KR20220113437A - 핵산 조성물 - Google Patents
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Abstract
일부 양태에서, 리보핵산의 고수율 및 비용 효율적인 생성을 위한 개시 전사된 서열 및 고유한 핵산 디자인을 포함하는 핵산의 조성물이 본원에 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2019년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/944,824의 35 U.S.C. § 119(e) 하에 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
저비용 RNA 제품의 가용성은 농업 및 생물제약 과학에 걸친 수많은 응용 분야에 필수적이다. 농업에서, RNA 간섭 (RNAi)은 전통적인 화학 살충제에 점점 더 내성을 갖는 해충 및 곤충의 표적 제어 및 작물에서 원하는 특정 표현형 (예를 들어, 개선된 보관 수명, 색상, 신선도)에 영향을 미치는 데 사용할 수 있다. 바이오 의약품에서, mRNA 제품은 백신뿐만 아니라 다양한 질병을 치료하는 치료제로 사용될 수 있다. 그러나 고비용의 RNA 합성은 RNA 제품의 광범위한 사용 및 개발에 있어 주요 장애물이다. RNA 제품을 위한 비용 효율적인 합성 공정을 개발하면 이러한 기술 및 기타 기술을 광범위하게 확장하고 사용할 수 있다.
요약
본 개시내용의 일부 양태는 관심 RNA의 향상된 발현을 위한 재조합 DNA 핵산 작제물 디자인을 제공한다. 일부 구현예에서, 작제물은 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 발현 카세트; 및 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하고, 상기 dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두가 dsRNA의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 종결 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두는 dsRNA의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 종결 서열을 포함하고 엔도뉴클레아제 인식 부위를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 개시 전사 서열은 1-15개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 개시 전사 서열은 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 단일 DNA 분자 내에 위치하고 동일한 방향으로 배향되고; 상기 동일한 DNA 가닥은 각각의 발현 카세트에 대한 전사 동안 주형 가닥으로서 작용한다. 다른 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 단일 DNA 분자 내에 위치하고 반대 방향으로 배향되고; 여기서 상이한 DNA 가닥은 각각의 발현 카세트에 대한 전사 동안 주형 가닥으로서 작용한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 ITS 및 ITS의 역 상보체에 의해 플랭킹되고, 제2 발현 카세트의 안티센스 가닥은 ITS 및 ITS의 역 상보체에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하고, 그리고 제2 발현 카세트는 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 종결 서열은 rrnBT1, rrnBT2, TT7, T7U, TT3, 및/또는 PTH 종결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 종결 서열은 서열번호: 19-30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 작제물은 선별 마커를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 선별 마커는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 항생제 내성 선별 마커 또는 무항생제 선별 마커이다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트의 프로모터, 제2 발현 카세트의 프로모터, 또는 제1 발현 카세트의 프로모터 및 제2 발현 카세트의 프로모터 둘 모두는 박테리오파지 T7 프로모터이다.
일부 구현예에서, 작제물은 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 천연 염색체, 박테리오파지 및 바이러스로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 작제물은 높은, 중간의 또는 낮은 카피 수 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 PUC-기반 플라스미드이다.
일부 구현예에서, dsRNA는 곤충, 식물, 진균 또는 바이러스의 게놈 서열을 표적화한다.
본 개시내용의 일부 양태는 다음을 포함하는 작제물을 제공한다: (a) 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 종결 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및 (b) 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 종결 서열을 포함하는 제2 발현 카세트, 상기 dsRNA의 센스 가닥이 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 단일 DNA 분자 내에 위치하고 동일한 방향으로 배향되고; 그리고 상기 동일한 DNA 가닥은 각각의 발현 카세트에 대한 전사 동안 주형 가닥으로서 작용한다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 단일 DNA 분자 내에 위치하고; 그리고 상기 상이한 DNA 가닥은 각각의 발현 카세트에 대한 전사 동안 주형 가닥으로서 작용한다.
일부 구현예에서, 제1 발현 카세트의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 ITS 및 ITS의 역 상보체에 의해 플랭킹되고, 제2 발현 카세트의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 ITS 및 ITS의 역 상보체에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트는 센스를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하고, 제2 발현 카세트는 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 종결 서열은 rrnBT1, rrnBT2, TT7, T7U, TT3, 및/또는 PTH 종결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 종결 서열은 서열번호: 19-30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 작제물은 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 추가로 포함하며, 선택적으로 종결 서열 중 하나의 다운스트림 또는 종결 서열이 없는 작제물에 포함된다. 일부 구현예에서, 작제물은 선별 마커를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 선별 마커는 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 항생제 내성 선별 마커 또는 무항생제 선별 마커이다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트의 프로모터, 제2 발현 카세트의 프로모터, 또는 제1 발현 카세트의 프로모터 및 제2 발현 카세트의 프로모터 둘 모두는 박테리오파지 T7 프로모터이다.
일부 구현예에서, 작제물은 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 천연 염색체, 박테리오파지 및 바이러스로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 작제물은 높은, 중간의 또는 낮은 카피 수 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 PUC-기반 플라스미드이다.
본 개시내용의 일부 양태는 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 개시 전사 서열 (ITS) 및, 선택적으로, 2개의 탠덤(tandem) 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 플랭킹되며, 상기 ITS는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태는 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 핵산을 제공한다.
본 개시내용의 일부 양태는 프로모터 및 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개시 전사 서열 (ITS)을 포함하는 조작된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 조작된 핵산은 서열번호: 10-13 또는 42-45 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태는 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 핵산; 및 중합효소를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 뉴클레오시드 모노포스페이트를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트, 및 프로모터에 작동 가능하게 연결된 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 작제물을 제공하고, 상기 dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다.
본 개시내용의 일부 양태는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제1 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제2 DNA ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 작제물을 제공하고, 상기 dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다.
본 개시내용의 다른 양태는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제1 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 dsRNA의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체 (ITS-RC)를 포함하는 제1 발현 카세트; 및 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제2 DNA ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체 (ITS-RC)를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이며/이거나 각각의 생성된 RNA 전사체의 ITS는 DNA 개시 전사 서열에 상응한다.
다른 양태는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제1 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 적어도 하나의 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 제1 발현 카세트; 및 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제2 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 적어도 하나의 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 작제물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 동일한 방향으로 배향되고, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이며, 그리고 각각의 생성된 RNA 전사체의 ITS는 DNA 개시 전사 서열에 상응한다.
다른 양태는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제1 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, dsRNA의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체 (ITS-RC), 및 적어도 하나의 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 제1 발현 카세트; 및 dsRNA (dsRNA)의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 제2 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체 (ITS-RC), 및 적어도 하나의 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 작제물을 제공한다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이며/이거나 각각의 RNA 전사체의 ITS는 DNA 개시 전사 서열에 상응한다.
본 개시내용의 일부 양태는 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 선택적으로 적어도 하나의 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
본 개시내용의 다른 양태는 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체 (ITS-RC)를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 있는 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체 (ITS-RC) 및 적어도 하나의 종결 서열 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예에서, ITS는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 핵산 구조적 배열 디자인 (예를 들어, 핵산 벡터, 핵산 작제물)을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 디자인은 관심 서열 (예를 들어, 관심 RNA)의 향상된 발현을 위한 플라스미드, 선형화된 주형, 또는 임의의 다른 DNA 작제물 구성을 포함한다 (예를 들어, 대조군 작제물과 관련된 관심 서열의 향상된 발현). 일부 구현예에서, 본 개시내용은 2개의 카세트를 포함하는 '상보적 발현 카세트' 디자인 (예를 들어, 관심 dsRNA 분자의 발현을 위한)을 포함하는 구조적 디자인을 제공하며, 여기서 각각의 카세트는 관심 dsRNA 분자의 발현을 위한 ITS 및 선택적으로 ITS-RC를 포함한다. 일부 구현예에서, 구조적 디자인은 2개의 카세트를 포함하는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 관심 dsRNA 분자의 발현을 위한 ITS 및 선택적으로 ITS-RC를 포함하고, 상기 제1 발현 카세트는 dsRNA의 센스가닥을 인코딩하고, 그리고 제2 발현 카세트는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두의 발현을 가능하게 하는 안티센스 가닥을 인코딩하고, 그리고 상기 제1 및 제2 카세트는 이중 가닥 DNA의 동일한 세그먼트의 2개의 상보적 가닥에 의해 인코딩되고, 상기 2개의 카세트로부터 전사시 생성된 센스 및 안티센스 RNA 가닥은 어닐링되어 r-ITS 및 선택적으로 r-ITC-RC를 포함하는 dsRNA 분자를 생성한다. 이 구조의 일부 구현예에서, DNA ITS가 있거나 없는 관심 서열은 각 말단에서 2개의 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 하나의 프로모터는 원하는 dsRNA 생성물의 센스 가닥의 발현을 구동하고 다른 프로모터는 원하는 dsRNA 생성물의 안티센스 가닥의 발현을 구동한다. '상보적 발현 카세트' 디자인의 전사 동안, RNA 중합효소는 두 말단의 프로모터로부터 상보적 가닥의 전사를 개시하고 중합효소는 처음에 DNA의 두 상보적 가닥을 가로지르는 동안 서로를 향해 이동한다 (예를 들어, 수렴 방식으로).
다른 구현예에서, 핵산 구조적 배열 디자인 (예를 들어, dsRNA 발현을 위한 벡터 또는 작제물)은 '독립적 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 상기 dsRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 발현 카세트는 DNA의 독립적인 세그먼트에 의해 인코딩된다. DNA의 독립적인 세그먼트는 동일한 플라스미드, 선형화된 주형 또는 기타 DNA 작제물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, '독립적 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자 상에서 동일한 방향으로 배향된다(동일한 DNA 가닥은 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 다른 구현예에서, '독립적 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 반대 방향으로 배향된다 (예를 들어, 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 두 개의 반대 가닥은 두 개의 발현 카세트에 대한 주형 가닥으로 작용함). 2개의 발현 카세트가 주어진 벡터 또는 다른 DNA 분자에서 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향되어 있는지 여부에 따라, RNA 중합효소는 dsDNA 분자의 동일한 가닥 상에서 동일한 방향으로 또는 상이한 두 가닥의 DNA 상에서 반대 방향으로 전사하거나 기능할 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산 구조적 디자인 (예를 들어, 벡터 또는 작제물)은 2개의 발현 카세트를 포함하는 '독립적 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 상기 dsRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 발현 카세트는 동일한 플라스미드, 선형화된 주형 또는 기타 DNA 작제물에 포함될 수도 있고 포함되지 않을 수도 있는 DNA 세그먼트에 의해 독립적으로 인코딩된다. 일부 구현예에서, '독립적 발현 카세트' 디자인은 ITS 및 선택적으로 ITS-RC를 포함하는 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 동일한 방향으로 배향된다 (동일한 DNA 가닥은 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 일부 구현예에서, '독립적 발현 카세트' 디자인은 ITS 및 선택적으로 ITS-RC를 포함하는 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 반대 방향으로 배향된다 (예를 들어, 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 두 개의 반대 가닥이 두 개의 발현 카세트에 대한 주형 가닥으로 작용함). 2개의 발현 카세트가 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 같은 방향으로 또는 반대 방향으로 배향되어 있는지에 따라, 2개의 독립적인 프로모터로부터 발현을 구동하는 RNA 중합효소는 dsDNA 분자의 동일한 가닥에서 동일한 방향으로 또는 두 개의 다른 DNA 가닥에서 반대 방향으로 전사하거나 기능할 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산 구조적 배열 디자인 (예를 들어, 벡터 또는 작제물)은 '다중 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 여기서 다중 발현 카세트는 동일한 DNA 분자 또는 상이한 DNA 분자의 일부인 DNA의 독립적인 세그먼트에 의해 인코딩되고, 다중 단일 가닥 RNA (ssRNA) 분자의 발현을 허용한다. 일부 구현예에서, 다중 ssRNA 분자는 동일한 관심 서열 (SOI)을 인코딩할 수 있고/있거나 동일한 플라스미드, 선형화된 주형, 또는 임의의 다른 DNA 작제물에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, '다중 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자 상의 동일한 방향으로 배향된다 (동일한 DNA 가닥이 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 다른 구현예에서, '다중 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 반대 방향으로 배향된다 (예를 들어, 벡터 또는 DNA 분자의 두 가닥이, 상이하거나 반대인 DNA 가닥은 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 일부 구현예에서, '다중 발현 카세트' 디자인은 ssRNA의 생성을 증가시킨다. 2개의 발현 카세트가 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향되어 있는지 여부에 따라 2개의 독립적인 프로모터로부터 발현을 구동하는 RNA 중합효소는 ssRNA 분자의 동일한 가닥에서 동일한 방향으로 또는 DNA의 상이한 두 가닥 상에서 반대 방향으로 전사될 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산 배열 구조적 디자인 (예를 들어, 벡터 또는 작제물)은 '다중 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 여기서 다중 발현 카세트는 동일한 DNA 분자 또는 상이한 DNA 분자의 일부인 DNA의 독립적인 세그먼트에 의해 인코딩되고, 그리고 각각은 ITS 및 선택적으로 ITS-RC를 포함하여 다중 ssRNA 분자의 발현을 허용한다. 다중 ssRNA 분자는 동일한 SOI를 가질 수 있고/있거나 동일한 플라스미드, 선형화된 주형 또는 임의의 다른 DNA 작제물로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, '다중 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자 상의 동일한 방향으로 배향된다 (동일한 DNA 가닥이 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 다른 구현예에서, '다중 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 반대 방향으로 배향된다 (예를 들어, 상이한 또는 반대쪽 DNA 가닥은 두 발현 카세트의 각 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 일부 구현예에서, '다중 발현 카세트' 디자인은 ssRNA의 생성을 증가시킨다.
또한, 일부 양태에서, 전사 반응에서 본원에 설명된 벡터 또는 작제물 중 임의의 하나 및 중합효소를 조합하는 단계, 및 RNA 전사체를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
도 1은 RNA 생성물의 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 발현 카세트를 갖는 예시적인 플라스미드 DNA 주형의 개략도를 제공한다.
도 2는 RNA 생성물의 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 예시적인 선형 DNA 주형의 개략도를 제공하며, 상기 DNA 주형은 각각 dsRNA 생성물의 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)의 ITS 업스트림에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 생성된 dsRNA 생성물은 완전히 혼성화될 때 DNA 주형의 각 ITS에 상응하는 5' r-ITS 오버행을 포함한다.
도 3은 생성된 RNA 전사체에 5' r-ITS 및 3' r-ITS-RC를 함유하는 RNA 생성물의 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 예시적인 선형 DNA 주형의 개략도를 제공한다. 나타난 2개의 DNA 주형은 각각 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 발현 카세트는 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)의 업스트림에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 ITS-역 상보체 (ITS-RC)를 포함한다. 생성된 dsRNA 생성물은 완전히 혼성화될 때 단일 가닥 오버행을 포함하지 않는다.
도 4는 dsRNA 생성물을 생성하기 위한 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 예시적인 DNA 주형의 개략도를 제공한다. 상부 개략도는 '상보적 발현 카세트' 구조를 포함하는 DNA 주형이며, 상기 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 발현 카세트는 2개의 상보적 DNA 가닥에 의해 인코딩되고, DNA 주형은 전사될 관심 서열 (SOI)의 두 말단에 위치한 ITS_2 서열에 작동 가능하게 연결된 2개의 수렴 프로모터를 포함한다. 중간 개략도는 dsRNA 합성을 위한 '상보적 발현 카세트' 구조를 포함하는 DNA 주형이며, 상기 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 발현 카세트는 2개의 상보적 DNA 가닥에 의해 인코딩되고, 상기 DNA 주형은 전사될 관심 서열 (SOI)의 두 말단에 위치한 GL-하이브리드-A9 ITS를 갖는 2개의 수렴 프로모터를 포함한다. 하단 개략도는 dsRNA 합성을 위한 '독립적 발현 카세트' 구조를 포함하는 DNA 주형이며, 상기 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥은 DNA의 개별 세그먼트 상의 개별 발현 카세트에 의해 인코딩되며, 여기서 각각의 발현 카세트는 프로모터 및 전사될 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)의 업스트림에 위치한 ITS를 포함한다.
도 5는 상이한 ITS를 포함하는 DNA 주형을 사용한 시험관 내 전사 (IVT) 반응에 따라 얻은 dsRNA 생성물 (GS1 dsRNA)의 발현 수준(역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다.
도 6a-6b는 상이한 ITS를 포함하는 DNA 주형을 사용한 무세포 반응에 따라 얻은 dsRNA 생성물 (GS1 dsRNA)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다. 5' 단일 가닥 오버행이 있고(도 6a) 5' 단일 가닥 오버행이 없는(도 6b) dsRNA 생성물을 생성하는 DNA 주형을 사용하여 데이터를 얻었다.
도 7a-7d는 다양한 DNA 주형 구조를 사용한 dsRNA 생성물 (GL Seq-A, GL Seq-B, GL Seq-C, GL Seq-D, GL Seq-E)의 발현 수준의 배수 증가를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 7a는 상이한 DNA 주형 구조를 사용한 RNA 역가 프록시를 나타내는 그래프이다. 도 7b는 GL-하이브리드_A9 ITS가 없는 동일한 디자인을 사용하는 DNA 주형에 비해 GL-하이브리드_A9 ITS가 있는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 대한 dsRNA의 발현 수준의 배수 증가를 보여준다. 도 7c는 동일한 GL-하이브리드_A9 ITS를 갖는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 비해 GL-하이브리드_A9 ITS를 사용하는 '독립적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 대한 발현 수준의 배수 증가를 보여준다. 도 7d는 GL-하이브리드_A9 ITS가 없는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 비해 GL-하이브리드_A9 ITS가 있는 '독립적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 대한 발현 수준의 배수 증가를 보여준다.
도 8a-8c는 단일 가닥 RNA (ssRNA) 생성물의 전사를 종결시키기 위한 상이한 종결 서열의 효과를 입증한다. 도 8a는 번역 초과(read-through) 및 종결 효율의 평가에 사용되는 DNA 주형의 개략도를 제공한다. 도 8b는 도 8a에 나타난 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사 반응에서 합성된 ssRNA 생성물의 역상 이온쌍 (RP-IP) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 크로마토그램을 제공한다. 도 8c는 다양한 수준의 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) (각 NTP의 2mM, 4mM 및 8mM)에서 도 8a에 나타난 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사 반응의 순 종결 효율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 2개의 개별 발현 카세트로부터의 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 전사를 위한 '독립적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 예시적인 DNA 플라스미드의 개략도이다. 센스 및 안티센스 가닥의 전사는 본원에 설명된 바와 같이 DNA 개시 전사된 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터로부터 독립적으로 구동된다.
도 10은 플라스미드 (pGLA583 및 pGLA584) 및 선형 DNA 주형을 이용한 무세포 반응 후 얻은 dsRNA 생성물 (GS4 dsRNA)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 다양한 ITS를 갖는 DNA 주형을 사용한 무세포 반응 (NTP 반응 및 NMP 반응) 후 얻은 dsRNA 생성물 (GS1 dsRNA)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다.
도 12는 단일 발현 카세트 (플라스미드 작제물-2)를 포함하는 플라스미드 DNA 주형으로부터 "헤어핀" 생성물 변이체로서 GLSeq-A dsRNA 생성물의 발현과 비교하여 센스 및 안티센스 가닥 (플라스미드 작제물-1)을 인코딩하는 2개의 독립적인 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 DNA 주형으로부터의 dsRNA 생성물 (GLSeq-A dsRNA)의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 13a-13b는 dsRNA 생성물의 발현을 위한 예시적인 플라스미드 DNA 주형의 개략도이다. 도 13a는 dsRNA 생성을 위한 '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하는 예시적인 플라스미드 DNA 주형 (플라스미드 작제물-3)을 나타내며, 여기서 플라스미드 내의 2개의 개별 발현 카세트 각각은 ITS 및 ITS-RC에 의해 플랭킹되는 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 허용한다. 2개의 발현 카세트는 동일한 방향으로 배향되고 선별 마커 및 복제 기점으로서 암피실린 내성 bla 유전자에 의해 분리된다. 도 13b는 dsRNA 발현을 위한 "상보적 발현 카세트" 구조를 사용하는 예시적인 플라스미드 DNA 주형 (플라스미드 작제물-4)을 나타내며, 상기 동일한 DNA 세그먼트의 2개의 상보적 DNA 가닥은 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 허용하고 2개의 발현 카세트를 인코딩하는 DNA의 세그먼트는 적절한 ITS에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터에 의해 각 말단에서 플랭킹된 관심 서열 (SOI)을 포함한다.
도 14는 '독립적 발현 카세트' 구조 (플라스미드 작제물-3) 또는 "상보적 발현 카세트" 구조 (플라스미드 작제물-4)를 사용하는 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 무세포 반응에서 얻은 2개의 상이한 dsRNA 생성물 (GS1 및 GS4)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다.
도 15는 발현 카세트의 일부로 사용된 상이한 ITS 변이체를 갖는 '독립적 발현 카세트' 구조 (플라스미드 작제물-3)를 사용하는 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 무세포 반응으로부터 얻은 GS1 dsRNA의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 보여주는 그래프이다.
도 16a는 G-개시 ITS(G-start ITS)를 사용하여 생성된 캡이 없는(uncapped) RNA 및 A-개시 ITS를 사용하여 캡핑된(capped) RNA의 생성 역가 (역가, mg/ml에서)를 나타내는 그래프이다. 도 16b는 BioAnalyzer 기기를 사용하여 캡처한 무세포 반응에서 생성된 RNA 종의 크기 분포를 예시하는 전기영동도를 나타낸다.
도 17a는 CleanCap AG, A-개시 ITS 및 다양한 오픈 리딩 프레임 서열을 사용한 캡핑된 RNA의 생성 역가 (역가, mg/ml에서)를 나타내는 그래프이다. 도 17b는 Fragment Analyzer 기기를 사용하여 캡처한 무세포 반응에서 생성된 RNA 종의 크기 분포를 예시하는 전기영동도를 나타낸다.
도 2는 RNA 생성물의 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 예시적인 선형 DNA 주형의 개략도를 제공하며, 상기 DNA 주형은 각각 dsRNA 생성물의 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)의 ITS 업스트림에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 생성된 dsRNA 생성물은 완전히 혼성화될 때 DNA 주형의 각 ITS에 상응하는 5' r-ITS 오버행을 포함한다.
도 3은 생성된 RNA 전사체에 5' r-ITS 및 3' r-ITS-RC를 함유하는 RNA 생성물의 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 예시적인 선형 DNA 주형의 개략도를 제공한다. 나타난 2개의 DNA 주형은 각각 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 발현 카세트는 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)의 업스트림에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 ITS-역 상보체 (ITS-RC)를 포함한다. 생성된 dsRNA 생성물은 완전히 혼성화될 때 단일 가닥 오버행을 포함하지 않는다.
도 4는 dsRNA 생성물을 생성하기 위한 시험관 내 또는 생체 내 전사를 위한 예시적인 DNA 주형의 개략도를 제공한다. 상부 개략도는 '상보적 발현 카세트' 구조를 포함하는 DNA 주형이며, 상기 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 발현 카세트는 2개의 상보적 DNA 가닥에 의해 인코딩되고, DNA 주형은 전사될 관심 서열 (SOI)의 두 말단에 위치한 ITS_2 서열에 작동 가능하게 연결된 2개의 수렴 프로모터를 포함한다. 중간 개략도는 dsRNA 합성을 위한 '상보적 발현 카세트' 구조를 포함하는 DNA 주형이며, 상기 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 발현 카세트는 2개의 상보적 DNA 가닥에 의해 인코딩되고, 상기 DNA 주형은 전사될 관심 서열 (SOI)의 두 말단에 위치한 GL-하이브리드-A9 ITS를 갖는 2개의 수렴 프로모터를 포함한다. 하단 개략도는 dsRNA 합성을 위한 '독립적 발현 카세트' 구조를 포함하는 DNA 주형이며, 상기 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥은 DNA의 개별 세그먼트 상의 개별 발현 카세트에 의해 인코딩되며, 여기서 각각의 발현 카세트는 프로모터 및 전사될 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)의 업스트림에 위치한 ITS를 포함한다.
도 5는 상이한 ITS를 포함하는 DNA 주형을 사용한 시험관 내 전사 (IVT) 반응에 따라 얻은 dsRNA 생성물 (GS1 dsRNA)의 발현 수준(역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다.
도 6a-6b는 상이한 ITS를 포함하는 DNA 주형을 사용한 무세포 반응에 따라 얻은 dsRNA 생성물 (GS1 dsRNA)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다. 5' 단일 가닥 오버행이 있고(도 6a) 5' 단일 가닥 오버행이 없는(도 6b) dsRNA 생성물을 생성하는 DNA 주형을 사용하여 데이터를 얻었다.
도 7a-7d는 다양한 DNA 주형 구조를 사용한 dsRNA 생성물 (GL Seq-A, GL Seq-B, GL Seq-C, GL Seq-D, GL Seq-E)의 발현 수준의 배수 증가를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 7a는 상이한 DNA 주형 구조를 사용한 RNA 역가 프록시를 나타내는 그래프이다. 도 7b는 GL-하이브리드_A9 ITS가 없는 동일한 디자인을 사용하는 DNA 주형에 비해 GL-하이브리드_A9 ITS가 있는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 대한 dsRNA의 발현 수준의 배수 증가를 보여준다. 도 7c는 동일한 GL-하이브리드_A9 ITS를 갖는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 비해 GL-하이브리드_A9 ITS를 사용하는 '독립적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 대한 발현 수준의 배수 증가를 보여준다. 도 7d는 GL-하이브리드_A9 ITS가 없는 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 비해 GL-하이브리드_A9 ITS가 있는 '독립적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 DNA 주형에 대한 발현 수준의 배수 증가를 보여준다.
도 8a-8c는 단일 가닥 RNA (ssRNA) 생성물의 전사를 종결시키기 위한 상이한 종결 서열의 효과를 입증한다. 도 8a는 번역 초과(read-through) 및 종결 효율의 평가에 사용되는 DNA 주형의 개략도를 제공한다. 도 8b는 도 8a에 나타난 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사 반응에서 합성된 ssRNA 생성물의 역상 이온쌍 (RP-IP) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 크로마토그램을 제공한다. 도 8c는 다양한 수준의 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) (각 NTP의 2mM, 4mM 및 8mM)에서 도 8a에 나타난 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사 반응의 순 종결 효율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 2개의 개별 발현 카세트로부터의 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 전사를 위한 '독립적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 예시적인 DNA 플라스미드의 개략도이다. 센스 및 안티센스 가닥의 전사는 본원에 설명된 바와 같이 DNA 개시 전사된 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터로부터 독립적으로 구동된다.
도 10은 플라스미드 (pGLA583 및 pGLA584) 및 선형 DNA 주형을 이용한 무세포 반응 후 얻은 dsRNA 생성물 (GS4 dsRNA)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 다양한 ITS를 갖는 DNA 주형을 사용한 무세포 반응 (NTP 반응 및 NMP 반응) 후 얻은 dsRNA 생성물 (GS1 dsRNA)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다.
도 12는 단일 발현 카세트 (플라스미드 작제물-2)를 포함하는 플라스미드 DNA 주형으로부터 "헤어핀" 생성물 변이체로서 GLSeq-A dsRNA 생성물의 발현과 비교하여 센스 및 안티센스 가닥 (플라스미드 작제물-1)을 인코딩하는 2개의 독립적인 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 DNA 주형으로부터의 dsRNA 생성물 (GLSeq-A dsRNA)의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 13a-13b는 dsRNA 생성물의 발현을 위한 예시적인 플라스미드 DNA 주형의 개략도이다. 도 13a는 dsRNA 생성을 위한 '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하는 예시적인 플라스미드 DNA 주형 (플라스미드 작제물-3)을 나타내며, 여기서 플라스미드 내의 2개의 개별 발현 카세트 각각은 ITS 및 ITS-RC에 의해 플랭킹되는 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 허용한다. 2개의 발현 카세트는 동일한 방향으로 배향되고 선별 마커 및 복제 기점으로서 암피실린 내성 bla 유전자에 의해 분리된다. 도 13b는 dsRNA 발현을 위한 "상보적 발현 카세트" 구조를 사용하는 예시적인 플라스미드 DNA 주형 (플라스미드 작제물-4)을 나타내며, 상기 동일한 DNA 세그먼트의 2개의 상보적 DNA 가닥은 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 허용하고 2개의 발현 카세트를 인코딩하는 DNA의 세그먼트는 적절한 ITS에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터에 의해 각 말단에서 플랭킹된 관심 서열 (SOI)을 포함한다.
도 14는 '독립적 발현 카세트' 구조 (플라스미드 작제물-3) 또는 "상보적 발현 카세트" 구조 (플라스미드 작제물-4)를 사용하는 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 무세포 반응에서 얻은 2개의 상이한 dsRNA 생성물 (GS1 및 GS4)의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 나타내는 그래프이다.
도 15는 발현 카세트의 일부로 사용된 상이한 ITS 변이체를 갖는 '독립적 발현 카세트' 구조 (플라스미드 작제물-3)를 사용하는 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 무세포 반응으로부터 얻은 GS1 dsRNA의 발현 수준 (역가, ng/μL에서)을 보여주는 그래프이다.
도 16a는 G-개시 ITS(G-start ITS)를 사용하여 생성된 캡이 없는(uncapped) RNA 및 A-개시 ITS를 사용하여 캡핑된(capped) RNA의 생성 역가 (역가, mg/ml에서)를 나타내는 그래프이다. 도 16b는 BioAnalyzer 기기를 사용하여 캡처한 무세포 반응에서 생성된 RNA 종의 크기 분포를 예시하는 전기영동도를 나타낸다.
도 17a는 CleanCap AG, A-개시 ITS 및 다양한 오픈 리딩 프레임 서열을 사용한 캡핑된 RNA의 생성 역가 (역가, mg/ml에서)를 나타내는 그래프이다. 도 17b는 Fragment Analyzer 기기를 사용하여 캡처한 무세포 반응에서 생성된 RNA 종의 크기 분포를 예시하는 전기영동도를 나타낸다.
일부 양태에서, 핵산, 핵산의 조성물, 예를 들어 DNA-기반 벡터 또는 작제물, 및 이중 가닥 RNA (dsRNA) 및 단일 가닥 RNA (ssRNA)와 같은 리보핵산 (RNA)의 생성을 위한 관련 사용 방법 및 키트가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 조성물은 무세포 반응 및 시험관 내 전사 반응을 사용하여 RNA의 비용 효율적이고 고수율 생성을 가능하게 한다.
정의
하기 용어들이 당업자에 의해 잘 이해되는 것으로 믿어지지만, 하기 정의들은 현재 개시된 대상의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 일반적으로 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 지칭한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자의 뉴클레오티드 단량체는 자연 발생 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기의 변형을 포함한다.
용어 "전사" 또는 "RNA 전사"는 일반적으로 생체 내 또는 시험관 내에서 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)를 주형으로 사용하여 리보뉴클레오시드 포스페이트를 중합할 수 있는 RNA 중합효소에 의해 RNA 전사체가 합성되는 과정을 의미한다.
용어 "주형" 또는 "전사 주형" 또는 "전사용 주형"은 일반적으로 전사 과정을 통해 RNA 전사체를 만들기 위한 RNA 중합효소의 주형으로 사용되는 핵산 서열 (DNA 또는 RNA)을 지칭한다. 주형은 RNA 중합효소에 의해 합성되는 RNA 전사체의 서열을 지정한다. RNA 중합효소는 주형 핵산 분자의 주형 가닥을 따라 이동하고 주형 (DNA 또는 RNA) 가닥에 상보적인 리보뉴클레오티드 포스페이트를 추가하여 성장하는 RNA 전사체에 RNA 전사체를 합성한다. 주형은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형은 단일 가닥 또는 이중 가닥이다. 대부분의 살아있는 유기체에서, 전사는 이중 가닥 DNA 분자 (염색체 DNA)를 세포의 주형으로 사용하여 mRNA를 합성하는 RNA 중합효소에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 시험관 내 전사는 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 전사될 합성 부분 이중 가닥 DNA 주형을 이용한다. 일부 구현예에서, 주형은 선형 분자이다. 일부 구현예에서, 주형은 원형이다. 주형에는 RNA 전사체의 발현에 필요한 요소 이외의 추가 요소가 함유될 수 있다. 또한, RNA 의존성 RNA 중합효소에 의한 단일 가닥 RNA의 생체 내 및/또는 시험관 내 전사도 가능하다 (예를 들어, 일부 RNA 바이러스의 경우). 용어 "주형" 또는 "전사 주형" 또는 "전사용 주형"은 일부 구현예에서 이중 가닥 DNA 분자의 세그먼트의 특정 핵산 서열 또는 전사될 핵산 서열을 함유하는 전체 DNA 분자를 지칭할 수 있다.
용어 "T7 프로모터", "T7 RNAP 프로모터" 또는 "T7 클래스 III 프로모터"는 일반적으로 T7 RNA 중합효소가 전사를 개시하기 위해 결합하는 이중 가닥 DNA 세그먼트를 지칭한다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 최소 T7 클래스 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 최소 T7 클래스 III 프로모터는 T7 박테리오파지 게놈에서 
6.5, 
10 및 
13 유전자의 업스트림에서 자연적으로 발견되는 17개 염기쌍 (bp) 길이의 dsDNA 세그먼트이며, 이의 비주형 가닥은 서열 TAATACGACTCACTATA (서열번호: 9)을 갖는다. 본원에 정의된 최소 T7 클래스 III 프로모터는 말단에 표준 'G'를 포함하지 않으며, 발현될 서열이 개시 부분에 'G'를 운반하지 않는 한, 자체적으로 전사를 개시할 것으로 예상되지 않는다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 다음을 포함하는 47 bp 프로모터를 포함한다: a) b) 서열번호: 9의 17 bp 최소 T7 클래스 III 프로모터에 작동 가능하게 연결된 T7 박테리오파지 게놈에서 
6.5, 
10 및 
13 유전자 앞의 영역에서 최소 T7 클래스 III 프로모터의 업스트림에서 자연적으로 발견되는 30 bp DNA 세그먼트 (비주형 가닥 서열 TCGATTCGAACTTCTGATAGACTTCGAAAT; 서열번호 37으로 표시됨).
용어 "전사 개시 부위 (TSS)"는 일반적으로 RNA 중합효소가 전사를 개시하는 주형 상의 특정 뉴클레오티드 위치를 지칭한다. 전사 개시 부위는 일반적으로 RNA 중합효소에 의한 RNA 합성이 개시되는 프로모터의 바로 다운스트림의 뉴클레오티드 위치이다. 일부 구현예에서, 전사용 주형이 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 갖는 DNA 분자인 경우에, TSS는 ITS의 첫 번째 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 전사를 위한 주형이 관심 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 갖는 DNA 분자인 경우 (즉, ITS가 결여된 주형), TSS는 관심 서열의 첫 번째 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, TSS는 일반적으로 최소 T7 클래스 III 프로모터와 중첩되지 않지만 ITS의 첫 번째 뉴클레오티드로 포함되거나, ITS가 존재하지 않는 경우, 관심 서열의 첫 번째 뉴클레오티드로 포함된다.
용어 "관심 서열 (SOI)"은 일반적으로 전사를 통해 생성된 RNA 전사체 또는 RNA 생성물에 통합되는 특정 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, SOI는 RNA 생성물의 특정 핵산 서열을 인코딩하는 DNA 주형의 세그먼트이다. 일부 구현예에서, SOI는 RNA 전사체 또는 생성물의 일부 또는 전체의 핵산 서열이다.
용어 "DNA 개시 전사 서열 (ITS)"은 일반적으로 프로모터의 바로 다운스트림에 있는 DNA 주형 상의 전사된 서열의 처음 몇 개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 1-15개의 뉴클레오티드)를 포함하는 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, DNA ITS는 전사를 통해 생성된 전장 RNA 전사체의 전체 수율에 영향을 미친다 (예를 들어, ITS 서열이 없는 대조군 DNA 주형에 비해 전체 수율을 증가시킨다). 프로모터에 대한 개시 결합 후, RNA 중합효소는 프로모터 제거 및 전사의 연장 단계로의 전환 전에 짧은 중단 RNA 전사체를 방출하기 위해 ITS를 통해 앞뒤로 순환하여 전장 RNA 전사체의 합성을 허용할 것으로 예상된다.
용어 "RNA 개시 전사체 서열 (r-ITS)"은 일반적으로 RNA 전사체의 전사에 사용된 DNA 주형 상의 ITS에 해당하는 RNA 전사체의 개시 부분에 처음 몇 개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 1-15개 뉴클레오티드)를 포함하는 서열을 의미한다. r-ITS는 SOI 업스트림의 RNA 전사체의 개시 부분에 존재하는 서열을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, r-ITS는 자연 발생 ITS에 상응한다. 일부 구현예에서, r-ITS는 프로모터와 SOI 사이에 존재하는 이종 또는 합성 서열이다.
용어 "ITS"는 일반적으로 DNA 개시 전사 서열 (ITS)을 지칭한다. "ITS-RC"라는 용어는 일반적으로 DNA 개시 전사 서열의 역 상보체를 의미한다. 용어 "r-ITS"는 일반적으로 상응하는 ITS로부터 전사된 RNA 개시 전사 서열을 지칭한다. 용어 "r-ITS-RC"는 일반적으로 상응하는 ITS-RC로부터 전사된 RNA 개시 전사 서열의 역 상보체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "전사 종결자" 또는 "종결자"는 일반적으로 중합효소에 의한 RNA 전사가 종결되도록 하는 DNA 주형 상의 SOI 말단에서 특정 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 종결자는 RNA 중합효소가 DNA 주형으로부터 방출되고 전사가 중단되도록 하는 핵산 서열이다. 종결자는 단방향 또는 양방향일 수 있다.
용어 "센스" 및 "안티센스"는 일반적으로 이중 가닥 DNA 또는 RNA 분자의 개별 가닥을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "센스 가닥"은 일반적으로 이중 가닥 핵산 분자의 코딩 가닥의 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "안티센스 가닥"은 mRNA를 생성하도록 전사되는 이중 가닥 핵산의 주형 가닥 또는 이의 단편의 핵산 서열을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 용어 "안티센스 가닥"은 mRNA 전사체 또는 이의 세그먼트에 상보적인 RNA 가닥의 핵산 서열을 지칭할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 일반적으로 전사를 통한 관심 RNA 전사체의 발현을 위한 DNA 주형으로서 작용하는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 발현될 RNA 분자를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터로 적어도 구성된다. 발현 카세트는 선택적으로 다음 요소 중 하나 이상을 포함한다: 발현을 향상시키기 위한 특정 개시 전사 서열 (ITS), 특정 ITS의 역 상보체 (ITS-RC), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)(RES) 및/또는 하나 이상의 종결자(들).
본원에 사용된 용어 "작제물", "핵산 작제물", "발현 작제물", "조작된 핵산" 또는 "벡터"는 일반적으로 RNA 전사체 또는 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA 중합효소에 의한 전사를 통한 관심 생성물 (예를 들어, RNA 생성물 또는 관심 단백질)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 지칭한다. "작제물" 및 "벡터"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다. 작제물은 RNA 전사체의 발현에 중요하지 않지만 생체 내 또는 시험관 내에서 자체 복제, 유지, 안정성 등을 보장하는 데 필수적인 추가 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 작제물은 각각 적합한 숙주에서 복제 및 유지를 위한 선별 마커 및 복제 기점을 추가로 갖는 하나 이상의 발현 카세트를 갖는 플라스미드일 수 있다. 선택적으로, RNA 전사체의 발현을 허용하기 위해 하나 이상의 발현 카세트를 통합함으로써 변형된 유기체의 염색체는 작제물을 포함할 수 있다. 따라서 작제물의 비제한적 예에는 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스 벡터), 플라스미드, 코스미드, 플라스톰, 박테리오파지, 인공 염색체, 발현 카세트가 통합된 천연 게놈, 또는 선형 DNA 분자가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 구현예에서, 2개의 핵산 서열 또는 요소가 서로 기능적으로 연결된 경우 2개의 핵산 서열 또는 요소가 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 프로모터는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결되어 ITS 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어 ("구동")하기 위해 조절하는 ITS와 관련하여 프로모터가 올바른 기능적 위치 및 방향에 있도록 한다.
RNA의 전사
전사, 예를 들어, RNA의 생성에는 3가지 주요 단계가 포함된다. 첫 번째 단계 (개시) 동안, RNA 중합효소는 DNA 주형의 프로모터에 결합하여, DNA의 두 가닥 (비주형 가닥 및 주형 가닥)을 녹인 다음 주형 DNA 가닥에 상보적인 리보뉴클레오티드를 포함하고 중합함으로써 전사 개시 부위 (TSS)에서 전사를 개시한다. 중합효소는 다음 단계 (신장)로 성공적으로 전환될 때까지 처음 몇 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 앞뒤로 순환을 계속하여, 반복적으로 짧은 중단 전사체 (3 내지 8개의 뉴클레오티드 길이)를 방출할 수 있다. 프로모터 제거 및 안정한 3원 신장 복합체의 형성 후, 중합효소는 DNA 주형을 따라 계속 이동하고 주형 DNA 가닥에 상보적인 리보뉴클레오티드를 포함함으로써 RNA 생성물을 신장/구축한다. RNA 생성물의 완전한 생성 후, 세 번째 단계 (종결)는 중합효소가 DNA 주형의 종결 서열을 만나거나 선형 DNA 주형의 말단에 도달하여 주형에서 떨어져 전사된 RNA 생성물에서 중합효소의 방출을 포함한다.
RNA 전사 방법에 사용하기 위한 핵산, 예를 들어 DNA 주형의 조성물이 본원에 설명되어 있다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 DNA 주형은 전사 반응, 예를 들어 무세포 반응 및/또는 시험관 내 또는 생체 내 전사 반응으로부터 RNA 생성물 수율을 최대화하기 위해, 종결 전사, 예를 들어 개시, 연장 및/또는 종결의 단계의 각각의 효율을 개선하는 주형 요소, 예를 들어 DNA 개시 전사된 서열 (ITS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 DNA 주형은 가변 길이 및 뉴클레오티드 서열의 ITS를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 DNA 주형, 예를 들어 DNA 벡터, DNA 작제물 또는 DNA 플라스미드는 2개의 발현 카세트를 포함하고, 여기서 하나의 발현 카세트는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하고 다른 발현 카세트는 상기 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩한다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 완전히 또는 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 DNA 주형, 예를 들어 DNA 벡터, DNA 작제물 또는 DNA 플라스미드는 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 SOI를 인코딩하여 ssRNA 분자를 생성한다.
일부 구현예에서, DNA 주형의 프로모터 영역은 DNA 개시 전사된 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된다. ITS는 프로모터 제거를 통해 전사의 개시 단계에서 연장 단계로의 전환에 영향을 미치는 최대 15개 뉴클레오티드 (예를 들어, 6-15개 뉴클레오티드)의 짧은 서열로, 주어진 프로모터로부터 전사의 속도 및 순 수율에 영향을 준다. 일부 구현예에서, ITS는 개시에 반복적으로 전사되어 전사 개시 단계 동안 짧은 중단 전사체를 방출한다. r-ITS는 결과적으로 DNA 주형에 대한 ITS의 전사 후 전장 RNA 전사체의 5' 말단에 존재한다. 따라서 ITS는 존재하는 경우 전사의 개시 단계 (프로모터 제거를 통한 연장 단계로의 전환 및 개시)에서 중요한 역할을 하며 주어진 프로모터로부터 전사의 전체 속도 및 수율에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, ITS는 자연 발생 ITS, 예를 들어 박테리오파지 T7 게놈에서 T7 클래스 III 프로모터 직후에 발견되는 공통 ITS이다. 일부 구현예에서, 공통 ITS는 
6.5, 
10 및 
13 유전자에 선행하고 T7 클래스 III 프로모터의 바로 다운스트림에 처음 6개 뉴클레오티드 (GGGAGA(서열번호: 8))를 포함한다. 일부 구현예에서, ITS는 합성 ITS (예를 들어, GGGAGACCAGGAATT(서열번호: 1))이다.
프로모터는 유전자 또는 서열, 예를 들어 내인성 프로모터와 자연적으로 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트의 업스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 코딩 핵산 서열, 예를 들어 SOI는 자연 환경에서 인코딩된 서열과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어 하에 위치할 수 있다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 다른 종에서 분리된 프로모터; 및 예를 들어, 당업계에 공지된 유전 공학 방법을 통해 발현을 변경하는 상이한 전사 조절 영역 및/또는 돌연변이의 상이한 요소를 함유하는 것과 같은 "자연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA는 본원에 설명된 핵산 및 예컨대 국제 공개 번호 WO 2019/075167에 설명된 바와 같은 무세포 반응을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 무세포 전사 반응은 다음의 3가지 주요 과정을 포함한다: (1) 세포내 중합체성 RNA의 뉴클레오티드 단량체로의 분해 - 뉴클레오티드 모노포스페이트 (NMP) 및 뉴클레오티드 디포스페이트 (NDP)의 조합, (2) 중합체성 RNA 형성을 위한 "빌딩 블록 (building block)" 역할을 하는, NMP 및 NDP에서 NTP(뉴클레오티드 트리포스페이트)로의 전환, 및 (3) 핵산의 조성을 사용하여 RNA를 생성하기 위한 NTP의 중합 (예를 들어, DNA 기반 벡터).
일부 구현예에서, RNA는 본원에 설명된 핵산의 조성 및 시험관 내 전사 (IVT) 반응을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, IVT 반응은 재조합 RNA 중합효소, NTP, 염, 금속, 보조인자, 및/또는 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 당업계에 설명된 임의의 IVT 반응이 본원에 설명된 핵산의 조성물과 함께 사용될 수 있다.
RNA 생성 방법은 4 ℃ 내지 80 ℃ 이상의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA를 생성하는 방법은 4 ℃, 5 ℃, 6 ℃, 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃, 10 ℃, 11 ℃, 12 ℃, 13 ℃, 14 ℃, 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃, 41 ℃, 42 ℃, 43 ℃, 44 ℃, 45 ℃, 46 ℃, 47 ℃, 48 ℃, 49 ℃, 50 ℃, 51 ℃, 52 ℃, 53 ℃, 54 ℃, 55 ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃, 61 ℃, 62 ℃, 63 ℃, 64 ℃, 65 ℃, 66 ℃, 67 ℃, 68 ℃, 69 ℃, 70 ℃, 71 ℃, 72 ℃, 73 ℃, 74 ℃, 75 ℃, 76 ℃, 77 ℃, 78 ℃, 79 ℃ 또는 80 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. RNA 생성 방법은 5분 (분) 내지 48시간 (시간) 이상의 기간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA를 생성하는 방법은 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
RNA를 생성하는 방법은 일부 구현예에서, 예를 들어 T7 박테리오파지 게놈의 유전자 1로부터 인코딩된 바와 같이 고도로 진행성인 DNA-의존성 T7 RNA 중합효소에 의해 촉매화될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 중합효소는 T7 파지로부터의 T7 RNA 중합효소다. 일부 구현예에서, RNA 중합효소는 RNA-의존성 RNA 중합효소, 예를 들어 파지 Φ6으로부터의 Φ6 RNA 중합효소다. 다른 DNA-의존성 또는 RNA-의존성 RNA 중합효소가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산의 전사는 RNA 생성물, 예를 들어 dsRNA, 메신저 RNA, shRNA, siRNA, ssRNA, gRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 갭머의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 생성한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산의 전사는 ITS (r-ITS) 및 ITS의 역 상보체 (r-ITS-RC)가 플랭킹된 RNA 생성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 조성물을 사용하여 RNA를 생성하는 방법은 대조군보다 적어도 5% 더 많은 RNA, 적어도 10% 더 많은 RNA, 적어도 20% 더 많은 RNA, 적어도 30% 더 많은 RNA, 적어도 40% 더 많은 RNA, 적어도 50% 더 많은 RNA, 적어도 60% 더 많은 RNA, 적어도 70% 더 많은 RNA, 또는 그 이상을 생성한다. 예를 들어, ITS, 예를 들어 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 또는 작제물을 사용하는 방법은 대조군(ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하지 않는 벡터 또는 작제물을 사용하는 방법)보다 적어도 5% 더 많은 RNA, 적어도 10% 더 많은 RNA, 적어도 20% 더 많은 RNA, 적어도 30% 더 많은 RNA, 적어도 40% 더 많은 RNA, 적어도 50% 더 많은 RNA, 적어도 60% 더 많은 RNA, 적어도 70% 더 많은 RNA 이상을 생성한다.
일부 구현예에서, RNA는 예를 들어 본원에 설명된 핵산 작제물 또는 조작된 핵산을 포함하는 미생물 세포에서 본원에 설명된 핵산 작제물 또는 조작된 핵산의 조성물을 사용하여 전사를 통해 생성된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물 또는 조작된 핵산은 미생물 세포의 염색체 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물 또는 조작된 핵산은 미생물 세포 내에 함유된 플라스미드 또는 임의의 다른 핵산 작제물 또는 조작된 핵산이다. 일부 구현예에서, RNA는 RNA 생성에 최적인 조건 하에 성장된, 본원에 설명된 핵산 작제물을 포함하는 원핵 또는 진핵 세포에서 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 핵산 작제물 또는 조작된 핵산을 포함하는 세포는 발효 챔버 또는 반응기에서 성장하여 관심 생성물로서 RNA를 생성한다. 다른 구현예에서, 본원에 설명된 핵산 작제물 또는 조작된 핵산을 포함하는 세포는 관심 단백질 또는 펩티드의 생성을 위한 발효 챔버 또는 반응기에서 성장되고, 상기 핵산 작제물 또는 조작된 핵산은 세포 내부의 관심 단백질 또는 펩티드 생성물을 인코딩하는 RNA의 발현을 허용한다.
개시 전사 서열
본원에 설명된 핵산의 조성물에 사용하기 위한 ITS는 1-15개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ITS는 1-6, 1-9, 1-12, 1-15, 3-6, 6-9, 6-12, 6-15, 9-15, 9-12, 10-15, 10-12, 12-15, 또는 15개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, ITS는 프로모터, 예를 들어 T7 클래스 III 최소 프로모터의 바로 다운스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, ITS는 전사 개시 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, ITS는 표 1에 설명된 바와 같다. 일부 구현예에서, ITS는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, ITS는 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, ITS는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 변이체이고, 여기서 변이체는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 관심 서열 (SOI)의 업스트림에 위치하며, 상기 SOI는 원하는 RNA 생성물, 예를 들어 dsRNA의 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩한다. 일부 구현예에서, T7 클래스 III 최소 프로모터는 TAATACGACTCACTATA(서열번호: 9)를 포함한다. 일부 구현예에서, T7 클래스 III 최소 프로모터 앞에는 예를 들어 TCGATTCGAACTTCTGATAGACTTCGAAATTAATACGACTCACTATA(서열번호: 18)를 포함하는 T7 박테리오파지 게놈 영역에서 프로모터의 업스트림에 자연적으로 존재하는 30개 염기쌍 서열이 있다.
표 1: ITS 변이체
일부 구현예에서, 프로모터는 서열: TAATACGACTCACTATA(서열번호: 9)를 포함하는 최소 클래스 III T7 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열: TCGATTCGAACTTCTGATAGACTTCGAAATTAATACGACTCACTATA(서열번호: 18)를 포함하는 확장된 클래스 III T7 프로모터이다.
ITS_6 변이체는 T7 게놈에서 유전자 
6.5, 
10 및 
13 유전자 앞에 있는 ITS의 보존된 영역에 해당한다. pT7-g10, pT7-g5 및 pT7-5_LIT_AI 변이체는 이전에 보고된 합성 또는 자연 발생 ITS에 해당한다. GL-하이브리드 변이체 (GL-하이브리드_A9, GL-하이브리드_A9G, GL-하이브리드_A9C, GL-하이브리드_A9T)는 본 발명의 발명자들에 의해 확인되었으며 놀랍게도 RNA 전사 과정을 촉진하는 데 효과적이다. 실시예에 의해 설명된 바와 같이, GL-하이브리드 ITS 변이체에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 주형은 대조군 DNA 주형, 예를 들어 ITS_6을 포함하는 DNA 주형에 비해 더 높은 수준의 전사된 RNA 생성물을 생성하였다.
관심 서열
본원에 설명된 핵산, 예를 들어 DNA 주형의 조성물은 관심 서열 (SOI)을 포함하고, 상기 SOI는 RNA 생성물을 인코딩하는 임의의 서열이다. 일부 구현예에서, SOI는 프로모터, 선택적으로 ITS를 포함하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 그것이 조절하는 SOI의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다.
일부 구현예에서, RNA 생성물은 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥이다. 일부 구현예에서, RNA 생성물은 dsRNA의 안티센스 가닥이다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, RNA 생성물은 단일 가닥 RNA, 예를 들어 메신저 RNA이다. 일부 구현예에서, RNA 생성물은 shRNA, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 갭머, 또는 임의의 다른 생각할 수 있는 RNA 생성물이다.
일부 구현예에서, RNA 생성물, 예를 들어 dsRNA는 예를 들어 곤충, 식물, 진균, 동물 또는 바이러스로부터의 관심 게놈 서열을 (예를 들어 RNA 간섭을 통해) 표적화한다. 일부 구현예에서, RNA 생성물, 예를 들어 mRNA는 관심 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, RNA 생성물을 인코딩하는 SOI는 생물학적 활성을 유도하기에 충분한 임의의 길이를 가질 수 있다. 비제한적인 예는 길이가 4 내지 10, 4 내지 20, 4 내지 30, 4 내지 50, 4 내지 60, 4 내지 70, 4 내지 80, 4 내지 90, 4 내지 100, 4 내지 200, 4 내지 300, 4 내지 400, 4 내지 500, 4 내지 1000, 500 내지 2000 뉴클레오티드, 500 내지 4000 뉴클레오티드, 500 내지 6000 뉴클레오티드, 500 내지 8000 뉴클레오티드, 또는 4 내지 10000 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA 생성물을 인코딩하는 SOI를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 생성물을 인코딩하는 SOI는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, RNA 생성물을 인코딩하는 SOI는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 500, 1000 또는 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
2개의 핵산, 예를 들어 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 왓슨-크릭 상호작용 (혼성화라고도 칭함)을 통해 이중 가닥 핵산 분자를 형성하기 위해 서로 염기쌍을 형성하거나 결합하는 경우 서로 상보적이다(예를 들어, 전체적으로 또는 부분적으로). 본원에 사용된 바와 같이, 결합은 예를 들어 생리학적 조건 하에서 정전기, 소수성, 이온 및/또는 수소 결합 상호작용으로 인한 동일한 분자의 적어도 2개의 분자 또는 2개 영역 사이의 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2개의 핵산은 100% 상보적이다 (즉, 핵산의 세그먼트 또는 전체를 따라 완전히 상보적임). 일부 구현예에서, 2개의 핵산은 핵산의 세그먼트 또는 전체를 따라 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상보적이다 (예를 들어, 부분적으로 상보적). 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있으며, 그 예로는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler Transform 기반 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies), ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 사용 가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 사용 가능)을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 서로 상보적인 2개의 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 불일치 염기쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 RNA 또는 dsRNA는 단일 가닥 영역 (예를 들어, 루프 또는 오버행)을 함유하지 않는 완전한 이중 가닥 분자이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 RNA 또는 dsRNA는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역 (예를 들어, 루프 또는 오버행)을 함유하는 부분적으로 이중 가닥 분자이다.
종결 서열
일부 구현예에서, 핵산의 조성물, 예를 들어 DNA 주형은 전사 종결 서열을 포함한다. 전사 종결자를 인코딩하는 서열은 일반적으로 코딩 서열의 바로 다운스트림에 위치한다. 이는 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사체의 특정 종결과 관련된 DNA 서열로 구성된다. 종결 서열은 업스트림 프로모터에 의한 다운스트림 핵산 서열의 전사 활성화를 방지한다. 따라서, 일부 구현예에서, RNA 전사체의 생성을 종결하는 종결자를 포함하는 DNA 주형이 고려된다. 가장 일반적으로 사용되는 유형의 종결자는 정방향 종결자이다. 일반적으로 전사되는 핵산 서열의 다운스트림에 배치되면 순방향 전사 종결자가 전사를 중단시킨다. 일부 구현예에서, 양방향 전사 종결자가 제공되며, 이는 일반적으로 전사가 정방향 및 역방향 가닥 모두에서 종결되게 한다. 일부 구현예에서, 일반적으로 역 가닥에서만 전사를 종결시키는 역전사 종결자가 제공된다. 원핵생물 시스템에서 종결자는 일반적으로 (1) rho-독립적 종결자, 및 (2) rho-의존적 종결자의 두 가지 범주로 나뉜다. Rho-독립적 종결자는 일반적으로 우라실 염기의 스트링이 뒤따르는 G-C 염기쌍이 풍부한 줄기 루프를 형성하는 회문 서열로 구성된다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 종결자는 본원에 설명되거나 당업자에게 공지된 임의의 전사 종결자를 포함한다. 종결자의 비제한적인 예는 유전자의 종결 서열, 예컨대, 예를 들어 소 성장 호르몬 종결자, 대장균 (E. coli) 리보솜 RNA T1T2 종결자, rrnBT1 및 rrnBT2, 인간 전부갑상선 PTH 종결자 및 바이러스 종결 서열 및 이들의 유도체, 예를 들어, T0 종결자, TE 종결자, 람다 T1, T7, TT7, T7U, TT3 종결자, 및 박테리아 시스템에서 발견되고/되거나 사용되는 기타 종결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 종결 신호는 예컨대 서열 절단으로 인한 것과 같이 전사되거나 번역될 수 없는 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 종결자는 2개 이상의 개별 및/또는 별개의 종결 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 종결자는 rrnBT1, rrnBT2, TT7, T7U, TT3, 및/또는 PTH 종결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 종결자는 표 2에 설명된 바와 같다. 일부 구현예에서, 종결자는 서열번호: 19-30 중 어느 하나를 포함한다.
표 2: 종결 서열의 예
핵산 구조
본원에 설명된 핵산은 임의의 생각할 수 있는 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 선형이다. 일부 구현예에서, 핵산은 원형이다. 일부 구현예에서, 원형 핵산은 적절한 엔도뉴클레아제가 상기 엔도뉴클레아제 인식 부위에서 핵산을 절단하는 경우 원형 핵산이 선형화되도록 할 수 있는 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 관심 서열 (SOI)을 포함하는 DNA 주형이고, 상기 SOI는 RNA 생성물을 인코딩한다. 일부 구현예에서, DNA 주형 또는 벡터는 플라스미드 또는 DNA 작제물이다. 일부 구현예에서, DNA 주형 또는 벡터는 플라스미드, 발현 카세트, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지, 아데노 관련 바이러스 벡터 (AAV 벡터), 또는 바이러스이다.
본 개시내용은 통상적인 구조 (예를 들어, 헤어핀)보다 관심 RNA (예를 들어, dsRNA)의 생성에서 더 나은 효과를 입증한 핵산 구조를 설명한다. 각각 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥을 발현할 수 있는 2개의 개별 발현 카세트 ("독립적 발현 카세트" 구조)를 포함하는 핵산 작제물의 사용은 주어진 dsRNA 생성물의 합성을 허용하는 다른 작제물 구조에 비해 이점을 제공한다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 본원에 설명된 벡터 또는 작제물은, 루프 서열에 의해 연결된 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 헤어핀 dsRNA 생성물을 발현할 수 있는 단일 발현 카세트를 운반하는 벡터로부터의 것보다 더 높은 수준에서 센스 및 안티센스 가닥의 혼성화로부터 형성되는 dsRNA 생성물을 초래하는 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 각각 허용하는 상기 설명된 바와 같은 2개의 발현 카세트를 포함한다.
예를 들어, 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 2개의 개별 발현 카세트와 독립적으로 허용하는 그러한 작제물은 전사체를 발현할 수 있는 단일 발현 카세트를 운반하는 작제물보다 더 높은 dsRNA 생성물 역가를 초래하고, 여기서 dsRNA 생성물의 2개의 상보적 가닥은 단일 가닥 링커 또는 루프 영역을 통해 연결되어 하기 실시예 4에서 볼 수 있는 바와 같이 dsRNA 헤어핀 구조를 형성한다.
길이가 'x'인 염기쌍 dsRNA 생성물의 경우, 단일 발현 카세트에서 발현된 dsRNA 헤어핀 생성물의 경우, 헤어핀의 성공적인 합성은 (2x + l) 염기쌍 길이인 DNA 영역을 성공적으로 전사하기 위해 중합효소가 필요하고, 여기서 'l'은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 연결하는 "루프"의 길이이다. 대조적으로, 센스 및 안티센스 가닥이 2개의 개별 발현 카세트와 독립적으로 발현되는 작제물과 비교하여, 각 중합효소 분자는 dsRNA 생성물을 형성하기 위한 혼성화할 수 있는 전장 전사체를 성공적으로 생성하기 위해 길이가 'x' 염기쌍인 DNA만을 전사하면 된다. 중합효소가 과량이고 적절한 ITS의 선택을 통해 효율적인 프로모터 제거가 보장되는 경우 (본원에 설명된 대로), 다중 중합효소 분자는 동시에 및 독립적으로 두 발현 카세트의 프로모터에 결합하고, 반응에서 동시에 발현된 센스 및 안티센스 전사체의 혼성화 시 다량의 dsRNA 생성물을 생성하는 2개의 개별 발현 카세트로부터의 센스 및 안티센스 전사체의 다중 카피를 전사할 수 있다. 대조적으로, 유사한 반응 조건하에서, dsRNA 헤어핀의 발현을 위한 단일 발현 카세트를 갖는 작제물은 헤어핀 루프를 통해 연결된 센스 및 안티센스 전사체를 모두 포함하는 단일 RNA 분자를 전사하기 위한 단지 단일 프로모터의 가용성으로 인해 상대적 수율이 더 낮을 것으로 예상된다. 또한, 높은 비율의 중단 전사를 유발하는 RNA 반응의 경우, 전장 전사체 ('x'에 비해 '2x + l')를 얻기 위해 전사될 DNA 주형의 길이가 증가하면 수율에 추가 영향을 미칠 것으로 예상된다.
본원에 설명된 바와 같이, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 프로모터, 선택적으로 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 관심 서열 (SOI), 및 종결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 ITS_6 공통 ITS, 예를 들어 서열번호: 17에서와 같은 서열에 작동 가능하게 연결된 T7 최소 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사될 SOI는 프로모터 예를 들어, 클래스 III T7 프로모터의 바로 다운스트림에 배치되거나 위치한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 예를 들어 추가의 및 바람직하지 않은 뉴클레오티드를 갖는 RNA 생성물을 야기할 SOI를 넘어 번역 초과 전사를 방지하기 위해, SOI의 다운스트림에 배치된 하나 이상의 종결자 또는 종결 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는, SOI의 다운스트림, 예를 들어 SOI의 바로 다운스트림에 배치되거나 위치되어 DNA 주형이 전사 반응에 사용되기 전에 상응하는 제한 엔도뉴클레아제와 플라스미드 주형의 선형화를 허용한다. 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 SOI와 종결자 사이에 있다. 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 SOI 및 종결자의 다운스트림이다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 관심 서열 (SOI); 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위; 및 종결자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 SOI의 다운스트림에, 선택적으로 SOI와 종결자 사이에 위치한 ITS의 역 상보체인 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 하나의 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 프로모터 및 SOI를 최소한으로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 프로모터 및 SOI를 최소한으로 포함하고, 선택적으로 각각의 발현 카세트는 별개의 SOI를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트는 dsRNA의 센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함하고 그리고 제2 발현 카세트는 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개 초과의 발현 카세트, 예를 들어 3개, 4개 또는 5개의 발현 카세트를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI의 ITS 업스트림에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 그리고 상기 제2 발현 카세트는 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI의 업스트림에 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, ITS는 길이가 1-15개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, ITS는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나이다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하고, 상기 제1 발현 카세트는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI의 업스트림에 있는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 상기 제2 발현 카세트는 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI의 업스트림에 있는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하고, 상기 제1 발현 카세트는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 상기 제2 발현 카세트는 dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하고, 상기 제1 발현 카세트는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, dsRNA의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, SOI, 종결자를 포함하고; 상기 제2 발현 카세트는 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, SOI, 및 종결자를 포함하고; 상기 dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, 2개의 발현 카세트는 이중 가닥 DNA의 동일한 세그먼트의 2개의 상보적 가닥에 의해 인코딩되어 어닐링되어 dsRNA 분자를 생성한다. 일부 구현예에서, RNA의 전사 동안, 중합효소 분자는 2개의 말단에서 프로모터로부터 상보적 가닥의 전사를 개시하고 중합효소는 DNA의 2개의 상보적 가닥을 (예를 들어, 수렴 방식으로) 처음에 횡단하면서 서로를 향해 이동한다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 2개의 발현 카세트를 포함하고, 상기 제1 발현 카세트는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 제1 RNA 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI, 종결자를 포함하고; 상기 제2 발현 카세트는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 제2 RNA 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI, 및 종결자를 포함하고; 상기 dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자 상에서 동일한 방향으로 배향된다 (동일한 DNA 가닥은 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터의 전사 동안 주형 가닥으로서 작용한다). 일부 구현예에서, 제1 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 반대 방향으로 배향된다 (예를 들어, 반대 가닥은 두 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로서 작용한다). 2개의 발현 카세트가 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향되어 있는지 여부에 따라 2개의 독립적인 프로모터로부터 발현을 유도하는 RNA 중합효소는 dsDNA 분자의 동일한 가닥의 동일한 방향으로 (예를 들어, 전사) 또는 두 개의 상이한 DNA 가닥에서 반대 방향으로 이동할 것이다.
일부 구현예에서, 발현 카세트를 사용하여 생성된 RNA 생성물은 r-ITS 및 r-ITS (r-ITC-RC)의 역 상보체에 의해 플랭킹되며, 예를 들어 상기 r-ITS는 RNA 생성물의 5' 말단에 있고 r-ITS의 역 상보체 (r-ITS-RC)는 RNA 생성물의 3' 말단에 있다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 '상보적 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 관심 dsRNA 분자의 발현을 위한 ITS 및 선택적으로 ITS-RC를 포함한다. 일부 구현예에서, 구조적 디자인은 관심 dsRNA 분자의 발현을 위한 ITS, 및 선택적으로 ITS-RC를 각각 포함하는 '상보적 발현 카세트'를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 (센스 가닥 인코딩) 및 제2 발현 카세트 (안티센스 가닥 인코딩)는 dsRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 발현한다. 센스 및 안티센스 가닥은 이중 가닥 DNA의 동일한 세그먼트의 2개의 상보적 가닥에 의해 인코딩되고 어닐링되어 dsRNA 분자를 생성하고, r-ITS (ITS에 상보적임) 및 선택적으로 r-ITC-RC (ITC-RC에 상보적임)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이 구조에서, DNA ITS의 존재 또는 부재하에 관심 서열 (SOI)은 각각의 말단에서, 하나의 프로모터는 원하는 dsRNA 생성물의 센스 가닥의 발현을 구동하고 원하는 dsRNA 생성물의 안티센스 가닥의 발현을 구동하는 다른 프로모터인 2개의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. '상보적 발현 카세트' 디자인의 전사 동안, RNA 중합효소 분자는 두 말단의 프로모터로부터 상보적 가닥의 전사를 개시하고 중합효소는 처음에 DNA의 두 상보적 가닥을 가로지르는 동안 서로를 향해 이동한다(예를 들어, 수렴 방식으로).
다른 구현예에서, 핵산, 예를 들어, 벡터 또는 작제물, 구조적 디자인은 '독립적 발현 카세트' 디자인을 포함하며, 상기 dsRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 발현 카세트는 DNA의 완전히 독립적인 세그먼트에 의해 인코딩되고, 이는 동일한 플라스미드, 선형화된 주형 또는 기타 DNA 작제물에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, '독립적 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자 상에서 동일한 방향으로 배향된다(예를 들어, 동일한 DNA 가닥이 각 발현 카세트의 각각의 프로모터로부터 전사 동안 주형 가닥으로 작용함). 다른 구현예에서, '독립적 발현 카세트' 디자인은 동일한 벡터 또는 DNA 분자의 일부인 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하며, 여기서 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 반대 방향으로 배향된다 (예를 들어, 전사 동안, 주어진 벡터 또는 DNA 분자의 두 개의 반대 가닥은 두 개의 발현 카세트에 대한 주형 가닥으로 작용한다). 2개의 발현 카세트가 주어진 벡터 또는 DNA 분자에서 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향되어 있는지 여부에 따라 2개의 독립적인 프로모터로부터 발현을 구동하는 RNA 중합효소는 dsDNA 분자의 동일한 가닥의 동일한 방향으로 또는 상이한 DNA 가닥에서 반대 방향으로 이동할 수 있다(예를 들어, 전사).
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 서열번호: 1-4 중 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터(서열번호: 38-41에 설명된 바와 같이 A로 돌연변이된 개시 G를 갖는 각각의 대안적인 버전), RNA 생성물 (예를 들어, mRNA)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SOI, 및 종결자 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는 단일 발현 카세트를 포함한다. 다른 구현예에서, 개시 GG는 유사하게 AU로 돌연변이된다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 핵산은 벡터 또는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 벡터 또는 플라스미드는 예를 들어 숙주에서 벡터 또는 플라스미드의 복제를 위해 복제 기점을 필요로 한다. 복제 기점은 플라스미드 카피 수를 정의한다. pUC18 또는 pUC19에서 복제 기점을 갖는 플라스미드는 특정 성장 조건에서 숙주 세포 하에서 높은 카피 수 (500 - 1000 카피/세포)로 유지된다. 일부 구현예에서, 복제 기점은 중간 카피 수 복제 기점, 예를 들어 pETDuet의 ColE1, 높은 카피 수 복제 기점, 예를 들어 pUC18 유래 복제 기점, 또는 낮은 카피 수 복제 기점, 예를 들어, P15A이다. 일부 구현예에서, 이러한 플라스미드를 운반하는 박테리아 세포, 예를 들어 대장균 세포는 단리 및 정제될 수 있는 상당한 양의 플라스미드 DNA를 생성하기 위해 발효에서 높은 세포 밀도로 성장될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 플라스미드는 선택 배지 상에서의 성장 동안 유지를 보장하는 선별 마커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 양성 선별 마커, 예를 들어, 선별 마커를 함유하는 박테리아에 경쟁 우위를 부여하는 단백질 또는 유전자이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 음성 선별 마커, 예를 들어, 선별 마커를 함유하는 박테리아의 성장 및/또는 분열을 억제하는 단백질 또는 유전자이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 혼합된 양성/음성 선별 마커, 예를 들어, 특정 상황 하에서 경쟁 우위를 제공할 수 있고 다른 상황 하에서 성장 및/또는 분열을 억제할 수 있는 단백질 또는 유전자이다. 선별 가능한 마커의 예는 항생제에 대한 내성 또는 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 인코딩하는 유전자 (예를 들어, 암피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자 및 클로람페니콜 저항성 유전자) 또는 기타 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 무항생제 선별 마커이다. 다른 선별 가능한 마커가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥이 2개의 별개의 발현 카세트로부터 발현되는 dsRNA 생성물의 발현을 위한 벡터 또는 플라스미드는 복제 기점 및 선별 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥이 2개의 별개의 발현 카세트로부터 발현되는 dsRNA 생성물의 발현을 위한 벡터 또는 플라스미드는 센스 및 안티센스 가닥, 예를 들어, 각 발현 카세트의 2, 3, 4 또는 5개의 카피를 인코딩하는 발현 카세트의 둘 모두의 다중 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, ssRNA 생성물이 단일 발현 카세트로부터 발현되는 ssRNA 생성물의 발현을 위한 벡터 또는 플라스미드는 복제 기점 및 선별 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, ssRNA 생성물의 발현을 위한 벡터 또는 플라스미드는 ssRNA 생성물을 인코딩하는 동일한 발현 카세트의 다중 카피, 예를 들어 동일한 발현 카세트의 2, 3, 4 또는 5개의 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 제한 효소 인식 부위는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고/되거나 절단된다. 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제는 I-SceI이다. 다른 제한 엔도뉴클레아제가 공지되어 있고 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, TaqI, NotI, HinFI, Sau3AI, PvuII, SmaI, HaeIII, HgaI, AluI, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, SacI, SalI, ScaI, SpeI, SphI, StuI, 및 XbaI, FokI, AscI, AsiAI, NotI, FseI, PacI, SdaI, SgfL, SfiI, PmeI, BspQI, Esp3I, BsmBI, 및 SapI를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 벡터 또는 작제물은 SOI의 다운스트림, 선택적으로 SOI와 종결자 사이에 위치한 ITS의 역 상보체인 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, ITS의 역 상보체는 100% 상보적이다. 일부 구현예에서, ITS의 역 상보체는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상보적이다.
일부 구현예에서, 핵산 작제물 (예를 들어, 플라스미드 작제물)은 숙주 미생물 세포에서 핵산 작제물 (예를 들어, 플라스미드 DNA)의 복제를 허용하는 최소 단위 또는 요소로 정의되는 레플리콘을 포함한다. 일부 구현예에서, 레플리콘은 핵산 작제물 (예를 들어, 플라스미드 DNA)의 복제가 개시되는 복제 기점 (ori) 및 핵산 작제물 (예를 들어, 플라스미드) 및 숙주세포에서 이의 카피 수를 제어하는 추가 요소를 포함한다. 핵산 작제물이 플라스미드 DNA 작제물인 구현예에서, 플라스미드 DNA의 복제는 숙주의 DNA 복제 기구에 의해 복제 기점에서 개시된다. 복제의 일부 비제한적인 예에는 박테리아 숙주 (예를 들어, 대장균)에서 플라스미드 복제를 허용하는 복제, 예컨대 ColE1 플라스미드, pBR322 플라스미드 (pMB1 복제 기점), pUC18 및 pUC19 플라스미드 (pUC 레플리콘, pMB1 레플리콘의 유도체를 운반하는), R6K 플라스미드, p15A 플라스미드, pSC101 플라스미드 등에서 발견되는 복제가 포함된다. 레플리콘이 상이하면 주어진 숙주에서 플라스미드에 대한 카피 수와 수율이 상이하다. 예를 들어, ColE1 및 pMB1 기점은 일반적으로 각 세포에서 약 15 - 20개의 플라스미드 분자 카피를 유지하도록 허용하는 반면, pUC18- 또는 pUC19- 유래 플라스미드에서 발견되는 pUC 레플리콘을 운반하는 플라스미드의 경우 세포당 500 - 1000개 카피까지 pMB1 기점에서 rop 유전자의 결실 및 2개의 점 돌연변이는 카피 수의 온도 유도성 증폭을 초래한다. 또한 진핵 미생물 세포 (예를 들어, 효모)에 사용되는 플라스미드는 복제가 개시되는 레플리콘으로 '자율 복제 서열 (ARS)'을 수행한다. 일부 구현예에서, 레플리콘은 복제의 기점으로 최소한으로 이루어진다.
키트
본 개시내용의 일부 양태는 키트를 제공한다. 키트는 예를 들어, 본원에 설명된 조작된 핵산 또는 작제물, 중합효소, 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 뉴클레오시드 모노포스페이트를 포함할 수 있다.
본원에 설명된 키트는 성분 및 선택적으로 사용 지침을 수용하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 연구용 키트에는 다양한 실험을 실행하기 위한 적절한 농도 또는 양의 성분이 함유될 수 있다. 본원에 설명된 임의의 키트는 본원에 설명된 임의의 방법을 수행하는 데 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
적용 가능한 경우 키트의 각 성분은 액체 형태 (예를 들어, 용액) 또는 고체 형태 (예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에, 일부 성분은 예를 들어 적절한 용매 또는 다른 종 (예를 들어, 물 또는 특정 유기 용매)의 첨가에 의해 동결건조, 재구성 또는 가공 (예를 들어, 활성 형태)될 수 있고, 키트와 함께 제공되거나 제공되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 제공된 성분의 사용에 대한 지침 및/또는 판촉을 포함한다. 지침은 지침 및/또는 판촉의 성분을 정의할 수 있으며, 일반적으로 본 개시내용의 패키징에 관한 또는 이와 관련된 서면 지침을 포함한다. 지침은 또한 사용자가 지침이 키트, 예를 들어, 시청각 (예를 들어, 비디오 테이프, DVD 등), 인터넷 및/또는 웹 기반 통신 등과 연관되어야 함을 명확하게 인식할 수 있도록 어떤 방식으로든 제공되는 구두 또는 전자 지침을 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의 용기에 본원에 설명된 성분 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 성분은 무균 상태로 준비되고 주사기에 포장되어 냉장 배송될 수 있다. 대안적으로, 저장을 위해 바이알 또는 기타 용기에 수용할 수 있다. 제2 용기에는 멸균 상태로 제조된 다른 성분이 있을 수 있다. 대안적으로, 키트는 바이알, 관 또는 기타 용기에 미리 혼합되어 배송된 활성제를 포함할 수 있다.
키트는 또한 특정 용도에 따라 다른 성분, 예를 들어 용기, 세포 배지, 염, 완충제, 시약, 주사기, 바늘, 일회용 장갑 등을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 시험관 내 전사 (IVT) 반응을 사용하여 상이한 ITS 변이체를 갖는 선형 DNA 주형으로부터 dsRNA의 생성
601-염기 쌍 dsRNA인 GS1은 발현될 관심 서열 (GS1 센스 및 GS1 안티센스 가닥)의 바로 업스트림에 배치된 상이한 ITS 변이체 (표 3에 나타낸 바와 같음)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 선형 DNA 주형을 사용하여 완충액에서 시험관 내 전사 (IVT) 반응에서 생성되었다. IVT 반응에서 합성된 각 GS1 가닥은 상이한 ITS 변이체에 상응하는 5' 단일 가닥 r-ITS 오버행을 포함한다. 특정 ITS가 없는 DNA 템플릿 (ITS_없음)은 실험에서 대조군으로 사용되었다. 각 ITS 변이체 및 대조군에 대해 2개의 DNA 주형이 이용되었으며, 그 중 하나는 GS1의 센스 가닥을 인코딩하는 관심 서열 (SOI)을 포함하고 다른 하나는 GS1의 안티센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 도 2는 발현 카세트 및 예상되는 dsRNA 생성물 (5' 단일 가닥 r-ITS 오버행을 포함)이 있는 선형 DNA 주형의 일반적인 구조를 나타낸다.
표 3: 실시예 1에서 사용하기 위한 ITS 변이체
*이 주형에서 각 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 T7 박테리오파지 게놈에 고유한 30bp의 DNA 서열을 갖는 17bp 최소 클래스 III T7 프로모터를 포함하는 47bp 확장 T7 프로모터 (즉, 서열번호: 18)이고, 자연스럽게 이의 업스트림에서 발견되었다. 굵게 강조 표시된 것은 최소 T7 클래스 III 프로모터이며 그 뒤에 이탤릭체로 된 특정 ITS 변형이 있다.
각 IVT 반응은 45mM 황산마그네슘, 2mM 스페르미딘, 4개의 표준 NTP (New England Biolabs, Ipswich, MA) 각각의 4mM, 재조합 열안정성 돌연변이 T7 RNA 중합효소 0.1 mg/mL, 0.04 U/μL의 열안정성 무기 피로포스파타제 (TIPP)(New England Biolabs, Ipswich, MA) 및 두 DNA 주형 (각각 GS1의 센스 및 안티센스 가닥을 인코딩) 각각 20 ng/μL을 포함했다. 반응은 48℃에서 2시간 동안 진행되었다. 2시간 후, RNA 생성물을 분리하고 하기에 설명된 바와 같이 역상 이온쌍 (RP-IP) 크로마토그래피를 사용하여 정량화하였다.
RP-IP HPLC 분석을 위해 각 반응에서 샘플을 채취하고 고체상 추출을 사용하여 샘플에서 전체 RNA를 추출했다. 추출된 dsRNA 샘플을 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템에서 RP-IP-HPLC로 분석했다. HPLC 분석은 표 4 (유속 0.85 mL/분)와 같이 구배 분리되어 50℃의 온도에서 유지되는 DNASep® 카트리지 (4.6 x 50mm, ADS Biotec, PN: DNA-99-3501)를 사용하여 수행되었다. 신호는 260 nm에서 흡광도로 측정되었다.
표 4: RP-IP HPLC 구배
도 5에 나타낸 바와 같이, 표 3의 ITS (ITS_6, pT7-g10; pT7-g5; 및 GL-하이브리드_A9) 중 하나를 포함하는 모든 주형은 2000 - 2800 ng/μL 사이의 발현 수준으로 IVT 반응에서 높은 수율의 dsRNA 생성물이 제공되었다. GL-하이브리드_A9 ITS는 합성된 GS1의 약 2800 ng/μL와 함께 GS1 dsRNA의 가장 높은 발현 수준을 초래했다. 예상대로, 특정 ITS가 없는 DNA 주형 (ITS_없음)은 dsRNA 생성물의 검출 가능한 발현을 생성하지 않았고; 이 DNA 주형에는 전사에 중요한 것으로 공지된 최소 클래스 III T7 프로모터의 끝에 말단 'G'가 없다.
실시예 2: 무세포 RNA 합성 반응을 사용하여 상이한 ITS 변이체를 갖는 선형 DNA 주형으로부터 dsRNA의 생성
GS1 dsRNA 생성물(5' 오버행 포함)은 발현될 SOI (GS1 센스 및 GS1 안티센스 가닥)의 업스트림에 위치한, 다양한 ITS 변이체에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 선형 DNA 주형을 사용하여 무세포 반응으로 생성되었다 (표 3에 나타남). ITS가 없는 DNA 템플릿 (ITS_없음)은 실험에서 대조군으로 사용되었다. 실시예 1에서와 같이, 각각의 ITS 변이체 및 대조군에 대해, 도 2에 나타난 바와 같은 2개의 DNA 주형이 이용되었으며, 그 중 하나는 GS1의 센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함하고 다른 하나는 GS1의 안티센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 추가로, 단일 가닥 오버행이 없는 GS1 dsRNA 생성물도 도 3에 나타난 바와 같이 SOI 다운스트림에 해당하는 ITS의 역 상보체를 추가로 포함하는 도 3에 따른 DNA 주형을 사용하여 생성되었다.
상업적 공급원에서 얻은 효모 RNA 분말을 56 g/L의 물에 용해시키고 0.05 mM 염화아연의 존재 하에 70℃, pH 5.5에서 1.2 g/L P1 뉴클레아제를 사용하여 단량체로 분해시켰다(depolymerized). 생성된 단량체로 분해된 물질을 원심분리에 의해 정화하고 10 kDa MWCO 필터를 사용하여 여과하였다. 생성된 스트림은 약 90 내지 100 mM(AMP, CMP, GMP 및 UMP 각각의 약 20 내지 25 mM)의 총 농도에서 5' 뉴클레오티드 모노포스페이트 (NMP)를 함유하였다.
개별 키나아제 효소 (TthCmk, PfPyrH, TmGmk, AaNdk 및 DgPPK2)를 인코딩하는 pBAD24 유래 벡터를 운반하는 대장균 BL21 (DE3) 유도체를 대장균의 높은 세포 밀도 배양을 위한 표준 기술 및 단순 유가 배양(fed-batch)을 사용하여 50 mg/L 카르베니실린이 보충된 Korz 배지로 발효 배양했다. 그런 다음 L-아라비노스를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 박테리아를 수확한 후, 고압 균질화를 사용하여 60 mM 포스페이트 완충액에서 용해물을 제조하여 대략 40 g/L 총 단백질의 혼합물을 생성했다.
열안정성 T7 RNA 중합효소 효소를 인코딩하는 pBAD24 유래 벡터를 운반하는 대장균 BL21 (DE3) 유도체를 배양하고, L-아라비노스를 사용하여 단백질 발현을 유도하고, 전술한 바와 같이 용해물을 제조하였다. 중합효소 효소는 황산암모늄 분획의 2단계를 사용하여 부분적으로 정제되었다.
무세포 반응을 조립하기 위해, 키나아제 효소를 함유하는 용해물을 동일한 비율로 조합하고, 2 g/L의 최종 총 단백질 농도로 희석하고, 반응 첨가제 (45 mM 황산마그네슘 및 13 mM 헥사메타인산나트륨)와 혼합하였다. 용해물을 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 과발현된 키나아제의 활성을 보존하면서 다른 효소 활성을 비활성화했다. 또한, 효모 유래 NMP를 각각 약 4 mM의 농도로 첨가하고, 0.1 mg/mL의 재조합 열안정성 돌연변이 T7 RNA 중합효소를 2개의 선형 DNA 주형 (각각 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥을 표현하는) 각각의 10 ng/μL과 함께 첨가하였다. 무세포 반응을 48℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 RNA 생성물을 단리하고 실시예 1에 설명된 바와 같이 RP-IP HPLC를 사용하여 정량화하였다.
도 6A에서 도시된 바와 같이, ITS를 포함하는 모든 주형은 적어도 ~1800 ng/μL 수준의 RNA를 생성했으며, GL-하이브리드_A9 ITS는 GS1 dsRNA (5' r-ITS 오버행 포함)의 최고 발현 수준 (~2500ng/μL)을 생성했다. 예상대로 ITS_없음 변이체는 생성물 합성을 다시 나타내지 않았지만 T7 게놈에서 
6.5, 
10 및 
13 유전자 앞에 자연적으로 발견된 ITS_6 변이체는 ~1800 ng/μL의 역가를 초래했다.
도 6b에 도시된 바와 같이, SOI 다운스트림의 ITS의 역 상보체를 인코딩하는 주형은 ITS의 역 상보체가 없는 것과 유사하게 수행된다. GL-하이브리드_A9 ITS를 포함하는 주형은 ~2500 ng/μL dsRNA를 보여주었다.
종합적으로 이러한 결과는 GL-하이브리드_A9 ITS 변이체가 T7 게놈에서 
6.5, 
10 및 
13 유전자보다 먼저 발견되는 자연 발생 공통 ITS_6 변이체보다 더 높은 수준의 RNA 생성물을 생성함을 시사한다.
실시예 3: 5개의 상이한 SOI에 대한 GL-하이브리드_A9 ITS를 사용한 선형 DNA 주형으로부터 dsRNA의 생성
5개 다른 dsRNA 생성물 (GLSeq-A, GLSeq-B, GLSeq-C, GLSeq-D & GLSeq-E)의 생성은 DNA 주형에서 GL-하이브리드_A9 ITS를 사용하여 달성한 RNA 합성의 이점을 입증하기 위해 평가되었다. 이 연구의 대조군으로, 전사에 중요한 것으로 알려진 최소 클래스 III T7 프로모터의 말단에 2개의 G를 도입하는 ITS_2 ITS가 있는 주형을 사용했다. ITS_2에 작동 가능하게 연결된 T7 클래스 III 최소 프로모터는 서열 TAATACGACTCACTATAGG(서열번호: 36)를 포함한다. 또한, 이중 가닥 DNA ('독립적 발현 카세트' 구조 디자인)의 개별 세그먼트에 인코딩된 2개의 독립적인 발현 카세트로부터의 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현은 DNA의 동일한 세그먼트의 2개의 상보적 가닥에 의해 인코딩되는 발현 카세트로부터의 발현에 비해 도 4에 도시된 바와 같이 3개의 상이한 DNA 주형 구조를 사용하여 5개의 SOI 모두에 대해 결정되었다: (a) ITS_2를 사용한 '상보적 발현 카세트' 디자인; (b) GL-하이브리드_A9 ITS를 사용한 '상보적 발현 카세트' 디자인; 및 (c) GL_하이브리드_A9 ITS를 사용한 '독립적 발현 카세트' 디자인.
2개의 '상보적 발현 카세트' 디자인 (a) 및 (b)의 경우, dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥을 인코딩하는 2개의 발현 카세트가 프로모터가 배향된 이중 가닥 DNA 주형의 2개의 상보적 가닥에 있었고, dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥이 반대 방향으로 2개의 상보적 가닥을 전사하는 T7RNAP에 의해 전사되도록 하였다는 점에 유의한다. '독립적 발현 카세트' 디자인 (c)은 실시예 1 및 2에 설명된 주형과 유사하고 2개의 독립적인 선형 DNA 주형으로부터 2개의 발현 카세트로부터 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 포함한다. 구조 (a)가 있는 주형은 T7 최소 클래스 III T7 프로모터 (서열번호: 9)를 사용하는 반면 구조 (b) 및 (c)가 있는 주형은 확장된 47 염기쌍 T7 프로모터 (서열번호: 18)를 사용했다. 따라서, 주어진 생성무에 대해 주형 구조 (a) 및 (b)를 사용한 dsRNA 생성의 비교는 최소 클래스 III T7 프로모터가 있는 ITS_2 변이체와 비교하여 확장된 T7 프로모터가 있는 GL-하이브리드_A9 ITS를 사용하는 효과를 나타낸다. (b) 와 (c)의 비교는 '상보적 발현 카세트' 구조와 비교하여 '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하는 효과를 나타낸다.
각 dsRNA 생성물 (GLSeq-A, GLSeq-B GLSeq-C, GLSeq-D 및 GLSeq-E)을 인코딩하는 상이한 SOI (길이가 최대 600bp 범위)와 조합된 각 핵산 구조는 NTP를 사용한 전사 반응에서 평가되었다. 무세포 반응은 15 mM 황산마그네슘, 2 mM 스페르미딘, 3.5 mM 헥사메타인산나트륨 및 10 mg/mL 농도의 총 단백질 농도에서 5가지 키나아제를 함유하는 용해물의 혼합물을 포함하는 실시예 2에 설명된 것과 유사했다. 다만, 실시예 2와 달리, 효모 유래 NMP 대신에 각 NTP의 4 mM 농도의 NTP를 사용하였다. 각 SOI에 대해 50 ng/μL의 'ITS_2를 갖는 상보적 발현 카세트 디자인' 또는 'GL_하이브리드_A9 ITS를 갖는 상보적 발현 카세트 디자인' DNA 주형이 반응 혼합물에 추가되었다. 각 SOI에 대해 'GL-하이브리드_A9 ITS를 갖는 독립적 발현 카세트 디자인' 디자인에서 2개의 DNA 주형 (하나는 센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함하고; 다른 하나는 안티센스 가닥을 인코딩하는 SOI를 포함함)을 각각의 50 ng/μL의 농도로 반응에 추가했다. 마지막으로, 전사를 개시하기 위해, 재조합 열안정성 T7 RNA 중합효소 돌연변이를 0.3 mg/mL의 농도로 첨가하였다. 실시예 1에 설명된 바와 같이 RNA 생성물을 단리하고 RP-IP HPLC를 통해 분석하기 전에 반응을 48℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
각 SOI에 대한 dsRNA 생성물의 생성은 'ITS_2를 갖는 상보적 발현 카세트'를 포함하는 주형에 비해 'GL-하이브리드_A9를 갖는 상보적 발현 카세트' 디자인을 포함하는 DNA 주형으로부터 전사될 때 증가되었다 (도 7b). GL-하이브리드_A9 ITS를 DNA 주형에 통합하면 GS1에서 나타난 바와 같이 각각의 SOI에 대한 dsRNA 생성물 역가가 일관되게 증가했다 (실시예 1-3). 특히, 개선 정도는 SOI에 따라 다르다 (대략 2 내지 36배 범위). 'ITS_2를 갖는 상보적 발현 카세트' 디자인(도 7a)을 갖는 DNA 주형으로부터 발현에서 5개의 상이한 SOI에 대해 달성된 dsRNA 역가에 큰 변동이 있었다. 반대로, '상보적 발현 카세트' 또는 '독립적 발현 카세트' 디자인에 GL-하이브리드_A9를 통합하면 5개 SOI 모두에 대해 일관되게 유사한 dsRNA 역가가 나타났다.
각 RNA 생성물의 생성은 'GL-하이브리드_A9를 갖는 상보적 발현 카세트'를 포함하는 주형에 비해 'GL-하이브리드_A9를 포함하는 독립적 발현 카세트' 디자인을 포함하는 DNA 주형에서 전사될 때 증가되었다 (도 7c). GL-하이브리드_A9 ITS를 사용하는 주형의 경우, '상보적 발현 카세트' 디자인에 비해 '독립적인 발현 카세트' 디자인 (상대 RNA 역가의 1.2-2.3배 증가)으로 주형을 전사할 때 5개 dsRNA SOI 생성물 모두 더 높은 발현 수준으로 생성되었다.
GL-하이브리드_A9 ITS를 SOI의 업스트림에 있는 DNA 주형에 통합하고 '독립적 발현 카세트' 디자인으로부터 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥을 발현시키는 전체적인 효과는 도 7d에 제공된다. ITS_2를 갖는 상보적 발현 카세트 디자인에서 GL-하이브리드_A9 ITS를 갖는 독립적 발현 카세트 디자인으로 전환할 때 RNA 역가의 총 배수 개선은 대략 2배 내지 70배 사이의 범위다.
실시예 4: '독립적 발현 카세트' 구조 및 헤어핀 구조를 사용하는 플라스미드 DNA 주형으로부터 GLSeq-A dsRNA 변이체 생성의 비교
2개의 상이한 플라스미드 DNA 주형을 사용한 GLSeq-A dsRNA의 생성은 무세포 및 IVT 반응을 사용하여 비교되었다.
플라스미드 작제물-1은 GLSeq-A dsRNA 분자의 2개 가닥의 발현을 위한 2개의 개별 발현 카세트로 구성되었으며, 각각의 발현 카세트는 GL-하이브리드_A9 ITS에 작동 가능하게 연결된 연장된 47 bp T7 프로모터 (서열번호: 18)로 구성되었고, GLSeq-A의 센스 또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 DNA 주형 (SOI) 및 종결자 18(서열번호: 20)을 포함하는 다운스트림 종결자의 업스트림에 위치하였다.
플라스미드 작제물-2는 센스 및 안티센스 가닥이 단일 가닥 링커 루프에 의해 연결된 GLSeq-A dsRNA 분자의 헤어핀 변이체의 발현을 위한 단일 발현 카세트로 구성되었다. 단일 발현 카세트는 GL-하이브리드_A9 ITS에 작동 가능하게 연결된 확장된 47 bp T7 프로모터로 구성되었고 GLSeq-A의 안티센스 가닥을 인코딩하는 DNA 주형 (SOI), 헤어핀의 단일 가닥 루프 영역을 인코딩하는 DNA 서열, GLSeq-A의 센스 가닥을 인코딩하는 DNA 주형 (SOI), 및 종결자 18(서열번호: 20)을 포함하는 다운스트림 종결자의 업스트림에 위치하였다.
각각의 플라스미드 작제물은 NTP 또는 효모 유래 NMP를 기질로 사용하여 실시예 3에 설명된 것과 유사한 무세포 반응에서 평가하였다. 2개의 플라스미드 작제물 각각을 사용하여 dsRNA 생성을 비교할 때, 각 반응에서 플라스미드의 농도는 전사를 유도하는 프로모터의 수와 거의 동일한 수를 달성하도록 조정되었다. 따라서, 플라스미드 작제물-1은 ~ 60 ng/μL의 농도로 사용되었고 플라스미드 작제물-2는 ~ 100 ng/μL의 농도로 사용되었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 센스 및 안티센스 가닥을 인코딩하는 2개의 독립적인 발현 카세트로부터의 GLSeq-A dsRNA 생성물의 발현은 단일 발현 카세트로부터 헤어핀 GLSeq-A dsRNA 생성물로서의 발현과 비교하여 IVT 및 무세포 반응 모두에서 dsRNA 역가에서 약 2배 개선을 초래하였다.
실시예 5: 상이한 종결자 작제물을 사용한 번역 초과 및 종결 효율성 평가
표 2에 설명된 종결자의 조합은 시험관 내 전사 반응에서 GL-하이브리드_A9 ITS에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터에 의해 구동되는 ssRNA 생성물의 합성 양태에서 평가되었다. 종결자(들)는 115 bp SOI의 다운스트림에 배치되었다(여기서 SOI의 전사는 15 bp GL-하이브리드_A9 ITS에 작동 가능하게 연결된 47 bp 확장된 T7 프로모터에 의해 구동됨). 따라서 시험 중인 종결자 조합에서 첫 번째 종결자에 의한 종결은 길이가 대략 115개 뉴클레오티드인 생성물을 생성한다. 번역 초과는 사용된 종결자의 특정 조합과 종결 위치에 따라 115 내지 912개 뉴클레오티드 길이 범위의 생성물 분포를 초래할 것으로 예상된다. 이 실시예에서 사용된 정확한 작제물은 도 8a에 제시되어 있다.
이러한 다양한 변이체는 5' 뉴클레오티드 트리포스페이트를 기질로 사용하여 시험관 내 전사 반응에서 평가되었다. 반응 혼합물은 45 mM 황산마그네슘, 2 mM 스페르미딘, 4개의 NTP (New England Biolabs, Ipswich, MA) 각각의 0.5, 2, 4 또는 8 mM, 열안정성 T7 RNA 중합효소 돌연변이 0.3 mg/mL로 구성되었다. 50 ng/μL의 DNA 주형 (특정 종결자 또는 종결자의 조합 함유함)을 각 반응에 추가했다. 반응을 48℃에서 2시간 동안 실행하고 후속 RNA 생성물을 분리하고 RP-IP HPLC를 사용하여 정량화했다.
각각의 종결자 또는 종결자의 조합에 대해, 실시예 1에 설명된 바와 같이 IVT 반응에서 합성된 상이한 ssRNA 생성물을 RP-IP HPLC를 사용하여 분리하였다. 도 8b는 상이한 종결자 작제물에 대한 크로마토그램을 보여준다. 통과율 (% 역전사)은 곡선 아래에서(표 5) 총 피크 면적의 백분율로 표시되는 생성물 피크 (모든 종결자 판독을 통한 중합효소의 결과로 관찰된 크로마토그램의 최종 피크)에 대한 피크 면적으로 계산되었다. 종결자 26, 종결자 34 및 종결자-쿼드는 가장 높은 종료 정도와 가장 낮은 % 역전사 값을 보여준다. 특히, 모든 종결자는 2 mM, 4 mM 또는 8 mM NTP를 포함하는 반응에서 비슷한 수준으로 수행되었다 (도 8c).
표 5: 다양한 종결자 작제물에 대한 % 역전사
100% 효율적인 종결은 길이가 약 115개 뉴클레오티드인 ssRNA 생성물을 생성할 것으로 예상되었다. 번역 초과는 종결 부위와 사용된 종결자의 특정 조합에 따라 길이가 115 - 912개의 뉴클레오티드 사이의 생성물 분포를 초래할 것으로 예상되었다. 예를 들어, PTH와 T7 종결자의 조합을 포함하는 이중 종결자 (종결자 18)의 경우 종결자에서 또는 PTH 종결자 내에서 약 115 - 125개 뉴클레오티드 길이의 생성물이 생성될 것으로 예상된다 (PTH 종결자가 SOI의 바로 다운스트림에 위치하며 자체 길이가 약 10개 뉴클레오티드로 주어짐). 그러나 PTH 종결자가 종결에 실패하고 T7 종결자에서 종결이 발생하는 것으로 관찰되는 경우, 크기가 137 내지 221개 뉴클레오티드인 ssRNA 생성물이 생성된다 (84 bp 길이의 T7 종결자 내 위치에 따라 종결이 발생한다). 마지막으로, T7 RNA 중합효소가 PTH와 T7 종결자를 모두 읽는 경우 생성된 ssRNA 생성물은 721개 뉴클레오티드 길이가 될 것으로 예상된다.
DNA 주형을 사용한 반응에서 얻은 ssRNA 생성물은 종결자 18, 종결자 26, 종결자 34 및 종결자-쿼드 모두가 50% 미만의 % 역전사를 보여 50% 이상의 전체 종결 효율을 제공하는 것으로 나타났다. 특히, 종결자 26, 종결자 34, 종결자-쿼드는 높은 종결 효율 (65-70%)을 제공했다.
실시예 6: GL-하이브리드_A9 ITS를 사용한 선형 DNA 주형 및 플라스미드 작제물 (pGLA583 & pGLA584)로부터 dsRNA의 생성.
GS4 dsRNA 생성물의 발현을 위한 플라스미드 DNA 주형이 디자인되었다. GS4는 554 bp 길이의 dsRNA 분자로, 524개의 염기쌍 관심 RNA 생성물을 포함하며, GL-하이브리드_A9 r-ITS와 GL-하이브리드_A9 (r-ITS-RC)의 역 상보체에 의해 플랭킹된 녹생 형광 단백질 (GFP) 유전자의 일부를 인코딩한다. '독립적 발현 카세트' 구조를 갖는 플라스미드 DNA 주형 (pGLA583 및 pGLA584)은 2개의 개별 발현 카세트로부터 GS4의 센스 및 안티센스 가닥을 발현하도록 디자인되었다 (도 4 참조). 이들 발현 카세트 각각은 GL-하이브리드_A9 ITS에 작동 가능하게 연결된 연장된 T7 프로모터 (서열번호: 18), GS4 SOI (센스 또는 안티센스 가닥), GL-하이브리드_A9 ITS의 역 상보체 (ITS-RC) 및 2개의 종결자 (종결자 18(서열번호: 20))를 포함했다. pGLA583 및 pGLA584 플라스미드 모두 항생제 내성 마커 (암피실린/카르베니실린에 대한 내성을 부여하는 구성적 프로모터가 앞에 오는 bla 유전자) 및 복제 기점을 추가로 포함했다. pGLA583은 pETDuet 벡터에서 유래된 pBR322 복제 기점이 있는 중간 카피 수 플라스미드이고; pGLA584는 돌연변이된 pBR322 복제 기점을 갖는 높은 카피 수 플라스미드이다 (도 9).
추가로, GL-하이브리드_A9 r-ITS 및 이의 역 상보체에 상응하는 서열에 의해 플랭킹된 GS4 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 발현 카세트를 인코딩하는 2개의 선형 DNA 주형을 디자인했다.
무세포 반응에서 GS4 dsRNA를 생성하는 2개의 플라스미드 및 선형 주형의 능력을 시험했다. 키나아제 효소를 함유하는 세포 용해물 (실시예 2에 설명된 바와 같이 제조됨)을 동일한 비율로 조합하고, 1.75g/L의 최종 총 단백질 농도로 희석하고, 반응 첨가제 (45 mM 황산마그네슘 및 13 mM 헥사메타인산나트륨)와 혼합하였다. 용해물을 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 과발현된 키나아제의 활성을 보존하면서 다른 효소 활성을 비활성화했다. 마지막으로, 각각 대략 7-8 mM 농도의 NMP (세포 효모 RNA의 해중합에 의해 유도됨)와 열안정성 T7 돌연변이 RNA 중합효소 0.1 mg/mL를 (A) 10 ng/μL의 두 선형 DNA 주형 (각각 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥을 표현) 또는 (B) 120 ng/μL의 플라스미드 DNA 주형 (pGLA583 또는 pGLA584)에 첨가했다. 무세포 반응을 48℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 후속 RNA 생성물을 분리하고 RP-IP HPLC를 사용하여 정량화했다.
각각의 DNA 주형으로부터 dsRNA 생성물의 높은 발현 수준이 관찰되었다 (도 10). 선형 DNA 템플릿은 ~2100 ng/μL를 생성했고; 2개의 플라스미드 주형 (pGLA583 및 pGLA584)은 각각 더 높은 수준을 생성했으며 pGLA583은 ~2500 ng/μL을 생성했다.
실시예 7: '독립적 발현 카세트' 대 '상보적 발현 카세트' 구조를 사용하는 플라스미드 주형을 사용한 dsRNA 생성물의 생성
무세포 반응에서 두 가지 다른 dsRNA 생성물 (GS1 및 GS4)의 생성은 dsRNA 생성물 (플라스미드 작제물-3: dsRNA의 발현을 위한 '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하는 플라스미드 DNA 주형 및 플라스미드 작제물-4: dsRNA 발현을 위한 '상보적 발현 카세트' 디자인을 사용하는 플라스미드 주형)의 생성을 위해 두 가지 상이한 구조를 사용하는 두 가지 유형의 플라스미드 주형을 사용하여 비교되었다. '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하는 플라스미드 주형은 도 13a에 도시된 바와 같이 동일한 플라스미드에서 각각 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 2개의 개별적인 DNA 세그먼트에 의해 인코딩된 2개의 개별 발현 카세트를 보유하고, 복제 및 선별 마커에 의해 분리된다. 반면에 '상보적 발현 카세트' 구조를 사용하는 플라스미드 주형은 도 13b에 도시된 바와 같이 주어진 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 발현 카세트를 인코딩하는 DNA 세그먼트의 상보적 가닥이 있는 DNA 세그먼트를 운반하였다. 두 구조 모두에서, 원하는 dsRNA 생성물의 각 가닥을 발현하기 위해 GL-하이브리드_A9 ITS와 함께 확장된 T7 프로모터 (서열번호: 18)를 사용했다.
dsRNA 생성을 위한 무세포 반응은 '독립적 발현 카세트' 또는 '상보적 발현 카세트' 구조를 사용하는 60-100ng/μL의 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 실시예 2에 설명된 대로 준비되었다. 도 14에서 관찰된 바와 같이, '독립적 발현 카세트' 구조 (플라스미드 작제물-3)를 사용하는 플라스미드로부터의 2개의 개별 발현 카세트로부터의 dsRNA 생성물의 센스 및 안티센스 가닥의 독립적인 발현은 '상보적 발현 카세트' 구조 (플라스미드 작제물-4)를 사용하는 DNA 주형의 동일한 dsRNA 생성물의 발현과 비교된다.
실시예 8: 상이한 ITS를 운반하는 발현 카세트와 함께 '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하는 플라스미드 주형을 사용한 dsRNA 생성물의 생성
5개의 상이한 플라스미드 DNA 주형으로부터의 무세포 반응에서의 GS1 dsRNA 생성물의 생성을 비교하였고, 여기서 5개의 플라스미드는 모두 도 13a에 나타낸 바와 같이 '독립적 발현 카세트' 구조를 사용하였고 각각의 플라스미드에서 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 발현 카세트에 사용된 ITS가 상이하였다. 센스 및 안티센스 가닥의 발현을 위한 각각의 발현 카세트에서, 47 bp 연장된 T7 프로모터 (서열번호: 18)는 표 6에 나타낸 5개의 상이한 ITS 중 하나에 작동 가능하게 연결되었다.
표 6: 실시예 8에서 사용하기 위한 ITS 변이체
도 15에 도시된 바와 같이, GL-하이브리드_A9 ITS는 T7 박테리오파지 게놈 뿐만 아니라 다른 더 짧은 ITS에서 자연적으로 발견되는 공통 ITS_6에 비해 dsRNA 합성에서 1.9배 개선을 가져왔다.
실시예 9. A-개시를 포함하는 ITS는 공동-전사 캡핑 시약을 사용하여 높은 역가 및 순도로 캡핑된 RNA를 생성한다.
한 쌍의 mRNA 분자는 무세포 반응에서 디자인되고 생성되었다. 두 분자 모두 5' ITS GL-하이브리드_A9(A 개시)(AGGAGACCAGGAATT(서열번호: 38))를 포함하는 유사한 서열 구조로 이루어졌다. mRNA 서열은 5' 말단의 T7 프로모터 및 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위와 함께 pUC-19 유래 플라스미드 주형 상에 인코딩되었다. 플라스미드를 대장균 균주 DH10b에서 증식시키고, Plasmid Giga Kits(Qiagen)로 정제하고, Esp3I 제한 엔도뉴클레아제 (New England Biolabs)로 분해하여 선형화하고, 그리고 페놀-클로로포름 추출로 추가 정제했다. RNA 합성 반응은 PCT/US2020/025824에 설명된 바와 같이 무세포 생성 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 캡핑된 RNA를 생성하는 반응에는 CleanCap AG 시약 (TriLink Biotechnologies)도 포함되었다. DNase I 처리로 주형 DNA를 제거한 후, 염화리튬 침전에 의해 RNA를 회수하였다. 회수된 RNA를 260nm에서 UV 흡광도로 정량화하고 2100 BioAnalyzer 기기 (Agilent Technologies)를 사용하여 크기와 품질을 분석했다.
도 16에 도시된 바와 같이, CleanCap AG 및 AG ITS(GL-하이브리드 A9(A 개시), 서열번호: 38)를 사용하여 캡핑된 RNA를 생성하는 무세포 반응은 GG ITS (GL-하이브리드_ A9, 서열번호: 1)를 사용하여 캡핑되지 않은 RNA를 생성하는 반응과 유사한 역가를 달성했다(도 16a). BioAnalyzer에 의한 분석은 두 반응 모두로부터의 RNA 생성물이 예상된 크기 및 유사한 순도임을 입증했다(도 16b).
실시예 10. 상이한 단백질을 인코딩하는 mRNA의 ITS는 일관된 생성 역가 및 분자 품질을 초래한다.
mRNA 분자 패밀리는 무세포 반응에서 디자인되고 생성되었다. 실시예 9에서와 같이, 서열은 5' ITS GL-하이브리드_A9 (A 개시)(AGGAGACCAGGAATT(서열번호: 38))를 포함하였다. RNA 합성 반응은 PCT/US2020/025824에 설명된 바와 같이 무세포 생성 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 캡핑된 RNA를 생성하는 반응에는 5mM CleanCap AG 시약(TriLink Biotechnologies)도 포함되었다. 플라스미드를 대장균 균주 DH10b에서 증식시키고, Plasmid Giga Kits(Qiagen)로 정제하고, Esp3I 또는 BspQI 제한 엔도뉴클레아제(New England Biolabs)로 분해하여 선형화하고, 그리고 페놀-클로로포름 추출에 의해 추가로 정제했다. DNase I 처리로 주형 DNA를 제거한 후, 염화리튬 침전에 의해 RNA를 회수하였다. 회수된 RNA를 260nm에서 UV 흡광도로 정량화하고 Fragment Analyzer 기기(Agilent Technologies)를 사용하여 크기 및 품질을 분석했다.
도 17에 나타난 바와 같이, CleanCap AG 및 AG ITS를 사용하여 캡핑된 RNA를 생성하는 무세포 반응은 다중 오픈 리딩 프레임 서열에 걸쳐 일관된 역가를 생성하였다(도 17a). 이러한 반응의 RNA 생성물은 예상된 크기로 이동했다. 모든 분자는 유사하게 고순도로 생성되었다(도 17b).
본원에 개시된 모든 참조, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 부정관사 ("a" 및 "an")는 명백하게 반대로 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한 명확하게 반대로 표시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 모든 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 단계 또는 행위가 인용되는 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
청구범위 및 상기 명세서에서 예컨대 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "운반하는(carrying)", "가지는(having)", "함유하는(containing)", "포함하는(involving)", "보유하는(holding)", "구성된(composed of)" 등과 같은 모든 과도기적인 구문은 개방형, 즉 포함하지만 이에 제한되지 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이 "~로 이루어지는(consisting of)" 및 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"이라는 과도기적인 구문만 폐쇄형 또는 반 폐쇄형 과도기적 구문으로 각각 지정된다.
수치적 값 앞의 "약" 및 "실질적으로"라는 용어는 인용된 수치적 값의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상단 및 하단 사이의 각 값이 본원에 구체적으로 고려되고 설명된다.
SEQUENCE LISTING
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Claims (56)
- 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개시 전사 서열 (ITS)을 포함하는, 조작된 핵산.
- 제1항에 있어서, ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 조작된 핵산.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호: 10-13 또는 42-45 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 핵산.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ITS의 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 관심 서열을 추가로 포함하는, 조작된 핵산.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하는, 조작된 핵산.
- 제5항에 있어서, 상기 종결 서열이 rrnBT1, rrnBT2, TT7, pET-T7, T7U, TT3, 및/또는 PTH 종결 서열을 포함하는, 조작된 핵산.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 종결 서열이 서열번호: 19-30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 핵산.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 박테리오파지 T7 프로모터인, 조작된 핵산.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호: 9 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 핵산.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산이 이중 가닥인, 조작된 핵산.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 핵산이 원형인, 조작된 핵산.
- 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 발현 카세트; 및
dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 발현 카세트
를 포함하는 작제물로서,
상기 dsRNA의 센스 가닥이 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적인, 작제물. - 제12항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두가 dsRNA의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 종결 서열을 추가로 포함하는, 작제물.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 카세트 중 하나 또는 둘 모두가 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 추가로 포함하는, 작제물.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 전사 서열이 1-15 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 작제물.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 전사 서열이 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
- 제16항에 있어서, 상기 개시 전사 서열이 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 단일 DNA 분자 내에 위치하고 동일한 방향으로 배향되는, 작제물.
- 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 단일 DNA 분자 내에 위치하고 반대 방향으로 배향되는, 작제물.
- 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 ITS 및 ITS의 역 상보체에 의해 플랭킹되고 제2 발현 카세트의 안티센스 가닥이 ITS 및 ITS의 역 상보체에 의해 플랭킹되는, 작제물.
- 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하고 제2 발현 카세트가 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하는, 작제물.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종결 서열이 rrnBT1, rrnBT2, TT7, pET-T7, T7U, TT3, 및/또는 PTH 종결 서열을 포함하는, 작제물.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종결 서열이 서열번호: 19-30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
- 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 마커를 추가로 포함하는, 작제물.
- 제24항에 있어서, 상기 선별 마커가 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치하는, 작제물.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 선별 마커가 항생제 내성 선별 마커 또는 무항생제 선별 마커인, 작제물.
- 제12항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트의 프로모터, 제2 발현 카세트의 프로모터 중 하나, 또는 제1 발현 카세트의 프로모터 및 제2 발현 카세트의 프로모터 둘 모두가 박테리오파지 T7 프로모터인, 작제물.
- 제12항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트의 프로모터 또는 제2 발현 카세트의 프로모터, 또는 제1 발현 카세트의 프로모터 및 제2 발현 카세트의 프로모터 둘 모두가 서열번호: 9 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
- 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 천연 염색체, 박테리오파지 및 바이러스로부터 선택되는, 작제물.
- 제29항에 있어서, 상기 작제물이 높은, 중간의 또는 낮은 카피 수 플라스미드인, 작제물.
- 제30항에 있어서, 상기 플라스미드가 ColE1 레플리콘 또는 pUC 레플리콘 또는 ColE1, pBR322, pUC, R6K, p15a 또는 pSC101 레플리콘으로부터 유래된 레플리콘을 포함하는, 작제물.
- 제12항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA가 곤충, 식물, 진균 또는 바이러스의 게놈 서열을 표적화하는, 작제물.
- (a) 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 종결 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및
(b) 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ITS에 작동 가능하게 연결된 프로모터, dsRNA의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 종결 서열을 포함하는 제2 발현 카세트
를 포함하는 작제물로서,
상기 dsRNA의 센스 가닥이 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적인, 작제물. - 제33항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 단일 DNA 분자 내에 위치하며 동일한 방향으로 배향되는, 작제물.
- 제33항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 카세트가 단일 DNA 분자 내에 위치하고; 그리고 선택적으로 상기 제1 및 제2 발현 카세트가 반대 방향으로 배향되는, 작제물.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 ITS 다운스트림의 역 상보체를 포함하고, 상기 제2 발현 카세트가 dsRNA 생성물의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 ITS 다운스트림의 역 상보체를 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 발현 카세트가 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 하나 이상의 종결 서열을 추가로 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트가 ITS의 역 상보체의 다운스트림이고/이거나 상기 제2 발현 카세트가 ITS의 역 상보체의 다운스트림인, 작제물.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종결 서열이 rrnBT1, rrnBT2, TT7, pET-T7, T7U, TT3, 및/또는 PTH 종결 서열을 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종결 서열이 서열번호: 19-30 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림, 선택적으로 ITS의 역 상보체 중 어느 하나의 다운스트림 및/또는 종결 서열 중 어느 하나의 다운스트림에 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 추가로 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 마커를 추가로 포함하는, 작제물.
- 제42항에 있어서, 상기 선별 마커가 상기 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 위치하는, 작제물.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 선별 마커가 항생제 내성 선별 마커 또는 무항생제 선별 마커인, 작제물.
- 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트의 프로모터 및 제2 발현 카세트의 프로모터 중 하나 또는 둘 모두가 박테리오파지 T7 프로모터인, 작제물.
- 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 발현 카세트의 프로모터 및 제2 발현 카세트의 프로모터 중 하나 또는 둘 모두가 서열번호: 9 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 천연 염색체, 박테리오파지 및 바이러스로부터 선택되는, 작제물.
- 제47항에 있어서, 상기 작제물이 높은, 중간의 또는 낮은 카피 수 플라스미드인, 작제물.
- 제48항에 있어서, 상기 플라스미드가 ColE1 레플리콘 또는 pUC 레플리콘 또는 ColE1, pBR322, pUC, R6K, p15a 또는 pSC101 레플리콘으로부터 유래된 레플리콘을 포함하는, 작제물.
- 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA가 곤충, 식물, 진균 또는 바이러스의 게놈 서열을 표적화하는, 작제물.
- 전사 반응에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조작된 핵산 또는 제12항 내지 제50항 중 어느 한 항의 작제물 및 중합효소를 조합하는 단계 및 RNA 전사체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 전사체가 대조군보다 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40% 더 많은 양으로 생성되는, 방법.
- 관심 생성물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 있는 개시 전사 서열 (ITS)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고 선택적으로 ITS-RC 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 부위 및/또는 2개의 탠덤(tandem) 종결 서열이 뒤따르는 발현 카세트로서, 상기 ITS가 서열번호: 1-8 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 카세트.
- 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 종결 서열을 포함하는 제1 발현 카세트; 및
dsRNA (dsRNA)의 안티센스 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 종결 서열을 포함하는 제2 발현 카세트
를 포함하는 작제물로서,
상기 제1 및 제2 발현 카세트는 동일한 DNA 분자 내에서 동일한 방향 또는 반대 방향으로 배향되고,
상기 dsRNA의 센스 가닥은 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적인, 작제물. - 서열번호: 1-4 또는 38-41 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조작된 핵산; 및 중합효소
를 포함하는, 키트. - 제55항에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 뉴클레오시드 모노포스페이트를 추가로 포함하는, 키트.
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