CN112239771B

CN112239771B - 一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌

Info

Publication number: CN112239771B
Application number: CN201910649568.9A
Authority: CN
Inventors: 胡美荣; 邱媛媛; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN112239771A

Abstract

本发明公开了一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌。本发明提供了一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法,包括以下步骤:以尿苷一磷酸和蔗糖为原料,在工程菌的作用下,生产尿苷二磷酸葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌,是将编码所述功能蛋白的基因导入出发菌得到的，所述的功能蛋白包括聚磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和蔗糖合成酶。本发明对于尿苷二磷酸葡萄糖的工业化生产具有重要意义。

Description

一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌

技术领域

本发明涉及一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌。

背景技术

尿苷二磷酸葡萄糖，简称UDP-萄糖或UDPG，广泛分布于微生物、动植物细胞内的核苷酸糖的一种，在生物体内，当各种苷、寡糖、多糖的生物合成时用作葡萄糖的供体。此外，在单糖的互变或糠醛酸生成时作为重要的中间产物，而在碳水化合物代谢中起着中心的作用。

尿苷二磷酸葡萄糖的合成方法主要是化学合成、发酵法、酶法转化。化学合成需要对糖基上活性基团进行保护和去保护，催化剂昂贵，反应条件苛刻，而且在反应的过程中使用大量有机溶剂，使得化学合成法总成本偏高，环境不友好。发酵法往往需要很长时间，产率低。由酶法合成尿苷二磷酸葡萄糖主要有两种方法,一是以尿苷三磷酸、葡萄糖-1-磷酸为底物，在相应的焦磷酸化酶作用下生成,如李新亮等以尿苷三磷酸、麦芽糊精为原料，表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶的大肠杆菌作为生物催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖，38小时最多能生成尿苷二磷酸葡萄糖42.5g，但是反应分两步进行，而且要添加大量压榨酵母，反应时间长生产成本高。另一种生产方法是以尿苷二磷酸为底物，经蔗糖合成酶催化合成尿苷二磷酸葡萄糖，10小时催化84.1mM(39g)尿苷酸二磷酸生成尿苷酸二磷酸葡萄糖40.9g，但是底物成本太高也限制了其工业化生产使用。

因此，本领域迫切需要构建高效、安全、工艺简单、成本低的尿苷二磷酸葡萄糖基因工程菌，以满足工业化生产尿苷二磷酸葡萄糖的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌。

第一方面，本发明保护功能蛋白质在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用；所述功能蛋白质包括聚磷酸激酶、蔗糖合成酶和尿苷一磷酸激酶。

进一步地，所述聚磷酸激酶来源于Gemmobacter sp.LW-1。

所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆或喜温硫杆菌。

所述尿苷一磷酸激酶来源于大肠杆菌。

进一步地，所述蔗糖合成酶具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)由序列表中序列1自N端第343-1150所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)序列表中序列1自N端第343-1150所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；

(b3)来源于拟南芥且与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述蔗糖合成酶具体可为如下(b4)或(b5)或(b6)：

(b4)由序列表中序列3自N端第343-1147所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b5)序列表中序列3自N端第343-1147所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；

(b6)来源于大豆且与(b4)-(b5)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述蔗糖合成酶具体可为下(b7)或(b8)或(b9)：

(b7)由序列表中序列5自N端第343-1135所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b8)序列表中序列5自N端第343-1135所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；

(b9)来源于喜温硫杆菌且与(b7)-(b8)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述聚磷酸激酶具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列1自N端第1-342所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)序列表中序列1自N端第1-342所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；

(a3)来源于Gemmobacter sp.LW-1且与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述尿苷一磷酸激酶具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)由序列表中序列1自N端第1151-1391所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c2)序列表中序列1自N端第1151-1391所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的蛋白质；

(c3)来源于大肠杆菌且与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

以上任一所述功能蛋白质具体可如序列表的序列1所示。

以上任一所述功能蛋白质具体可如序列表的序列3所示。

以上任一所述功能蛋白质具体可如序列表的序列5所示。

第二方面，本发明保护能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。

所述能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子具体可为序列表的序列2所示的DNA分子。

所述能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。

所述能够表达以上任一所述功能蛋白质的核酸分子具体可为序列表的序列6所示的DNA分子。

第三方面，本发明保护重组菌，是对出发菌进行改造使其能够表达以上任一所述功能蛋白质得到的。

所述“对出发菌进行改造使其能够表达以上任一所述功能蛋白质”是通过将核酸分子导入出发菌中实现的；所述核酸分子能够表达以上任一所述功能蛋白质。

所述“将核酸分子导入出发菌”具体可通过将含有所述核酸分子的表达载体导入出发菌实现。

所述表达载体具体可为将pBAD-hisB载体的XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点间的片段替换为序列2所示的DNA分子得到的重组表达载体。

所述表达载体具体可为将pBAD-hisB载体的XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点间的片段替换为序列4所示的DNA分子得到的重组表达载体。

所述表达载体具体可为将pBAD-hisB载体的XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点间的片段替换为序列6所示的DNA分子得到的重组表达载体。

所述出发菌具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌BW25113。

本发明还保护所述重组菌在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。

第四方面，本发明保护一种制备尿苷二磷酸葡萄糖的方法，包括如下步骤：以尿苷一磷酸和蔗糖为底物，在以上任一所述重组菌的催化作用下反应得到尿苷二磷酸葡萄糖。

所述催化反应体系中包括所述重组菌、尿苷一磷酸、蔗糖、ATP、MgCl₂和polyP。

所述催化反应体系中具体可含有浓度为20OD/ml的所述重组菌、浓度为100mM的尿苷一磷酸、浓度为1M的蔗糖、浓度为5mM的ATP、浓度为20mM的MgCl₂和浓度为20mM的polyP。

所述催化反应程序具体可为37℃、220rpm催化反应6小时。

第五方面，本发明保护用于制备尿苷二磷酸葡萄糖的试剂盒，包括尿苷一磷酸、蔗糖和以上任一所述的重组菌。

所述试剂盒还包括ATP、MgCl₂和polyP。

本发明的主要优点包括：(1)原料易得且成本较低；(2)工艺简单：不需要纯化酶，直接用一种共表达聚磷酸激酶、蔗糖合成酶和尿苷一磷酸激酶的细胞破碎液，在一个反应器内一步反应即可制备尿苷二磷酸葡萄糖，不涉及中间步骤和反映，极大地简化了工艺流程，且设备利用率高。

本发明提供了一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法,包括以下步骤:以尿苷一磷酸和蔗糖为原料,在工程菌的作用下,生产尿苷二磷酸葡萄糖；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌,是将编码所述功能蛋白的基因导入出发菌得到的，所述的功能蛋白包括聚磷酸激酶、尿苷一磷酸激酶和蔗糖合成酶。本发明对于尿苷二磷酸葡萄糖的工业化生产具有重要意义。

附图说明

图1为尿苷一磷酸标准品HPLC峰图。

图2为尿苷二磷酸葡萄糖标准品HPLC峰图。

图3为利用重组工程菌TY001进行催化反应后的上清液HPLC峰图。

图4为利用重组工程菌生产尿苷二磷酸葡萄糖原理图。

图5为尿苷二磷酸葡萄糖的结构。

图6为利用对照重组工程菌进行催化反应后的上清液HPLC峰图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pBAD-hisB载体：Invitrogen公司，货号:854314DE。

大肠杆菌BW25113：武汉圣达威科技有限公司，货号：P1466。

2YT液体培养基：0.5％(质量百分含量)NaCl、1％(质量百分含量)酵母提取物、1.6％(质量百分含量)胰蛋白胨，蒸馏水定容。

尿苷二磷酸葡萄糖标准品：北京中原合聚经贸有限公司，货号：ab120384。

尿苷二磷酸葡萄糖的结构如图5所示。

Gemmobacter sp.LW-1记载于文献：Kumaresan D,Wischer D,Murrell J C.DraftGenome Sequences of Facultative Methylotrophs,Gemmobacter sp.Strain LW1andMesorhizobium sp.Strain 1M-11,Isolated from Movile Cave,Romania.[J].GenomeAnnouncements,2015,3(6).。

实施例1、重组表达载体的构建

1、将pBAD-hisB载体的XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点间的片段替换为序列2所示的DNA分子，得到重组表达载体pBAD-GS-AT-EC-1(已经测序验证)。

序列表的序列2中，自5’端第1-1029位编码来源于Gemmobacter sp.LW-1的聚磷酸激酶，第1041-3467位编码来源于拟南芥Arabidopsis thaliana的蔗糖合成酶，第3479-4204位编码来源于大肠杆菌Escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。

序列表的序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质。序列表的序列1中，自N端第1-342位为来源于Gemmobacter sp.LW-1的聚磷酸激酶，第343-1150位为来源于拟南芥Arabidopsis thaliana的蔗糖合成酶，第1151-1391位为来源于大肠杆菌Escherichiacoli的尿苷一磷酸激酶。

2、将pBAD-hisB载体的XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点间的片段替换为序列4所示的DNA分子，得到重组表达载体pBAD-GS-GM-EC-2(已经测序验证)。

序列表的序列4中，自5’端第1-1029位编码来源于Gemmobacter sp.LW-1的聚磷酸激酶，第1041-3458位编码来源于大豆Glycine max的蔗糖合成酶，第3470-4195位编码来源于大肠杆菌Escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。

序列表的序列4所示的DNA分子编码序列3所示的蛋白质。序列表的序列3中，自N端第1-342位为来源于Gemmobacter sp.LW-1的聚磷酸激酶，第343-1147位为来源于大豆Glycine max的蔗糖合成酶，第1148-1388位为来源于大肠杆菌Escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。

2、将pBAD-hisB载体的XhoⅠ和SpeⅠ酶切位点间的片段替换为序列6所示的DNA分子，得到重组表达载体pBAD-GS-AC-EC-3(已经测序验证)。

序列表的序列6中，自5’端第1-1029位编码来源于Gemmobacter sp.LW-1的聚磷酸激酶，第1041-3422位编码来源于喜温硫杆菌Acidithiobacillus caldus的蔗糖合成酶，第3434-4159位编码来源于大肠杆菌Escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。

序列表的序列6所示的DNA分子编码序列5所示的蛋白质。序列表的序列5中，自N端第1-342位为来源于Gemmobacter sp.LW-1的聚磷酸激酶，第343-1135位为来源于喜温硫杆菌Acidithiobacillus caldus的蔗糖合成酶，第1136-1376位为来源于大肠杆菌Escherichia coli的尿苷一磷酸激酶。

实施例2、重组工程菌的制备

1、将实施例1制备的重组表达载体pBAD-GS-AT-EC-1导入大肠杆菌BW25113，得到重组工程菌TY001。

2、将实施例1制备的重组表达载体pBAD-GS-GM-EC-2导入大肠杆菌BW25113，得到重组工程菌TY002。

3、将实施例1制备的重组表达载体pBAD-GS-AC-EC-3导入大肠杆菌BW25113，得到重组工程菌TY003。

4、将pBAD-hisB载体导入大肠杆菌BW25113，得到对照重组工程菌。

实施例3、利用重组工程菌生产尿苷二磷酸葡萄糖

合成原理如图4所示。

一、利用重组工程菌TY001生产尿苷二磷酸葡萄糖

1、实施例2制备的重组工程菌TY001接种至含有50μg/ml链霉素的2YT液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD为0.8，向培养体系中加入阿拉伯糖(上海源叶生物科技有限公司,货号：S11032)(阿拉伯糖在培养体系中的浓度为0.2mM)，30℃、220rpm诱导培养16小时后，收集培养体系，4℃、8000rpm/min离心10min，收集菌体沉淀。

2、采用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)重悬步骤1得到的菌体沉淀，超声(功率195W)破碎10min，然后加入尿苷一磷酸、蔗糖、ATP、MgCl₂和polyP配置催化反应体系；反应体系中含有浓度为20OD/ml的菌体(细胞)、浓度为100mM的尿苷一磷酸(北京普益华科技有限公司,货号:U820323)、浓度为1M的蔗糖、浓度为5mM的ATP、浓度为20mM的MgCl₂和浓度为20mM的polyP(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,货号:S108858)。

3、将步骤2的催化反应体系在37℃、220rpm催化反应6小时。

4、完成步骤3后，将催化反应体系4℃、12000rpm/min离心5min，取上清。用0.22μM的滤膜过滤上清，收集滤液进行HPLC检测尿苷二磷酸葡萄糖的产量。

HPLC采用YMC Triart C18柱，流动相：50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH6.8)，流速为0.45ml/min，柱温40℃，进样5μl，检测波长260nm。

尿苷一磷酸标准品(北京普益华科技有限公司,货号:U820323)的保留时间为7.514min(图1)。

尿苷二磷酸葡萄糖标准品的保留时间为8.047min(图2)。

利用重组工程菌TY001进行催化反应后的上清液检测结果如图3所示。

结果显示，上清液中也有保留时间为8.066的峰值，表明采用尿苷一磷酸为底物生成了尿苷二磷酸葡萄糖。

二、三种重组工程菌尿苷二磷酸葡萄糖产量

分别采用实施例2制备的重组工程菌TY001、重组工程菌TY002和重组工程菌TY003按照步骤一的方法进行检测。实验设置三次重复，取平均值。

结果显示，重组工程菌TY001催化100mM尿苷一磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖59.66mM(33g/L)，TY002催化100mM尿苷一磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖55.68mM(31g/L)，TY003催化100mM尿苷一磷酸生成尿苷二磷酸葡萄糖20mM(11.3g/L)。重组工程菌TY001转化能力最强，转化率最高。

将实施例二制备的对照重组工程菌按照步骤一的方法进行检测。结果显示产物中没有得到尿苷二磷酸葡萄糖。结果如图6所示。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种生产尿苷二磷酸葡萄糖的方法及其专用工程菌

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1391

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asp Pro Ala Val Val Pro Val Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala

1 5 10 15

Ala Thr Asp Gly Pro Pro Glu Leu Pro Pro Ala Ala Thr Pro Ala Val

20 25 30

Ala His Gly Pro Arg Gln Phe Pro Arg Ala Asp Gln Asp Ala Ile Arg

35 40 45

Glu Ala Phe Glu Ser Gly Arg Tyr Pro Tyr Ser Arg Leu Met Gly Arg

50 55 60

Gly Pro Tyr Glu Lys Glu Lys Ala Leu Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys

65 70 75 80

Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu Thr Gly Gln Lys Phe Val Val Leu Met

85 90 95

Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met

100 105 110

Glu His Leu Asn Pro Arg Tyr Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro

115 120 125

Ser Asp Lys Glu Lys Gly Glu Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His

130 135 140

Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile Val Phe Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Asn

145 150 155 160

Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Ser Pro Ser Glu Tyr

165 170 175

Leu Glu Phe Met Arg Gln Val Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg

180 185 190

Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Glu Glu

195 200 205

Gln His Arg Arg Phe Thr Ala Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Met Trp

210 215 220

Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala

245 250 255

Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn

260 265 270

Cys Met Arg His Phe Leu Ser Thr Ile Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Ala

275 280 285

Ser Val Ile Gly Thr Pro Asp Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Val Ile Gly Gly Ala Gly His Ile Leu Asp Thr Ala Leu Pro Pro Asp

305 310 315 320

Phe Arg Lys Ala Phe Asp Ala Gly Lys Thr Pro Ala Thr Ala Arg Ala

325 330 335

Gln Glu Ala Ala Gln Ala Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg

340 345 350

Val His Ser Gln Arg Glu Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg

355 360 365

Asn Glu Val Leu Ala Leu Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly

370 375 380

Ile Leu Gln Gln Asn Gln Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu

385 390 395 400

Gln Thr Arg Lys Lys Leu Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys

405 410 415

Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val

420 425 430

Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala

435 440 445

Leu Val Val Glu Glu Leu Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu

450 455 460

Glu Leu Val Asp Gly Val Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp

465 470 475 480

Phe Glu Pro Phe Asn Ala Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr

485 490 495

Ile Gly Asn Gly Val Asp Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu

500 505 510

Phe His Asp Lys Glu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu

515 520 525

His Ser His Gln Gly Lys Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn

530 535 540

Leu Asn Thr Leu Gln His Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala

545 550 555 560

Glu Leu Lys Ser Glu Thr Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu

565 570 575

Glu Ile Gly Leu Glu Arg Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu

580 585 590

Asp Met Ile Arg Leu Leu Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys

595 600 605

Thr Leu Glu Thr Phe Leu Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val

610 615 620

Ile Leu Ser Pro His Gly Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr

625 630 635 640

Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala

645 650 655

Leu Glu Ile Glu Met Leu Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile

660 665 670

Lys Pro Arg Ile Leu Ile Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly

675 680 685

Thr Thr Cys Gly Glu Arg Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys

690 695 700

Asp Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys

705 710 715 720

Trp Ile Ser Arg Phe Glu Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu

725 730 735

Asp Ala Ala Val Glu Leu Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu

740 745 750

Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala

755 760 765

His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys

770 775 780

Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys

785 790 795 800

Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His

805 810 815

Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys

820 825 830

Glu Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly

835 840 845

Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn

850 855 860

Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu

865 870 875 880

Glu Lys Arg Arg Leu Thr Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu

885 890 895

Tyr Ser Asp Val Glu Asn Lys Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys

900 905 910

Lys Lys Pro Ile Leu Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn

915 920 925

Leu Ser Gly Leu Val Glu Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu

930 935 940

Leu Ala Asn Leu Val Val Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys

945 950 955 960

Asp Asn Glu Glu Lys Ala Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu

965 970 975

Glu Tyr Lys Leu Asn Gly Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp

980 985 990

Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly

995 1000 1005

Ala Phe Val Gln Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val

1010 1015 1020

Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly

1025 1030 1035 1040

Pro Ala Glu Ile Ile Val His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro

1045 1050 1055

Tyr His Gly Asp Gln Ala Ala Asp Thr Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys

1060 1065 1070

Cys Lys Glu Asp Pro Ser His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu

1075 1080 1085

Gln Arg Ile Glu Glu Lys Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu

1090 1095 1100

Leu Thr Leu Thr Gly Val Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu

1105 1110 1115 1120

Asp Arg Leu Glu Ala Arg Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys

1125 1130 1135

Tyr Arg Pro Leu Ala Gln Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp Met Ala

1140 1145 1150

Thr Asn Ala Lys Pro Val Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu Ser Gly

1155 1160 1165

Glu Ala Leu Gln Gly Thr Glu Gly Phe Gly Ile Asp Ala Ser Ile Leu

1170 1175 1180

Asp Arg Met Ala Gln Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Leu Gly Ile Gln

1185 1190 1195 1200

Val Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala Gly Leu

1205 1210 1215

Ala Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly Met Leu

1220 1225 1230

Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ala Leu His Arg Ala

1235 1240 1245

Tyr Val Asn Ala Arg Leu Met Ser Ala Ile Pro Leu Asn Gly Val Cys

1250 1255 1260

Asp Ser Tyr Ser Trp Ala Glu Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn Asn Arg

1265 1270 1275 1280

Val Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr Thr Asp

1285 1290 1295

Ser Ala Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val Val Leu

1300 1305 1310

Lys Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Ala Lys Asp

1315 1320 1325

Pro Thr Ala Thr Met Tyr Glu Gln Leu Thr Tyr Ser Glu Val Leu Glu

1330 1335 1340

Lys Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ala Ala Phe Thr Leu Ala Arg Asp

1345 1350 1355 1360

His Lys Leu Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Asn Lys Pro Gly Ala Leu

1365 1370 1375

Arg Arg Val Val Met Gly Glu Lys Glu Gly Thr Leu Ile Thr Glu

1380 1385 1390

<210> 2

<211> 4204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcggacc cggctgttgt tccagtggca ccagttgcgg ctccggcagc gacagacggt 60

cctccggaac tgccaccggc agctacgcca gcagttgcgc acggtccgcg tcagtttccg 120

cgtgcggatc aggatgcaat ccgtgaagca ttcgaaagcg gtcgctaccc atattcccgt 180

ttaatgggcc gtggtccgta cgagaaagaa aaagctctgc tccaagccga acttctgaaa 240

gtccagattt gggcgcagga aactggccag aagttcgtag tactgatgga gggtcgtgac 300

gctgcaggca aaggtggcac cattaaacgt tttatggaac acctgaaccc gcgttacgca 360

cgtgtcgtgg ctctgacgaa accgtctgac aaagagaagg gtgaatggtt tttccagcgt 420

tatatccagc atttgccgac cgcaggtgaa atcgttttct atgatcgttc ctggtacaac 480

cgtgcaggcg ttgaacgtgt aatgggcttc tgctctcctt ctgaatatct ggagttcatg 540

cgccaggtgc cagaactcga acgcatgctc gttcgctccg gtatccgcct ctacaaatac 600

tggttctctg tcacccgtga ggagcagcac cgccgtttca ccgcgcgtga aaccgacccg 660

ctcaagatgt ggaaactgtc gccaatcgac aaagcatctc tggacaaatg ggacgattac 720

accgaggcca aagaagcaat gttcttctac accgacaccg ccgatgcgcc gtggaccatc 780

gtcaaaagca acgacaaaaa acgcgcacgc ttgaactgca tgcgccactt cctgagcacc 840

attgactacc caggtaaaga tgcttctgtc atcggtactc cagacccact gatcgtcggt 900

cgtgcgagtc aagttattgg tggtgcgggt cacatcctgg ataccgccct gccgccagac 960

tttcgtaaag cgttcgacgc gggtaaaact ccggctactg cgcgtgcgca ggaggcagct 1020

caggcataaa aggagatata atggcaaacg ctgaacgtat gataacgcgc gtccacagcc 1080

aacgtgagcg tttgaacgaa acgcttgttt ctgagagaaa cgaagtcctt gccttgcttt 1140

ccagggttga agccaaaggt aaaggtattt tacaacaaaa ccagatcatt gctgaattcg 1200

aagctttgcc tgaacaaacc cggaagaaac ttgaaggtgg tcctttcttt gaccttctca 1260

aatccactca ggaagcaatt gtgttgccac catgggttgc tctagctgtg aggccaaggc 1320

ctggtgtttg ggaatactta cgagtcaatc tccatgctct tgtcgttgaa gaactccaac 1380

ctgctgagtt tcttcatttc aaggaagaac tcgttgatgg agttaagaat ggtaatttca 1440

ctcttgagct tgatttcgag ccattcaatg cgtctatccc tcgtccaaca ctccacaaat 1500

acattggaaa tggtgttgac ttccttaacc gtcatttatc ggctaagctc ttccatgaca 1560

aggagagttt gcttccattg cttaagttcc ttcgtcttca cagccaccag ggcaagaacc 1620

tgatgttgag cgagaagatt cagaacctca acactctgca acacaccttg aggaaagcag 1680

aagagtatct agcagagctt aagtccgaaa cactgtatga agagtttgag gccaagtttg 1740

aggagattgg tcttgagagg ggatggggag acaatgcaga gcgtgtcctt gacatgatac 1800

gtcttctttt ggaccttctt gaggcgcctg atccttgcac tcttgagact tttcttggaa 1860

gagtaccaat ggtgttcaac gttgtgatcc tctctccaca tggttacttt gctcaggaca 1920

atgttcttgg ttaccctgac actggtggac aggttgttta cattcttgat caagttcgtg 1980

ctctggagat agagatgctt caacgtatta agcaacaagg actcaacatt aaaccaagga 2040

ttctcattct aactcgactt ctacctgatg cggtaggaac tacatgcggt gaacgtctcg 2100

agagagttta tgattctgag tactgtgata ttcttcgtgt gcccttcaga acagagaagg 2160

gtattgttcg caaatggatc tcaaggttcg aagtctggcc atatctagag acttacaccg 2220

aggatgctgc ggttgagcta tcgaaagaat tgaatggcaa gcctgacctt atcattggta 2280

actacagtga tggaaatctt gttgcttctt tattggctca caaacttggt gtcactcagt 2340

gtaccattgc tcatgctctt gagaaaacaa agtacccgga ttctgatatc tactggaaga 2400

agcttgacga caagtaccat ttctcatgcc agttcactgc ggatattttc gcaatgaacc 2460

acactgattt catcatcact agtactttcc aagaaattgc tggaagcaaa gaaactgttg 2520

ggcagtatga aagccacaca gcctttactc ttcccggatt gtatcgagtt gttcacggga 2580

ttgatgtgtt tgatcccaag ttcaacattg tctctcctgg tgctgatatg agcatctact 2640

tcccttacac agaggagaag cgtagattga ctaagttcca ctctgagatc gaggagctcc 2700

tctacagcga tgttgagaac aaagagcact tatgtgtgct caaggacaag aagaagccga 2760

ttctcttcac aatggctagg cttgatcgtg tcaagaactt gtcaggtctt gttgagtggt 2820

acgggaagaa cacccgcttg cgtgagctag ctaacttggt tgttgttgga ggagacagga 2880

ggaaagagtc aaaggacaat gaagagaaag cagagatgaa gaaaatgtat gatctcattg 2940

aggaatacaa gctaaacggt cagttcaggt ggatctcctc tcagatggac cgggtaagga 3000

acggtgagct gtaccggtac atctgtgaca ccaagggtgc ttttgtccaa cctgcattat 3060

atgaagcctt tgggttaact gttgtggagg ctatgacttg tggtttaccg actttcgcca 3120

cttgcaaagg tggtccagct gagatcattg tgcacggtaa atcgggtttc cacattgacc 3180

cttaccatgg tgatcaggct gctgatactc ttgctgattt cttcaccaag tgtaaggagg 3240

atccatctca ctgggatgag atctcaaaag gagggcttca gaggattgag gagaaataca 3300

cttggcaaat ctattcacag aggctcttga cattgactgg tgtgtatgga ttctggaagc 3360

atgtctcgaa ccttgaccgt cttgaggctc gccgttacct tgaaatgttc tatgcattga 3420

agtatcgccc attggctcag gctgttcctc ttgcacaaga tgattgaaag gagatataat 3480

ggctaccaat gcaaaacccg tctataaacg cattctgctt aagttgagtg gcgaagctct 3540

gcagggcact gaaggcttcg gtattgatgc aagcatactg gatcgtatgg ctcaggaaat 3600

caaagaactg gttgaactgg gtattcaggt tggtgtggtg attggtgggg gtaacctgtt 3660

ccgtggcgct ggtctggcga aagcgggtat gaaccgcgtt gtgggcgacc acatggggat 3720

gctggcgacc gtaatgaacg gcctggcaat gcgtgatgca ctgcaccgcg cctatgtgaa 3780

cgctcgtctg atgtccgcta ttccattgaa tggcgtgtgc gacagctaca gctgggcaga 3840

agctatcagc ctgttgcgca acaaccgtgt ggtgatcctc tccgccggta caggtaaccc 3900

gttctttacc accgactcag cagcttgcct gcgtggtatc gaaattgaag ccgatgtggt 3960

gctgaaagca accaaagttg acggcgtgtt taccgctgat ccggcgaaag atccaaccgc 4020

aaccatgtac gagcaactga cttacagcga agtgctggaa aaagagctga aagtcatgga 4080

cctggcggcc ttcacgctgg ctcgtgacca taaattaccg attcgtgttt tcaatatgaa 4140

caaaccgggt gcgctgcgcc gtgtggtaat gggtgaaaaa gaagggactt taatcacgga 4200

ataa 4204

<210> 3

<211> 1388

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Asp Pro Ala Val Val Pro Val Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala

1 5 10 15

Ala Thr Asp Gly Pro Pro Glu Leu Pro Pro Ala Ala Thr Pro Ala Val

20 25 30

Ala His Gly Pro Arg Gln Phe Pro Arg Ala Asp Gln Asp Ala Ile Arg

35 40 45

Glu Ala Phe Glu Ser Gly Arg Tyr Pro Tyr Ser Arg Leu Met Gly Arg

50 55 60

Gly Pro Tyr Glu Lys Glu Lys Ala Leu Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys

65 70 75 80

Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu Thr Gly Gln Lys Phe Val Val Leu Met

85 90 95

Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met

100 105 110

Glu His Leu Asn Pro Arg Tyr Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro

115 120 125

Ser Asp Lys Glu Lys Gly Glu Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His

130 135 140

Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile Val Phe Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Asn

145 150 155 160

Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Ser Pro Ser Glu Tyr

165 170 175

Leu Glu Phe Met Arg Gln Val Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg

180 185 190

Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Glu Glu

195 200 205

Gln His Arg Arg Phe Thr Ala Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Met Trp

210 215 220

Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala

245 250 255

Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn

260 265 270

Cys Met Arg His Phe Leu Ser Thr Ile Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Ala

275 280 285

Ser Val Ile Gly Thr Pro Asp Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Val Ile Gly Gly Ala Gly His Ile Leu Asp Thr Ala Leu Pro Pro Asp

305 310 315 320

Phe Arg Lys Ala Phe Asp Ala Gly Lys Thr Pro Ala Thr Ala Arg Ala

325 330 335

Gln Glu Ala Ala Gln Ala Met Ala Thr Asp Arg Leu Thr Arg Val His

340 345 350

Ser Leu Arg Glu Arg Leu Asp Glu Thr Leu Thr Ala Asn Arg Asn Glu

355 360 365

Ile Leu Ala Leu Leu Ser Arg Ile Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu

370 375 380

Gln His His Gln Val Ile Ala Glu Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Asn

385 390 395 400

Arg Gln Lys Leu Thr Asp Gly Ala Phe Gly Glu Val Leu Arg Ser Thr

405 410 415

Gln Glu Ala Ile Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro

420 425 430

Arg Pro Gly Val Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Val His Ala Leu Val

435 440 445

Val Glu Glu Leu Gln Pro Ala Glu Tyr Leu His Phe Lys Glu Glu Leu

450 455 460

Val Asp Gly Ser Ser Asn Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu

465 470 475 480

Pro Phe Asn Ala Ala Phe Pro Arg Pro Thr Leu Asn Lys Ser Ile Gly

485 490 495

Asn Gly Val Gln Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His

500 505 510

Asp Lys Glu Ser Leu His Pro Leu Leu Glu Phe Leu Arg Leu His Ser

515 520 525

Val Lys Gly Lys Thr Leu Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Asn Pro Asp

530 535 540

Ala Leu Gln His Val Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Gly Thr Val

545 550 555 560

Pro Pro Glu Thr Pro Tyr Ser Glu Phe Glu His Lys Phe Gln Glu Ile

565 570 575

Gly Leu Glu Arg Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Glu Ser

580 585 590

Ile Gln Leu Leu Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu

595 600 605

Glu Thr Phe Leu Gly Arg Ile Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu

610 615 620

Ser Pro His Gly Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp

625 630 635 640

Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu

645 650 655

Asn Glu Met Leu His Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asp Ile Val Pro

660 665 670

Arg Ile Leu Ile Ile Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr

675 680 685

Cys Gly Gln Arg Leu Glu Lys Val Phe Gly Thr Glu His Ser His Ile

690 695 700

Leu Arg Val Pro Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile

705 710 715 720

Ser Arg Phe Glu Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Val

725 730 735

Ala His Glu Leu Ala Lys Glu Leu Gln Gly Lys Pro Asp Leu Ile Val

740 745 750

Gly Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys

755 760 765

Leu Gly Val Thr Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys

770 775 780

Tyr Pro Glu Ser Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Glu Glu Arg Tyr His

785 790 795 800

Phe Ser Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Phe Ala Met Asn His Thr Asp

805 810 815

Phe Ile Ile Thr Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr

820 825 830

Val Gly Gln Tyr Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr

835 840 845

Arg Val Val His Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val

850 855 860

Ser Pro Gly Ala Asp Gln Thr Ile Tyr Phe Pro His Thr Glu Thr Ser

865 870 875 880

Arg Arg Leu Thr Ser Phe His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser

885 890 895

Ser Val Glu Asn Glu Glu His Ile Cys Val Leu Lys Asp Arg Ser Lys

900 905 910

Pro Ile Ile Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Ile Thr

915 920 925

Gly Leu Val Glu Trp Tyr Gly Lys Asn Ala Lys Leu Arg Glu Leu Val

930 935 940

Asn Leu Val Val Val Ala Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Leu

945 950 955 960

Glu Glu Lys Ala Glu Met Lys Lys Met Tyr Gly Leu Ile Glu Thr Tyr

965 970 975

Lys Leu Asn Gly Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asn Arg Val

980 985 990

Arg Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Val Ile Cys Asp Thr Arg Gly Ala Phe

995 1000 1005

Val Gln Pro Ala Val Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala

1010 1015 1020

Met Thr Cys Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Asn Gly Gly Pro Ala

1025 1030 1035 1040

Glu Ile Ile Val His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His

1045 1050 1055

Gly Asp Arg Ala Ala Asp Leu Leu Val Asp Phe Phe Glu Lys Cys Lys

1060 1065 1070

Leu Asp Pro Thr His Trp Asp Lys Ile Ser Lys Ala Gly Leu Gln Arg

1075 1080 1085

Ile Glu Glu Lys Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr

1090 1095 1100

Leu Thr Gly Val Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg

1105 1110 1115 1120

Arg Glu Ser Arg Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg

1125 1130 1135

Lys Leu Ala Glu Ser Val Pro Leu Ala Ala Glu Met Ala Thr Asn Ala

1140 1145 1150

Lys Pro Val Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu Ser Gly Glu Ala Leu

1155 1160 1165

Gln Gly Thr Glu Gly Phe Gly Ile Asp Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met

1170 1175 1180

Ala Gln Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Leu Gly Ile Gln Val Gly Val

1185 1190 1195 1200

Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala Gly Leu Ala Lys Ala

1205 1210 1215

Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly Met Leu Ala Thr Val

1220 1225 1230

Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ala Leu His Arg Ala Tyr Val Asn

1235 1240 1245

Ala Arg Leu Met Ser Ala Ile Pro Leu Asn Gly Val Cys Asp Ser Tyr

1250 1255 1260

Ser Trp Ala Glu Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn Asn Arg Val Val Ile

1265 1270 1275 1280

Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr Thr Asp Ser Ala Ala

1285 1290 1295

Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val Val Leu Lys Ala Thr

1300 1305 1310

Lys Val Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Ala Lys Asp Pro Thr Ala

1315 1320 1325

Thr Met Tyr Glu Gln Leu Thr Tyr Ser Glu Val Leu Glu Lys Glu Leu

1330 1335 1340

Lys Val Met Asp Leu Ala Ala Phe Thr Leu Ala Arg Asp His Lys Leu

1345 1350 1355 1360

Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Asn Lys Pro Gly Ala Leu Arg Arg Val

1365 1370 1375

Val Met Gly Glu Lys Glu Gly Thr Leu Ile Thr Glu

1380 1385

<210> 4

<211> 4195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcggacc cggctgttgt tccagtggca ccagttgcgg ctccggcagc gacagacggt 60

cctccggaac tgccaccggc agctacgcca gcagttgcgc acggtccgcg tcagtttccg 120

cgtgcggatc aggatgcaat ccgtgaagca ttcgaaagcg gtcgctaccc atattcccgt 180

ttaatgggcc gtggtccgta cgagaaagaa aaagctctgc tccaagccga acttctgaaa 240

gtccagattt gggcgcagga aactggccag aagttcgtag tactgatgga gggtcgtgac 300

gctgcaggca aaggtggcac cattaaacgt tttatggaac acctgaaccc gcgttacgca 360

cgtgtcgtgg ctctgacgaa accgtctgac aaagagaagg gtgaatggtt tttccagcgt 420

tatatccagc atttgccgac cgcaggtgaa atcgttttct atgatcgttc ctggtacaac 480

cgtgcaggcg ttgaacgtgt aatgggcttc tgctctcctt ctgaatatct ggagttcatg 540

cgccaggtgc cagaactcga acgcatgctc gttcgctccg gtatccgcct ctacaaatac 600

tggttctctg tcacccgtga ggagcagcac cgccgtttca ccgcgcgtga aaccgacccg 660

ctcaagatgt ggaaactgtc gccaatcgac aaagcatctc tggacaaatg ggacgattac 720

accgaggcca aagaagcaat gttcttctac accgacaccg ccgatgcgcc gtggaccatc 780

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cgtgcgagtc aagttattgg tggtgcgggt cacatcctgg ataccgccct gccgccagac 960

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agctggattt cgaacctttc aatgctgctt ttcctcgtcc gactctgaac aaatctatcg 1500

gcaacggtgt tcaatttctg aaccgtcatt taagcgctaa actattccat gacaaggaat 1560

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tgaacgatcg tatccagaac ccggacgcgc ttcagcacgt tctgcgcaaa gctgaggagt 1680

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gcgacggtaa cattgtagcg tctctgctgg cgcacaaact gggcgtgacc cagtgcacca 2340

tcgcacacgc gcttgaaaaa accaaatacc cagaatccga tatttattgg aaaaagctgg 2400

aagaacgtta ccacttttct tgccagttca ccgctgatct gttcgcgatg aaccacaccg 2460

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agctttatcg cgttatctgc gacactcgtg gtgcattcgt ccagccggcg gtttatgagg 3060

ccttcggcct caccgtggtt gaagctatga cctgcggcct cccgactttc gcaacgtgca 3120

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agatttactc ccagcgcctg ctgactctga ccggtgtata cggtttctgg aagcacgtat 3360

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cctgttgcgc aacaaccgtg tggtgatcct ctccgccggt acaggtaacc cgttctttac 3900

caccgactca gcagcttgcc tgcgtggtat cgaaattgaa gccgatgtgg tgctgaaagc 3960

aaccaaagtt gacggcgtgt ttaccgctga tccggcgaaa gatccaaccg caaccatgta 4020

cgagcaactg acttacagcg aagtgctgga aaaagagctg aaagtcatgg acctggcggc 4080

cttcacgctg gctcgtgacc ataaattacc gattcgtgtt ttcaatatga acaaaccggg 4140

tgcgctgcgc cgtgtggtaa tgggtgaaaa agaagggact ttaatcacgg aataa 4195

<210> 5

<211> 1376

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Asp Pro Ala Val Val Pro Val Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala

1 5 10 15

Ala Thr Asp Gly Pro Pro Glu Leu Pro Pro Ala Ala Thr Pro Ala Val

20 25 30

Ala His Gly Pro Arg Gln Phe Pro Arg Ala Asp Gln Asp Ala Ile Arg

35 40 45

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Gly Pro Tyr Glu Lys Glu Lys Ala Leu Leu Gln Ala Glu Leu Leu Lys

65 70 75 80

Val Gln Ile Trp Ala Gln Glu Thr Gly Gln Lys Phe Val Val Leu Met

85 90 95

Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Met

100 105 110

Glu His Leu Asn Pro Arg Tyr Ala Arg Val Val Ala Leu Thr Lys Pro

115 120 125

Ser Asp Lys Glu Lys Gly Glu Trp Phe Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His

130 135 140

Leu Pro Thr Ala Gly Glu Ile Val Phe Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Asn

145 150 155 160

Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Ser Pro Ser Glu Tyr

165 170 175

Leu Glu Phe Met Arg Gln Val Pro Glu Leu Glu Arg Met Leu Val Arg

180 185 190

Ser Gly Ile Arg Leu Tyr Lys Tyr Trp Phe Ser Val Thr Arg Glu Glu

195 200 205

Gln His Arg Arg Phe Thr Ala Arg Glu Thr Asp Pro Leu Lys Met Trp

210 215 220

Lys Leu Ser Pro Ile Asp Lys Ala Ser Leu Asp Lys Trp Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Thr Glu Ala Lys Glu Ala Met Phe Phe Tyr Thr Asp Thr Ala Asp Ala

245 250 255

Pro Trp Thr Ile Val Lys Ser Asn Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn

260 265 270

Cys Met Arg His Phe Leu Ser Thr Ile Asp Tyr Pro Gly Lys Asp Ala

275 280 285

Ser Val Ile Gly Thr Pro Asp Pro Leu Ile Val Gly Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Val Ile Gly Gly Ala Gly His Ile Leu Asp Thr Ala Leu Pro Pro Asp

305 310 315 320

Phe Arg Lys Ala Phe Asp Ala Gly Lys Thr Pro Ala Thr Ala Arg Ala

325 330 335

Gln Glu Ala Ala Gln Ala Met Ile Glu Ala Leu Arg Gln Gln Leu Leu

340 345 350

Asp Asp Pro Arg Ser Trp Tyr Ala Phe Leu Arg His Leu Val Ala Ser

355 360 365

Gln Arg Asp Ser Trp Leu Tyr Thr Asp Leu Gln Arg Ala Cys Ala Asp

370 375 380

Phe Arg Glu Gln Leu Pro Glu Gly Tyr Ala Glu Gly Ile Gly Pro Leu

385 390 395 400

Glu Asp Phe Val Ala His Thr Gln Glu Val Ile Phe Arg Asp Pro Trp

405 410 415

Met Val Phe Ala Trp Arg Pro Arg Pro Gly Arg Trp Ile Tyr Val Arg

420 425 430

Ile His Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu Glu Leu Ser Thr Asp Ala Tyr

435 440 445

Leu Gln Ala Lys Glu Gly Ile Val Gly Leu Gly Ala Glu Gly Glu Ala

450 455 460

Val Leu Thr Val Asp Phe Arg Asp Phe Arg Pro Val Ser Arg Arg Leu

465 470 475 480

Arg Asp Glu Ser Thr Ile Gly Asp Gly Leu Thr His Leu Asn Arg Arg

485 490 495

Leu Ala Gly Arg Ile Phe Ser Asp Leu Ala Ala Gly Arg Ser Gln Ile

500 505 510

Leu Glu Phe Leu Ser Leu His Arg Leu Asp Gly Gln Asn Leu Met Leu

515 520 525

Ser Asn Gly Asn Thr Asp Phe Asp Ser Leu Arg Gln Thr Val Gln Tyr

530 535 540

Leu Gly Thr Leu Pro Arg Glu Thr Pro Trp Ala Glu Ile Arg Glu Asp

545 550 555 560

Met Arg Arg Arg Gly Phe Ala Pro Gly Trp Gly Asn Thr Ala Gly Arg

565 570 575

Val Arg Glu Thr Met Arg Leu Leu Met Asp Leu Leu Asp Ser Pro Ser

580 585 590

Pro Ala Ala Leu Glu Ser Phe Leu Asp Arg Ile Pro Met Ile Ser Arg

595 600 605

Ile Leu Ile Val Ser Ile His Gly Trp Phe Ala Gln Asp Lys Val Leu

610 615 620

Gly Arg Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Ala

625 630 635 640

Arg Ala Leu Glu Arg Glu Met Arg Asn Arg Leu Arg Gln Gln Gly Val

645 650 655

Asp Val Glu Pro Arg Ile Leu Ile Ala Thr Arg Leu Ile Pro Glu Ser

660 665 670

Asp Gly Thr Thr Cys Asp Gln Arg Leu Glu Pro Val Val Gly Ala Glu

675 680 685

Asn Val Gln Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg Tyr Pro Asp Gly Arg Ile

690 695 700

His Pro His Trp Ile Ser Arg Phe Lys Ile Trp Pro Trp Leu Glu Arg

705 710 715 720

Tyr Ala Gln Asp Leu Glu Arg Glu Val Leu Ala Glu Leu Gly Ser Arg

725 730 735

Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr

740 745 750

Leu Leu Ser Glu Arg Leu Gly Val Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala

755 760 765

Leu Glu Lys Ser Lys Tyr Leu Tyr Ser Asp Leu His Trp Arg Asp His

770 775 780

Glu Gln Asp His His Phe Ala Cys Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala

785 790 795 800

Met Asn Ala Ala Asp Ile Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala

805 810 815

Gly Asn Asp Arg Glu Ile Gly Gln Tyr Glu Gly His Gln Asp Tyr Thr

820 825 830

Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Glu Asn Gly Ile Asp Val Phe Asp Ser

835 840 845

Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Pro Arg Phe Tyr Phe Ser

850 855 860

Tyr Ala Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Phe Leu Glu Pro Glu Ile Glu

865 870 875 880

Ser Leu Leu Phe Gly Arg Glu Pro Gly Ala Asp Arg Arg Gly Val Leu

885 890 895

Glu Asp Arg Gln Lys Pro Leu Leu Leu Ser Met Ala Arg Met Asp Arg

900 905 910

Ile Lys Asn Leu Ser Gly Leu Ala Glu Leu Tyr Gly Arg Ser Ser Arg

915 920 925

Leu Arg Gly Leu Ala Asn Leu Val Ile Ile Gly Gly His Val Asp Val

930 935 940

Gly Asn Ser Arg Asp Ala Glu Glu Arg Glu Glu Ile Arg Arg Met His

945 950 955 960

Glu Ile Met Asp His Tyr Gln Leu Asp Gly Gln Leu Arg Trp Val Gly

965 970 975

Ala Leu Leu Asp Lys Thr Val Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Val Val Ala

980 985 990

Asp Gly Arg Gly Val Phe Val Gln Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly

995 1000 1005

Leu Thr Val Ile Glu Ala Met Ser Ser Gly Leu Pro Val Phe Ala Thr

1010 1015 1020

Arg Phe Gly Gly Pro Leu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Val Ser Gly Phe

1025 1030 1035 1040

His Ile Asp Pro Asn Asp His Glu Ala Thr Ala Glu Arg Leu Ala Asp

1045 1050 1055

Phe Leu Glu Ala Ala Arg Glu Arg Pro Lys Tyr Trp Leu Glu Ile Ser

1060 1065 1070

Asp Ala Ala Leu Ala Arg Val Ala Glu Arg Tyr Thr Trp Glu Arg Tyr

1075 1080 1085

Ala Glu Arg Leu Met Thr Ile Ala Arg Ile Phe Gly Phe Trp Arg Phe

1090 1095 1100

Val Leu Asp Arg Glu Ser Gln Val Met Glu Arg Tyr Leu Gln Met Phe

1105 1110 1115 1120

Arg His Leu Gln Trp Arg Pro Leu Ala His Ala Val Pro Met Glu Met

1125 1130 1135

Ala Thr Asn Ala Lys Pro Val Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu Ser

1140 1145 1150

Gly Glu Ala Leu Gln Gly Thr Glu Gly Phe Gly Ile Asp Ala Ser Ile

1155 1160 1165

Leu Asp Arg Met Ala Gln Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Leu Gly Ile

1170 1175 1180

Gln Val Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala Gly

1185 1190 1195 1200

Leu Ala Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly Met

1205 1210 1215

Leu Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ala Leu His Arg

1220 1225 1230

Ala Tyr Val Asn Ala Arg Leu Met Ser Ala Ile Pro Leu Asn Gly Val

1235 1240 1245

Cys Asp Ser Tyr Ser Trp Ala Glu Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn Asn

1250 1255 1260

Arg Val Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr Thr

1265 1270 1275 1280

Asp Ser Ala Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val Val

1285 1290 1295

Leu Lys Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Ala Lys

1300 1305 1310

Asp Pro Thr Ala Thr Met Tyr Glu Gln Leu Thr Tyr Ser Glu Val Leu

1315 1320 1325

Glu Lys Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ala Ala Phe Thr Leu Ala Arg

1330 1335 1340

Asp His Lys Leu Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Asn Lys Pro Gly Ala

1345 1350 1355 1360

Leu Arg Arg Val Val Met Gly Glu Lys Glu Gly Thr Leu Ile Thr Glu

1365 1370 1375

<210> 6

<211> 4159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcggacc cggctgttgt tccagtggca ccagttgcgg ctccggcagc gacagacggt 60

cctccggaac tgccaccggc agctacgcca gcagttgcgc acggtccgcg tcagtttccg 120

cgtgcggatc aggatgcaat ccgtgaagca ttcgaaagcg gtcgctaccc atattcccgt 180

ttaatgggcc gtggtccgta cgagaaagaa aaagctctgc tccaagccga acttctgaaa 240

gtccagattt gggcgcagga aactggccag aagttcgtag tactgatgga gggtcgtgac 300

gctgcaggca aaggtggcac cattaaacgt tttatggaac acctgaaccc gcgttacgca 360

cgtgtcgtgg ctctgacgaa accgtctgac aaagagaagg gtgaatggtt tttccagcgt 420

tatatccagc atttgccgac cgcaggtgaa atcgttttct atgatcgttc ctggtacaac 480

cgtgcaggcg ttgaacgtgt aatgggcttc tgctctcctt ctgaatatct ggagttcatg 540

cgccaggtgc cagaactcga acgcatgctc gttcgctccg gtatccgcct ctacaaatac 600

tggttctctg tcacccgtga ggagcagcac cgccgtttca ccgcgcgtga aaccgacccg 660

ctcaagatgt ggaaactgtc gccaatcgac aaagcatctc tggacaaatg ggacgattac 720

accgaggcca aagaagcaat gttcttctac accgacaccg ccgatgcgcc gtggaccatc 780

gtcaaaagca acgacaaaaa acgcgcacgc ttgaactgca tgcgccactt cctgagcacc 840

attgactacc caggtaaaga tgcttctgtc atcggtactc cagacccact gatcgtcggt 900

cgtgcgagtc aagttattgg tggtgcgggt cacatcctgg ataccgccct gccgccagac 960

tttcgtaaag cgttcgacgc gggtaaaact ccggctactg cgcgtgcgca ggaggcagct 1020

caggcataaa aggagatata atgattgaag ccctacgcca gcagcttctg gacgaccccc 1080

gttcctggta tgcctttctc cgccatctgg tggcaagtca gcgcgactct tggctctaca 1140

cggacctgca gcgggcctgt gccgactttc gcgagcagct cccggagggc tatgccgaag 1200

gtatcggccc gctggaggat ttcgtcgcgc acacccagga ggtcatcttt cgcgatccct 1260

ggatggtctt tgcctggcgt ccacgtcctg gccgctggat ctatgtgcgc atccaccgcg 1320

agcaactggc gctggaggag ctcagtaccg atgcctatct gcaggccaag gagggcattg 1380

tcggcctagg ggccgagggt gaggcggttc tgaccgtgga tttccgcgat tttcggcccg 1440

tgagccgacg cctgcgcgac gagagcacca tcggcgatgg gctgacccac ctcaaccggc 1500

ggttggctgg gcggatcttc agcgatctgg ccgcgggccg cagtcagatt ctggaatttc 1560

tcagcctgca tcgcctggat ggccagaacc tcatgctcag caatggcaac accgatttcg 1620

acagtctgcg tcagacggtg cagtacctcg gcaccctgcc gcgggagacg ccctgggcgg 1680

agattcgcga ggacatgcgc cgccgtggct ttgccccggg ctgggggaac acggcgggcc 1740

gcgtgcggga gaccatgcgc ctgctcatgg acctcctgga cagcccctcg cccgctgcgc 1800

tggagtcctt tctcgatcgc attcccatga tttcccggat cctcatcgtc tccatccacg 1860

gttggtttgc tcaggacaag gtgctgggac ggcccgatac cggggggcag gtggtctata 1920

tcctggatca ggcccgcgcc ctggaacggg aaatgcgcaa ccggctgcgg cagcagggcg 1980

tggatgtgga accgcgcatc ctcatcgcta cccgcctcat acccgagtcc gatggtacca 2040

cctgcgacca gcgtctggag ccggtggtgg gggcggagaa cgtgcagatt ctgcgcgtac 2100

ccttccgcta tcccgatggc cgtatccacc cccactggat ttcccgtttc aagatctggc 2160

cctggctgga gcgctacgcg caggatctgg agcgggaggt cctggcggaa ctgggcagcc 2220

gcccggatct catcatcggc aactattccg atggcaatct cgtggcgacc ctgctcagtg 2280

agcgccttgg ggtgacccag tgcaacatcg cccacgccct ggaaaagagc aagtacctct 2340

acagcgatct gcactggcgc gatcacgagc aggatcacca ttttgcctgc cagttcaccg 2400

ccgatctcat cgccatgaat gccgccgaca tcatcgtcac cagcacctac caggaaattg 2460

ccggtaacga tcgcgaaatc ggccagtacg aggggcatca ggactatacc ctgccgggtc 2520

tgtatcgggt ggagaatggt attgacgtct tcgacagcaa gttcaacatc gtctcgccgg 2580

gggcggatcc gcgtttttac ttttcatacg cccgaaccga ggagcgtcct agcttcctcg 2640

aaccggagat cgagtcgctg ctttttggcc gtgagcccgg cgctgaccgg cgcggggtgc 2700

tggaggatcg gcaaaaacct ctgctcctga gcatggcgcg tatggatcgc atcaagaatc 2760

tgagtggcct ggccgaactc tatggacgct cctcgcgcct gcgcggtctg gccaatctcg 2820

tcatcatcgg cggccacgtg gatgtgggta actcccgcga tgccgaggag cgcgaggaga 2880

tccgccggat gcacgagatc atggaccatt accagctgga tgggcagttg cgctgggtcg 2940

gtgcactgct ggacaagacc gtcgctggcg aactgtaccg ggtggtggcg gatggccggg 3000

gggtcttcgt ccagcctgcc cttttcgagg ccttcggcct gaccgtcatc gaggccatga 3060

gttcgggcct gccggtcttc gctacccgct ttggcggccc cctggagatc atcgaagatg 3120

gtgtctccgg ttttcacatc gatcccaacg atcacgaggc cacggcggag cgcctggccg 3180

attttctgga ggcggcccgg gagcgcccca agtattggct ggagatttcc gacgcggcgc 3240

tggcgcgggt ggctgagcgc tatacctggg aacgctacgc cgaacggctg atgaccattg 3300

cccgcatctt tggcttctgg cgctttgtcc tggatcggga aagtcaggtt atggagcgtt 3360

atctgcagat gtttcggcac ctgcagtggc ggcctttggc ccatgccgtg ccgatggagt 3420

agaaggagat ataatggcta ccaatgcaaa acccgtctat aaacgcattc tgcttaagtt 3480

gagtggcgaa gctctgcagg gcactgaagg cttcggtatt gatgcaagca tactggatcg 3540

tatggctcag gaaatcaaag aactggttga actgggtatt caggttggtg tggtgattgg 3600

tgggggtaac ctgttccgtg gcgctggtct ggcgaaagcg ggtatgaacc gcgttgtggg 3660

cgaccacatg gggatgctgg cgaccgtaat gaacggcctg gcaatgcgtg atgcactgca 3720

ccgcgcctat gtgaacgctc gtctgatgtc cgctattcca ttgaatggcg tgtgcgacag 3780

ctacagctgg gcagaagcta tcagcctgtt gcgcaacaac cgtgtggtga tcctctccgc 3840

cggtacaggt aacccgttct ttaccaccga ctcagcagct tgcctgcgtg gtatcgaaat 3900

tgaagccgat gtggtgctga aagcaaccaa agttgacggc gtgtttaccg ctgatccggc 3960

gaaagatcca accgcaacca tgtacgagca actgacttac agcgaagtgc tggaaaaaga 4020

gctgaaagtc atggacctgg cggccttcac gctggctcgt gaccataaat taccgattcg 4080

tgttttcaat atgaacaaac cgggtgcgct gcgccgtgtg gtaatgggtg aaaaagaagg 4140

gactttaatc acggaataa 4159

Claims

1.功能蛋白质在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用；所述功能蛋白质包括聚磷酸激酶、蔗糖合成酶和尿苷一磷酸激酶；

所述聚磷酸激酶来源于Gemmobacter sp. LW-1；

所述蔗糖合成酶来源于拟南芥或大豆；

所述尿苷一磷酸激酶来源于大肠杆菌；

所述功能蛋白质的氨基酸序列如序列表的序列1所示或如序列表的序列3所示。

2.能够表达权利要求1所述功能蛋白质的核酸分子在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。

3.重组菌，是对出发菌进行改造使其能够表达权利要求1所述功能蛋白质得到的。

4.权利要求3所述的重组菌在制备尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。

5.一种制备尿苷二磷酸葡萄糖的方法，包括如下步骤：以尿苷一磷酸和蔗糖为底物，在权利要求3所述的重组菌的催化作用下反应得到尿苷二磷酸葡萄糖。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述催化反应体系中包括所述重组菌、尿苷一磷酸、蔗糖、ATP、MgCl₂和polyP。

7.用于制备尿苷二磷酸葡萄糖的试剂盒，包括尿苷一磷酸、蔗糖和权利要求3所述的重组菌。