生型细胞或生物体中不天然存在，但一般通过分子生物学技术引入细胞(即改造以产生重组微生物)的多核苷酸序列或多肽。“外源”多核苷酸的示例包括编码期望的蛋白或酶的载体、质粒和/或人造核酸构建体。
术语“内源”指天然产生的多核苷酸序列或多肽，其可在给定野生型细胞或生物体中发现。在这方面，也注意到尽管生物体可包括给定多核苷酸序列或基因的内源拷贝，引入编码该序列的质粒或载体代表该基因或多核苷酸序列的“外源”拷贝，所述引入用于过表达或另外调节编码蛋白的表达。本文所述任何通路、基因或酶可使用或依靠“内源”序列，其可作为一种或多种“外源”多核苷酸序列来提供，或两者皆可。
本文所用的“重组核酸”或“重组多核苷酸”指核酸聚合物，其中至少以下一种是真实的：(a)核酸序列对给定宿主细胞是外来的(即未天然发现)；(b)序列可在给定宿主细胞中天然发现，但量是非天然的(如高于预期)；或(c)核酸序列包括2种或更多子序列，其天然未发现相同的彼此关系。例如，关于例子(c)，重组核酸序列具有来自不相关基因的2种或更多序列，所述序列排列成产生新的功能性核酸。
术语“可操作连接”指2个或更多的多核苷酸(如DNA)区段之间的功能关系。通常，这指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，若启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调节DNA或RNA序列转录，则其可操作连接DNA或RNA序列。一般，可操作连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上连续，即它们顺式作用。然而，一些转录调节序列如增强子，不需要与其增强转录的编码序列在物理上连续或位置上靠近。
术语“表达盒”或“DNA构建体”或“表达构建体”指核酸构建体，当其引入宿主细胞中时，分别引起RNA或多肽的转录和/或翻译。在转基因表达的情况中，技术人员将认识到，插入的多核苷酸序列不必与其衍生的基因序列相同，但可以与其衍生的基因序列仅基本相同。如本文所解释，通过提及特异核酸序列，特别地涵盖这些基本相同的变体。表达盒的一个示例是多核苷酸构建体，包括编码本发明蛋白多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作连接启动子如其天然启动子，其中表达盒被引入异源微生物。在一些实施方式中，表达盒包括编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中多核苷酸被靶向微生物基因组中的位置，从而多核苷酸序列表达由微生物内存在的启动子驱动。
用于本发明上下文的术语“宿主细胞”指微生物且包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明任何重组载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代，由于自然、意外或特意的突变和/或改变，该后代不必与初始亲代细胞完全相同(形态上或总DNA互补上)。宿主细胞包括引入(包括通过转化、转染等)本发明重组载体或多核苷酸的细胞。
术语“分离的”指基本或本质上没有在其天然状态中伴随其的组分。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”可指与在其天然存在或基因组状态侧翼的序列分离的多核苷酸，如从通常毗邻片段的序列中移出的DNA片段，如通过克隆入载体。例如，若多核苷酸克隆到不是自然环境一部分的载体内，或若其以不同于其天然存在状态的方式人工引入细胞基因组，则认为多核苷酸是分离的。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等指没有其它细胞组分的多肽分子，即其不与体内物质相关联。
本公开的多个方面
本公开部分基于以下发现：一种或多种生物膜分散多肽在微生物如革兰氏阴性细菌中的表达增加提高氨基酸如赖氨酸的产生和/或赖氨酸的氨基酸衍生物如尸胺的产生。根据本发明过表达的生物膜分散多肽通常是有EAL蛋白基序的多肽。
改造成过表达生物膜分散多肽的宿主细胞通常也改造成过表达酶以合成氨基酸衍生物，如赖氨酸脱羧酶多肽和/或参与氨基酸生物合成的额外多肽。赖氨酸脱羧酶和赖氨酸生物合成多肽以及核酸序列为本领域熟知。
本发明采用多种常规重组核酸技术。一般，下述重组DNA技术的命名法和实验室程序常用于本领域。许多提供实施重组DNA操作指南的手册可得，如Sambrook&Russell,《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)(第3版,2001)；和《最新分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等,纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons),2009-2014)。
编码生物膜分散多肽的多核苷酸
多种多核苷酸显示编码水解c-di-GMP并增加生物膜分散活性的多肽(如来自大肠杆菌的bdcA或yahA；来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的rapA、fleN、rocR或bifA；来自霍乱弧菌(V.cholerae)的vieA或mbaA；和来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的rmdAB)。
适用于本发明的生物膜分散核酸和多肽序列包括编码SEQ NO:4或6中任一项所示生物膜分散多肽或其基本相同的变体的生物膜分散核酸序列。这种变体通常与SEQ NO:4或6之一或替代的生物膜分散多肽如SEQ NO:4或6的同源物，具有至少70％或至少75％、80％、85％或90％相同性。本文所用的术语“变体”涵盖相对于生物膜分散多肽参照序列(如SEQNO:4或6)具有一个或多个取代、缺失或插入的生物活性多肽。因此，术语“变体”包括生物活性片段以及取代变体。
在一些实施方式中，本公开的生物膜分散多肽具有水解二-(3’-5’)-环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)的磷酸二酯酶活性，c-di-GMP是调节生物膜分散的第二信使。这些多肽具有称为EAL(也称为DUF2)蛋白结构域的保守结构特征。EAL结构域包含许多保守的酸性氨基酸残基且表征为特征性基序谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸(参见例如Schmidt等,JBacteriol.187:4774-4781,2005，通过引用纳入)。具有磷酸二酯酶活性的说明性生物膜分散YahA多肽序列在SEQ ID NO:6中提供。已确定YahA晶体结构。该蛋白显示具有修饰的TIM-桶式折叠(Sundruyal等,J.Biol.Chem.289,6978-6990,2014)。此折叠由其它带EAL结构域和生物膜分散活性的磷酸二酯酶蛋白共有，如来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的RocR(Chen等,J.Bacteriol.194,4837-4846,2012)。EAL结构域(PfamPF00563)为约250个氨基酸且在SEQ ID NO:6中带下划线。图1显示来自不同细菌物种多种蛋白的EAL结构域比对。如前面Schmidt等,J.Bacteriol.187,4774-4781,2005所述，尽管EAL结构域序列中的总体同源性是约30％，结构域内有若干个氨基酸保守序列。
在一些实施方式中，本公开所述生物膜分散多肽是BdcA多肽。一种说明性序列作为SEQ ID NO:4提供。BdcA具有特异性结合NADPH的Rossman折叠。BdcA在天然微生物大肠杆菌中且当在其它微生物中异源表达时，减少胞内c-di-GMP浓度(Ma等,BMC Research Notes4:447,2011)。SEQ ID NO:4包含短EAL序列(aa 91-93)并形成二聚体，如YahA和其它c-di-GMP磷酸二酯酶一样，但不显示体内磷酸二酯酶活性。图2显示SEQ ID NO:4与来自其它物种的同源物比对。
技术人员能获得生物膜分散多肽变体，使用本领域可用的序列比对和结构分析以鉴定保守结构内的预期会保留生物膜分散多肽功能残基以及耐受取代的残基。例如，Schmidt等,J Bacteriol.187:4774-4781,2005显示YahA的纯化EAL结构域足以水解c-di-GMP。
生物膜分散多肽活性能用许多测定评价，包括评估氨基酸或氨基酸衍生化合物产生的测定。一种说明性测定测量大肠杆菌的赖氨酸产生，所述大肠杆菌被修饰为共表达在一个质粒上的LysC、DapA、LysA、Asd、DapB,AspC和TetA，以及在第二质粒上的BdcA或YahA或生物分散多肽变体。各质粒具有独特的抗生素抗性选择标记。选择和培养抗生素抗性菌落。例如，培养物在3mL培养基中37℃过夜生长，所述培养基含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)。第二天，各培养物接种到50mL新鲜培养基中，所述培养基含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)，并在37℃生长72小时，在该处，各培养物的尸胺浓度用NMR定量，将产生的尸胺摩尔量除以加入的赖氨酸葡萄糖量来计算收率。用于本发明的生物膜分散多肽提高赖氨酸或尸胺收率。或者，就增加的赖氨酸产生或另一赖氨酸衍生物的产生来评估菌落。
生物膜分散多核苷酸序列的分离或产生能通过多种技术完成。这样的技术在生物膜分散基因的上下文中讨论。然而，技术人员理解，同一技术能用于分离和表达其它期望的基因。在一些实施方式中，基于本文所公开序列的寡核苷酸探针能用于鉴定来自期望的细菌物种的cDNA或基因组DNA文库中的期望的多核苷酸。探针可用于和基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物物种中的同源基因。
或者，感兴趣的核酸能用常规扩增技术扩增自核酸样品。例如，PCR可用于直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增基因序列。PCR和其它体外扩增方法也可有用，例如用于克隆编码待表达蛋白的核酸序列，制备核酸以用作检测样品中所需mRNA存在的探针，用于核酸测序，或用于其它目的。
用于鉴定细菌中生物膜分散多核苷酸的合适引物和探针能产生自本文所提供序列的比较。PCR的总体概述参见PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications.(Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.和White,T.,编),圣地亚哥的学术出版社(AcademicPress)(1990)。说明性引物序列如实施例章节的引物表所示。
编码本公开所用生物膜分散多肽的核酸序列包括通过诸如杂交和/或序列分析等技术使用说明性核酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5识别和鉴定的基因及基因产物。在一些实施方式中，宿主细胞通过引入核酸序列来遗传修饰，所述核酸序列与含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多核苷酸有至少60％相同性，或至少70％、75％、80％、85％或90％相同性或100％相同性。
编码生物膜分散多肽的核酸序列可另外针对在期望的宿主细胞中的表达进行密码子优化，所述多肽赋予宿主细胞增加的氨基酸如赖氨酸或氨基酸衍生产物例如尸胺生成。能采用的方法和数据库为本领域已知。例如，优选的密码子可涉及以下确定：单一基因、一组具有共同功能或来源的基因、高表达基因的密码子使用，整个生物体的聚合蛋白编码区中的密码子频率，相关生物体的聚合蛋白编码区中的密码子频率，或其组合。参见例如Henaut和Danchin，收录于"大肠杆菌和沙门氏菌(Escherichia coli and Salmonella),"Neidhardt等.编,华盛顿特区的ASM出版社(ASM Pres)(1996),第2047-2066页；NucleicAcids Res.20:2111-2118；Nakamura等,2000,Nucl.Acids Res.28:292)。
制备重组载体
用于表达生物膜分散多肽的重组载体能用本领域熟知的方法制备。例如，编码生物膜分散多肽的DNA序列(如下进一步详述)能组合转录及其它调节序列，所述调节序列会指导来自基因的序列在预期细胞如细菌细胞例如大肠杆菌中的转录。在一些实施方式中，包括含编码生物膜分散多肽的基因的表达盒的表达载体进一步包括可操作连接生物膜分散基因的启动子。在其它实施方式中，指导生物膜分散基因转录的启动子和/或其它调节序列对宿主细胞而言是内源的，且含生物膜分散基因的表达盒被引入(如通过同源重组)使得外源基因可操作连接内源启动子并由内源启动子驱动表达。
如上所示，编码生物膜分散多肽的基因表达能通过一些调节序列控制，包括启动子，其可以是组成型或诱导型；以及若需要，包括可选的抑制子序列。合适启动子特别是在细菌宿主细胞中的示例是获自大肠杆菌lac操纵子的启动子和其它衍生自参与其它糖如半乳糖和麦芽糖代谢的基因的启动子。另外的示例包括启动子如trp启动子、bla启动子噬菌体λPL和T5。另外，能使用合成启动子如tac启动子(美国专利号4,551,433)。其它启动子示例包括天蓝色链霉菌琼脂糖基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因。合适的启动子也描述于Ausubel和Sambrook&Russell,同上。额外的启动子包括Jensen&Hammer,Appl.Environ.Microbiol.64:82,1998；Shimada等,J.Bacteriol.186:7112,2004；和Miksch等,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:312,2005所述启动子。
在一些实施方式中，可修饰影响天然生物膜分散多肽表达的启动子以增加表达。例如，内源BdcA或YahA启动子可由提供相较天然启动子表达增加的启动子取代。
表达载体也可包括影响生物膜分散多肽编码基因表达的额外序列。这类序列包括增强子序列、核糖体结合位点或其它序列如转录终止序列等。
表达编码本发明生物膜分散多肽的核酸的载体可以是自主复制载体，即载体作为染色体外实体存在，其复制独立于染色体复制，如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于确保自我复制的任何手段。或者，载体可以是在引入宿主时，整合入基因组并与其整合入的染色体一起复制的载体。因此，表达载体可额外包含允许载体整合入宿主基因组的元件。
本发明的表达载体优选包含一个或多个选择标记，其允许方便地选择已转化的宿主。例如，表达载体可包括向重组生物体如细菌细胞例如大肠杆菌赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。
尽管任何合适的表达载体可用于掺入期望的序列，可容易获得的细菌表达载体包括但不限于：质粒如pSClOl、pBR322、pBBRlMCS-3、pUR、pET、pEX、pMRlOO、pCR4、pBAD24、p15a、pACYC、pUC例如pUC18或pUC19，或衍生自这些质粒的质粒；和噬菌体，如Ml 3噬菌体和λ噬菌体。然而，本领域普通技术人员能通过常规实验容易地确定任意特定表达载体是否适合任意给定宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主细胞，随后监测其活力和载体所含序列的表达。
本发明的表达载体可用许多熟知方法引入宿主细胞，包括基于氯化钙的方法、电穿孔或本领域已知的任何其它方法。
宿主细胞
本发明提供遗传修饰的宿主细胞，所述细胞改造成过表达生物膜分散多肽。这种宿主细胞可包括编码异源生物膜分散多肽的核酸，所述异源生物膜分散多肽包括任何非天然存在的生物膜分散多肽变体；或可遗传修饰成相对于野生型宿主细胞过表达天然或内源的生物膜分散多肽。
遗传修饰的本发明宿主菌株通常包括至少一种额外遗传修饰以相对于不具有所述一种额外遗传修饰的对照菌株(如野生型菌株或相同菌株的不具有所述一种额外遗传修饰的细胞)提高氨基酸或氨基酸衍生物产生。“提高氨基酸或氨基酸衍生物产生的额外遗传修饰”可以是任何遗传修饰。在一些实施方式中，所述遗传修饰是引入多核苷酸，所述多核苷酸表达参与氨基酸或氨基酸衍生物合成的酶。在一些实施方式中，所述宿主细胞包括多种修饰以相对于野生型宿主细胞提高氨基酸或氨基酸衍生物产生。
在一些方面，宿主细胞过表达生物膜分散多肽的遗传修饰与修饰宿主细胞以过表达赖氨酸脱羧酶多肽和/或一种或多种赖氨酸生物合成多肽结合进行。
赖氨酸脱羧酶指将L-赖氨酸转变成尸胺的酶。该酶归类为E.C.4.1.1.18。赖氨酸脱羧酶多肽是研究透彻的酶，其结构为本领域熟知(参见例如Kanjee等,EMBO J.30:931-944,2011；和Lemmonier&Lane,Microbiology 144；751-760,1998的综述；以及其中描述的参考文献)。赖氨酸脱羧酶的EC号是4.1.1.18。说明性赖氨酸脱羧酶序列是来自以下的CadA同源物：克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.),WP 012968785.1；产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes),YP 004592843.1；肠道沙门氏菌(Salmonella enterica),WP 020936842.1；沙雷氏菌属(Serratia sp.),WP 033635725.1；和解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica),YP 007874766.1；以及来自以下的LdcC同源物：志贺氏菌属(Shigellasp.),WP 001020968.1；柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.),WP 016151770.1；和肠道沙门氏菌,WP 001021062.1。本文所用的赖氨酸脱羧酶包括具有赖氨酸脱羧酶活性的天然赖氨酸脱羧酶变体。其它赖氨酸脱羧酶描述于PCT/CN2014/080873和PCT/CN2015/072978。
在一些实施方式中，宿主细胞可以遗传修饰成表达一种或多种影响赖氨酸生物合成的多肽。赖氨酸生物合成多肽的示例包括大肠杆菌基因SucA、Ppc、AspC、LysC、Asd、DapA、DapB、DapD、ArgD、DapE、DapF、LysA、Ddh、PntAB、CyoABE、GadAB、YbjE、GdhA、GltA、SucC、GadC、AcnB、PflB、ThrA、AceA、AceB、GltB、AceE、SdhA、MurE、SpeE、SpeG、PuuA、PuuP和YgjG，或来自其它生物体的对应基因。这类基因为本领域已知(参见例如Shah等,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.Recent Patents on Biotechnol.1:11-24,2007)。还参见Kind等,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011关于参与尸胺生成的基因的综述。编码赖氨酸生物合成多肽的说明性基因如下所提供。
Figure GDA0001970026490000181
Figure GDA0001970026490000191
在一些实施方式中，宿主细胞可遗传修饰成减弱或降低影响赖氨酸生物合成的一种或多种多肽表达。这种多肽的示例包括大肠杆菌基因Pck、Pgi、DeaD、CitE、MenE、PoxB、AceA、AceB、AceE、RpoC和ThrA，或来自其它生物体的对应基因。这类基因为本领域已知(参见例如Shah等,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.Recent Patents onBiotechnol.1:11-24,2007)。还参见Kind,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011关于减弱以增加尸胺生成的基因的综述。以下提供编码多肽的说明性基因，所述多肽的减弱可增加赖氨酸生物合成。
Figure GDA0001970026490000201
编码赖氨酸脱羧酶或赖氨酸生物合成多肽的核酸可与生物膜分散多核苷酸一起引入宿主细胞，如在单一表达载体上编码，或在多个表达载体中同时引入。或者，在宿主细胞遗传修饰成过表达生物膜分散多肽之前或之后，宿主细胞可遗传修饰成过表达赖氨酸脱羧酶或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。
在替代的实施方式中，过表达天然存在的生物膜分散多肽的宿主细胞能通过其它技术获得，如通过诱变细胞，如大肠杆菌细胞，并筛选细胞以鉴定以高于诱变前细胞的水平表达生物膜分散多肽如BdcA或YahA的那些细胞。
含本文所述生物膜分散多肽的宿主细胞是细菌宿主细胞。在典型的实施方式中，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌宿主细胞。在本发明的一些实施方式中，所述细菌是肠内细菌。在本发明的一些实施方式中，所述细菌是棒状杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克洛诺菌属(Cronobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、哈夫尼菌属、耶尔森菌属(Yersinia)、摩根菌属(Morganella)、爱德华菌属(Edwardsiella)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)分类。在一些实施方式中，所述宿主细胞是埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属的成员。在一些实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒状杆菌宿主细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌宿主细胞，如芽孢杆菌物种(Bacillus sp.)例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；或另一芽孢杆菌物种如嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、噬胺芽胞杆菌(B.aminovorans)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(、B.stearothermophilus)、嗜热葡萄糖苷酶地衣芽胞杆菌(B.thermoglucosidasius)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或B.vulgatis。
如本文所述，可就赖氨酸或赖氨酸衍生物如尸胺生成增加来筛选根据本发明修饰的宿主细胞。
产生赖氨酸或赖氨酸衍生物的方法
遗传修饰成过表达生物膜分散多肽的宿主细胞能用于产生赖氨酸或赖氨酸衍生物。在一些实施方式中，所述宿主细胞产生尸胺。为产生赖氨酸或赖氨酸衍生物，遗传修饰成过表达本文所述生物膜分散多肽的宿主细胞可以在适合允许所述多肽表达和编码用于生成赖氨酸或赖氨酸衍生物的酶的基因表达的条件下培养。相对于以天然水平表达生物膜分散多肽的未修饰对应宿主细胞，根据本发明修饰的宿主细胞提供赖氨酸或赖氨酸衍生物的更高产率。
宿主细胞可用熟知的技术培养(参见例如实施例章节提供的说明性条件)。
赖氨酸或赖氨酸衍生物随后用已知技术分离和纯化。根据本发明产生的赖氨酸或赖氨酸衍生物如尸胺随后可用于任何已知工艺，如用于产生聚酰胺。
在一些实施方式中，使用化学催化剂或通过使用酶和化学催化剂，赖氨酸可转变成己内酰胺。
本发明通过具体实施例更详细描述。提供下列实施例用于说明目的，而不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易识别多种非关键参数，其能改变或修改以产生本质上相同的结果。
实施例
实施例1：构建编码CadA的质粒载体。
含野生型大肠杆菌cadA(SEQ ID NO:1)(其编码赖氨酸脱羧酶CadA(SEQ ID NO:2))的质粒载体用PCR引物cadA-F和cadA-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18内以产生质粒pCIB60。cadA基因上游的5’序列用PCR引物cadA-F2和cadA-R2优化以生成pCIB71。
实施例2：构建表达生物膜分散多肽的质粒载体。
编码生物膜分散蛋白BdcA(SEQ ID NO:4)的大肠杆菌基因bdcA(SEQ ID NO:3)用PCR引物bdcA-F和bdcA-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18质粒载体内以产生pCIB85。bdcA基因上游的5’序列用PCR引物bdcA-F2和bdcA-R2优化以产生pCIB119。类似地，编码生物膜分散蛋白YahA(SEQ ID NO:6)的yahA(SEQID NO:5)使用引物yahA-F和yahA-R克隆到pUC18质粒载体内以产生质粒pCIB107。yahA基因上游的5’序列用PCR引物yahA-F2和yahA-R2优化以产生pCIB162。
实施例3：构建编码四环素流出泵的质粒载体。
合成启动子序列(SEQ ID NO:7)用PCR引物psyn-1和psyn-2合成。引物psyn-1包含启动子序列和与pUC18同源的序列，引物psyn-2包含与pUC18同源的序列。这2种PCR引物用于扩增包含来自质粒的插入合成启动子序列下游的多克隆位点的pUC18部分。限制酶EcoRI和ScaI用于消化含合成启动子的扩增DNA，其进一步连接到pUC18中以构建pCIB10。
编码四环素流出泵TetA(SEQ ID NO:9)的tetA基因(SEQ ID NO:8)用PCR引物tetA-F和tetA-R扩增自大肠杆菌克隆载体pBR322。扩增的DNA用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pCIB10质粒载体内以产生pCIB20。
实施例4：构建共表达含有来自赖氨酸生物合成通路的3种蛋白(LysC、DapA、LysA) 的合成操纵子I的质粒载体。
来自大肠杆菌lysC、dapA和lysA的3个基因编码参与大肠杆菌赖氨酸生物合成通路的蛋白：天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC编码)、二氢吡啶二羧酸合成酶(DapA或DHDPS，由dapA编码)和二氨基庚酸脱羧酶(LysA，由lysA编码)。所述3个基因克隆到质粒载体内，且3种蛋白LysC(SEQ ID NO:11)、DapA(SEQ ID NO:13)和LysA(SEQ ID NO:15)在大肠杆菌中过表达。基因lysC用引物lysC-F和lysC-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，扩增的片段用SacI和BamHI消化，并连接到pUC18内以产生pCIB7。基因dapA用引物dapA-F和dapA-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，扩增的片段用SacI和BamHI消化，并连接到pCIB7内以产生pCIB8。基因lysA用引物lysA-F和lysA-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，扩增的片段用XbaI和SalI消化，并连接到pCIB8内以产生pCIB9。三基因操纵子用引物lysC-F和lysA-R扩增自pCIB9。扩增的产物用SacI和SalI消化，消化的片段连接到pCIB10内以产生pCIB32。基因tetA用引物tetA-F3和tetA-R3扩增自pCIB20，扩增的产物用SbfI和XhoI消化，并连接到pCIB32内以产生质粒pCIB42。
实施例5：构建共表达多种天冬氨酸激酶的质粒载体。表达多种天冬氨酸激酶以增 加赖氨酸产生。
选择2对突变，所述突变能使大肠杆菌天冬氨酸激酶III(LysC or AKIII，由lysC编码，SEQ ID NO:10)对赖氨酸的反馈抗性增加。编码第一突变体LysC-1的基因(M318I,G323D)(SEQ.ID NO:17)用引物318-F、318-R、323-F、323-R构建。编码LysC-1的基因(M318I,G323D)克隆到pCIB32内并取代野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶LysC以产生质粒pCIB43。之前提示了来自链霉菌(Streptomyces)菌株、能生成聚赖氨酸的天冬氨酸激酶，相较大肠杆菌天冬氨酸激酶对赖氨酸的反馈抗性更强，但未证实。如此，来自变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的天冬氨酸激酶基因进行密码子优化、合成并克隆到pCIB32中取代野生型lysC，以用引物SlysC-F和SlysC-R产生质粒pCIB55。所得表达的天冬氨酸激酶蛋白称为S-LysC(SEQ ID NO:19)。
实施例6：构建共表达含有来自赖氨酸生物合成通路的3种蛋白(Asd、DapB、DapD、 AspC)的合成操纵子II的质粒载体。
然后，提高4个额外基因asd、dapB、dapD和aspC的表达，所述基因参与大肠杆菌赖氨酸生物合成通路。这些基因编码下列酶：天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd(SEQ ID NO:21)，由asd编码)，二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB或DHDPR(SEQ ID NO:23)，由dapB编码)，四氢吡啶二羧酸酶琥珀酰酶(DapD(SEQ ID NO:25)，由dapD编码)和天冬氨酸转氨酶(AspC(SEQ IDNO:27)，由aspC编码)。基因asd用引物asd-F和asd-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，扩增的片段用SacI和BamHI消化，并连接到pUC18内以产生pCIB12。基因dapB用引物dapB-F和dapB-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，扩增的片段用BamHI和XbaI消化，并连接到pCIB12内以产生pCIB13。基因dapD用引物dapD-F和dapD-R扩增自大肠杆菌MG1655K12基因组DNA，扩增的片段用XbaI和SalI消化，并连接到pCIB13内以产生pCIB14。类似地，基因aspC用引物aspC-F和aspC-R扩增自大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA，扩增的片段用XbaI和SalI消化，并连接到pCIB13内以产生pCIB31。基因tetA用引物tetA-F3和tetA-R3扩增自pCIB20，扩增的片段用XhoI和SphI消化，并分别连接到pCIB14和pCIB31内以产生质粒pCIB15及pCIB59。
实施例7：构建共表达含有来自赖氨酸生物合成通路的蛋白的合成操纵子I和II的 质粒载体。
2种合成操纵子即合成操纵子I和合成操纵子II合并到单一载体内，所述操纵子由基因lysC、dapA、lysA、asd、dapB和aspC组成。来自pCIB32的由基因lysC、dapA和lysA组成的操纵子用引物LAL-F和LAL-R扩增。来自pCIB59的由基因asd、dapB和aspC组成的操纵子用引物ABC-F和ABCT-R扩增，且tetA基因用引物ABC-F和ABCT-R扩增。产物用限制酶ApaI和KpnI消化。pCIB32和pCIB59的消化产物连接形成pCIB103-1。类似地，含有不同天冬氨酸激酶的合成操纵子I变体与合成操纵子II组合。含LysC-1的合成操纵子I变体用引物LAL-F和LAL-R扩增自pCIB43，消化，并与pCIB59的消化产物连接形成pCIB103-2。含S-LysC的合成操纵子I变体用引物SAL-F和SAL-R扩增自pCIB55，消化，并与pCIB59的消化产物连接形成pCIB103-3。
实施例8：从过表达赖氨酸合成操纵子I和II的大肠杆菌产生赖氨酸。
大肠杆菌MG1655 K12用以下质粒之一转化：pCIB20、pCIB103-1、pCIB103-2或pCIB103-3，以制备各菌株：CIB20、CIB103-1、CIB103-2或CIB103-3(图2)。来自各转化的3个单菌落在3mL培养基中37℃过夜生长，所述培养基含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸和四环素(10μg/mL)。第二天，各培养物接种至100mL含30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2和四环素(10μg/mL)的新鲜培养基，并在37℃生长72小时，在该处确定各培养物的赖氨酸浓度(表1)。
表1.含合成操纵子I和II的大肠杆菌菌株的赖氨酸产生。
Figure GDA0001970026490000251
如表1所示，过量产生的不同天冬氨酸激酶变体(LysC-1、LysC-2、S-LysC)相较野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶(LysC)表达增加赖氨酸产生-比较就CIB103-1而言的1.0g/L与CIB103-2的6.6g/L、CIB103-3的6.0g/L。
实施例9：来自共同过表达编码生物膜分散蛋白的基因以及赖氨酸合成操纵子I和 II的大肠杆菌的赖氨酸产生。
CIB103-3用一种过表达生物膜分散蛋白之一的质粒转化：pCIB119或pCIB162，以分别产生菌株：CIB119或CIB162。
来自各转化的3个单菌落在3mL培养基中37℃过夜生长，所述培养基含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/mL)和四环素(10μg/mL)。第二天，各培养物接种到50mL新鲜培养基内，所述新鲜培养基含有40g/L葡萄糖、0.7％CaCO3、氨苄青霉素(100μg/mL)和四环素(10μg/mL)，并在37℃生长72小时，在该处确定各培养物的赖氨酸浓度(表2)。
表2.含赖氨酸合成操纵子I和II以及过量生成生物膜分散蛋白的大肠杆菌菌株的赖氨酸产生。
菌株 蛋白 赖氨酸(g/L)
CIB103-3 S-LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC、TetA 6.2±0.1
CIB119 S-LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC、TetA、BdcA 7.3±0.3
CIB162 S-LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC、TetA、YahA 6.9±0.2
如表2所示，编码生物膜蛋白的某些基因过表达可增加赖氨酸产生。过量生成的BdcA和YahA可增加赖氨酸产生-比较就CIB103-3而言的6.2g/L与CIB119的7.3g/L和CIB162的6.8g/L。
实施例10：构建共表达生物膜分散蛋白和CadA的质粒载体。
大肠杆菌生物膜分散基因bdcA和yahA用合适引物(bdcA-F3、bdcA-R3、yahA-F3、yahA-R3)如实施例2所述扩增，用XbaI和HindIII消化，并连接到pCIB71内以共表达生物膜分散基因与赖氨酸脱羧酶基因cadA。共表达cadA和bdcA的质粒是pCIB123，共表达cadA和yahA的质粒是pCIB163。
实施例11：来自共同过表达编码赖氨酸脱羧酶的基因以及赖氨酸合成操纵子I和 II的大肠杆菌的赖氨酸产生。
CIB103-1、CIB103-2和CIB103-3用pCIB71转化以构建菌株CIB71-1、CIB71-2和CIB71-3。CIB71-1、CIB71-2和CIB71-3都表达编码赖氨酸脱羧酶基因cadA的基因和6个赖氨酸生物合成基因。然而，CIB71-1表达野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC，CIB71-2表达突变反馈抗性天冬氨酸激酶lysC-1，CIB71-3表达野生型变铅青链霉菌(S.lividans)天冬氨酸激酶S-lysC。
来自各转化的3个单菌落在3mL培养基中37℃过夜生长，所述培养基含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)。第二天，各培养物接种到50mL新鲜培养基内，所述新鲜培养基含有40g/葡萄糖、0.7％CaCO3、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)，并在37℃生长72小时，在该处确定各培养物的赖氨酸浓度(表3)。
表3.含合成操纵子I和II以及共同生成CadA的大肠杆菌菌株的赖氨酸和尸胺产生。
Figure GDA0001970026490000271
如表3所示，过量生成CadA以及赖氨酸合成操纵子I和II可导致赖氨酸和尸胺两者的产生。
实施例12：来自共同过表达编码赖氨酸脱羧酶、生物膜分散蛋白的基因以及赖氨 酸合成操纵子I和II的大肠杆菌的尸胺产生。
CIB103-3用pCIB71、pCIB123或pCIB163转化以分别形成菌株CIB71-3、CIB123-3和CIB163-3。
来自各转化的3个单菌落在3mL培养基中37℃过夜生长，所述培养基含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)。第二天，各培养物接种到50mL新鲜培养基内，所述新鲜培养基含有40g/葡萄糖、0.7％CaCO3、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)，并在37℃生长72小时，在该处确定各培养物的赖氨酸浓度(表4)。
表4.含合成操纵子I和II以及共同生成CadA和生物膜分散蛋白的大肠杆菌菌株的赖氨酸及尸胺产生。
Figure GDA0001970026490000281
如表4所示，除了CadA以外还过量生成生物膜分散蛋白BdcA和YahA相较仅过量生成CadA的对照，在共表达赖氨酸合成操纵子I和II的大肠杆菌中引起总赖氨酸和尸胺产生的增加-比较就CIB71-3而言的6.0g/L与CIB123-3的7.2g/L。
实施例使用的质粒表
Figure GDA0001970026490000282
Figure GDA0001970026490000291
实施例使用的引物序列的表
Figure GDA0001970026490000292
Figure GDA0001970026490000301
说明性序列
SEQ ID NO:1大肠杆菌cadA核酸序列
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
SEQ ID NO:2CadA多肽序列
MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQA DGRYTVKVLKEESKK
SEQ ID NO:3大肠杆菌bdcA核酸序列
ATGGGCGCTTTTACAGGTAAGACAGTTCTCATCCTCGGTGGCAGTCGTGGTATCGGTGCCGCTATCGTACGTCGTTTCGTCACCGATGGGGCCAATGTACGATTCACCTATGCGGGGTCGAAAGATGCCGCTAAACGCCTGGCACAAGAGACTGGAGCGACAGCAGTATTCACAGATAGTGCTGACAGAGACGCTGTCATTGATGTCGTTCGTAAGAGCGGCGCATTGGATATCCTGGTGGTAAATGCAGGTATTGGCGTCTTTGGCGAGGCCCTGGAATTAAATGCCGACGATATTGATCGCCTTTTCAAAATCAATATTCATGCTCCTTATCATGCCTCTGTTGAAGCCGCCCGGCAGATGCCCGAAGGCGGGCGCATCTTAATCATCGGCTCCGTGAATGGCGATCGTATGCCTGTTGCAGGCATGGCTGCTTATGCCGCCAGCAAATCTGCCCTGCAAGGCATGGCGCGCGGGCTGGCCCGTGATTTTGGACCGCGTGGGATCACCATTAACGTCGTCCAGCCAGGGCCAATTGATACCGACGCTAATCCCGCCAACGGGCCAATGCGCGATATGTTGCATAGTTTGATGGCTATCAAAAGACATGGGCAACCGGAAGAGGTCGCTGGTATGGTCGCATGGTTAGCAGGGCCAGAAGCCAGTTTTGTTACCGGCGCGATGCATACCATTGATGGCGCGTTTGGCGCATAA
SEQ ID NO:4BdcA多肽序列
MGAFTGKTVLILGGSRGIGAAIVRRFVTDGANVRFTYAGSKDAAKRLAQETGATAVFTDSADRDAVIDVVRKSGALDILVVNAGIGVFGEALELNADDIDRLFKINIHAPYHASVEAARQMPEGGRILIIGSVNGDRMPVAGMAAYAASKSALQGMARGLARDFGPRGITINVVQPGPIDTDANPANGPMRDMLHSLMAIKRHGQPEEVAGMVAWLAGPEASFVTGAMHTIDGAFGA
SEQ ID NO:5大肠杆菌yahA核酸序列
ATGAATTCATGTGATTTTCGTGTTTTTCTGCAAGAGTTCGGTACAACGGTTCATTTGTCATTGCCTGGTAGCGTATCCGAGAAAGAACGACTGCTACTCAAGCTGCTGATGCAGGGAATGTCTGTAACAGAAATATCACAGTACAGAAATCGCAGTGCAAAGACAATTTCACATCAAAAGAAACAGCTCTTTGAGAAACTGGGGATTCAGAGCGATATTACTTTCTGGCGCGATATTTTCTTTCAGTACAATCCGGAGATCATATCCGCCACGGGGAGTAATAGTCACAGATATATTAATGATAATCACTATCACCATATCGTCACGCCTGAAGCCATCAGTCTGGCGTTGGAAAACCACGAATTCAAACCGTGGATCCAACCGGTTTTCTGCGCGCAGACTGGCGTACTGACGGGCTGTGAGGTGCTTGTCCGCTGGGAACATCCACAAACGGGAATTATCCCACCGGATCAGTTTATTCCTCTGGCGGAGTCATCCGGTCTTATTGTCATAATGACCCGCCAACTGATGAAACAGACTGCGGATATTCTGATGCCGGTAAAACATTTGCTGCCGGACAATTTCCATATTGGCATCAACGTCTCGGCGGGTTGTTTTTTGGCAGCGGGATTTGAAAAAGAGTGTCTGAACCTGGTTAATAAATTAGGTAACGATAAAATCAAGCTGGTTCTCGAGCTAACGGAACGTAACCCTATTCCGGTAACGCCAGAAGCCAGAGCGATATTTGACAGCCTTCATCAGCACAACATTACCTTTGCGCTGGATGACTTTGGTACGGGTTATGCGACCTATCGTTACTTGCAGGCGTTCCCGGTCGATTTTATTAAGATCGATAAGTCATTTGTGCAAATGGCGAGTGTCGACGAAATCTCCGGTCATATTGTGGACAATATTGTCGAACTAGCGCGTAAGCCTGGTCTGAGTATCGTGGCGGAAGGGGTAGAAACCCAGGAGCAGGCGGATTTAATGATCGGTAAAGGCGTTCACTTTTTGCAGGGCTATTTGTACTCTCCGCCAGTACCGGGTAATAAATTTATCTCTGAATGGGTAATGAAAGCAGGTGGTTGA
SEQ ID NO:6YahA多肽序列
MNSCDFRVFLQEFGTTVHLSLPGSVSEKERLLLKLLMQGMSVTEISQYRNRSAKTISHQKKQLFEKLGIQSDITFWRDIFFQYNPEIISATGSNSHRYINDNHYHHIVTPEAISLALENHEFKPWIQPVFCAQTGVLTGCEVLVRW EHPQTGIIPPDQFIPLAESSGLIVIMTRQLMKQTADILMPVKHLLPDNFHIGINVSAGCFLAAGFEKECLNLVNKLG NDKIKLVLELTERNPIPVTPEARAIFDSLHQHNITFALDDFGTGYATYRYLQAFPVDFIKIDKSFVQMASVDEISGH IVDNIVELARKPGLSIVAEGVETQEQADLMIGKGVHFLQGYLYSPPVPGNKFISEWVMKAGG
SEQ ID NO:7合成启动子核酸序列
AGTTTATTCTTGACATGTAGTGAGGGGGCTGGTATAAT
SEQ ID NO:8tetA核酸序列
ATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCATTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGA
SEQ ID NO:9TetA多肽序列
MKSNNALIVILGTVTLDAVGIGLVMPVLPGLLRDIVHSDSIASHYGVLLALYALMQFLCAPVLGALSDRFGRRPVLLASLLGATIDYAIMATTPVLWILYAGRIVAGITGATGAVAGAYIADITDGEDRARHFGLMSACFGVGMVAGPVAGGLLGAISLHAPFLAAAVLNGLNLLLGCFLMQESHKGERRPMPLRAFNPVSSFRWARGMTIVAALMTVFFIMQLVGQVPAALWVIFGEDRFRWSATMIGLSLAVFGILHALAQAFVTGPATKRFGEKQAIIAGMAADALGYVLLAFATRGWMAFPIMILLASGGIGMPALQAMLSRQVDDDHQGQLQGSLAALTSLTSIIGPLIVTAIYAASASTWNGLAWIVGAALYLVCLPALRRGAWSRATST
SEQ ID NO:10lysC核酸序列
ATGTCTGAAATTGTTGTCTCCAAATTTGGCGGTACCAGCGTAGCTGATTTTGACGCCATGAACCGCAGCGCTGATATTGTGCTTTCTGATGCCAACGTGCGTTTAGTTGTCCTCTCGGCTTCTGCTGGTATCACTAATCTGCTGGTCGCTTTAGCTGAAGGACTGGAACCTGGCGAGCGATTCGAAAAACTCGACGCTATCCGCAACATCCAGTTTGCCATTCTGGAACGTCTGCGTTACCCGAACGTTATCCGTGAAGAGATTGAACGTCTGCTGGAGAACATTACTGTTCTGGCAGAAGCGGCGGCGCTGGCAACGTCTCCGGCGCTGACAGATGAGCTGGTCAGCCACGGCGAGCTGATGTCGACCCTGCTGTTTGTTGAGATCCTGCGCGAACGCGATGTTCAGGCACAGTGGTTTGATGTACGTAAAGTGATGCGTACCAACGACCGATTTGGTCGTGCAGAGCCAGATATAGCCGCGCTGGCGGAACTGGCCGCGCTGCAGCTGCTCCCACGTCTCAATGAAGGCTTAGTGATCACCCAGGGATTTATCGGTAGCGAAAATAAAGGTCGTACAACGACGCTTGGCCGTGGAGGCAGCGATTATACGGCAGCCTTGCTGGCGGAGGCTTTACACGCATCTCGTGTTGATATCTGGACCGACGTCCCGGGCATCTACACCACCGATCCACGCGTAGTTTCCGCAGCAAAACGCATTGATGAAATCGCGTTTGCCGAAGCGGCAGAGATGGCAACTTTTGGTGCAAAAGTACTGCATCCGGCAACGTTGCTACCCGCAGTACGCAGCGATATCCCGGTCTTTGTCGGCTCCAGCAAAGACCCACGCGCAGGTGGTACGCTGGTGTGCAATAAAACTGAAAATCCGCCGCTGTTCCGCGCTCTGGCGCTTCGTCGCAATCAGACTCTGCTCACTTTGCACAGCCTGAATATGCTGCATTCTCGCGGTTTCCTCGCGGAAGTTTTCGGCATCCTCGCGCGGCATAATATTTCGGTAGACTTAATCACCACGTCAGAAGTGAGCGTGGCATTAACCCTTGATACCACCGGTTCAACCTCCACTGGCGATACGTTGCTGACGCAATCTCTGCTGATGGAGCTTTCCGCACTGTGTCGGGTGGAGGTGGAAGAAGGTCTGGCGCTGGTCGCGTTGATTGGCAATGACCTGTCAAAAGCCTGCGGCGTTGGCAAAGAGGTATTCGGCGTACTGGAACCGTTCAACATTCGCATGATTTGTTATGGCGCATCCAGCCATAACCTGTGCTTCCTGGTGCCCGGCGAAGATGCCGAGCAGGTGGTGCAAAAACTGCATAGTAATTTGTTTGAGTAA
SEQ ID NO:11LysC多肽序列
MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNMLHSRGFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE
SEQ ID NO:12dapA核酸序列
ATGTTCACGGGAAGTATTGTCGCGATTGTTACTCCGATGGATGAAAAAGGTAATGTCTGTCGGGCTAGCTTGAAAAAACTGATTGATTATCATGTCGCCAGCGGTACTTCGGCGATCGTTTCTGTTGGCACCACTGGCGAGTCCGCTACCTTAAATCATGACGAACATGCTGATGTGGTGATGATGACGCTGGATCTGGCTGATGGGCGCATTCCGGTAATTGCCGGGACCGGCGCTAACGCTACTGCGGAAGCCATTAGCCTGACGCAGCGCTTCAATGACAGTGGTATCGTCGGCTGCCTGACGGTAACCCCTTACTACAATCGTCCGTCGCAAGAAGGTTTGTATCAGCATTTCAAAGCCATCGCTGAGCATACTGACCTGCCGCAAATTCTGTATAATGTGCCGTCCCGTACTGGCTGCGATCTGCTCCCGGAAACGGTGGGCCGTCTGGCGAAAGTAAAAAATATTATCGGAATCAAAGAGGCAACAGGGAACTTAACGCGTGTAAACCAGATCAAAGAGCTGGTTTCAGATGATTTTGTTCTGCTGAGCGGCGATGATGCGAGCGCGCTGGACTTCATGCAATTGGGCGGTCATGGGGTTATTTCCGTTACGGCTAACGTCGCAGCGCGTGATATGGCCCAGATGTGCAAACTGGCAGCAGAAGGGCATTTTGCCGAGGCACGCGTTATTAATCAGCGTCTGATGCCATTACACAACAAACTATTTGTCGAACCCAATCCAATCCCGGTGAAATGGGCATGTAAGGAACTGGGTCTTGTGGCGACCGATACGCTGCGCCTGCCAATGACACCAATCACCGACAGTGGTCGTGAGACGGTCAGAGCGGCGCTTAAGCATGCCGGTTTGCTGTAA
SEQ ID NO:13DapA多肽序列
MFTGSIVAIVTPMDEKGNVCRASLKKLIDYHVASGTSAIVSVGTTGESATLNHDEHADVVMMTLDLADGRIPVIAGTGANATAEAISLTQRFNDSGIVGCLTVTPYYNRPSQEGLYQHFKAIAEHTDLPQILYNVPSRTGCDLLPETVGRLAKVKNIIGIKEATGNLTRVNQIKELVSDDFVLLSGDDASALDFMQLGGHGVISVTANVAARDMAQMCKLAAEGHFAEARVINQRLMPLHNKLFVEPNPIPVKWACKELGLVATDTLRLPMTPITDSGRETVRAALKHAGLL
SEQ ID NO:14lysA核酸序列
ATGCCACATTCACTGTTCAGCACCGATACCGATCTCACCGCCGAAAATCTGCTGCGTTTGCCCGCTGAATTTGGCTGCCCGGTGTGGGTCTACGATGCGCAAATTATTCGTCGGCAGATTGCAGCGCTGAAACAGTTTGATGTGGTGCGCTTTGCACAGAAAGCCTGTTCCAATATTCATATTTTGCGCTTAATGCGTGAGCAGGGCGTGAAAGTGGATTCCGTCTCGTTAGGCGAAATAGAGCGTGCGTTGGCGGCGGGTTACAATCCGCAAACGCACCCCGATGATATTGTTTTTACGGCAGATGTTATCGATCAGGCGACGCTTGAACGCGTCAGTGAATTGCAAATTCCGGTGAATGCGGGTTCTGTTGATATGCTCGACCAACTGGGCCAGGTTTCGCCAGGGCATCGGGTATGGCTGCGCGTTAATCCGGGGTTTGGTCACGGACATAGCCAAAAAACCAATACCGGTGGCGAAAACAGCAAGCACGGTATCTGGTACACCGATCTGCCCGCCGCACTGGACGTGATACAACGTCATCATCTGCAGCTGGTCGGCATTCACATGCACATTGGTTCTGGCGTTGATTATGCCCATCTGGAACAGGTGTGTGGTGCTATGGTGCGTCAGGTCATCGAATTCGGTCAGGATTTACAGGCTATTTCTGCGGGCGGTGGGCTTTCTGTTCCTTATCAACAGGGTGAAGAGGCGGTTGATACCGAACATTATTATGGTCTGTGGAATGCCGCGCGTGAGCAAATCGCCCGCCATTTGGGCCACCCTGTGAAACTGGAAATTGAACCGGGTCGCTTCCTGGTAGCGCAGTCTGGCGTATTAATTACTCAGGTGCGGAGCGTCAAACAAATGGGGAGCCGCCACTTTGTGCTGGTTGATGCCGGGTTCAACGATCTGATGCGCCCGGCAATGTACGGTAGTTACCACCATATCAGTGCCCTGGCAGCTGATGGTCGTTCTCTGGAACACGCGCCAACGGTGGAAACCGTCGTCGCCGGACCGTTATGTGAATCGGGCGATGTCTTTACCCAGCAGGAAGGGGGAAATGTTGAAACCCGCGCCTTGCCGGAAGTGAAGGCAGGTGATTATCTGGTACTGCATGATACAGGGGCATATGGCGCATCAATGTCATCCAACTACAATAGCCGTCCGCTGTTACCAGAAGTTCTGTTTGATAATGGTCAGGCGCGGTTGATTCGCCGTCGCCAGACCATCGAAGAATTACTGGCGCTGGAATTGCTTTAA
SEQ ID NO:15LysA多肽序列
MPHSLFSTDTDLTAENLLRLPAEFGCPVWVYDAQIIRRQIAALKQFDVVRFAQKACSNIHILRLMREQGVKVDSVSLGEIERALAAGYNPQTHPDDIVFTADVIDQATLERVSELQIPVNAGSVDMLDQLGQVSPGHRVWLRVNPGFGHGHSQKTNTGGENSKHGIWYTDLPAALDVIQRHHLQLVGIHMHIGSGVDYAHLEQVCGAMVRQVIEFGQDLQAISAGGGLSVPYQQGEEAVDTEHYYGLWNAAREQIARHLGHPVKLEIEPGRFLVAQSGVLITQVRSVKQMGSRHFVLVDAGFNDLMRPAMYGSYHHISALAADGRSLEHAPTVETVVAGPLCESGDVFTQQEGGNVETRALPEVKAGDYLVLHDTGAYGASMSSNYNSRPLLPEVLFDNGQARLIRRRQTIEELLALELL
SEQ ID NO:16lysC-1核酸序列
ATGTCTGAAATTGTTGTCTCCAAATTTGGCGGTACCAGCGTAGCTGATTTTGACGCCATGAACCGCAGCGCTGATATTGTGCTTTCTGATGCCAACGTGCGTTTAGTTGTCCTCTCGGCTTCTGCTGGTATCACTAATCTGCTGGTCGCTTTAGCTGAAGGACTGGAACCTGGCGAGCGATTCGAAAAACTCGACGCTATCCGCAACATCCAGTTTGCCATTCTGGAACGTCTGCGTTACCCGAACGTTATCCGTGAAGAGATTGAACGTCTGCTGGAGAACATTACTGTTCTGGCAGAAGCGGCGGCGCTGGCAACGTCTCCGGCGCTGACAGATGAGCTGGTCAGCCACGGCGAGCTGATGTCGACCCTGCTGTTTGTTGAGATCCTGCGCGAACGCGATGTTCAGGCACAGTGGTTTGATGTACGTAAAGTGATGCGTACCAACGACCGATTTGGTCGTGCAGAGCCAGATATAGCCGCGCTGGCGGAACTGGCCGCGCTGCAGCTGCTCCCACGTCTCAATGAAGGCTTAGTGATCACCCAGGGATTTATCGGTAGCGAAAATAAAGGTCGTACAACGACGCTTGGCCGTGGAGGCAGCGATTATACGGCAGCCTTGCTGGCGGAGGCTTTACACGCATCTCGTGTTGATATCTGGACCGACGTCCCGGGCATCTACACCACCGATCCACGCGTAGTTTCCGCAGCAAAACGCATTGATGAAATCGCGTTTGCCGAAGCGGCAGAGATGGCAACTTTTGGTGCAAAAGTACTGCATCCGGCAACGTTGCTACCCGCAGTACGCAGCGATATCCCGGTCTTTGTCGGCTCCAGCAAAGACCCACGCGCAGGTGGTACGCTGATGTGCAATAAAACTGAAAATCCGCCGCTGTTCCGCGCTCTGGCGCTTCGTCGCAATCAGACTCTGCTCACTTTGCACAGCCTGAATATACTGCATTCTCGCGATTTCCTCGCGGAAGTTTTCGGCATCCTCGCGCGGCATAATATTTCGGTAGACTTAATCACCACGTCAGAAGTGAGCGTGGCATTAACCCTTGATACCACCGGTTCAACCTCCACTGGCGATACGTTGCTGACGCAATCTCTGCTGATGGAGCTTTCCGCACTGTGTCGGGTGGAGGTGGAAGAAGGTCTGGCGCTGGTCGCGTTGATTGGCAATGACCTGCCAAAAGCCTGCGGCGTTGGCAAAGAGGTATTCGGCGTACTGGAACCGTTCAACATTCGCATGATTTGTTATGGCGCATCCAGCCATAACCTGTGCTTCCTGGTGCCCGGCGAAGATGCCGAGCAGGTGGTGCAAAAACTGCATAGTAATTTGTTTGAGTAA
SEQ ID NO:17LysC-1多肽序列
MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNILHSRDFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE
SEQ ID NO:18S-lysC核酸序列
ATGGGCTTAGTTGTGCAGAAATACGGCGGTAGTAGCGTGGCCGATGCCGAAGGCATCAAACGTGTTGCCAAACGCATTGTTGAAGCCAAAAAGAATGGTAATCAGGTTGTGGTTGTCGTTTCAGCAATGGGCGATACCACAGATGAACTTATTGATCTGGCCCAGGAAGTTAGCCCGATTCCGAGCGGTCGTGAATTTGATATGTTACTTACAGCCGGTGAACGTATTAGCATGGCCTTACTGGCCATGGCAATCAAAAATCTGGGTCACGAAGCCCAGAGCTTCACAGGTTCACAGGCCGGTGTTATTACAGATAGCGTTCATAATAAAGCGCGCATTATCGATGTTACCCCGGGTCGTATTAAAGCAAGCCTGGATGAAGGCAACATCGCCATTGTGGCAGGCTTTCAGGGTGTTAGCCAGGATAAAAAGGATATTACCACACTGGGTCGCGGTGGCAGCGATACAACGGCAGTGGCCCTGGCAGCCGCATTAAATGCAGATGTTTGTGAAATCTATACCGATGTTGATGGTGTTTTTACCGCAGATCCGCGCGTGGTTAAGAAAGCCCGTAAAATTGAATGGATCTCATTCGAAGATATGCTGGAATTAGCCAGCAGCGGTAGCAAAGTTCTGCTGCATCGTTGTGTTGAATATGCACGCCGTTACAATATTCCTATTCATGTTCGTTCAAGTTTTTCAGGTTTACAGGGCACATGGGTTAGCAATGAACCGCAGGGTGATCGTCCGATGGAACAGGCAATCATTAGCGGTGTTGCACATGATACCTCAGAAGCAAAAGTTACCGTTGTTGGTGTTCCGGATAAACCGGGCGAAGCAGCACGTATCTTTCGGGCCATTGCCGATTCAGAAGTGAATATCGACATGGTGGTTCAGAATGTTAGCGCAGCAAGCACCGGTCTGACCGATATTAGCTTTACCCTGCCGAAAGCAGAAGGTCGTAAAGCAGTTGCAGCACTGGAGAAAACCCGTGCAGCCGTGGGCTTTGATAGTTTACGGTATGATGATCAGATTGCAAAAATTAGCCTGGTTGGTGCAGGTATGAAAACCAATCCGGGTGTGACCGCAACCTTTTTTGAAGCATTAAGCAATGCAGGCGTTAATATTGAACTGATTAGCACCAGTGAAATTCGTATCAGCGTTGTGACCCGCGCAGATGATGTTAATGAAGCCGTTCAGGCAGTTCATAGCGCATTTGGTCTGGATAGCGAAACCGATGAAGCAGTGGTTTATGGCGGCACAGGTCGTTAA
SEQ ID NO:19S-LysC多肽序列
MGLVVQKYGGSSVADAEGIKRVAKRIVEAKKNGNQVVAVVSAMGDTTDELIDLAEQVSPIPAGRELDMLLTAGERISMALLAMAIKNLGHEAQSFTGSQAGVITDSVHNKARIIDVTPGRIRTSVDEGNVAIVAGFQGVSQDSKDITTLGRGGSDTTAVALAAALDADVCEIYTDVDGVFTADPRVVPKAKKIDWISFEDMLELAASGSKVLLHRCVEYARRYNIPIHVRSSFSGLQGTWVSSEPIKQGEKHVEQALISGVAHDTSEAKVTVVGVPDKPGEAAAIFRAIADAQVNIDMVVQNVSAASTGLTDISFTLPKSEGRKAIDALEKNRPGIGFDSLRYDDQIGKISLVGAGMKSNPGVTADFFTALSDAGVNIELISTSEIRISVVTRKDDVNEAVRAVHTAFGLDSDSDEAVVYGGTGR
SEQ ID NO:20asd核酸序列
ATGAAAAATGTTGGTTTTATCGGCTGGCGCGGTATGGTCGGCTCCGTTCTCATGCAACGCATGGTTGAAGAGCGCGACTTCGACGCCATTCGCCCTGTCTTCTTTTCTACTTCTCAGCTTGGCCAGGCTGCGCCGTCTTTTGGCGGAACCACTGGCACACTTCAGGATGCCTTTGATCTGGAGGCGCTAAAGGCCCTCGATATCATTGTGACCTGTCAGGGCGGCGATTATACCAACGAAATCTATCCAAAGCTTCGTGAAAGCGGATGGCAAGGTTACTGGATTGACGCAGCATCGTCTCTGCGCATGAAAGATGACGCCATCATCATTCTTGACCCCGTCAATCAGGACGTCATTACCGACGGATTAAATAATGGCATCAGGACTTTTGTTGGCGGTAACTGTACCGTAAGCCTGATGTTGATGTCGTTGGGTGGTTTATTCGCCAATGATCTTGTTGATTGGGTGTCCGTTGCAACCTACCAGGCCGCTTCCGGCGGTGGTGCGCGACATATGCGTGAGTTATTAACCCAGATGGGCCATCTGTATGGCCATGTGGCAGATGAACTCGCGACCCCGTCCTCTGCTATTCTCGATATCGAACGCAAAGTCACAACCTTAACCCGTAGCGGTGAGCTGCCGGTGGATAACTTTGGCGTGCCGCTGGCGGGTAGCCTGATTCCGTGGATCGACAAACAGCTCGATAACGGTCAGAGCCGCGAAGAGTGGAAAGGGCAGGCGGAAACCAACAAGATCCTCAACACATCTTCCGTAATTCCGGTAGATGGTTTATGTGTGCGTGTCGGGGCATTGCGCTGCCACAGCCAGGCATTCACTATTAAATTGAAAAAAGATGTGTCTATTCCGACCGTGGAAGAACTGCTGGCTGCGCACAATCCGTGGGCGAAAGTCGTTCCGAACGATCGGGAAATCACTATGCGTGAGCTAACCCCAGCTGCCGTTACCGGCACGCTGACCACGCCGGTAGGCCGCCTGCGTAAGCTGAATATGGGACCAGAGTTCCTGTCAGCCTTTACCGTGGGCGACCAGCTGCTGTGGGGGGCCGCGGAGCCGCTGCGTCGGATGCTTCGTCAACTGGCGTAA
SEQ ID NO:21Asd多肽序列
MKNVGFIGWRGMVGSVLMQRMVEERDFDAIRPVFFSTSQLGQAAPSFGGTTGTLQDAFDLEALKALDIIVTCQGGDYTNEIYPKLRESGWQGYWIDAASSLRMKDDAIIILDPVNQDVITDGLNNGIRTFVGGNCTVSLMLMSLGGLFANDLVDWVSVATYQAASGGGARHMRELLTQMGHLYGHVADELATPSSAILDIERKVTTLTRSGELPVDNFGVPLAGSLIPWIDKQLDNGQSREEWKGQAETNKILNTSSVIPVDGLCVRVGALRCHSQAFTIKLKKDVSIPTVEELLAAHNPWAKVVPNDREITMRELTPAAVTGTLTTPVGRLRKLNMGPEFLSAFTVGDQ
SEQ ID NO:22dapB核酸序列
ATGCATGATGCAAACATCCGCGTTGCCATCGCGGGAGCCGGGGGGCGTATGGGCCGCCAGTTGATTCAGGCGGCGCTGGCATTAGAGGGCGTGCAGTTGGGCGCTGCGCTGGAGCGTGAAGGATCTTCTTTACTGGGCAGCGACGCCGGTGAGCTGGCCGGAGCCGGGAAAACAGGCGTTACCGTGCAAAGCAGCCTCGATGCGGTAAAAGATGATTTTGATGTGTTTATCGATTTTACCCGTCCGGAAGGTACGCTGAACCATCTCGCTTTTTGTCGCCAGCATGGCAAAGGGATGGTGATCGGCACTACGGGGTTTGACGAAGCCGGTAAACAAGCAATTCGTGACGCCGCTGCCGATATTGCGATTGTCTTTGCTGCCAATTTTAGCGTTGGCGTTAACGTCATGCTTAAGCTGCTGGAGAAAGCAGCCAAAGTGATGGGTGACTACACCGATATCGAAATTATTGAAGCACATCATAGACATAAAGTTGATGCGCCGTCAGGCACCGCACTGGCAATGGGAGAGGCGATCGCCCACGCCCTTGATAAAGATCTGAAAGATTGCGCGGTCTACAGTCGTGAAGGCCACACCGGTGAACGTGTGCCTGGCACCATTGGTTTTGCCACCGTGCGTGCAGGTGACATCGTTGGTGAACATACCGCGATGTTTGCCGATATTGGCGAGCGTCTGGAGATCACCCATAAGGCGTCCAGCCGTATGACATTTGCTAACGGCGCGGTAAGATCGGCTTTGTGGTTGAGTGGTAAGGAAAGCGGTCTTTTTGATATGCGAGATGTACTTGATCTCAATAATTTGTAA
SEQ ID NO:23DapB多肽序列
MHDANIRVAIAGAGGRMGRQLIQAALALEGVQLGAALEREGSSLLGSDAGELAGAGKTGVTVQSSLDAVKDDFDVFIDFTRPEGTLNHLAFCRQHGKGMVIGTTGFDEAGKQAIRDAAADIAIVFAANFSVGVNVMLKLLEKAAKVMGDYTDIEIIEAHHRHKVDAPSGTALAMGEAIAHALDKDLKDCAVYSREGHTGERVPGTIGFATVRAGDIVGEHTAMFADIGERLEITHKASSRMTFANGAVRSALWLSGKESGLFDMRDVLDLNNL
SEQ ID NO:24dapD核酸序列
ATGCAGCAGTTACAGAACATTATTGAAACCGCTTTTGAACGCCGTGCCGAGATCACGCCAGCCAATGCAGACACCGTTACCCGCGAAGCGGTAAATCAGGTGATCGCCCTGCTGGATTCCGGCGCACTGCGTGTAGCGGAAAAAATTGACGGTCAGTGGGTGACGCATCAGTGGTTGAAAAAAGCGGTGCTGCTCTCTTTCCGTATTAATGATAATCAGGTGATCGAAGGGGCAGAAAGCCGCTACTTCGACAAAGTGCCGATGAAATTCGCCGACTACGACGAAGCACGTTTCCAGAAAGAAGGCTTCCGCGTTGTGCCACCAGCGGCGGTACGTCAGGGTGCGTTTATTGCCCGTAACACCGTGCTGATGCCGTCTTACGTCAACATCGGCGCATATGTTGATGAAGGCACCATGGTTGATACCTGGGCGACCGTCGGTTCTTGTGCGCAGATTGGTAAAAACGTCCACCTTTCCGGTGGCGTGGGCATCGGCGGCGTGCTGGAACCGCTGCAGGCTAACCCAACCATCATTGAAGATAATTGCTTCATCGGCGCGCGCTCTGAAGTGGTTGAAGGGGTGATTGTCGAAGAAGGTTCCGTCATTTCCATGGGCGTATACATTGGTCAGAGCACCCGTATTTACGACCGTGAAACCGGCGAAATCCACTACGGTCGCGTTCCGGCGGGGTCTGTGGTTGTTTCAGGTAATCTGCCGTCAAAAGATGGCAAATACAGCCTCTACTGTGCGGTTATCGTTAAGAAAGTTGACGCGAAAACTCGCGGCAAAGTCGGCATTAACGAACTGCTGCGTACCATCGACTAA
SEQ ID NO:25DapD多肽序列
MQQLQNIIETAFERRAEITPANADTVTREAVNQVIALLDSGALRVAEKIDGQWVTHQWLKKAVLLSFRINDNQVIEGAESRYFDKVPMKFADYDEARFQKEGFRVVPPAAVRQGAFIARNTVLMPSYVNIGAYVDEGTMVDTWATVGSCAQIGKNVHLSGGVGIGGVLEPLQANPTIIEDNCFIGARSEVVEGVIVEEGSVISMGVYIGQSTRIYDRETGEIHYGRVPAGSVVVSGNLPSKDGKYSLYCAVIVKKVDAKTRGKVGINELLRTID
SEQ ID NO:26aspC核酸序列
ATGTTTGAGAACATTACCGCCGCTCCTGCCGACCCGATTCTGGGCCTGGCCGATCTGTTTCGTGCCGATGAACGTCCCGGCAAAATTAACCTCGGGATTGGTGTCTATAAAGATGAGACGGGCAAAACCCCGGTACTGACCAGCGTGAAAAAGGCTGAACAGTATCTGCTCGAAAATGAAACCACCAAAAATTACCTCGGCATTGACGGCATCCCTGAATTTGGTCGCTGCACTCAGGAACTGCTGTTTGGTAAAGGTAGCGCCCTGATCAATGACAAACGTGCTCGCACGGCACAGACTCCGGGGGGCACTGGCGCACTACGCGTGGCTGCCGATTTCCTGGCAAAAAATACCAGCGTTAAGCGTGTGTGGGTGAGCAACCCAAGCTGGCCGAACCATAAGAGCGTCTTTAACTCTGCAGGTCTGGAAGTTCGTGAATACGCTTATTATGATGCGGAAAATCACACTCTTGACTTCGATGCACTGATTAACAGCCTGAATGAAGCTCAGGCTGGCGACGTAGTGCTGTTCCATGGCTGCTGCCATAACCCAACCGGTATCGACCCTACGCTGGAACAATGGCAAACACTGGCACAACTCTCCGTTGAGAAAGGCTGGTTACCGCTGTTTGACTTCGCTTACCAGGGTTTTGCCCGTGGTCTGGAAGAAGATGCTGAAGGACTGCGCGCTTTCGCGGCTATGCATAAAGAGCTGATTGTTGCCAGTTCCTACTCTAAAAACTTTGGCCTGTACAACGAGCGTGTTGGCGCTTGTACTCTGGTTGCTGCCGACAGTGAAACCGTTGATCGCGCATTCAGCCAAATGAAAGCGGCGATTCGCGCTAACTACTCTAACCCACCAGCACACGGCGCTTCTGTTGTTGCCACCATCCTGAGCAACGATGCGTTACGTGCGATTTGGGAACAAGAGCTGACTGATATGCGCCAGCGTATTCAGCGTATGCGTCAGTTGTTCGTCAATACGCTGCAGGAAAAAGGCGCAAACCGCGACTTCAGCTTTATCATCAAACAGAACGGCATGTTCTCCTTCAGTGGCCTGACAAAAGAACAAGTGCTGCGTCTGCGCGAAGAGTTTGGCGTATATGCGGTTGCTTCTGGTCGCGTAAATGTGGCCGGGATGACACCAGATAACATGGCTCCGCTGTGCGAAGCGATTGTGGCAGTGCTGTAA
SEQ ID NO:27AspC多肽序列
MFENITAAPADPILGLADLFRADERPGKINLGIGVYKDETGKTPVLTSVKKAEQYLLENETTKNYLGIDGIPEFGRCTQELLFGKGSALINDKRARTAQTPGGTGALRVAADFLAKNTSVKRVWVSNPSWPNHKSVFNSAGLEVREYAYYDAENHTLDFDALINSLNEAQAGDVVLFHGCCHNPTGIDPTLEQWQTLAQLSVEKGWLPLFDFAYQGFARGLEEDAEGLRAFAAMHKELIVASSYSKNFGLYNERVGACTLVAADSETVDRAFSQMKAAIRANYSNPPAHGASVVATILSNDALRAIWEQELTDMRQRIQRMRQLFVNTLQEKGANRDFSFIIKQNGMFSFSGLTKEQVLRLREEFGVYAVASGRVNVAGMTPDNMAPLCEAIVAVL
序列表
<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司
凯赛生物产业有限公司
<120> 控制生物膜分散以产生氨基酸或氨基酸衍生产物
<130> P2016TC305
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 715
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 3
<211> 714
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 3
atgggcgctt ttacaggtaa gacagttctc atcctcggtg gcagtcgtgg tatcggtgcc 60
gctatcgtac gtcgtttcgt caccgatggg gccaatgtac gattcaccta tgcggggtcg 120
aaagatgccg ctaaacgcct ggcacaagag actggagcga cagcagtatt cacagatagt 180
gctgacagag acgctgtcat tgatgtcgtt cgtaagagcg gcgcattgga tatcctggtg 240
gtaaatgcag gtattggcgt ctttggcgag gccctggaat taaatgccga cgatattgat 300
cgccttttca aaatcaatat tcatgctcct tatcatgcct ctgttgaagc cgcccggcag 360
atgcccgaag gcgggcgcat cttaatcatc ggctccgtga atggcgatcg tatgcctgtt 420
gcaggcatgg ctgcttatgc cgccagcaaa tctgccctgc aaggcatggc gcgcgggctg 480
gcccgtgatt ttggaccgcg tgggatcacc attaacgtcg tccagccagg gccaattgat 540
accgacgcta atcccgccaa cgggccaatg cgcgatatgt tgcatagttt gatggctatc 600
aaaagacatg ggcaaccgga agaggtcgct ggtatggtcg catggttagc agggccagaa 660
gccagttttg ttaccggcgc gatgcatacc attgatggcg cgtttggcgc ataa 714
<210> 4
<211> 237
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 4
Met Gly Ala Phe Thr Gly Lys Thr Val Leu Ile Leu Gly Gly Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Arg Phe Val Thr Asp Gly Ala Asn
20 25 30
Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Ser Lys Asp Ala Ala Lys Arg Leu Ala
35 40 45
Gln Glu Thr Gly Ala Thr Ala Val Phe Thr Asp Ser Ala Asp Arg Asp
50 55 60
Ala Val Ile Asp Val Val Arg Lys Ser Gly Ala Leu Asp Ile Leu Val
65 70 75 80
Val Asn Ala Gly Ile Gly Val Phe Gly Glu Ala Leu Glu Leu Asn Ala
85 90 95
Asp Asp Ile Asp Arg Leu Phe Lys Ile Asn Ile His Ala Pro Tyr His
100 105 110
Ala Ser Val Glu Ala Ala Arg Gln Met Pro Glu Gly Gly Arg Ile Leu
115 120 125
Ile Ile Gly Ser Val Asn Gly Asp Arg Met Pro Val Ala Gly Met Ala
130 135 140
Ala Tyr Ala Ala Ser Lys Ser Ala Leu Gln Gly Met Ala Arg Gly Leu
145 150 155 160
Ala Arg Asp Phe Gly Pro Arg Gly Ile Thr Ile Asn Val Val Gln Pro
165 170 175
Gly Pro Ile Asp Thr Asp Ala Asn Pro Ala Asn Gly Pro Met Arg Asp
180 185 190
Met Leu His Ser Leu Met Ala Ile Lys Arg His Gly Gln Pro Glu Glu
195 200 205
Val Ala Gly Met Val Ala Trp Leu Ala Gly Pro Glu Ala Ser Phe Val
210 215 220
Thr Gly Ala Met His Thr Ile Asp Gly Ala Phe Gly Ala
225 230 235
<210> 5
<211> 1089
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 5
atgaattcat gtgattttcg tgtttttctg caagagttcg gtacaacggt tcatttgtca 60
ttgcctggta gcgtatccga gaaagaacga ctgctactca agctgctgat gcagggaatg 120
tctgtaacag aaatatcaca gtacagaaat cgcagtgcaa agacaatttc acatcaaaag 180
aaacagctct ttgagaaact ggggattcag agcgatatta ctttctggcg cgatattttc 240
tttcagtaca atccggagat catatccgcc acggggagta atagtcacag atatattaat 300
gataatcact atcaccatat cgtcacgcct gaagccatca gtctggcgtt ggaaaaccac 360
gaattcaaac cgtggatcca accggttttc tgcgcgcaga ctggcgtact gacgggctgt 420
gaggtgcttg tccgctggga acatccacaa acgggaatta tcccaccgga tcagtttatt 480
cctctggcgg agtcatccgg tcttattgtc ataatgaccc gccaactgat gaaacagact 540
gcggatattc tgatgccggt aaaacatttg ctgccggaca atttccatat tggcatcaac 600
gtctcggcgg gttgtttttt ggcagcggga tttgaaaaag agtgtctgaa cctggttaat 660
aaattaggta acgataaaat caagctggtt ctcgagctaa cggaacgtaa ccctattccg 720
gtaacgccag aagccagagc gatatttgac agccttcatc agcacaacat tacctttgcg 780
ctggatgact ttggtacggg ttatgcgacc tatcgttact tgcaggcgtt cccggtcgat 840
tttattaaga tcgataagtc atttgtgcaa atggcgagtg tcgacgaaat ctccggtcat 900
attgtggaca atattgtcga actagcgcgt aagcctggtc tgagtatcgt ggcggaaggg 960
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tatttgtact ctccgccagt accgggtaat aaatttatct ctgaatgggt aatgaaagca 1080
ggtggttga 1089
<210> 6
<211> 362
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 6
Met Asn Ser Cys Asp Phe Arg Val Phe Leu Gln Glu Phe Gly Thr Thr
1 5 10 15
Val His Leu Ser Leu Pro Gly Ser Val Ser Glu Lys Glu Arg Leu Leu
20 25 30
Leu Lys Leu Leu Met Gln Gly Met Ser Val Thr Glu Ile Ser Gln Tyr
35 40 45
Arg Asn Arg Ser Ala Lys Thr Ile Ser His Gln Lys Lys Gln Leu Phe
50 55 60
Glu Lys Leu Gly Ile Gln Ser Asp Ile Thr Phe Trp Arg Asp Ile Phe
65 70 75 80
Phe Gln Tyr Asn Pro Glu Ile Ile Ser Ala Thr Gly Ser Asn Ser His
85 90 95
Arg Tyr Ile Asn Asp Asn His Tyr His His Ile Val Thr Pro Glu Ala
100 105 110
Ile Ser Leu Ala Leu Glu Asn His Glu Phe Lys Pro Trp Ile Gln Pro
115 120 125
Val Phe Cys Ala Gln Thr Gly Val Leu Thr Gly Cys Glu Val Leu Val
130 135 140
Arg Trp Glu His Pro Gln Thr Gly Ile Ile Pro Pro Asp Gln Phe Ile
145 150 155 160
Pro Leu Ala Glu Ser Ser Gly Leu Ile Val Ile Met Thr Arg Gln Leu
165 170 175
Met Lys Gln Thr Ala Asp Ile Leu Met Pro Val Lys His Leu Leu Pro
180 185 190
Asp Asn Phe His Ile Gly Ile Asn Val Ser Ala Gly Cys Phe Leu Ala
195 200 205
Ala Gly Phe Glu Lys Glu Cys Leu Asn Leu Val Asn Lys Leu Gly Asn
210 215 220
Asp Lys Ile Lys Leu Val Leu Glu Leu Thr Glu Arg Asn Pro Ile Pro
225 230 235 240
Val Thr Pro Glu Ala Arg Ala Ile Phe Asp Ser Leu His Gln His Asn
245 250 255
Ile Thr Phe Ala Leu Asp Asp Phe Gly Thr Gly Tyr Ala Thr Tyr Arg
260 265 270
Tyr Leu Gln Ala Phe Pro Val Asp Phe Ile Lys Ile Asp Lys Ser Phe
275 280 285
Val Gln Met Ala Ser Val Asp Glu Ile Ser Gly His Ile Val Asp Asn
290 295 300
Ile Val Glu Leu Ala Arg Lys Pro Gly Leu Ser Ile Val Ala Glu Gly
305 310 315 320
Val Glu Thr Gln Glu Gln Ala Asp Leu Met Ile Gly Lys Gly Val His
325 330 335
Phe Leu Gln Gly Tyr Leu Tyr Ser Pro Pro Val Pro Gly Asn Lys Phe
340 345 350
Ile Ser Glu Trp Val Met Lys Ala Gly Gly
355 360
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成启动子核酸序列
<400> 7
agtttattct tgacatgtag tgagggggct ggtataat 38
<210> 8
<211> 1191
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 8
atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60
ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120
atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180
cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240
cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300
gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360
gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420
ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480
gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540
atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600
agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660
atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720
tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780
ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840
atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900
tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960
caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020
gcggctctta ccagcctaac ttcgatcatt ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080
gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140
tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 1191
<210> 9
<211> 396
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 9
Met Lys Ser Asn Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Thr Leu
1 5 10 15
Asp Ala Val Gly Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu
20 25 30
Arg Asp Ile Val His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu
35 40 45
Leu Ala Leu Tyr Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly
50 55 60
Ala Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gly Ala Thr Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu
85 90 95
Trp Ile Leu Tyr Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr
100 105 110
Gly Ala Val Ala Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp
115 120 125
Arg Ala Arg His Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met
130 135 140
Val Ala Gly Pro Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His
145 150 155 160
Ala Pro Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu
165 170 175
Gly Cys Phe Leu Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met
180 185 190
Pro Leu Arg Ala Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly
195 200 205
Met Thr Ile Val Ala Ala Leu Met Thr Val Phe Phe Ile Met Gln Leu
210 215 220
Val Gly Gln Val Pro Ala Ala Leu Trp Val Ile Phe Gly Glu Asp Arg
225 230 235 240
Phe Arg Trp Ser Ala Thr Met Ile Gly Leu Ser Leu Ala Val Phe Gly
245 250 255
Ile Leu His Ala Leu Ala Gln Ala Phe Val Thr Gly Pro Ala Thr Lys
260 265 270
Arg Phe Gly Glu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Gly Met Ala Ala Asp Ala
275 280 285
Leu Gly Tyr Val Leu Leu Ala Phe Ala Thr Arg Gly Trp Met Ala Phe
290 295 300
Pro Ile Met Ile Leu Leu Ala Ser Gly Gly Ile Gly Met Pro Ala Leu
305 310 315 320
Gln Ala Met Leu Ser Arg Gln Val Asp Asp Asp His Gln Gly Gln Leu
325 330 335
Gln Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ile Ile Gly Pro
340 345 350
Leu Ile Val Thr Ala Ile Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Thr Trp Asn Gly
355 360 365
Leu Ala Trp Ile Val Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala
370 375 380
Leu Arg Arg Gly Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr
385 390 395
<210> 10
<211> 1350
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 10
atgtctgaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60
aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120
tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180
ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240
ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300
gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360
atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420
gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480
gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540
acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600
agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660
accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720
gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780
ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840
gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900
gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat 960
tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020
ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaacccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080
actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140
gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc 1200
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caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350
<210> 11
<211> 449
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 11
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165 170 175
Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195 200 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His
305 310 315 320
Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn
325 330 335
Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370 375 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys
385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405 410 415
Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
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Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
<210> 12
<211> 879
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 12
atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt 60
cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt 120
tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg 180
atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac 240
gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc 300
ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa 360
gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc 420
tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc 480
aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat 540
tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat 600
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acggtcagag cggcgcttaa gcatgccggt ttgctgtaa 879
<210> 13
<211> 292
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 13
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1 5 10 15
Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val
20 25 30
Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn
65 70 75 80
Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln
100 105 110
Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu
115 120 125
Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile
145 150 155 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu
165 170 175
Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn
195 200 205
Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly
210 215 220
His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His
225 230 235 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys
245 250 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260 265 270
Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His
275 280 285
Ala Gly Leu Leu
290
<210> 14
<211> 1263
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 14
atgccacatt cactgttcag caccgatacc gatctcaccg ccgaaaatct gctgcgtttg 60
cccgctgaat ttggctgccc ggtgtgggtc tacgatgcgc aaattattcg tcggcagatt 120
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attttgcgct taatgcgtga gcagggcgtg aaagtggatt ccgtctcgtt aggcgaaata 240
gagcgtgcgt tggcggcggg ttacaatccg caaacgcacc ccgatgatat tgtttttacg 300
gcagatgtta tcgatcaggc gacgcttgaa cgcgtcagtg aattgcaaat tccggtgaat 360
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aacagcaagc acggtatctg gtacaccgat ctgcccgccg cactggacgt gatacaacgt 540
catcatctgc agctggtcgg cattcacatg cacattggtt ctggcgttga ttatgcccat 600
ctggaacagg tgtgtggtgc tatggtgcgt caggtcatcg aattcggtca ggatttacag 660
gctatttctg cgggcggtgg gctttctgtt ccttatcaac agggtgaaga ggcggttgat 720
accgaacatt attatggtct gtggaatgcc gcgcgtgagc aaatcgcccg ccatttgggc 780
caccctgtga aactggaaat tgaaccgggt cgcttcctgg tagcgcagtc tggcgtatta 840
attactcagg tgcggagcgt caaacaaatg gggagccgcc actttgtgct ggttgatgcc 900
gggttcaacg atctgatgcg cccggcaatg tacggtagtt accaccatat cagtgccctg 960
gcagctgatg gtcgttctct ggaacacgcg ccaacggtgg aaaccgtcgt cgccggaccg 1020
ttatgtgaat cgggcgatgt ctttacccag caggaagggg gaaatgttga aacccgcgcc 1080
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tcaatgtcat ccaactacaa tagccgtccg ctgttaccag aagttctgtt tgataatggt 1200
caggcgcggt tgattcgccg tcgccagacc atcgaagaat tactggcgct ggaattgctt 1260
taa 1263
<210> 15
<211> 420
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 15
Met Pro His Ser Leu Phe Ser Thr Asp Thr Asp Leu Thr Ala Glu Asn
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu Pro Ala Glu Phe Gly Cys Pro Val Trp Val Tyr Asp
20 25 30
Ala Gln Ile Ile Arg Arg Gln Ile Ala Ala Leu Lys Gln Phe Asp Val
35 40 45
Val Arg Phe Ala Gln Lys Ala Cys Ser Asn Ile His Ile Leu Arg Leu
50 55 60
Met Arg Glu Gln Gly Val Lys Val Asp Ser Val Ser Leu Gly Glu Ile
65 70 75 80
Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Thr His Pro Asp Asp
85 90 95
Ile Val Phe Thr Ala Asp Val Ile Asp Gln Ala Thr Leu Glu Arg Val
100 105 110
Ser Glu Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Gly Ser Val Asp Met Leu Asp
115 120 125
Gln Leu Gly Gln Val Ser Pro Gly His Arg Val Trp Leu Arg Val Asn
130 135 140
Pro Gly Phe Gly His Gly His Ser Gln Lys Thr Asn Thr Gly Gly Glu
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Asn Ser Lys His Gly Ile Trp Tyr Thr Asp Leu Pro Ala Ala Leu Asp
165 170 175
Val Ile Gln Arg His His Leu Gln Leu Val Gly Ile His Met His Ile
180 185 190
Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ala His Leu Glu Gln Val Cys Gly Ala Met
195 200 205
Val Arg Gln Val Ile Glu Phe Gly Gln Asp Leu Gln Ala Ile Ser Ala
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Ser Val Pro Tyr Gln Gln Gly Glu Glu Ala Val Asp
225 230 235 240
Thr Glu His Tyr Tyr Gly Leu Trp Asn Ala Ala Arg Glu Gln Ile Ala
245 250 255
Arg His Leu Gly His Pro Val Lys Leu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Phe
260 265 270
Leu Val Ala Gln Ser Gly Val Leu Ile Thr Gln Val Arg Ser Val Lys
275 280 285
Gln Met Gly Ser Arg His Phe Val Leu Val Asp Ala Gly Phe Asn Asp
290 295 300
Leu Met Arg Pro Ala Met Tyr Gly Ser Tyr His His Ile Ser Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Asp Gly Arg Ser Leu Glu His Ala Pro Thr Val Glu Thr Val
325 330 335
Val Ala Gly Pro Leu Cys Glu Ser Gly Asp Val Phe Thr Gln Gln Glu
340 345 350
Gly Gly Asn Val Glu Thr Arg Ala Leu Pro Glu Val Lys Ala Gly Asp
355 360 365
Tyr Leu Val Leu His Asp Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ser Ser
370 375 380
Asn Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Val Leu Phe Asp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Ala Arg Leu Ile Arg Arg Arg Gln Thr Ile Glu Glu Leu Leu Ala
405 410 415
Leu Glu Leu Leu
420
<210> 16
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysC-1 核酸序列
<400> 16
atgtctgaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60
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ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300
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atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420
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gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540
acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600
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gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780
ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840
gacccacgcg caggtggtac gctgatgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900
gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatactgcat 960
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ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaacccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080
actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140
gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgcc aaaagcctgc 1200
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ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg 1320
caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350
<210> 17
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LysC-1 多肽序列
<400> 17
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn
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Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
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Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Ile Leu His
305 310 315 320
Ser Arg Asp Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn
325 330 335
Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370 375 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys
385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405 410 415
Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
<210> 18
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S-lysC 核酸序列
<400> 18
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ctggccatgg caatcaaaaa tctgggtcac gaagcccaga gcttcacagg ttcacaggcc 300
ggtgttatta cagatagcgt tcataataaa gcgcgcatta tcgatgttac cccgggtcgt 360
attaaagcaa gcctggatga aggcaacatc gccattgtgg caggctttca gggtgttagc 420
caggataaaa aggatattac cacactgggt cgcggtggca gcgatacaac ggcagtggcc 480
ctggcagccg cattaaatgc agatgtttgt gaaatctata ccgatgttga tggtgttttt 540
accgcagatc cgcgcgtggt taagaaagcc cgtaaaattg aatggatctc attcgaagat 600
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cgccgttaca atattcctat tcatgttcgt tcaagttttt caggtttaca gggcacatgg 720
gttagcaatg aaccgcaggg tgatcgtccg atggaacagg caatcattag cggtgttgca 780
catgatacct cagaagcaaa agttaccgtt gttggtgttc cggataaacc gggcgaagca 840
gcacgtatct ttcgggccat tgccgattca gaagtgaata tcgacatggt ggttcagaat 900
gttagcgcag caagcaccgg tctgaccgat attagcttta ccctgccgaa agcagaaggt 960
cgtaaagcag ttgcagcact ggagaaaacc cgtgcagccg tgggctttga tagtttacgg 1020
tatgatgatc agattgcaaa aattagcctg gttggtgcag gtatgaaaac caatccgggt 1080
gtgaccgcaa ccttttttga agcattaagc aatgcaggcg ttaatattga actgattagc 1140
accagtgaaa ttcgtatcag cgttgtgacc cgcgcagatg atgttaatga agccgttcag 1200
gcagttcata gcgcatttgg tctggatagc gaaaccgatg aagcagtggt ttatggcggc 1260
acaggtcgtt aa 1272
<210> 19
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S-LysC 多肽序列
<400> 19
Met Gly Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Val Ala Asp Ala
1 5 10 15
Glu Gly Ile Lys Arg Val Ala Lys Arg Ile Val Glu Ala Lys Lys Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Val Val Ala Val Val Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Ile Asp Leu Ala Glu Gln Val Ser Pro Ile Pro Ala Gly Arg
50 55 60
Glu Leu Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Met Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Met Ala Ile Lys Asn Leu Gly His Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Ile Thr Asp Ser Val His Asn Lys Ala Arg
100 105 110
Ile Ile Asp Val Thr Pro Gly Arg Ile Arg Thr Ser Val Asp Glu Gly
115 120 125
Asn Val Ala Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Ser Gln Asp Ser Lys
130 135 140
Asp Ile Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asp Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Thr Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Pro Lys Ala Lys Lys
180 185 190
Ile Asp Trp Ile Ser Phe Glu Asp Met Leu Glu Leu Ala Ala Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Val Leu Leu His Arg Cys Val Glu Tyr Ala Arg Arg Tyr Asn
210 215 220
Ile Pro Ile His Val Arg Ser Ser Phe Ser Gly Leu Gln Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ser Ser Glu Pro Ile Lys Gln Gly Glu Lys His Val Glu Gln Ala
245 250 255
Leu Ile Ser Gly Val Ala His Asp Thr Ser Glu Ala Lys Val Thr Val
260 265 270
Val Gly Val Pro Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Arg Ala
275 280 285
Ile Ala Asp Ala Gln Val Asn Ile Asp Met Val Val Gln Asn Val Ser
290 295 300
Ala Ala Ser Thr Gly Leu Thr Asp Ile Ser Phe Thr Leu Pro Lys Ser
305 310 315 320
Glu Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ala Leu Glu Lys Asn Arg Pro Gly Ile
325 330 335
Gly Phe Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Asp Gln Ile Gly Lys Ile Ser Leu
340 345 350
Val Gly Ala Gly Met Lys Ser Asn Pro Gly Val Thr Ala Asp Phe Phe
355 360 365
Thr Ala Leu Ser Asp Ala Gly Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser
370 375 380
Glu Ile Arg Ile Ser Val Val Thr Arg Lys Asp Asp Val Asn Glu Ala
385 390 395 400
Val Arg Ala Val His Thr Ala Phe Gly Leu Asp Ser Asp Ser Asp Glu
405 410 415
Ala Val Val Tyr Gly Gly Thr Gly Arg
420 425
<210> 20
<211> 1104
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 20
atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60
atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120
ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180
gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240
atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300
ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360
gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420
ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480
taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540
catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600
gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660
ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720
gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780
gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840
aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900
tgggcgaaag tcgttccgaa cgatcgggaa atcactatgc gtgagctaac cccagctgcc 960
gttaccggca cgctgaccac gccggtaggc cgcctgcgta agctgaatat gggaccagag 1020
ttcctgtcag cctttaccgt gggcgaccag ctgctgtggg gggccgcgga gccgctgcgt 1080
cggatgcttc gtcaactggc gtaa 1104
<210> 21
<211> 350
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 21
Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro
20 25 30
Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly
35 40 45
Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys
50 55 60
Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu
65 70 75 80
Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp
85 90 95
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp
100 105 110
Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg
115 120 125
Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu
130 135 140
Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr
180 185 190
Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
210 215 220
Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg
225 230 235 240
Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser
245 250 255
Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg
260 265 270
Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile
275 280 285
Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val
290 295 300
Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala
305 310 315 320
Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn
325 330 335
Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln
340 345 350
<210> 22
<211> 822
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 22
atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60
ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggagcgtgaa 120
ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180
accgtgcaaa gcagcctcga tgcggtaaaa gatgattttg atgtgtttat cgattttacc 240
cgtccggaag gtacgctgaa ccatctcgct ttttgtcgcc agcatggcaa agggatggtg 300
atcggcacta cggggtttga cgaagccggt aaacaagcaa ttcgtgacgc cgctgccgat 360
attgcgattg tctttgctgc caattttagc gttggcgtta acgtcatgct taagctgctg 420
gagaaagcag ccaaagtgat gggtgactac accgatatcg aaattattga agcacatcat 480
agacataaag ttgatgcgcc gtcaggcacc gcactggcaa tgggagaggc gatcgcccac 540
gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600
cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660
accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgt ctggagatca cccataaggc gtccagccgt 720
atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780
ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttgt aa 822
<210> 23
<211> 273
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 23
Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg
1 5 10 15
Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln
20 25 30
Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp
35 40 45
Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser
50 55 60
Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr
65 70 75 80
Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly
85 90 95
Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln
100 105 110
Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn
115 120 125
Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala
130 135 140
Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His
145 150 155 160
Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu
165 170 175
Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr
180 185 190
Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe
195 200 205
Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe
210 215 220
Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg
225 230 235 240
Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly
245 250 255
Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn
260 265 270
Leu
<210> 24
<211> 825
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 24
atgcagcagt tacagaacat tattgaaacc gcttttgaac gccgtgccga gatcacgcca 60
gccaatgcag acaccgttac ccgcgaagcg gtaaatcagg tgatcgccct gctggattcc 120
ggcgcactgc gtgtagcgga aaaaattgac ggtcagtggg tgacgcatca gtggttgaaa 180
aaagcggtgc tgctctcttt ccgtattaat gataatcagg tgatcgaagg ggcagaaagc 240
cgctacttcg acaaagtgcc gatgaaattc gccgactacg acgaagcacg tttccagaaa 300
gaaggcttcc gcgttgtgcc accagcggcg gtacgtcagg gtgcgtttat tgcccgtaac 360
accgtgctga tgccgtctta cgtcaacatc ggcgcatatg ttgatgaagg caccatggtt 420
gatacctggg cgaccgtcgg ttcttgtgcg cagattggta aaaacgtcca cctttccggt 480
ggcgtgggca tcggcggcgt gctggaaccg ctgcaggcta acccaaccat cattgaagat 540
aattgcttca tcggcgcgcg ctctgaagtg gttgaagggg tgattgtcga agaaggttcc 600
gtcatttcca tgggcgtata cattggtcag agcacccgta tttacgaccg tgaaaccggc 660
gaaatccact acggtcgcgt tccggcgggg tctgtggttg tttcaggtaa tctgccgtca 720
aaagatggca aatacagcct ctactgtgcg gttatcgtta agaaagttga cgcgaaaact 780
cgcggcaaag tcggcattaa cgaactgctg cgtaccatcg actaa 825
<210> 25
<211> 274
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 25
Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala
1 5 10 15
Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn
20 25 30
Gln Val Ile Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Arg Val Ala Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Gly Gln Trp Val Thr His Gln Trp Leu Lys Lys Ala Val Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Arg Ile Asn Asp Asn Gln Val Ile Glu Gly Ala Glu Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Phe Asp Lys Val Pro Met Lys Phe Ala Asp Tyr Asp Glu Ala
85 90 95
Arg Phe Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val Val Pro Pro Ala Ala Val Arg
100 105 110
Gln Gly Ala Phe Ile Ala Arg Asn Thr Val Leu Met Pro Ser Tyr Val
115 120 125
Asn Ile Gly Ala Tyr Val Asp Glu Gly Thr Met Val Asp Thr Trp Ala
130 135 140
Thr Val Gly Ser Cys Ala Gln Ile Gly Lys Asn Val His Leu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Leu Glu Pro Leu Gln Ala Asn Pro Thr
165 170 175
Ile Ile Glu Asp Asn Cys Phe Ile Gly Ala Arg Ser Glu Val Val Glu
180 185 190
Gly Val Ile Val Glu Glu Gly Ser Val Ile Ser Met Gly Val Tyr Ile
195 200 205
Gly Gln Ser Thr Arg Ile Tyr Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile His Tyr
210 215 220
Gly Arg Val Pro Ala Gly Ser Val Val Val Ser Gly Asn Leu Pro Ser
225 230 235 240
Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Tyr Cys Ala Val Ile Val Lys Lys Val
245 250 255
Asp Ala Lys Thr Arg Gly Lys Val Gly Ile Asn Glu Leu Leu Arg Thr
260 265 270
Ile Asp
<210> 26
<211> 1191
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 26
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60
cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120
ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180
accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240
ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300
ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360
aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420
ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480
gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540
tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600
tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660
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gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780
gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840
gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900
gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960
atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020
atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080
ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140
acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191
<210> 27
<211> 396
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 27
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly
20 25 30
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser
35 40 45
Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn
50 55 60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu
65 70 75 80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro
115 120 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
130 135 140
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
165 170 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu
180 185 190
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro
195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
225 230 235 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
245 250 255
Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe
260 265 270
Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala
275 280 285
His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg
290 295 300
Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305 310 315 320
Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg
325 330 335
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly
340 345 350
Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr
355 360 365
Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn
370 375 380
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu
385 390 395

Claims (15)

1.一种遗传修饰的宿主细胞，其包括编码降低胞内c-di-GMP水平的生物膜分散多肽的异源核酸，其中所述宿主细胞相对于未修饰成表达所述异源核酸的对应宿主细胞过表达所述生物膜分散多肽；且过表达赖氨酸脱羧酶、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和TetA以相较于野生型宿主细胞增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生，其中所述生物膜分散多肽为SEQID NO:4或SEQ ID NO:6所示序列的生物膜分散多肽，并且其中所述氨基酸是赖氨酸且所述氨基酸衍生物是尸胺。
2.如权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中所述生物膜分散多肽对所述宿主细胞是外源的。
3.如权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中编码所述生物膜分散多肽的异源核酸由引入所述细胞的表达载体编码，其中所述表达载体包括与启动子可操作连接的所述异源核酸。
4.如权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中所述异源核酸整合入宿主染色体。
5.如权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞属于埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。
6.如权利要求5所述的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.如权利要求6所述的遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
8.一种产生氨基酸或氨基酸衍生物的方法，所述方法包括在生物膜分散多肽过表达的条件下培养权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，其中所述氨基酸是赖氨酸且所述氨基酸衍生物是尸胺。
9.一种改造宿主细胞以增加氨基酸或氨基酸衍生物产生的方法，所述方法包括向所述宿主细胞引入编码降低胞内c-di-GMP水平的生物膜分散多肽的异源核酸，其中所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和TetA以相较于野生型宿主细胞增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生，其中所述生物膜分散多肽为SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6所示序列的生物膜分散多肽，并且其中所述氨基酸是赖氨酸且所述氨基酸衍生物是尸胺；和
在所述异源生物膜分散多肽表达的条件下培养所述宿主细胞，其中所述生物膜分散多肽的表达使氨基酸或氨基酸衍生物的产生相对于未修饰成表达所述异源核酸的对应对照宿主细胞增加。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述生物膜分散多肽对所述宿主细胞是外源的。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中编码所述生物膜分散多肽的异源核酸由引入所述细胞的表达载体编码，其中所述表达载体包括与启动子可操作连接的所述异源核酸。
12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述异源核酸整合入宿主染色体。
13.如权利要求9或10所述的方法，其中所述宿主细胞属于埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒状杆菌。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
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