KR20230130144A - 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산 생산을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산 생산을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20230130144A
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드류 에스. 쿤닝햄
대니얼 맥커츠란
히만슈 다만카르
이페인와 이우추쿠
제임스 로빈스 압샤어
메학 굽타
매튜 에두아르도 모우라
나빈 수다르산
니콜라스 스키짐
라칫 제인
카르티케얀 라마찬드리야
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그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨.
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Abstract

일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산의 생산을 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.

Description

뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산 생산을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATE AND RIBONUCLEIC ACID PRODUCTION}
관련 출원
본 출원은 2017년 10월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/571,071을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
리보핵산 (RNA)은 리보뉴클레오티드의 반복 단위를 포함하고 유전자 발현 및 단백질 합성을 포함한 주요 세포 프로세스에서 일정 역할을 한다. 따라서, RNA는 세포의 기본 프로세스, 예를 들어, 세포 면역 반응을 유도하는 RNA 백신을 조정하기 위한 매력적인 표적이다. 그러나, 상업적 규모 (예를 들어, 그램 내지 킬로그램)로 RNA를 저비용으로 생산하는 것은, 부분적으로 출발 물질 (예를 들어, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)) 및 반응 성분 (예를 들어, DNA 주형 및 폴리머라제)의 비용으로 인해 어려운 일이다. 상업적으로 관련된 규모로 고품질 RNA를 제공하기 위해서는 NTP와 RNA 둘 다를 비용 면에서 효율적으로 생산해야 한다.
저비용 기질 (예를 들어, 세포 RNA, 핵염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP), 및/또는 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP)), 재조합 및/또는 내인성 효소 (예를 들어, 키나제 및/또는 폴리머라제), 및 에너지원 (예를 들어, NTP, 폴리포스페이트, 및/또는 피로포스페이트)을 활용하기 위해 개발된 생합성 경로를 사용하여, NTP 및/또는 RNA를 저비용 생산 (생합성)하기 위한 시스템, 방법, 조성물 (예를 들어, 세포, 세포 용해물, 시약, 및 반응 혼합물), 및 키트가 본원에 제공된다. NTP 및/또는 RNA의 생산은 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 효소 활성을 최소화 (예를 들어, 감소, 억제 및/또는 제거)하도록 설계된 시험관내 및/또는 무세포 용해물 시스템을 사용하여 달성되므로, 프로세스의 효율 및 원하는 최종 산물의 수율을 증가시킨다.
본원에 기재된 생합성 경로는 전형적으로, 내인성 경로 효소 및 포스페이트 공급원에 대한 대안으로서 폴리포스페이트 키나제 및 폴리포스페이트를 활용한다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 반응 혼합물에서 NDP (예를 들어, ADP, CDP, GDP, 및/또는 UDP), 폴리포스페이트 키나제 (예를 들어, PPK2), 및 폴리포스페이트 (예를 들어, 헥사메타포스페이트)를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, NTP를 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 도 2a에 도시된 바와 같이, PPK는 폴리포스페이트로부터 ADP, CDP, GDP, 및 UDP로 포스페이트를 전달하여 ATP, CTP, GDP, 및 UTP의 생산을 초래한다. 일부 실시양태에서, 이러한 반응 혼합물은 NDP 키나제 (예를 들어, ndk)를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 반응 혼합물에서 NMP (예를 들어, 5'-NMP, 예컨대 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-GMP, 및/또는 5'-UMP), 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, NTP를 생산하기 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 NMP 키나제 또는 NDP 키나제 (예를 들어, ndk)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 NMP 키나제 (예를 들어, adk, cmk, gmk, 및/또는 pyrH) 및 NDP 키나제 (예를 들어, ndk)를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또한 다른 측면은 반응 혼합물에서 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및/또는 우리딘), 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, NTP를 생산하기 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 추가 측면은 반응 혼합물에서 핵염기 (예를 들어, 아데닌, 시토신, 구아닌, 및/또는 우라실), 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, NTP를 생산하기 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, NTP의 생합성을 위한 출발 물질 (예를 들어, NMP, NDP, 및/또는 뉴클레오시드)은 세포 RNA로부터 생산된다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA (예를 들어, 단세포 또는 다세포 유기체로부터 수득됨), 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), 및 무기 포스페이트를, 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP)의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계; (b) PNPase를 제거하는 단계 (및 임의로, 다른 바람직하지 못한 효소 활성을 제거하는 단계); 및 (c) 이로써 생성된 반응 혼합물에서 NDP, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, NTP를 생산하기 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 반응 혼합물은 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 또 다른 한편으론, 상기 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA), PNPase, 무기 포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 뉴클레오시드 디포스페이트의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계 (임의로, 여기서 반응 혼합물은 NDP 키나제를 추가로 포함한다); (b) PNPase를 제거하는 단계; 및 (c) 반응 혼합물을 NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 필요한 경로 효소 (예를 들어, 폴리포스페이트 키나제 및/또는 NDP 키나제)는 PNPase를 제거 (예를 들어, 감소, 억제 및/또는 제거)하기 위해 사용된 조건에 노출된 후 그들의 활성 (예를 들어, 그들의 활성의 적어도 50%)을 유지하도록 제거 조건 (예를 들어, 고온 또는 화학적 억제제에의 노출)을 견딜 수 있다.
본 개시내용의 다른 측면은 (a) 제1 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 리보뉴클레아제 (RNase, 예를 들어 RNase R 또는 뉴클레아제 P1)를, NMP (예를 들어, 5'-NMP)의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계; (b) RNase (및 임의로 다른 바람직하지 못한 효소 활성)를 제거하는 단계; 및 (c) 이로써 생성된 반응 혼합물에서 NMP, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, NTP를 생산하기 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 반응 혼합물은 NMP 키나제, NDP 키나제, 또는 NMP 키나제와 NDP 키나제 둘 다를 추가로 포함한다. 또 다른 한편으론, 상기 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA, RNase, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NMP (예를 들어, 5'-NMP)의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계; (b) RNase를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 반응 혼합물을 NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 생산된 NTP는 일부 실시양태에서, RNA (예를 들어, mRNA 또는 이중 가닥 RNA)의 생산을 위해 사용된다. 이는, 예를 들어, DNA 주형 및 폴리머라제 (예를 들어, T7 RNA 폴리머라제)를 본원에 기재된 바와 같이, NTP의 생산을 위해 사용된 반응 혼합물 중 임의의 것에 부가함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 한편으론, NTP는 단리되고, 별도의 반응 혼합물에서 DNA 주형 및 폴리머라제와 조합되어 RNA를 생산할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한, RNA의 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 생합성 경로 중 임의의 것에서, 핵염기, 뉴클레오시드, NMP, NDP, 또는 NTP가 출발 기질로서 사용될 때, 이는 화학적으로 합성될 수 있거나, 발효 산물일 수 있거나, 또는 다른 수단에 의해 생산될 수 있다.
본원에 기재된 시스템, 반응 혼합물, 및 방법에 사용된 폴리포스페이트 키나제는 표 2 또는 12에 열거된 폴리포스페이트 키나제 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 데이노코쿠스 게오써말리스(Deinococcus geothermalis)로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함한다.
폴리포스페이트는 경로 효소에 대한 기질로서 제공되는 임의의 폴리포스페이트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트는 헥사메타포스페이트이다.
세포 RNA가 사용되는 실시양태에서, 세포 RNA는, 예를 들어, 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함한다. 세포 RNA는 단세포 유기체 (예를 들어, 박테리아 또는 효모) 또는 다세포 유기체 (예를 들어, 식물)로부터의 것일 수 있다.
본 개시내용에 유용한 생합성 경로의 효소는, 예를 들어, 이러한 경로의 효소 (예를 들어, 뉴클레아제 (예컨대 RNase 및/또는 PNPase), 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제)를 발현하는 세포 (예를 들어, 조작된 세포)로부터 제조된 (적어도 하나의) 세포 용해물로부터 수득 (단리 및/또는 정제)될 수 있다. 이들 세포 용해물을 제조하기 위한 예시적인 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 한편으론, 반응 혼합물은 상기 경로의 효소를 발현하는 세포 (예를 들어, 조작된 세포)로부터 제조된 세포 용해물 (단일 세포 용해물 또는 세포 용해물의 혼합물)을 포함할 수 있다. 즉, 상기 경로의 재조합 효소 및/또는 내인성 효소뿐만 아니라 NTP의 생산에 필요한 다른 반응 성분 (예를 들어, 폴리포스페이트)을 함유하는 세포 용해물의 혼합물 또는 세포 용해물에서 완전한 반응이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, (적어도 하나의) 정제된 경로 효소가 반응 혼합물에 부가된다.
세포 용해물(들) 또는 세포 용해물(들)로부터 수득된 효소를 포함하는 반응 혼합물의 경우, 본원에 기재된 제거 방법 중 임의의 것을 사용하여 바람직하지 못한 천연 효소 활성을 제거하는 것이 유리할 수 있다. 바람직하지 못한 천연 효소 활성은, 예를 들어, 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 천연 효소 활성은 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 국재화 (예를 들어, 주변 세포질 표적화), 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거된다. 다른 실시양태에서, 천연 효소 활성은 온도, pH, 염, 세정제, 알콜 또는 다른 용매, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거된다. 또한 다른 실시양태에서, 천연 효소 활성은 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거된다.
본 발명의 여러 실시양태의 세부 사항은 첨부되는 실시예, 도면 및 상세한 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명백할 것이다.
도 1a는 뉴클레오티드 출발 물질을 사용하는 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP), 및 하류 리보핵산 (RNA)의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 도 1b는 폴리포스페이트가 반응 혼합물에 공급되는 고 에너지 포스페이트 전략의 예를 보여준다. 도 1c는 부가의 고 에너지 포스페이트 전략의 예를 보여준다.
도 2a는 출발 물질로서 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP)를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 도 2b는 출발 물질로서 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트 (5'-NMP)를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 도 2c는 출발 물질로서 뉴클레오시드를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 도 2d는 출발 물질로서 핵염기를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 도 2e는 출발 물질로서 핵염기 및 리보스를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다.
도 3a는 출발 물질로서 세포 RNA를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 이러한 경로에서, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제는 세포 RNA를 NDP로 분해시키기 위해 사용된다. 도 3b는 출발 물질로서 세포 RNA를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 이러한 경로에서, 리보뉴클레아제는 세포 RNA를 NMP로 분해시키기 위해 사용된다.
도 4a는 단지 폴리포스페이트 키나제를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 도 4b는 폴리포스페이트 키나제 (예를 들어, PPK2)와 ATP/ADP-의존성 키나제 (예를 들어, NMP 키나제, 예컨대 adk, cmk, gmk, 및/또는 pyrH, 및/또는 NDP 키나제, 예컨대 ndk) 둘 다를 사용하는 NTP, 및 하류 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다.
도 5는 5'-NMP로부터 출발하는 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다.
도 6은 세포 RNA로부터 출발하는 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 개략도는 주형, 키나제 및 폴리머라제가 RNA 생산 반응 동안 부가되는 예를 보여준다.
도 7은 세포 RNA로부터 출발하는 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 보여준다. 개략도는 주형이 해중합 시기 또는 RNA 생산 시기 동안 부가될 수 있고, 키나제가 해중합 시기 또는 RNA 생산 시기 동안 부가될 수 있으며, 폴리머라제가 해중합 시기 또는 RNA 생산 시기 동안 부가될 수 있는 예를 보여준다.
도 8a는 과다발현된 RNase R을 사용하여 이. 콜라이(E. coli) 용해물로부터 RNA의 해중합 동안 시간 경과에 따라 생산된 산 가용성 뉴클레오티드 (mM)의 그래프를 도시한다. 산 가용성 뉴클레오티드는 UV 흡광도에 의해 측정되었다.
도 8b는 RNA 폴리머라제 및 해중합에 의해 생산된 NMP (- NMP) 또는 정제된 NMP (+ NMP, 각각 4 mM)를 포함하는 반응에서 생산된 RNA 산물의 아가로스 겔을 보여준다. 약어: - 2log: 2-log DNA 래더 [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)], NMP: 5'-NMP의 등몰 혼합물, RNA Pol: 열안정성 T7 RNA 폴리머라제, 주형 1: 선형 DNA 주형, 주형 2: 플라스미드 DNA 주형.
도 9a는 1 mg/mL 정제된 RNase R을 사용하여 정제된 RNA의 해중합 동안 시간 경과에 따라 생산된 산 가용성 뉴클레오티드 (mM)의 그래프를 도시한다. 산 가용성 뉴클레오티드는 UV 흡광도에 의해 측정되었다.
도 9b는 정제된 RNA의 해중합에 의해 생산된 NMP 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 반응에서 생산된 RNA 산물의 아가로스 겔을 보여준다. 음성 대조군으로서, 반응을 RNA 폴리머라제의 부재 하에 수행하였다. 약어: - 2log: 2-log DNA 래더 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), NMP: 5'-뉴클레오시드 모노포스페이트의 등몰 혼합물, RNA Pol: 열안정성 T7 RNA 폴리머라제, 주형 1: 선형 DNA 주형, 주형 2: 플라스미드 DNA 주형.
도 10은 37℃에서 야생형 폴리머라제 (W) 또는 열안정성 폴리머라제 돌연변이체 (T)를 사용하는 무세포 RNA 합성에 의해 생산된 RNA 산물의 아가로스 겔을 보여준다. 약어: - 2log: 2-log DNA 래더 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), W: 야생형 T7 RNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), T: 열안정성 T7 RNA 폴리머라제, 주형 1: 선형 DNA 주형, 주형 2: 플라스미드 DNA 주형.
도 11a는 단독 키나제로서의 DgPPK2 또는 5-효소 용해물 시스템 중 하나를 포함하는 반응의 반응 계수 (상업적으로 이용 가능한 dsRNA 내부 표준의 면적에 대한 관심 dsRNA의 면적 비로서 계산됨)의 플롯을 도시한다.
도 11b는 DgPPK2 용해물, 5-효소 용해물 시스템, 및 T7 RNA 폴리머라제를 수반하지 않는 음성 대조군을 포함하는 반응에서 생산된 dsRNA 산물의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 12a는 정제된 RNase R 또는 뉴클레아제 P1을 사용하여 다양한 공급원의 RNA의 해중합 동안 시간 경과에 따라 생산된 산 가용성 뉴클레오티드 (mM)의 그래프를 도시한다. 산 가용성 뉴클레오티드는 UV 흡광도에 의해 측정되었다.
도 12b는 뉴클레아제 P1을 사용하여 이. 콜라이 또는 효모로부터의 RNA의 해중합 동안 시간 경과에 따라 생산된 이용 가능한 5'-NMP의 퍼센트의 그래프를 도시한다. 이용 가능한 5'-NMP의 퍼센트는 LC-MS에 의해 결정되었다.
도 13은 GL17-109로부터의 용해물의 상이한 온도 전체에 걸친 RNA 해중합에 대한 뉴클레오믹(nucleomic) 프로파일 플롯을 도시한다. 20개 분석물의 누적 농도가 도시되어 있다. 뉴클레오시드는 백색 반점 패턴으로 도시되며, 최소로 생산되었다. 50℃에 대한 데이터가 수집되었지만 도시되지는 않았다.
도 14는 아세테이트의 주기적 인산화를 통해 피로포스페이트로부터 ATP를 생산하기 위한 효소 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: AcK1 = 제1 아세테이트 키나제, AcK2 = 제2 아세테이트 키나제, PPi = 무기 피로포스페이트, Pi = 무기 포스페이트, ATP = 아데노신 트리포스페이트, ADP = 아데노신 디포스페이트, 및 아세틸-P = 아세틸-포스페이트.
도 15a-15b는 시트레이트로부터 ATP를 생산하기 위한 효소 경로의 개략도이다. 도 15a는 시트레이트 및 피로포스페이트로부터 ATP 생산을 위한 3가지 효소 반응을 제시한다. 도 15b는 전반적 화학 반응을 제시한다. 약어의 의미는 하기와 같다: PPi = 무기 피로포스페이트, PEP = 포스포엔올피루베이트, CO2 = 이산화탄소, Pi = 무기 포스페이트, ATP = 아데노신 트리포스페이트, 및 AMP = 아데노신 모노포스페이트.
도 16는 술파이트로부터 ATP를 생산하기 위한 효소 경로의 개략도이다. 약어의 의미는 하기와 같다: ATP = 아데노신 트리포스페이트, AMP = 아데노신 모노포스페이트, APS = 아데노신 5'-포스포술페이트, 및 PPi = 무기 피로포스페이트.
도 17은 dsRNA의 무세포 합성이 뉴클레오티드 공급원에 상관없이 유사한 산물 역가를 초래한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 18은 dsRNA의 무세포 합성이, 중온성 반응 온도에서 야생형 및 열안정성 돌연변이체 RNA 폴리머라제와 거의 동등한 수준의 산물 역가를 초래다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 19는 NTP의 무세포 합성이, 48℃에서 1시간 인큐베이션한 후 뉴클레오티드 공급원에 상관없이 유사한 NTP 역가를 초래한다는 것을 보여주는 그래프이다. 뉴클레오티드의 각각의 공급원 (세포 RNA, 정제된 NMP 또는 정제된 NDP)에 대해, 대략 4 mM의 각각의 뉴클레오티드를 제공하기에 충분한 양의 기질을 반응에 부가하였다. 예를 들어, NDP와의 반응은 각각의 ADP, CDP, GDP 및 UDP 4 mM을 포함하였다.
본 개시내용은 일부 측면에서, 비용 면에서 효과적인 반응 성분, 예컨대 세포 RNA 기질 또는 단량체성 기질, 예컨대 핵염기, 뉴클레오시드, NMP, 또는 NDP, 재조합 및/또는 정제된 경로 효소 (예를 들어, 포스포리보실트랜스퍼라제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 뉴클레오시드 키나제, RNA 폴리머라제), 고 에너지 포스페이트 (예를 들어, 폴리포스페이트)의 공급원, 및/또는 DNA 주형을 활용하는 NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 생합성 경로를 제공한다.
반응 성분
세포 RNA. 세포 RNA는, 예를 들어, 세포 물질 (바이오매스)로부터 수득된 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 및 리보솜 RNA (rRNA)를 포함한다. 세포 RNA는 발효로부터 또는 프로세스 폐기물 스트림으로부터의 단세포 유기체 (예를 들어, 박테리아 및 효모) 및 다세포 유기체 (예를 들어, 식물 및 동물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포 물질의 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어, 효소 (예를 들어, 키나제)를 발현하는 용해물로부터 수득된 세포 RNA일 수 있다.
핵염기. 핵염기는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 질소성 염기 성분이다. 핵염기는 유전 코드의 기본 단위로서 기능한다. 핵염기는 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 우라실 (U)을 포함한다. 핵염기는 슈도우리딘 (Ψ), 디히드로우리딘 (D), 및 7-메틸구아노신 (m7G)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 변형된 핵염기를 포함한다.
뉴클레오시드. 뉴클레오시드는 5-탄소 당 (예를 들어, 리보스)에 연결된 핵염기이다. 뉴클레오시드의 예는 아데노신, 시티딘, 구아노신, 티미딘 및 우리딘을 포함한다.
뉴클레오티드. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 및 포스페이트 기를 포함한다. 1개의 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오시드는 뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP)이며, 이는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 및 우리딘 모노포스페이트 (UMP)를 포함한다. 2개의 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오시드는 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP)이며, 이는 아데노신 디포스페이트 (ADP), 시티딘 디포스페이트 (CDP), 구아노신 디포스페이트 (GDP), 티미딘 디포스페이트 (TDP), 및 우리딘 디포스페이트 (UDP)를 포함한다. 3개의 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오시드는 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)이며, 이는 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP)를 포함한다.
포스포리보실트랜스퍼라제. 포스포리보실트랜스퍼라제, 예컨대 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (APRTase)는 뉴클레오티드 생합성에 대한 대안을 제공하는, 세포에서의 뉴클레오티드 재이용 경로에 관여한다. APRTase는 퓨린 뉴클레오티드 재이용 경로에서 하기 반응을 촉매한다: 아데닌 + 포스포리보실 피로포스페이트 (PRPP) → 아데노신 5' 모노포스페이트 (AMP) + 피로포스페이트 (PPi).
리보키나제. 리보키나제는 고 에너지 포스페이트 공급원 (예를 들어, ATP 또는 폴리포스페이트)으로부터 D-리보스 형성 D-리보스-5-포스페이트로 포스페이트를 전달하는 효소이다. 그 예는 이. 콜라이의 rbsK 유전자 산물 및 써무스(Thermus) 종 2.9의 QT17_05185 유전자 산물을 포함한다.
포스포펜토뮤타제. 포스포펜토뮤타제는 리보스-포스페이트 분자 내의 포스페이트를 전달하는 효소이다. 구체적으로, 포스포리보뮤타제는 D-리보스-1-포스페이트 및 D-리보스-5-포스페이트의 가역적 상호 전환을 촉매한다. 그 예는 이. 콜라이의 deoB 유전자 산물 및 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)의 TM0167 유전자 산물을 포함한다.
뉴클레오시드 포스포릴라제. 뉴클레오시드 포스포릴라제는 하기 가역적 반응: 핵염기 + D-리보스-1-포스페이트 ↔ 뉴클레오시드 + 무기 포스페이트를 촉매하는 효소이다. 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제는 이러한 퓨린 핵염기 (예를 들어, 아데닌, 구아닌) 및 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 구아노신)와의 반응을 촉매한다. 피리미딘 뉴클레오시드 포스포릴라제는 이러한 피리미딘 핵염기 (예를 들어, 시토신, 우라실) 및 피리미딘 뉴클레오시드 (예를 들어, 시티딘, 우리딘)와의 반응을 촉매한다. 뉴클레오시드 포스포릴라제의 예는 이. 콜라이의 deoD, xapA, 및 udp 유전자 산물뿐만 아니라 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) HB27의 TtPNPI, TtPNPII, 및 TtPyNP 효소를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 포스포릴라제. 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase)는 가인산 분해 3' 내지 5' 엑소리보뉴클레아제 활성 및 3'-말단 올리고뉴클레오티드 폴리머라제 활성을 갖는 이작용성 효소이다. PNPase는 보조 기질로서 무기 포스페이트를 사용하여 RNA가 뉴클레오시드 5' 디포스페이트 (NDP)로 분해되는 것을 촉매할 수 있다. RNA를 분해하기 위해 PNPase를 이용하는 동안 고농도의 무기 포스페이트를 사용하면, PNPase 활성을 동시에 구동시키면서 반응 혼합물에 존재할 수도 있는 포스파타제 활성으로 인한 잠재적 NDP 수율 손실을 감소시킬 수 있는데, 이는 무기 포스페이트가 상기 바람직하지 못한 활성을 억제하는 것으로 공지되어 있기 때문이다. 일부 실시양태에서, RNA가 NDP로 분해되는 것을 촉매하기 위해, PNPase가 임의로 하나 이상의 헬리카제와 연계해서 사용된다. 헬리카제를 부가하는 것이, 구조화된 RNA의 접근성을 개선시킴으로써 세포 RNA의 PNPase-매개된 해중합을 개선시킬 수 있다.
뉴클레아제. 뉴클레아제는 DNA (DNase) 또는 RNA (RNase)의 골격에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소이다. 따라서, 리보뉴클레아제 (RNase)는 RNA가 뉴클레오시드 모노포스페이트 (NMP)로 분해되는 것을 촉매할 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, RNA를 해중합시키기 위해 사용될 수 있는 효소의 비-제한적 예가 표 1에 제공된다. 일부 실시양태에서, RNA를 해중합시키기 위해 2개 이상의 뉴클레아제가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 뉴클레아제가 반응 혼합물에 사용된다.
<표 1>
RNA 해중합을 위한 효소의 예
키나제. 키나제는 일반적으로, 고 에너지 포스페이트 공여 분자 (예를 들어, ATP, GTP, UTP, CTP, 또는 중합체 내에 n개의 포스페이트 기를 함유하는 폴리포스페이트)로부터 특이적 기질/분자로 포스페이트 기를 전달하는 것을 촉매하는 효소이다. 이러한 프로세스는 인산화된 기질 및 탈인산화된 형태의 고 에너지 포스페이트 공여 분자 (예를 들어, ADP, GDP, UDP, CDP, 또는 중합체 내에 n-1개의 포스페이트 기를 함유하는 폴리포스페이트)를 생산한다. 본원에 제공된 바와 같이 사용하기 위한 키나제의 비-제한적 예는 NMP 키나제, NDP 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및 폴리포스페이트 키나제를 포함한다.
폴리포스페이트 키나제. 폴리포스페이트 키나제는 고 에너지 포스페이트 공여 분자, 예컨대 폴리포스페이트 (폴리Pn)로부터 특이적 기질/분자로 포스페이트 기(들)를 전달하는 것을 촉매하는 효소이다. 이러한 프로세스는 인산화로서 지칭되며, 여기서 기질은 포스페이트 기를 얻고, 고 에너지 포스페이트 공여 분자는 포스페이트 기를 공여한다. 이러한 에스테르 교환 반응은 인산화된 기질; 및 공여된 포스페이트 기가 결여된 포스페이트 공여 분자, 예컨대 폴리Pn-1을 생산한다. 본 개시내용의 폴리포스페이트 키나제는 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드를 NMP로 전환시키고/시키거나, NMP를 NDP로 전환시키고/시키거나 NDP를 NTP로 전환시킨다. 폴리포스페이트 키나제의 비-제한적 예가 표 2에 제공된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 폴리포스페이트 키나제가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 폴리포스페이트 키나제가 반응 혼합물에 사용된다.
<표 2>
폴리포스페이트 키나제의 예
뉴클레오시드 키나제. 뉴클레오시드 키나제는 고 에너지 포스페이트 공여 분자 (예를 들어, 뉴클레오티드 트리포스페이트)로부터, 전형적으로 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘)의 당 모이어티의 5'-히드록실 기인 R-OH 수용체로 포스포릴을 전달하는 것을 촉매한다. 이러한 프로세스는 뉴클레오시드를 NMP (예를 들어, AMP, CMP, GMP, UMP)로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 아데노신으로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 아데노신 모노포스페이트 (AMP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 시티딘으로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 시티딘 모노포스페이트 (CMP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 구아노신으로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 구아노신 모노포스페이트 (GMP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 우리딘으로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 우리딘 모노포스페이트 (UMP)를 생산한다. 뉴클레오시드 키나제의 비-제한적 예가 표 3에 제공된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 뉴클레오시드 키나제가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 뉴클레오시드 키나제가 반응 혼합물에 사용된다.
<표 3>
뉴클레오시드 키나제의 예
NMP 키나제. 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제 (NMP 키나제)는 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP), 통상적으로 ATP로부터의 말단 포스포릴 기를 뉴클레오시드 모노포스페이트 (예를 들어, AMP, CMP, GMP, UMP) 상의 포스포릴 기로 전달하는 것을 촉매하는 효소이다. 이러한 프로세스는 NMP를 NDP (예를 들어, ADP, CDP, GDP, UDP)로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, NMP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 AMP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 아데노신 디포스페이트 (ADP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, NMP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 CMP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 시티딘 디포스페이트 (CDP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, NMP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 GMP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 구아노신 디포스페이트 (GDP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, NMP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 UMP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 우리딘 디포스페이트 (UDP)를 생산한다. NMP 키나제의 비-제한적 예가 표 4에 제공된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 NMP 키나제가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 NMP 키나제가 반응 혼합물에 사용된다.
<표 4A>
AMP 키나제 효소의 예
<표 4B>
CMP 키나제 효소의 예
<표 4C>
UMP 키나제 효소의 예
<표 4D>
GMP 키나제 효소의 예
NDP 키나제. 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 (NDP 키나제)는 NTP (예를 들어, ATP, CTP, GTP, UTP)를 생산하기 위해 가역적 방식으로 상이한 NDP (예를 들어, ADP, CDP, GDP, UDP)와 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 간의 말단 포스페이트의 교환을 촉매하는 효소이다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 ADP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 아데노신 트리포스페이트 (ATP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 CDP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 시티딘 트리포스페이트 (CTP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 GDP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 구아노신 트리포스페이트 (GTP)를 생산한다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제는 포스페이트 공여 분자로부터 UDP로 포스페이트를 전달하는 것을 촉매하여 우리딘 트리포스페이트 (UTP)를 생산한다. NDP 키나제의 비-제한적 예가 표 5에 제공된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 NDP 키나제가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 NDP 키나제가 반응 혼합물에 사용된다.
<표 5>
NDP 키나제의 예
NDP를 NTP로 전환시키는 키나제의 비-제한적 예는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제, 폴리포스페이트 키나제, 및 피루베이트 키나제를 포함한다. 본원에 논의된 바와 같이, 전술한 효소의 열안정성 변이체가 본 개시내용에 의해 포괄된다. 일부 실시양태에서, NDP 키나제(들)는 아퀴펙스 아에오리쿠스(Aquifex aeolicus)로부터 수득된다.
NMP가 NTP로 인산화되는 것은 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트-의존성 키나제 경로를 통해 발생하는데, 여기서 고 에너지 포스페이트는 폴리포스페이트 키나제 (PPK)를 통해 폴리포스페이트로부터 ADP로 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 폴리포스페이트 키나제 1 (PPK1) 패밀리에 속하며, 이는 폴리포스페이트로부터 ADP로 고 에너지 포스페이트를 전달하여 ATP를 형성한다. 이러한 ATP는 NMP를 그들의 동족 리보뉴클레오티드 디포스페이트 (NDP)로 전환시키기 위해 NMP 키나제 (예를 들어, AMP 키나제, UMP 키나제, GMP 키나제 및 CMP 키나제)에 의해 후속적으로 사용된다. 더욱이, ATP는 NDP를 NTP로 전환시키기 위해 뉴클레오티드 디포스페이트 키나제에 의해 후속적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 폴리포스페이트 키나제 2 (PPK2) 패밀리에 속한다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 클래스 I PPK2 패밀리에 속하며, 이는 폴리포스페이트로부터 NDP로 고 에너지 포스페이트를 전달하여 NTP를 형성한다. 이러한 시스템에 의해 생산된 ATP가 고 에너지 포스페이트 공여자로서 사용되어 NMP를 NDP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제는 클래스 III PPK2 패밀리에 속하며, 이는 폴리포스페이트로부터 NMP 및 NDP로 고 에너지 포스페이트를 전달하여 NTP를 형성한다. 일부 실시양태에서, 클래스 III PPK2는 NMP로부터 NTP를 생산하기 위해 단독으로 사용된다. 다른 실시양태에서, 클래스 III PPK2는 다른 키나제와 조합하여 사용된다. 클래스 III PPK2는 ADP, AMP, 및 폴리포스페이트로부터 ATP를 생산하며, 이는 NMP를 NTP로 전환시키기 위해 NMP 및 NDP 키나제에 의해 후속적으로 사용된다.
본원에 제공된 바와 같이 사용하기 위한 PPK2 효소의 비-제한적 예가 표 2에 열거된다. 따라서, 일부 실시양태에서, PPK2 효소는 열안정성이다. 예를 들어, PPK2 효소는 열안정성 클래스 III PPK2 효소일 수 있으며, 이는 폴리포스페이트 중합보다는 ATP 합성을 선호하고, ADP와 AMP 둘 다를 ATP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, PPK2 효소는, 예를 들어, 시간 당 10 내지 800 mM (예를 들어, 시간 당 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 800 mM)의 범위의 속도로 폴리포스페이트, 예컨대 헥사메타포스페이트를 ATP로 전환시키기 위해 사용된다.
폴리포스페이트 및 다른 고 에너지 포스페이트. 고 에너지 포스페이트 분자 (포스페이트 공여 분자)는 고 에너지 결합의 가수 분해 시 에너지를 방출함으로써, 생화학 반응을 위한 에너지원을 제공한다. 폴리포스페이트 (폴리Pn) 및 다른 고 에너지 포스페이트 분자는 본원에 기재된 바와 같이, NTP의 생산, 및 RNA의 하류 생산을 위한 포스페이트 공급원으로서 사용될 수 있다. 폴리Pn은, 예를 들어, 공유 산소 원자에 의해 함께 연결된 포스페이트의 반복 단위 (PO4)를 포함한다. 본 개시내용의 키나제에 의한 특이적 기질/분자의 인산화는 폴리Pn으로부터 포스페이트 기를 공여함으로써, 폴리Pn-1을 생산하는 것을 수반한다.
본 개시내용은 폴리포스페이트 내의 포스페이트 기의 수로써 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리Pn은 적어도 3개의 포스페이트 기 (폴리P3)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리Pn은 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 포스페이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리Pn은 헥사메타포스페이트이다.
고 에너지 포스페이트 분자의 다른 예는 NTP (예를 들어, ATP), NDP (예를 들어, ADP), NMP (예를 들어, AMP), 포스포엔올피루베이트, 1,3-비스포스포글리세레이트, 포스포크레아틴, 포스포엔올 피루베이트, 글루코스 1-포스페이트, 프룩토스 6-포스페이트, 및 글루코스 6-포스페이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 고 에너지 포스페이트가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 고 에너지 포스페이트가 반응 혼합물에 사용된다.
주형. DNA 주형은 원하는 RNA 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 임의로 유도성 프로모터, 및 임의로 전사 종결 인자를 포함한다. DNA 주형은 전형적으로, 벡터, 예컨대 플라스미드 상에 제공되지만, 다른 주형 포맷 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 화학적 합성 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 수단에 의해 생성된 선형 DNA 주형)이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 DNA 주형이 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 DNA 주형이 반응 혼합물에 사용된다.
프로모터 또는 종결 인자는 자연적으로 발생하는 서열 또는 조작된 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 서열은 전사 활성을 증강시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 자연적으로 발생하는 서열이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 조작된 서열이다. 일부 실시양태에서, 종결 인자는 자연적으로 발생하는 서열이다. 다른 실시양태에서, 종결 인자는 조작된 서열이다.
폴리머라제. 폴리머라제는 핵산의 중합체를 합성하는 효소이다. 본 개시내용의 폴리머라제는 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함한다. 폴리머라제의 비-제한적 예가 표 6에 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 RNA 폴리머라제, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 폴리머라제가 반응 혼합물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 폴리머라제가 반응 혼합물에 사용된다.
<표 6>
RNA 폴리머라제의 예
RNA 산물. 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 RNA는 단일 가닥 RNA (ssRNA) 및 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 포함한, 임의의 형태의 RNA일 수 있다. 단일 가닥 RNA의 비-제한적 예는 메신저 RNA (mRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 및 안티센스 RNA를 포함한다. 본원에서의 이중 가닥 RNA는 단일 가닥 영역 (예를 들어, 루프 또는 오버행)을 함유하지 않는 완전히 이중 가닥인 분자뿐만 아니라 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역 (예를 들어, 루프 또는 오버행)을 함유하는 부분적으로 이중 가닥인 분자를 포함한다. 따라서, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)가 본 개시내용의 방법에 의해 생산될 수 있다.
본원에 제공된 방법에 의해 생산된 RNA는 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 본원에 기재된 방법에 따라 생산되고, 후속적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, RNA는 변형된 출발 물질을 사용하여 본원에 기재된 방법에 따라 생산된다. 일부 실시양태에서, 변형된 출발 물질은 변형된 핵염기이다. 일부 실시양태에서, 변형된 출발 물질은 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 출발 물질은 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 변형된 RNA는 골격 변형을 포함한다. 일부 경우에, 골격 변형은 감소된 뉴클레아제 매개 분해로 인해 RNA에 대해 더 긴 반감기를 초래한다. 이로써 결국, 더 반감기가 초래된다. 적합한 골격 변형의 예는 포스포로티오에이트 변형, 포스포로디티오에이트 변형, p-에톡시 변형, 메틸포스포네이트 변형, 메틸포스포로티오에이트 변형, 알킬- 및 아릴-포스페이트 (여기서, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴기에 의해 대체된다), 알킬 포스포트리에스테르 (여기서, 하전된 산소 모이어티가 알킬화된다), 펩티드 핵산 (PNA) 골격 변형, 잠금 핵산 (LNA) 골격 변형 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 변형은 서로 조합하여 사용되고/되거나 포스포디에스테르 골격 연결과 조합하여 사용될 수 있다.
또 다른 한편 또는 부가적으로, RNA는 염기 또는 당 모이어티에서의 변형을 포함한 다른 변형을 포함할 수 있다. 그 예는 3' 위치에서의 히드록실 기 이외의 저 분자량 유기 기 및 5' 위치에서의 포스페이트 기 이외의 저 분자량 유기 기에 공유적으로 부착되는 당 (예를 들어, 2'-O-알킬화된 리보스)을 갖는 RNA, 리보스 대신 아라비노스와 같은 당을 RNA를 포함한다. RNA는 또한, 치환된 퓨린 및 피리미딘, 예컨대 C-5 프로핀 변형된 염기를 포괄한다 (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). 다른 퓨린 및 피리미딘은 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 히포크산틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 이러한 변형은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
NTP 생산 경로
다양한 상이한 효소 경로를 통해 NTP를 생산하기 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트가 본원에 제공되며, 각각은 반응 혼합물에서 본원에 기재된 바와 같은 에너지원, 및 저비용 출발 물질을 활용한다. 이들 효소 경로는 일부 실시양태에서, DNA 주형 및 폴리머라제를 반응 혼합물에 부가함으로써 RNA (예를 들어, mRNA 또는 이중 가닥 RNA)의 생산으로까지 연장될 수 있다 (예를 들어, 도 1 참조).
본원에 기재된 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제 및/또는 폴리머라제) 중 임의의 것은 변형되지 않은 (천연) 또는 조작된 세포로부터 수득될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 경로 효소(들)는 세포로부터 분비된다 (예를 들어, 세포는 효소(들)를 분비하도록 조작된다). 다른 실시양태에서, 경로 효소는 세포의 세포 용해물(들)로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 경로 효소는 세포의 세포 용해물(들)의 성분이며, 이러한 경우 세포 용해물(들)은 생합성 반응에서 반응 혼합물에 부가되거나 또는 반응 혼합물로서 제공된다. 세포 용해물(들)이 반응 혼합물에 사용되거나 또는 반응 혼합물로서 제공되는 경우, 관심 산물 (NTP 및/또는 RNA)을 생산하기 전에, 세포 용해물은 하기 기재되는 바와 같이, 바람직하지 못한 효소 활성을 제거하기 위한 조건에 노출될 수 있다.
NDP에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 2a에 도시된 바와 같이, 기질로서 NDP를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 NDP, (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트 키나제, 및 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NTP 생산을 위한 반응 혼합물은 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
NMP에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 2b에 도시된 바와 같이, 기질로서 5' NMP를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 5'-NMP, (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트 키나제, 및 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NTP 생산을 위한 반응 혼합물은 NMP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
뉴클레오시드에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 2c에 도시된 바와 같이, 기질로서 뉴클레오시드를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 뉴클레오시드, (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트 키나제, 및 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제 (예를 들어, 표 3 참조) 및/또는 NMP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함할 수 있다.
핵염기에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 2d에 도시된 바와 같이, 기질로서 핵염기를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 핵염기, (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트 키나제, 및 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, NMP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 생합성 경로는, 먼저 세포 RNA를 NDP로 해중합시키거나 또는 먼저 세포 RNA를 NMP로 해중합시킴으로써, 기질로서 세포 RNA를 사용할 수 있다.
핵염기 및 리보스에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 2e에 도시된 바와 같이, 기질로서 핵염기를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 핵염기, D-리보스, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 뉴클레오시드 포스포릴라제, 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트 키나제, 및 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 폴리포스페이트를, NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, 적어도 하나의 NMP 키나제 (예를 들어, 표 3 참조) 및/또는 적어도 하나의 NDP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
NDP를 통한 세포 RNA에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 3a에 도시된 바와 같이, 먼저 세포 RNA를 NDP로 분해 (분해/해중합)시킨 다음, NDP를 NTP로 전환함으로써 기질로서 세포 RNA를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 세포 RNA, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), 및 포스페이트를, NDP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. NTP의 생산을 진행하기 위해서는, 반응 혼합물이 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제 및 폴리포스페이트를 또한 포함한다. 따라서, 상기 방법은 반응 혼합물을 NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
NMP를 통한 세포 RNA에서 NTP로의 전환. 일부 측면에서, NTP는 도 3b에 도시된 바와 같이, 먼저 세포 RNA를 5'-NMP로 분해시킨 다음, NMP를 NDP로 전환시키고 NDP를 NTP로 전환시킴으로써 기질로서 세포 RNA를 사용하여 생산된다. 예를 들어, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 세포 RNA, 및 리보뉴클레아제를, 5'-NMP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. NTP의 생산을 진행하기 위해서는, 반응 혼합물이 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제 및 폴리포스페이트를 또한 포함한다. 따라서, 상기 방법은 반응 혼합물을 NTP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NTP 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, NTP 생산 방법은 반응 혼합물에서 세포 RNA, RNA를 3'-NMP로 절단시키는 리보뉴클레아제, 및 적절한 포스파타제 (예를 들어 알칼리성 포스파타제 또는 다른 것)를, 뉴클레오시드의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 포스파타제는 NTP의 생산으로 진행하기 전에 제거될 것이다.
RNA 생산 경로
도 1에 나타낸 바와 같이, RNA (예를 들어, mRNA 또는 이중 가닥 RNA)는 다양한 상이한 효소 경로를 통해 생산될 수 있으며, 경로 각각은 반응 혼합물(들)에서 본원에 기재된 바와 같은 에너지원, 및 저비용 출발 물질을 활용한다. 따라서, RNA의 생산을 위한 시스템, 방법, 조성물, 및 키트가 본원에 제공된다.
NDP에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 2a에 도시된 바와 같이, 기질로서 NDP를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 NDP, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 RNA 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
NMP에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 2b에 도시된 바와 같이, 기질로서 5' NMP를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 5' NMP, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 RNA 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, NMP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
뉴클레오시드에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 2c에 도시된 바와 같이, 기질로서 뉴클레오시드를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 뉴클레오시드, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 RNA 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제 (예를 들어, 표 3 참조) 및/또는 NMP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함할 수 있다.
NDP를 통한 세포 RNA에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 3a에 도시된 바와 같이, 먼저 세포 RNA를 NDP로 분해시킴으로써 기질로서 세포 RNA를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 세포 RNA, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), 및 포스페이트를, NDP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. RNA의 생산을 진행하기 전에, 최종 산물을 분해하는 것을 피하기 위해 PNPase를 제거하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 PNPase를 제거하는 단계, 및 상기 반응 혼합물에서, 또는 제2 반응 혼합물에서, NDP, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이들 경로 효소는 하기에 논의된 바와 같은 제거 조건을 견딜 수 있으므로, 모든 반응 성분이 단일 (1-단계) 반응 혼합물에 포함된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA, PNPase, 포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 폴리머라제를, NDP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계 (임의로, 여기서 상기 반응 혼합물은 NDP 키나제를 추가로 포함한다), (b) PNPase를 제거하는 단계, 및 (c) 상기 반응 혼합물을 RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
NMP를 통한 세포 RNA에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 3b에 도시된 바와 같이, 먼저 세포 RNA를 5' NMP로 분해시킴으로써 기질로서 세포 RNA를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 세포 RNA 및 리보뉴클레아제를, 5' NMP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. RNA의 생산을 진행하기 전에, 최종 산물을 분해하는 것을 피하기 위해 리보뉴클레아제를 제거하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 리보뉴클레아제를 제거하는 단계, 및 상기 반응 혼합물에서, 또는 제2 반응 혼합물에서, 5' NMP, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 NMP 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이들 경로 효소는 하기에 논의된 바와 같은 제거 조건을 견딜 수 있으므로, 모든 반응 성분이 단일 (1-단계) 반응 혼합물에 포함된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 (a) 반응 혼합물에서 세포 RNA, 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 폴리머라제를, NMP의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계 (임의로, 여기서 상기 반응 혼합물은 NMP 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다), (b) 리보뉴클레아제를 제거하는 단계, 및 (c) 상기 반응 혼합물을 RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다.
핵염기에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 2d에 도시된 바와 같이, 기질로서 핵염기를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 핵염기, (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, DNA 주형, 및 RNA 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, NMP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 NDP 키나제 (예를 들어, 표 5 참조)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
핵염기 및 리보스에서 RNA로의 전환. 일부 측면에서, RNA는 도 2e에 도시된 바와 같이, 기질로서 핵염기를 사용하여 생산된다. 예를 들어, RNA 생산 방법은 반응 혼합물에서 핵염기, D-리보스, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 뉴클레오시드 포스포릴라제, 적어도 하나의 폴리포스페이트 키나제, 적어도 하나의 폴리포스페이트, 적어도 하나의 DNA 주형, 및 적어도 하나의 RNA 폴리머라제를, RNA의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 생산 반응 혼합물은 또한, 적어도 하나의 NMP 키나제 (예를 들어, 표 3 참조) 및/또는 적어도 하나의 NDP 키나제 (예를 들어, 표 4 참조) 및/또는 뉴클레오시드 키나제를 포함할 수 있다.
효소 공급원
본원에 제공된 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등) 중 임의의 것 (예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 그 초과) 또는 모두는 세포에 의해 발현된 내인성 (변형되지 않은) 효소 또는 재조합 효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 경로 효소는 세포 용해물의 성분으로서 제공되며, 이는 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 경로 효소는 세포 용해물로부터 정제되고, 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 경로 효소는 세포 용해물의 성분으로서 제공되고, 경로 효소는 세포 용해물로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 경로 효소는 세포 브로스(broth)로부터 분비되고 임의로 정제된다.
일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등)는 세포로부터 정제된 내인성 효소이고, 정제된 효소로서 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등)는 반응 혼합물에 포함되는 세포 용해물의 성분으로서 제공된 내인성 효소이다. 일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등)는 세포로부터 정제된 재조합 효소이고, 정제된 효소로서 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등)는 반응 혼합물에 포함되는 세포 용해물의 성분으로서 제공된 재조합 효소이다. 일부 실시양태에서, 경로 효소는 세포 브로스로부터 분비되고 임의로 정제된다.
본 개시내용은 또한, 세포에 의해 분비된 내인성 효소 및 재조합 효소를 포괄한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등)는 세포로부터 분비된 내인성 효소이다. 일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등)는 세포로부터 분비된 재조합 효소이다.
바람직하지 못한 효소 활성의 제거
본원에 제공된 다양한 실시양태에서, 경로 효소를 발현하는 세포 또는 세포의 용해물로부터 제조된 효소가 NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 사용된다. 이들 세포 또는 세포 용해물에는, NTP 및/또는 RNA 생산에 유해한 영향을 미칠 수 있는 효소가 있다. 이러한 효소의 비-제한적 예는 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및/또는 가수분해효소, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포에 의해 발현된 것을 포함한다. 포스파타제는 포스페이트 기를 제거하고 (예를 들어, NMP를 뉴클레오시드로 전환시키거나, NDP를 NMP로 전환시키거나, 또는 NTP를 NDP로 전환시키고), 이는 뉴클레오티드 인산화/탈인산화의 무익 회로(futile cycle)로 인해 NTP 생산을 감소시킨다. 뉴클레아제는 핵산을 단량체 또는 올리고머로 절단하여 RNA 산물 분해 (예를 들어, RNase에 의함) 및/또는 DNA 주형 분해 (예를 들어, DNase에 의함)를 초래한다. 프로테아제는 단백질을 아미노산 또는 펩티드로 절단하여 경로 효소를 분해시킨다. 데아미나제는 아미노 기를 제거하여, 경로 중간체를 비-유용한 기질 (예를 들어, 크산틴 및 히포크산틴)로 전환시킴으로써 NTP 농도를 감소시키고 RNA 산물에서의 돌연변이 (예를 들어, C에서 U로의 돌연변이)를 유발할 수 있다. 가수분해효소 (예를 들어, 뉴클레오시드 가수분해효소 또는 뉴클레오티드 가수분해효소)는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 염기 및 당 모이어티로 절단하여, 뉴클레오티드의 비가역적 분해로 인해 NTP 농도를 감소시킨다. 산화환원효소는 한 분자 (산화제)로부터 또 다른 분자 (환원제)로 전자를 전달하는 것을 촉매한다. 산화 및/또는 환원 반응은, 예를 들어, DNA 및/또는 RNA 내의 핵염기를 손상시켜, 전사 및/또는 번역 상의 오류를 유발시키거나, 또는 단백질 또는 효소를 손상시켜 기능 상실을 유발할 수 있다.
따라서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에서 이들 천연 효소 활성 또는 다른 바람직하지 못한 효소 활성을 제거하는 것이 많은 실시양태에서 유리하다. 본원에서, 효소 활성의 "제거"는 바람직하지 못한 효소 활성의 부분적이거나 (예를 들어, 이러한 활성의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 제거된다) 또는 전체일 수 있다 (상기 활성의 100%가 제거된다). 본원에 논의된 바와 같이, 효소 활성은 유전자 변형, 조건부 불활성화, 및/또는 물리적 분리에 의해 제거될 수 있다. 다른 제거 방법이 또한 사용될 수 있다. 바람직하지 못한 효소 활성은 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및/또는 가수분해효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의) 천연 (내인성) 효소로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 포스파타제 활성이 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에서 제거된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 뉴클레아제 활성이 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에서 제거된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 프로테아제 활성이 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에서 제거된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 데아미나제 활성이 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에서 제거된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 가수분해효소 활성이 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에서 제거된다.
바람직하지 못한 (예를 들어, 천연) 효소 활성(들)은 유전적, 조건부, 또는 분리 접근법을 사용하여 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전적 접근법이 바람직하지 못한 효소 활성을 제거하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포는 바람직하지 못한 효소 활성을 감소 또는 제거하도록 변형된다. 바람직하지 못한 효소 활성을 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있는 유전적 접근법의 예는 분비, 유전자 녹아웃, 및 프로테아제 표적화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 조건부 접근법이 바람직하지 못한 효소 활성을 제거하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 바람직하지 못한 효소가 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에 여전히 남아 있어 선택적으로 불활성화된다. 바람직하지 못한 효소 활성을 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있는 조건부 접근법의 예는 온도, pH, 염, 세정제, 유기 용매 (예를 들어, 알콜) 상의 변화, 및 화학적 억제제의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 분리/정제 접근법이 바람직하지 못한 효소 활성을 제거하기 위해 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 바람직하지 못한 효소가 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 물리적으로 제거된다. 바람직하지 못한 효소 활성을 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있는 분리 접근법의 예는 침전, 고정화, 여과, 및 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
유전적 접근법. 일부 실시양태에서, NTP 및/또는 RNA 생산 경로의 효소 및/또는 DNA 주형을 발현하는 세포는 바람직하지 못한 효소 활성을 감소 또는 제거하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자가 상기 세포로부터 결실된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자가 돌연변이되어, 이로써 생성된 유전자 산물이 비-기능적이게 한다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 그의 단백질 서열 내에 부위 특이적 프로테아제 인식 서열을 포함하도록 변형되어, 이러한 효소가 "표적화"될 수 있고, 불활성화를 위해 절단될 수 있게 한다 (예를 들어, 2012년 3월 1일에 공개된 미국 공개 번호 2012/0052547 A1; 2015년 2월 12일에 공개된 국제 공개 번호 WO 2015/021058 A2; 및 2012년 3월 8일에 공개된 국제 공개 번호 WO 2012/030980 (이들 각각이 본원에 참조로 포함된다) 참조).
부위 특이적 프로테아제 인식 서열을 함유하는 효소의 절단은 세포 성장 시기 동안 (예를 들어, 조작된 세포가 배양됨에 따라) 세포의 주변 세포질에 격리되고 (표적 효소로부터 분리되고), ATP 생산 시기 동안 (예를 들어, 세포 용해물을 생산하기 위한 세포 용해 후) 효소와 접촉하게 되는 동족 부위 특이적 프로테아제와의 접촉으로부터 비롯된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포는 일부 실시양태에서, (i) 바람직하지 못한 활성을 나타내고 효소의 단백질 서열 내에 부위 특이적 프로테아제 인식 서열을 포함하는 효소를 코딩하는 조작된 핵산, 및 (ii) 효소의 부위 특이적 프로테아제 인식 서열을 절단하고 주변 세포질-표적화 서열을 포함하는 부위 특이적 프로테아제를 코딩하는 조작된 핵산을 포함한다. 이러한 주변 세포질-표적화 서열은 세포가 용해될 때까지 부위 특이적 프로테아제를 세포의 주변 세포질 공간에 격리시키는 데에 책임이 있다. 주변 세포질-표적화 서열의 예가 공지되어 있다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 프로테아제의 예는 알라닌 카르복시펩티다제, 아스타신, 박테리아 류실 아미노펩티다제, 암 응고 촉진제, 카텝신 B, 클로스트리파인, 시토졸 알라닐 아미노펩티다제, 엘라스타제, 엔도프로테이나제 Brg-C, 엔테로키나제, 가스트릭신, 젤라티나제, Gly-X 카르복시펩티다제, 글리실 엔도펩티다제, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제, 히포데르민 C, Iga-특이적 세린 엔도펩티다제, 류실 아미노펩티다제, 류실 엔도펩티다제, lysC, 리소좀 프로-X 카르복시펩티다제, 리실 아미노펩티다제, 메티오닐 아미노펩티다제, 믹소박터, 나르디리신, 췌장 엔도펩티다제 E, 피코르나인 2B, 피코르나인 3C, 프로엔도펩티다제, 프롤릴 아미노펩티다제, 프로 단백질 전환 효소 I, 프로 단백질 전환 효소 II, 루셀리신, 사카로펩신, 세메노겔라제, T-플라스미노겐 활성화제, 트롬빈, 조직 칼리크레인, 토바코 에치(tobacco etch) 바이러스 (TEV), 토가비린, 트립토파닐 아미노펩티다제, U-플라스미노겐 활성화제, V8, 베놈빈 B, 베놈빈 BB 및 Xaa-프로 아미노펩티다제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조건부 접근법. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물은 선택적으로 불활성화되는 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 이러한 효소를 제거 조건 (예를 들어, 고온 또는 저온, 산성 또는 염기성 pH 값, 고염 또는 저염, 세정제, 및/또는 유기 용매)에 노출시킴으로써 선택적으로 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 효소 제제, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물은 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 일시적으로 또는 비가역적으로 불활성화시키는 온도에 노출된다. "온도 불활성화"는 효소 제제, 세포 용해물 및/또는 반응 혼합물을, 천연 표적 효소를 불활성화 (또는 적어도 부분적으로 불활성화)시키기에 충분한 온도로 가열 또는 냉각하는 프로세스를 지칭한다. 일반적으로, 이러한 온도 불활성화 프로세스는 해로운 효소의 변성 (언폴딩)을 수반한다. 효소가 변성되는 온도는 유기체마다 다양하다. 이. 콜라이에서, 예를 들어, 효소는 일반적으로, 41℃ 초과 온도에서 변성된다. 변성 온도는 다른 유기체의 경우 41℃보다 높거나 낮을 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 세포 용해물의 효소는 0℃-95℃, 또는 그 초과의 온도에서 온도 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 0-90℃, 0-80℃, 0-70℃, 0-60℃, 0-50℃, 0-40℃, 0-30℃, 0-20℃, 0-10℃, 또는 0-5℃의 온도에서 온도 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 5-95℃, 10-95℃, 20-95℃, 30-95℃, 40-95℃, 50-95℃, 60-95℃, 70-95℃, 80-95℃, 또는 90-95℃의 온도에서 온도 불활성화된다. 예를 들어, 세포 용해물의 효소는 대략 40℃, 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 또는 95℃의 온도에서 온도 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 50-80℃의 온도에서 온도 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 대략 70℃의 온도에서 온도 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 대략 60℃의 온도에서 온도 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물은 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 일시적으로 또는 비가역적으로 불활성화시키는 산 또는 염기 (pH 상의 변화)에 노출시킨다. "산 또는 염기 불활성화"는 효소를 불활성화 (또는 적어도 부분적으로 불활성화)시키기에 충분한 pH로 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물을 조정하는 프로세스를 지칭한다. 일반적으로, 산 또는 염기 불활성화의 프로세스는 효소의 변성 (언폴딩)을 수반한다. 효소가 변성되는 pH는 유기체마다 다양하다. 이. 콜라이에서, 예를 들어, 천연 효소는 일반적으로, 7.5 초과 또는 6.5 미만 pH에서 변성된다. 이러한 변성 pH는 다른 유기체에 대한 변성 pH보다 더 높거나 낮을 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 7.5-14, 또는 그 초과의 pH에서 염기 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 효소는 8-14, 8.5-14, 9-14, 9.5-14, 10-14, 10.5-14, 11-14, 11.5-14, 12-14, 12.5-14, 13-14, 또는 13.5-14의 pH에서 염기 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 7.5-13.5, 7.5-13, 7.5-12.5, 7.5-12, 7.5-11.5, 7.5-11, 7.5-10.5, 7.5-10, 7.5-9.5, 7.5-9, 7.5-8.5, 또는 7.5-8의 pH에서 염기 불활성화된다. 예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 대략 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 또는 14의 pH에서 염기 불활성화될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 6.5-0, 또는 그 미만의 pH에서 산 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 6.5-0.5, 6.5-1, 6.5-1.5, 6.5-2, 6.5-2.5, 6.5-3, 6.5-3.5, 6.5-4, 6.5-4.5, 6.5-5, 또는 6.5-6의 pH에서 산 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 6-0, 5.5-0, 5-0, 4.5-0, 4-0, 3.5-0, 3-0, 2.5-0, 2-0, 1.5-0, 1-0, 또는 0.5-0의 pH에서 산 불활성화된다. 예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 대략 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0의 pH에서 산 불활성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물은 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 일시적으로 또는 비가역적으로 불활성화시키는 고염 또는 저염 (염 농도 상의 변화)에 노출된다. "염 불활성화"는 효소를 불활성화 (또는 적어도 부분적으로 불활성화)시키기에 충분한 염 농도로 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물을 조정하는 프로세스를 지칭한다. 일반적으로, 염 불활성화의 프로세스는 효소의 변성 (언폴딩)을 수반한다. 효소가 변성되는 염 농도는 유기체마다 다양하다. 이. 콜라이에서, 예를 들어, 천연 효소는 일반적으로, 600 mM 초과의 염 농도에서 변성된다. 이러한 변성 염 농도는 다른 유기체에 대한 변성 염 농도보다 더 높거나 낮을 수 있다. 염은 음이온과 양이온의 조합이다. 양이온의 비-제한적 예는 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 암모늄을 포함한다. 음이온의 비-제한적 예는 아세테이트, 클로라이드, 술페이트 및 포스페이트를 포함한다. 본원에 제공된 바와 같은 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 600-1000 mM, 또는 그 초과의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 700-1000 mM, 750-1000 mM, 800-1000 mM, 850-1000 mM, 900-1000 mM, 950-1000 mM의 염 농도에서 염 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 600-950 mM, 600-900 mM, 600-850 mM, 600-800 mM, 600-750 mM, 600-700 mM, 또는 600-650 mM의 염 농도에서 염 불활성화된다. 예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 대략 600 mM, 650 mM, 700 mM, 750 mM, 800 mM, 850 mM, 900 mM, 950 mM, 또는 1000 mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 400-0 mM, 또는 그 미만의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 350-0 mM, 300-0 mM, 250-0 mM, 200-0 mM, 150-0 mM, 100-0 mM, 또는 50-0 mM의 염 농도에서 염 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 400-50 mM, 400-100 mM, 400-150 mM, 400-200 mM, 400-250 mM, 400-300 mM, 또는 400-350 mM의 염 농도에서 염 불활성화된다. 예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 효소는 대략 400 mM, 350 mM, 300 mM, 250 mM, 200 mM, 150 mM, 100 mM, 50 mM, 또는 0 mM의 염 농도에서 염 불활성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유기 용매는 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 불활성화시키기 위해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에 부가된다. 유기 용매의 비-제한적 예는 에탄올, 메탄올, 에테르, 디옥산, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 아세토니트릴, 디메틸 술폭시드, 및 톨루엔을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세정제는 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 불활성화시키기 위해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에 부가된다. 세정제의 비-제한적 예는 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 에틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (ETMAB), 라우릴 트리메틸 암모늄 브로마이드 (LTAB). 및 라우릴 트리메틸암모늄 클로라이드 (LTAC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적 억제제는 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소를 불활성화시키기 위해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물에 부가된다. 화학적 억제제의 비-제한적 예는 소듐 오르토바나데이트 (단백질 포스포티로실 포스파타제의 억제제), 플루오린화나트륨 (포스포세릴 및 포스포트레오닐 포스파타제의 억제제), 소듐 피로포스페이트 (포스파타제 억제제), 인산나트륨, 및/또는 인산칼륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 억제제는 화학적 억제제 라이브러리로부터 선택된다.
본원에 사용된 조건부 접근법 중 임의의 것의 경우, 세포 용해물 또는 반응 혼합물에 존재하는 경로 효소 중 임의의 것이 또한, 제거 조건 (예를 들어, 고온 또는 저온, 산성 또는 염기성 pH 값, 고염 또는 저염, 세정제 및/또는 유기 용매)에 노출될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 경로 효소 (예를 들어, 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제)는 제거 조건을 견딜 수 있다. 효소가 제거 조건에 노출된 후, (불활성화 조건에 노출되기 이전의 효소 활성과 비교해서) 그의 효소 활성의 적어도 10% (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%)를 유지하는 경우에, 상기 효소는 제거 조건을 견디는 것으로 간주된다.
예를 들어, 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물의 천연 효소가 열 불활성화될 때 (예를 들어, 적어도 40℃, 또는 40-95℃의 온도에 적어도 2분, 또는 2-60분 동안 노출될 때), 경로 효소는 열안정성 효소일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 포스포리보실트랜스퍼라제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 및 폴리머라제 중 적어도 하나는 열안정성이다. 효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)가 (a) 천연 효소를 변성시키는 고온에 일시적으로 노출된 후 활성을 유지하거나 또는 (b) 천연 효소가 저속으로 기능하는 중간 온도 내지 고온에 일시적으로 노출된 후 고속으로 기능하는 경우에, 상기 효소는 열안정성인 것으로 간주된다. 열안정성 효소는 공지되어 있고, 사용되는 열안정성 효소의 비-제한적 예는 본원에 제공된다. 제거 조건을 견딜 수 있는 경로 효소의 다른 비-제한적 예가 또한, 본원에 제공된다.
분리 접근법. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 천연 효소는 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 물리적으로 제거된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 침전된다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 여과된다 (예를 들어, 크기에 근거함). 일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 포획 및/또는 크로마토그래피 (예를 들어, 정지상에 대한 차등 친화력에 의함)를 통해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 제거된다.
일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 친화성 크로마토그래피를 통해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 제거된다. 친화성 크로마토그래피의 예는 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 금속 결합 크로마토그래피 (예를 들어, 니켈 크로마토그래피), 렉틴 크로마토그래피, 및 GST 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 제거된다. 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)의 예는 디에틸아미노에틸 (DEAE) 크로마토그래피, 4급 아미노에틸 (QAE) 크로마토그래피, 및 4급 아민(Q) 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 양이온 교환 크로마토그래피의 예는 카르복시메틸 (CM) 크로마토그래피, 술포에틸 (SE) 크로마토그래피, 술포프로필 (SP) 크로마토그래피, 포스페이트 (P) 크로마토그래피, 및 술포네이트 (S) 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 바람직하지 못한 활성을 나타내는 효소는 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)를 통해 효소 제제, 세포 용해물, 및/또는 반응 혼합물로부터 제거된다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피의 예는 페닐 세파로즈 크로마토그래피, 부틸 세파로즈 크로마토그래피, 옥틸 세파로즈 크로마토그래피, 캅토 페닐 크로마토그래피, 토요펄(Toyopearl) 부틸 크로마토그래피, 토요펄 페닐 크로마토그래피, 토요펄 헥실 크로마토그래피, 토요펄 에테르 크로마토그래피, 및 토요펄 PPG 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 상세된 화학 중 임의의 것이 또 다른 한편으론, 경로 효소를 고정화 또는 포획하기 위해 사용될 수 있다.
열안정성 효소
본원에 제공된 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등) 중 임의의 것이 열안정성 효소일 수 있다. 열안정성은 비교적 높거나 낮은 온도에서 변성에 저항하는 효소의 성질을 지칭한다. 예를 들어, 효소가 42℃의 온도에서 변성 (불활성화)되는 경우, 유사한 활성 (예를 들어, 키나제 활성)을 갖는 효소가 42℃에서 변성하지 않으면 이는 "열안정성"인 것으로 간주된다.
효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)가 (a) 다른 천연 효소를 변성시키는 고온에 일시적으로 노출된 후 활성을 유지하거나 또는 (b) 천연 효소가 저속으로 기능하는 중간 온도 내지 고온에 일시적으로 노출된 후 고속으로 기능하는 경우에, 상기 효소는 열안정성인 것으로 간주된다.
효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)가 (a) 다른 천연 효소를 변성시키는 저온에 일시적으로 노출된 후 활성을 유지하거나 또는 (b) 천연 효소가 저속으로 기능하는 중간 온도 내지 저온에 일시적으로 노출된 후 고속으로 기능하는 경우에, 상기 효소는 또한, 열안정성인 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 높은 온도 (예를 들어, 이. 콜라이로부터 수득된 키나제의 경우에는 41℃보다 높은 온도이고, 많은 RNA 폴리머라제의 경우에는 37℃보다 높은 온도이다)에 일시적으로 노출된 후에 10% 초과 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 높은 온도에 일시적으로 노출된 후에 10-100%, 25-100%, 또는 50-100% 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 높은 온도에 일시적으로 노출된 후에 10-90%, 10-85%, 10-80%, 10-75%, 10-70%, 10-65%, 10-60%, 10-55%, 25-90%, 25-85%, 25-80%, 25-75%, 25-70%, 25-65%, 25-60%, 25-55%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-65%, 50-60%, 또는 50-55% 활성을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소은 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 높은 온도에 일시적으로 노출된 후에 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 활성을 유지한다.
일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 낮은 온도 (예를 들어, 이. 콜라이로부터 수득된 키나제의 경우에는 32℃보다 낮은 온도이고, 많은 RNA 폴리머라제의 경우에는 32℃보다 낮은 온도이다)에 일시적으로 노출된 후에 50% 초과 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 낮은 온도에 일시적으로 노출된 후에 50-100% 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 낮은 온도에 일시적으로 노출된 후에 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%, 50-70%, 50-65%, 50-60%, 또는 50-55% 활성을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 유사한 (비-열안정성) 천연 효소를 달리 변성시킬 것인 비교적 낮은 온도에 일시적으로 노출된 후에 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 활성을 유지한다.
일부 실시양태에서, 중간 온도 내지 고온 (예를 들어, 42-80℃)에 일시적으로 노출된 후의 열안정성 효소의 활성은 유사한 (비-열안정성) 천연 효소의 활성보다 더 크다 (예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 더 크다).
일부 실시양태에서, 중간 온도 내지 저온 (예를 들어, 32-0℃)에 일시적으로 노출된 후의 열안정성 효소의 활성은 유사한 (비-열안정성) 천연 효소의 활성보다 더 크다 (예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 더 크다).
열안정성 키나제의 활성은, 예를 들어, 이러한 키나제가 인산화할 수 있는 NMP 또는 NDP의 양에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 비교적 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 50% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 50% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 60% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 60% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 70% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 70% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 80% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 80% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 높은 온도 (예를 들어, 42℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 90% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 90% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다.
일부 실시양태에서, 비교적 낮은 온도 (예를 들어, 32℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 50% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 50% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 낮은 온도 (예를 들어, 32℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 60% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 60% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 낮은 온도 (예를 들어, 32℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 70% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 70% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 낮은 온도 (예를 들어, 32℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 80% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 80% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비교적 낮은 온도 (예를 들어, 32℃)에서의 열안정성 키나제는 37℃에서의 유사한 전환을 완료하는 데 필요한 것과 동일한 시간 내에 90% 초과의 NMP를 NDP로 전환시키거나, 또는 90% 초과의 NDP를 NTP로 전환시킨다.
열안정성 폴리머라제의 활성은, 예를 들어, 충실도 및 중합 동역학 (예를 들어, 중합 속도)에 근거하여 평가된다. 따라서, 열안정성 T7 폴리머라제의 1 단위는, 예를 들어, 37℃ 초과의 온도 (예를 들어, 50℃)에서 30분 내에 10 nmole의 NTP를 산 불용성 물질 내로 혼입할 수 있다. 또 다른 예에서, 열안정성 T7 폴리머라제의 1 단위는 32℃ 미만의 온도 (예를 들어, 25℃)에서 30분 내에 10 nmole의 NTP를 산 불용성 물질 내로 혼입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 열안정성 효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)는 42℃ 내지 80℃, 또는 그 초과의 온도에서 활성을 유지할 수 있다 (반응을 촉매할 수 있다). 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 42-80℃, 42-70℃, 42-60℃, 42-50℃, 50-80℃, 50-70℃, 50-60℃, 60-80℃, 60-70℃, 또는 70-80℃의 온도에서 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 또는 80℃의 온도에서 활성을 유지할 수 있다. 열안정성 효소는 비교적 높은 온도에서 15분 내지 48시간, 또는 그 초과 동안 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 열안정성 효소는 비교적 높은 온도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42, 또는 48시간 동안 활성을 유지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 열안정성 효소 (예를 들어, 키나제 또는 폴리머라제)는 32℃ 내지 0℃, 또는 그 미만의 온도에서 활성을 유지할 수 있다 (반응을 촉매할 수 있다). 일부 실시양태에서, 열안정성 효소는 32-5℃, 32-10℃, 32-20℃, 32-25℃, 32-30℃, 30-0℃, 25-0℃, 20-0℃, 10-0℃, 또는 5-0℃의 온도에서 활성을 유지한다. 예를 들어, 열안정성 효소는 32℃, 31℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 4℃, 3℃, 2℃, 1℃, 또는 0℃의 온도에서 활성을 유지할 수 있다. 열안정성 효소는 비교적 낮은 온도에서 15분 내지 48시간, 또는 그 초과 동안 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 열안정성 효소는 비교적 낮은 온도에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 36, 42, 또는 48시간 동안 활성을 유지할 수 있다.
열안정성 NMP 키나제의 비-제한적 예가 표 4A-4D에 열거된다. 다른 열안정성 키나제는 열안정성 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 (예를 들어, 표 5 참조), 열안정성 피루베이트 키나제, 및 열안정성 폴리포스페이트 키나제 (예를 들어, 표 2 참조)를 포함한다. 다른 열안정성 키나제가 본 개시내용에 의해 포괄된다.
RNA 폴리머라제의 비-제한적 예가 표 6에 열거된다. 열안정성 RNA 폴리머라제를 포함한 다른 RNA 폴리머라제가 본 개시내용에 의해 포괄된다.
열안정성 RNA 폴리머라제는 야생형 효소를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형 (예를 들어, 돌연변이)은 공지되어 있다. 예를 들어, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 하기 점 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: V426L, A702V, V795I, S430P, F849I, S633P, F880Y, C510R, 및 S767G (EP2377928 및 EP1261696A1; 이들 각각이 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 V426L, A702V, 및 V795I 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 S430P, F849I, S633P, 및 F880Y 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 F880Y, S430P, F849I, S633P, C510R, 및 S767G 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 Y639V, H784G, E593G, 및 V685A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 열안정성 T7 RNA 폴리머라제는 S430P, N433T, S633P, F849I, 및 F880Y 돌연변이를 포함한다. 다른 변이체 및 재조합 열안정성 폴리머라제가 본 개시내용에 의해 포괄된다.
일부 실시양태에서, 열안정성 T7 폴리머라제는 관심 RNA를 생산하기 위해 사용된다. 예를 들어, 0.1-5% 총 단백질 농도를 갖는 열안정성 T7 폴리머라제 (예를 들어, 37-60℃의 온도에서 인큐베이션됨)가, 1 g/L/hr 초과 (또는, 예를 들어, 1 g/L/hr - 20 g/L/hr)의 속도로 관심 RNA를 합성하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 많은 실시양태가 열안정성 폴리머라제/효소의 사용을 설명하지만, 다른 효소/폴리머라제가 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는, 예를 들어, 열안정성 효소(들)의 활성의 임의의 감소 또는 상실을 보상하기 위해 열-불활성화된 세포 용해물에 외생적으로 부가될 수 있다.
융합 효소
본원에 제공된 경로 효소 (예를 들어, 뉴클레아제, 키나제, 폴리머라제 등) 중 임의의 것은 개별 효소, 다중 활성을 갖는 효소, 또는 융합 효소일 수 있다. 융합 효소는 별도의 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 연결함으로써 창출될 수 있다. 이러한 융합 유전자의 번역은 각각의 원래 단백질, 예를 들어, 뉴클레아제로서 작용하고/하거나, 키나제로서 작용하고/하거나, 폴리머라제로서 작용하는 융합 단백질로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 또는 다중 폴리펩티드를 초래한다. 다른 효소가 또한, 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
자연에 존재하는 일부 효소는 다기능성이다 (예를 들어, CMP-UMP 키나제). 따라서, 용어 "효소"는 공급 방식에 관계없이 "효소 활성"을 포괄한다.
융합 효소가 뉴클레아제 활성 (핵산을 절단 또는 해중합한다; 예를 들어, RNase R)을 나타내는 경우, 이러한 융합 효소는 "뉴클레아제로서 작용"하는 것으로 간주된다. 융합 효소가 키나제 활성 (한 분자로부터 또 다른 분자로의 포스페이트 기의 전달을 촉매한다; 예를 들어, 폴리포스페이트 키나제)을 나타내는 경우, 이러한 융합 효소는 "키나제로서 작용"하는 것으로 간주된다. 융합 효소가 폴리머라제 활성 (뉴클레오타이드를 어셈블리하여 핵산을 생산한다; RNA 폴리머라제)을 나타내는 경우, 이러한 융합 효소는 "폴리머라제로서 작용"하는 것으로 간주된다.
에너지원
NTP 및/또는 RNA의 생산을 위해, 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 몇 가지 에너지원 및 포스페이트 공급원이 있다. 포스페이트 공급원의 비-제한적 예는 NTP (예를 들어, ATP, GTP, UTP, CTP), 폴리포스페이트 (예를 들어, 헥사메타포스페이트) 및 피로포스페이트 (PPi)를 포함한다. 일부 실시양태에서, NTP는 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되든지 간에, RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 키나제가, NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 아세테이트, ADP, 피로포스페이트, 및 적어도 2개의 아세테이트 키나제 (예를 들어, 아세테이트 키나제 (디포스페이트) EC 2.7.2.12 및 아세테이트 키나제 (인산화) EC.7.2.1)가, NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 시트레이트, AMP, 피로포스페이트, 시트레이트 리아제 (시트레이트 리아제 복합체), 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (PEPCK) 또는 포스포엔올피루베이트 카르복실라제 (PEPC), 및 피루베이트 포스페이트 디키나제 (PPDK)가, NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 술파이트, AMP, 피로포스페이트, 아데닐릴 술페이트 리덕타제, 및 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제가, NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 반응 혼합물에 포함된다. 다른 에너지원이 또한, 본 개시내용에 의해 포괄된다.
일부 실시양태에서, 에너지원은 아세테이트의 주기적 인산화를 통해 피로포스페이트로부터, 피로포스페이트 및 시트레이트로부터, 또는 피로포스페이트 및 술파이트로부터 생산된 ATP이다. 상기 경로로부터의 ATP 생산 방법이 본원에 기재되어 있다. ATP 생산 경로 및 경로 효소의 요약이 하기 표 7에 제공된다.
<표 7>
예시적인 ATP 생산 경로 및 효소의 요약
아세테이트 인산화/탈인산화 사이클을 통한 피로포스페이트 및 ADP로부터의 ATP 생산
본 개시내용의 일부 측면은 아세테이트 인산화/탈인산화 사이클을 통해 피로포스페이트 (고 에너지 포스페이트 공여체) 및 ADP (궁극적인 에너지/포스페이트 수용체)로부터 ATP를 생산하는 방법을 사용한다 (예를 들어, 도 14 참조). 제1 아세테이트 키나제 (AcK1; EC 2.7.2.12)는 무기 피로포스페이트 (PPi)를 사용하여 아세테이트를 인산화시켜, 아세틸-포스페이트 및 무기 포스페이트 (Pi)를 생산한다. 이어서, 아세틸-포스페이트는 제2 아세테이트 키나제 (AcK2; EC 2.7.2.1)에 의해 탈인산화되어, 아세틸-포스페이트로부터 ADP로 고 에너지 포스페이트 기를 전달하고 ATP 및 아세테이트를 생산한다. 이어서, 이로써 생성된 아세테이트는 AcK1에 의해 다시 자유롭게 인산화됨으로써, 반응 사이클을 완료한다.
일부 실시양태에서, 피로포스페이트 및 ADP로부터 ATP를 생산하는 방법은 제1 아세테이트 키나제, 제2 아세테이트 키나제, 또는 2개의 상이한 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 제1 아세테이트 키나제 및 제2 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아세테이트 키나제 및 제2 아세테이트 키나제는 단일 융합 (키메라) 단백질로서 발현된다.
일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 하나는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 모두는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 열안정성 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 제1 열안정성 아세테이트 키나제 및 제2 열안정성 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아세테이트의 주기적 인산화를 통해 피로포스페이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 삼투성, 기계적 (예를 들어, 초음파 처리), 화학적, 또는 효소적 용해)하여 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의) 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 예를 들어, 동일한 유기체 (예를 들어, 박테리아)로부터 또는 상이한 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모 및/또는 식물)로부터의 다수의 세포 용해물 (및 따라서 다수의 세포 집단)이, 본원에 제공된 바와 같은 효소 반응에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 하나의 세포 집단은 ATP 생산 경로의 제1 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작될 수 있는 반면, 또 다른 세포 집단은 ATP 생산 경로의 제2 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하고/하거나 적어도 하나의 부가의 아세테이트 키나제를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포를 용해한 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 아세테이트의 주기적 인산화를 통해 피로포스페이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을, 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 ATP 생산 경로의 열안정성 효소 중 어떠한 것도 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다. 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 일부 실시양태에서, 그의 활성 수준이 적어도 50% 만큼 감소될 때, 불활성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 그의 활성 수준이 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 감소될 때, 불활성인 것으로 간주된다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키기에 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4분, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 15분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 2분 미만 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%) 만큼 감소시키기에 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의 또는 적어도 3개의) 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 부가될 수 있다. 따라서, 반응 혼합물은 일부 실시양태에서, 세포 용해물에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨)와 적어도 하나의 정제된 효소의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 정제된 효소는 제1 아세테이트 키나제 및/또는 제2 아세테이트 키나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 열-불활성화 단계 후, 정제된 효소(들)를 부가하기 전에, (예를 들어, 50℃로) 냉각될 수 있다.
일부 실시양태에서, 아세테이트의 주기적 인산화를 통해 피로포스페이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 또한, 아세테이트, 아데노신 디포스페이트 (ADP), 및 무기 포스페이트의 존재 하에 열-불활성화된 용해물(들)을 인큐베이션하여 ATP를 생산하는 것을 포함한다. 무기 포스페이트는, 예를 들어, 피로포스페이트일 수 있다. 트리폴리포스페이트, 테트라폴리포스페이트, 펜타폴리포스페이트, 헥사메타포스페이트 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다른 무기 포스페이트 및/또는 오르토포스페이트 중합체가 사용될 수 있다.
아세테이트의 주기적 인산화를 통해 피로포스페이트로부터 ATP를 생산하기 위해 사용되는 세포 및 세포 용해물이 또한 본원에 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의) 아세테이트 키나제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의) 열안정성 아세테이트 키나제를 포함한다.
<표 8>
예시적인 아세테이트 키나제 효소
피로포스페이트, AMP, 및 시트레이트로부터의 ATP 생산
본 개시내용의 일부 측면은 피로포스페이트, AMP 및 시트레이트로부터 ATP를 생산하는 방법을 사용한다 (예를 들어, 도 15a-15b 참조). 3 단계 효소 경로가 도 15a에 도시되어 있다. 제1 단계에서, 시트레이트 리아제는 시트레이트를 아세테이트 및 옥살로아세테이트로 전환시킨다. 제2 단계에서, 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제 (PEPCK)는 제1 단계에서 생성된 피로포스페이트 및 옥살로아세테이트를 포스포엔올피루베이트 (PEP), 이산화탄소 (CO2), 및 무기 포스페이트 (Pi)로 전환시킨다. 제3 단계에서, 피루베이트 포스페이트 디키나제 (PPDK)는 제2 단계에서 생성된 무기 피로포스페이트 (PPi), AMP, 및 PEP를 피루베이트, Pi 및 ATP로 전환시킨다. 복합 화학 반응은 1 몰의 시트레이트, 1 몰의 AMP 및 2 몰의 PPi를 사용하여 1 몰의 아세테이트, 1 몰의 피루베이트, 1 몰의 CO2, 2 몰의 Pi 및 1 몰의 ATP를 산출한다 (도 15b). 또 다른 한편으론, 포스포엔올피루베이트 카르복실라제 (PEPC)는 PEP의 옥살로아세테이트로의 카르복실화를 촉매하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 특정 조건 하에서 가역적일 수 있다.
이들 방법은 일부 실시양태에서, 시트레이트 리아제, PEPCK (또는 적어도 하나의 PEPC), PPDK, 또는 전술한 효소 중 적어도 2개의 또는 적어도 3개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시트레이트 리아제 및 PEPCK (또는 PEPC), PEPCK (또는 PEPC) 및 PPDK, 또는 시트레이트 리아제 및 PPDK는 단일 융합 (키메라) 단백질로서 발현된다.
일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 하나는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개 또는 적어도 3개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 모두는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 열안정성 시트레이트 리아제, 열안정성 PEPCK, PPDK, 또는 전술한 열안정성 효소 중 적어도 2개의 또는 적어도 3개의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시트레이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 삼투성, 기계적 (예를 들어, 초음파 처리), 화학적, 또는 효소적 용해)하여 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개 또는 3개의) 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 예를 들어, 동일한 유기체 (예를 들어, 박테리아)로부터 또는 상이한 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모 및/또는 식물)로부터의 다수의 세포 용해물 (및 따라서 다수의 세포 집단)이, 본원에 제공된 바와 같은 효소 반응에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 하나의 세포 집단은 ATP 생산 경로의 하나 이상의 효소를 발현하도록 조작될 수 있는 반면, 또 다른 세포 집단 (또는 몇 가지 다른 세포 집단)은 ATP 생산 경로의 또 다른 (적어도 하나의 다른) 효소를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시트레이트 리아제를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하고/하거나, PEPCK (열안정성 PEPCK)를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하고/하거나, PPDK를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포를 용해한 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 시트레이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을, 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 ATP 생산 경로의 열안정성 효소 중 어떠한 것도 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다. 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 일부 실시양태에서, 그의 활성 수준이 적어도 50% 만큼 감소될 때, 불활성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 그의 활성 수준이 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 감소될 때, 불활성인 것으로 간주된다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키기에 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4분, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%) 만큼 감소시키기에 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의 또는 적어도 3개의) 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 부가될 수 있다. 따라서, 반응 혼합물은 일부 실시양태에서, 세포 용해물에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨)와 적어도 하나의 정제된 효소의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 정제된 효소는 시트레이트 리아제, PEPCK (또는 PEPC), 및 PPDK로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 열-불활성화 단계 후, 정제된 효소(들)를 부가하기 전에, (예를 들어, 50℃로) 냉각될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시트레이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 또한, 시트레이트, 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 및 무기 포스페이트의 존재 하에 열-불활성화된 용해물(들)을 인큐베이션하여 ATP를 생산하는 것을 포함한다. 무기 포스페이트는, 예를 들어, 피로포스페이트일 수 있다. 트리폴리포스페이트, 테트라폴리포스페이트, 펜타폴리포스페이트, 헥사메타포스페이트 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다른 무기 포스페이트 및/또는 오르토포스페이트 중합체가 사용될 수 있다.
시트레이트로부터 ATP를 생산하기 위해 사용되는 세포 및 세포 용해물이 또한 본원에 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 시트레이트 리아제, PEPCK (또는 PEPC), 및 PPDK로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의 또는 적어도 3개의) 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 열안정성 시트레이트 리아제, 열안정성 PEPCK (또는 열안정성 PEPC), 및 열안정성 PPDK로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의 또는 적어도 3개의) 효소를 포함한다.
<표 9>
피로포스페이트 및 시트레이트 경로 효소로부터의 예시적인 ATP 생산
피로포스페이트, AMP, 및 술파이트로부터의 ATP 생산
본 개시내용의 일부 측면은 피로포스페이트, AMP, 및 술파이트로부터 ATP를 생산하기 위한 방법을 사용한다 (예를 들어, 도 16 참조). 제1 단계에서, 아데닐릴 술페이트 리덕타제는 술파이트의 소비와 함께 아데노신 모노포스페이트 (AMP)를 아데노신 5'-포스포술페이트 (APS)로 전환시킨다. 제2 단계에서, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제는 ATP의 생성 및 피로포스페이트의 소비와 함께 APS를 술페이트로 전환시키는 것을 촉매한다.
일부 실시양태에서, 피로포스페이트, AMP, 및 술파이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 아데닐릴 술페이트 리덕타제, 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제, 또는 아데닐릴 술페이트 리덕타제와 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제의 조합을 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데닐릴 술페이트 리덕타제 및 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제는 단일 융합 (키메라) 단백질 또는 이작용성 단백질로서 발현된다.
일부 실시양태에서, 전자 싱크로서 제공되는 환원제가 부가될 수 있다. 이러한 환원제의 예는 디티오트레이톨 (DTT) 또는 글루타티온 또는 페리시아니드 또는 디티오에리트리톨 또는 트리스-2-카르복시에틸포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 개별 효소는 그들의 보조 인자 선호도에 있어서 상이할 것이지만, 생물학적 보조 인자, 예컨대 NAD+, NADP+, NADH 또는 NADPH가 효소에 의해 이들 전자를 흡수하는 데 사용될 수 있는 경우가 있을 수 있다. 이러한 경우에, 이들과 같은 보조 인자가 포함될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 하나는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 중 적어도 2개는 열안정성 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 모두는 열안정성 효소이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 열안정성 아데닐릴 술페이트 리덕타제 및 열안정성 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 발현하도록 조작된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 술파이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 배양된 세포를 용해 (예를 들어, 열적, 삼투성, 기계적 (예를 들어, 초음파 처리), 화학적, 또는 효소적 용해)하여 적어도 하나의 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개의) 세포 용해물을 생산하는 것을 포함한다. 예를 들어, 동일한 유기체 (예를 들어, 박테리아)로부터 또는 상이한 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모 및/또는 식물)로부터의 다수의 세포 용해물 (및 따라서 다수의 세포 집단)이, 본원에 제공된 바와 같은 효소 반응에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 하나의 세포 집단은 아데닐릴 술페이트 리덕타제를 발현하도록 조작될 수 있는 반면, 또 다른 세포 집단 (또는 몇 가지 다른 세포 집단)은 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 아데닐릴 술페이트 리덕타제를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하고/하거나 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 발현하도록 조작된 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 세포를 용해한 후, 효소가 단일 세포 용해물/반응 혼합물에 존재하도록 세포 용해물을 조합한다.
일부 실시양태에서, 술파이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 세포 용해물(들) (또는 세포 용해물 혼합물)을, 천연 효소 활성은 불활성화시키지만 ATP 생산 경로의 열안정성 효소 중 어떠한 것도 불활성화시키지 않는 온도로 가열하여 열-불활성화된 용해물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 세포 용해물(들)은 일부 실시양태에서, 적어도 50℃의 온도로 가열된다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 또는 90℃의 온도로 가열될 수 있다. 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 일부 실시양태에서, 그의 활성 수준이 적어도 50% 만큼 감소될 때, 불활성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)는 그의 활성 수준이 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 감소될 때, 불활성인 것으로 간주된다.
세포 용해물(들)은 세포의 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)를 불활성화시키기에 충분한 기간 동안 가열될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물(들)은 적어도 2, 3, 4분, 또는 적어도 5분 동안 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 5분 초과 동안 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물(들)은 천연 효소 (또는 다른 비-열안정성 효소)의 활성을 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 90%) 만큼 감소시키기에 충분한 기간 동안 가열된다.
열 불활성화 후, 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의 또는 적어도 3개의) 정제된 효소가 세포 용해물/반응 혼합물에 부가될 수 있다. 따라서, 반응 혼합물은 일부 실시양태에서, 세포 용해물, 이러한 세포 용해물에 존재하는 효소 (조작된 숙주 세포(들)에 의해 발현됨) 및 적어도 하나의 정제된 효소의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 정제된 효소는 제1 아세테이트 키나제 및/또는 제2 아세테이트 키나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물은 열-불활성화 단계 후, 정제된 효소(들)를 부가하기 전에, (예를 들어, 50℃로) 냉각될 수 있다.
일부 실시양태에서, 술파이트로부터 ATP를 생산하는 방법은 또한, 술파이트, 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 및 무기 포스페이트의 존재 하에 열-불활성화된 용해물(들)을 인큐베이션하여 ATP를 생산하는 것을 포함한다. 무기 포스페이트는, 예를 들어, 피로포스페이트일 수 있다. 트리폴리포스페이트, 테트라폴리포스페이트, 펜타폴리포스페이트, 헥사메타포스페이트 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다른 무기 포스페이트 및/또는 오르토포스페이트 중합체가 사용될 수 있다.
ATP를 생산하기 위해 사용되는 세포 및 세포 용해물이 또한 본원에 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의) 아데닐릴 술페이트 리덕타제 및/또는 적어도 하나의 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 및/또는 식물 세포) 또는 세포 용해물(들)은 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2개의, 적어도 3개의, 또는 적어도 4개의) 열안정성 아데닐릴 술페이트 리덕타제 및/또는 적어도 하나의 열안정성 술페이트 아데닐릴트랜스퍼라제를 포함한다.
<표 10>
피로포스페이트, AMP, 및 술파이트 경로 효소로부터의 예시적인 ATP 생산
세포 RNA의 해중합
일부 실시양태에서, 세포 RNA는 NTP 및/또는 RNA의 생산을 위한 기질로서 제공된다. 세포 RNA의 해중합 (분해)은 해중합을 위해 사용된 효소에 따라, 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP) 또는 5'-뉴클레오시드 모노포스페이트 (5'-NMP)를 포함하는 풀을 생성한다.
세포 RNA는 일부 실시양태에서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase) (예를 들어, 표 1 참조)를 사용하여 NDP로 해중합된다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물에 사용된 PNPase의 농도는 0.001-10 mg/mL (예를 들어, 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 5, 또는 10 mg/mL)이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 PNPase의 농도는 0.5-5 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 PNPase의 농도는 5 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 PNPase의 농도는 10 mg/mL 초과이다.
세포 RNA는 다른 실시양태에서, 예를 들어, 뉴클레아제 (예를 들어, RNase R 또는 P1 뉴클레아제) (예를 들어, 표 1 참조)를 사용하여 NMP로 해중합된다. 효소에 따라, RNA의 효소적 해중합은 3'-NMP, 5'-NMP 또는 3'-NMP와 5'-NMP의 조합을 산출할 수 있다. 3'-NTP (3'-NMP로부터 전환되는 3'-NDP로부터 전환됨)를 중합시키는 것이 가능하지 않기 때문에, 5'-NMP (이는 이어서 5'-NDP로 전환된 다음, 5'-NTP로 전환된다)를 산출하는 효소 (예를 들어, RNase R 및/또는 P1 뉴클레아제)가 바람직하다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물에 사용된 뉴클레아제 (예를 들어, RNase R 및/또는 P1 뉴클레아제)의 농도는 0.001-10 mg/mL (예를 들어, 0.001, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 5, 또는 10 mg/mL)이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 뉴클레아제의 농도는 0.5-5 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 뉴클레아제의 농도는 5 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 뉴클레아제의 농도는 10 mg/mL 초과이다.
PNPase 및/또는 RNase는 일부 실시양태에서, PNPase 및/또는 RNase를 발현하는 세포로부터 수득되거나 또는 이러한 세포의 세포 용해물의 성분이다.
관심 RNA 산물을 합성하는 데 필요한 세포 RNA의 양은, 예를 들어, RNA 산물의 원하는 길이 및 수율뿐만 아니라 세포 RNA 출발 물질의 뉴클레오티드 조성과 비교한 RNA 산물의 뉴클레오티드 조성에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 박테리아 세포 또는 효모 세포의 경우, 예를 들어, 세포 RNA 함량은 총 세포 질량의 5 내지 50% 범위이다. 총 세포 질량의 퍼센트는, 예를 들어, 하기 방정식을 사용하여 계산될 수 있다: (RNA의 킬로그램 (kg)/건조 세포 중량의 킬로그램) x 100%.
NMP의 생산에 적합한 조건 및 NDP의 생산에 적합한 조건은 관련 기술 분야에 공지되어 있거나, 또는 예를 들어, 반응 혼합물의 pH (예를 들어, pH 3-8), 온도 (예를 들어, 15℃ 내지 70℃), 기간 (예를 들어, 5분 내지 72시간), 및 염 농도 (예를 들어, 5 mM 내지 1 M의 농도 하의 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨)뿐만 아니라 임의의 외인성 보조 인자를 포함한, 뉴클레아제 (예를 들어, RNase) 활성에 대한 최적의 조건을 고려하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 특별한 pH 값 및/또는 염 농도를 달성하기 위해, 완충제가 세포 용해물에 부가된다. 완충제의 예는 포스페이트 완충제, 트리스 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제, 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 말레이트 완충제, MES 완충제, 히스티딘 완충제, PIPES 완충제, 비스-트리스 완충제, 및 에탄올아민 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 반응 혼합물은 37℃의 온도에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 반응 혼합물은 37℃의 온도에서 5 내지 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 반응 혼합물은 7.0의 pH를 가지며, 37℃의 온도에서 15분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 반응 혼합물은 RNA를 NDP로 65% 초과하여 전환시키거나 또는 RNA를 5'-NMP로 65% 초과하여 전환시키는 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 (또는 적어도) 50 mM/hr, 100 mM/hr 또는 200 mM/hr의 속도로 NDP 또는 5'-NMP로 전환된다. 다른 실시양태에서, RNA 해중합 반응 동안의 반응 혼합물은 실시예 5에서와 같이, 더 높은 온도 (예를 들어, 50℃-70℃)에서 인큐베이션된다.
RNA 산물의 중합
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산되거나 또는 상업적 공급원으로부터 공급된 NTP는 관심 RNA 산물의 생산을 위한 생합성 경로에 사용된다. RNA 산물을 코딩하도록 설계된 DNA는 RNA의 합성을 위한 주형으로서 제공된다. DNA 주형은 일부 경우에, 관심 RNA의 전사를 선택적으로 구동시키는 전사 프로모터를 갖도록 조작될 수 있다. RNA의 중합은 NTP, 전사 프로모터를 포함하는 DNA 주형, 및 전사 프로모터에 특이적인 폴리머라제 (예를 들어, RNA 폴리머라제)를 필요로 한다. 전형적으로, 본원에 제공된 바와 같이 사용하기 위한 폴리머라제는 단일 서브유닛 폴리머라제이고, 그의 동족 전사 프로모터에 대해 고도로 선택적이며, 고 충실도를 가지고, 고도로 효율적이다.
일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 DNA 주형의 농도는 0.001-10 μg/μl이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중의 DNA 주형의 농도는 0.001 μg/μl, 0.05 μg/μl, 0.1 μg/μl, 0.5 μg/μl, 1.0 μg/μl, 5 μg/μl, 또는 10 μg/μl이다.
RNA의 생산에 적합한 조건은 관련 기술 분야에 공지되어 있거나, 또는 예를 들어, 반응 혼합물의 pH (예를 들어, pH 3-8), 온도 (예를 들어, 15℃ 내지 70℃), 기간 (예를 들어, 5분 내지 72시간), 및 염 농도 (예를 들어, 5 mM 내지 1 M의 농도 하의 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨)뿐만 아니라 임의의 외인성 보조 인자를 포함한, 폴리머라제 (예를 들어, T7 RNA 폴리머라제) 활성에 대한 최적의 조건을 고려하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 특별한 pH 값 및/또는 염 농도를 달성하기 위해, 완충제가 세포 용해물에 부가된다. 완충제의 예는 포스페이트 완충제, 트리스 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제, 시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 말레이트 완충제, MES 완충제, 히스티딘 완충제, PIPES 완충제, 비스-트리스 완충제, 및 에탄올아민 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNA 중합 반응 동안의 반응 혼합물은 37℃의 온도에서 0.5 내지 24시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, RNA 중합 반응 동안의 반응 혼합물은 50℃의 온도에서 0.5 내지 24시간 동안 인큐베이션된다.
세포 및 세포 용해물
본 개시내용의 세포는 일부 실시양태에서, 세포 RNA, RNA를 해중합시키는 효소 (예를 들어, RNase), 경로 효소 (예를 들어, 재조합 효소, 예컨대 폴리포스페이트 키나제), 및/또는 폴리머라제 (예를 들어, RNA 폴리머라제)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 관심 RNA 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 임의로 전사 종결 인자를 함유하는 DNA 주형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 조작된 세포이다. 조작된 세포는 조작된 (예를 들어, 재조합 또는 합성) 핵산을 포함하거나, 또는 이들이 자신의 자연적으로 발생하는 대응물과 구조적으로 및/또는 기능적으로 완전히 다르도록 달리 변형되는 세포이다. 따라서, 조작된 핵산을 함유하는 세포는 "조작된 세포"로 간주된다.
핵산 (예를 들어, 조작된 핵산)에 의해 코딩된 산물이 특정 세포에서 생산되는 경우, 이러한 세포는 그 산물을 "발현"한다. 유전자 발현은 핵산 형태의 유전적 지시가 특정 산물, 예컨대 단백질 (예를 들어, 효소)을 합성하기 위해 사용되는 프로세스를 지칭하는 것으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유 동물 세포, 식물 세포, 또는 다른 유형의 세포이다.
본 개시내용의 박테리아 세포는 에스케리키아(Escherichia) 종, 스트렙토미세스(Streptomyces) 종, 자이모모나스(Zymomonas) 종, 아세토박터(Acetobacter) 종, 시트로박터(Citrobacter) 종, 시네코시스티스(Synechocystis) 종, 리조비움(Rhizobium) 종, 클로스트리디움(Clostridium) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 크산토모나스(Xanthomonas) 종, 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 바실루스(Bacillus) 종, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 아에로모나스(Aeromonas) 종, 아조토박터(Azotobacter) 종, 코마모나스(Comamonas) 종, 미코박테리움(Mycobacterium) 종, 로도코쿠스(Rhodococcus) 종, 글루코노박터(Gluconobacter) 종, 랄스토니아(Ralstonia) 종, 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus) 종, 미크로루나투스(Microlunatus) 종, 게오박터(Geobacter) 종, 게오바실루스(Geobacillus) 종, 아르트로박터(Arthrobacter) 종, 플라보박테리움(Flavobacterium) 종, 세라티아(Serratia) 종, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 종, 써무스 종, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 종, 크로모박테리움(Chromobacterium) 종, 시노르히조비움(Sinorhizobium) 종, 사카로폴리스포라 종, 아그로박테리움(Agrobacterium) 종, 판토에아(Pantoea) 종, 및 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 효모 세포는 조작된 사카로미세스(Saccharomyces) 종, 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia) 및 피치아(Pichia)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 에스케리키아 콜라이 세포, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 세포, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포, 또는 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 에스케리키아 콜라이 세포이다.
전형적으로, 세포는 배양된다. 배양은 세포가 전형적으로 자신의 자연 환경 밖에서 제어된 조건 하에 성장하는 프로세스이다. 예를 들어, 세포, 예컨대 박테리아 세포는 액체 배양 배지로서 지칭되기도 하는 액체 영양 브로스에서 세포 현탁액으로서 성장될 수 있다.
흔히 사용되는 박테리아 에스케리키아 콜라이 성장 배지의 예는 LB [리소게니 브로스(Lysogeny Broth)] 밀러(Miller) 브로스 (1% NaCl): 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 1% NaCl; LB (리소게니 브로스) 레녹스(Lennox) 브로스 (0.5% NaCl): 1% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 0.5% NaCl; SOB 배지 (최고 최적의 브로스): 2% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4; SOC 배지 (이화 억제인자를 수반한 최고 최적의 브로스): SOB + 20 mM 글루코스; 2x YT 브로스 (2x 효모 추출물 및 트립톤): 1.6% 펩톤, 1% 효모 추출물, 및 0.5% NaCl; TB [테리픽 브로스(Terrific Broth)] 배지: 1.2% 펩톤, 2.4% 효모 추출물, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4 및 0.4% 글리세롤; 및 SB (슈퍼 브로스) 배지: 3.2% 펩톤, 2% 효모 추출물, 및 0.5% NaCl 및/또는 코르츠(Korz) 배지를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Korz, DJ et al. 1995).
고 밀도 박테리아 에스케리키아 콜라이 성장 배지의 예는 DNAGro™ 배지, ProGro™ 배지, AutoX™ 배지, DetoX™ 배지, InduX™ 배지, 및 SecPro™ 배지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 세포는 효소 또는 핵산의 발현을 초래하는 조건 하에서 배양된다. 이러한 배양 조건은 발현되는 특별한 산물 및 원하는 양의 산물에 의존할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 30℃ 내지 40℃의 온도에서 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃의 온도에서 배양될 수 있다. 전형적으로, 세포, 예컨대 조작된 이. 콜라이 세포는 37℃의 온도에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 세포는 12시간 내지 72시간 또는 그 초과의 기간 동안 배양된다. 예를 들어, 조작된 세포는 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 또는 72시간의 기간 동안 배양될 수 있다. 전형적으로, 세포, 예컨대 조작된 박테리아 세포는 12 내지 24시간의 기간 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 37℃의 온도에서 12 내지 24시간 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 세포는 600 nm의 파장에서 측정된 5 내지 200의 광학 밀도 (OD600)로 (예를 들어, 액체 세포 배양 배지 중에서) 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 또는 200의 OD600로 배양된다.
일부 실시양태에서, 세포는 1 x 108 (OD600< 1) 내지 2 x 1011 (OD 약 200)개의 생존 세포/ml 세포 배양 배지의 밀도로 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108, 6 x 108, 7 x 108, 8 x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4 x 1010, 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 1 x 1011, 또는 2 x 1011개의 생존 세포/ml의 밀도로 배양된다. (전환 계수: OD 1 = 8 x 108개의 세포/ml).
일부 실시양태에서, 세포는 바이오리액터(bioreactor)에서 배양된다. 바이오리액터는 단순히 세포가 배양되는 용기, 예컨대 배양 플라스크, 접시, 또는 1회용 (사용 후 버릴 수 있는), 가압 멸균 가능한 또는 멸균 가능한 백을 지칭한다. 바이오리액터는 유리로 만들어지거나, 또는 중합체 기반일 수 있거나, 또는 다른 재료로 만들어 질 수 있다.
바이오리액터의 예는 교반 탱크 (예를 들어, 잘 혼합된) 바이오리액터 및 관형 (예를 들어, 플러그 흐름) 바이오리액터, 에어 리프트 바이오리액터, 막 교반 탱크, 스핀 필터 교반 탱크, 진동 혼합기, 유동층 반응기 및 막 바이오리액터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바이오리액터를 작동시키는 방식은 배치식 또는 연속식 프로세스일 수 있으며 배양되는 조작된 세포에 의존할 것이다. 공급물 및 산물 스트림이 지속적으로 공급되고 시스템으로부터 배출될 때, 바이오리액터는 연속식이다. 배치식 바이오리액터는 연속적인 재순환 흐름을 가질 수 있지만, 영양소 또는 산물 수거물을 연속적으로 공급하지는 않는다. 간헐적 수거 및 공급-배치식 (또는 배치 공급식) 배양의 경우, 세포는 조성이 배치식 배지와 유사한 배지에서 더 낮은 생존 세포 밀도로 접종된다. 영양소가 다소 고갈되고 세포가 정지 성장기에 접근할 때까지, 세포는 본질적으로 외부 조작없이 기하 급수적으로 성장할 수 있다. 이러한 시점에서, 간헐적 수거 배치 공급식 프로세스의 경우, 세포 및 산물의 일정 부분이 수거될 수 있고, 제거된 배양 배지는 신선한 배지로 보충된다. 이러한 프로세스는 여러 번 반복될 수 있다. 재조합 단백질 및 항체의 생산을 위해, 공급-배치식 프로세스가 사용될 수 있다. 세포가 기하 급수적으로 성장하고 있지만 영양소가 고갈되는 동안, 농축된 피드 배지 (예를 들어, 10 내지 15배 농축된 기저 배지)를 연속적으로 또는 간헐적으로 부가하여 부가의 영양소를 공급하여, 세포 농도와 생산 시기의 기간을 추가로 증가시킬 수 있다. 신선한 배지는 배양 배지 (브로스)의 제거없이 세포 농도에 비례하여 부가될 수 있다. 배지의 부가를 수용하기 위해, 공급-배치식 배양은 바이오리액터의 전체 용량보다 훨씬 더 낮은 용적 (예를 들어, 최대 용적의 대략 40% 내지 50%)에서 시작된다.
본 개시내용의 일부 방법은 RNA (예를 들어, mRNA)의 대규모 (상업적 규모) 생산에 관한 것이다. 대규모 생산 방법의 경우, 세포를 액체 배양 배지에서 5 리터 (L) 내지 250,000 L 이상의 용적으로 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 액체 배양 배지에서 10 L, 100 L, 1000 L, 10000 L, 또는 100000 L 이상의 용적으로 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 액체 배양 배지에서 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L, 100 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 10000 L, 100000 L, 150000 L, 200000 L, 250000 L, 또는 그 초과의 용적으로 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 액체 배양 배지에서 5 L 내지 10 L, 5 L 내지 15 L, 5 L 내지 20 L, 5 L 내지 25 L, 5 L 내지 30 L, 5 L 내지 35 L, 5 L 내지 40 L, 5 L 내지 45 L, 10 L 내지 15 L, 10 L 내지 20 L, 10 L 내지 25 L, 20 L 내지 30 L, 10 L 내지 35 L, 10 L 내지 40 L, 10 L 내지 45 L, 10 L 내지 50 L, 15 L 내지 20 L, 15 L 내지 25 L, 15 L 내지 30 L, 15 L 내지 35 L, 15 L 내지 40 L, 15 L 내지 45 L, 또는 15 내지 50 L의 용적으로 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 액체 배양 배지에서 100 L 내지 300000 L, 100 L 내지 200000 L, 또는 100 L 내지 100000 L의 용적으로 성장시킬 수 있다.
전형적으로, 세포를 배양한 후 세포를 용해시킨다. 용해시키는 것은, 예를 들어, 바이러스, 열, 화학적, 효소적, 기계적 또는 삼투 메커니즘에 의해 세포를 분해시키는 프로세스이다. 세포 용해물은, 예를 들어, 세포 소기관, 막 지질, 단백질, 핵산 및 역막 소포를 포함한, 용해된 세포 (예를 들어, 용해된 조작된 세포)의 내용물을 함유하는 유체이다. 본 개시내용의 세포 용해물은 본원에 제공된 바와 같이 조작된 세포의 임의의 집단을 용해시킴으로써 생산될 수 있다.
세포 용해는 조심스럽게 제어된 세포 환경을 방해하여, 비조절된 내인성 프로테아제 및 포스파타제에 의한 단백질 분해 및 변형을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 프로테아제 억제제 및/또는 포스파타제 억제제 및/또는 뉴클레아제 억제제 및/또는 가수분해효소 억제제 및/또는 데아미나제 억제제가 용해 전에 세포 용해물 또는 세포에 부가될 수 있거나, 또는 이들 활성은 열 불활성화, 유전자 불활성화, 또는 프로테아제 표적화에 의해 제거될 수 있다.
세포 용해물은 일부 실시양태에서, 영양소와 조합될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 Na2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, NaCl, MgSO4, CaCl2와 조합될 수 있다. 다른 영양소의 예는 황산마그네슘, 염화마그네슘, 마그네슘 오로테이트, 시트르산 마그네슘, 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨, 삼염기성 인산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 삼염기성 인산나트륨, 일염기성 인산암모늄, 이염기성 인산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 및 수산화암모늄을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
세포 용해물은 일부 실시양태에서, 보조 인자와 조합될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물은 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 또는 효소의 활성에 필요한 다른 비-단백질 화학 화합물 (예를 들어, 무기 이온 및 보조 효소)과 조합될 수 있다.
단일 반응을 위해 사용된 세포 용해물의 용적은 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물의 용적은 0.001 내지 250 m3이다.
핵산
"핵산"은 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드이고, 일부 경우에, 포스포디에스테르 결합 (예를 들어, 포스포디에스테르 "골격")을 함유할 수 있다. 핵산 (예를 들어, 핵산의 성분 또는 부분)은 자연적으로 발생하거나 또는 조작될 수 있다. "자연적으로 발생하는" 핵산은 인간의 개입없이 자연에서 존재하는 세포에 존재한다. "조작된 핵산"은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "재조합 핵산"은 핵산 분자 (예를 들어, 동일한 종으로부터 유래되거나 또는 상이한 종으로부터 유래됨)를 연결함으로써 구축되고 전형적으로 살아있는 세포에서 복제될 수 있는 분자를 지칭한다. "합성 핵산"은 생물학적으로 합성되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 다른 수단에 의해 합성 또는 증폭되는 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학적으로 변형되거나 또는 달리 변형되지만 자연적으로 발생하는 핵산 분자와 염기쌍을 이룰 수 있는 핵산을 포함한다. 재조합 및 합성 핵산은 또한, 전술한 것 중 하나의 복제로부터 비롯되는 분자를 포함한다. 조작된 핵산은 자연적으로 발생하는 핵산의 일부분을 함유할 수 있지만, 전체적으로 조작된 핵산은 자연적으로 발생하지 않으며 인간의 개입이 필요하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 산물을 코딩하는 핵산은 재조합 핵산 또는 합성 핵산이다. 다른 실시양태에서, 산물을 코딩하는 핵산은 자연적으로 발생한다.
본원에 제공된 바와 같이, RNA를 코딩하는 조작된 DNA 주형은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 프로모터는 핵산의 나머지 부분의 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산의 제어 영역이다. 프로모터는 그것이 조절하는 핵산의 발현을 구동시키거나 또는 전사를 구동시킨다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 내인성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 코딩 핵산 서열은 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 위치될 수 있으며, 이러한 이종 프로모터는 자신의 자연 환경에서 코딩된 서열과 정상적으로 연합되지 않는 프로모터를 지칭한다. 이러한 프로모터는 다른 유전자의 프로모터; 임의의 다른 세포로부터 단리된 프로모터; 및 "자연적으로 발생하지" 않는 합성 프로모터 또는 인핸서, 예컨대, 예를 들어, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 관련 기술 분야에 공지되는 유전 공학 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 것을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 외에도, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함한, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 서열을 생산할 수 있다.
프로모터는 그것이 뉴클레오티드 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어 ("구동")하도록 조절되는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및 배향으로 있을 때, 그러한 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 것으로 간주된다.
본 개시내용의 조작된 핵산은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터는 코딩 서열, 및 임의로 하나 이상의 전사 종결 인자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 단백질 또는 RNA 산물을 코딩한다. "구성적 프로모터"는 세포에서 지속적으로 활성인 프로모터를 지칭한다. "유도성 프로모터"는 유도 인자 또는 유도제의 존재 하에 있거나, 그에 의해 영향을 받거나 또는 그에 의해 접촉되거나, 또는 억제를 유발하는 인자의 부재 하에 활성화될 때, 전사 활성을 개시 또는 증강시키는 프로모터를 지칭한다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 프로모터는 본원에 기재되거나 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 화학적으로/생화학적으로 조절된 프로모터 및 물리적적으로 조절된 프로모터, 예컨대 유기 용매 조절된 프로모터, 테트라사이클린 조절된 프로모터, 스테로이드 조절된 프로모터, 금속 조절된 프로모터, 발병 기전 조절된 프로모터, 온도/열 유도성 프로모터, 포스페이트 조절된 (예를 들어, PhoA) 프로모터 및 광 조절된 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 바와 같이, RNA를 코딩하는 조작된 DNA 주형은, 폴리머라제가 전사를 정지시키고 DNA 주형으로부터 분리되도록 하는 핵산의 제어 영역인 하나 이상의 전사 종결 인자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
종결 인자는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트의 하류에 위치한 3'-비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연합된 하나 이상의 서열일 수 있다. 이러한 종결 인자는 내인성이거나 또는 개선된 종결 효율을 위해 조작될 수 있다. 하나 이상의 공급원로부터의 내인성 및/또는 조작된 종결 인자 서열은 개선된 종결 효율을 위해 연속적으로 부가될 수 있다.
RNA를 코딩하는 원형 DNA 주형은 비-주형 DNA 서열, 예를 들어, 플라스미드 골격의 일부인 서열의 전사를 최소화하거나 방지하기 위한 하나 이상의 전사 종결 인자를 포함할 수 있다.
조작된 핵산은 형질 전환, 형질 감염 [예를 들어, 화학적 (예를 들어, 인산칼슘, 양이온성 중합체 또는 리포좀) 또는 비-화학적 (예를 들어, 전기 천공, 소노포레이션(sonoporation), 임팔레펙션(impalefection), 광학 형질 감염, 유체 역학적 형질 감염)], 및 형질 도입 (예를 들어, 바이러스 형질 도입)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
자연적으로 발생하는 세포내 핵산에 의해 코딩된 효소 또는 다른 단백질은 "내인성 효소" 또는 "내인성 단백질"로서 지칭될 수 있다.
조성물
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산을 위한 반응 혼합물은 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP), 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, NTP의 생산을 위한 반응 혼합물은 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, NTP의 생산을 위한 반응 혼합물은 뉴클레오시드, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, NTP의 생산을 위한 반응 혼합물은 핵염기, 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, NTP의 생산을 위한 반응 혼합물은 핵염기, D-리보스, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 리보핵산 (RNA)의 생산을 위한 반응 혼합물은 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP), 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 데옥시리보핵산 (DNA) 주형, 및 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA의 생산을 위한 반응 혼합물은 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 데옥시리보핵산 (DNA) 주형, 및 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA의 생산을 위한 반응 혼합물은 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 키나제, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 데옥시리보핵산 (DNA) 주형, 및 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA의 생산을 위한 반응 혼합물은 핵염기, 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 데옥시리보핵산 (DNA) 주형, 및 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA의 생산을 위한 반응 혼합물은 핵염기, D-리보스, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 데옥시리보핵산 (DNA) 주형, 및 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반응 혼합물은 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함한다.
부가의 실시양태
본 개시내용의 부가의 실시양태는 하기 번호가 매겨진 단락에 의해 포함된다.
1. 반응 혼합물에서 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP), 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
2. NDP가 ADP, GDP, CDP, 및/또는 UDP를 포함하는 것인, 단락 1의 방법.
3. NDP가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 1 또는 2의 방법.
4. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.
5. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 4의 방법.
6. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 1 내지 5 중 어느 하나의 방법.
7. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 1 내지 6 중 어느 하나의 방법.
8. 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 1 내지 7 중 어느 하나의 방법.
9. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 8의 방법.
10. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 9의 방법.
11. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 9 또는 10의 방법.
12. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 9 내지 11 중 어느 하나의 방법.
13. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 9 내지 12 중 어느 하나의 방법.
14. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 1 내지 13 중 어느 하나의 방법.
15. 반응 혼합물에서 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트 (5' NMP), 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
16. 5' NMP가 5' AMP, 5' GMP, 5' CMP 및/또는 5' UMP를 포함하는 것인, 단락 15의 방법.
17. 5' NMP가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 15 또는 16의 방법.
18. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 15 내지 17 중 어느 하나의 방법.
19. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 18의 방법.
20. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 15 내지 19 중 어느 하나의 방법.
21. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 15 내지 20 중 어느 하나의 방법.
22. 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 15 내지 21 중 어느 하나의 방법.
23. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 22의 방법.
24. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 23의 방법.
25. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 23 또는 24의 방법.
26. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 23 내지 25 중 어느 하나의 방법.
27. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 23 내지 26 중 어느 하나의 방법.
28. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 15 내지 27 중 어느 하나의 방법.
29. 반응 혼합물에서 뉴클레오시드, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
30. 뉴클레오시드가 아데노신, 구아노신, 시티딘, 및/또는 우리딘을 포함하는 것인, 단락 29의 방법.
31. 뉴클레오시드가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 29 또는 30의 방법.
32. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 29 내지 31 중 어느 하나의 방법.
33. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 32의 방법.
34. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 29 내지 33 중 어느 하나의 방법.
35. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 29 내지 34 중 어느 하나의 방법.
36. 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 29 내지 35 중 어느 하나의 방법.
37. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 36의 방법.
38. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 37의 방법.
39. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 37 또는 38의 방법.
40. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 37 내지 39 중 어느 하나의 방법.
41. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 37 내지 40 중 어느 하나의 방법.
42. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 29 내지 41 중 어느 하나의 방법.
43. 반응 혼합물에서 핵염기, 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
44. 핵염기가 아데닌, 구아니딘, 시토신, 및/또는 우라실을 포함하는 것인, 단락 43의 방법.
45. 핵염기가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 43 또는 44의 방법.
46. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 43 내지 45 중 어느 하나의 방법.
47. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 46의 방법.
48. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 43 내지 47 중 어느 하나의 방법.
49. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 43 내지 48 중 어느 하나의 방법.
50. 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 43 내지 49 중 어느 하나의 방법.
51. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 50의 방법.
52. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 51의 방법.
53. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 51 또는 52의 방법.
54. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 51 내지 53 중 어느 하나의 방법.
55. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 51 내지 54 중 어느 하나의 방법.
56. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 43 내지 55 중 어느 하나의 방법.
57. 반응 혼합물에서 핵염기, 리보스, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
58. 핵염기가 아데닌, 구아니딘, 시토신, 및/또는 우라실을 포함하는 것인, 단락 57의 방법.
59. 핵염기가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 57 또는 58의 방법.
60. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 57 내지 59 중 어느 하나의 방법.
61. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 60의 방법.
62. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 57 내지 61 중 어느 하나의 방법.
63. 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 57 내지 62 중 어느 하나의 방법.
64. 반응 혼합물이, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조된 용해물을 포함하는 것인, 단락 57 내지 63 중 어느 하나의 방법.
65. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 64의 방법.
66. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 65의 방법.
67. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 유기 용매, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 65 또는 66의 방법.
68. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 65 내지 67 중 어느 하나의 방법.
69. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 65 내지 68 중 어느 하나의 방법.
70. 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 뉴클레오시드 키나제가 제거 조건을 견디도록 변형되는 것인, 단락 57 내지 69 중 어느 하나의 방법.
71. 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA), 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), 무기 포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, NDP 및 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
72. 세포 RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함하는 것인, 단락 71의 방법.
73. 세포 RNA가 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터의 것인, 단락 61 또는 72의 방법.
74. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 71 내지 73 중 어느 하나의 방법.
75. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 74의 방법.
76. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 71 내지 75 중 어느 하나의 방법.
77. PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 71 내지 76 중 어느 하나의 방법.
78. 반응 혼합물이, PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 71 내지 77 중 어느 하나의 방법.
79. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 78의 방법.
80. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 79의 방법.
81. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 79 또는 80의 방법.
82. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 79 내지 81 중 어느 하나의 방법.
83. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 79 내지 82 중 어느 하나의 방법.
84. PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 79 내지 83 중 어느 하나의 방법.
85. (a) 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA), 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트를, 5' NMP 및 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, NTP를 생산하는 방법.
86. 세포 RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함하는 것인, 단락 85의 방법.
87. 세포 RNA가 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터의 것인, 단락 85 또는 86의 방법.
88. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 85 내지 87 중 어느 하나의 방법.
89. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 88의 방법.
90. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 85 내지 89 중 어느 하나의 방법.
91. 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 85 내지 90 중 어느 하나의 방법.
92. 반응 혼합물이, 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 85 내지 91 중 어느 하나의 방법.
93. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 92의 방법.
94. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 93의 방법.
95. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 93 또는 94의 방법.
96. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 93 내지 95 중 어느 하나의 방법.
97. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 93 내지 96 중 어느 하나의 방법.
98. 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 93 내지 97 중 어느 하나의 방법.
99. 반응 혼합물에서 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP), 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 리보핵산 (RNA)을 코딩하는 DNA 주형, 및 RNA 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
100. NDP가 ADP, GDP, CDP, 및/또는 UDP를 포함하는 것인, 단락 99의 방법.
101. NDP가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 99 또는 100의 방법.
102. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 99 내지 101 중 어느 하나의 방법.
103. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 102의 방법.
104. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 99 내지 103 중 어느 하나의 방법.
105. 폴리포스페이트 키나제, DNA 주형, 폴리머라제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, DNA 주형, 폴리머라제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 99 내지 104 중 어느 하나의 방법.
106. 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, DNA 주형, 폴리머라제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 99 내지 105 중 어느 하나의 방법.
107. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 106의 방법.
108. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 107의 방법.
109. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 107 또는 108의 방법.
110. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 107 내지 109 중 어느 하나의 방법.
111. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 107 내지 110 중 어느 하나의 방법.
112. 폴리포스페이트 키나제, 폴리머라제, 뉴클레오시드 키나제, 및/또는 NDP 키나제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 99 내지 111 중 어느 하나의 방법.
113. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 99 내지 112 중 어느 하나의 방법.
114. 반응 혼합물에서 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트 (5' NMP), 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 리보핵산 (RNA)을 코딩하는 DNA 주형, 및 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
115. 5' NMP가 5' AMP, 5' GMP, 5' CMP 및/또는 5' UMP를 포함하는 것인, 단락 114의 방법.
116. 5' NMP가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 114 또는 115의 방법.
117. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 114 내지 116 중 어느 하나의 방법.
118. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 117의 방법.
119. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 114 내지 118 중 어느 하나의 방법.
120. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 114 내지 119 중 어느 하나의 방법.
121. 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 114 내지 120 중 어느 하나의 방법.
122. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 121의 방법.
123. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 122의 방법.
124. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 122 또는 123의 방법.
125. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 122 내지 124 중 어느 하나의 방법.
126. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 122 내지 125 중 어느 하나의 방법.
127. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 114 내지 126 중 어느 하나의 방법.
128. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 114 내지 127 중 어느 하나의 방법.
129. 반응 혼합물에서 뉴클레오시드, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 리보핵산 (RNA)을 코딩하는 DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
130. 뉴클레오시드가 아데노신, 구아노신, 시티딘, 및/또는 우리딘을 포함하는 것인, 단락 129의 방법.
131. 뉴클레오시드가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 129 또는 130의 방법.
132. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 129 내지 131 중 어느 하나의 방법.
133. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 132의 방법.
134. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 129 내지 133 중 어느 하나의 방법.
135. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 적어도 하나의 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, 폴리포스페이트, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 129 내지 134 중 어느 하나의 방법.
136. 반응 혼합물이, 적어도 하나의 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 129 내지 135 중 어느 하나의 방법.
137. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 136의 방법.
138. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 137의 방법.
139. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 137 또는 138의 방법.
140. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 137 내지 139 중 어느 하나의 방법.
141. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 137 내지 140 중 어느 하나의 방법.
142. 적어도 하나의 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 129 내지 141 중 어느 하나의 방법.
143. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 129 내지 142 중 어느 하나의 방법.
144. 반응 혼합물에서 핵염기, 포스포리보실트랜스퍼라제, 포스포리보실피로포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트, 관심 리보핵산 (RNA)을 코딩하는 DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
145. 핵염기가 아데닌, 구아니딘, 시토신, 및/또는 우라실을 포함하는 것인, 단락 144의 방법.
146. 핵염기가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 144 또는 145의 방법.
147. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 144 내지 146 중 어느 하나의 방법.
148. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 148의 방법.
149. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 144 내지 148 중 어느 하나의 방법.
150. 포스포리보실트랜스퍼라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 포스포리보실트랜스퍼라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 144 내지 149 중 어느 하나의 방법.
151. 반응 혼합물이, 포스포리보실트랜스퍼라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터의 세포 용해물 또는 효소 제제를 포함하는 것인, 단락 144 내지 150 중 어느 하나의 방법.
152. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 151의 방법.
153. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 152의 방법.
154. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 152 또는 153의 방법.
155. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 152 내지 154 중 어느 하나의 방법.
156. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 152 내지 155 중 어느 하나의 방법.
157. 포스포리보실트랜스퍼라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 144 내지 156 중 어느 하나의 방법.
158. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 144 내지 157 중 어느 하나의 방법.
159. 반응 혼합물에서 핵염기, 리보스, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 리보핵산 (RNA)을 코딩하는 DNA 주형, 및 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 적어도 하나의 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
160. 핵염기가 아데닌, 구아니딘, 시토신, 및/또는 우라실을 포함하는 것인, 단락 159의 방법.
161. 핵염기가 화학적으로 합성되거나, 발효 산물이거나, 또는 자연 공급원으로부터 추출되는 것인, 단락 159 또는 160의 방법.
162. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 159 내지 161 중 어느 하나의 방법.
163. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 162의 방법.
164. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 159 내지 163 중 어느 하나의 방법.
165. 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하도록 변형된 조작된 세포로부터 제조된 적어도 하나의 용해물로부터의 것인, 단락 159 내지 164 중 어느 하나의 방법.
166. 반응 혼합물이, 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조된 용해물을 포함하는 것인, 단락 159 내지 165 중 어느 하나의 방법.
167. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 166의 방법.
168. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 167의 방법.
169. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 유기 용매, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 167 또는 168의 방법.
170. 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 167 내지 169 중 어느 하나의 방법.
171. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 167 내지 170 중 어느 하나의 방법.
172. 리보키나제, 포스포펜토뮤타제, 뉴클레오시드 포스포릴라제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견디도록 변형되는 것인, 단락 159 내지 171 중 어느 하나의 방법.
173. 적어도 하나의 폴리머라제가 적어도 하나의 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 159 내지 172 중 어느 하나의 방법.
174. (a) 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA), 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), 및 무기 포스페이트를, 뉴클레오시드 디포스페이트 (NDP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계;
(b) PNPase를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 반응 혼합물에서, 또는 제2 반응 혼합물에서, NDP, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 RNA를 코딩하는 DNA 주형, 및 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계이며, 임의로 단계 (c)의 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
175. 세포 RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함하는 것인, 단락 174의 방법.
176. 세포 RNA가 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터의 것인, 단락 174 또는 175의 방법.
177. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 174 내지 176 중 어느 하나의 방법.
178. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 177의 방법.
179. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 174 내지 178 중 어느 하나의 방법.
180. PNPase가, 이러한 PNPase를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 174 내지 179 중 어느 하나의 방법.
181. 단계 (a)의 반응 혼합물이, PNPase를 발현하는 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함하는 것인, 단락 174 내지 180 중 어느 하나의 방법.
182. 단계 (b)가, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 PNPase를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 181의 방법.
183. 단계 (b)가, 세포 용해물 또는 효소 제제 중의 효소의 천연 효소 활성을 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것을 통해, PNPase를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 181 또는 182의 방법.
184. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 174 내지 183 중 어느 하나의 방법.
185. 단계 (c)의 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함하는 것인, 단락 174 내지 183 중 어느 하나의 방법.
186. 단계 (c)의 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 185의 방법.
187. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 186의 방법.
188. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 186 또는 187의 방법.
189. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 186 내지 188 중 어느 하나의 방법.
190. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 186 내지 189 중 어느 하나의 방법.
191. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 186 내지 190 중 어느 하나의 방법.
192. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 174 내지 191 중 어느 하나의 방법.
193. (a) 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA), 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 (PNPase), 무기 포스페이트, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 RNA를 코딩하는 DNA 주형, 및 폴리머라제를, 뉴클레오시드 디포스페이트의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계이며, 임의로 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인 단계;
(b) PNPase를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 반응 혼합물을 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
194. 세포 RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함하는 것인, 단락 193의 방법.
195. 세포 RNA가 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터의 것인, 단락 193 또는 194의 방법.
196. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 193 내지 195 중 어느 하나의 방법.
197. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 196의 방법.
198. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 193 내지 197 중 어느 하나의 방법.
199. PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 193 내지 198 중 어느 하나의 방법.
200. 단계 (a)의 반응 혼합물이, PNPase, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함하는 것인, 단락 193 내지 199 중 어느 하나의 방법.
201. 단계 (b)가, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 세포 용해물 중의 천연 효소 활성 및 PNPase를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 200의 방법.
202. 단계 (b)가, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 세포 용해물 중의 천연 효소 활성 및 PNPase를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 200 또는 201의 방법.
203. 단계 (b)가, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 세포 용해물 중의 천연 효소 활성을 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 200 내지 202 중 어느 하나의 방법.
204. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 201 내지 203 중 어느 하나의 방법.
205. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 201 내지 204 중 어느 하나의 방법.
206. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 193 내지 205 중 어느 하나의 방법.
207. (a) 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA) 및 리보뉴클레아제를, 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트 (5' NMP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계;
(b) 리보뉴클레아제를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 반응 혼합물에서, 또는 제2 반응 혼합물에서, 5' NMP, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 RNA를 코딩하는 DNA 주형, 및 폴리머라제를, 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계이며, 임의로 단계 (c)의 반응 혼합물이 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, 및/또는 NDP 키나제를 추가로 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
208. 세포 RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함하는 것인, 단락 207의 방법.
209. 세포 RNA가 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터의 것인, 단락 207 또는 208의 방법.
210. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 207 내지 209 중 어느 하나의 방법.
211. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 210의 방법.
212. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 207 내지 211 중 어느 하나의 방법.
213. 리보뉴클레아제가, 이러한 리보뉴클레아제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 207 내지 212 중 어느 하나의 방법.
214. 단계 (a)의 반응 혼합물이, 리보뉴클레아제를 발현하는 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함하는 것인, 단락 207 내지 213 중 어느 하나의 방법.
215. 단계 (b)가, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 리보뉴클레아제를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 214의 방법.
216. 단계 (b)가, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 리보뉴클레아제를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 214 또는 215의 방법.
217. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 207 내지 216 중 어느 하나의 방법.
218. 단계 (c)의 반응 혼합물이, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함하는 것인, 단락 207 내지 216 중 어느 하나의 방법.
219. 단계 (c)의 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을 제거시킨 것인, 단락 218의 방법.
220. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 제거시킨 것인, 단락 219의 방법.
221. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 제거시킨 것인, 단락 219 또는 220의 방법.
222. 세포 용해물 중의 효소의 천연 효소 활성을, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 제거시킨 것인, 단락 219 내지 221 중 어느 하나의 방법.
223. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 219 내지 222 중 어느 하나의 방법.
224. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 219 내지 223 중 어느 하나의 방법.
225. 폴리머라제가 적어도 하나의 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 207 내지 224 중 어느 하나의 방법.
226. (a) 반응 혼합물에서 세포 리보핵산 (RNA), 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 폴리포스페이트, 관심 RNA를 코딩하는 DNA 주형, 및 폴리머라제를, 5' 뉴클레오시드 모노포스페이트 (5' NMP)의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계;
(b) 리보뉴클레아제를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 반응 혼합물을 관심 RNA의 생산에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 리보핵산 (RNA)을 생산하는 방법.
227. 세포 RNA가 리보솜 RNA, 메신저 RNA, 및/또는 전달 RNA를 포함하는 것인, 단락 226의 방법.
228. 세포 RNA가 단세포 유기체 또는 다세포 유기체로부터의 것인, 단락 226 또는 214의 방법.
229. 폴리포스페이트 키나제가 PPK1 패밀리 효소 및 PPK2 패밀리 효소로부터 선택되는 것인, 단락 226 내지 228 중 어느 하나의 방법.
230. 폴리포스페이트 키나제가 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2를 포함하는 것인, 단락 229의 방법.
231. 폴리포스페이트가 헥사메타포스페이트를 포함하는 것인, 단락 226 내지 230 중 어느 하나의 방법.
232. 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제가, 이러한 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조되는 것인, 단락 226 내지 231 중 어느 하나의 방법.
233. 단계 (a)의 반응 혼합물이, 리보뉴클레아제, 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, DNA 주형, 및/또는 폴리머라제를 발현하는 세포로부터 제조된 세포 용해물을 포함하는 것인, 단락 227 내지 232 중 어느 하나의 방법.
234. 단계 (b)가, 온도, pH, 염, 세정제, 알콜, 및/또는 화학적 억제제를 통해 세포 용해물 중의 천연 효소 활성 및 리보뉴클레아제를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 233의 방법.
235. 단계 (b)가, 분리, 침전, 여과, 포획, 및/또는 크로마토그래피를 통해 세포 용해물 중의 천연 효소 활성 및 리보뉴클레아제를 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 233 또는 234의 방법.
236. 단계 (b)가, 유전자 변형, 세포로부터의 효소 분비, 및/또는 프로테아제 표적화를 통해 세포 용해물 중의 천연 효소 활성을 제거하는 것을 포함하는 것인, 단락 233 내지 235 중 어느 하나의 방법.
237. 천연 효소 활성이 포스파타제, 뉴클레아제, 프로테아제, 데아미나제, 산화환원효소, 및 가수분해효소로부터 선택되는 것인, 단락 234 내지 236 중 어느 하나의 방법.
238. 폴리포스페이트 키나제, 뉴클레오시드 키나제, NMP 키나제, NDP 키나제, 및/또는 폴리머라제가 제거 조건을 견딜 수 있는 것인, 단락 234 내지 237 중 어느 하나의 방법.
239. 폴리머라제가 RNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 단락 226 내지 238 중 어느 하나의 방법.
실시예
실시예 1 - 용해물 RNA 또는 정제된 이. 콜라이 RNA 중 하나로부터 출발하는 RNA의 무세포 합성
물질 및 방법
균주 및 용해물
이. 콜라이 균주 BL21(DE3)을 하기 효소의 코돈-최적화된 버전을 코딩하는 pETDuet-1 벡터로 형질 전환시켰다: 이. 콜라이로부터의 RNase R (K544R) (EcRNR), 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의 UMP 키나제 (PfPyrH), 써무스 써모필루스로부터의 CMP 키나제 (TthCmk), 써모토가 마리티마로부터의 GMP 키나제 (TmGmk), 아퀴펙스 아에오리쿠스로부터의 NDP 키나제 (AaNdk), 및 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2 (DgPPK2). DgPPK2를 제외한 모든 효소는 N-말단 헥사히스티딘 태그를 함유하였다. 이로써 생성된 균주를 OD600 = 20이 될 때까지 40 g/L 글루코스 및 50 mg/L 카르베니실린이 보충된 코르츠 배지에서 37℃ 배치식 발효 프로세스로 성장시켰고, 0.8 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도되었고, 원심 분리를 통해 수거하기 전에 1시간 더 성장시켰다. 수거 후, 바이오매스 펠릿을 -80℃에서 저장하였다.
이어서, 바이오매스 펠릿을 사용하여 세포 용해물을 제조하였다. 바이오매스 펠릿을 얼음 상에서 해동한 다음, 1.5 용적의 재현탁 완충액에 재현탁시킴으로써 용해물을 제조하였다. EcRNR을 발현하는 균주에 대해서는, 바이오매스를 58.8 mM 이염기성 인산칼륨에 재현탁시켰다. PfPyrH, TthCmk, TmGmk, 및 AaNdk를 발현하는 균주에 대해서는, 바이오매스를 50 mM NaCl과 함께 50 mM 트리스-HCl (pH 8.5)에 재현탁시켰다. DgPPK2를 발현하는 균주에 대해서는, 바이오매스를 100 mM MOPS-NaOH (pH 7.0)에 재현탁시켰다. 모든 균주에 대해서는, 바이오매스를 4℃에서 15,000 psi 하에 2 내지 3회 패스의 기계적 균질화에 의해 용해시켰다. 이어서, 용해물을 4℃에서 1시간 동안 16,000 x g 하에 원심 분리시킴으로써 정화시켰다.
이. 콜라이 RNA의 추출 및 정제
확립된 프로토콜에 따라 RNA를 고 밀도 이. 콜라이 용해물로부터 추출 및 정제하였다 (단백질 농도: 40-50 mg/mL) (Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in Enzymology, 447, 3-29).
단백질 발현 및 정제
이. 콜라이 균주 BL21(DE3)을 N-말단 헥사히스티딘 태그를 갖는 열안정성 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 pBAD24 벡터로 형질 전환시켰다. 이로써 생성된 균주를 50 mg/L 카르베니실린이 보충된 리소게니 브로스 (LB) 배지를 사용하여 칸막이가 있는 진탕 플라스크에서 배양하였다. OD600 = 0.6이 될 때까지 진탕시키면서 배양물을 37℃에서 성장시킨 후, 0.2% (w/v) L-아라비노스로 유도하고, 4시간 더 성장시켰다. 이어서, 바이오매스를 원심 분리에 의해 수거하고, 용해 전에 -80℃에 저장하였다. 바이오매스 펠릿을 얼음 상에서 해동시키고, 1.5 용적의 평형/세척 완충액 (20 mM 인산나트륨 pH 7.4, 500 mM 염화나트륨, 30 mM 이미다졸)에 재현탁시키며, 15,000 psi 및 4℃에서 2 내지 3회 패스의 기계적 균질화에 의해 용해물을 제조하였다. 이어서, 용해물을 원심 분리에 의해 정화시켰다. 재조합 단백질을 표준 프로토콜에 따라 HisTrap HP 컬럼 [GE 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)]이 장착된 AKTA프라임 플러스를 사용하는 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)에 의해 정제하였다. 이어서, 재조합 단백질을 함유하는 분획을 합하고, 5 mM DTT 및 0.01% 트리톤 X-100이 보충된 2X 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 내로의 투석에 의해 완충제 교환시켰다. 투석 후, 단백질 스톡을 동일한 용적의 글리세롤로 희석하고 -20℃에서 저장하였다.
이. 콜라이 RNase R의 경우, 배양물을 성장시키고, 발현을 유도하며, 용해물을 본원에 기재된 프로토콜에 따라 제조하였다. 이어서, 상기 효소를 본원에 기재된 프로토콜에 따라 정제하였는데, 단 정제된 효소를 글리세롤과 혼합하기 전에 500 mM NaCl이 보충된 2X PBS 내로의 투석에 의해 완충제 교환시켰다.
DNA 주형 제조
선형 DNA 주형을 PCR에 의해 합성 DNA로부터 증폭시키고, 상자성 비드 상에서의 고상 가역적 고정화 (SPRI)를 사용하여 정제하였다. 관심 서열을 적합한 플라스미드 벡터 내로 클로닝하고, 이로써 생성된 플라스미드를 이. 콜라이 균주 DH10b로 형질 전환시키며, LB 배지에서 형질 전환체를 배양하고, 플라스미드 맥시 또는 기가 키트 [퀴아젠(Qiagen)]를 사용하여 플라스미드를 정제함으로써 플라스미드 DNA 주형을 제조하였다.
용해물 RNA로부터의 무세포 RNA 합성
EcRNR, TthCmk, PfPyrH, TmGmk, AaNdk, 및 DgPPK2를 발현하는 용해물을 각각, 50 mM 트리스, 50 mM NaCl (pH 7.0) 중에서 42 mg/mL로 희석시킨 다음, 동일한 비율로 조합하였다. 50 mM 트리스, 50 mM NaCl (pH 7.0) 중의 동일한 용적의 3 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 부가하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 용해물에서의 RNA의 해중합을 개시하였다. 260 nm에서의 흡광도에 의해 산 가용성 뉴클레오티드를 정량화함으로써 해중합을 모니터링하였다. 황산마그네슘 및 소듐 헥사메타포스페이트를 각각 30 mM 및 1 mM의 최종 농도로 용해물에 부가한 다음, 용해물을 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 EcRNR 및 내인성 이. 콜라이 효소를 불활성화시켰다. 15분 후, 온도를 50℃로 낮추고 반응을 하기 조성으로 어셈블리하였다:
<표 11>
반응 조건
반응물을 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, TURBO DNase [써모 피셔(Thermo Fisher)]로 처리하며, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분석하였다.
정제된 이. 콜라이 RNA로부터의 무세포 RNA 합성
정제된 이. 콜라이 RNA (대략 8 g/L)를, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.0), 50 mM 염화나트륨, 및 2 mM 황산마그네슘을 함유하는 완충액에서 1 g/L 정제된 이. 콜라이 RNase R과 함께 인큐베이션함으로써 해중합시켰다. 해중합 반응물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 산 가용성 뉴클레오티드를 정량화함으로써 모니터링하였다. 30분 후, 해중합 반응물을, 각각 50 mM 트리스-HCl (pH 7.0), 50 mM NaCl에서 희석되고 동일한 비율로 혼합된 TthCmk, TmGmk, PfPyrH, AaNdk, 및 DgPPK2 용해물과 조합하였다. 이어서, 황산마그네슘 및 소듐 헥사메타포스페이트를 각각 30 mM 및 1 mM의 최종 농도로 부가하고, 반응물을 15분 동안 70℃로 가열하였다. 열 불활성화 후, 반응을 본원에 기재된 바와 같이 하기 조성으로 어셈블리하였다:
<표 12>
반응 조건
결과
용해물 RNA를 기질로서 사용하여 RNA의 무세포 합성을 수행하였다. 경로 효소를 과다발현하는 풀링된 용해물로부터의 RNA를 먼저, 5' NMP를 생산하는 엑소뉴클레아제인 과다발현된 이. 콜라이 RNase R (EcRNR)에 의해 해중합시켰다. 해중합은 신속하였는데, 15분 후에 대략 14 mM의 산 가용성 뉴클레오티드가 생산되었다 (도 8a). 이어서, 경로 효소 및 5' NMP를 함유하는 용해물 혼합물을 열처리하여 EcRNR 및 내인성 이. 콜라이 효소를 불활성화시킨 반면, 열안정성 경로 효소는 활성을 유지하였다. 열 불활성화 후, RNA 합성 반응을 어셈블리하고, 50℃에서 인큐베이션하며, 아가로스 겔 상에서 시각화하였다 (도 8b). 선형 PCR 산물 (주형 1) 및 플라스미드 상에 코딩된 헤어핀 주형 (주형 2)을 포함한, 2가지 상이한 주형과의 반응은 아가로스 겔 상에 별개의 밴드를 산출하였다 (도 8b). RNA 폴리머라제를 수반하지 않은 조건에서는 밴드가 관찰되지 않았다. 양성 대조군으로서, 정제된 5' NMP (각각의 AMP, CMP, GMP 및 UMP 4 mM)를 부가한 반응을 수행하였다. 이들 반응은 RNA를 해중합하여 생산된 NMP를 사용하는 반응과 동일한 크기로 이동한 산물을 생산하였다.
정제된 이. 콜라이 RNA를 기질로서 사용하여 RNA의 무세포 합성을 또한 수행하였다. RNA를 먼저, 정제된 이. 콜라이 RNase R (K544R)과 함께 인큐베이션하여 5' NMP를 방출시켰다 (도 9a). 30분 후, 해중합 반응을, 경로 효소를 함유하는 용해물 혼합물과 조합하고 열 처리하여 EcRNR 및 내인성 이. 콜라이 효소를 불활성화시킨 반면, 열안정성 경로 효소는 활성을 유지하였다. 열 불활성화 후, RNA 합성 반응을 어셈블리하고, 50℃에서 인큐베이션하며, 아가로스 겔 상에서 시각화하였다 (도 9b). 선형 PCR 산물 (주형 1) 및 플라스미드 상에 코딩된 헤어핀 주형 (주형 2)을 포함한, 2가지 상이한 주형과의 반응은 아가로스 겔 상에 한정된 밴드를 산출하였지만, 주형 2에 대해서는 그 수율이 더 낮게 나타났다 (도 9b). 또한, RNA 폴리머라제를 수반하지 않은 조건에서는 밴드가 관찰되지 않았다.
취합해 보면, 이들 결과는 무세포 RNA 합성이, 고순도 구매 NMP, 용해물 RNA의 효소적 해중합에 의해 생산된 NMP, 및 정제된 RNA의 효소적 해중합에 의해 생산된 NMP를 포함한, 다양한 NMP 공급원 물질로부터 관심 RNA를 생산하는 데 사용될 수 있다는 것을 입증해 준다.
실시예 2 - 기질로서 정제된 NMP, 및 비-열안정성 야생형 폴리머라제 또는 열안정성 폴리머라제 돌연변이체를 사용하는 RNA의 무세포 합성
물질 및 방법
바이오매스, 용해물, 정제된 단백질, 및 DNA 주형은 본원에 기재된 바와 같이 제조되었다. EcRNR을 생략하고 각각의 AMP, CMP, GMP 및 UMP 4 mM을 반응에 부가한 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 RNA의 무세포 합성을 수행하였다.
결과
37℃ 반응 온도에서 기질로서 정제된 NMP를 사용하여 RNA의 무세포 합성을 수행하였다. 경로 효소를 함유하는 용해물을 어셈블리하고 열처리하여 내인성 이. 콜라이 효소를 불활성화시킨 반면, 열안정성 경로 효소는 활성을 유지하였다. 열 불활성화 후, 반응을 야생형 T7 RNA 폴리머라제 또는 열안정성 돌연변이체를 사용하여 어셈블리하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하며, 아가로스 겔 상에서 시각화하였다 (도 10). 선형 PCR 산물 (주형 1) 및 플라스미드 상에 코딩된 헤어핀 주형 (주형 2)을 포함한, 2가지 상이한 주형과의 반응은 두 폴리머라제의 경우에 별개의 밴드를 산출하였다. 37℃에서, RNA 수율 (겔 밴드 강도에 근거함)은 열안정성 돌연변이체보다 야생형 폴리머라제의 경우, 특히 주형 2의 경우에 더 크게 나타났다. RNA 폴리머라제를 수반하지 않은 조건에서는 밴드가 관찰되지 않았다.
이들 결과는 무세포 RNA 합성에 사용된 RNA 폴리머라제가 열안정성일 필요는 없다는 것과, 37℃ 반응에서 야생형 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 RNA가 생산될 수 있다는 것을 입증해 준다.
실시예 3 - 기질로서 NMP 및 데이노코쿠스 게오써말리스로부터의 클래스 III 폴리포스페이트 키나제 2 (DgPPK2)를 사용하는 RNA의 무세포 합성
물질 및 방법
무세포 RNA 합성 반응을 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이, 하기 조성으로 어셈블리하였다:
<표 13>
반응 조건
양성 대조군으로서, 우리딜레이트 키나제, 시티딜레이트 키나제, 구아닐레이트 키나제, 뉴클레오티드 디포스페이트 키나제 및 폴리포스페이트 키나제를 함유하는 5-효소 용해물 시스템을 실시예 1 내지 2에 따른 반응에 사용하였다. 반응에서 합성된 dsRNA를, 적응된 RNASwift 추출 프로토콜을 통해 정제하고, 본원에 기재된 바와 같이 역상 이온 쌍 크로마토그래피를 사용하여 정량화하였다 (Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry, 512, 36 -46).
결과
RNA의 무세포 합성은 반응에서 유일한 키나제로서 DgPPK2, 및 기질로서 NMP를 포함하는 반응에서 수행되었다. 양성 대조군으로서, 우리딜레이트 키나제, 시티딜레이트 키나제, 구아닐레이트 키나제, 뉴클레오티드 디포스페이트 키나제, 및 폴리포스페이트 키나제를 함유하는 5-효소 용해물 시스템의 존재 하에 RNA를 합성하였다. 폴리머라제의 부재 하에 대조군 반응을 수행하였다.
각각의 반응에 대한 반응 계수를 결정하였다. 반응 계수는 상업적으로 이용 가능한 dsRNA 내부 표준의 면적에 대한 관심 dsRNA의 면적 비로서 계산되었다. 반응 계수를 비교한 결과, 유일한 키나제로서 DgPPK2를 함유하는 반응이, 상기 5-효소 용해물 시스템을 함유하는 반응에서 합성된 dsRNA의 약 48%를 합성하였다는 것이 입증되었다 (도 11a). DgPPK2 반응 및 5-효소 용해물 시스템 반응에서 합성된 dsRNA 산물을 HPLC에 의해 분석하였다. 상기 반응으로부터의 dsRNA 산물의 HPLC 크로마토그램은 유사하였는데, 이는 DgPPK2-전용 시스템에 의해 생산된 dsRNA 산물이, 상기 5-효소 시스템에 의해 생산된 산물과 유사하였다는 것을 입증해 준다 (도 11b).
취합해 보면, 이들 결과는 DgPPK2가 NMP 또는 NDP로부터 무세포 dsRNA를 합성하기 위한 유일한 키나제로서 사용될 수 있었다는 것을 입증해 준다.
실시예 4 - 정제된 RNase R 또는 정제된 뉴클레아제 P1을 사용한 다양한 공급원으로부터의 RNA의 해중합
물질 및 방법
RNA 및 뉴클레아제의 추출 및 정제
확립된 프로토콜에 따라 RNA를 고 밀도 이. 콜라이 용해물로부터 추출 및 정제하였다 (단백질 농도: 40-50 mg/mL) (Mohanty, B. K., Giladi, H., Maples, V. F., & Kushner, S. R. (2008). Analysis of RNA decay, processing, and polyadenylation in Escherichia coli and other prokaryotes. Methods in Enzymology, 447, 3-29).
비브리오(Vibrio)로부터의 RNA는 RNASwift 프로토콜을 사용하여 브이. 나트리에겐스(V. natriegens) 세포 브로스로부터 정제되었다 (Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry, 512, 36 -46).
효모 유래 RNA 추출물은 상업적 공급원으로부터 구입하였다. RNA 분말은 약 85% 내지 약 90% 순도였으며, 추가 정제가 필요하지 않았다. RNase R은 RNase R을 과다발현하는 이. 콜라이 균주로부터 정제하고, 높은 세포 밀도로 성장시켰다. 단백질을 AKTA프라임 플러스 FPLC 시스템 (GE 헬스케어)에 연결된 HisTrap HP 컬럼을 사용하여 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 5' 포스포디에스테라제인 정제된 뉴클레아제 P1을 상업적 공급원으로부터 수득하였다.
외인성 뉴클레아제를 이용한 RNA의 해중합
이. 콜라이 RNA, 브이. 나트리에겐스 RNA, 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁된 효모 유래 RNA 분말 (RNA 함량 11 mg/mL), RNase R 용액 (300 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.4, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2 중의 1 mg/mL) 및 정제된 뉴클레아제 P1 (5' 포스포디에스테라제로서 지칭되기도 함) (100 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.4, 1 mM ZnCl2, 10 mM MgCl2 중의 1 내지 2 mg/mL)을, 반응을 개시하기 전에 2℃에서 미리 평형시켰다. 시간 t = 0에서, 50 μL의 RNA 및 50 μL 뉴클레아제 용액을 혼합하고, 예열된 37℃ 블록으로 옮김으로써 반응을 개시하였다. 개시 후, 반응물을 37℃에서 인큐베이션하고, 10 μL를 얼음 상의 산 켄칭 용액 (90 μL의 0.2 M 황산)으로 옮김으로써 주기적으로 샘플링하였다. 시간 과정의 완료 후, 켄칭된 샘플을 2℃에서 20분 동안 3,200 x g 하에 원심 분리함으로써 정화시켰다. 해중합은 먼저, 260 nm에서 산 가용성 뉴클레오티드의 흡광도에 의해 정량화하였다. RNA의 알칼리 가수 분해에 의해 총 뉴클레오타이드 풀 (예를 들어, 100% 해중합)을 측정하였다: 50 μL RNA를 150 μL의 0.2 M 수산화칼륨과 조합한 다음, 20분 동안 99℃로 가열하였다. 이어서, 알칼리 가수 분해된 샘플을 켄칭하고 상기 언급된 바와 같이 분석하였다. 5', 2', 및 3' NMP의 LC-MS 분석에 의해 해중합을 또한 정량화하였다: 10 μL의 샘플을 30 μL 100% 아세토니트릴에 켄칭하였고, 내부 표준으로 사용된 10 μM 아디프산을 함유하는 500 μL의 탈이온수로 희석하였다. 이어서, 샘플을 원심 분리시키고 LC-MS 분석 전에 0.2 μm 필터를 통과시켰다.
뉴클레오티드 분석
2', 3', 및 5' NMP의 분석은 ABSCIEX API 5000 질량 분석기 및 시퀀트 지크 힐릭(Sequant Zic-hilic) 컬럼 (2.1 x 50 mm, 3 μm i.d.)이 장착된 표준 애질런트(Agilent) 1200 HPLC를 사용하여 질량 분석법 및 액체 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 이동 상은 90% 아세토니트릴 중 20 mM 암모늄 아세테이트 (A) 및 10% 아세토니트릴 중 20 mM 암모늄 아세테이트 (B)로 이루어졌다. 분리 방법은 하기로 이루어졌다: 6% B의 출발 구배에 이어 600초에 걸쳐 8.5% B로 구배, 400초에 걸쳐 13% B로 구배한 다음, 60초에 걸쳐 20% B에서부터 구배, 50% B에서 60초 동안 세척하고, 마지막으로 6% B에서 220초 동안 재평형시킨다. 하기 질량 분석기 전이를 사용하여 네거티브 모드 전기 분무 이온화 (ESI)에서 정량화를 수행하였다: 2'3'5' AMP: 346.1 - 134.1, 2'3'5' UMP: 323.0 - 97, 2'3'5' CMP: 322 - 97, 2'3'5' GMP: 362.1 - 211. 피크 면적을 정제된 화합물 [바이오로그 라이프 사이언스 연구소(Biolog Life Science Institute)로부터 구입한 2' 및 3' CMP, UMP, 및 GMP를 제외하고는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입함]로 이루어진 표준 곡선과 비교하였고, 분석 전에 샘플 내로 스파이크된 내부 표준 (아디프산)으로 정규화하였다. 샘플의 분석을 위해, 표준 곡선을 탈이온수에서 제조하고, 내부 표준으로 희석하며, 본원에 기재된 샘플 제조 단계에서와 같이 여과하였다.
결과
브이. 나트리에겐스 RNA는 정제된 이. 콜라이 RNase R을 사용하여 소화시키고, 이. 콜라이 RNA 및 효모 유래 RNA 추출물은 이. 콜라이 RNase R과 뉴클레아제 P1 둘 다를 이용하여 소화시켰다. 해중합은 산 가용성 뉴클레오티드의 방출에 의해 모니터링되었다. 이. 콜라이 및 브이. 나트리에겐스 RNA를 RNase R로 처리하면, RNA의 산 가용성 뉴클레오티드로의 시간 의존성 전환이 나타나서, 인큐베이션 30분 후에 약 98 내지 약 100% 해중합에 도달하였다 (도 12a). 효모 유래 RNA 추출물을 뉴클레아제 P1로 처리하면, 약 94% 해중합에 도달하였다 (도 12a). 또한, 이. 콜라이 RNA를 뉴클레아제 P1로 처리하면, 약 90% 해중합이 초래되었다 (도 12a). LC-MS에 의한 후속 분석은 뉴클레아제 P1로 처리된 효모 유래 RNA 추출물 및 이. 콜라이 RNA에서의 5' NMP의 방출을 밝혀냈다 (도 12b).
이들 결과는 RNA의 다양한 공급원 (예를 들어, 비브리오 RNA, 이. 콜라이 RNA 및 효모 RNA)이 상이한 뉴클레아제 (예를 들어, RNase R 및 뉴클레아제 P1)를 사용하여 5' NMP로 소화될 수 있다는 것을 입증해 준다.
실시예 5 - RNA 해중합에 대한 온도 및 용해물 불활성화의 효과
물질 및 방법
균주 및 용해물
균주 GL17-086 (BL21(DE3).ΔtolC.Δph[DE3]1+2*.Δph[285p]*.ΔfhuA*.ΔlamB*. rna::tolC) 및 균주 GL17-109 (BL21(DE3). ΔtolC.Δph[DE3]1+2*.Δph[285p]*.ΔfhuA*.ΔlamB*.Δrna*.ΔphoA*.ΔappA*.Δamn*.ΔnagD*.ΔushA::tolC)가 본원에 기재된 연구에 사용되었다. 두 균주 모두에 대해, 1 L 배양물을 코르츠 배지 (5 g/L (NH4)2SO4, 15.7 g/L K2HPO4, 4.2 g/L KH2PO4, 1.7 g/L 시트르산, 0.6 g/L MgSO4, 0.1% 티아민-HCl, 0.01% 플루로닉, 미량 금속, 및 40 g/L 글루코스)에서 배치식 성장 조건 하에 대략 7시간 동안 성장시켰다. 성장 후, 세포를 6000 g에서 20분 동안 원심 분리한 다음, -80℃에서 저장하였다. 동결된 바이오매스를 1.5X 용적의 58.8 mM 이염기성 인산칼륨 용액에서 해동시키고, 15000-20000 psi의 펄스로 재순환하면서, 3회 패스 동안 에멀시플렉스(EmulsiFlex) C3 균질화기 [아베스틴(Avestin)]를 통과시킴으로써 용해시켰다. 4℃에서 1시간 동안 15000 g으로 회전시킴으로써 용해물을 정화시켰다. 이어서, 용해물을 -80℃에서 1회용 분취액으로 저장하였다.
다양한 온도에서 RNA 중합 산물의 분석
두 균주 (086 및 109)에 대한 동결된 용해물을 다양한 온도에서 인큐베이션하여 RNA 해중합 산물 및 그들의 잠재적 분해를 프로파일링하였다. 용해물 분취액을 얼음 상에서 해동시킨 다음, PCR 스트립-튜브에 분배하였다. 이어서, 간헐 샘플링으로 튜브를 40℃, 50℃, 60℃, 및 70℃에서 1시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 초기 t0 시점은 용해물이 여전히 얼음 위에 있는 동안 켄칭에 의해 이루어졌다. 다른 모든 시간 동안, 샘플을 50 mM 암모늄 아세테이트 중 500 μl의 50 μM 아디프산 용액으로 희석된 60 μl로 5X 용적의 아세토니트릴에서 켄칭한 다음, LC-QQQ 상에서 실행시켰다. MRM을 사용하여, 4가지 모든 주요 뉴클레오티드 및 그들의 관련 유도체 (ATP, ADP, AMP, 아데닌, 아데노신, GTP, GDP, GMP, 구아닌, 구아노신, CTP, CDP, CMP, 시티딘, 시토신, UTP, UDP, UMP, 우리딘, 및 우라실)를 각각의 시점에서 정량화하였다. RNA가 NMP로 완전히 가수 분해되는 용해물의 염기 가수 분해는 99℃에서 20분 동안 3X 용적의 0.2 M NaOH에서 용해물을 인큐베이션함으로써 수행되었다. 이어서, 동일한 용적의 150 mM HCl로 중화시키고, 이러한 용액 20 μl를 50 μM 아디프산과 함께 200 μl의 50 mM 암모늄 아세테이트 용액으로 희석시켰다. 염기 가수 분해된 용해물 값은 100% 해중합을 나타낸다. 일부 조건 하에서 이들 용해물은 있는 그대로 인큐베이션되고, 다른 조건에서는 용해물이 0.5 mg/ml 뉴클레아제 P1 (시그마 N8630) 또는 RNase R 중 하나와 혼합되었다. RNase R은 다음과 같이 제조되었다: 세포를 1.5X 용적의 용해 완충액 (50 mM 인산칼륨, pH = 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)에서 재현탁시키고, 15000-25000 psi에서 3회 패스 동안 에멀시플렉스 C3 균질화기 (아베스틴)에 용해시키며, 16000 g, 4 ℃에서 1시간 동안 정화시켰다. 이어서, 상등액을 FPLC를 통해 정제한 다음, 2X PBS에서 밤새 투석시켰다. 500 mM NaCl을 부가함으로써, 투석 후 침전된 단백질을 회수하고, 글리세롤과 혼합하여 등분 및 -20℃에서의 저장을 위한 50% 글리세롤 용액을 산출하였다.
RNA 해중합에 대한 희석 효과 및 예열 사멸 효과의 분석
본원에 기재된 바와 같이 제조된 GL17-109의 용해물을 사용하여 실험을 수행하였다. 용해물은 광범위한 조건 하에서 제조되었다. 모든 조건 전체에 걸쳐 공통적으로, 반응물에 150 mM 인산칼륨 (pH = 7.4), 100 mM KCl, 및 0.1 mM ZnCl2를 부가하고, 하기 조건 모두를 RNase R, 뉴클레아제 P1로 시험하거나, 또는 외인성 뉴클레아제를 부가하지 않은 것으로 시험하였다. 두 뉴클레아제 스톡 용액은 전술한 바와 같이 제조되었다. 해중합 반응은 물로 80% 및 50% 용해물 희석 하에 수행되었다. 이들을 스파이킹된 외인성 뉴클레아제 0.5 또는 0.31 mg/ml로 각각 스크리닝하였다. 1 mg/ml 뉴클레아제 용해물을 만들고, 이를 스파이킹되지 않은 용해물 내로 혼합하여 80% 희석 조건에서 0.064 및 0.04 mg/ml 뉴클레아제를 산출시키거나 또는 50% 희석 조건에서 0.04 및 0.025 mg/ml 뉴클레아제를 산출시킴으로써, 용해물 혼합물을 또한 제조하였다. 마지막으로, 부가된 뉴클레아제를 함유하지 않은 용해물을 70℃에서 15분 동안 열 사멸시킨 다음, 정제된 뉴클레아제, 또는 여전히 활성인 1 mg/ml 뉴클레아제 용해물과 혼합하는 조건을 시험하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였고, 5X 용적의 아세토니트릴에서 켄칭하며, 50 mM 암모늄 아세테이트 중 1 ml의 50 μM 아디프산 용액으로 희석함으로써 샘플링하였다. 이어서, 켄칭 용액을 침강시키고, 0.2 μm 필터 플레이트를 통해 여과하고, 여액을 LC-QQQ 상에서 실행시켜 NMP, 뉴클레오시드, 및 핵염기를 측정하였다.
결과
RNA 뉴클레아제 (RNase)는 중온성 공급원으로부터의 다른 많은 효소보다 온도 프로파일에 더 광범위하게 걸쳐 있는 활성 프로파일을 갖는 것으로 공지되어 있으며, 37℃에서 성장하는 것으로 진화된 유기체로부터 유래한 것임에도 불구하고 때로는 60℃까지 활성을 보인다. 이. 콜라이 용해물에서 RNA 해중합에 대한 상승 온도의 영향을 평가하기 위해, 2가지 별도의 연구가 시행되었다. 첫 번째로, 2가지 별도의 균주로부터의 용해물을 2가지 RNase, 즉 RNase R 또는 RNase P1 중 하나를 부가하거나 부가하지 않으면서, 1시간의 과정에 걸쳐 37℃ 초과의 온도에서 인큐베이션하였다. 두 번째 연구는 해로운 효소 활성을 제거하기 위해 용해물을 제거하고 이러한 불활성 용해물을 활성 용해물과 혼합하여 RNA 해중합에 대한 잠재적 영향을 연구하거나, 또는 외인성 뉴클레아제를 불활성화된 용해물 내로 혼합하는 것을 수반하였다.
용해물을 60℃ 및 70℃에서 인큐베이션할 때 개선된 해중합이 관찰되었다 (도 13). 해중합은 여러 가지 방식으로 개선되었다. RNA가 해중합될 때, 이는 주로 NMP를 생산한다. 그러나, 활성 용해물에서는, 이들 NMP가 다른 효소에 의해 지속적으로 분해되어, 구아노신 및 우라실이라는 2가지 주요 산물이 매우 다량으로 축적된다. 용해물을 60℃ 및 70℃에서 인큐베이션하는 것이, 외인성 RNase R 또는 뉴클레아제 P1을 받지 않은 용해물에서도 이들 핵염기의 축적을 현저하게 감소시켰다 (도 13). 핵염기 각각의 몰이 RNA로부터의 NMP의 비가역적 손실과 상관이 있기 때문에, 이는 용해물에서 개선된 NMP 안정성을 입증해 주었다. 부가적으로, 이들 온도 조건 하에서 외인성 뉴클레아제가 부가될 때, RNase R이 부가된 70℃에서 도 13에 도시된 바와 같이, 순 NMP 축적에 있어서의 극적인 개선이 관찰된다. GL17-109 용해물의 염기 가수 분해는 32.6 mM NMP의 최대 농도를 나타냈다. 부가된 뉴클레아제의 희석을 보정하여, RNase R이 부가된 70℃에서 관찰된 약 22 mM NMP의 축적은 75% 수율이다. tRNA가 총 RNA 풀의 약 15%를 나타내고, 그것이 이들 뉴클레아제에 접근할 수 없는 것으로 가정하면, 이는 모든 접근 가능한 RNA의 94% 수율을 나타낼 것이다. GL17-086에서의 해중합은 GL17-109보다 전반에 걸쳐 더 열악하였는데, 이는 더 큰 가인산 분해 활성에 기인한 것으로 예상된다 (데이터는 제시되지 않음).
예열 사멸 및 용해물 희석의 영향은 작은 혜택을 보여주었지만, 더 많이 희석된 용해물에서만 가능하다. 이러한 연구에서는, 2가지 유형의 용해물, 즉 해중합될 RNA를 함유하는 "시약" 용해물과 외인성 뉴클레아제 (RNase R 또는 뉴클레아제 P1)를 함유하는 "촉매" 용해물이 만들어졌다. RNA 해중합에 대한 그들의 영향을 결정하기 위해, 하기 표 14에 나타낸 바와 같은 많은 상이한 조건을 평가하였다. 80%로만 희석된 용해물은, 용해물의 일부분이 열 사멸되었는지의 여부에 관계없이 유사한 해중합 성능을 나타냈다. 그러나, 50%로 희석된 용해물은, RNA의 많은 부분이 불활성화된 용해물에 존재하였을 때 약간 더 잘 수행되었다. 이러한 희석도에서 시험된 모든 조건 전체에 걸쳐, 2.7%의 평균 해중합 수율 개선이 관찰되었다. 이들 조건 하에서의 해중합 반응의 성능은 크게 개선되지는 않지만, 동등하거나 약간만 더 잘 수행함으로써, 이것은 프로세스의 다른 부분이 해중합 이전 열 사멸을 구현할 수 있는 가능성을 열어 두어, 예를 들어, 배양물에 남아있을 수 있는 용해되지 않은 임의의 세포의 성장을 정지시키거나 또는 펠릿화 단계가 열 처리 후에 포함되는 경우 용해물의 단백질 함량을 감소시킨다.
<표 14>
용해물, 뉴클레아제, 및 불활성화된 용해물의 다양한 혼합물 전체에 걸친 RNA 해중합 수율의 요약. RNA의 용해물 염기 가수 분해를 통해 정량화된 바와 같이, 퍼센트 수율은 32.6 mM NMP를 기준으로 한 것이다.
실시예 6: 다양한 뉴클레오티드 공급원을 사용한 RNA의 무세포 생산
물질 및 방법
상업적 공급원으로부터 수득된 효모 RNA 분말을 45 내지 60 g/L로 물에 용해시키고, 0.05 mM 염화아연의 존재 하에 70℃, pH 5.5-5.8에서 1시간 동안 1.2 g/L P1 뉴클레아제를 사용하여 해중합시켰다. 이로써 생성된 해중합된 물질을 원심 분리에 의해 정화시키고, 10 kDa MWCO 필터를 사용하여 여과하였다. 이로써 생성된 스트림은 약 90 내지 100 mM (각각의 AMP, CMP, GMP 및 UMP 약 20 내지 25 mM)의 총 농도로 5' 뉴클레오티드 모노포스페이트 (NMP)를 함유하였다.
개별 키나제 효소 (TthCmk, PfPyrH, TmGmk, AaNdk 및 DgPPK2)를 코딩하는 pBAD24 유래 벡터를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 유도체를, 표준 기술을 사용하여 50 mg/L 카르베니실린이 보충된 코르츠 배지에서 발효 하에 배양하였다 [Korz, D. J., Rinas, U., Hellmuth, K., Sanders, E. A., & Deckwer, W. D. (1995). Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli. Journal of biotechnology, 39(1), 59-65.]. L-아라비노스를 부가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 수거 후, 용해물을 고압 균질화를 사용하여 60 mM 포스페이트 완충제에서 제조하여, 대략 40 g/L 총 단백질의 혼합물을 생성하였다.
524 bp 이중 가닥 RNA 서열을 코딩하는 하나 이상의 전사 주형 (각각 T7 프로모터, 표적 서열 및 하나 이상의 전사 종결 인자로 이루어짐)을 함유하는 pUC19 유래 벡터를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 유도체. 세포를, 표준 기술을 사용하여 코르츠 배지에서 발효 하에 배양하였다 [Phue, J. N., Lee, S. J., Trinh, L., & Shiloach, J. (2008). Modified Escherichia coli B (BL21), a superior producer of plasmid DNA compared with Escherichia coli K (DH5alpha). Biotechnology and bioengineering, 101(4), 831.]. 수거 후, 용해물을 고압 균질화에 의해 창출시키고, 유사한 절차에 따라 희석하고 열처리하였다.
열안정성 T7 RNA 폴리머라제 효소를 코딩하는 pBAD24 유래 벡터를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 유도체를 배양하고, 효소 발현을 유도하며, 유사한 절차를 사용하여 용해물을 제조하였다. 폴리머라제 효소를 2 단계의 황산암모늄 분별법을 사용하여 부분적으로 정제하였다.
반응을 표 15에 따라 30 mM 포스페이트 완충제, pH 7에서 어셈블리하였다.
<표 15>
반응 조건
무세포 반응을 어셈블리하는 데 있어서, 키나제 효소 및 주형 DNA를 함유하는 용해물을 희석하고, 동일한 비율로 조합한 다음, 반응 첨가제, 예컨대 황산마그네슘 및 소듐 헥사메타포스페이트와 혼합하였다. 과다발현된 키나제의 활성을 유지하면서 용해물을 70℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 다른 효소 활성을 불활성화시켰다. RNA 폴리머라제를 부가함으로써 무세포 반응을 개시하고, 48℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 확립된 프로토콜에 따라 분석하였다 [Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical biochemistry, 512, 36].
결과
무세포 RNA 합성 반응은 세포 RNA, 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트 (AMP, CMP, GMP, UMP)의 등몰 혼합물, 또는 5' 뉴클레오시드 디포스페이트 (ADP, CDP, GDP, UDP)의 등몰 혼합물을 사용하여 수행되었다. 각각의 뉴클레오티드 공급원에 대해 유사한 역가의 dsRNA 산물이 생산되었다 (도 17).
이들 결과는 본원에 기재된 무세포 반응이 세포 RNA, 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트, 및 뉴클레오시드 디포스페이트를 포함한 다수의 뉴클레오티드 공급원으로부터 RNA를 합성하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증해 준다.
실시예 7: 야생형 RNA 폴리머라제를 사용한 RNA의 무세포 생산
물질 및 방법
헥사히스티딘-태그부착된 열안정성 또는 야생형 T7 RNA 폴리머라제 효소를 코딩하는 pBAD24 유래 벡터를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 유도체를 배양하고, 효소 발현을 유도하며, 용해물을 본원에 기재된 절차를 사용하여 제조하였다. 폴리머라제 효소는 본원에 기재된 바와 같이 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 의해 정제되었다. 반응을 일정 온도 범위 (37 내지 48℃)에서 2시간 동안 수행한 것을 제외하고는 본원에 기재된 바와 같이 무세포 반응을 수행하였다. dsRNA 산물의 역가는 본원에 기재된 바와 같이 정량화되었다.
결과
무세포 RNA 합성 반응은 야생형 T7 RNA 폴리머라제 또는 열안정성 돌연변이 체를 사용하여 수행되었다 (도 18). 열안정성 돌연변이체를 사용하여 수행된 반응은 37℃ 및 48℃에서 dsRNA 산물을 생산하였다. 대조적으로, 야생형 폴리머라제를 사용하여 수행된 반응은 37℃에서 산물을 생산하였지만, 48℃에서는 그렇지 못하였다.
이들 결과는 본원에 기재된 무세포 반응이 적절한 온도에서 인큐베이션되는 한은, 열안정성 RNA 폴리머라제를 필요로 하지 않는다는 것을 입증해 준다.
실시예 8: 다양한 뉴클레오티드 공급원을 사용한 NTP의 무세포 생산
물질 및 방법
주형 DNA 용해물 및 RNA 폴리머라제를 생략한 것을 제외하고는 실시예 6에 기재된 바와 같이 무세포 반응을 수행하였다. 공개된 방법의 적응을 사용하여 뉴클레오티드를 HPLC에 의해 분석하였다 [de Korte, D., Haverkort, W. A., Roos, D., & van Gennip, A. H. (1985). Anion-exchange high performance liquid chromatography method for the quantitation of nucleotides in human blood cells. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 148(3), 185].
결과
뉴클레오티드 5'-트리포스페이트 (NTP: ATP, CTP, GTP 및 UTP)를 생산하기 위한 무세포 반응은 세포 RNA, 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트 (AMP, CMP, GMP, UMP)의 등몰 혼합물, 또는 5' 뉴클레오시드 디포스페이트 (ADP, CDP, GDP, UDP)의 등몰 혼합물을 사용하여 수행되었다. 각각의 뉴클레오티드 공급원에 대해 유사한 역가의 각각의 NTP가 생산되었다 (도 19).
이들 결과는 본원에 기재된 무세포 반응이 또한, RNA 폴리머라제 및 DNA 주형을 단순히 생략함으로써 NTP를 생산하는 데 사용될 수 있다는 것을 입증해 준다. 실시예 6에 기재된 RNA를 생산하는 무세포 반응과 유사하게, NTP를 생산하는 무세포 반응은 세포 RNA, 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트, 및 뉴클레오시드 디포스페이트를 포함한 다수의 뉴클레오티드 공급원을 활용할 수 있다.
참고 문헌
서열
데이노코쿠스 게오써말리스 DSM 11300 PPK2
메이오써무스 루버(Meiothermus ruber) DM 1279 PPK2
메이오써무스 실바누스(Meiothermus silvanus) DSM 9946 PPK2
써모시네코코쿠스 엘롱가투스(Thermosynechococcus elongatus) BP-1 PPK2
아나에로리네아 써모필라(Anaerolinea thermophila) UNI-1 PPK2
칼디리네아 아에로필라(Caldilinea aerophila) DSM 14535 PPK2
클로로바쿨룸 테피둠(Chlorobaculum tepidum) TLS PPK2
오세아니써무스 프로푼두스(Oceanithermus profundus) DSM 14977 PPK2
로세이플렉수스 카스텐홀치이(Roseiflexus castenholzii) DSM 13941 PPK2
로세이플렉수스(Roseiflexus) 종 RS-1 PPK2
트루에페라 라디오빅트릭스(Truepera radiovictrix) DSM 17093 PPK2
써무스 써모필루스 Adk
써무스 써모필루스 Cmk
피로코쿠스 푸리오수스 PyrH
써모토가 마리티마 Gmk
아퀴펙스 아에오리쿠스 Ndk
본원에 개시된 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용되는 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에 문서의 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 달리 명백하게 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 2개 이상의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 이러한 방법의 단계 또는 작용이 인용되는 순서로 반드시 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다.
청구 범위뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 이행 문구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "운반하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "구성된" 등은 개방형, 즉 포함하나 그에 제한되지 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이행 문구 "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는" 만이 각각, 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이 폐쇄 또는 반-폐쇄 이행 문구일 것이다.
수치에 선행하는 용어 "약" 및 "실질적으로"는 나열된 수치의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위의 상단과 하단 사이의 각각의 값이 본원에서 구체적으로 고려되고 기재된다.
SEQUENCE LISTING <110> GreenLight Biosciences, Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATE AND RIBONUCLEIC ACID PRODUCTION <130> G0830.70025WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently herewith <150> US 62/571,071 <151> 2017-10-11 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Deinococcus geothermalis <400> 1 Met Gln Leu Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Gln Arg Val Arg Leu 1 5 10 15 Ser Asn Trp Pro Thr Asp Asp Asp Gly Gly Leu Ser Lys Ala Glu Gly 20 25 30 Glu Ala Leu Leu Pro Asp Leu Gln Gln Arg Leu Ala Asn Leu Gln Glu 35 40 45 Arg Leu Tyr Ala Glu Ser Gln Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu Gln Ala 50 55 60 Arg Asp Ala Gly Gly Lys Asp Gly Thr Val Lys His Val Ile Gly Ala 65 70 75 80 Phe Asn Pro Ser Gly Val Gln Val Ser Asn Phe Lys Val Pro Thr Glu 85 90 95 Glu Glu Arg Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln Thr Pro 100 105 110 Arg Leu Gly Met Ile Gly Val Phe Asn Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val 115 120 125 Leu Val Thr Arg Val His His Leu Ile Asp Asp Gln 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  1. 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)를 생산하기 위한 조성물의 용도.
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