CN115397982A - 核酸组合物 - Google Patents

Abstract

在一些方面，本文提供了包含起始转录序列核酸组合物和独特核酸设计用于核糖核酸的高产率和具有成本效益的生产。

Description

核酸组合物

相关申请

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2019年12月6日提交的美国临时申请号62/944,824的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。

背景技术

低成本RNA产品的可用性对于跨越农业和生物制药科学的众多应用至关重要。在农业中，RNA干扰(RNAi)可用于经靶向地控制害虫和昆虫，这些害虫和昆虫对传统化学杀虫剂的抗性越来越强，并且可用于影响作物中特定所需表型(例如，提高保质期、颜色、新鲜度)。在生物制药中，mRNA产品可用作治疗不同疾病的疫苗以及治疗剂。然而，RNA合成的高成本是RNA产品广泛使用和开发的主要障碍。开发具有成本效益的RNA产品合成工艺可以广泛扩展和使用这些技术和其他技术。

发明内容

本公开的一些方面提供了用于增强目标RNA表达的重组DNA核酸构建体设计。在一些实施方案中，构建体包含：第一表达盒，其包含可操作地连接到在编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列上游的起始转录序列(ITS)的启动子；以及第二表达盒，其包含可操作地连接到在编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列上游的起始转录序列(ITS)的启动子，其中该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。

在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒中的一者或两者都还包含编码该dsRNA链的核苷酸序列下游的终止子序列。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒中的一者或两者都还包含限制性内切酶识别位点。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒中的一者或两者都包含编码该dsRNA链的核苷酸序列下游的终止子序列，并且还包含核酸内切酶识别位点。

在一些实施方案中，起始转录序列的长度为1-15个核苷酸的长度。在一些实施方案中，起始转录序列包含SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项的核苷酸序列。

在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒位于单个DNA分子内并且朝向相同方向；其中相同的DNA链在每个表达盒的转录期间用作模板链。在其他实施方案中，第一表达盒和第二表达盒位于单个DNA分子内并且朝向相反方向；其中不同的DNA链在每个表达盒的转录期间用作模板链。

在一些实施方案中，编码第一表达盒的正义链的核苷酸序列的侧翼为ITS和ITS的反向互补序列，并且第二表达盒的反义链的侧翼为ITS和ITS的反向互补序列。在一些实施方案中，第一表达盒还包含编码正义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列，并且第二表达盒还包含编码反义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列。在一些实施方案中，终止子序列包含rrnBT1、rrnBT2、TT7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。在一些实施方案中，终止子序列包含SEQ ID NO:19-30中任一项的核苷酸序列。

在一些实施方案中，构建体还包含选择标记，任选地其中该选择标记位于第一表达盒和第二表达盒之间。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性选择标记或无抗生素选择标记。

在一些实施方案中，第一表达盒的启动子、第二表达盒的启动子中一者或第一表达盒的启动子和第二表达盒的启动子两者都是噬菌体T7启动子。

在一些实施方案中，构建体选自质粒、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、天然染色体、噬菌体和病毒。在一些实施方案中，构建体是高、中或低拷贝数质粒。在一些实施方案中，质粒是基于PUC的质粒。

在一些实施方案中，dsRNA靶向昆虫、植物、真菌或病毒的基因组序列。

本公开的一些方面提供了一种构建体，其包含：(a)第一表达盒，其包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列的起始转录序列(ITS)的启动子、编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列、和终止子序列；和(b)第二表达盒，其包含可操作地连接到含有SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列的ITS的启动子、编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列、和终止子序列，其中该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。

在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒位于单个DNA分子内并且朝向相同方向；并且其中相同的DNA链在每个表达盒的转录期间用作模板链。在其他实施方案中，第一表达盒和第二表达盒位于单个DNA分子内；并且其中不同的DNA链在每个表达盒的转录期间用作模板链。

在一些实施方案中，编码第一表达盒的正义链的核苷酸序列的侧翼为ITS和ITS的反向互补序列，并且编码第二表达盒的反义链的核苷酸序列的侧翼为ITS和ITS的反向互补序列。在一些实施方案中，第一表达盒还包含编码正义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列，并且第二表达盒还包含编码反义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列。在一些实施方案中，终止子序列包含rrnBT1、rrnBT2、TT7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。在一些实施方案中，终止子序列包含SEQ ID NO:19-30中任一项的核苷酸序列。

在一些实施方案中，构建体还包含在编码该正义链的核苷酸序列和/或编码该反义链的核苷酸序列下游、任选地在这些终止子序列中一者下游或在缺乏终止子序列的构建体中的限制性核酸内切酶识别位点。在一些实施方案中，构建体还包含选择标记，任选地其中该选择标记位于第一表达盒和第二表达盒之间。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性选择标记或无抗生素选择标记。在一些实施方案中，第一表达盒的启动子、第二表达盒的启动子中一者或第一表达盒的启动子和第二表达盒的启动子两者都是噬菌体T7启动子。

在一些实施方案中，构建体选自质粒、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、天然染色体、噬菌体和病毒。在一些实施方案中，构建体是高、中或低拷贝数质粒。在一些实施方案中，质粒是基于PUC的质粒。

本公开的一些方面提供了一种表达盒，其包含可操作地连接到编码目标产物的核苷酸序列的启动子，其中该核苷酸序列侧接有起始转录序列(ITS)和任选地两个串联终止子序列和/或限制性内切酶位点，其中该ITS包含SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项的核苷酸序列。

本公开的一些方面提供了一种工程化核酸，其包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列。

本公开的一些方面提供了一种工程化核酸，其包含启动子和起始转录序列(ITS)，该ITS包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化核酸包含SEQ ID NO:10-13或42-45中任一项的核苷酸序列。

本公开的一些方面提供了一种试剂盒，其包括：工程化核酸，其包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列；和聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包括核苷三磷酸和/或核苷一磷酸。

本公开的一些方面提供了包含第一表达盒和第二表达盒的载体或构建体，该第一表达盒包含编码可操作地连接到启动子的双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列，该第二表达盒包含编码可操作地连接到启动子的dsRNA的反义链的核苷酸序列，其中该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。

本公开的一些方面提供了包含第一表达盒和第二表达盒的载体或构建体，该第一表达盒包含可操作地连接到在编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列上游的第一DNA起始转录序列(ITS)的启动子，该第二表达盒包含可操作地连接到在编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列上游的第二DNA ITS的启动子，其中该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。

本公开的其他方面提供了包含第一表达盒和第二表达盒的载体或构建体，该第一表达盒包含可操作地连接到在编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列上游的第一DNA起始转录序列(ITS)的启动子和在编码该dsRNA的正义链的核苷酸序列下游的DNA起始转录序列的反向互补序列(ITS-RC)；该第二表达盒包含可操作地连接到在编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列上游的第二DNA ITS的启动子和在编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列下游的DNA起始转录序列的反向互补序列(ITS-RC)。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补，和/或每个得到的RNA转录物的ITS对应于该DNA起始转录序列。

其他方面提供了包含第一表达盒和第二表达盒的载体或构建体，该第一表达盒包含可操作地连接到在编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列上游的第一DNA起始转录序列(ITS)的启动子、以及至少一个终止子序列和/或限制性内切酶位点；该第二表达盒包含可操作地连接到在编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列上游的第二DNA起始转录序列(ITS)的启动子、以及至少一个终止子序列和/或限制性内切酶位点。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒以相同方向定向，该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补，并且每个得到的RNA转录物的ITS对应于该DNA起始转录序列。

其他方面提供了包含第一表达盒和第二表达盒的载体或构建体，该第一表达盒包含可操作地连接到在编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列上游的第一DNA起始转录序列(ITS)的启动子、在编码dsRNA的正义链的核苷酸序列下游的DNA起始转录序列的反向互补序列(ITS-RC)、以及至少一个终止子序列和/或限制性内切酶位点；该第二表达盒包含可操作地连接到在编码dsRNA(dsRNA)的反义链的核苷酸序列上游的第二DNA起始转录序列(ITS)的启动子、在编码dsRNA的反义链的核苷酸序列下游的DNA起始转录序列的反向互补序列(ITS-RC)、以及至少一个终止子序列和/或限制性内切酶位点。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补，并且/或者每个RNA转录物的ITS对应于该DNA起始转录序列。

本公开的一些方面提供了表达盒，其包含可操作地连接到在编码目标产物的核苷酸序列上游的DNA起始转录序列(ITS)的启动子，和任选地，至少一个终止子序列和/或限制性核酸内切酶位点。

本公开的其他方面提供了表达盒，其包含可操作地连接到在编码目标产物的核苷酸序列上游的DNA起始转录序列(ITS)的启动子和在编码目标产物的核苷酸序列下游的DNA起始转录序列的反向互补序列(ITS-RC)。

在又其他方面，本公开提供了表达盒，其包含可操作地连接到编码目标产物的核苷酸序列上游的DNA起始转录序列(ITS)的启动子、编码目标产物的核苷酸序列下游的DNA起始转录序列的反向互补序列(ITS-RC)、以及至少一个终止子序列和/或限制性内切酶位点。在一些实施方案中，ITS包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

本公开的其他方面提供核酸结构排列设计(例如，核酸载体、核酸构建体)。在一些实施方案中，核酸设计包括质粒、线性化模板或任何其他DNA构建体构型，用于增强目标序列(例如，目标RNA)的表达(例如，相对于对照构建体，目标序列的表达增强)。在一些实施方案中，本公开提供了一种结构设计，其包含涉及两个盒的“互补表达盒”设计(例如，用于表达目标dsRNA分子)，其中每个盒包括ITS和任选的ITS-RC，用于目标dsRNA分子的表达。在一些实施方案中，结构设计包含涉及两个盒的“互补表达盒”设计，其中每个盒包括ITS和任选的ITS-RC，用于表达目标dsRNA分子，其中该第一表达盒编码dsRNA的正义链，并且该第二表达盒编码反义链，使得正义链和反义链都能够表达，并且其中第一盒和第二盒由双链DNA的相同区段的两条互补链编码，其中从两个盒转录产生的正义链和反义RNA链退火以生成dsRNA分子，其包括r-ITS和任选的r-ITC-RC。在该结构的一些实施方案中，具有或不具有DNA ITS的目标序列可操作地连接到每端的两个启动子，一个启动子驱动所需dsRNA产物的正义链的表达，并且另一个驱动所需dsRNA产物的反义链的表达。在“互补表达盒”设计的转录期间，RNA聚合酶从两端的启动子开始转录互补链，并且聚合酶在起始穿过两条互补DNA链时相互移动(例如，以聚合方式)。

在其他实施方案中，核酸结构排列设计(例如载体或构建体，例如用于dsRNA表达)包含“独立表达盒”设计，其中通过独立DNA区段编码用于表达该dsRNA分子的正义链和反义链的表达盒。DNA的独立区段可以掺入相同的质粒、线性化模板或任何其他DNA构建体中。在一些实施方案中，“独立表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(同一DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)上以相同方向定向。在一些实施方案中，“独立表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(例如，给定载体或DNA分子中的两条相反链用作两个表达盒的模板链)上以相反方向定向。取决于两个表达盒在给定载体或其他DNA分子上以相同方向或相反方向定向，RNA聚合酶可能在dsDNA分子的同一链上以相同方向或在两条不同的DNA链上以相反方向转录或发挥作用。

在其他实施方案中，核酸结构设计(例如，载体或构建体)包含涉及两个表达盒的“独立表达盒”设计，其中用于表达dsRNA分子的正义链和反义链的表达盒由独立DNA区段编码，可能会或可能不会掺入相同的质粒、线性化模板、或其他DNA构建体中。在一些实施方案中，“独立表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，包括该ITS和任选的该ITS-RC，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(同一DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)上以相同方向定向。在一些实施方案中，“独立表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，包括该ITS和任选的该ITS-RC，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(例如，给定载体或DNA分子中的两条相反链用作两个表达盒的模板链)上以相反方向定向。取决于两个表达盒在给定载体或DNA分子上以相同方向或相反方向定向，驱动来自两个独立启动子的表达的RNA聚合酶可能在dsDNA分子的同一链上以相同方向或在两条不同的DNA链上以相反方向转录或发挥作用。

在其他实施方案中，核酸结构排列设计(例如，载体或构建体)包含“多表达盒”设计，其中多个表达盒由相同DNA分子或不同DNA分子的一部分的独立DNA区段编码，允许表达多个单链RNA(ssRNA)分子。在一些实施方案中，这些多个ssRNA分子可以编码相同的目标序列(SOI)和/或可以掺入相同的质粒、线性化模板或任何其他DNA构建体中。在一些实施方案中，“多表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(同一DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)上以相同方向定向。在其他实施方案中，“多表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是同一载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒以相反方向定向(例如，两个载体或DNA分子中的链，不同或相反的DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)。在一些实施方案中，“多表达盒”设计导致ssRNA的产生增加。取决于两个表达盒在给定载体或DNA分子上以相同方向或相反方向定向，驱动来自两个独立启动子的表达的RNA聚合酶可能在ssRNA分子的同一链上以相同方向或在两条不同的DNA链上以相反方向转录。

在其他实施方案中，核酸排列结构设计(例如，载体或构建体)包含“多表达盒”设计，其中多个表达盒由相同DNA分子或不同DNA分子的一部分的独立DNA区段编码，并且每个都包括ITS和任选的ITS-RC，允许表达多个ssRNA分子。这些多个ssRNA分子可以具有相同的SOI和/或可以掺入相同的质粒、线性化模板或任何其他DNA构建体中。在一些实施方案中，“多表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(同一DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)上以相同方向定向。在其他实施方案中，“多表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是同一载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒以相反方向定向(例如，不同或相反的DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)。在一些实施方案中，“多表达盒”设计导致ssRNA的产生增加。

在一些方面，本文还提供了包含在转录反应中组合本文所述的任何一种载体或构建体和聚合酶并且产生RNA转录物的方法。

附图说明

图1提供了示例性质粒DNA模板的示意图，该模板具有用于体外或体内转录RNA产物的表达盒。

图2提供了用于体外或体内转录RNA产物的示例性线性DNA模板的示意图，其中每个DNA模板包含表达盒，该表达盒包含可操作地连接到编码dsRNA产物的正义链或反义链的目标序列(SOI)上游的ITS的启动子。得到的dsRNA产物在完全杂交后包含对应于DNA模板的每个ITS的5'r-ITS突出端。

图3提供了用于体外或体内转录在得到的RNA转录物中含有5'r-ITS和3'r-ITS-RC的RNA产物的示例性线性DNA模板的示意图。所示的两个DNA模板各自包含分别编码dsRNA产物的正义链和反义链的表达盒，其中每个表达盒包含可操作地连接到编码正义链或反义链的目标序列(SOI)上游的ITS的启动子和ITS反向互补序列(ITS-RC)。得到的dsRNA产物在完全杂交时不包含任何单链突出端。

图4提供了用于体外或体内转录以产生dsRNA产物的示例性DNA模板的示意图。顶部示意图是包含“互补表达盒”结构的DNA模板，其中该dsRNA产物的正义链和反义链的表达盒由两条互补DNA链编码并且其中该DNA模板包含两个可操作地连接到位于要转录的目标序列(SOI)的两端的ITS_2序列的聚合启动子。中间示意图是包含用于dsRNA合成的“互补表达盒”结构的DNA模板，其中dsRNA产物的正义链和反义链的表达盒由两条互补DNA链编码并且其中该DNA模板包含两个具有位于要转录的目标序列(SOI)的两端的GL-杂交体-A9 ITS的聚合启动子。底部示意图是包含用于dsRNA合成的“独立表达盒”结构的DNA模板，其中dsRNA产物的正义链和反义链由单独的DNA区段上的单独的表达盒编码，其中每个表达盒包含启动子和位于编码要转录的正义链或反义链的目标序列(SOI)上游的ITS。

图5是显示使用包含不同ITS的DNA模板在体外转录(IVT)反应后获得的dsRNA产物(GS1 dsRNA)的表达水平(效价，以ng/μL计)的图。

图6A至图6B是显示使用包含不同ITS的DNA模板在无细胞反应后获得的dsRNA产物(GS1 dsRNA)的表达水平(效价，以ng/μL计)的图。使用产生具有5'单链突出端(图6A)和没有5'单链突出端(图6B)的dsRNA产物的DNA模板获得数据。

图7A至图7D提供了显示使用各种DNA模板结构的dsRNA产物(GL Seq-A、GL Seq-B、GL Seq-C、GL Seq-D、GL Seq-E)的表达水平增加倍数的图。图7A是显示使用不同DNA模板结构的RNA效价代理的图。图7B显示了相对于采用相同设计但没有GL-杂交体_A9 ITS的DNA模板，使用具有GL-杂交体_A9 ITS的“互补表达盒”设计的DNA模板的dsRNA表达水平增加倍数。图7C显示了相对于使用具有相同GL-杂交体_A9 ITS的“互补表达盒”设计的DNA模板，使用具有GL-杂交体_A9 ITS的“独立表达盒”设计的DNA模板的表达水平增加倍数。图7D显示了相对于使用没有GL-杂交体_A9 ITS的“互补表达盒”设计的DNA模板，使用具有GL-杂交体_A9 ITS的“独立表达盒”设计的DNA模板的表达水平增加倍数。

图8A至图8C证明了不同终止子序列终止单链RNA(ssRNA)产物转录的有效性。图8A提供了用于评估通读和终止效率的DNA模板的示意图。图8B提供了使用图8A所示的DNA模板在体外转录反应中合成的ssRNA产物的反相离子对(RP-IP)高效液相色谱(HPLC)色谱图。图8C是显示在不同水平的三磷酸核苷(NTP)(每种NTP的2mM、4mM和8mM)使用图8A所示的DNA模板的体外转录反应的净终止效率的图。

图9是示例性DNA质粒的示意图，其采用“独立表达盒”设计来从两个单独的表达盒转录dsRNA产物的正义链和反义链。如本文所述，正义链和反义链的转录由可操作地连接到DNA起始转录序列(ITS)的T7启动子独立驱动。

图10是显示在使用质粒(pGLA583和pGLA584)和线性DNA模板进行无细胞反应后获得的dsRNA产物(GS4 dsRNA)的表达水平(效价，以ng/μL计)的图。

图11是显示在使用具有各种ITS的DNA模板的无细胞反应(NTP反应和NMP反应)后获得的dsRNA产物(GS1 dsRNA)的表达水平(效价，以ng/μL计)的图。

图12是显示与作为来自包含单个表达盒的质粒DNA模板(质粒构建体-2)的“发夹”产物变体的GLSeq-A dsRNA产物的表达相比，来自质粒DNA模板的dsRNA产物(GLSeq-AdsRNA)的表达的图，该质粒DNA模板包含编码正义链和反义链的两个独立表达盒(质粒构建体-1)。

图13A至图13B是用于表达dsRNA产物的示例性质粒DNA模板的示意图。图13A显示了示例性质粒DNA模板(质粒构建体-3)，其采用'独立表达盒'结构来产生dsRNA，其中该质粒中两个单独的表达盒中的每一个分别允许表达侧翼为ITS和ITS-RC的dsRNA产物的正义链和反义链。两个表达盒以相同方向定向，并且由作为选择标记和复制起点的氨苄青霉素抗性bla基因隔开。图13B显示了采用“互补表达盒”结构进行dsRNA表达的示例性质粒DNA模板(质粒构建体-4)，其中相同DNA区段的两条互补DNA链允许表达dsRNA产物的正义链和反义链，并且编码两个表达盒的DNA区段包含目标序列(SOI)，其每一端侧翼为可操作地连接到合适的ITS的T7启动子。

图14是显示使用质粒DNA模板采用“独立表达盒”结构(质粒构建体-3)或“互补表达盒”结构(质粒构建体-4)从无细胞反应获得的两种不同的dsRNA产物(GS1和GS4)的表达水平(效价，以ng/μL计)的图。

图15是显示使用质粒DNA模板采用不同ITS变体用作部分表达盒的“独立表达盒”结构(质粒构建体-3)从无细胞反应获得的GS1 dsRNA的表达水平(效价，以ng/μL计)的图。

图16A是显示使用G-开始ITS产生的未加帽RNA和使用A-开始ITS产生的加帽RNA的产生效价(效价，以mg/ml计)的图。图16B显示了说明在无细胞反应中产生的RNA种类的大小分布的电泳图，使用BioAnalyzer仪器捕获。

图17A是显示使用CleanCap AG、A-开始ITS和各种开放阅读框序列的加帽RNA的产生效价(效价，以mg/ml计)的图。图17B显示了说明在无细胞反应中产生的RNA种类的大小分布的电泳图，使用片段分析仪仪器捕获。

具体实施方式

在一些方面，本文提供了核酸、核酸组合物，例如，基于DNA的载体或构建体，以及用于产生核糖核酸(RNA)如双链RNA(dsRNA)和单链RNA(ssRNA)的有关使用方法和试剂盒。本文提供的组合物能够使用无细胞反应和体外转录反应以成本效益和高产产生RNA。

定义

尽管相信以下术语被本领域普通技术人员很好理解，但提出以下定义是为了便于解释当前公开的主题。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。核酸可以是单链或双链的。该核酸分子中的核苷酸单体可以是天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其组合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱的修饰。

术语“转录”或“RNA转录”通常是指RNA转录物由能够使用核酸分子(DNA或RNA)作为模板聚合核糖核苷三磷酸的RNA聚合酶在体内或体外合成的过程。

术语“模板”或“转录模板”或“用于转录的模板”通常是指用作RNA聚合酶的模板以通过转录过程产生RNA转录物的核酸序列(DNA或RNA)。该模板指定了由该RNA聚合酶合成的RNA转录物的序列。该RNA聚合酶通过沿着模板核酸分子的模板链移动并且将与模板(DNA或RNA)链互补的核糖核苷酸三磷酸添加到生长的RNA转录物中来合成RNA转录物。该模板可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，模板是单链或双链的。在大多数生物体中，转录是通过RNA聚合酶进行的，使用双链DNA分子(染色体DNA)作为细胞中的模板合成mRNA。在一些实施方案中，体外转录利用合成的部分双链DNA模板被DNA依赖性RNA聚合酶转录。在一些实施方案中，模板是线性分子。在一些实施方案中，模板是环状的。模板可含有除RNA转录物表达所必需的要素之外的其他要素。此外，通过RNA依赖性RNA聚合酶从单链RNA进行体内和/或体外转录也是可能的(例如，在一些RNA病毒的情况下)。在一些实施方案中，术语“模板”或“转录模板”或“用于转录的模板”可以指双链DNA分子的区段的特定核酸序列或含有要转录的核酸序列的完整DNA分子。

术语“T7启动子”、“T7 RNAP启动子”或“T7 III类启动子”通常是指T7 RNA聚合酶结合以启动转录的双链DNA区段。在一些实施方案中，T7启动子是最小的T7 III类启动子。在一些实施方案中，最小T7 III类启动子是天然存在于T7噬菌体基因组中的

和

基因上游的17个碱基对(bp)长dsDNA区段，其非模板链具有序列TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:9)。本文定义的最小T7 III类启动子在其端不包括规范的“G”，并且预计不会自行启动转录，除非要表达的序列在其开始处携带“G”。在一些实施方案中，T7启动子包含47bp启动子，其包含：a)30bp DNA区段(由非模板链序列TCGATTCGAACTTCTGATAGACTTCGAAAT表示；SEQ ID NO:37)，该区段自然发现于

之前区域中最小T7 III类启动子上游，T7噬菌体基因组中的

和

基因可操作地连接到SEQ ID NO:9的b)17bp最小T7 III类启动子。

术语“转录起始位点(TSS)”通常是指模板上RNA聚合酶启动转录的特定核苷酸位置。该转录起始位点通常是紧邻启动子下游的核苷酸位置，RNA聚合酶在此开始合成RNA。在一些实施方案中，在转录模板是具有可操作地连接到ITS的启动子的DNA分子的情况下，该TSS是ITS的第一个核苷酸。在一些实施方案中，在转录模板是具有可操作地连接到目标序列的启动子的DNA分子的情况下(即，缺乏ITS的模板)，该TSS是目标序列的第一个核苷酸。如本文所用，该TSS通常不与最小T7 III类启动子重叠，而是作为该ITS的第一个核苷酸被包括在内，或者如果ITS不存在，则作为目标序列的第一个核苷酸被包括在内。

术语“目标序列(SOI)”通常是指掺入RNA转录物或通过转录产生的RNA产物中的特定核酸序列。因此，在一些实施方案中，SOI是编码RNA产物的特定核酸序列的DNA模板的区段。在一些实施方案中，SOI是RNA转录物或产物的部分或全部的核酸序列。

术语“DNA起始转录序列(ITS)”通常是指包含DNA模板上转录序列的前几个核苷酸(例如，1-15个核苷酸)的序列，紧邻启动子下游。在一些实施方案中，DNA ITS影响通过转录产生的全长RNA转录物的总产量(例如，相对于缺乏ITS序列的对照DNA模板增加总产量)。在与启动子起始结合后，预计RNA聚合酶将在ITS上来回循环以释放短的无效RNA转录物，然后启动子清除和转变到转录的延伸阶段，从而允许合成全长RNA转录物。

术语“RNA起始转录物序列(r-ITS)”通常是指包含RNA转录物开始处的前几个核苷酸(例如，1-15个核苷酸)的序列，对应于用于所述RNA转录物的转录的DNA模板上的ITS。该r-ITS可以指存在于SOI上游的RNA转录物开始处的序列。在一些实施方案中，r-ITS对应于天然存在的ITS。在一些实施方案中，r-ITS是存在于启动子和SOI之间的异源或合成序列。

术语“ITS”通常是指DNA起始转录序列(ITS)。术语“ITS-RC”通常是指DNA起始转录序列的反向互补序列。术语“r-ITS”通常是指从相应的ITS转录的RNA起始转录序列。术语“r-ITS-RC”通常是指从相应的ITS-RC转录的RNA起始转录序列的反向互补序列。

如本文所用，术语“转录终止子”或“终止子”通常指特定序列，通常位于DNA模板上的SOI端，该DNA模板导致聚合酶的RNA转录终止。在一些实施方案中，终止子是导致RNA聚合酶从DNA模板释放并且转录停止的核酸序列。终止子可以是单向的或双向的。

术语“正义”和“反义”通常是指双链DNA或RNA分子中的单个链。如本文所用，术语“正义链”通常是指双链核酸分子的编码链的核酸序列。术语“反义链”可用于指被转录以产生mRNA的双链核酸的模板链或其区段的核酸序列。可替代地，术语“反义链”可以指与mRNA转录物或其区段互补的RNA链的核酸序列。

术语“表达盒”通常是指作为DNA模板用于通过转录表达目标RNA转录物的DNA序列。在一些实施方案中，表达盒至少由可操作地连接到编码待表达的RNA分子的核酸序列的启动子组成。该表达盒任选地还包括一种或多种以下要素：增强表达的特定起始转录序列(ITS)、特异性ITS的反向互补序列(ITS-RC)、一个或多个限制性内切酶位点(RES)、和/或一个或多个终止子。

如本文所用，术语“构建体”、“核酸构建体”、“表达构建体”、“工程化核酸”或“载体”通常是指包括一个或多个表达盒的DNA分子，用于在体外或体内通过RNA聚合酶的转录来表达RNA转录物或目标产物(例如，RNA产物或目标蛋白质)。“构建体”和“载体”在本文中可互换使用。构建体可包括其他要素，这些要素对于RNA转录物的表达并不重要，但对于确保其自身在体内或体外的复制、维持、稳定性等是必不可少的。例如，构建体可以是具有一个或多个表达盒的质粒，该表达盒另外具有复制起点和分别用于其在合适的宿主中复制和维持的选择标记。可替代地，已通过整合一个或多个表达盒而修饰以允许RNA转录物表达的生物体的染色体可包含构建体。因此，构建体的非限制性实例包括载体、病毒载体(例如，腺相关病毒载体)、质粒、粘粒、质体、噬菌体、人工染色体、整合了表达盒的天然基因组或线性DNA分子。

如本文所用，在一些实施方案中，当两个核酸序列或要素在功能上彼此连接时，两个核酸序列或要素被认为是“可操作地连接”。例如，在一些实施方案中，启动子可操作地连接到起始转录序列(ITS)，使得该启动子相对于它调节的ITS处于正确的功能位置和方向以控制(“驱动”)转录起始和/或该ITS序列的表达。

RNA的产生

RNA的转录，例如，产生，涉及三个主要步骤。在第一步(起始)中，RNA聚合酶与DNA模板上的启动子结合，熔化两条DNA链(非模板链和模板链)并且通过掺入和聚合与模板DNA链互补的核糖核苷酸在转录起始点(TSS)启动转录。该聚合酶可以继续在前几个核苷酸上来回循环以反复释放短的无效转录物(长度为3至8个核苷酸)，直到成功转变到下一步(延伸)。在启动子清除和形成稳定的三元延伸复合物后，该聚合酶继续沿着DNA模板移动并且通过掺入与模板DNA链互补的核糖核苷酸来延伸/构建RNA产物。在完成RNA产物产生后，第三步(终止)涉及聚合酶从转录的RNA产物中释放，这是由于聚合酶遇到DNA模板上的终止子序列或到达线性DNA模板的末端并且从模板上脱落。

本文描述了用于RNA转录方法的核酸组合物，例如，DNA模板。在一些实施方案中，核酸，例如，DNA模板，包含模板要素，例如，DNA起始转录序列(ITS)，其提高每个转录步骤(例如，起始、延伸、和/或终止)的效率，以最大化来自转录反应(例如，无细胞反应和/或体外或体内转录反应)的RNA产物产量。在一些实施方案中，核酸，例如，DNA模板，包含可变长度的ITS和核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸，例如，DNA模板，例如，DNA载体、DNA构建体或DNA质粒，包含两个表达盒，其中一个表达盒编码双链RNA(dsRNA)的正义链并且其他表达盒编码所述dsRNA的反义链。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链完全或部分互补。在一些实施利中，核酸，例如，DNA模板，例如，DNA载体、DNA构建体或DNA质粒，包含至少两个表达盒，其中每个表达盒编码SOI以产生ssRNA分子。

在一些实施方案中，DNA模板的启动子区域可操作地连接到DNA起始转录序列(ITS)。该ITS是长达15个核苷酸(例如，6-15个核苷酸)的短序列，其通过启动子清除影响从转录起始阶段到延伸阶段的转变，从而影响从给定启动子转录的速率和净产量。在一些实施方案中，ITS最初和重复转录以在转录起始步骤期间释放短的无效转录物。因此，在DNA模板上的ITS转录后，r-ITS存在于全长RNA转录物的5'端。因此，当ITS存在时，它在转录的早期阶段(通过启动子清除启动和转变到延伸阶段)具有关键作用，并且影响从给定启动子转录的总体速率和产量。在一些实施方案中，ITS是天然存在的ITS，例如，在噬菌体T7基因组中的T7 III类启动子之后立即发现的共有ITS。在一些实施方案中，共有ITS在

和

基因之前并且包含紧邻T7 III类启动子下游的前6个核苷酸(GGGAGA(SEQ ID NO:8))。在一些实施方案中，ITS是合成ITS(例如，GGGAGACCAGGAATT(SEQ ID NO:1))。

启动子可以与基因或序列天然有关，例如，内源启动子。在一些实施方案中，内源启动子位于给定基因或序列的编码区段上游。在一些实施方案中，编码核酸序列，例如，SOI，可以位于重组或异源启动子的控制下，该启动子是指在其自然环境中通常不与编码序列有关的启动子。此类启动子可以包括其他基因的启动子；从任何其他种类中分离的启动子；和非“天然存在”的合成启动子或增强子，例如，含有不同转录调控区的不同要素和/或通过本领域已知的基因工程方法改变表达的突变的那些。

在一些实施方案中，使用本文所述的核酸和无细胞反应产生RNA，如国际公开号WO2019/075167中所述。在一些实施方案中，无细胞转录反应涉及三个主要过程：(1)细胞内聚合RNA降解为核苷酸单体——核苷酸单磷酸(NMP)和核苷酸二磷酸(NDP)的组合，(2)NMP和NDP转化为三磷酸核苷酸(NTP)，其用作形成聚合RNA的“构件”，以及(3)使用核酸组合物(例如，基于DNA的载体)聚合NTP以产生RNA。

在一些实施利中，使用本文所述的核酸组合物和体外转录(IVT)反应产生RNA。在一些实施利中，IVT反应包含重组RNA聚合酶、NTP、盐、金属、辅因子、和/或缓冲液。在一些实施方案中，本领域中任何描述的IVT反应可以与本文描述的核酸组合物一起使用。

产生RNA的方法可以在4℃至80℃或更高的温度下进行。例如，产生RNA的方法可以在4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃的温度下进行。产生RNA的方法可以进行5分钟(min)至48小时(hr)或更长的时间段。例如，产生RNA的方法可以进行5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、或48小时的时间段。

在一些实施方案中，产生RNA的方法可以由高度进行性DNA依赖性T7 RNA聚合酶催化，例如，由来自T7噬菌体基因组的基因1编码的T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶是来自T7噬菌体的T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶是RNA依赖性RNA聚合酶，例如，来自噬菌体Φ6的Φ6RNA聚合酶。根据本公开，可以使用其他DNA依赖性或RNA依赖性RNA聚合酶。

在一些实施方案中，本公开的核酸的转录产生RNA产物，例如，dsRNA、信使RNA、shRNA、siRNA、ssRNA、gRNA、反义寡核苷酸、或gapmer的正义链或反义链。在一些实施方案中，本公开的核酸的转录产生侧翼为ITS(r-ITS)和ITS的反向互补序列(r-ITS-RC)的RNA产物。

在一些实施方案中，使用本文所述组合物产生RNA的方法产生比对照多至少5％RNA、多至少10％RNA、多至少20％RNA、多至少30％RNA、多至少40％RNA、多至少50％RNA、多至少60％RNA、多至少70％RNA、或更大。例如，使用包含可操作地连接到ITS(例如，包含SEQID NO:1的核苷酸序列的ITS)的启动子的载体或构建体的方法，产生的RNA比对照多至少5％RNA、至少10％RNA、至少20％RNA、至少30％RNA、至少40％RNA、至少50％RNA、至少60％RNA、至少70％RNA、或更大(例如，使用不包含可操作地连接到ITS的启动子的载体或构建体的方法)。

在一些实施方案中，使用本文所述的核酸构建体或工程化核酸的组合物通过转录产生RNA，例如，在包含本文所述的核酸构建体或工程化核酸的微生物细胞中。在一些实施方案中，核酸构建体或工程化核酸整合到该微生物细胞的染色体中。在一些实施方案中，核酸构建体或工程化核酸是质粒或含有在微生物细胞内的任何其他核酸构建体或工程化核酸。在一些实施方案中，在包含本文所述核酸构建体的原核或真核细胞中产生RNA，在对RNA产生最佳的条件下生长。在一些实施方案中，包含本文所述的核酸构建体或工程化核酸的细胞在发酵室或反应器中生长以产生作为目标产物的RNA。在其他实施方案中，包含本文所述的核酸构建体或工程化核酸的细胞在发酵室或反应器中生长以产生目标蛋白质或肽，其中该核酸构建体或工程核酸允许在细胞内表达编码该目标蛋白质或肽产物的RNA。

起始转录序列

用于本文所述的核酸组合物的ITS可包含1-15个核苷酸长度，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个核苷酸长度。在一些实施方案中，ITS长度是1-6、1-9、1-12、1-15、3-6、6-9、6-12、6-15、9-15、9-12、10-15、10-12、12-15、或多于15个核苷酸。在一些实施方案中，ITS位于紧邻启动子(例如，T7 III类最小的启动子)下游。在一些实施方案中，ITS包含转录起始位点。

在一些实施方案中，ITS如表1所述。在一些实施方案中，ITS是SEQ ID NO:1-8或38-41中的任一项。在一些实施方案中，ITS是SEQ ID NO:1-4或38-41中的任一项。在一些实施方案中，ITS是SEQ ID NO:1-8或38-41中任一个的变体，其中该变体包含至少1、2、3、4、5、或更多个突变。在一些实施方案中，可操作地连接到ITS的启动子位于目标序列(SOI)上游，其中该SOI编码所需RNA产物，例如，dsRNA的正义链或反义链。在一些实施方案中，T7 III类最小启动子包含TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，T7 III类最小启动子之前是天然存在于T7噬菌体基因组区域中启动子上游的30个碱基对序列，例如，包含TCGATTCGAACTTCTGATAGACTTCGAAATTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:18)。

表1：ITS变体

在一些实施方案中，启动子是最小III类T7启动子，其包含序列：TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，启动子是延伸的III类T7启动子，其包含序列：TCGATTCGAACTTCTGATAGACTTCGAAATTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:18)。

该ITS_6变体对应于T7基因组中基因

和

基因之前的ITS保守区域。该pT7-g10、pT7-g5和pT7-5_LIT_AI变体对应于先前报道的合成或天然存在的ITS。GL-杂交体变体(GL-杂交体_A9、GL-杂交体_A9G、GL-杂交体_A9C、GL-杂交体_A9T)由本公开的发明人鉴定并且在促进RNA转录过程中出人意料地有效。如实例所述，相对于对照DNA模板，例如，包含ITS_6的DNA模板，包含可操作地连接到GL-杂交体ITS变体的启动子的DNA模板产生更高水平的转录的RNA产物。

目标序列

本文所述的核酸(例如，DNA模板)的组合物包含目标序列(SOI)，其中所述SOI是编码RNA产物的任何序列。在一些实施方案中，SOI可操作地连接到启动子，任选地包含ITS的启动子。该启动子驱动其调节的SOI的表达或转录。

在一些实施方案中，RNA产物是双链RNA(dsRNA)的正义链。在一些实施方案中，RNA产物是dsRNA的反义链。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与dsRNA的反义链互补。在一些实施方案中，RNA产物是单链RNA，例如，信使RNA。在一些实施方案中，RNA产物是shRNA、siRNA、反义寡核苷酸、gapmer、或任何其他可能的RNA产物。

在一些实施方案中，RNA产物，例如，dsRNA、靶向(例如，通过RNA干扰)目标基因组序列，例如，来自昆虫、植物、真菌、动物、或病毒的基因组序列。在一些实施方案中，RNA产物，例如，mRNA，编码目标蛋白质。

在一些实施方案中，编码RNA产物的SOI可以具有足以诱导生物活性的任何长度。非限制性实例可包括编码长度为4至10、4至20、4至30、4至50、4至60、4至70、4至80、4至90、4至100、4至200、4至300、4至400、4至500、4至1000、500至2000个核苷酸、500至4000个核苷酸、500至6000个核苷酸、500至8000个核苷酸、或4至10000个核苷酸的RNA产物的SOI。在一些实施方案中，编码RNA产物的SOI具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，编码RNA产物的SOI具有4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、500、1000、或更多个核苷酸的长度。

如果两个核酸(例如，dsRNA的正义链和反义链)通过Watson-Crick相互作用(也称为杂交)相互碱基配对或结合形成双链核酸分子，则它们彼此互补(例如，全部或部分互补)。如本文所用，结合是指由于例如生理条件下的静电、疏水、离子和/或氢键相互作用而导致至少两个分子或同一分子的两个区域之间的结合。在一些实施方案中，两种核酸是100％互补的(即，沿着核酸的区段或全部完全互补)。在一些实施方案中，两种核酸沿着核酸的区段或全部至少75％、80％、85％、90％或95％互补(例如，分互补)。可使用任何合适的序列比对算法来确定最佳比对，非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows Wheeler对齐器)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)、SOAP(可访问soap.genomics.org.cn)和Maq(可访问maq.sourceforge.net)。在一些实施方案中，彼此互补的两个核酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个错配碱基对。

在一些实施方案中，双链RNA或dsRNA是完全双链分子，其不含有单链区(例如，环或突出端)。在一些实施方案中，双链RNA或dsRNA是部分双链分子，其含有双链区和单链区(例如，环或突出端)。

终止子序列

在一些实施方案中，核酸(例如，DNA模板)的组合物包括转录终止子序列。转录终止子的编码序列通常位于紧邻编码序列的下游。它由参与RNA聚合酶特异性终止RNA转录物的DNA序列组成。终止子序列防止上游启动子对下游核酸序列的转录激活。因此，在一些实施方案中，考虑了包含终止RNA转录物产生的终止子的DNA模板。最常用的终止子类型是正向终止子。当置于通常被转录的核酸序列下游时，正向转录终止子将导致转录中止。在一些实施方案中，提供了双向转录终止子，其通常导致转录在正向和反向链上都终止。在一些实施方案中，提供了逆转录终止子，其通常仅在反向链上终止转录。在原核系统中，终止子通常分为两类：(1)rho非依赖性终止子，和(2)rho依赖性终止子。Rho非依赖性终止子通常由回文序列组成，该序列形成富含G-C碱基对的茎环，然后是一串尿嘧啶碱基。

根据本公开使用的终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何转录终止子。终止子的非限制性实例包括基因的终止序列，如像，牛生长激素终止子、大肠杆菌核糖体RNA T1T2终止子、rrnBT1和rrnBT2、人甲状旁腺前体PTH终止子和病毒终止序列及其衍生物如像，T0终止子、TE终止子、λT1、T7、TT7、T7U、TT3终止子、以及在细菌系统中发现和/或使用的其他终止子序列。在一些实施方案中，终止信号可以是不能被转录或翻译的序列，如由序列截短产生的那些。

在一些实施方案中，终止子包含两个或更多个单独的和/或不同的终止子序列或其组合。在一些实施方案中，终止子包含rrnBT1、rrnBT2、TT7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。在一些实施方案中，终止子如表2中所述。在一些实施方案中，终止子包含SEQ ID NO:19-30中任一项。

表2：实例终止子序列

核酸结构

本文所述的核酸可包含任何可想到的结构。在一些实施方案中，核酸是线性的。在一些实施方案中，核酸是环状的。在一些实施方案中，环状核酸包含核酸内切酶识别位点，如果合适的核酸内切酶在所述核酸内切酶识别位点处切割核酸，则可以允许该环状核酸线性化。在一些实施方案中，核酸是包含目标序列(SOI)的DNA模板，其中该SOI编码RNA产物。在一些实施方案中，DNA模板或载体是质粒或DNA构建体。在一些实施方案中，DNA模板或载体是质粒、表达盒、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、腺相关病毒载体(AAV载体)、或病毒。

本公开描述了与常规结构(例如发夹)相比，在产生目标RNA(例如dsRNA)方面已证明有更好效果的核酸结构。使用包含两个单独的表达盒(“独立表达盒”结构)的核酸构建体，每个都能够表达dsRNA产物的正义链和反义链，与允许合成给定dsRNA产物的其他构建体结构相比，具有优势。

在一些实施方案中，核酸，例如，本文所述的载体或构建体，包含两个如上所述的表达盒，它们分别允许表达dsRNA产物的正义链和反义链，从而导致dsRNA产物被由正义链和反义链的杂交形成，其水平高于来自携带单个表达盒的载体的杂交，该表达盒能够表达发夹dsRNA产物，正义链和反义链通过环序列连接。

例如，允许独立于两个单独的表达盒表达正义链和反义链的这种构建体导致dsRNA产物效价高于携带能够表达转录物的单个表达盒的构建体，其中dsRNA产物的两条互补链通过单链接头或环区连接以形成dsRNA发夹结构，如下面实例4所示。

对于长度为“x”个碱基对的dsRNA产物，在从单个表达盒表达的dsRNA发夹产物的情况下，发夹的成功合成需要聚合酶成功地在(2x+l)碱基对长的DNA区成功转录，其中“l”是连接正反义链的“环”的长度。相比之下，对于正义链和反义链从两个单独的表达盒独立表达的构建体，每个聚合酶分子只需要转录长度为“x”个碱基对的DNA即可成功生成能够杂交形成该dsRNA产物的全长转录物。当聚合酶过量并且通过选择合适的ITS(如本文所述)确保有效的启动子清除时，多个聚合酶分子可同时并且独立地结合两个表达盒的启动子并且转录多个拷贝的来自两个单独的表达盒的正义转录物和反义转录物，在反应中同时表达的正义转录物和反义转录物杂交时生成大量的dsRNA产物。相比之下，在类似的反应条件下，具有用于表达dsRNA发夹的单个表达盒的构建体预计会导致较低的相对产量，因为仅有单个启动子可用于转录包含通过发夹环连接的正义转录物和反义转录物的单个RNA分子。此外，对于导致转录失败率高的RNA反应，增加要转录以获得全长转录物的DNA模板长度(与“x”相比，“2x+l”)预计将进一步影响产量。

如本文所述，核酸，例如，载体或构建体，包含启动子任选地可操作地连接到ITS的启动子、目标序列(SOI)、和终止子序列。在一些实施方案中，核酸包含可操作地连接到ITS_6共有ITS(例如，如SEQ ID NO:17中的序列)的T7最小启动子。在一些实施方案中，待转录的SOI置于或位于紧邻启动子(例如，III类T7启动子)的下游。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体还包含一个或多个位于SOI下游的终止子或终止子序列，例如，以防止通读转录超出SOI，这将导致RNA产物具有其他和不期望的核苷酸。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体还包含限制性内切核酸酶识别位点。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶识别位点置于或位于SOI的下游，例如，紧邻SOI的下游，以允许在DNA模板用于转录反应之前用相应的限制性核酸内切酶线性化质粒模板。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶识别位点位于SOI和终止子之间。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶识别位点位于SOI和终止子下游。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含可操作地连接到ITS的启动子；目标序列(SOI)；限制性内切酶识别位点；和终止子。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，还包含作为位于SOI下游、任选地在SOI和终止子之间的ITS的反向互补序列的序列。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含一个表达盒，其中该表达盒最低限度地包含启动子和SOI。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中每个表达盒最低限度地包含启动子和SOI，任选地其中每个表达盒包含不同的SOI。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中该第一表达盒包含编码dsRNA的正义链的SOI并且第二表达盒包含编码该dsRNA的反义链的SOI。在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含多于两个表达盒，例如，三个、四个或五个表达盒。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中第一表达盒包含可操作地连接到编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列(例如，SOI)上游的ITS的启动子；其中第二表达盒包含可操作地连接到编码dsRNA的反义链的核苷酸序列(例如，SOI)上游的ITS的启动子。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。在一些实施方案中，ITS长度为1-15个核苷酸。在一些实施方案中，ITS是SEQ ID NO:1-8或38-41中的任一项。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中第一表达盒包含可操作地连接到编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列(例如，SOI)上游的SEQID NO:1-8或38-41中任一项所提供的ITS的启动子，并且其中第二表达盒包含可操作地连接到编码dsRNA的反义链的核苷酸序列(例如，SOI)上游的SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项所提供的ITS的启动子。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中第一表达盒包含可操作地连接到编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列(例如，SOI)的启动子，并且其中第二表达盒包含可操作地连接到编码dsRNA的反义链的核苷酸序列(例如，SOI)的启动子。在一些实施方案中，dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中第一表达盒包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项的核苷酸序列的ITS的启动子、编码dsRNA的正义链的核苷酸序列(例如，SOI)、终止子；其中第二表达盒，其包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项的核苷酸序列的ITS的启动子、编码该dsRNA的反义链的核苷酸序列(例如，SOI)、和终止子；并且其中该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。在一些实施方案中，两个表达盒由双链DNA的相同区段的两条互补链编码以退火以产生dsRNA分子。在一些实施方案中，在RNA的转录期间，聚合酶分子从两端的启动子开始转录互补链，并且聚合酶在最初穿过DNA的两条互补链时彼此靠近(例如，以聚合方式)。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含两个表达盒，其中第一表达盒包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的ITS的启动子、编码第一RNA产物的核苷酸序列(例如，SOI)、终止子；其中第二表达盒包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的ITS的启动子、编码第二RNA产物的核苷酸序列(例如，SOI)、和终止子；并且其中该dsRNA的正义链与该dsRNA的反义链互补。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒在该给定载体或DNA分子(同一DNA链在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)上以相同方向定向。在一些实施方案中，第一表达盒和第二表达盒在该给定载体或DNA分子(例如，在从两个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链的相反链)上以相反方向定向。取决于两个表达盒在给定载体或DNA分子上以相同方向或相反方向定向，驱动来自两个独立启动子的表达的RNA聚合酶可能在dsDNA分子的同一链上以相同方向或在两条不同的DNA链上以相反方向移动(例如，转录)。

在一些实施方案中，使用表达盒产生的RNA产物的侧翼为r-ITS和r-ITS的反向互补序列(r-ITC-RC)，例如，其中该r-ITS在该RNA产物的5′端并且该r-ITS的反向互补序列(r-ITS-RC)在该RNA产物的3'端。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含“互补表达盒”设计，其中每个盒包括ITS和任选的ITS-RC，用于表达目标dsRNA分子。在一些实施方案中，结构设计包含“互补表达盒”，其各自包括ITS和任选的ITS-RC，用于表达目标dsRNA分子，其中该第一表达盒(编码正义链)和第二表达盒(编码反义链)分别表达dsRNA分子的正义链和反义链。正义链和反义链由双链DNA的同一区段的两条互补链编码并且退火以产生dsRNA分子，该分子包括r-ITS(与ITS互补)和任选的r-ITC-RC(互补于ITC-RC)。在一些实施方案中，在该结构中，具有或不具有DNA ITS的目标序列(SOI)可操作地连接到每端的两个启动子，一个启动子驱动所需dsRNA产物的正义链的表达并且另一个启动子驱动所需dsRNA产物的反义链的表达。在“互补表达盒”设计的转录期间，RNA聚合酶分子从两端的启动子开始转录互补链并且聚合酶在起始穿过两条互补DNA链时相互移动(例如，以聚合方式)。

在其他实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，结构设计包含“独立表达盒”设计，其中用于表达该dsRNA分子的正义链和反义链的表达盒由完全独立DNA区段编码，可能会或可能不会掺入相同的质粒、线性化模板、或其他DNA构建体中。在一些实施方案中，“独立表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(例如，同一DNA链在从每个表达盒的各自启动子转录期间用作模板链)上以相同方向定向。在一些实施方案中，“独立表达盒”设计涉及至少两个表达盒，它们是相同载体或DNA分子的一部分，其中该第一表达盒和该第二表达盒在该给定载体或DNA分子(例如，在转录期间，给定载体或DNA分子中的两条相反链用作两个表达盒的模板链)上以相反方向定向。取决于两个表达盒在给定载体或DNA分子上以相同方向或相反方向定向，驱动来自两个独立启动子的表达的RNA聚合酶可能在dsDNA分子的同一链上以相同方向或在两条不同的DNA链上以相反方向移动(例如，转录)。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，包含单个表达盒，其包含可操作地连接到包含SEQ ID NO:1-4(或每个序列的起始G突变为A的替代版本，如SEQ ID NO:38-41所述)之一的核苷酸序列的ITS的启动子、编码RNA产物(例如，mRNA)的核苷酸序列(例如，SOI)、和终止子和/或限制性内切核酸酶识别位点。在其他实施方案中，起始GG类似地突变为AU。

在一些实施方案中，本文所述的核酸是载体或质粒。在一些实施方案中，载体或质粒需要复制起点，例如，用于载体或质粒在宿主中的复制。复制起点定义了质粒拷贝数。携带来自pUC18或pUC19的复制起点的质粒在特定生长条件下在宿主细胞中保持高拷贝数(500-1000拷贝/细胞)。在一些实施方案中，复制起点是中等拷贝数复制起点，例如，来自pETDuet的ColE1，高拷贝数复制起点，例如，pUC18衍生的复制起点，或低拷贝数复制起点，例如P15A。在一些实施方案中，携带此类质粒的细菌细胞，例如，大肠杆菌细胞，可以在发酵中生长至高细胞密度，以产生大量可以分离和纯化的质粒DNA。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或质粒，还包含选择标记，其确保在选择性培养基上生长期间的维持。在一些实施方案中，选择标记是阳性选择标记，例如，赋予含有选择标记的细菌竞争优势的蛋白质或基因。在一些实施方案中，选择标记是阴性选择标记，例如，抑制含有选择标记的细菌的生长和/或分裂的蛋白质或基因。在一些实施方案中，选择标记是混合的阳性/阴性选择标记，例如，在某些情况下可以提供竞争优势并且在其他情况下抑制生长和/或分裂的蛋白质或基因。可选择标记的实例包括但不限于编码增加或降低对抗生素的抗性或敏感性的蛋白质的基因(例如，氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因和氯霉素抗性基因)或其他化合物。在一些实施方案中，选择标记是无抗生素选择标记。根据本公开，可以使用其他可选择标记。

在一些实施方案中，用于表达dsRNA产物的载体或质粒，其中正义链和反义链从两个不同的表达盒表达，包含复制起点和选择标记。在一些实施方案中，用于表达dsRNA产物的载体或质粒，其中正义链和反义链从两个不同的表达盒表达，包含编码正义链和反义链的两个表达盒的多个拷贝，例如，每个表达盒2、3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，用于表达ssRNA产物的载体或质粒，其中该ssRNA产物从单个表达盒表达，包含复制起点和选择标记。在一些实施方案中，用于表达ssRNA产物的载体或质粒包含编码ssRNA产物的相同表达盒的多个拷贝，例如，相同表达盒的2、3、4、或5个拷贝。

在一些实施方案中，限制性内切酶识别位点被限制性内切酶识别和/或切割。在一些实施方案中，限制性内切核酸酶是I-SceI。其他限制性核酸内切酶是已知的并且可以根据本公开使用。非限制性实例包括EcoRI、EcoRII、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinFI、Sau3AI、PvuII、SmaI、HaeIII、HgaI、AluI、EcoRV、EcoP15I、KpnI、PstI、SacI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、和XbaI、FokI、AscI、AsiAI、NotI、FseI、PacI、SdaI、SgfL、SfiI、PmeI、BspQI、Esp3I、BsmBI、和SapI。

在一些实施方案中，核酸，例如，载体或构建体，还包含作为位于SOI下游、任选地在SOI和终止子之间的ITS的反向互补序列的序列。在一些实施方案中，ITS的反向互补序列是100％互补。在一些实施方案中，ITS的反向互补序列是至少75％、80％、85％、90％或95％互补。

在一些实施方案中，核酸构建体(例如质粒构建体)包含复制子，其定义为允许该核酸构建体(例如质粒DNA)在宿主微生物细胞中复制的最小单位或要素。在一些实施方案中，复制子包括启动核酸构建体(例如质粒DNA)复制的复制起点(ori)和控制核酸构建体(例如质粒)的复制及其在宿主细胞中的拷贝数的其他要素。在该核酸构建体是质粒DNA构建体的实施方案中，质粒DNA的复制由宿主的DNA复制机制在ori处启动。复制子的一些非限制性实例包括那些允许质粒在细菌宿主(例如大肠杆菌)中复制的复制子，这些复制子在ColE1质粒、pBR322质粒(pMB1复制起点)、pUC18和pUC19质粒(携带pUC复制子、pMB1复制子的衍生物)、R6K质粒、p15A质粒、pSC101质粒等中发现。不同的复制子导致给定宿主中质粒的不同拷贝数和产量。例如，ColE1和pMB1起点通常允许在每个细胞中维持约15-20个质粒分子拷贝，而对于携带pUC18或pUC19衍生质粒中的pUC复制子的质粒，rop基因的缺失和pMB1起点中的两个点突变导致温度诱导的拷贝数扩增至每个细胞500–1000个拷贝。此外，真核微生物细胞(例如酵母)中使用的质粒在启动复制处携带“自主复制序列(ARS)”作为复制子。在一些实施方案中，复制子最低限度地由复制起点组成。

试剂盒

本公开的一些方面提供试剂盒。该试剂盒可包括例如本文所述的工程化核酸或构建体、聚合酶、核苷三磷酸和/或核苷一磷酸。

本文所述的试剂盒可包括一个或多个容纳组分的容器和任选的使用说明书。用于研究目的的试剂盒可含有适当浓度或数量的组分以进行各种实验。本文所述的任何试剂盒可进一步包括进行本文所述的任何方法所需的组分。

在适用的情况下，试剂盒的每个组分可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组分可以被冻干、复溶或加工(例如，形成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他种类(例如，水或某些有机溶剂)，其可能会或可能不会随试剂盒一起提供。

在一些实施方案中，试剂盒包括使用所提供的组分的说明书和/或宣传册。说明可以定义说明和/或宣传的组成部分，并且通常涉及在本公开的包装上或与本公开的包装有关的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式(例如视听(例如，录像带、DVD等)、互联网和/或基于网络的通信等)提供的任何口头或电子说明书，使得用户将清楚地认识到说明书将与试剂盒有关。

这些试剂盒可在一个或多个容器中含有本文所述的任何一种或多种组分。这些组分可以无菌制备、包装在注射器中并且冷藏运输。可替代地，它可以装在小瓶或其他容器中进行储存。第二容器可以具有无菌制备的其他组分。可替代地，该试剂盒可以包括预先混合并且在小瓶、管或其他容器中运输的活性剂。

根据特定应用，该试剂盒还可以包括其他组分，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲液、试剂、注射器、针头、一次性手套等。

实施例

实施例1：使用体外转录(IVT)反应从具有不同ITS变体的线性DNA模板产生dsRNA

GS1，一种601碱基对dsRNA，在缓冲液中使用线性DNA模板在体外转录(IVT)反应中产生，该模板包含表达盒，该表达盒包含可操作地连接到置于紧邻要表达的目标序列(GS1正义链和GS1反义链)上游的不同ITS变体(如表3所示)的启动子。在IVT反应中合成的每条GS1链都包含对应于不同的ITS变体的5'单链r-ITS突出端。在实验中使用缺乏特定ITS(ITS_无)的DNA模板作为对照。请注意，对于每个ITS变体和对照，利用了两个DNA模板，其中一个包含编码GS1的正义链的目标序列(SOI)，并且另一个包含编码GS1的反义链的SOI。图2显示了具有表达盒和预期的dsRNA产物(具有5'单链r-ITS突出端)的线性DNA模板的一般结构。

表3：实施例1中使用的ITS变体

*可操作地连接到这些模板中每个ITS的启动子是47bp延伸的T7启动子(即SEQ IDNO.18)，包含17bp最小III类T7启动子与对于T7噬菌体基因组天然的30bp的DNA序列(天然存在于其上游)。以粗体突出显示的是最小的T7 III类启动子，然后是斜体的特定ITS变体。

每个IVT反应包括45mM硫酸镁、2mM亚精胺、四种典型NTP(New England Biolabs,Ipswich,MA)各4mM、0.1mg/mL重组热稳定突变T7 RNA聚合酶、0.04U/μL热稳定无机焦磷酸酶(TIPP)(New England Biolabs,Ipswich,MA)，和各20ng/μL的两个DNA模板(分别编码GS1的正义链和反义链)。反应在48℃下进行2小时。2小时后，如下所述，使用反相离子对(RP-IP)色谱分离和定量RNA产物。

对于RP-IP HPLC分析，从每个反应中取出样品并且使用固相萃取从样品中提取总RNA。在Agilent 1100系列HPLC系统上通过RP-IP-HPLC分析提取的dsRNA样品。使用保持在50℃温度下的

Cartridge(4.6x50mm,ADS Biotec,PN:DNA-99-3501)进行HPLC分析，梯度分离如表4所示(流速为0.85mL/分钟)。信号测量为260nm处的吸光度。

表4：RP-IP HPLC梯度

如图5所示，包含表3中ITS之一的所有模板(ITS_6；pT7-g10；pT7-g5；和GL-杂交体_A9)在IVT反应中提供了高产量的dsRNA产物，表达水平在2000ng/μL–2800ng/μL之间。GL-杂交体_A9 ITS导致GS1 dsRNA的最高表达水平，合成的GS1约为2800ng/μL。正如预期的那样，缺乏特定ITS(ITS_无)的DNA模板没有产生可检测的dsRNA产物表达；该DNA模板在已知对转录至关重要的最小III类T7启动子端缺少端“G”。

实施例2：使用无细胞RNA合成反应从具有不同ITS变体的线性DNA模板产生dsRNA

GS1 dsRNA产物(具有5'突出端)使用包含含核苷酸序列的表达盒的线性DNA模板在无细胞反应中产生，该核苷酸序列包含可操作地连接到不同ITS变体(如表3所示)的启动子，置于要表达的SOI(GS1正义链和GS1反义链)上游。在实验中使用缺乏ITS(ITS_无)的DNA模板作为对照。如在实施例1中，对于每个ITS变体和对照，如图2所示利用两个DNA模板，其中一个包含编码GS1的正义链的SOI，并且另一个包含编码GS1的反义链的SOI。此外，没有单链突出端的GS1 dsRNA产物，如图3所示，也使用根据图3的还包含SOI下游的其相应ITS的反向互补序列的DNA模板产生。

从商业来源获得的酵母RNA粉末以56g/L溶解在水中并且在0.05mM氯化锌存在下使用1.2g/L P1核酸酶在70℃、pH 5.5下解聚1小时。得到的解聚材料通过离心澄清并且使用10kDa MWCO过滤器过滤。得到的流含有总浓度为约90mM至100mM(AMP、CMP、GMP和UMP中的每一种的约20mM至25mM)的5'核苷酸单磷酸(NMP)。

在含补充50mg/L羧苄青霉素的Korz培养基的发酵物中，采用大肠杆菌高细胞密度培养标准技术和简单补料分批技术，培养携带编码单个激酶酶(TthCmk、PfPyrH、TmGmk、AaNdk和DgPPK2)的pBAD24衍生载体的大肠杆菌BL21(DE3)衍生物。然后通过添加L-阿拉伯糖诱导蛋白质表达。收获细菌后，使用高压匀浆在60mM磷酸盐缓冲液中制备裂解物，产生约40g/L总蛋白的混合物。

培养携带编码热稳定T7 RNA聚合酶酶的pBAD24-衍生载体的大肠杆菌BL21(DE3)衍生物，使用L-阿拉伯糖诱导蛋白质表达，并且如上所述制备裂解物。聚合酶酶使用两个硫酸铵分级分离步骤进行部分纯化。

为了组装无细胞反应，含有激酶酶的裂解物以等比例合并，稀释至最终总蛋白浓度为2g/L并且与反应添加剂(45mM硫酸镁和13mM六偏磷酸钠)混合。裂解物在70℃下孵育15分钟以灭活其他酶促活性，同时保留过表达的激酶的活性。此外，加入浓度各为约为4mM的酵母衍生NMP和0.1mg/mL的重组热稳定突变T7 RNA聚合酶，以及两个线性DNA模板(分别表达dsRNA产物的正义链和反义链)各10ng/μL。如实施例1所述，无细胞反应在48℃下孵育2小时并且使用RP-IP HPLC分离和定量RNA产物。

如图6A所示，包含ITS的所有模板产生至少约1800ng/μL水平的RNA，其中GL-杂交体_A9 ITS导致GS1 dsRNA(具有5'r-ITS突出端)的最高表达水平(约2500ng/μL)。正如预期的那样，ITS_无变体再次显示没有产物合成，而在T7基因组中在

和

基因之前天然存在的ITS_6变体导致约1800ng/μL的效价。

如图6B所示，在SOI下游编码ITS的反向互补序列的模板与没有ITS的反向互补序列的那些表现相当。包含GL-杂交体_A9 ITS的模板显示约2500ng/μL dsRNA。

总的来说，这些结果表明GL-杂交体_A9 ITS变体比在T7基因组中在

和

基因之前存在的天然存在的共有ITS_6体产生更高水平的RNA产物。

实施例3：使用GL-杂交体_A9 ITS从五种不同的SOI的线性DNA模板产生dsRNA

评估了五种不同dsRNA产品(GLSeq-A、GLSeq-B、GLSeq-C、GLSeq-D和GLSeq-E)的产生，以证明在DNA模板中使用GL-杂交体_A9 ITS在RNA合成方面的益处。作为本研究中的对照，使用具有ITS_2ITS的模板，该模板在已知对转录至关重要的最小III类T7启动子端引入了两个G。可操作地连接到ITS_2的T7 III类最小启动子包含序列：TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO:36)。此外，针对所有五种SOI，相对于由相同DNA区段的两条互补链编码的表达盒(“互补表达盒”设计)中的表达，由双链DNA的单独区段上编码的两个独立表达盒(“独立表达盒”结构设计)表达dsRNA产物的正义链和反义链使用三种不同的DNA模板结构来测定，如图4所示：(a)使用ITS_2的“互补表达盒”设计；(b)使用GL-杂交体_A9 ITS的“互补表达盒”设计；和(c)使用GL_杂交体_A9 ITS的“独立表达盒”设计。

请注意，对于两个“互补表达盒”设计(a)和(b)，编码dsRNA产物的正义链和反义链的两个表达盒位于启动子彼此朝向的双链DNA模板的两条互补链上，使得dsRNA产物的正义链和反义链被T7RNAP转录，两条互补链以相反方向转录。“独立表达盒”设计(c)类似于实施例1和2中描述的模板，并且涉及来自两个独立线性DNA模板的两个表达盒的正义链和反义链的表达。具有结构(a)的模板采用T7最小III类T7启动子(SEQ ID NO:9)，而具有结构(b)和(c)的模板采用延伸的47碱基对T7启动子(SEQ ID NO:18)。因此，对于给定的产物，使用模板结构(a)和(b)进行的dsRNA产生的比较显示了使用具有延伸的T7启动子的GL-杂交体_A9 ITS与具有最小III类T7启动子的ITS_2变体相比的效果。(b)&(c)的比较显示了采用“独立表达盒”结构与“互补表达盒”结构相比的效果。

使用NTP在转录反应中评价每种核酸结构与编码每种dsRNA产物(GLSeq-A、GLSeq-B GLSeq-C、GLSeq-D和GLSeq-E)的不同SOI(长度范围高达600bp)组合。无细胞反应类似于实施例2中描述的那些，包含15mM硫酸镁、2mM亚精胺、3.5mM六偏磷酸钠和含有浓度为10mg/mL总蛋白的五种激酶的裂解物的混合物。然而，与实施例2不同，使用各NTP浓度为4mM的NTP代替酵母衍生NMP。对于每个SOI，将50ng/μL的“使用ITS_2的互补表达盒设计”或“使用GL_杂交体_A9 ITS的互补表达盒设计”的DNA模板添加到反应混合物中。对于每个SOI，在“使用GL-杂交体_A9 ITS的独立表达盒设计”设计中，将两个DNA模板(一个包含编码正义链的SOI；另一个包含编码反义链的SOI)以每个50ng/μL的浓度添加到反应中。最后，为了启动转录，添加了浓度为0.3mg/mL的重组热稳定T7 RNA聚合酶突变体。如实施例1所述，反应在48℃下孵育2小时，然后通过RP-IP HPLC分离和分析RNA产物。

当从包含“具有GL-杂交体_A9的互补表达盒”设计的DNA模板转录时，相对于包含“具有ITS_2的互补表达盒”的模板，每个SOI的dsRNA产物的产生增加(图7B)。将GL-杂交体_A9 ITS掺入DNA模板始终导致每个SOI的dsRNA产物效价增加，如已经用GS1所示(实施例1-3)。值得注意的是，改善程度特定于SOI(大约在2到36倍之间)。从有“具有ITS_2的互补表达盒”设计的DNA模板中表达的五种不同SOI实现的dsRNA效价存在很大差异(图7A)。相反，在“互补表达盒”或“独立表达盒”设计中掺入GL-杂交体_A9，导致所有五种SOI的dsRNA效价始终类似。

相对于包含“具有GL-杂交体_A9的互补表达盒”的模板，当从包含“具有GL-杂交体_A9的独立表达盒”设计的DNA模板转录时，每种RNA产物的生产增加(图7C)。对于采用GL-杂交体_A9 ITS的模板，与“互补表达盒”相比，在转录具有“独立表达盒”设计(相对RNA效价增加1.2-2.3倍)的模板时，所有五种dsRNA SOI产物均以更高的表达水平产生。

图7D中提供了将GL-杂交体_A9 ITS掺入SOI上游的DNA模板中并且从“独立表达盒”设计中表达dsRNA的正义链和反义链的总体效果。当从具有ITS_2的互补表达盒设计转变到具有GL-杂交体_A9ITS的独立表达盒设计时，RNA效价的总倍数提高范围在约两倍到七十倍之间。

实施例4：采用“独立表达盒”结构&发夹结构从质粒DNA模板产生GLSeq-A dsRNA变体的比较

使用无细胞和IVT反应比较了使用两种不同质粒DNA模板产生GLSeq-A dsRNA。

质粒构建体-1包含两个单独的表达盒，用于表达GLSeq-A dsRNA分子的两条链，每个表达盒包含可操作地连接到GL-杂交体_A9 ITS并且位于编码GLSeq-A的正义链或反义链的DNA模板(SOI)上游的延伸的47bp T7启动子(SEQ ID NO:18)和含终止子18(SEQ ID NO:20)的下游终止子。

质粒构建体-2包含用于表达GLSeq-A dsRNA分子的发夹变体的单个表达盒，其中正义链和反义链通过单链接头环连接。单个表达盒包含可操作地连接到GL-杂交体_A9 ITS并且位于编码GLSeq-A的反义链的DNA模板(SOI)上游的经延伸的47bp T7启动子、编码发夹单链环区的DNA序列、编码GLSeq-A的正义链的DNA模板(SOI)、和包含终止子18(SEQ ID NO:20)的下游终止子。

在无细胞反应中评价每个质粒构建体，类似于实施例3中描述的那些，使用NTP或酵母衍生NMP作为底物。在比较使用两种质粒构建体中的每一种进行dsRNA产生时，调整各自反应中的质粒浓度以实现大致相同数量的驱动转录的启动子。因此，质粒构建体-1在约60ng/μL的浓度下使用，而质粒构建体-2在约100ng/μL的浓度下使用。

如图12所示，与来自单个表达盒的发夹GLSeq-A dsRNA产物相比，来自编码正义链和反义链的两个独立表达盒的GLSeq-A dsRNA产物的表达导致IVT和无细胞反应中的dsRNA效价提高约两倍。

实施例5：使用不同终止子构建体评价通读和终止效率

在体外转录反应中，根据由可操作地连接到GL-杂交体_A9 ITS的T7启动子驱动的ssRNA产物的合成，评价了表2中描述的终止子的组合。将一个或多个终止子置于115bp SOI下游(其中SOI的转录由可操作地连接到15bp GL-杂交体_A9 ITS的47bp延伸的T7启动子驱动)。因此，被测试的终止子的组合中第一终止子的终止将产生大约115个核苷酸长度的产物。预计通读将导致长度范围为115至912个核苷酸的产物分布，取决于采用的终止子的特定组合和终止位置。在该实施例中使用的确切构建体呈现在图8A中。

使用5'核苷酸三磷酸作为底物，在体外转录反应中评估了这些不同的变体。反应混合物由45mM硫酸镁、2mM亚精胺、四种NTP(New England Biolabs,Ipswich,MA)各0.5mM、2mM、4mM或8mM、0.3mg/mL热稳定T7 RNA聚合酶突变体组成。向每个反应中添加50ng/μL DNA模板(含有特定终止子或终止子的组合)。反应在48℃下进行2小时，并且随后的RNA产物被分离并且使用RP-IP HPLC进行定量。

对于每个终止子或终止子的组合，在IVT反应中合成的不同ssRNA产物使用RP-IPHPLC分离，如实施例1中所述。图8B显示了不同终止子构建体的色谱图。通读百分比(％RT)计算为通读产物峰(色谱图中由于聚合酶通读所有终止子而观察到的最终峰)的峰面积，表示为曲线下总峰面积的百分比(表5)。Term 26、Term 34和Term-Quad显示最高程度的终止和最低的％RT值。值得注意的是，在包含2mM、4mM或8mM NTP的反应中，所有终止剂子都以相当的水平进行(图8C)。

表5：不同终止子构建体的％RT

预计100％有效终止会产生长度为约115个核苷酸的ssRNA产物。预计通读将导致长度在115至912核苷酸之间的产物分布，取决于终止位点和使用的终止子的特定组合。例如，对于携带PTH和T7终止子的组合的双终止子(Term 18)，在PTH终止子处或内部终止预计会产生约115-125个核苷酸长的产物(假设该PTH终止子置于紧邻SOI下游并且其本身长约10个核苷酸)。然而，如果PTH终止子没有成功终止，并且观察到该T7终止子处发生终止，这将导致任何地方的ssRNA产物的大小在137到221个核苷酸之间(取决于84bp长T7终止子内终止发生的位置)。最后，如果T7 RNA聚合酶同时通读PTH和T7终止子，那么得到的ssRNA产物预计有721个核苷酸长。

从与DNA模板反应获得的ssRNA产物证明，所有Term 18、Term 26、Term 34和Term-Quad显示出的％RT均小于50％，提供大于50％的总终止效率。特别地，Term 26、Term 34和Term-Quad提供了很高的终止效率(65％-70％)。

实施例6：用GL-杂交体_A9 ITS从质粒构建体(pGLA583&pGLA584)和线性DNA模板产生dsRNA。

设计了用于表达GS4 dsRNA产物的质粒DNA模板。GS4是554bp长的dsRNA分子，其包含524个碱基对的目标RNA产物，编码部分绿色荧光蛋白(GFP)基因的，该GFP基因侧接有GL-杂交体_A9 r-ITS和GL-杂交体_A9的反向互补序列(r-ITS-RC)。设计具有“独立表达盒”结构的质粒DNA模板(pGLA583和pGLA584)以从两个单独的表达盒表达GS4的正义链和反义链(参见图4)。这些表达盒中的每一个包含可操作地连接到GL-杂交体_A9 ITS的延伸的T7启动子(SEQ ID NO:18)、GS4 SOI(正义链或反义链)、GL-杂交体_A9 ITS的反向互补序列(ITS-RC)和2个终止子(Term 18(SEQ ID NO:20))。pGLA583和pGLA584质粒都还包含抗生素抗性标记(bla基因前面是赋予氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性的组成型启动子)和复制起点。pGLA583是中等拷贝数的质粒，具有衍生自pETDuet载体的pBR322复制起点；pGLA584是具有突变的pBR322复制起点的高拷贝数质粒(图9)。

此外，设计了两个线性DNA模板，它们编码用于表达GS4正义链和反义链的表达盒，侧接了对应于GL-杂交体_A9 r-ITS及其反向互补序列的序列。

测试了两种质粒和线性模板在无细胞反应中产生GS4 dsRNA的能力。含有激酶酶的细胞裂解物(如实施例2中所述制备)以等比例组合，稀释至最终总蛋白浓度为1.75g/L并且与反应添加剂(45mM硫酸镁和13mM六偏磷酸钠)混合。裂解物在70℃下孵育15分钟以灭活其他酶促活性，同时保留过表达的激酶的活性。最后，加入浓度各为约7mM-8mM的NMP(通过解聚细胞酵母RNA)和0.1mg/mL的热稳定T7突变RNA聚合酶，以及(A)各10ng/μL的两种线性DNA模板(分别表达dsRNA产物的正义链和反义链)或(B)120ng/μL的质粒DNA模板(pGLA583或pGLA584)。无细胞反应物在48℃下孵育2小时，并且随后的RNA产物被分离并且使用RP-IPHPLC进行定量。

从每个DNA模板观察到dsRNA产物的高表达水平(图10)。该线性DNA模板产生约2100ng/μL；两种质粒模板(pGLA583和pGLA584)均产生较高水平，pGLA583产生约2500ng/μL。

实施例7：使用采用“独立表达盒”对比“互补表达盒”结构的质粒模板产生dsRNA产物

使用两种类型的质粒模板比较了在无细胞反应中两种不同dsRNA产物(GS1和GS4)的产生，这些质粒模板采用了两种不同的结构来产生dsRNA产物(质粒构建体-3：采用“独立表达盒”结构表达dsRNA的质粒DNA模板和质粒构建体-4：采用“互补表达盒”设计表达dsRNA的质粒模板)。采用“独立表达盒”结构的质粒模板携带两个单独的表达盒，这两个表达盒由两个单独的DNA区段编码，用于分别在相同的质粒中表达dsRNA产物的正义链和反义链，由如图13A所示的复制起点和选择标记隔开。另一方面，采用“互补表达盒”结构的质粒模板携带DNA区段，其中该DNA区段的互补链编码表达盒，用于表达给定dsRNA产物的正义链和反义链，如图13B所示。在这两种结构中，延伸的T7启动子(SEQ ID NO:18)与GL-杂交体_A9 ITS结合使用以表达所需dsRNA产物的每条链。

如实施例2中所述制备用于dsRNA产生的无细胞反应，使用60ng/μL-100ng/μL的质粒DNA模板，采用“独立表达盒”或“互补表达盒”结构。如图14所示，与来自采用“互补表达盒”结构的DNA模板(质粒构建体-4)的相同dsRNA产物的表达相比，来自采用“独立表达盒”结构的质粒(质粒构建体-3)的两个独立表达盒的dsRNA产物的正义链和反义链的独立表达导致高4-20倍的dsRNA产生。

实施例8：使用采用携带不同的ITS的“独立表达盒”结构的质粒模板产生dsRNA产物

比较了来自五种不同质粒DNA模板的无细胞反应中GS1 dsRNA产物的产生，如图13A所示，其中所有五种质粒都采用了“独立表达盒”结构，并且在该表达盒中用于表达每个质粒中的正义链和反义链的ITS不同。在用于表达该正义链和反义链的每个表达盒中，47bp延伸的T7启动子(SEQ ID NO:18)可操作地连接到表6中所示的五种不同的ITS之一。

表6：实施例8中使用的ITS变体

如图15所示，GL-杂交体_A9 ITS导致dsRNA合成比T7噬菌体基因组中天然存在的共有ITS_6以及其他较短的ITS提高了1.9倍。

实施例9.包含A-开始的ITS使用共转录加帽试剂以高效价和纯度产生加帽RNA

在无细胞反应中设计和产生了一对mRNA分子。两种分子均由类似的序列结构组成，掺入5'ITS GL-杂交体_A9(A开始)(AGGAGACCAGGAATT(SEQ ID NO:38))。mRNA序列在pUC-19衍生质粒模板上与5'端的T7启动子和限制性内切核酸酶识别位点一起编码。质粒在大肠杆菌菌株DH10b中繁殖，通过质粒Giga试剂盒(Qiagen)纯化，通过Esp3I限制性内切酶(New England Biolabs)消化线性化，并且通过苯酚-氯仿提取进一步纯化。RNA合成反应使用如PCT/US2020/025824中描述的无细胞产生平台进行。产生加帽RNA的反应还包括CleanCap AG试剂(TriLink Biotechnologies)。通过用DNA酶I处理去除模板DNA，然后通过氯化锂沉淀回收RNA。在260nm处通过UV吸光度对回收的RNA进行定量，并且使用2100生物分析仪仪器(Agilent Technologies)分析大小和质量。

如图16所示，使用CleanCap AG和AG ITS(GL-杂交体A9(A开始)，SEQ ID NO:38)产生加帽RNA的无细胞反应获得与使用GG ITS(GL-杂交体_A9，SEQ ID NO:1)产生未加帽RNA的反应类似的效价(图16A)。生物分析仪分析证明来自两种反应的RNA产物都具有预期的大小和类似的纯度(图16B)。

实施例10.编码不同蛋白质的mRNA中的ITS导致一致的产生效价和分子质量

在无细胞反应中设计和产生了一系列mRNA分子。如在实施例9中，掺入了5'ITSGL-杂交体_A9(A开始)(AGGAGACCAGGAATT(SEQ ID NO:38))的序列。RNA合成反应使用如PCT/US2020/025824中描述的无细胞产生平台进行。产生加帽RNA的反应还包括5mMCleanCap AG试剂(TriLink Biotechnologies)。质粒在大肠杆菌菌株DH10b中繁殖，通过质粒Giga试剂盒(Qiagen)纯化，通过Esp3I或BspQI限制性内切酶(New England Biolabs)消化线性化，并且通过苯酚-氯仿提取进一步纯化。通过用DNA酶I处理去除模板DNA，然后通过氯化锂沉淀回收RNA。在260nm处通过UV吸光度对回收的RNA进行定量，并且使用片段分析仪仪器(Agilent Technologies)分析大小和质量。

如图17所示，使用CleanCap AG和AG ITS产生加帽RNA的无细胞反应在多个开放阅读框序列上产生一致的效价(图17A)。这些反应的RNA产物以预期的大小迁移。所有分子均以类似的高纯度产生(图17B)。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用并入每一个所引用的主题，在一些情况下，该主题可包含文件的全部内容。

在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个/种(a或an)”，除非明确指出相反，应理解为“至少一个/种”。

还应该理解的是，除非有明确的相反指示，在本文要求保护的任何包括一个以上步骤或动作的方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作列举的顺序。

在权利要求以及上述说明书中，所有过渡短语如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……组成”，等应被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，仅有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭或半封闭过渡短语。

在数值之前的术语“约”和“基本上”是指所列举数值的±10％。

在提供数值范围的情况下，本文中具体考虑和描述了该范围的上限和下限之间的每个值。

序列表

<110> 绿光生物科学公司(GreenLight Biosciences, Inc.)

<120> 核酸组合物

<130> G0830.70037WO00

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> US 62/944,824

<151> 2019-12-06

<160> 49

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 1

gggagaccag gaatt 15

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 2

gggagaccgg gaatt 15

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 3

gggagacccg gaatt 15

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 4

gggagacctg gaat 14

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 5

gggagaccac aacg 14

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 6

gggagaccgg aatt 14

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 7

gggagaccgg aattt 15

<210> 8

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 8

gggaga 6

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 9

taatacgact cactata 17

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 10

taatacgact cactataggg agaccaggaa tt 32

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 11

taatacgact cactataggg agaccgggaa tt 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 12

taatacgact cactataggg agacccggaa tt 32

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 13

taatacgact cactataggg agacctggaa tt 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 14

taatacgact cactataggg agaccacaac gt 32

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 15

taatacgact cactataggg agaccggaat t 31

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 16

taatacgact cactataggg agaccggaat tt 32

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 17

taatacgact cactataggg aga 23

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 18

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactata 47

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 19

aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt g 41

<210> 20

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 20

catctgtttt cttgcaagat cagctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 60

acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccgga 106

<210> 21

<211> 295

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 21

cctagcataa ccccgcgggg cctcttcggg ggtctcgcgg ggttttttgc tgaaagaagc 60

ttcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt 120

cgctgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccattga gatccggctg ctaacaaagc 180

ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg 240

ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccgga 295

<210> 22

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 22

cctagcataa accccttggg ttccctcttt aggagtctga ggggtttttt gctgaaagaa 60

gcttcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt 120

gtcgctgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccatt gagatccggc tgctaacaaa 180

gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 240

ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccgga 297

<210> 23

<211> 185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 23

aagcttgctt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacctagcat 60

aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt ggccatctgt tttcttgcaa 120

gatcagctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 180

ttttg 185

<210> 24

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 24

tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 60

gctgcggcc 69

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 25

ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctac 45

<210> 26

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 26

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttg 48

<210> 27

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 27

gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 60

ctgaaaggag gaactatatc cgga 84

<210> 28

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 28

cctagcataa ccccgcgggg cctcttcggg ggtctcgcgg ggttttttgc tgaaagaagc 60

t 61

<210> 29

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 29

cctagcataa accccttggg ttccctcttt aggagtctga ggggtttttt gctgaaagaa 60

gct 63

<210> 30

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 30

catctgtttt 10

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 31

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactata 47

<210> 32

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 32

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactataggg aga 53

<210> 33

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 33

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac 60

gt 62

<210> 34

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 34

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactataggg agaccggaat 60

t 61

<210> 35

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 35

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactataggg agaccgggaa 60

tt 62

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 36

taatacgact cactatagg 19

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 37

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat 30

<210> 38

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 38

aggagaccag gaatt 15

<210> 39

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 39

aggagaccgg gaatt 15

<210> 40

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 40

aggagacccg gaatt 15

<210> 41

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 41

aggagacctg gaat 14

<210> 42

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 42

taatacgact cactataagg agaccaggaa tt 32

<210> 43

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 43

taatacgact cactataagg agaccgggaa tt 32

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 44

taatacgact cactataagg agacccggaa tt 32

<210> 45

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 45

taatacgact cactataagg agacctggaa tt 32

<210> 46

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 46

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactatag 48

<210> 47

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 47

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactatagg 49

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 48

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactataggg 50

<210> 49

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 49

tcgattcgaa cttctgatag acttcgaaat taatacgact cactataggg aga 53

Claims (56)

1.一种包含起始转录序列(ITS)的工程化核酸，所述ITS包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的工程化核酸，其包含可操作地连接至所述ITS的启动子。

3.如权利要求1或2所述的工程化核酸，其包含SEQ ID NO:10-13或42-45中任一项的核苷酸序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化核酸，其还包含所述ITS的核苷酸序列下游的目标序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化核酸，其还包含所述目标序列下游的一个或多个终止子序列。

6.如权利要求5所述的工程化核酸，其中所述终止子序列包含rrnBT1、rrnBT2、TT7、pET-T7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。

7.如权利要求5或6所述的工程化核酸，其中所述终止子序列包含SEQ ID NO:19-30中任一项的核苷酸序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的工程化核酸，其中所述启动子是噬菌体T7启动子。

9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化核酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9或18的核苷酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化核酸，其中所述工程化核酸是双链的。

11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化核酸，其中所述工程化核酸是环状的。

12.一种构建体，所述构建体包含：

第一表达盒，其包含可操作地连接到在编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列上游的起始转录序列(ITS)的启动子；以及

第二表达盒，其包含可操作地连接到在编码所述dsRNA的反义链的核苷酸序列上游的起始转录序列(ITS)的启动子，

其中所述dsRNA的正义链与所述dsRNA的反义链互补。

13.如权利要求12所述的构建体，其中所述第一表达盒和第二表达盒中的一者或两者都还包含编码所述dsRNA的链的核苷酸序列下游的终止子序列。

14.如权利要求12或13所述的构建体，其中所述第一表达盒和第二表达盒中的一者或两者都还包含限制性内切酶识别位点。

15.如权利要求12-14中任一项所述的构建体，其中所述起始转录序列具有1-15个核苷酸的长度。

16.如权利要求12-15中任一项所述的构建体，其中所述起始转录序列包含SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项的核苷酸序列。

17.如权利要求16所述的构建体，其中所述起始转录序列包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列。

18.如权利要求12-17中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒位于单个DNA分子内并且以相同方向定向。

19.如权利要求12-17中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒位于单个DNA分子内并且以相反方向定向。

20.如权利要求12-19中任一项所述的构建体，其中编码所述第一表达盒的正义链的核苷酸序列的侧接有所述ITS和所述ITS的反向互补序列，并且所述第二表达盒的反义链侧接有所述ITS和所述ITS的反向互补序列。

21.如权利要求12-20中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒还包含编码所述正义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列，并且所述第二表达盒还包含编码所述反义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列。

22.如权利要求13-21中任一项所述的构建体，其中所述终止子序列包含rrnBT1、rrnBT2、TT7、pET-T7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。

23.如权利要求13-21中任一项所述的构建体，其中所述终止子序列包含SEQ ID NO:19-30中任一项的核苷酸序列。

24.如权利要求11-22中任一项所述的构建体，所述构建体还包含选择标记。

25.如权利要求24所述的构建体，其中所述选择标记位于所述第一表达盒和所述第二表达盒之间。

26.如权利要求24或25所述的构建体，其中所述选择标记是抗生素抗性选择标记或无抗生素选择标记。

27.如权利要求12-26中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒的启动子、所述第二表达盒的启动子中一者或所述第一表达盒的启动子和所述第二表达盒的启动子两者都是噬菌体T7启动子。

28.如权利要求12-27中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒的启动子或所述第二表达盒的启动子、或所述第一表达盒的启动子和所述第二表达盒的启动子两者包含SEQID NO:9或18的核苷酸序列。

29.如权利要求12-28中任一项所述的构建体，其中所述构建体选自质粒、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、天然染色体、噬菌体和病毒。

30.如权利要求29所述的构建体，其中所述构建体是高、中或低拷贝数质粒。

31.如权利要求30所述的构建体，其中所述质粒包含ColE1复制子或pUC复制子或者衍生自ColE1、pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子的复制子。

32.如权利要求12-31中任一项所述的构建体，其中所述dsRNA靶向昆虫、植物、真菌或病毒的基因组序列。

33.一种构建体，所述构建体包含：

(a)第一表达盒，其包含

可操作地连接到包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列的起始转录序列(ITS)的启动子、编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列、和终止子序列；以及

(b)第二表达盒，其包含

可操作地连接到包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列的ITS的启动子、编码所述dsRNA的反义链的核苷酸序列、和终止子序列，其中所述dsRNA的正义链与所述dsRNA的反义链互补。

34.如权利要求33所述的构建体，其中所述第一表达盒和所述第二表达盒位于单个DNA分子内并且以相同方向定向。

35.如权利要求33所述的构建体，其中所述第一表达盒和第二表达盒位于单个DNA分子内；并且任选地其中所述第一表达盒和第二表达盒以相反方向定向。

36.如权利要求33-35中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒包括在编码所述正义链的核苷酸序列下游的所述ITS的反向互补序列，并且所述第二表达盒包括在编码所述dsRNA产物的反义链的核苷酸序列下游的所述ITS的反向互补序列。

37.如权利要求33-36中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒还包含编码所述正义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列，并且所述第二表达盒还包含编码所述反义链的核苷酸序列下游的一个或多个终止子序列。

38.如权利要求33-37中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒在所述ITS的反向互补序列下游和/或所述第二表达盒在所述ITS的反向互补序列下游。

39.如权利要求33-38中任一项所述的构建体，其中所述终止子序列包含rrnBT1、rrnBT2、TT7、pET-T7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。

40.如权利要求33-39中任一项所述的构建体，其中所述终止子序列包含SEQ ID NO:19-30中任一项的核苷酸序列。

41.如权利要求33-30中任一项所述的构建体，其还包含在编码所述正义链的核苷酸序列和/或编码所述反义链的核苷酸序列下游、任选地在所述ITS的反向互补序列中一者下游和/或所述终止子序列中一者下游的限制性核酸内切酶识别位点。

42.如权利要求33-41中任一项所述的构建体，所述构建体还包含选择标记。

43.如权利要求42所述的构建体，其中所述选择标记位于所述第一表达盒和所述第二表达盒之间。

44.如权利要求42或43所述的构建体，其中所述选择标记是抗生素抗性选择标记或无抗生素选择标记。

45.如权利要求33-44中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒的启动子和所述第二表达盒的启动子中的一者或两者都是噬菌体T7启动子。

46.如权利要求33-45中任一项所述的构建体，其中所述第一表达盒的启动子和所述第二表达盒的启动子中的一者或两者都包含SEQ ID NO:9或18的核苷酸序列。

47.如权利要求33-46中任一项所述的构建体，其中所述构建体选自质粒、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、天然染色体、噬菌体和病毒。

48.如权利要求47所述的构建体，其中所述构建体是高、中或低拷贝数质粒。

49.如权利要求48所述的构建体，其中所述质粒包含ColE1复制子或pUC复制子或者衍生自ColE1、pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子的复制子。

50.如权利要求33-49中任一项所述的构建体，其中所述dsRNA靶向昆虫、植物、真菌或病毒的基因组序列。

51.一种方法，所述方法包括在转录反应中将如权利要求1-11中任一项所述的工程化核酸或如权利要求12-50中任一项所述的构建体与聚合酶组合，并且产生RNA转录物。

52.如权利要求50所述的方法，其中所述转录物以比对照大至少20％、至少30％或至少40％的量产生。

53.一种表达盒，所述表达盒包含可操作地连接到在编码目标产物的核苷酸序列上游的起始转录序列(ITS)的启动子，并且任选地后跟ITS-RC和/或限制性内切核酸酶位点和/或两个串联终止子序列，其中所述ITS包含SEQ ID NO:1-8或38-41中任一项的核苷酸序列。

54.一种构建体，所述构建体包含：

第一表达盒，其包含可操作地连接到编码双链RNA(dsRNA)的正义链的核苷酸序列的启动子、和终止子序列；以及

第二表达盒，其包括可操作地连接到编码dsRNA(dsRNA)的反义链的核苷酸序列的启动子、和终止子序列，其中所述第一表达盒和第二表达盒在同一DNA分子内以相同方向或相反方向定向，

其中所述dsRNA的正义链与所述dsRNA的反义链互补。

55.一种试剂盒，其包括：

包含SEQ ID NO:1-4或38-41中任一项的核苷酸序列的工程化核酸；以及

聚合酶。

56.如权利要求55所述的试剂盒，其还包括核苷三磷酸和/或核苷一磷酸。

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