CN116355919B - 高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株及构建方法与用途 - Google Patents

高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株及构建方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株及构建方法与用途，构建方法为：(1)敲除大肠杆菌LS02的低效率呼吸链相关基因ndh和低效率呼吸链相关基因appB，并过表达糖酵解途径的基因fbp，得到EC‑FMN 03菌株；(2)将质粒pLS01转入EC‑FMN 03菌株中并制作成电转感受态；将质粒p20C‑ribFM‑1转入电转感受态中，得到高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株EC‑FMN 04。本发明构建的菌株EC‑FMN 04，克服了目前黄素单核苷酸生产菌株生产性能很低的缺点，在摇瓶有氧发酵条件下，黄素单核苷酸产量为0.9g/L以上，这为后续发酵罐连续补料提高黄素单核苷酸的产量和产率奠定了基础。

Description

高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株及构建方法与用途
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地涉及一种高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株及构建方法与用途。
背景技术
黄素单核苷酸(Flavin mononucleotide，FMN)是一种橙黄色，易溶于水的固体，和黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，FAD)一样，在呼吸等生物氧化过程中的电子传递、光合作用、脂肪酸氧化、以及维生素B6，B9和B12的代谢中起着重要的作用。由于比核黄素(Riboflavin，RF)有更好的水溶性和利用率，FMN可作为肌肉及静脉注射药剂用于治疗核黄素缺乏症，以及一些遗传疾病。在食品工业中，FMN也可以和核黄素一样作为添加剂和营养强化剂使用，但由于溶解度更高而比核黄素具有更大的性能优势。FMN是黄素蛋白的氧化还原辅因子，和各种黄素蛋白一起催化细胞内的诸多氧化还原反应。另外，在当前迅猛发展的体外合成生物学中，FMN在许多高效体外酶催化体系中作为辅因子或激活剂发挥着不可或缺的作用。
目前，FMN的商业化生产方法主要是化学法和全细胞催化法，前者是通过化学试剂磷酸化核黄素的5’羟基生成FMN，但该方法需要用到毒性较强的有机溶剂，同时在生产中会形成大量FMN的同分异构体以及二磷酸核黄素和多磷酸核黄素，极大地增加了FMN的分离纯化成本。后者是利用核黄素激酶活性大幅度增强的工程菌株将体外添加的核黄素和ATP(或葡萄糖)转化为FMN。与化学法类似，为了提高全细胞催化法的催化效率，在反应体系中也添加了具有一定毒性的有机溶剂以增强底物核黄素的溶解度，去除这些有机溶剂进一步增加了分离纯化的成本。因此，高昂的生产成本和价格极大地限制了FMN在医药、食品和体外酶工程等领域的应用和市场规模。
与化学法与全细胞催化法相比，微生物发酵法利用廉价的糖质原料从头合成FMN，无需添加ATP等昂贵的前体物和毒性有机溶剂，也没有浓缩收集高密度菌体的复杂过程，因此显示了巨大的竞争潜力。国内外研究人员对于通过微生物直接代谢葡萄糖等廉价原料生产FMN的方法也做了一些研究，但还缺乏对生产菌株深入和系统的改造，因此菌株的生产性能还很低。目前，通过代谢工程改造从头合成FMN的菌株主要是大肠杆菌。公开报道的FMN生产菌株大肠杆菌的最高产量(摇瓶)为586mg/L。由于FMN的合成途径较为复杂，相关菌株的合成途径优化及发酵工艺等关键技术亟需突破。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株。
本发明的第二个目的是提供一种高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途。
本发明的技术方案概述如下：
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)敲除大肠杆菌LS02的低效率呼吸链相关基因ndh和低效率呼吸链相关基因appB，并过表达糖酵解途径的基因fbp，得到EC-FMN 03菌株；
所述低效率呼吸链相关基因ndh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述低效率呼吸链相关基因appB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述糖酵解途径的基因fbp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)将质粒pLS01转入EC-FMN 03菌株中并制作成电转感受态；将质粒p20C-ribFM-1转入电转感受态中，得到高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株，命名为EC-FMN 04菌株。
上述方法构建的高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株。
上述高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途。
上述用途，包括如下步骤：
(1)活化菌株：将高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养12-20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12-20h；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，得到黄素单核苷酸。
优选地，发酵培养基为按比例，取1mL组分I，1mL组分II，1mL组分III和IV的混合液，加入葡萄糖使终浓度为10g/L，加入酵母提取物使终浓度为5g/L，加蒸馏水至50mL；
所述组分I为：取10g-30g(NH4)2SO4，2g MgSO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分II为：取38.3g Na2HPO4，15g KH2PO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分III为：取5g柠檬酸铁铵，2g CaCl2·2H2O，41.7mL浓度为12mol/L的HCl水溶液，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分IV为：取1g ZnSO4·7H2O，0.3g MnCl2·4H2O，3g H3BO3，2g CoCl2·6H2O，0.1gCuSO4·5H2O，0.2g NiCl2·6H2O，0.3g NaMoO4·2H2O，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分III和IV的混合液为：取100ml组分III，1ml组分IV，用蒸馏水定容到200mL，并用5M的NaOH水溶液调pH值到4.5-5.5，121℃灭菌20min。
本发明的优点：
本发明构建的一种高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株EC-FMN 04，克服了目前黄素单核苷酸生产菌株生产性能很低的缺点，在摇瓶有氧发酵条件下，黄素单核苷酸产量为0.9g/L以上，这为后续发酵罐连续补料提高黄素单核苷酸的产量和产率奠定了基础。
附图说明
图1为ndh基因敲除过程中的琼脂糖凝胶电泳示意图。
图2为EC-FMN 04菌株的核黄素和黄素单核苷酸产量示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的原始菌株大肠杆菌MG1655来源为CGSC(Coli Genetic StockCenter，http://cgsc.biology.yale.edu/)。
本发明所用到的原始菌株大肠杆菌LS02来源于如下文章：Liu S,Kang P,Cui Z,et al.Increased riboflavin production by knockout of 6-phosphofructokinase Iand blocking the Entner-Doudoroff pathway in Escherichia coli[J].Biotechnology Letters,2016,38(8):1307-1314.
原始质粒pLS01的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
原始质粒p20C-ribFM-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
原始质粒pTKRED和pTKS/CS来源为Addgene(Addgene,https://www.addgene.org/)。
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别以ndh U-F(SEQ ID No.21)和ndh U-R(SEQ ID No.22)，ndh L-F(SEQ ID No.27)和ndh L-R(SEQ ID No.28)为引物，PCR扩增，分别得到ndh-U(SEQ ID No.6)和ndh-L(SEQ ID No.9)，大小为571bp和520bp(图1A)；以质粒pTKS/CS为模板，分别以ndh T-F(SEQ ID No.23)和tet T-R(SEQ ID No.24)，tet T-F(SEQID No.25)和ndh T-R(SEQ ID No.26)为引物，PCR扩增，分别得到ndh-T1(SEQ ID No.7)和ndh-T2(SEQ ID No.8)，大小为778bp和703bp(图1A)；以ndh-U和ndh-T1两个片段为模板，以ndh U-F(SEQ ID No.21)和tet T-R(SEQ ID No.24)为引物，PCR融合得到ndh-UT1，大小为1329bp(图1B)；以ndh-T2和ndh-L两个片段为模板，以tet T-F(SEQ ID No.25)和ndh L-R(SEQ ID No.28)为引物，PCR融合得到ndh-T2L，大小为1203bp(图1B)；以ndh-UT1和ndh-T2L两个片段为模板，以ndh U-F(SEQ ID No.21)和ndh L-R(SEQ ID No.28)为引物，PCR融合得到ndh基因的敲除片段ndh-tet(SEQ ID No.10)，大小为2388bp(图1C)。
(2)将质粒pTKRED转入大肠杆菌LS02中并制作成电转感受态；将上述步骤获得的片段ndh-tet(SEQ ID No.10)转入本步骤获得的电转感受态中；以tet T-F(SEQ ID No.25)和ndh L-R(SEQ ID No.28)为引物，菌落PCR验证ndh-tet片段的重组情况，在1203bp有目标条带(图1D)；以ndh U-F(SEQ ID No.21)和ndh L-R(SEQ ID No.28)为引物，菌落PCR验证四环素抗性基因的弹出情况，在1075bp有目标条带(图1E)；将低效率呼吸链相关基因ndh(SEQID No.1)敲除成功的LS02菌株命名为EC-FMN 01。
(3)以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别以appB U-F(SEQ ID No.29)和appB U-R(SEQ ID No.30)，appB L-F(SEQ ID No.33)和appB L-R(SEQ ID No.34)为引物，PCR扩增，分别得到appB-U(SEQ ID No.11)和appB-L(SEQ ID No.14)，大小为536bp和482bp；以质粒pTKS/CS为模板，分别以appB T-F(SEQ ID No.31)和tet T-R(SEQ ID No.24)，tet T-F(SEQID No.25)和appB T-R(SEQ ID No.32)为引物，PCR扩增，分别得到appB-T1(SEQ ID No.12)和appB-T2(SEQ ID No.13)，大小为784bp和703bp；以appB-U和appB-T1两个片段为模板，以appB U-F(SEQ ID No.29)和tet T-R(SEQ ID No.24)为引物，PCR融合得到appB-UT1，大小为1300bp；以appB-T2和appB-L两个片段为模板，以tet T-F(SEQ ID No.25)和appB L-R(SEQ ID No.34)为引物，PCR融合得到appB-T2L，大小为1165bp；以appB-UT1和appB-T2L两个片段为模板，以appB U-F(SEQ ID No.29)和appB L-R(SEQ ID No.34)为引物，PCR融合得到appB基因的敲除片段appB-tet(SEQ ID No.15)，大小为2321bp。
(4)将质粒pTKRED转入EC-FMN 01菌株中并制作成电转感受态；将上述步骤获得的片段appB-tet(SEQ ID No.15)转入本步骤获得的电转感受态中；以tet T-F(SEQ IDNo.25)和appB L-R(SEQ ID No.34)为引物，菌落PCR验证appB-tet片段的重组情况，在1165bp有目标条带；以appB U-F(SEQ ID No.29)和appB L-R(SEQ ID No.34)为引物，菌落PCR验证四环素抗性基因的弹出情况，在973bp有目标条带；将低效率呼吸链相关基因appB(SEQ ID No.2)敲除成功的EC-FMN 01菌株命名为EC-FMN 02。
(5)以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别以fbp U-F(SEQ ID No.35)和fbp U-R(SEQ ID No.36)，fbp L-F(SEQ ID No.39)和fbp L-R(SEQ ID No.40)为引物，PCR扩增，分别得到fbp-U(SEQ ID No.16)和fbp-L(SEQ ID No.19)，大小为364bp和390bp；以质粒pTKS/CS为模板，分别以fbp T-F(SEQ ID No.37)和tet T-R(SEQ ID No.24)，tet T-F(SEQ IDNo.25)和fbp T-R(SEQ ID No.38)为引物，PCR扩增，分别得到fbp-T1(SEQ ID No.17)和fbp-T2(SEQ ID No.18)，大小为734bp和799bp；以fbp-U和fbp-T1两个片段为模板，以fbpU-F(SEQ ID No.35)和tet T-R(SEQ ID No.24)为引物，PCR融合得到fbp-UT1，大小为1069bp；以fbp-T2和fbp-L两个片段为模板，以tet T-F(SEQ ID No.25)和fbp L-R(SEQ IDNo.40)为引物，PCR融合得到fbp-T2L，大小为1153bp；以fbp-UT1和fbp-T2L两个片段为模板，以fbp U-F(SEQ ID No.35)和fbp L-R(SEQ ID No.40)为引物，PCR融合得到fbp基因的过表达片段fbp-tet(SEQ ID No.20)，大小为2078bp。
(6)将质粒pTKRED转入EC-FMN 02菌株中并制作成电转感受态；将上述步骤获得的片段fbp-tet(SEQ ID No.20)转入本步骤获得的电转感受态中；以tet T-F(SEQ ID No.25)和fbp L-R(SEQ ID No.40)为引物，菌落PCR验证fbp-tet片段的重组情况，在1153bp有目标条带；以fbp U-F(SEQ ID No.35)和fbp L-R(SEQ ID No.40)为引物，菌落PCR验证四环素抗性基因的弹出情况，在725bp有目标条带；将糖酵解途径的基因fbp(SEQ ID No.3)过表达成功的EC-FMN02菌株命名为EC-FMN 03。
(7)将质粒pLS01(SEQ ID No.4)转入EC-FMN 03菌株中并制作成电转感受态；将质粒p20C-ribFM-1(SEQ ID No.5)转入本步骤获得的电转感受态中，得到高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株，命名为EC-FMN 04菌株。
实施例2
发酵培养基的制备，包括如下步骤：
取1mL组分I，1mL组分II，1mL组分III和IV的混合物，加入葡萄糖使终浓度为10g/L，加入酵母提取物使终浓度为5g/L，加蒸馏水至50mL；
所述组分I为：取10g(NH4)2SO4，2g MgSO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分II为：取38.3g Na2HPO4，15g KH2PO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分III为：取5g柠檬酸铁铵，2g CaCl2·2H2O，41.7mL浓度为12mol/L的HCl水溶液，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分IV为：取1g ZnSO4·7H2O，0.3g MnCl2·4H2O，3g H3BO3，2g CoCl2·6H2O，0.1gCuSO4·5H2O，0.2g NiCl2·6H2O，0.3g NaMoO4·2H2O，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分III和IV的混合液为：取100ml组分III，1ml组分IV，用蒸馏水定容到200mL，并用5M的NaOH水溶液调pH值到4.5，121℃灭菌20min。
实施例3
发酵培养基的制备，包括如下步骤：
取1mL组分I，1mL组分II，1mL组分III和IV的混合物，加入葡萄糖使终浓度为10g/L，加入酵母提取物使终浓度为5g/L，加蒸馏水至50mL；
所述组分I为：取30g(NH4)2SO4，2g MgSO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分II为：取38.3g Na2HPO4，15g KH2PO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分III为：取5g柠檬酸铁铵，2g CaCl2·2H2O，41.7mL浓度为12mol/L的HCl水溶液，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分IV为：取1g ZnSO4·7H2O，0.3g MnCl2·4H2O，3g H3BO3，2g CoCl2·6H2O，0.1gCuSO4·5H2O，0.2g NiCl2·6H2O，0.3g NaMoO4·2H2O，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分III和IV的混合液为：取100ml组分III，1ml组分IV，用蒸馏水定容到200mL，并用5M的NaOH水溶液调pH值到5.5，121℃灭菌20min。
实施例4
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将实施例1获得的高产黄素单核苷酸大肠杆菌菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养12h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h。
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到实施例2制备的发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，经过37h发酵，OD600达到9.1，黄素核苷酸产量达到939.9mg/L。
实施例5
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将实施例1获得的高产黄素单核苷酸大肠杆菌工程菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养12h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养14h；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到实施例2制备的发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，经过47h发酵，OD600达到8.5，黄素核苷酸产量达到974.9mg/L。
实施例6
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将实施例1获得的高产黄素单核苷酸大肠杆菌工程菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养14h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养16h；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到实施例3制备的发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，经过47h发酵，OD600达到8.3，黄素核苷酸产量达到1191.26mg/L。
实施例7
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将实施例1获得的高产黄素单核苷酸大肠杆菌工程菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养16h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养14h；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到实施例2制备的发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，经过47h发酵，OD600达到8.2，黄素核苷酸产量达到1328.6mg/L，发酵结果见图2。
实施例8
高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将实施例1获得的高产黄素单核苷酸大肠杆菌工程菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养20h；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到实施例2制备的发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，经过47h发酵，OD600达到7.9，黄素核苷酸产量达到1537.2mg/L。
从摇瓶发酵结果可以看出，本发明所构建的高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株能够达到较高的黄素核苷酸生产产量，具有很好的应用前景。
序列表
<110> 天津大学
<120> 高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株及构建方法与用途
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1305
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 1
ttgactacgc cattgaaaaa gattgtgatt gtcggcggcg gtgctggtgg gctggaaatg 60
gcaacacagc tggggcataa gctgggacgc aagaaaaaag ccaaaattac gctggtcgat 120
cgtaaccaca gccacctgtg gaaaccgctg ctgcacgaag tggcgactgg ctcgcttgat 180
gaaggcgtcg atgcgttgag ctatctggcc catgcgcgca atcatggttt ccagttccag 240
ctgggttccg tcattgatat tgatcgtgaa gcgaaaacaa tcactattgc agaactgcgc 300
gacgagaaag gtgaactgct ggttccggaa cgtaaaatcg cctatgacac cctggtaatg 360
gcgctgggta gcacctctaa cgatttcaat acgccaggtg tcaaagagaa ctgcattttc 420
ctcgataacc cgcaccaggc gcgtcgcttc caccaggaga tgctgaattt gttcctgaaa 480
tactccgcca acctgggcgc gaatggcaaa gtgaacattg cgattgtcgg cggcggcgcg 540
acgggtgtag aactctccgc tgaattgcac aacgcggtca agcaactgca cagctacggt 600
tacaaaggcc tgaccaacga agccctgaac gtaacgctgg tagaagcggg agaacgtatt 660
ttgcctgcgt taccgccacg tatctctgct gcggcccaca acgagctaac gaaacttggc 720
gttcgcgtgc tgacgcaaac catggtcacc agtgctgatg aaggcggcct gcacactaaa 780
gatggcgaat atattgaggc tgatctgatg gtatgggcag ccgggatcaa agcgccagac 840
ttcctgaaag atatcggtgg tcttgaaact aaccgtatca accagctggt ggtggaaccg 900
acgctgcaaa ccacccgcga tccagacatt tacgctattg gcgactgcgc gtcatgcccg 960
cgtccggaag ggggctttgt tccgccgcgt gctcaggctg cacaccagat ggcgacttgc 1020
gcaatgaaca acattctggc gcagatgaac ggtaagccgc tgaaaaatta tcagtataaa 1080
gatcatggtt cgctggtatc gctgtcgaac ttctccaccg tcggtagcct gatgggtaac 1140
ctgacgcgcg gctcaatgat gattgaagga cgaattgcgc gctttgtata tatctcgcta 1200
taccgaatgc atcagattgc gctgcatggt tactttaaaa ccggattaat gatgctggtg 1260
gggagtatta accgcgttat ccgtccgcgt ttgaagttgc attaa 1305
<210> 2
<211> 1137
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 2
atgtttgatt atgaaacatt gcgcttcatc tggtggctgc tgattggcgt gatcctggtg 60
gtctttatga tctccgacgg atttgacatg gggatcggct gtctgctgcc gctggtggcg 120
cgtaatgatg atgaacgccg gatagtgata aacagcgttg gtgcacactg ggaaggcaac 180
caggtctggt tgatcctcgc tggtggggca ttatttgccg cctggcccag agtgtatgca 240
gcggcgtttt ccggctttta tgtggcgatg atcctggtgc tgtgctcact gttcttccgc 300
ccgctggcct ttgattatcg cggaaaaatc gccgatgcac gctggcgtaa aatgtgggac 360
gccggtctgg tcatcggcag tctggtgccg ccggtagtct tcggtatcgc cttcggcaac 420
ttgttgctcg gcgtgccgtt tgccttcaca ccgcaattac gcgtggagta tctcggcagc 480
ttctggcaac tgctgacgcc attcccttta ttgtgcggat tgctcagcct tgggatggtg 540
attttgcaag gtggcgtctg gttacaactg aaaactgttg gtgtgattca tctgcgttca 600
cagctggcga ccaaacgcgc tgcactgttg gtgatgctgt gctttttgct ggcgggttac 660
tggctgtggg tcggtattga tggctttgta ctgctcgccc aggatgctaa cggtccttcc 720
aatccgttaa tgaaactggt ggcagtgcta cctggtgcct ggatgaataa ttttgtcgag 780
tcgcccgttt tgtggatctt cccgctgctg ggattcttct gcccattgct gacggtgatg 840
gcgatttatc gtggtcgccc gggttgggga tttttgatgg catcattgat gcaatttggc 900
gtgattttca cggcaggcat cacgctgttc ccctttgtca tgccgtcaag cgtgagtccg 960
atctccagcc tgacgttgtg ggacagtact tccagtcagc tgacgctgag cattatgttg 1020
gtaatcgtgc tgatattttt gcccattgtg ttgctctaca ctctctggag ctactacaaa 1080
atgtgggggc gcatgacaac agaaactctc cgccgtaacg aaaacgagtt gtactaa 1137
<210> 3
<211> 999
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 3
atgaaaacgt taggtgaatt tattgtcgaa aagcagcacg agttttctca tgctaccggt 60
gagctcactg ctttgctgtc ggcaataaaa ctgggcgcca agattatcca tcgcgatatc 120
aacaaagcag gactggttga tatcctgggt gccagcggtg ctgagaacgt gcagggcgag 180
gttcagcaga aactcgactt gttcgctaat gaaaaactga aagccgcact gaaagcacgc 240
gatatcgttg cgggcattgc ctctgaagaa gaagatgaga ttgtcgtctt tgaaggctgt 300
gaacacgcaa aatacgtggt gctgatggac cccctggatg gctcgtccaa catcgatgtt 360
aacgtctctg tcggtaccat tttctccatc taccgccgcg ttacgcctgt tggcacgccg 420
gtaacggaag aagatttcct ccagcctggt aacaaacagg ttgcggcagg ttacgtggta 480
tacggctcct ctaccatgct ggtttacacc accggatgcg gtgttcacgc ctttacttac 540
gatccttcgc tcggcgtttt ctgcctgtgc caggaacgga tgcgcttccc ggagaaaggc 600
aaaacctact ccatcaacga aggaaactac attaagtttc cgaacggggt gaagaagtac 660
attaaattct gccaggaaga agataaatcc accaaccgcc cttatacctc acgttatatc 720
ggttcactgg tcgcggattt ccaccgtaac ctgctgaaag gcggtattta tctctaccca 780
agcaccgcca gccacccgga cggcaaactg cgtttgctgt atgagtgcaa cccgatggca 840
ttcctggcgg aacaagcggg cggtaaagcg agcgatggca aagagcgtat tctggatatc 900
atcccggaaa ccctgcacca gcgccgttca ttctttgtcg gcaacgacca tatggttgaa 960
gatgtcgaac gctttatccg tgagttcccg gacgcgtaa 999
<210> 4
<211> 7224
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60
ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120
gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180
tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggtca cacagaattc 240
gagctcaagt cctcaactac caaggagaaa acaatgcagc ttaaacgtgt ggcagaagcc 300
aaactgccaa ccccatgggg cgatttcctg atggtgggat ttgaagaact ggcaaccgga 360
cacgatcatg tcgcgctagt ctatggcgat atttccgggc ataccccggt acttgcgcgc 420
gtccattccg aatgtctgac cggtgacgcc ctgttcagct tgcgctgcga ttgtggcttc 480
cagctcgaag cggcattgac gcaaattgcc gaggaaggcc gtggtatttt gctgtatcac 540
cgtcaggaag gtcgtaacat tggtctgctg aataaaatcc gcgcttacgc actgcaggat 600
caaggttacg ataccgtaga ggctaaccac cagttaggct tcgccgctga tgagcgcgac 660
ttcactcttt gcgctgatat gttcaaactc cttggcgtca atgaagtccg cttgttaacc 720
aataacccga aaaaagtcga aattctgacc gaagcaggga ttaatattgt tgaacgcgta 780
ccattgattg taggtcgtaa ccccaataac gaacattatc tcgataccaa agccgagaaa 840
atgggccatt tgctgaacaa ataaatctat aaaataaggg ggccctaact taatgaatca 900
gacgctactt tcctcttttg gtacgccttt cgaacgtgtt gaaaatgcac tggctgcgct 960
gcgtgaagga cgcggtgtaa tggtgcttga tgatgaagac cgtgaaaacg aaggtgatat 1020
gatcttcccg gcagaaacca tgactgttga gcagatggcg ctgaccattc gccacggtag 1080
cggtattgtt tgcctgtgca ttactgaaga tcgccgtaaa caactcgatc tgccaatgat 1140
ggtagaaaat aacaccagcg cctatggcac cggttttacc gtgaccattg aagcagctga 1200
aggtgtgact accggtgttt ctgccgctga ccgtattacg accgttcgcg cagcgattgc 1260
cgatggcgca aaaccgtcag atctgaatcg tcctggccac gttttcccac ttcgcgctca 1320
ggcaggtggt gtactgacgc gtggcggtca tactgaagca actattgatc tgatgacgct 1380
ggcaggcttt aaaccggctg gtgtactgtg tgagctgact aatgacgatg gcacgatggc 1440
gcgtgcacca gagtgtattg agtttgccaa taaacacaat atggcgctcg tgactattga 1500
agacctggtg gcataccgtc aggcacatga gcgtaaagcc agctgaggat cccgtagata 1560
gacaaggagg aaaacacagt gcaggacgag tattacatgg cgcgggcgct aaagctggcg 1620
caacgaggac gttttaccac gcatcccaac ccgaatgtcg ggtgcgtcat tgtcaaagat 1680
ggcgaaattg tcggtgaagg ttaccaccaa cgtgcgggtg aaccacatgc cgaagtacac 1740
gcgttgcgta tggcgggtga aaaagccaaa ggtgcgaccg cctatgtcac actcgaaccc 1800
tgtagccatc atggtcgtac gccaccgtgc tgtgacgcac tcatcgccgc tggcgtagcg 1860
cgcgtggttg cctcgatgca agatcctaac ccgcaggtcg ctgggcgtgg actttaccgt 1920
ctgcaacagg ctggcattga cgtcagccac ggcctgatga tgagtgaagc cgagcaattg 1980
aataaaggct ttctcaagcg gatgcgcacc ggctttcctt atattcagtt aaaacttggc 2040
gcatcgcttg atggtcgcac ggcgatggcg agcggcgaaa gccagtggat cacttcgccc 2100
caggcgcggc gtgatgtaca actactgcgc gcgcaaagtc atgccatttt aaccagcagc 2160
gccacggtgc tggcggatga tcctgcctta acggtgcgtt ggtctgaact ggatgaacaa 2220
actcaggcgc tctatccgca acaaaatctc cgtcagccga tacgtattgt gattgatagc 2280
caaaatcgcg tgacgccggt acatcgcatt gtgcagcagc ccggcgaaac ctggttcgcg 2340
cgtacgcagg aagattctcg tgagtggccg gaaacggtgc gtaccttgct gattccagag 2400
cataaaggtc atctggatct ggttgtactg atgatgcaac tgggtaaaca gcaaattaac 2460
agcatctggg tggaagcggg gccaacgctc gctggcgcat tgctgcaggc gggtttagtc 2520
gatgagctga ttgtctatat cgcacctaaa ctattaggca gcgacgcccg cggattatgc 2580
acgctgccag ggcttgagaa attagccgac gccccccaat ttaaattcaa agagatacgt 2640
catgtaggcc cggatgtttg cctgcattta gtgggtgcat gagtcgacac atacgtcaaa 2700
cgcaggaaga ggaggaaata catgaacatt attgaagcta acgttgctac cccggacgct 2760
cgcgtcgcca tcaccatcgc gcgtttcaac aactttatca atgacagcct gctggaaggt 2820
gcaattgacg cactgaaacg tatcggtcag gtaaaagatg aaaacattac cgttgtttgg 2880
gtgcctggtg cctatgagct gccgctggcg gcgggtgcac tggctaaaac cggtaaatac 2940
gacgcggtga ttgcgctggg tacggttatt cgtggtggca ctgcccactt tgaatatgtc 3000
gctggtggtg caagcaacgg cctggcgcat gttgcccagg acagcgaaat tccggttgct 3060
tttggggttc tgaccactga aagcattgaa caagcgatcg aacgtgctgg caccaaagct 3120
ggcaacaaag gtgcagaagc tgcactgacc gcgcttgaaa tgattaatgt attgaaagcc 3180
atcaaggcct gagaggacgc agacgcgcct cttacaggag gagagagatg tttacgggga 3240
ttgtacaggg caccgcaaaa ctggtgtcga ttgacgagaa accaaatttt cgtacgcatg 3300
tggtggagtt acccgaccac atgctggacg gcctggaaac cggtgcttcc gtggcgcata 3360
acggttgctg cctgaccgtg acggaaatta acggcaacca tgtcagtttt gacctgatga 3420
aagaaacgtt acgcattacc aatcttggcg atttaaaagt gggggattgg gtaaacgttg 3480
agcgtgcggc gaaattcagt gatgaaattg gcggacactt aatgtcaggt catattatga 3540
ccactgctga agtggcgaaa atattaacct cagaaaataa tcgccagatc tggtttaaag 3600
tccaggatag tcagttgatg aaatatattc tgtacaaagg atttattggc atcgacggta 3660
ttagcctgac cgtcggcgaa gtcacgccaa cgcgtttttg cgtccattta attccggaaa 3720
cactggaacg cacgactctt gggaagaaaa aacttggcgc acgcgtcaac attgaaatcg 3780
atccacaaac tcaggcagtg gtagatacgg tagaacgtgt gctggcggca cgagaaaatg 3840
ccatgaatca accaggcaca gaagcctgaa agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga 3900
ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc 3960
ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc 4020
gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa 4080
ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 4140
aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg 4200
cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag 4260
gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa 4320
tacatgtgac ggaagatcac ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg 4380
ggaagccctg ggccaacttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca 4440
actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt 4500
caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat 4560
cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata 4620
accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca 4680
agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc 4740
gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg 4800
ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc 4860
ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt 4920
tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca 4980
ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg 5040
gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg 5100
ccgtctgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg 5160
agtggcaggg cggggcgtaa tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa acgcctggtg 5220
ctacgcctga ataagtgata ataagcggat gaatggcaga aattcgaaag caaattcgac 5280
ccggtcgtcg gttcagggca gggtcgttaa atagccgctt atgtctattg ctggttctaa 5340
gcctgttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc agtctgaatg acctgtcacg 5400
ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag gaactgctga acagcaaaaa 5460
gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc tgagaagccc gtgacgggct 5520
tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa aaggcgcctg tagtgccatt 5580
tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg aatgtcacga aaaagacagc 5640
gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca gcgatttgcc cgagcttgcg 5700
agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt gtagaggagc aaacagcgtt 5760
tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta gtgagttata cacagggctg 5820
ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc tataaattat aaccacttga 5880
atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta cagagggtct agcagaattt 5940
acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac ccacaactca aaggaaaagg 6000
actagtaatt atcattgact agcccatctc aattggtata gtgattaaaa tcacctagac 6060
caattgagat gtatgtctga attagttgtt ttcaaagcaa atgaactagc gattagtcgc 6120
tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta attttatgct gtgtggcact actcaacccc 6180
acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg acggtatcgt tcacttataa ccaatacgct 6240
cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct tatggtgtat tagctaaagc aaccagagag 6300
ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat cctttggtta aaggctttga gattttccag 6360
tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa aaattagaat tagtttttag tgaagagata 6420
ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc ataaaatata atctggaaca tgttaagtct 6480
tttgaaaaca aatactctat gaggatttat gagtggttat taaaagaact aacacaaaag 6540
aaaactcaca aggcaaatat agagattagc cttgatgaat ttaagttcat gttaatgctt 6600
gaaaataact accatgagtt taaaaggctt aaccaatggg ttttgaaacc aataagtaaa 6660
gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg gtggttgata agcgaggccg cccgactgat 6720
acgttgattt tccaagttga actagataga caaatggatc tcgtaaccga acttgagaac 6780
aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata ccaacaacca ttacatcaga ttcctaccta 6840
cataacggac taagaaaaac actacacgat gctttaactg caaaaattca gctcaccagt 6900
tttgaggcaa aatttttgag tgacatgcaa agtaagtatg atctcaatgg ttcgttctca 6960
tggctcacgc aaaaacaacg aaccacacta gagaacatac tggctaaata cggaaggatc 7020
tgaggttctt atggctcttg tatctatcag tgaagcatca agactaacaa acaaaagtag 7080
aacaactgtt caccgttaca tatcaaaggg aaaactgtcc atatgcacag atgaaaacgg 7140
tgtaaaaaag atagatacat cagagctttt acgagttttt ggtgcattca aagctgttca 7200
ccatgaacag atcgacaatg taac 7224
<210> 5
<211> 3744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 60
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 120
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 180
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 240
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 300
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 360
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 420
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 480
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 540
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 600
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 660
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 720
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 780
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 840
gattttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gttctgattt 900
cggtactcaa tcgccggtta accttgaccg ctgtacaagg tatactcgga cgattttcac 960
tgttttgagc cagacatgaa gctgatacgc ggcatacata atctcagcca ggccccgcaa 1020
gaagggtgtg tgctgactat tggtaatttc gacggcgtgc atcgcggtca tcgcgcgctg 1080
ttacagggct tgcaggaaga agggcgcaag cgcaacttac cggtgatgct ttttgaacct 1140
caaccactgg aactgtttgc taccgataaa gccccggcaa gactgacccg gctgcgggaa 1200
aaactgcgtt accttgcaga gtgtggcgtt gattacgtgc tgtgcgtgcg tttcgacagg 1260
cgtttcgcgg cgttaaccgc gcaaaatttc atcagcgaac ttctggtgaa gcatttgcgc 1320
gtaaaatttc ttgccgtagg tgatgatttc cgctttggcg ctggtcgtga aggcgatttc 1380
ttgttattac agaaagctgg catggaatac ggcttcgata tcaccagtac gcaaactttt 1440
tgcgaaggtg gcgtgcgcat cagcagcacc gccgtgcgtc aggcccttgc ggatgacaat 1500
ctggctctgg cagagagttt actggggcac ccgtttgcca tctccgggcg tgtagtccac 1560
ggtgatgaat tagggcgcac tataggtttc ccgacggcga atgtaccgct gcgccgtcag 1620
gtttccccgg tgaaaggggt ttatgcggta gaagtgctgg gcctcggtga aaagccgtta 1680
cccggcgtgg caaacatcgg aacacgccca acggttgccg gtattcgcca gcagctggaa 1740
gtgcatttgt tagatgttgc aatggacctt tacggtcgcc atatacaagt agtgctgcgt 1800
aaaaaaatac gcaatgagca gcgatttgcg tcgctggacg aactgaaagc gcagattgcg 1860
cgtgatgaat taaccgcccg cgaatttttt gggctaacaa aaccggctta actgaagcca 1920
aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt 1980
ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta gggatatatt 2040
ccgcttcctg cccgttccat acagaagctg ggcgaacaaa cgatgctcgc cttccagaaa 2100
accgaggatg cgaaccactt catccggggt cagcaccacc ggcaagcgcc gcgacggccg 2160
aggtcttccg atctcctgaa gccagggcag atccgtgcac agcaccttgc cgtagaagaa 2220
cagcaaggcc gccaatgcct gacgatgcgt ggagaccgaa accttgcgct cgttcgccag 2280
ccaggacaga aatgcctcga cttcgctgct gcccaaggtt gccgggtgac gcacaccgtg 2340
gaaacggatg aaggcacgaa cccagtggac ataagcctgt tcggttcgta agctgtaatg 2400
caagtagcgt atgcgctcac gcaactggtc cagaaccttg accgaacgca gcggtggtaa 2460
cggcgcagtg gcggttttca tggcttgtta tgactgtttt tttggggtac agtctatgcc 2520
tcgggcatcc aagcagcaag cgcgttacgc cgtgggtcga tgtttgatgt tatggagcag 2580
caacgatgtt acgcagcagg gcagtcgccc taaaacaaag ttaaacatca tgagggaagc 2640
ggtgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct 2700
cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc 2760
acacagtgat attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg 2820
agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct ggagagagcg agattctccg 2880
cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa 2940
gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc 3000
agccacgatc gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc 3060
cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga 3120
ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg 3180
aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc 3240
gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat 3300
acttgaagct agacaggctt atcttggaca agaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga 3360
tcagttggaa gaatttgtcc actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata 3420
atgtctaaca attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag 3480
atgcactaag cacataattg ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt 3540
tttaagcgtg cataataagc cctacacaaa ttgggagata tatcatgaaa ggctggcttt 3600
ttcttgttat cgcaatagtt ggcgaagtaa tcgcaacatc cgcattaaaa tctagcgagg 3660
gctttactaa gctcctgcag agatctgaat tccctagaga gacgaaagtg attgcgccta 3720
cccggatatt atcgtgagga tgcg 3744
<210> 6
<211> 571
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 6
agcggacatc tgaagagttg catcattatt acgagattgt ctgggacgaa gagcagacgc 60
acaaattcaa gaatatctcc ccgcatttac agcgcattaa agcgttcaaa accctcgggt 120
aaatgccctc gtcgcatcag gtaaccttgc cggtacctga tgcgctccga attctgtggg 180
tcggataagg cgtccacgcc gcatccgaca gtcgagcatc aatgcctgat gcgcttctta 240
tcaggcctac cgaacgccct gcatacaccc ctcactctat atcactctca caaattcgct 300
caaataataa acaataaact ctgttttttg atctcacccg gtaaagtcgc ctatcttttc 360
agcaacaaaa cttgattaac atcaattttg gtatgaccaa tgcaccattc atgttattct 420
caatagcgaa gaacattttc attgctgtaa cctgttgtta attaagagct atgttaataa 480
ccattaatta acaattggtt aataaattta agggggtcac gttgactacg tcgacgtaca 540
ctggcggatg tggcataaac gcctcattac c 571
<210> 7
<211> 778
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcataaacg cctcattacc ctgttatccc tactaagcac ttgtctcctg tttactcccc 60
tgagcttgag gggtcaacat gaaggtcatt gatagcagga taataataca gtaaaacgct 120
aaaccaataa tccaaatcca gccatcccaa attggtagtg aatgattata aataacagta 180
aacagtaatg ggccaataac accggttgca ttggtaaggc tcaccaataa tccctgtaaa 240
gcaccttgct catgactctt tgtttggata gacatcactc cctgtaatgc aggtaaagcg 300
atcccaccac cagccaataa aattaaaaca gggaaatcta accaaccttc agatataaac 360
gctaaaaagg caaatgcact actatctgca ataaattcga gcagtactgc cgttttttcg 420
ccccatttag tggctattct tcctgccaca aaggcttgga atactgagtg taaaagacca 480
agacccgcta atgaaaagcc aaccatcatg ctattccatc caaaacgatt ttcggtaaat 540
agcacccaca ccgttgcggg aatttggcct atcaattgcg ctgaaaaata aataatcaac 600
aaaatgggca tcgttttaaa taaagtgatg tacaccgaat ttgattgcgt ctcaacccct 660
acttcggtat ctgtattatc acgtgtattt ttggtttcac ggaaccaaaa cataaccaca 720
aggaaagtga caatatttag caacgcagcg ataaaaaagg gactatgcgg tgaaatct 778
<210> 8
<211> 703
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgaatttga ttgcgtctca acccctactt cggtatctgt attatcacgt gtatttttgg 60
tttcacggaa ccaaaacata accacaagga aagtgacaat atttagcaac gcagcgataa 120
aaaagggact atgcggtgaa atctctcctg caaaaccacc aataataggc cccgctatta 180
aaccaagccc aaaacttgcc cctaaccaac cgaaccactt cacgcgttga gaagctgagg 240
tggtatcggc aatgaccgat gccgcgacag ccccagtagc tcctgtgatc cctgaaagca 300
aacggcctaa atacagcatc caaagcgcac ttgaaaaagc cagcaataag taatccagcg 360
atgcgcctat taatgacaac aacagcactg ggcgccgacc aaatcggtca gacatttttc 420
caagccaagg agcaaagata acctgcatta acgcataaag tgcaagcaat acgccaaagt 480
ggttagcgat atcttccgaa gcaataaatt cacgtaataa cgttggcaag actggcatga 540
taaggccaat ccccatggca tcgagtaacg taattaccaa tgcgatcttt gtcgaactat 600
tcatattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata cgcgaaaggt 660
ggtgtcaacg taaatattac cctgttatcc ctataatcga cgt 703
<210> 9
<211> 520
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 9
gttatcccta taatcgacgt acactggcgg atgtggcata aacgcctcat ccgcccttga 60
ggaacagcgc gatcggcagc cgcgttgtat caggcatcct ttcagactcc tccgaatcct 120
taagtatttc cagccattcc cgcgcttttc atcttctgtc tgatagctgc ttttctcctt 180
cgcttgcatg attggcataa ctgcaaagaa ggaggtgttc ccgtgaataa atcaatgttg 240
gcgggtatcg ggattggtgt cgcagctgcg ctgggcgtag cggcagtggc cagtctgaac 300
gtgtttgaac ggggcccgca atacgctcag gttgtttctg caaccccaat caaggaaacg 360
gttaaaacac cgcgtcagga gtgtcgcaac gtcacagtga cccatcgtcg accggtgcag 420
gatgaaaatc gcattaccgg gtcggtgctc ggcgctgttg ctggcggcgt gatagggcat 480
cagtttggtg gtggtcgcgg taaagatgtc gccactgttg 520
<210> 10
<211> 2388
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcggacatc tgaagagttg catcattatt acgagattgt ctgggacgaa gagcagacgc 60
acaaattcaa gaatatctcc ccgcatttac agcgcattaa agcgttcaaa accctcgggt 120
aaatgccctc gtcgcatcag gtaaccttgc cggtacctga tgcgctccga attctgtggg 180
tcggataagg cgtccacgcc gcatccgaca gtcgagcatc aatgcctgat gcgcttctta 240
tcaggcctac cgaacgccct gcatacaccc ctcactctat atcactctca caaattcgct 300
caaataataa acaataaact ctgttttttg atctcacccg gtaaagtcgc ctatcttttc 360
agcaacaaaa cttgattaac atcaattttg gtatgaccaa tgcaccattc atgttattct 420
caatagcgaa gaacattttc attgctgtaa cctgttgtta attaagagct atgttaataa 480
ccattaatta acaattggtt aataaattta agggggtcac gttgactacg tcgacgtaca 540
ctggcggatg tggcataaac gcctcattac cctgttatcc ctactaagca cttgtctcct 600
gtttactccc ctgagcttga ggggtcaaca tgaaggtcat tgatagcagg ataataatac 660
agtaaaacgc taaaccaata atccaaatcc agccatccca aattggtagt gaatgattat 720
aaataacagt aaacagtaat gggccaataa caccggttgc attggtaagg ctcaccaata 780
atccctgtaa agcaccttgc tcatgactct ttgtttggat agacatcact ccctgtaatg 840
caggtaaagc gatcccacca ccagccaata aaattaaaac agggaaatct aaccaacctt 900
cagatataaa cgctaaaaag gcaaatgcac tactatctgc aataaattcg agcagtactg 960
ccgttttttc gccccattta gtggctattc ttcctgccac aaaggcttgg aatactgagt 1020
gtaaaagacc aagacccgct aatgaaaagc caaccatcat gctattccat ccaaaacgat 1080
tttcggtaaa tagcacccac accgttgcgg gaatttggcc tatcaattgc gctgaaaaat 1140
aaataatcaa caaaatgggc atcgttttaa ataaagtgat gtacaccgaa tttgattgcg 1200
tctcaacccc tacttcggta tctgtattat cacgtgtatt tttggtttca cggaaccaaa 1260
acataaccac aaggaaagtg acaatattta gcaacgcagc gataaaaaag ggactatgcg 1320
gtgaaatctc tcctgcaaaa ccaccaataa taggccccgc tattaaacca agcccaaaac 1380
ttgcccctaa ccaaccgaac cacttcacgc gttgagaagc tgaggtggta tcggcaatga 1440
ccgatgccgc gacagcccca gtagctcctg tgatccctga aagcaaacgg cctaaataca 1500
gcatccaaag cgcacttgaa aaagccagca ataagtaatc cagcgatgcg cctattaatg 1560
acaacaacag cactgggcgc cgaccaaatc ggtcagacat ttttccaagc caaggagcaa 1620
agataacctg cattaacgca taaagtgcaa gcaatacgcc aaagtggtta gcgatatctt 1680
ccgaagcaat aaattcacgt aataacgttg gcaagactgg catgataagg ccaatcccca 1740
tggcatcgag taacgtaatt accaatgcga tctttgtcga actattcata ttcaccaccc 1800
tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccatacgcga aaggtggtgt caacgtaaat 1860
attaccctgt tatccctata atcgacgtac actggcggat gtggcataaa cgcctcatcc 1920
gcccttgagg aacagcgcga tcggcagccg cgttgtatca ggcatccttt cagactcctc 1980
cgaatcctta agtatttcca gccattcccg cgcttttcat cttctgtctg atagctgctt 2040
ttctccttcg cttgcatgat tggcataact gcaaagaagg aggtgttccc gtgaataaat 2100
caatgttggc gggtatcggg attggtgtcg cagctgcgct gggcgtagcg gcagtggcca 2160
gtctgaacgt gtttgaacgg ggcccgcaat acgctcaggt tgtttctgca accccaatca 2220
aggaaacggt taaaacaccg cgtcaggagt gtcgcaacgt cacagtgacc catcgtcgac 2280
cggtgcagga tgaaaatcgc attaccgggt cggtgctcgg cgctgttgct ggcggcgtga 2340
tagggcatca gtttggtggt ggtcgcggta aagatgtcgc cactgttg 2388
<210> 11
<211> 536
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 11
ctacggcatg ttgctctccc gctatgcgcc ggatatgaat catgtcacag ccgcacagta 60
ccaggcggcg atgcgtggcg cgatacctca ggttgcgccg gtattctgga gtttccgcat 120
catggtgggc tgtggttccc tgctgctact ggtgatgctg attgcgcttg tccagacgct 180
gcgtggcaaa atcgaccagc atcgctgggt gctgaaaatg gcgctctgga gtttgccgtt 240
gccgtggatt gcgattgaag ccgggtggtt tatgaccgag tttggtcgtc agccgtgggc 300
gatacaggac atcttaccga catactccgc gcactccgct ttaaccacag gacaactggc 360
tttctcactg atcatgatcg tagggcttta caccctgttc ttaatcgccg aagtctacct 420
gatgcagaaa tatgcccgtc tggggccgag cgcgatgcag agtgaacaac cgacgcagca 480
acaggggtaa aggagaaaat cggagcagaa acaatgtggt atttactttg gttcgt 536
<210> 12
<211> 784
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggtatttac tttggttcgt attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctcctgttta 60
ctcccctgag cttgaggggt caacatgaag gtcattgata gcaggataat aatacagtaa 120
aacgctaaac caataatcca aatccagcca tcccaaattg gtagtgaatg attataaata 180
acagtaaaca gtaatgggcc aataacaccg gttgcattgg taaggctcac caataatccc 240
tgtaaagcac cttgctcatg actctttgtt tggatagaca tcactccctg taatgcaggt 300
aaagcgatcc caccaccagc caataaaatt aaaacaggga aatctaacca accttcagat 360
ataaacgcta aaaaggcaaa tgcactacta tctgcaataa attcgagcag tactgccgtt 420
ttttcgcccc atttagtggc tattcttcct gccacaaagg cttggaatac tgagtgtaaa 480
agaccaagac ccgctaatga aaagccaacc atcatgctat tccatccaaa acgattttcg 540
gtaaatagca cccacaccgt tgcgggaatt tggcctatca attgcgctga aaaataaata 600
atcaacaaaa tgggcatcgt tttaaataaa gtgatgtaca ccgaatttga ttgcgtctca 660
acccctactt cggtatctgt attatcacgt gtatttttgg tttcacggaa ccaaaacata 720
accacaagga aagtgacaat atttagcaac gcagcgataa aaaagggact atgcggtgaa 780
atct 784
<210> 13
<211> 703
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgaatttga ttgcgtctca acccctactt cggtatctgt attatcacgt gtatttttgg 60
tttcacggaa ccaaaacata accacaagga aagtgacaat atttagcaac gcagcgataa 120
aaaagggact atgcggtgaa atctctcctg caaaaccacc aataataggc cccgctatta 180
aaccaagccc aaaacttgcc cctaaccaac cgaaccactt cacgcgttga gaagctgagg 240
tggtatcggc aatgaccgat gccgcgacag ccccagtagc tcctgtgatc cctgaaagca 300
aacggcctaa atacagcatc caaagcgcac ttgaaaaagc cagcaataag taatccagcg 360
atgcgcctat taatgacaac aacagcactg ggcgccgacc aaatcggtca gacatttttc 420
caagccaagg agcaaagata acctgcatta acgcataaag tgcaagcaat acgccaaagt 480
ggttagcgat atcttccgaa gcaataaatt cacgtaataa cgttggcaag actggcatga 540
taaggccaat ccccatggca tcgagtaacg taattaccaa tgcgatcttt gtcgaactat 600
tcatattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata cgcgaaaggt 660
ggtgtcaacg taaatattac cctgttatcc ctaggagcag aaa 703
<210> 14
<211> 482
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 14
gttatcccta ggagcagaaa caatgtggta tttactttgg ttcgtcggca ttttgttgat 60
gtgttcgctc tccacccttg tgttggtatg gctggacccg cgtctgaaaa gttaacgaac 120
gtaggcctga tgcggcgcat tagcatcgca tcaggcaatc aataatgtca gatatgaaaa 180
gcggaaacat atcgatgaaa gcgatcttaa tcccattttt atctcttctg attccgttaa 240
ccccgcaatc tgcattcgct cagagtgagc cggagctgaa gctggaaagt gtggtgattg 300
tcagtcgtca tggtgtgcgt gctccaacca aggccacgca actgatgcag gatgtcaccc 360
cagacgcatg gccaacctgg ccggtaaaac tgggttggct gacaccgcgc ggtggtgagc 420
taatcgccta tctcggacat taccaacgcc agcgtctggt agccgacgga ttgctggcga 480
aa 482
<210> 15
<211> 2321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctacggcatg ttgctctccc gctatgcgcc ggatatgaat catgtcacag ccgcacagta 60
ccaggcggcg atgcgtggcg cgatacctca ggttgcgccg gtattctgga gtttccgcat 120
catggtgggc tgtggttccc tgctgctact ggtgatgctg attgcgcttg tccagacgct 180
gcgtggcaaa atcgaccagc atcgctgggt gctgaaaatg gcgctctgga gtttgccgtt 240
gccgtggatt gcgattgaag ccgggtggtt tatgaccgag tttggtcgtc agccgtgggc 300
gatacaggac atcttaccga catactccgc gcactccgct ttaaccacag gacaactggc 360
tttctcactg atcatgatcg tagggcttta caccctgttc ttaatcgccg aagtctacct 420
gatgcagaaa tatgcccgtc tggggccgag cgcgatgcag agtgaacaac cgacgcagca 480
acaggggtaa aggagaaaat cggagcagaa acaatgtggt atttactttg gttcgtatta 540
ccctgttatc cctactaagc acttgtctcc tgtttactcc cctgagcttg aggggtcaac 600
atgaaggtca ttgatagcag gataataata cagtaaaacg ctaaaccaat aatccaaatc 660
cagccatccc aaattggtag tgaatgatta taaataacag taaacagtaa tgggccaata 720
acaccggttg cattggtaag gctcaccaat aatccctgta aagcaccttg ctcatgactc 780
tttgtttgga tagacatcac tccctgtaat gcaggtaaag cgatcccacc accagccaat 840
aaaattaaaa cagggaaatc taaccaacct tcagatataa acgctaaaaa ggcaaatgca 900
ctactatctg caataaattc gagcagtact gccgtttttt cgccccattt agtggctatt 960
cttcctgcca caaaggcttg gaatactgag tgtaaaagac caagacccgc taatgaaaag 1020
ccaaccatca tgctattcca tccaaaacga ttttcggtaa atagcaccca caccgttgcg 1080
ggaatttggc ctatcaattg cgctgaaaaa taaataatca acaaaatggg catcgtttta 1140
aataaagtga tgtacaccga atttgattgc gtctcaaccc ctacttcggt atctgtatta 1200
tcacgtgtat ttttggtttc acggaaccaa aacataacca caaggaaagt gacaatattt 1260
agcaacgcag cgataaaaaa gggactatgc ggtgaaatct ctcctgcaaa accaccaata 1320
ataggccccg ctattaaacc aagcccaaaa cttgccccta accaaccgaa ccacttcacg 1380
cgttgagaag ctgaggtggt atcggcaatg accgatgccg cgacagcccc agtagctcct 1440
gtgatccctg aaagcaaacg gcctaaatac agcatccaaa gcgcacttga aaaagccagc 1500
aataagtaat ccagcgatgc gcctattaat gacaacaaca gcactgggcg ccgaccaaat 1560
cggtcagaca tttttccaag ccaaggagca aagataacct gcattaacgc ataaagtgca 1620
agcaatacgc caaagtggtt agcgatatct tccgaagcaa taaattcacg taataacgtt 1680
ggcaagactg gcatgataag gccaatcccc atggcatcga gtaacgtaat taccaatgcg 1740
atctttgtcg aactattcat attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat 1800
gccatacgcg aaaggtggtg tcaacgtaaa tattaccctg ttatccctag gagcagaaac 1860
aatgtggtat ttactttggt tcgtcggcat tttgttgatg tgttcgctct ccacccttgt 1920
gttggtatgg ctggacccgc gtctgaaaag ttaacgaacg taggcctgat gcggcgcatt 1980
agcatcgcat caggcaatca ataatgtcag atatgaaaag cggaaacata tcgatgaaag 2040
cgatcttaat cccattttta tctcttctga ttccgttaac cccgcaatct gcattcgctc 2100
agagtgagcc ggagctgaag ctggaaagtg tggtgattgt cagtcgtcat ggtgtgcgtg 2160
ctccaaccaa ggccacgcaa ctgatgcagg atgtcacccc agacgcatgg ccaacctggc 2220
cggtaaaact gggttggctg acaccgcgcg gtggtgagct aatcgcctat ctcggacatt 2280
accaacgcca gcgtctggta gccgacggat tgctggcgaa a 2321
<210> 16
<211> 364
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli )
<400> 16
tgccaataat caccagatcc ggctgcggct cgagctggct ggcatcgtac ccctgaatca 60
gctcaatgcc ttgcttctca agtaaggtgc tcatcggcgg atacacattg gcgtccgaac 120
ccgttacttc atggcctaac tggcgcgcca gcatcgccag accgcccata aatgtgccac 180
aaattcctaa aatatgaatg cgcatacgtc actatccttt tttaatctgc cgctcatttt 240
acgcatatgt cgggcaagtg agaaacgcat ttcaggataa tccgtaattt gctggcgcga 300
ttcacctgag cgcaacattg agattatttg gagctgttga caattaatca tccggctcgt 360
ataa 364
<210> 17
<211> 734
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggtagg gataacaggg taatgtacca 60
tttacgttga caccaccttt cgcgtatggc atgatagcgc ccggaagaga gtcaattcag 120
ggtggtgaat atgaatagtt cgacaaagat cgcattggta attacgttac tcgatgccat 180
ggggattggc cttatcatgc cagtcttgcc aacgttatta cgtgaattta ttgcttcgga 240
agatatcgct aaccactttg gcgtattgct tgcactttat gcgttaatgc aggttatctt 300
tgctccttgg cttggaaaaa tgtctgaccg atttggtcgg cgcccagtgc tgttgttgtc 360
attaataggc gcatcgctgg attacttatt gctggctttt tcaagtgcgc tttggatgct 420
gtatttaggc cgtttgcttt cagggatcac aggagctact ggggctgtcg cggcatcggt 480
cattgccgat accacctcag cttctcaacg cgtgaagtgg ttcggttggt taggggcaag 540
ttttgggctt ggtttaatag cggggcctat tattggtggt tttgcaggag agatttcacc 600
gcatagtccc ttttttatcg ctgcgttgct aaatattgtc actttccttg tggttatgtt 660
ttggttccgt gaaaccaaaa atacacgtga taatacagat accgaagtag gggttgagac 720
gcaatcaaat tcgg 734
<210> 18
<211> 799
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agatttcacc gcatagtccc ttttttatcg ctgcgttgct aaatattgtc actttccttg 60
tggttatgtt ttggttccgt gaaaccaaaa atacacgtga taatacagat accgaagtag 120
gggttgagac gcaatcaaat tcggtgtaca tcactttatt taaaacgatg cccattttgt 180
tgattattta tttttcagcg caattgatag gccaaattcc cgcaacggtg tgggtgctat 240
ttaccgaaaa tcgttttgga tggaatagca tgatggttgg cttttcatta gcgggtcttg 300
gtcttttaca ctcagtattc caagcctttg tggcaggaag aatagccact aaatggggcg 360
aaaaaacggc agtactgctc gaatttattg cagatagtag tgcatttgcc tttttagcgt 420
ttatatctga aggttggtta gatttccctg ttttaatttt attggctggt ggtgggatcg 480
ctttacctgc attacaggga gtgatgtcta tccaaacaaa gagtcatgag caaggtgctt 540
tacagggatt attggtgagc cttaccaatg caaccggtgt tattggccca ttactgttta 600
ctgttattta taatcattca ctaccaattt gggatggctg gatttggatt attggtttag 660
cgttttactg tattattatc ctgctatcaa tgaccttcat gttgacccct caagctcagg 720
ggagtaaaca ggagacaagt gcttagtagg gataacaggg taatttgaca attaatcatc 780
cggctcgtat aatgtgtgg 799
<210> 19
<211> 390
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 19
tttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggttaa gattgttgcg gtcgctttac 60
tccataaaca ttgcagggaa agttttatga aaacgttagg tgaatttatt gtcgaaaagc 120
agcacgagtt ttctcatgct accggtgagc tcactgcttt gctgtcggca ataaaactgg 180
gcgccaagat tatccatcgc gatatcaaca aagcaggact ggttgatatc ctgggtgcca 240
gcggtgctga gaacgtgcag ggcgaggttc agcagaaact cgacttgttc gctaatgaaa 300
aactgaaagc cgcactgaaa gcacgcgata tcgttgcggg cattgcctct gaagaagaag 360
atgagattgt cgtctttgaa ggctgtgaac 390
<210> 20
<211> 2078
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgccaataat caccagatcc ggctgcggct cgagctggct ggcatcgtac ccctgaatca 60
gctcaatgcc ttgcttctca agtaaggtgc tcatcggcgg atacacattg gcgtccgaac 120
ccgttacttc atggcctaac tggcgcgcca gcatcgccag accgcccata aatgtgccac 180
aaattcctaa aatatgaatg cgcatacgtc actatccttt tttaatctgc cgctcatttt 240
acgcatatgt cgggcaagtg agaaacgcat ttcaggataa tccgtaattt gctggcgcga 300
ttcacctgag cgcaacattg agattatttg gagctgttga caattaatca tccggctcgt 360
ataatgtgtg gtagggataa cagggtaatg taccatttac gttgacacca cctttcgcgt 420
atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa ttcagggtgg tgaatatgaa tagttcgaca 480
aagatcgcat tggtaattac gttactcgat gccatgggga ttggccttat catgccagtc 540
ttgccaacgt tattacgtga atttattgct tcggaagata tcgctaacca ctttggcgta 600
ttgcttgcac tttatgcgtt aatgcaggtt atctttgctc cttggcttgg aaaaatgtct 660
gaccgatttg gtcggcgccc agtgctgttg ttgtcattaa taggcgcatc gctggattac 720
ttattgctgg ctttttcaag tgcgctttgg atgctgtatt taggccgttt gctttcaggg 780
atcacaggag ctactggggc tgtcgcggca tcggtcattg ccgataccac ctcagcttct 840
caacgcgtga agtggttcgg ttggttaggg gcaagttttg ggcttggttt aatagcgggg 900
cctattattg gtggttttgc aggagagatt tcaccgcata gtcccttttt tatcgctgcg 960
ttgctaaata ttgtcacttt ccttgtggtt atgttttggt tccgtgaaac caaaaataca 1020
cgtgataata cagataccga agtaggggtt gagacgcaat caaattcggt gtacatcact 1080
ttatttaaaa cgatgcccat tttgttgatt atttattttt cagcgcaatt gataggccaa 1140
attcccgcaa cggtgtgggt gctatttacc gaaaatcgtt ttggatggaa tagcatgatg 1200
gttggctttt cattagcggg tcttggtctt ttacactcag tattccaagc ctttgtggca 1260
ggaagaatag ccactaaatg gggcgaaaaa acggcagtac tgctcgaatt tattgcagat 1320
agtagtgcat ttgccttttt agcgtttata tctgaaggtt ggttagattt ccctgtttta 1380
attttattgg ctggtggtgg gatcgcttta cctgcattac agggagtgat gtctatccaa 1440
acaaagagtc atgagcaagg tgctttacag ggattattgg tgagccttac caatgcaacc 1500
ggtgttattg gcccattact gtttactgtt atttataatc attcactacc aatttgggat 1560
ggctggattt ggattattgg tttagcgttt tactgtatta ttatcctgct atcaatgacc 1620
ttcatgttga cccctcaagc tcaggggagt aaacaggaga caagtgctta gtagggataa 1680
cagggtaatt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggttaaga ttgttgcggt 1740
cgctttactc cataaacatt gcagggaaag ttttatgaaa acgttaggtg aatttattgt 1800
cgaaaagcag cacgagtttt ctcatgctac cggtgagctc actgctttgc tgtcggcaat 1860
aaaactgggc gccaagatta tccatcgcga tatcaacaaa gcaggactgg ttgatatcct 1920
gggtgccagc ggtgctgaga acgtgcaggg cgaggttcag cagaaactcg acttgttcgc 1980
taatgaaaaa ctgaaagccg cactgaaagc acgcgatatc gttgcgggca ttgcctctga 2040
agaagaagat gagattgtcg tctttgaagg ctgtgaac 2078
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agcggacatc tgaagagt 18
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggtaatgagg cgtttatgcc acatccgcca gtgtacgtcg acgtagtcaa cgtgaccc 58
<210> 23
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggcataaacg cctcattacc ctgttatccc tactaagcac ttgtctcctg tt 52
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agatttcacc gcatagtcc 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccgaatttga ttgcgtctc 19
<210> 26
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgtcgatta tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctt 48
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttatcccta taatcgacgt acactggc 28
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caacagtggc gacatctt 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctacggcatg ttgctctc 18
<210> 30
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acgaaccaaa gtaaatacca cattgtttct gctccgattt tctcctttac ccctgt 56
<210> 31
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tggtatttac tttggttcgt attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctcctgtt 58
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tttctgctcc tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctt 48
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttatcccta ggagcagaaa caatgtgg 28
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tttcgccagc aatccgtc 18
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgccaataat caccagatcc g 21
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttatacgagc cggatgatta attgtcaaca gctccaaata atctcaatgt tgcgctcag 59
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggtagg gataacaggg taatgtacc 59
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccacacatta tacgagccgg atgattaatt gtcaaattac cctgttatcc ctactaag 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggttaa gattgttgcg gtcgct 56
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttcacagcc ttcaaagacg a 21

Claims (5)

1.高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)敲除大肠杆菌LS02的低效率呼吸链相关基因ndh和低效率呼吸链相关基因appB，并过表达糖酵解途径的基因fbp，得到EC-FMN 03菌株；
所述低效率呼吸链相关基因ndh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述低效率呼吸链相关基因appB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述糖酵解途径的基因fbp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)将质粒pLS01转入EC-FMN 03菌株中并制作成电转感受态；将质粒p20C-ribFM-1转入电转感受态中，得到高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株，命名为EC-FMN 04菌株；
所述质粒pLS01的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述质粒p20C-ribFM-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1的方法构建的高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株。
3.权利要求2的高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株发酵生产黄素单核苷酸的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征是包括如下步骤：
(1)活化菌株：将权利要求2的高产黄素单核苷酸的大肠杆菌菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养12-20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12-20h；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始OD600为0.025的接种量接种到发酵培养基中，摇瓶装液量为50mL/500mL，加入氯霉素使终浓度为10mg/L，加入奇霉素使终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养，得到黄素单核苷酸。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征是所述发酵培养基为按比例，取1mL组分I，1mL组分II，1mL组分III和IV的混合液，加入葡萄糖使终浓度为10g/L，加入酵母提取物使终浓度为5g/L，加蒸馏水至50mL；
所述组分I为：取10g-30g(NH4)2SO4，2g MgSO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分II为：取38.3g Na2HPO4，15g KH2PO4，用蒸馏水定容到200mL，121℃灭菌20min；
所述组分III为：取5g柠檬酸铁铵，2g CaCl2·2H2O，41.7mL浓度为12mol/L的HCl水溶液，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分IV为：取1g ZnSO4·7H2O，0.3g MnCl2·4H2O，3g H3BO3，2g CoCl2·6H2O，0.1gCuSO4·5H2O，0.2g NiCl2·6H2O，0.3g NaMoO4·2H2O，用蒸馏水定容到1000mL；
所述组分III和IV的混合液为：取100ml组分III，1ml组分IV，用蒸馏水定容到200mL，并用5M的NaOH水溶液调pH值到4.5-5.5，121℃灭菌20min。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101115832A (zh) * 2004-11-26 2008-01-30 协和发酵工业株式会社 工业上有用的微生物
CN101633690A (zh) * 2008-07-22 2010-01-27 清华大学 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用
CN103865944A (zh) * 2014-02-20 2014-06-18 天津大学 一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途
CN104220591A (zh) * 2012-01-25 2014-12-17 森文特公司 来自芽孢杆菌的新型甲醇脱氢酶
CN105483071A (zh) * 2015-12-29 2016-04-13 天津大学 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法
CN112961814A (zh) * 2020-12-08 2021-06-15 天津大学 一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和ffa的大肠杆菌工程菌的构建方法
WO2021198904A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Pirelli Tyre S.P.A. Process of engineering an oleaginous microorganism
CN113564190A (zh) * 2021-07-16 2021-10-29 天津大学 高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013103780A1 (en) * 2012-01-06 2013-07-11 Trustees Of Boston University Compositions and methods to boost endogenous ros production from bacteria
JP2016165225A (ja) * 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
US20200224283A1 (en) * 2019-01-10 2020-07-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Ratiometric biosensor to measure intracellular nadh/nad+ redox

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101115832A (zh) * 2004-11-26 2008-01-30 协和发酵工业株式会社 工业上有用的微生物
CN101633690A (zh) * 2008-07-22 2010-01-27 清华大学 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用
CN104220591A (zh) * 2012-01-25 2014-12-17 森文特公司 来自芽孢杆菌的新型甲醇脱氢酶
CN103865944A (zh) * 2014-02-20 2014-06-18 天津大学 一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途
CN105483071A (zh) * 2015-12-29 2016-04-13 天津大学 一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法
WO2021198904A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Pirelli Tyre S.P.A. Process of engineering an oleaginous microorganism
CN112961814A (zh) * 2020-12-08 2021-06-15 天津大学 一种偏好利用木糖高效分泌乙酸和ffa的大肠杆菌工程菌的构建方法
CN113564190A (zh) * 2021-07-16 2021-10-29 天津大学 高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
4，CNKI，（AU=陈涛 OR AU=户文亚 OR AU=刘双 OR AU=王智文）AND （ AB=黄素单核苷酸 OR AB=FMN）;Shuang Liu等;J. Agric. Food Chem;第67卷(第23期);6532-6540 *
Acidianus ambivalens type-II NADH dehydrogenase: genetic characterisation and identification of the favin moiety as FMN;Tiago M Bandeiras等;FEBS Lett;第531卷(第2期);273-277 *
代谢工程改造大肠杆菌生产核黄素和黄素单核苷酸;户文亚;中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑（电子期刊）;A006-45 *
叶绿体NAD(P)H脱氢酶(NDH)复合体的研究进展;李庆华;何志辉;米华玲;;植物生理学报(05);401-409 *

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