CN102892884B - 马克斯克鲁维酵母转化体的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种不使用特定的限制酶及其识别序列,而利用简单且有效地将DNA片段的末端联结起来的方法制造马克斯克鲁维酵母转化体的方法,以及使用该转化体的有用物质的制造方法等。由此,发现了下述解决手段:将不含马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列的二种以上的直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌,以通过所希望的DNA连接体表达的标记基因的表达为指标,选择包含所希望的DNA连接体的转化体,或者,将含有马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列的直链状的双链DNA片段单独导入或与一种以上的其它直链状的双链DNA片段组合导入马克斯克鲁维酵母菌,以通过所希望的DNA连接体表达的标记基因的表达为指标,选择包含所希望的DNA连接体的转化体。
Description
技术领域
本发明涉及马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)转化体的制造方法、使用该转化体的有用物质的制造方法等。
背景技术
联结DNA片段的末端制作任意DNA分子的技术,是以克隆为代表的众多分子生物学领域中的实验操作所必需的基本技术。目前,用于连接DNA片段的最常用的手段,是一种用DNA连接酶将具有平末端的DNA分子与分子之间,或具有互补的突出末端的DNA分子与分子之间结合起来的手段。并且,作为应用这种手段的克隆方法,已知Cohen-Boyer法(参见非专利文献1),这种方法中,分别利用限制酶切断插入DNA和载体并提纯后,通过DNA连接酶使它们连接,制作目的构建体,通过该构建体转化大肠杆菌,使其扩增。但是,在利用限制酶和DNA连接酶的DNA连接方法上,若不是预先以使得末端互相适合的方式制备的DNA分子,就无法连接,因此,为了制作转化用的构建体,Cohen-Boyer法需要将聚合酶链式反应(PCR)或限制酶处理等复杂的体外(in vitro)操作作为必要操作,并且,为了从转化后的大肠杆菌菌落中选出包含目的构建体的大肠杆菌,需要大量时间。由于上述原因,要求开发一种更为简便有效的DNA分子的连接方法。
作为一种替代Cohen-Boyer法且不使用限制酶和DNA连接酶的克隆方法,已开发出了体外同源重组法和体内(in vivo)同源重组法。上述体外同源重组法是通过使用特定的重组酶和该酶的识别序列联结DNA分子的方法,已知有Invitrogen公司的Gateway法、TaKaRa Bio公司的In-Fusion克隆法等。但是,由于在这些方法中,需要在插入DNA的两端及载体上存在特定的DNA序列,因此,这些方法 不能说是通用性好的方法。此外,作为上述的体内同源重组法,已知使用大肠杆菌(参见非专利文献2和3)和使用面包酵母的方法(参见非专利文献4和5)。这些体内同源重组法,是利用了表达来自噬菌体的多种蛋白质的大肠杆菌菌株或面包酵母具有极高的同源重组功能这一特性的方法。具体而言,通过制备在插入DNA的两端添加了与克隆载体同源的序列的插入DNA及用限制酶等切断了同源重组发生部分的克隆载体,并对大肠杆菌或面包酵母进行转化,由此可使得该转化细胞内(体内)发生同源重组,获得插入了插入DNA的克隆载体。由于这种反应的发生与限制酶位点无关,因此,在载体序列中的各种位置均可插入DNA片段。而且,由于插入DNA的长度,该方法还具有克隆效率不变的特点。但是,任一方法都是利用了同源重组的方法,因此,有必要向插入DNA添加与载体同源的序列。而且,对于使用了大肠杆菌的体内同源重组法而言,为了获得高的转化效率,有需要进行电穿孔且由于此操作而需要昂贵的装置和器具等缺点。此外,对于使用面包酵母的体内同源重组法而言,由于在大量制备DNA时要将克隆载体转移至大肠杆菌,因此,需要使用面包酵母-大肠杆菌穿梭载体。但是,面包酵母-大肠杆菌穿梭载体并非通常使用的载体,其制备费时费力。
此外,作为不使用限制酶和DNA连接酶,而进行环状DNA构筑和扩增的方法,已知有使用通过滚环扩增法(rolling cycle)得到的直链DNA转化原核细胞,并在该转化细胞内再构筑环状DNA的方法(参见专利文献1)。但是,通过滚环扩增法制作的扩增DNA片段具有包含重复序列的特殊构造,尚不明确该方法是否能够应用于不包含重复序列的DNA片段的环状化。
专利文献1:日本特开2005-229950号公报
非专利文献1:Cohen SN et al.,Proc Natl Acad Sci USA.70,3240-3244(1973)
非专利文献2:Zhang Y et al.,Nat Genet.20,123-128(1998)
非专利文献3:Yu D et al.,Proc Natl Acad Sci USA.97, 5978-5983(2000)
非专利文献4:Marykwas DL and Passmore SE,Proc Natl AcadSci USA.92,11701-11705(1995)
非专利文献5:Oldenburg KR et al.,Nucleic Acids Res.25,451-452(1997)
发明内容
本发明的课题在于提供不使用特定的限制酶及其识别序列,简便且有效地联结DNA片段的末端来制造马克斯克鲁维酵母转化体的方法,以及使用该转化体的有用物质的制造方法。
到目前为止本发明人等已经证实,作为一种酵母的马克斯克鲁维酵母菌具有其它酵母所未被观察到的多种优异的性质(PCT/JP2007/001270、PCT/JP2009/001214)。而且,在进行涉及马克斯克鲁维酵母菌的转化方法的研究的过程中已表明不含有同源序列的直链状DNA被有效地并入了马克斯克鲁维酵母菌的基因组DNA中(NonklangS.et al.Appl Environ Microbiol 74:7514-7521(2008))。从这些研究成果,本发明人等考虑是否可以将马克斯克鲁维酵母菌作为分子生物学研究的新工具来使用,于是,尝试了使用马克斯克鲁维酵母菌来进行新的DNA片段结合方法的开发。首先,将含有URA3基因的从转录起始密码子ATG的A到+771的序列的DNA片段和含有URA3基因的从+772到终止密码子的序列的DNA片段导入为尿嘧啶营养缺陷型突变株的马克斯克鲁维酵母RAK3605,并使用尿嘧啶缺陷型培养基进行了培养。结果证明,可高效地获得联结了导入的DNA片段的DNA连接体含在基因组DNA中的转化体。而且,本发明人等尝试进行了对此前未知的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(ARS)的鉴定,确定了序列号1~5所示的新ARS序列,同时发现通过将含有该ARS序列的直链状DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌中,可制作环状DNA连接体,由此完成了本发明。
也就是说,本发明涉及:(1)一种包含含有二种以上的直链状的双 链DNA片段的DNA连接体的转化酵母的制造方法,其特征在于依次包括步骤(a)和步骤(b),其中,(a)为将不含自主复制序列的二种以上的直链状双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤,上述二种以上的直链状的双链DNA片段是下述二种以上的直链状的双链DNA片段,各双链DNA片段单独时不含有标记基因的表达所需的全部序列,而只有当多条双链DNA片段连接而形成了所希望的DNA连接体时,才含有使标记基因的表达成为可能的序列;(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、上述所希望的DNA连接体被插入到基因组DNA中的转化体的步骤,(2)一种包含含有1种直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法,其特征在于依次包括步骤(a)和(b),其中,(a)为将含有全部自主复制序列且含有标记基因的表达所需的全部序列的1种直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌中的步骤;(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、所希望的环状DNA连接体的步骤,(3)一种包含含有二种以上的直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法,其特征在于依次包括步骤(a)和(b),其中,(a)为将含有全部自主复制序列且含有标记基因的表达所需的一部分序列的直链状的双链DNA片段与一种以上的其它直链状的双链DNA片段组合起来并导入马克斯克鲁维酵母菌中的步骤,上述一种以上的其它直链状的双链DNA片段是下述直链状的双链DNA片段:其单独时不含有标记基因的表达所需的全部序列,而只有当与上述含有自主复制序列且含有标记基因的一部分的双链DNA片段连接而形成所希望的环状DNA连接体时,才含有使得标记基因的表达成为可能的序列;(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、含有上述所希望的环状DNA连接体的转化体的步骤,(4)一种包含含有二种以上的直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法,其特征在于依次包括步骤(a)和(b),其中,(a)为将含有一部分自主复制序列且含有标记基因的表达所需的一部分序列的直链状的双链DNA片段与一种以上的其它直链状的双链DNA片段组 合起来并导入马克斯克鲁维酵母菌中的步骤,上述一种以上的其它直链状的双链DNA片段是下述直链状的双链DNA片段:其单独时不含有自主复制序列的全部和标记基因的表达所需的全部序列,而只有当与上述含有一部分自主复制序列且含有标记基因的表达所需的一部分序列的直链状的双链DNA片段连接而形成所希望的环状DNA连接体时,才含有全部自主复制序列和使标记基因的表达成为可能的序列;(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、含有上述所希望的环状DNA连接体的转化体的步骤,(5)上述(2)~(4)中任一项所述的制造方法,其特征在于自主复制序列含有序列号1~5中任一条所示的碱基序列,(6)上述(1)~(5)中任一项所述的制造方法,其特征在于DNA连接体还包含对所希望的有用物质进行编码的基因,(7)上述(1)~(6)中任一项所述的制造方法,其特征在于马克斯克鲁维酵母菌为马克斯克鲁维酵母RAK3605,标记基因为URA3基因,(8)通过上述(6)或(7)所述的制造方法得到的转化酵母,(9)一种有用物质的制造方法,其特征在于在培养基培养上述(8)所述的转化酵母,并从培养物中提取所希望的有用物质,(10)序列号1~5的任一条所示的马克斯克鲁维酵母菌的ARS序列。
根据本发明,可不使用特定的限制酶及其识别序列就能制造出二种以上的直链状DNA片段的连接体被插入基因组DNA中的马克斯克鲁维酵母菌的转化体。而且,根据本发明,通过对所希望的DNA序列添加对马克斯克鲁维酵母菌的ARS进行编码的序列,并对马克斯克鲁维酵母菌进行转化,可构筑包含该DNA序列的环状DNA连接体,不进行繁杂的操作即可克隆所需的DNA序列。
附图说明
图1是表示本发明的使用二种直链状的双链DNA片段制作DNA连接体的方法的图。
图2是表示通过本发明的方法对编码URA3的DNA连接体进行制作的结果的图。
图3是表示本发明的使二种直链状的双链DNA片段结合的方法的简图。
图4是表示通过本发明的方法对编码URA3、TDH3p及yCLuc的DNA连接体进行制作的结果的图。
图5是表示通过本发明的方法对编码URA3的DNA连接体进行制作的结果的图。
图6是表示为了获得本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)而使用的质粒的图。
图7是表示用于获得本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)的实验的简图。
图8是表示为了获得本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)而选择转化体的方法的图。
图9是表示获得含有本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)的质粒的方法的图。
图10是表示含有本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)的质粒的图。
图11是表示用于确定本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)的缺失突变株的图。
图12是表示本发明的马克斯克鲁维酵母菌的自主复制序列(KmARS)的图。
图13是表示本发明的环状DNA连接体的制作方法的简图。
具体实施方式
作为本发明的包含含有二种以上的直链状双链DNA片段的DNA连接体的转化酵母的制造方法,只要为依次包括下述步骤(a)和步骤(b)的方法(以下,有时也称为“制造方法[I]”),则不受特别限制,(a)为将不含自主复制序列的、二种以上的直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤,上述二种以上的直链状的双链DNA片段是下述二种以上的直链状的双链DNA片段:各双链DNA片段单独存在 时,不含有标记基因的表达所需的全部序列,而只有当多条双链DNA片段连接而形成了所希望的DNA连接体时,才含有使标记基因的表达成为可能的序列;(b)为以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、上述所希望的DNA连接体被插入到基因组DNA中的转化体的步骤。其中,“不含自主复制序列的、二种以上的直链状的双链DNA片段”,意味着下述双链DNA片段:各双链DNA片段中都不含自主复制序列,而且,即使在多条DNA片段按任意顺序连接并形成DNA结合体时,该DNA结合体中也不含自主复制序列;上述“只有当形成了所希望的DNA连接体时才含有使标记基因的表达成为可能的序列的二种以上直链状的双链DNA片段”,意味着下述直链状的双链DNA片段:各双链DNA片段都含有用于在马克斯克鲁维酵母菌内表达标记基因所必需的一部分序列,但不含有用于在马克斯克鲁维酵母菌内表达标记基因所必需的全部序列,而且,只有在多条双链DNA片段按所希望的顺序连接而形成所希望的DNA连接体时,才含有使标记基因在马克斯克鲁维酵母菌内的表达成为可能的序列,并且其还意味着下述直链状双链DNA片段:当多条双链DNA片段按照与所希望的顺序不同的顺序连接,并形成与所希望的DNA连接体不同的DNA连接体时,其含有的序列不能使得标记基因在马克斯克鲁维酵母菌内表达。
作为用于本发明的制造方法[I]的二种以上的直链状双链DNA片段,其序列、长度及末端的形状并不受到特别限制,除了含有对成为克隆目标的所希望的有用物质进行编码的基因等任意的基因DNA、及对连接到高表达启动子的所希望的有用物质进行编码的基因等任意的基因DNA以外,还可含有任意序列的DNA。例如,在上述本发明的制造方法[I]中,当所希望的DNA连接体为依次含有高表达启动子序列、对标记基因进行编码的序列以及任意碱基序列的DNA连接体时,可优选使用以下(i)或(ii)所例示的二种直链状的双链DNA片段的组合。
(i)包含高表达启动子序列和编码标记基因的序列中缺乏功能性标记基因表达必需的3’末端区域的序列的直链状双链DNA片段;以及,包含对上述功能性标记基因表达必需的3’末端区域进行编码的序列和 对其下游所希望的有用物质进行编码的DNA序列等任意的碱基序列的直链状双链DNA片段。
(ii)包含高表达启动子序列和对编码标记基因的序列中含有转录起点的5’末端区域进行编码的序列的直链状双链DNA片段;以及,包含上述编码标记基因的序列中不含上述标记基因的5’末端区域且对上述标记基因的5’末端区域的下游的到3’末端为止的区域进行编码的序列、和对其下游所希望的有用物质进行编码的DNA序列等任意碱基序列的直链状双链DNA片段。
作为制备上述直链状的双链DNA片段的方法,只要是公知的制备直链状的双链DNA的方法,并不受特别限制,作为制备较短的双链DNA片段的方法,可优选举出使通过亚磷酰胺法和亚磷酸酯法合成的单链退火的方法、及通过通常的PCR法制备的方法;作为制备长的DNA片段的方法,可优选举出通过融合PCR法(参见日本特开2009-268360)制备的方法,其中,优选PCR法。例如,在本发明的制造方法[I]中,在使用上述(i)的二种直链状的双链DNA片段的情况下,事先通过PCR法制备“包含高表达启动子序列、和对编码标记基因的序列中缺乏功能性标记基因表达必需的3’末端区域的序列的直链状双链DNA片段”,并使用引物组来制备另一者的“包含对上述功能性标记基因表达必需的3’末端区域进行编码的序列及其下游的任意碱基序列的直链状双链DNA片段”,所述引物组是对应于上述任意碱基序列的引物组,即包含对上述功能性标记基因表达必需的3’末端区域进行编码的序列和对任意碱基序列的5’末端区域进行编码的序列的正义(正向)引物以及包含与任意碱基序列的3’末端区域互补的序列的反义(反向)引物的引物组,由此可简单地制备包含添加了上述共同的“对功能性标记基因表达必需的3’末端区域进行编码的序列”的各种任意碱基序列的直链状的双链DNA片段。根据上述本发明的制造方法[I],不进行连接反应,仅通过将二种以上直链状的双链DNA片段直接导入酵母,就可使直链状的双链DNA片段连接起来并形成所希望的DNA连接体,而且,由于通过培养利用该所希望的连接体进行了转化的酵母,可使得该所希望的 DNA连接体扩增,因此,可有效地进行基因克隆等。
作为本发明的包含含有一种直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法,只要是依次具有下述步骤(a)将包含全部自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的全部序列的一种直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤;(b)以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)所得到的、所希望的环状DNA连接体的步骤的方法(以下有时也称为“制造方法[II]”),就不受到特别限制,作为用于上述制造方法[II]的“包含全部自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的全部序列的一种直链状的双链DNA片段”,只要是包含马克斯克鲁维酵母菌内全部功能性自主复制序列、且包含使得标记基因在马克斯克鲁维酵母菌内的表达成为可能的序列的直链状的双链DNA片段,则对其序列、长度及末端形状没有特别限制,除了可含有对成为克隆目标的有用物质进行编码的基因等任意的基因DNA、对与高表达启动子连接的所希望的有用物质进行编码的基因等任意的基因DNA之外,还可含有任意序列的DNA。而且,作为制备上述直链状的双链DNA片段的方法,只要是公知的制备直链状的双链DNA片段的方法,就不受特别限制,作为制备较短的双链DNA片段的方法,可优选举出使利用亚磷酰胺法和亚磷酸酯法进行了合成的单链退火的方法,及通过通常的PCR法制备的方法;作为制备长的DNA片段的方法,可优选举出通过融合PCR法(参见日本特开2009-268360)制备的方法作为例子,但特别优选使用了包含自主复制序列的引物的PCR法。通过上述制造方法[II]制作的所希望的环状DNA连接体,可使用公知的环状DNA的提取方法,从通过上述制造方法[II]的步骤(b)选择的转化体获得。通过上述本发明的制造方法[II],不进行连接反应,仅通过将一种含有自主复制序列的直链状的双链DNA片段直接导入酵母,就可形成所希望的环状DNA连接体,而且,通过培养利用上述所希望的环状连接体进行了转化的酵母,可使得上述所希望的环状DNA连接体扩增。
作为本发明的包含含有二种以上的直链状的双链DNA片段的环状DNA连接体的转化酵母的制造方法,只要是依次具有(a)将包含全部 自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状双链DNA片段与一种以上的其它直链状的双链DNA片段组合并导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤,上述一种以上的其它直链状的双链DNA片段,是在单独时不含标记基因的表达所必需的全部序列,只有在与上述包含自主复制序列且包含一部分标记基因的直链状双链DNA片段连接而形成了所希望的环状DNA连接体时,才含有使标记基因的表达成为可能的序列的直链状双链DNA片段;(b)以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)得到的、包含上述所希望的环状DNA连接体的转化体的步骤的方法(以下有时也称为“制造方法[III]”),或,依次具有(a)将包含一部分自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状双链DNA片段与一种以上的其它直链状的双链DNA片段组合并导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤,上述一种以上的其它直链状的双链DNA片段,是在单独时不含自主复制序列的全部和标记基因的表达所必需的全部序列,只有在与上述包含一部分自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状双链DNA片段连接而形成了所希望的环状DNA连接体时,才含有全部自主复制序列和使标记基因的表达成为可能的序列的直链状双链DNA片段;(b)以标记基因的表达为指标来选择通过上述步骤(a)得到的、包含上述所希望的环状连接体的转化体的步骤的方法(以下,有时也称为“制造方法[IV]”),就不受特别限制,作为上述制造方法[III]中的“包含全部自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状的双链DNA片段”,只要是包含马克斯克鲁维酵母菌内全部功能性自主复制序列且不包含在马克斯克鲁维酵母菌内功能性标记基因的表达所必需的全部序列的双链DNA片段,则无特别限制,另外,作为“一种以上的其他直链状的双链DNA片段”,只要是单独时不包含标记基因在马克斯克鲁维酵母菌内的表达所必需的全部序列,而只有在形成了所希望的环状DNA连接体时,才包含使标记基因在马克斯克鲁维酵母菌内的表达成为可能的序列的双链DNA片段,则其序列、长度和末端形状不管是怎样的均可。作为上述制造方法[IV]中的“包含一部分自主复制序列且包含标记基因 的表达所必需的一部分序列的直链状的双链DNA片段”,只要是不含马克斯克鲁维酵母菌内功能性自主复制序列的全部且不含在马克斯克鲁维酵母菌内功能性标记基因的表达所必需的全部序列的双链DNA片段,则不受特别限制,并且,作为上述“一种以上的其它直链状的双链DNA片段”,只要是在马克斯克鲁维酵母菌内单独时不含功能性自主复制序列的全部且不含标记基因的表达所必需的全部序列的双链DNA片段,而只在与上述“包含一部分自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状的双链DNA片段”连接并形成了所希望的DNA连接体的情况下,才在该DNA连接体中包含自主复制序列及标记基因的表达所必需的序列的双链DNA片段,则其序列、长度和末端的形状不管是怎样的均可。
用于本发明的制造方法[III]的“包含全部自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状的双链DNA片段”以及“一种以上的其它直链状的双链DNA片段”,除了含有对成为克隆目标的所希望的有用物质进行编码的基因等任意的基因DNA,及对与高表达启动子连接的所希望的有用物质进行编码的基因等任意的基因DNA以外,还可含有任意序列的DNA。另外,用于本发明的制造方法[IV]的上述“包含一部分自主复制序列且包含标记基因的表达所必需的一部分序列的直链状的双链DNA片段”以及“一种以上的其它直链状的双链DNA片段”,还可以含有包含成为克隆目标的基因序列的碱基序列,以及包含其下游与高表达启动子连接的任意基因序列的碱基序列等任意碱基序列。作为制备上述直链状的双链DNA片段的方法,只要是公知的制备直链状的双链DNA片段的方法,则不受特别限制,作为制备较短的双链DNA片段的方法,可优选举出使利用亚磷酰胺法和亚磷酸酯法合成的单链退火的方法及利用通常的PCR法来制备的方法,作为制备长的DNA片段的方法,可优选举出通过融合PCR法(日本特开2009-268360)来制备的方法作为例子,但特别优选使用了包含自主复制序列的引物的PCR法。通过上述制造方法[III]或[IV]制作的所希望的环状DNA连接体,可使用公知的环状DNA的提取方法,从通过上述制造方法[III]或[IV] 的步骤(b)选择的转化体来获得。通过上述本发明的制造方法[III]或[IV],不进行连接反应,仅将包含自主复制序列的一种直链状的双链DNA片段直接导入酵母,就可形成所希望的环状DNA连接体,而且,通过培养利用上述所希望的环状DNA连接体进行了转化的酵母,可使上述所希望的环状DNA连接体扩增。
在上述本发明的制造方法[I]~[IV]中,作为将直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌的方法,只要是作为酵母的转化方法而被通常使用的方法,则不受特别限制,例如,可优选举出乙酸锂法(J.Bacteriology,153,p163(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methodsin yeast genetics,2000 Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual)、电穿孔法(Meth.Enzym.,194,p182(1990))及原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978))等,其中,可有利地利用乙酸锂法。乙酸锂法是一种非常简便的方法,但已知与其它转化方法相比,它的转化效率非常低。但是,由于本发明中所用的马克斯克鲁维酵母菌可通过直链状的双链DNA片段进行有效的转化,因此,即使用乙酸锂法也可获得充分的转化效率。
作为上述标记基因,只要是可用于酵母中的标记基因,就不受到特别限制,例如,可优选举出:与成为宿主的马克斯克鲁维酵母菌的营养缺陷互补的营养缺陷型标记基因、耐抗生素等的耐药性标记基因、对绿色荧光蛋白质(GFP)等荧光蛋白质进行编码的基因、以及对β-半乳糖甘酶进行编码的基因等,其中,优选营养缺陷型标记基因。作为上述营养缺陷型标记基因,例如,可以是与色氨酸、精氨酸和亮氨酸等氨基酸的营养缺陷型突变株的营养缺陷互补的营养缺陷型标记基因,也可以是与腺嘌呤、尿嘧啶等核酸的营养缺陷型突变株的营养缺陷互补的营养缺陷型标记基因,但特别优选与尿嘧啶缺陷型突变株的营养缺陷互补的URA3基因。而且,在本发明中,也可以将二种以上的标记基因组合起来使用。
并且,上述马克斯克鲁维酵母菌并不受到特别限制,可以是野生型菌株,也可以是营养缺陷型突变株等具有基因突变的突变株,但由于将 营养缺陷型标记基因的表达作为指标可容易地选择转化体,因此,优选营养缺陷型突变株,其中,特别优选腺嘌呤、尿嘧啶等核酸的营养缺陷型突变株。例如,在本发明的制造方法[I]~[IV]中,当使用马克斯克鲁维酵母菌的尿嘧啶缺陷型突变株时,通过组合URA3基因作为标记基因,而当使用马克斯克鲁维酵母菌的腺嘌呤缺陷型突变株时,通过组合ADE2基因作为标记基因,从而可有效地选择包含所希望的DNA连接体的转化体。另外,作为上述尿嘧啶缺陷型突变株,具体而言,可优选举出马克斯克鲁维酵母RAK3605、马克斯克鲁维酵母RAK4071、马克斯克鲁维酵母RAK4076、马克斯克鲁维酵母RAK4077等为例,作为腺嘌呤缺陷型突变株,可优选举出RAK6038等为例。
作为本发明所用的自主复制序列,只要是在马克斯克鲁维酵母菌中成为自主复制起点的序列,就不受特别限制,例如,优选为:包含序列号1所示的碱基序列的自主复制序列KmARS7(201-250)(5’-CAAGACTTCTTGAAGTGAAAACCAACTTTCAGTCTTCAAACTAAAAATGA-3’)、包含序列号2所示的碱基序列的自主复制序列KmARS 11(46-105)(5-TCCAAAATTAACTTTCTAAGCTAAATGTCATATTTCGCAATAAAATAATAAGAATATAGA-3’)、包含序列号3所示的碱基序列的自主复制序列KmARS 16(721-790)(5’-TTTTATTTTTTTTTAACTCAATTTCCAGTTTAAACACCAAAATACGTTTCCATATAATTGAAAAAGGAAG-3’)、包含序列号4所示的碱基序列的自主复制序列KmARS18(80-159)(5’-GATTATTATAAGGCATAATGCCAGGAATCTTTCCATAATTTGGAATTGAAAGTCACTTTAGGTTCACTATATAATGAAAA-3’)、包含序列号5所示的碱基序列的自主复制序列KmARS36(291-340)(5’-TCTTTAATATTATTTTTCATTTCAAAAAGTGTGAAATAAAAATTAAAATG-3’)、序列号1~5中任一条所示的碱基序列中1个或数个碱基缺失、被取代或被添加的自主复制序列。通过利用PCR等公知的方法,将包含上述序列号1~5中任一条所示的碱基序列的自主 复制序列、序列号1~5中任一条所示的碱基序列中1个或数个碱基缺失、被取代或被添加的自主复制序列赋予至任意的DNA片段,可制作包含自主复制序列的直链状的双链DNA片段,并用于本发明的制造方法[II]~[IV]中。
作为本发明的有用物质的制造方法,只要是将利用通过上述本发明的制造方法[I]~[IV]得到的包含对所希望的有用物质进行编码的基因的DNA连接体进行了转化的酵母置于培养基中培养,并从培养物中提取所希望的有用物质的方法,就不受特别限制,作为上述有用物质并不受特别限制,例如,可优选举出抗体和细胞因子等重组药用蛋白质等。由于马克斯克鲁维酵母是蛋白质生产率高且具有耐热性的酵母(Biosci.Biotechnol.Biochem.71:1170-82,2007),因此,通过本发明的有用物质的制造方法,可以廉价且有效地进行有用物质的制造。
作为用于制造可有用地用于本发明的转化酵母的制造方法中的DNA连接体的试剂盒,及用于制造环状DNA连接体的试剂盒,可示例具备马克斯克鲁维酵母菌的试剂盒,作为上述马克斯克鲁维酵母菌,可以是野生菌株,也可以是营养缺陷型突变株等具有基因突变的突变株,优选营养缺陷型突变株,其中,特别优选腺嘌呤、尿嘧啶等核酸的营养缺陷型突变株。作为上述尿嘧啶缺陷型突变株,具体而言,可优选举出马克斯克鲁维酵母RAK3605、马克斯克鲁维酵母RAK4071、马克斯克鲁维酵母RAK4076、马克斯克鲁维酵母RAK4077等为例,作为腺嘌呤缺陷型突变株,可优选举出RAK6038等为例,特别优选为尿嘧啶缺陷型突变株的马克斯克鲁维酵母RAK3605。另外,用于制造上述本发明的环状DNA连接体的试剂盒,还可具有包含序列号1~5中任一条所示的碱基序列的引物,或包含序列号1~5中任一条所示的碱基序列中1个或数个碱基缺失、被取代或被添加的自主复制序列的引物。并且,上述试剂盒也可以含有包含对标记基因进行编码的基因序列的全部或一部分的双链DNA、用于培养马克斯克鲁维酵母菌的培养基、或缓冲液等。
下面,通过实施例对本发明进行更详细地说明,但本发明的技术范围并不仅限于这些实施例。
实施例1
【对URA3进行编码的DNA连接体的制作】
1.DNA片段的制作
将来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4704的DNA作为模板,使用KOD-plus聚合酶(TOYOBO公司制造)进行PCR反应,制作了包含全部或一部分URA3基因的DNA片段(URA3-290-280c、URA3-290+771c、URA3+772-280c)。用于PCR反应的引物的序列如下所示。在包含全部URA3的DNA片段URA3-290-280c的制作中,使用了URA3-290作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物;在包含一部分URA3(N末端侧)的DNA片段URA3-290+771c的制作中,使用了URA3-290作为正向引物,使用了URA3+771c作为反向引物;在包含一部分URA3(C末端侧)的DNA片段URA3+772-280c的制作中,使用了URA3+772作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物。
(正向引物)
URA3-290(5’-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3’;序列号6)
URA3+772(5’-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3’;序列号7)
(反向引物)
URA3+771c(5’-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3’;序列号8)
URA3-280c(5’-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3’;序列号9)
PCR反应是先在94℃下进行1分钟的初期变性,然后是进行30次下述循环:在94℃下进行20秒的热变性,在55℃下进行30秒的退火,在68℃下进行2分30秒的延伸反应。另外,PCR反应液如下制备。反应后,测定所得的PCR产物的DNA浓度,并将各个DNA扩增片段的浓度制备为10pM。
实施例2
2.转化体的制作
将尿嘧啶缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母RAK3605株接种到10ml的YPD培养基(1%酵母浸膏、2%多聚蛋白胨、2%葡萄糖)中,在28℃下培养20小时。回收培养液并移入2支15ml管中,以8000rpm进行3分钟离心分离。弃去上清液,向沉淀的细胞中添加300μL/管的转化用溶液(2000μL的60%PEG3350、150μL的4M乙酸锂、300μL的1M DTT、550μL灭菌水),通过涡流混合器进行搅拌。再以8000rpm进行3分钟的离心分离,弃去上清液,向沉淀的细胞中添加600μL/管的转化用溶液后,分别注入1.5ml管,使其达到100μL/管。在其中,单独或组合地添加实施例1中制作的DNA片段(每种片段3μL),在47℃下进行15分钟的热处理。加入150μL灭菌水,将细胞涂布在尿嘧啶缺陷型营养基上,在28℃下培养3天,计数生长的菌落数。
图1示出了实验概要,图2示出了所进行的三次转化实验的结果。在通过包含全部URA3的DNA片段URA3-290-280c进行了转化的情况下,可获得平均275个菌落。而且,在将包含一部分URA3(N末端侧)的DNA片段URA3-290+771c与包含一部分URA3(C末端侧)的DNA片段URA3+772-280c组合起来进行了转化的情况下,可获得平均36个菌落。另一方面,在单独使用了DNA片段URA3-290+771c、DNA片段URA3+772-280c的情况下,完全没有观察到菌落。由上述结果可知,在组合导入了URA3-290+771c和URA3+772-280c的转化体中,通过二个DNA片段结合,可表达全长URA3蛋白质。
实施例3
【对URA3、TDH3p、及yCLuc进行编码的DNA连接体的制作】
1.DNA片段的制作
将来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4704的DNA作为模板,使用KOD-plus聚合酶(TOYOBO公司制造)进行PCR反应,制作了包含全部或一部分URA3基因的DNA片段(URA3-290-280c、URA3-290+771c、URA3+772-280c)。用于PCR反应的引物的序列如下所示。在包含全部URA3的DNA片段URA3-290-280c的制作中,使用了URA3-290作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物;在包含一部分URA3(N末端侧)的DNA片段URA3-290+771c的制作中,使用了URA3-290作为正向引物,使用了URA3+771c作为反向引物;在包含一部分URA3(C末端侧)的DNA片段URA3+772-280c的制作中,使用了URA3+772作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物。
(正向引物)
URA3-290(5’-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3’;序列号6)
URA3+772(5’-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3’;序列号7)
(反向引物)
URA3+771c(5’-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3’;序列号8)
URA3-280c(5’-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3’;序列号9)
并且,将来自于马克斯克鲁维酵母RAK4960株的DNA为模板,使用KOD-plus聚合酶(TOYOBO公司制造)进行PCR反应,制作了包含对TDH3p和yCLuc进行编码的序列的DNA片段(URA3+772TAA+1662c、URA3+772TAA+17+1662c)。用于PCR反应的引物序列如下所示。在DNA片段URA3+772TAA+1662c的制作中,使用了URA3+772TAA-TDH-527作为正向引物,使用了yCLuc+1662c作为反向引物;在DNA片段URA3+772TAA+17+1662c的制作中,使用了URA3+772TAA+17-TDH-527作为正向引物,使用了yCLuc+1662c作为反向引物。
(正向引物)
URA3+772TAA-TDH-527(5-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAA ACTAAgctgtaacccgtacatgcccaa-3’;序列号10)
URA3+772TAA+17-TDH-527(5’-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAaaaactgtattataagtGCTGTAACCCGTACATGCCCAA-3’;序列号11)
(反向引物)
yCLuc+1662c(5’-CTACTTGCACTCATCTGGGACC-3’;序列号12)
PCR反应是先在94℃下进行1分钟的初期变性,然后是进行30次下述循环:在94℃下进行20秒的热变性,在55℃下进行30秒的退火,在68℃下进行3分钟延伸反应。另外,PCR反应液如下制备。反应后,测定所得的PCR产物的DNA浓度,并将各个DNA扩增片段的浓度制备为10pM。
实施例4
2.转化体的制作
将尿嘧啶缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母RAK3605株接种到2ml的YPD培养基(1%酵母浸膏、2%多聚蛋白胨、2%葡萄糖)中,培养一个晚上。回收1.5ml培养液并移入其它管中,以12000rpm进行1分钟离心分离。弃去上清液,向沉淀的细胞中添加200μL/管的转化用溶液(2000μL的60%PEG3350、150μL的4M乙酸锂、300μL的1M DTT、550μL的灭菌水),通过涡流混合器搅拌。再以12000rpm进行1分钟的离心分离,弃去上清液,向沉淀的细胞加入50μL的转化用溶液和实施 例3中制作的DNA片段(每种DNA片段3μL)的组合,通过涡流混合器搅拌,在47℃下进行了15分钟热处理。然后,加入150μL的灭菌水,将细胞涂布到尿嘧啶缺陷型培养基上,在28℃下培养3天,计数生长的菌落数。
图3示出了实验概要,图4示出了所进行的转化实验的结果。在通过包含全部URA3的DNA片段URA3-290-280c进行了转化的情况下,获得了327个菌落,而在将DNA片段URA3-290+771c和DNA片段URA3+772-280c组合并进行了转化的情况下,获得了243个菌落。而且,在将DNA片段URA3-290+771c与DNA片段URA3+772TAA+1662c组合并进行了转化的情况下,获得了130个菌落,而在将DNA片段URA3-290+771c和DNA片段URA3+772TAA+17+1662c组合并进行了转化的情况下,获得了95个菌落。
实施例5
【包含具有一部分重叠或缺失序列的DNA片段的DNA连接体的制作】
1.DNA片段的制作
将来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4704的DNA作为模板,使用KOD-plus聚合酶(TOYOBO公司制造)进行PCR反应,制成了包含全部或一部分URA3基因的DNA片段(URA3-290-280c、URA3-290+771c、URA3+772-280c、URA3+773-280c、URA3+774-280c、URA3+770-280c、URA3+771-280c)。用于PCR反应的引物序列如下所示。在DNA片段URA3-290-280c的制作中,使用了URA3-290作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物;在DNA片段URA3-290+771c的制作中,使用了URA3-290作为正向引物,使用了URA3+771c作为反向引物;在DNA片段URA3+772-280c的制作中,使用了URA3+772作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物;在DNA片段URA3+773-280c的制作中,使用了URA3+773作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物;在DNA片段URA3+774-280c的制作中,使用了URA3+774作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物;DNA片段URA3+770-280c的制作中,使用了URA3+770作为正向引物,使 用了URA3-280c作为反向引物;在DNA片段URA3+771-280c的制作中,使用了URA3+771作为正向引物,使用了URA3-280c作为反向引物。
(正向引物)
URA3-290(5’-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3’;序列号6)
URA3+772(5’-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3’;序列号7)
URA3+773(5’-CATATTtGAGAAGATGCGGCCA-3’;序列号13)
URA3+774(5’-ATATTtGAGAAGATGCGGCCAG-3’;序列号14)
URA3+770(5’-AaGCATATTtGAGAAGATGCGG-3’;序列号15)
URA3+771(5’-aGCATATTtGAGAAGATGCGGC-3’;序列号16)
(反向引物)
URA3+771c(5’-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3’;序列号8)
URA3-280c(5’-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3’;序列号9)
PCR反应是先在94℃下进行1分钟的初期变性,然后是进行30次下述循环:在94℃下进行20秒的热变性,在55℃下进行30秒的退火,在68℃下进行2分30秒的延伸反应。另外,PCR反应液如下制备。反应后,测定所得的PCR产物的DNA浓度,并将各个DNA扩增片段的浓度制备为10pM。
实施例6
2.转化体的制作
将尿嘧啶缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母RAK3605株接种到2ml的YPD培养基(1%酵母浸膏、2%多聚蛋白胨、2%葡萄糖)中,培养一个晚上。回收1.5ml培养液并移入其它管中,以12000rpm进行1分钟离心分离。弃去上清液,向沉淀的细胞中添加200μL/管的转化用溶液(2000μL的60%PEG3350、150μL的4M乙酸锂、300μL的1M DTT、550μL的灭菌水),通过涡流混合器搅拌。再以12000rpm进行1分钟的离心分离,弃去上清液,向沉淀的细胞加入50μL的转化用溶液和实施例5中制作的DNA片段(每种DNA片段3μL)的组合,通过涡流混合器搅拌,在47℃下进行了15分钟热处理。然后,加入150μL的灭菌水,将细胞涂布到尿嘧啶缺陷型培养基上,在28℃下培养3天,计数生长的菌落数。
图5示出所进行的转化实验的结果。在通过包含全部URA3的DNA片段URA3-290-280c进行了转化的情况下,获得了329个菌落。另外,在将包含一部分URA3(N末端侧)的DNA片段URA3-290+771c与包含一部分URA3(C末端侧)的DNA片段URA3+772-280c组合并进行了转化的情况下,获得了182个菌落。另外,DNA片段URA3-290+771c与DNA片段URA3+773-280c、DNA片段URA3-290+771c与DNA片段URA3+774-280c这二对组合,虽然DNA片段结合了,但也只是将对URA3进行编码的碱基序列中缺失了1或2个碱基的连接序列的DNA片段进行了组合,但即使是这种组合,也能分别确认到少数菌落(分别是4个、1个)。另一方面,DNA片段URA3-290+771c与DNA片段URA3+770-280c、DNA片段URA3-290+771c与DNA片段URA3+771-280c这二对组合在DNA片段结合了的情况下,是对URA3进行编码的碱基序列中形成重叠了1或2个碱基的连接序列的DNA片段的组合,这种组合的结果是,分别能确认到28个、21个菌落。
上述结果表明,通过制作将对URA3基因的N末端侧进行编码的DNA片段与对URA3基因的C末端侧进行编码的序列配置在5’侧的DNA片段,并导入马克斯克鲁维酵母RAK3605株中,可得到包含目标DNA序列的转化体。
实施例7
【马克斯克鲁维酵母的自主复制序列的鉴定】
出于确定马克斯克鲁维酵母中的自主复制序列(ARS)的目的,进行了如下实验。通过用限制酶XhoI及EcoRI消化来自马克斯克鲁维酵母的基因组DNA,并插入到用于芽殖酵母的单拷贝载体pRS316(Sikorski and Hieter,1989;Genetics122,19-27)(图6)。将该载体导入大肠杆菌,得到6868个菌落。从这些菌落中提取质粒并提纯,制作马克斯克鲁维酵母菌的基因组DNA文库,并导入马克斯克鲁维酵母中(图7)。通过用5-FOA培养基挑选丢失了URA3的菌株,仅选出了转化的质粒序列未插入到基因组中的菌落(图8)。
对通过这种方式得到的168株转化体进行培养,并用Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep KitII(Zymoresearch公司制造)提纯质粒,进行了大肠杆菌的转化。并且,从大肠杆菌提取并提纯质粒,对尿嘧啶缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母RAK3605进行了转化(图9)。结果,得到了图10所示的14种质粒。图中分别地,以序列号17表示包含在质粒KmARS7中的序列,以序列号18表示包含在质粒KmARS11中的序列,以序列号19表示包含在质粒KmARS14中的序列,以序列号20表示包含在质粒KmARS16中的序列,以序列号21表示包含在质粒KmARS18中的序列,以序列号22表示包含在质粒KmARS22中的序列,以序列号23表示包含在质粒KmARS36中的序列,以序列号24表示包含在质粒KmARS45中的序列,以序列号25表示包含在质粒KmARS51中的序列。
接着,为了确定KmARS区域而制作缺失突变体(Deletion mutant),进行了实验。图11示出了实验概要。实验结果如图12所示,确定了对应于KmARS7的205~250bp的区域(序列号1)、对应于KmARS11的46~105bp的区域(序列号2)、对应于KmARS16的721~700bp的区域(序列号3)、对应于KmARS18的80~159bp的区域(序列号4)、对应于KmARS36的291~340bp的区域(序列号5)均为Km的ARS。
上述内容表明,如图13所示,通过将此次鉴定的50~60bp的Km 的ARS添加至任意DNA片段并导入马克斯克鲁维酵母中,可在转化细胞内构筑环状DNA。
Claims (5)
1.一种方法,其是包含含有二种以上直链状的双链DNA片段的DNA连接体的转化酵母的制造方法,所述方法特征在于,所述二种以上的直链状的双链DNA片段各自单独时不包含标记基因的表达所必需的全部序列,只在多个双链DNA片段以非同源末端连接的方式连接并形成了所希望的DNA连接体的情况下,才包含使标记基因的表达成为可能的序列,并且,所述方法依次具有如下步骤(a)和(b):
(a)将所述二种以上的直链状的双链DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌的步骤;
(b)以标记基因的表达为指标来选择通过所述步骤(a)得到的、含有所述所希望的DNA连接体的转化体的步骤。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,二种以上直链状的双链DNA片段是不含自主复制序列的DNA片段,所希望的DNA连接体被插入基因组DNA中。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,二种以上直链状的双链DNA片段中的一种含有自主复制序列的全部,所述自主复制序列包含序列号1~5中任一条所示的碱基序列,所希望的DNA连接体是环状的。
4.如权利要求1~3中任一项所述的制造方法,其特征在于,DNA连接休还包含对所希望的有用物质进行编码的基因。
5.如权利要求1~3中任一项所述的制造方法,其特征在于,马克斯克鲁维酵母菌为马克斯克鲁维酵母RAK3605,标记基因为URA3基因。
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