CN112501102B - 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌，属于基因工程和发酵工程技术领域。所述重组菌以MG1655为出发菌株，通过引入含有基因簇ectABC、温敏蛋白CI857编码基因和温敏启动子的高拷贝质粒，使其初步具备合成四氢嘧啶的能力。通过敲除crr、iclR、thrA，同时通过在高拷贝质粒上过表达抗反馈抑制的EclysC*；另外，在同一高拷贝质粒载体上过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和来自铜绿假单胞菌PAO1的天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH。构建得到产四氢嘧啶的重组菌MWZ003/pFT28‑ectABC‑EclysC*‑aspDH‑ppc3可较出发菌株的四氢嘧啶的产量提高5.6倍，通过条件优化，在摇瓶补料分批发酵下产量可达到25.34g/L，转化率可以达到0.29g/g葡萄糖。

Description

一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌
技术领域
本发明涉及一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌，属于基因工程和发酵工程技术领域。
背景技术
四氢嘧啶是一种杂环氨基酸，可以减轻脱水、辐射、冻融、高渗透压和化学试剂对核酸、蛋白质和活细胞的有害影响。由于其对人体皮肤具有保护作用，它已经被广泛添加到各种化妆品中。四氢嘧啶最初在极端嗜盐光营养菌Ectothiorhodospirahalochloris中被检测到，嗜盐微生物如Halomonas elongate和Chromohalobactersalexigens处于高渗透压环境中可以合成四氢嘧啶。利用这些微生物生产四氢嘧啶需要高渗透压的发酵条件，对发酵设备的要求比较高，且发酵效率低，不利于实际生产。
H.elongate中四氢嘧啶的生物合成途径已经被发现，基因簇ectABC所编码的三种酶分别催化三步酶促反应。首先，L-天冬氨酸-β-半醛被ectB编码的L-2，4-二氨基丁酸转氨酶催化为L-2，4-二氨基丁酸。随后，L-2，4-二氨基丁酸被ectA编码的L-二氨基丁酸乙酰转移酶乙酰化为N-γ-乙酰二氨基丁酸。最后，由ectC编码的四氢嘧啶合成酶催化N-γ-乙酰二氨基丁酸转化为四氢嘧啶。通过将基因簇ectABC引入工业微生物中，工业微生物可以异源表达三种酶，从而具备合成四氢嘧啶的能力。工业上常用的微生物Escherichia.coli具有遗传背景清晰、基因编辑技术成熟、发酵周期短等优势，是改造成为高效生产四氢嘧啶的理想菌株。
近些年来，通过基因及代谢工程改造大肠杆菌生产四氢嘧啶的研究有较多的报道，但大多数的研究构建的菌株需要添加诱导剂以控制四氢嘧啶的合成。实验室前期研究，已经构建一个可以由温度的变化来控制基因表达的质粒。该质粒由具有三氯生抗性基因，可通过添加三氯生来维持其在菌株中的稳定存在。因此，可以通过将基因簇ectABC连接到质粒上，将质粒转入E.coli中，从而通过改变温度来控制四氢嘧啶的合成。另外，为了进一步提高四氢嘧啶的产量，需要通过基因工程手段，对初步具备四氢嘧啶合成能力的菌株进行合理的代谢工程改造。
发明内容
本发明旨在提供一株通过基因敲除和在含有温敏蛋白编码基因和温敏启动子的高拷贝质粒上过表达相关基因，运用多种代谢工程策略，最终构建由温度控制生产的高产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌。
本发明提供了一株大肠杆菌，其特征在于，敲除编码磷酸转移酶系统葡萄糖特异酶II结构域A的crr基因，敲除编码乙醛酸分支转录抑制子的iclR基因，敲除编码双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thrA基因，并过表达基因簇ectABC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH和编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC。
在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌MG1655为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述crr基因的Gene ID为946880，所述iclR基因的Gene ID为948524，所述thrA基因的Gene ID为945803。
在本发明的一种实施方式中，基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC的核苷酸序列如NCBI登录号为AP023230的第1916877～1919528位所示；所述基因EclysC的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；编码所述天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH的核苷酸序列如NCBI登录号为CP034908的第3906908～3907711位所示。
在本发明的一种实施方式中，所述基因簇ectABC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC，天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH和编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC利用载体pFT28表达。
在本发明的一种实施方式中，所述载体pFT28上含有温敏蛋白CI857编码基因和高拷贝复制子pMB1。
在本发明的一种实施方式中，所述高拷贝复制子pMB1核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述温敏蛋白CI857的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，利用PR启动子表达基因簇ectABC，利用PJ23115启动子表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC，利用启动子PR表达天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH，利用启动子PR表达编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC。
在本发明的一种实施方式中，所述PR启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述PJ23115启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明提供了一种生产四氢嘧啶的方法，利用上述大肠杆菌，全细胞转化葡萄糖生成四氢嘧啶。
在本发明的一种实施方式中，葡萄糖在反应体系中的初始浓度为30-40g/L。
在本发明的一种实施方式中，先以35-40℃的温度发酵3-4小时，再以40-45℃进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，当发酵体系中的葡萄糖浓度低于15-20g/L时，补加葡萄糖，使得反应体系中的葡萄糖浓度维持在15g/L-25g/L。
本发明提供了所述大肠杆菌，或所述方法在制备四氢嘧啶中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明构建的一株高产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3，遗传性能稳定，通过改变温度来控制重组菌四氢嘧啶的生产，有利于工业化生产的控制和操作。
(2)以MG1655为出发菌株，通过引入含有基因簇ectABC、温敏蛋白CI857编码基因和温敏启动子的高拷贝质粒，使其初步具备合成四氢嘧啶的能力。通过敲除crr和iclR，增加前体物质草酰乙酸的积累；通过敲除thrA，削弱竞争途径，同时通过在高拷贝质粒上过表达抗反馈抑制的EclysC*，补充由于thrA敲除造成的天冬氨酸激酶活性的不足；另外，在同一高拷贝质粒载体上过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和来自铜绿假单胞菌PAO1的天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH。多种代谢工程策略结合使得本发明构建的高产四氢嘧啶的重组菌MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3可较出发菌株的四氢嘧啶的产量提高5.6倍，通过条件优化，在摇瓶补料分批发酵下产量可达到25.34g/L，转化率可以达到0.29g/g葡萄糖。
附图说明
图1为重组菌中四氢嘧啶相关的生物合成途径及本发明涉及的代谢工程策略；直的虚线表示转录阻遏被消除；弯的虚线表示反应受阻；加粗的线表示加强的酶促反应；旁边有叉的基因从大肠杆菌基因组中被敲除；方框中的基因被高拷贝表达质粒过表达。
图2为菌株MWZ003构建示意图及相关表达载体示意图。
图3为最终重组菌株在不同初始葡萄糖浓度下的摇瓶补料分批发酵；A为细菌生长情况；B为葡萄糖消耗情况；C为四氢嘧啶产量。
具体实施方式
LB培养基配方：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和10g/L NaCl
发酵培养基配方：30/40g/L葡萄糖、2g/L酵母提取物、2g/L柠檬酸、25g/L(NH4)2SO4、7.46g/L KH2PO4、2g/L MgSO4·7H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、5mg/L MnSO4·4H2O、0.8mg/LVB1、0.2mg/L VH和20g/L CaCO3。
实施例1：基因缺失菌株MWZ001，MWZ002，MWZ003的构建
以MG1655为出发菌株。采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因敲除。首先敲除MG1655基因组上的基因crr(NCBI Gene ID为946880)得到菌株MWZ001，具体操作步骤如下：用引物crrF1和crrR1扩增出crr基因上游同源臂，crrF2和crrR2crr基因下游同源臂，通过重叠PCR获得crr基因上游和下游同源臂的重叠片段。
crrF1：TGCTGAAGGCAAATGGAC，
crrR1：ATAACAACCGGAGTCAGGGTTCTTGTCGTCGGAAACC；
crrF2：GGTTTCCGACGACAAGAACCCTGACTCCGGTTGTTAT，
crrR2：GGGACTGGCGACCTGTTT。
同时，构建包含一个用于靶向crr位点的N20序列(ACCGTTGAACTGAAAGGCGA)的敲除质粒pTargetF-crr。pTargetF-crr具体构建方法：以crr-sgRNA-F和crr-sgRNA-R为引物，以质粒pTargetF为模板，反向PCR得到线性质粒pTargetF-crr，用DpnI酶切去除模板质粒后，转化到大肠杆菌JM109形成环状质粒。然后，将pCas质粒转导入MG1655，制备MG1655/pCas的电转感受态。随后，将pTargetF-crr和crr基因上游和下游同源臂的重叠片段同时电转到MG1655/pCas的电转感受态中，在含卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上筛选克隆，通过菌落PCR确定crr基因被成功敲除的菌株。后续分别通过添加诱导剂IPTG和在42℃条件下培养去除质粒pTargetF-crr和pCas，最后获得不含任何质粒的crr缺失菌株MWZ001。
crr-sgRNA-F：ACCGTTGAACTGAAAGGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
crr-sgRNA-R：TCGCCTTTCAGTTCAACGGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC。
以相同的方法敲除菌株MWZ001基因组上的基因iclR(Gene ID为948524)得到菌株MWZ002，敲除菌株MWZ002基因组上的基因thrA(Gene ID为945803)得到菌株MWZ003。
利用iclRF1和iclRR1 PCR获得iclR上游同源臂，利用iclRF2和iclRR2 PCR获得iclR下游同源臂：
iclRF1：CTTGTTGCTAAAGATATGACG，
iclRR1：CAAACCATACTGGCATAAACGCAGAGGCAATATTCTGCCCATC；
iclRF2：GATGGGCAGAATATTGCCTCTGCGTTTATGCCAGTATGGTTTG，
iclRR2：GATCAGATCCGCGCCACCTTC；
iclR的N20序列：ACGATGAGGAACATGCACTG。
利用thrAF1和thrAR1 PCR获得thrA上游同源臂，利用thrAF2和thrAR2 PCR获得thrA下游同源臂
thrAF1：ATTACCACCACCATCACCA)，
thrAR1：CCACTTCGGCAATCTTCACTTCAATCATCGCCACCAG，
thrAF2：CTGGTGGCGATGATTGAAGTGAAGATTGCCGAAGTGG，
thrAR2：CTGGCTGATGATGTCGTTTT，
thrA的N20序列：TGATTGCGTAATCAGCACCA。
利用iclRR1和iclRR1PCR获得iclR上游同源臂，利用iclRF2和iclRR2获得iclR上游同源臂
iclRF1：CTTGTTGCTAAAGATATGACG，
iclRR1：CAAACCATACTGGCATAAACGCAGAGGCAATATTCTGCCCATC，
iclRF2：GATGGGCAGAATATTGCCTCTGCGTTTATGCCAGTATGGTTTG，
iclRR2：GATCAGATCCGCGCCACCTTC。
实施例2：高拷贝基因表达质粒载体的构建
高拷贝质粒pFT28是由Fang等人(Fang Y,Wang J,Ma W,Yang J,Zhang H,Zhao L,Chen S,Zhang S,Hu X,Li Y,Wang X(2020)Rebalancing microbial carbondistribution for L-threonine maximization using a thermal switch system.MetabEng 61:33-46 doi:10.1016/j.ymben.2020.01.009)构建的pFT24改造而来，方法是去除pFT24载体上的tetR(包括RBS)和PLtetO1启动子，并将p15A复制子替换为具有高拷贝数的pMB1复制子(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。以上所述的基因操作是用ClonExpressⅡ一步克隆试剂盒完成的。
以伸长盐单胞菌的基因组(NCBI登录号为NC_014532.2)为模板，扩增出编码三个四氢嘧啶合成关键酶的基因簇ectABC(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并连接到载体pFT28上构建得到质粒pFT28-ectABC。以大肠杆菌的基因组为模板，设计包含突变位点碱基的引物，扩增出编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC*(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)，并连接到pFT28-ectABC上构建得到质粒pFT28-ectABC-EclysC*。以铜绿假单胞菌PAO1的基因组为模板，扩增出编码天冬氨酸脱氢酶的基因aspDH(核苷酸序列如NCBI登录号为CP034908的第3906908～3907711位所示)；以大肠杆菌的基因组为模板，扩增出编码磷酸烯醇式丙酮酸的基因ppc(核苷酸序列如NCBI登录号为AP023230的第1916877～1919528位所示)；将基因aspDH和ppc连接到质粒pFT28-ectABC-EclysC*上构建得到pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3(上述基因按照图2中的顺序连接)。以上所述的基因的连接是用ClonExpressⅡ一步克隆试剂盒完成的。
实施例3：产四氢嘧啶重组菌的构建
将表达基因簇ectABC的高拷贝质粒载体分别电转入相应的基因缺失菌株MWZ001、MWZ002、MWZ003中，在含有0.9μg/mL三氯生的LB平板上筛选含有质粒的克隆，获得重组菌MG1655/pFT28-ectABC，MWZ001/pFT28-ectABC，MWZ002/pFT28-ectABC，MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*，MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3。
实施例4：摇瓶补料分批发酵
所有用于培养含有四氢嘧啶合成编码基因的质粒的菌株的培养基中都添加了0.9mg/L的三氯生以维持质粒。首先将菌株在LB琼脂平板上活化培养24小时，然后从LB琼脂平板上刮取菌苔，接种至50mL灭菌的LB培养基中，培养6小时，转速为200转/分。将该种子培养物接种至30ml发酵培养基(葡萄糖浓度为30g/L)，使得初始发酵体系的OD600值为0.2，在发酵开始时，将培养温度设定为37℃以促进细胞生长，然后在发酵开始后3小时将培养温度提高到42℃以产生四氢嘧啶。培养过程中每隔6小时取0.5mL发酵样品，用于测定细胞生物量、发酵液中葡萄糖及四氢嘧啶的浓度。当发酵液中葡萄糖浓度低于15g/L时，添加高浓度的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在15g/L-25g/L，直至发酵菌株不再消耗葡萄糖为止，如表1所示，菌株MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3发酵36h，四氢嘧啶产量可达到12.93g/L。
表1不同菌株四氢嘧啶的产量(g/L)
36h
MG1655 0
MG1655/pFT28(空载) 0
MG1655/pFT28-ectABC 1.95
MWZ001/pFT28-ectABC 5.28
MWZ002/pFT28-ectABC 9.09
MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC* 11.85
MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3 12.93
在上述基础上，选取菌株MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3，对发酵过程做优化：在发酵开始后3小时将培养温度提高到42℃以产生四氢嘧啶，并分别在葡萄糖浓度为30g/L和40g/L的培养基中发酵。
将MWZ003/pFT28-ectABC-EclysC*-aspDH-ppc3在初始葡萄糖浓度为40g/L的发酵培养基中发酵，在发酵开始时，将培养温度设定为37℃以促进细胞生长，然后在发酵开始后3小时将培养温度提高到42℃以产生四氢嘧啶。培养过程中每隔6小时取0.5mL发酵样品，用于测定细胞生物量、发酵液中葡萄糖及四氢嘧啶的浓度。当发酵液中葡萄糖浓度低于15g/L时，添加高浓度的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在15g/L-25g/L，直至发酵菌株不再消耗葡萄糖为止。发酵63h后的产量可达25.34g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株高效生产四氢嘧啶的大肠杆菌重组菌
<130> BAA201468A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2433
<212> DNA
<213> Halomonas elongata
<400> 1
atgaacgcaa ccacagagcc gtttacacca tccgccgacc tggccaagcc gagcgtggcc 60
gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag cccggatgac 120
ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgcctc tcgacgtcaa ttccgcctac 180
gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240
ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgccccaga tacctatttc 300
ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360
gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctggagac cactatcacg 420
ccggacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480
ttgaacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatga cccggaaaac 540
ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgag ccgggacgcc gcctggccgg 600
cccggtacgg gccggcaacc cgtcttttcg ttttatcact ttccccccac aggaggtcgc 660
aatgcagacc cagattctcg aacgcatgga gtccgacgtt cgtacctact cccgctcctt 720
cccggtcgtc ttcaccaagg cgcgcaatgc ccgcctgacc gacgaggaag ggcgcgagta 780
catcgacttc ctggccggtg ccggcaccct gaactacggc cacaacaacc cgcacctcaa 840
gcaggcgctg ctcgactata tcgacagcga cggcatcgtc cacggcctgg acttctggac 900
tgcggccaag cgcgactatc tggaaaccct ggaagaggtg atcctcaagc cgcgcggtct 960
cgactacaag gtgcatctgc cgggaccgac tggcaccaac gccgtcgagg cggccattcg 1020
cctggcccgt gtcgccaagg ggcgccacaa tatcgtctcc ttcaccaacg gctttcatgg 1080
cgtcactatg ggcgcgctgg cgaccaccgg taaccgcaag ttccgcgagg ccaccggtgg 1140
cgtgccgacc caggctgctt ccttcatgcc gttcgatggc tacctcggca gcagcaccga 1200
caccctcgac tacttcgaga agctgctcgg cgacaagtcc ggcggcctgg acgtgccggc 1260
ggcggtgatc gtcgagacag tgcagggcga gggcggtatc aatgtcgccg gcctggagtg 1320
gctcaagcgc ctggagagca tctgccgcgc caatgacatc ctgctgatca tcgacgacat 1380
ccaggcgggc tgcggccgta ccggcaagtt cttcagcttc gagcatgccg gcatcacgcc 1440
ggatattgtg accaactcca agtctctgtc cggttacggc ctgccgttcg ctcacgtcct 1500
gatgcgcccg gagctggaca agtggaagcc gggtcagtac aacggcacct tccgcggctt 1560
caacctggct ttcgccactg ctgctgccgc catgcgcaag tactggagcg acgacacctt 1620
cgagcgtgac gtgcagcgca aggctcgcat cgtcgaggaa cgcttcggca agatcgccgc 1680
ctggctgagc gagaacggca tcgaggcctc cgagcgtggc cgcgggctga tgcgtggcat 1740
cgacgtgggt tccggcgata ttgccgacaa gatcacccac caagccttcg agaacgggtt 1800
gatcatcgaa accagcggtc aggacggcga agtggtcaag tgcctgtgcc cgctgaccat 1860
tccggacgaa gacctggtcg agggactcga catcctggag accagcacca agcaggcctt 1920
tagctgatcg cctgaggtgc gccatcgggc ctgtccatgg catcctgtat cggtcggccg 1980
tgcgcggccg gccagtcatt gattcactgg agaatcgaca tgatcgttcg caatctcgaa 2040
gaagcgcgcc agaccgaccg tctggtcacc gccgaaaacg gcaactggga cagcacccgc 2100
ctgtctctgg ccgaagatgg tggcaactgc tccttccaca tcacccgcat cttcgagggc 2160
accgagaccc acatccacta taagcatcac ttcgaggctg tttattgcat cgaaggcgag 2220
ggcgaagtgg aaaccctggc cgatggcaag atctggccga tcaagccggg tgacatctac 2280
atcctcgacc agcacgacga gcacctgctg cgcgccagca agaccatgca cctggcctgc 2340
gtgttcacgc cgggcctgac cggcaacgaa gtgcaccgcg aagacggttc ctacgcacct 2400
gccgacgaag ccgacgacca gaagccgctg taa 2433
<210> 2
<211> 1350
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgtctgaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60
aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120
tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180
ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240
ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300
gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360
atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420
gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480
gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540
acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600
agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660
accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720
gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780
ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840
gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900
gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat 960
tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020
ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaacccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080
actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140
gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc 1200
ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat 1260
ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg 1320
caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350
<210> 3
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 60
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 120
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 180
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 240
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 300
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 360
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 420
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 480
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 540
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 600
tcaagaagat cctttgatct 620
<210> 4
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcagccaaac gtctcttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggaacaact 60
ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct 120
atccctgatc agtttcttga aggtaaactc atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc 180
acctggctca acagcctgct cagggtcaac gagaattaac attccgtcag gaaagcttgg 240
cttggagcct gttggtgcgg tcatggaatt accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc 300
actggctttt ttggttgtgc ttacccatct ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag 360
cttaggtgag aacatccctg cctgaacatg agaaaaaaca gggtactcat actcacttct 420
aagtgacggc tgcatactaa ccgcttcata catctcgtag atttctctgg cgattgaagg 480
gctaaattct tcaacgctaa ctttgagaat ttttgtaagc aatgcggcgt tataagcatt 540
taatgcattg atgccattaa ataaagcacc aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc 600
tgcgacagat tcctgggata agccaagttc atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag 660
gcgacgtgcg tcctcaagct gctcttgtgt taatggtttc ttttttgtgc tcat 714
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgc 49
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttatagcta gctcagccct tggtacaatg ctagc 35

Claims (2)

1.一种生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，利用重组大肠杆菌，全细胞转化葡萄糖生成四氢嘧啶；所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌MG1655为出发菌株，并敲除了编码磷酸转移酶系统葡萄糖特异酶II结构域A的crr基因，敲除编码乙醛酸分支转录抑制子的iclR基因，敲除编码双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thrA基因，并过表达基因簇ectABC、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH和编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC；
所述crr基因的Gene ID为946880，所述iclR基因的Gene ID为948524，所述thrA基因的Gene ID为945803；
所述基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC的核苷酸序列如NCBI登录号为AP023230的第1916877～1919528位所示；所述基因EclysC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH的核苷酸序列如NCBI登录号为CP034908的第3906908～3907711位所示；
所述基因簇ectABC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC，天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH和编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC利用载体pFT28表达：利用核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的PR启动子表达基因簇ectABC，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的启动子PJ23115表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC，利用启动子PR表达天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH，利用启动子PR表达编码天冬氨酸激酶III的抗反馈抑制的基因EclysC；所述载体pFT28上含有核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的pMB1复制子和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的温敏蛋白CI857；
所述载体pFT28是去除pFT24载体上的包括RBS的tetR基因和PLtetO1启动子，并将p15A复制子替换为具有高拷贝数的pMB1复制子得到的；
葡萄糖在反应体系中的初始浓度为40g/L；先以37℃的温度发酵4小时，再以42℃进行发酵；当发酵体系中的葡萄糖浓度低于15-20g/L时，补加葡萄糖，使得反应体系中的葡萄糖浓度维持在15g/L-25g/L。
2.权利要求1所述方法在制备四氢嘧啶中的应用。
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