CN107723307A

CN107723307A - 一种高效制备d‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法及其应用

Info

Publication number: CN107723307A
Application number: CN201710927405.3A
Authority: CN
Inventors: 孙媛霞; 杨建刚; 朱玥明; 门燕; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-10-09
Filing date: 2017-10-09
Publication date: 2018-02-23

Abstract

本发明公开了一种高效制备D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法及其应用，提出了一种通过同工酶组合表达高效制备催化同一反应的酶催化剂的方法，运用该方法，以谷氨酸棒杆菌为宿主细胞，构建了质粒游离和染色体整合两种表达方式的重组菌株，并测定了针对D‑果糖的催化效率，与表达单个D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶相比，组合表达使得酶催化效率提高2‑4倍，以70％果糖为底物时，转化率达到29％。该方法可以提高D‑阿洛酮糖的生产效率，适用于D‑阿洛酮糖的工业化生产。本发明还公开了新的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶在阿洛酮糖合成中的应用，该酶来源于类芽孢杆菌属Paenibacillus senegalensis，酶催化活性约为25U/mg，可用于转化D‑果糖生成D‑阿洛酮糖。

Description

一种高效制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及其应用

技术领域

本发明涉及工业生物技术领域，具体涉及一种高效制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及其在阿洛酮糖制备中的应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是果糖的差向异构体，其甜度为蔗糖的70％，然而能量值仅为0.007kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3％，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；D-阿洛酮糖被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道d-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积，在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面也有很高的医疗价值。美国食品及药品管理局(FDA)于2011 年正式批准D-阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，因此，D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖C3位羟基的差向异构，采用DPE催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖是非常高效的D-阿洛酮糖制备方法。目前已报到约12种不同物种来源的DPE，分别来源于Agrobacterium tumefacien，Rhodobacter sphaeroides SK001，Clostridium cellulolyticum，Desmospora sp.8437，Clostridium.bolteae，Clostridium.scindens，Clostridium sp.，Treponema primitiaZAS-1，Dorea sp.CAG317，P.cichorii，Ruminococcus sp.，Flavonifractor plautii，这些DPE经分子改造获得的若干催化活性高、热稳定性好的DPE突变体，这些DPE酶及其突变体组成了一个以果糖为底物合成D-阿洛酮糖的备用酶分子元件库。目前与DPE 相关的专利保护主要集中在对DPE氨基酸序列及其突变体的保护，对筛选获得的DPE 生产菌株对DPE表达系统构建的保护，以及对DPE应用于阿洛酮糖制备方面的保护。目前的专利保护中仅仅针对单个DPE的表达和转化，造成酶的表达和酶催化反应效率较低。

同工酶是指催化同一化学反应而化学组成不同的一组酶，它们的氨基酸序列存在差异，具有一定相似度，然而编码氨基酸的核苷酸序列差别很大，相似度很低。基于这一点，本专利提供了一种通过组合同工酶高效表达外源基因的方法，并将其应用于DPE 酶高效制备和D-阿洛酮糖的合成。

发明内容

本发明目的之一是提供一种同工酶串联表达的基因片段的构建方法，其特征在于，将催化同一反应的2个以上的同工酶编码基因串联组合并由一个启动子启动，或将催化同一反应的2个以上的同工酶编码基因分别由单独的启动子启动并串联组合。

在优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，所述2个以上的同工酶编码基因，优选2-20个同工酶编码基因、更优选2-10个同工酶编码基因、更优选2-5个同工酶编码基因、更优选2-3个同工酶编码基因，最优选3个同工酶编码基因。

在优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，同工酶编码基因为D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因，所述的启动子为tuf，sod，H34或H36。

在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，催化同一反应的3个D- 阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因分别由单独的启动子启动并串联组合，所述3个D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，启动序列为SEQ ID NO：4的启动子为tuf，启动序列为SEQ ID NO：5的启动子为H34，启动序列为SEQ ID NO：6的启动子为H36。

在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，催化同一反应的3个D- 阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因分别由单独的启动子启动并串联组合，所述3个D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因编码氨基酸序列是SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，启动编码氨基酸序列为SEQ ID NO：7的基因的启动子为tuf，启动编码氨基酸序列为SEQ IDNO：8的基因的启动子为H34，启动编码氨基酸序列为SEQ ID NO：9的基因的启动子为H36。

在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，催化同一反应的3个D- 阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因串联组合并由一个启动子启动，所述3个D-阿洛酮糖 3-差向异构酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，所述启动子为tuf。

在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，催化同一反应的3个D- 阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因串联组合并由一个启动子启动，所述3个D-阿洛酮糖 3-差向异构酶编码基因编码氨基酸序列是SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，所述启动子为tuf。

在优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因编码氨基酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：7；b)SEQ ID NO：8；c)SEQ ID NO：9；d)与SEQ ID NO：7具有70％或以上，优选90％以上，更优选 99％以上同源性的氨基酸序列；e)与SEQ ID NO：8具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；f)与SEQ ID NO：9具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因的核苷酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：1；b)SEQ ID NO：2；c)SEQ ID NO：3；d)与SEQ ID NO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；e)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；f)与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

本发明目的之二是提供一株重组菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.14524。

本发明目的之三是提供一株重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有本发明目的之一所述任一方法获得的基因片段。

在优选的实施方式中，所述的重组菌株，其特征选自(a)或(b)；

(a)所述的基因片段构建于载体，载体转化宿主菌株；

(b)所述的基因片段整合至宿主菌株染色体上。

在更优选的实施方式中，所述重组菌株，其特征在于，载体是pEC-XK99E或pXMJ19或pVWEx2，重组菌株为谷氨酸棒状杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌或酿酒酵母。

本发明目的之四是提供一种生产D-阿洛酮糖的方法，培养本发明目的之三所述重组菌株，利用重组菌株以D-果糖为底物进行催化。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系为D-果糖的浓度为1-700g/L，所述反应体系中的催化剂为全细胞催化剂或粗酶液，优选的全细胞催化剂为1-50g细胞干重/L，优选的粗酶液为10-1000mg/L，优选的反应体系pH为7-9。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，D-果糖的浓度为500-700g/L。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，D-果糖的浓度为500g/L。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，粗酶液为500mg/L。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，反应体系的pH为7.5。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，反应体系含有金属离子，优选的金属离子为Co2+和/或Mn2+。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应条件为，温度为45-60℃，催化时间1-10小时。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，D-阿洛酮糖对D-果糖的摩尔转化率不低于27％。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应条件为，温度为55℃，催化时间4-6小时。

在最优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，D-阿洛酮糖对D-果糖的摩尔转化率不低于27％。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系为，D-果糖的浓度为1-700g/L、优选的D-果糖的浓度为500-700g/L、最优选的D- 果糖的浓度为500g/L，所述反应体系中的催化剂为全细胞催化剂或粗酶液，全细胞催化剂为1-50g细胞干重/L，粗酶液为10-1000mg/L，优选的粗酶液为500mg/L，反应体系pH为7-9，优选的pH为7.5，所述反应体系还含有金属离子Co2+和/或Mn2+，所述的催化的反应条件为，温度为45-60℃，优选的温度为55℃，所述的催化的催化时间为 1-10小时，优选的时间4-6小时。

本发明目的之四是提供生产D-阿洛酮糖的方法，培养重组菌株，利用重组菌株，以D-果糖为底物进行催化。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，重组菌株为将含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因的载体转化目标菌株得到的，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因编码氨基酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：7；b)SEQ ID NO：8；c)SEQ ID NO：9；d)与SEQ ID NO：7具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；e)与SEQ ID NO：8具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；f)与SEQ ID NO：9具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，重组菌株为将含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因的载体转化目标菌株得到的，D-阿洛酮糖3- 差向异构酶编码基因的核苷酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：1； b)SEQID NO：2；c)SEQ ID NO：3；d)与SEQ ID NO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；e)与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列；f)与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系为D-果糖的浓度为1-700g/L，所述反应体系中的催化剂为全细胞催化剂或粗酶液，反应体系pH为7-9，优选的全细胞催化剂为1-50g细胞干重/L，优选的粗酶液为 10-1000mg/L。

在最优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，D-果糖的浓度为500-700g/L。

在最优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，D-果糖的浓度为500g/L。

在最优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，粗酶液为500mg/L。

在最优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，反应体系的pH为7.5。

在优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，体系含有金属离子，优选的金属离子为Co2+和/或Mn2+。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应条件为，温度为45-60℃，催化时间1-10小时。

在最优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应条件为，温度为55℃，催化时间4-6小时。

在更优选的实施方式中，所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系为，D-果糖的浓度为1-700g/L，优选的D-果糖的浓度为500g/L，金属离子为Co2+ 和/或Mn2+，全细胞催化剂为1-50g细胞干重/L，粗酶液为10-1000mg/L，优选的粗酶液为500mg/L，反应体系pH为7-9，优选的pH为7.5，所述的催化的反应条件为，温度为45-60℃，优选的温度为55℃，所述重组菌株为将含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因的载体转化目标菌株得到的菌株，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因编码氨基酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：7；b)SEQ ID NO：8； c)SEQ ID NO：9；d)与SEQ IDNO：7具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；e)与SEQ IDNO：8具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；f)与SEQ IDNO：9具有70％或以上，优选90％以上，更优选 99％以上同源性的氨基酸序列。

本发明目的五是提供一种高效制备催化同一反应的酶催化剂的制备方法，其特征为，采用组合表达的思路将多个同工酶元件组成一个操纵子，并将操纵子构建至表达载体或者整合至染色体中进行表达。所述同工酶是指具有催化同一反应的一组酶，编码同工酶的核苷酸序列往往相似度很低；所述同工酶基因组合操纵子的构建方法如图1所示三种情况，同工酶组合操纵子可以采用同一启动子启动多个同工酶基因转录；也可以每个同工酶基因前含有一个启动子启动基因转录；还可以若干个同工酶基因共用一个启动子启动转录，所使用的启动子可以是诱导型表达启动子也可以是组成型表达启动子。所述同工酶组合表达是指将同工酶基因组合而成的操纵子构建至表达载体或者整合至染色体中进行表达，所采用的表达载体可以是在如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等菌株中表达的表达载体，所述整合到染色体中，是指将同工酶基因组合操纵子通过分子遗传操作整合至如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等菌株的染色体中进行表达。

本发明所述的同工酶组合表达还包括以下情形，同一酶的氨基酸序列可以按照大肠杆菌中的密码子偏好性，设计核苷酸序列1，也可以根据谷氨酸棒杆菌中的密码子偏好性，设计核苷酸序列2，也还可以根据枯草芽孢杆菌的密码子偏好性，设计核苷酸序列3……，这些核苷酸序列往往具有很低的相似性，但是其转录翻译之后获得的氨基酸序列相同，催化相同的反应，这些核苷酸序列可以按照如图1所示的操纵子构建方法，获得一个基因表达盒，进而以质粒形式或者染色体整合形式转入如上所述的菌株中进行表达。

本发明目的六是提供一种高效制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)的方法，其特征为，采用同工酶组合表达的思路，构建由不同物种来源的DPE基因组成的操纵子，并将该操纵子构建至可以在大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳酸菌，或者酿酒酵母中表达的表达载体中，或者整合至大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳酸菌或者酿酒酵母染色体中进行表达。

本发明目的七是提供一个可在谷氨酸棒杆菌中高效表达DPE的重组载体，其特征为，采用同工酶基因组合表达策略将tuf启动子，来源于Paenibacillus senegalensis 的DPE基因(SEQ ID NO：1)，H34启动子，来源于Ruminococcus sp.的DPE基因(SEQ ID NO：2)，H36启动子和来源于Clostridium cellulolyticum的DPE基因(SEQ ID NO： 3)通过串联连接，构建组合操纵子(图2)，并将该组合操纵子构建至谷氨酸棒杆菌表达载体pEC-XK99E中(Kirchner，O.et al.Tools for genetic engineering in the amino acid-producingbacterium Corynebacterium glutamicum.J.Biotechnol.2003，104，287-299)，获得重组表达载体命名为 pEC-RPCDPE。所述重组载体pEC-RPCDPE中，在来源于Paenibacillussenegalensis的 DPE基因前有tuf启动子(SEQ ID NO：4)，在来源于Ruminococcus sp.的DPE基因前有H34启动子(SEQ ID NO：5)，在来源于Clostridium cellulolyticum的DPE基因前含有H36启动子(SEQ ID NO 6)，这些启动子均为组成型启动子，用于启动下游基因的转录。

本发明目的八是提供一株谷氨酸棒杆菌重组菌株，该重组菌株命名为DPE1，其特征为重组菌株DPE1中含有重组表达载体pEC-RPCDPE，重组菌株DPE1在不含有诱导剂的培养基中培养后即可制备成全细胞催化剂或者经破碎制备成粗酶液，所述培养基可以是营养丰富的培养基如脑心浸粉培养基，也可以是基本盐培养基。

本发明目的九是提供谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE1在D-阿洛酮糖合成中的应用，其特征为所述由重组菌株DPE1制备而成的全细胞催化剂或者粗酶液，可用于转化D-果糖合成D-阿洛酮糖；所述转化条件为，温度设定为50-60℃，pH设定为7-9，反应体系中可以选择无添加金属离子，也可以添加Co²⁺、Mn²⁺等，底物D-果糖的浓度为1-700g/L；优选的温度为55℃，pH为7.5，金属离子为Co²⁺或者Mn²⁺，D-果糖浓度为500g/L，所述全细胞催化剂的使用量为1-50g细胞干重/L，所述粗酶的使用量为10-1000U/L。

本发明目的十是提供另外一株谷氨酸棒杆菌重组菌株，该重组菌株命名为DPE3,该菌株已于2017年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14524,分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。其特征为，在重组菌株DPE3染色体中整合了由来源于Paenibacillus senegalensis的DPE基因(SEQ ID NO：1),来源于Ruminococcus sp.的DPE基因(SEQ ID NO：2)，和来源于Clostridium cellulolyticum的DPE基因(SEQ ID NO：3)组合的操纵子(图2)，基因组合方式和所选择的启动子与本发明目的七相同。所述重组菌株DPE3在不含有抗生素和诱导剂的培养基中培养后即可制备成全细胞催化剂或者经破碎制备成粗酶液，所述培养基可以是营养丰富的培养基如脑心浸粉培养基，也可以是基本盐培养基。

本发明目的十一是提供谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE3在D-阿洛酮糖合成中的应用，其特征为，所述由重组菌株DPE3制备而成的全细胞催化剂或者粗酶液，可用于转化D- 果糖合成D-阿洛酮糖；所述转化条件为，温度设定为50-60℃，pH设定为7-9，反应体系中可以选择无添加金属离子，也可以添加Co²⁺、Mn²⁺等，底物D-果糖的浓度为1-700g/L；优选的温度为55℃，pH为7.5，金属离子为Co²⁺或者Mn²⁺，D-果糖浓度为500g/L，所述全细胞催化剂的使用量为1-50g细胞干重/L，所述粗酶的使用量为10-1000U/L。

本发明目的十二是提供运用来源于类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis的DPE 转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，来源于Paenibacillus senegalensis的DPE简写为PDPE。转化条件中，温度设定为50-60℃，pH设定为7-9，金属离子可选择Co²⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、Fe²⁺，底物D-果糖的浓度为1-700g/L；优选的温度为55℃，pH为7.5，金属离子为Co²⁺或者Mn² ⁺，D-果糖浓度为500g/L。

与现有技术相比，本发明采用同工酶基因组合表达的方法可以实现获得单一酶的多个拷贝表达，还可以实现同工酶的组合表达，对于某一个特定的酶转化反应具有增强催化效率的效果，在外源基因的表达方面具有广泛的应用前景；根据同工酶基因组合表达策略，本发明实现了多个DPE的组合表达，催化D-果糖合成D-阿洛酮糖的效率提高近 3倍，该发明有助于进一步降低D-阿洛酮糖生产中的酶及全细胞催化剂的成本，为D- 阿洛酮糖的工业化生产提供基础。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为同工酶基因组合操纵子构建方法。(a)多个同工酶基因共用一个启动子；(b)每个同工酶基因前均含有一个启动子；(c)若干个同工酶共用一个启动子。

图2为DPE基因组合表达构建策略。

图3酶法催化D-果糖生成D-阿洛酮糖过程曲线。(a)用50％果糖作为底物；(b) 用70％果糖作为底物。

图4SDS-PAGE分析来源于类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis的DPE。

图5酶学性质表征来源于类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis的DPE。

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位 g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物和基因由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing：Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo， H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包 (Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

本发明的“细胞干重”的含义是，发酵培养获得的细胞经冷冻干燥后，称量计算所得到的细胞重量。

本发明的“粗酶液”的含义是，发酵培养所获得的细胞，收集后，经超声破碎，离心所得到的上清液。

本发明的“2个以上的同工酶编码基因”的含义是，2个以上的基因，所述基因编码的蛋白催化同一化学反应，2个以上的基因序列互相不相同，且2个以上的基因编码蛋白的氨基酸序列也互相不相同。

“3个D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因”的含义是，3个基因，所述基因编码的蛋白催化同一化学反应，编码蛋白都具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，3个基因序列互相不相同，且3个基因编码蛋白的氨基酸序列也互相不相同。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

SEQ ID NO：1编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：2编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：3编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：9。

实施例1、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株以游离质粒形式表达组合DPE操纵子

1、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE1

首先，构建重组表达载体pEC-RPCDPE1根据来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子序列(SEQ ID NO：4)设计引物1和2，以来源于Paenibacillus senegalensis的DPE基因序列(SEQ ID NO：1)设计引物3和4，以来源于Ruminococcus sp.的DPE基因序列 (SEQ ID NO：2)设计引物5和6，以来源于Clostridium cellulolyticum的DPE基因序列(SEQ ID NO：3)设计引物7和8，其中引物2与3，引物4和5，引物6和7分别含有约40bp的同源区域，用于PCR片段之间的融合，引物5中含有H34启动子序列，引物7中含有H36启动子序列，H34启动子用于启动来源于Ruminococcus sp.的DPE 基因的转录，H36启动子用于启动来源于Clostridiumcellulolyticum的DPE基因的转录，其中引物1和8中分别含有PstI酶切位点，引物序列如下：

引物1：GACAACTGCAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG

引物2：AGTAAGTACCGAATTTCATTGTATGTCCTCCTGGACTTCG

引物3：CGAAGTCCAGGAGGACATACAATGAAATTCGGTACTTACT

引物4：TTGCCTTGCAGGGTACCTTACGGGGTAGATTTCAGGAAGG

引物5：

CCTTCCTGAAATCTACCCCGTAAGGTACCCTGCAAGGCAATGTTCGATGTTGGGCTTCATTTTGAGGGTTTGGTTGAGTTTCAAGGGTCGTAGGATAATAATGGGATCC

引物6：GGGCACCAGATAGAGGTACCTTAGACTTCAAATACATGTT

引物7：

AACATGTATTTGAAGTCTAAGGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCC

引物8：GACAACTGCAGTCAGGAGTGTTTATGACATTCT

用引物1和2以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增tuf启动子，用引物3和4以由江苏金唯智生物技术有限公司提供的重组质粒pUC57-PDPE为模板PCR扩增PDPE基因，以瘤胃菌Ruminococcus sp的基因组为模板PCR扩增RDPE基因，以梭菌Clostridiumcellulolyticum的基因组为模板PCR扩增CDPE基因，采用融合PCR技术，将上述所得的四个PCR片段进行融合，得到融合片段“tuf-PDPE-H34-RDPE-H36-CDPE”(SEQ ID NO：10)，用限制性内切酶PstI同时酶切融合片段和表达载体pEC-XK99E，并进行连接，得到重组表达载体pEC-RPCDPE1。

其次，采用电转化方法将重组质粒pEC-RPCDPE1转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株DPE1。

2、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE2

首先，构建重组表达载体pEC-RPCDPE2根据来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子序列(SEQ ID NO：4)设计引物9和10，以来源于Paenibacillus senegalensis的DPE 基因序列(SEQ ID NO：1)设计引物11和12，以来源于Ruminococcus sp.的DPE基因序列(SEQ ID NO：2)设计引物13和14，以来源于Clostridium cellulolyticum的DPE 基因序列(SEQ ID NO：3)设计引物15和16，其中引物10与11，引物12和13，引物 14和15分别含有约40bp的同源区域，用于PCR片段之间的融合，其中引物9和16中分别含有PstI酶切位点，引物序列如下：

引物9：GACAACTGCAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG

引物10：CACGAAGTCCAGGAGGACATACAATGAAATATGGTATTTATTA

引物11：TAATAAATACCATATTTCATTGTATGTCCTCCTGGACTTCGTG

引物12：AACATGTATTTGAAGTCTAAATGAAATTCGGTACTTACT

引物13：AGTAAGTACCGAATTTCATTTAGACTTCAAATACATGTT

引物14：CGTAGTATATACCATGTTTCATTTACGGGGTAGATTTCAGGAAGGT

引物15：ACCTTCCTGAAATCTACCCCGTAAATGAAACATGGTATATACTACG

引物16：GACAACTGCAGTCAGGAGTGTTTATGACATTCT

用引物9和10以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增tuf启动子，用引物11和12 以由江苏金唯智生物技术有限公司提供的重组质粒pUC57-PDPE为模板PCR扩增PDPE 基因，用引物13和14以瘤胃菌Ruminococcus sp的基因组为模板PCR扩增RDPE基因，用引物15和16以梭菌Clostridium cellulolyticum的基因组为模板PCR扩增CDPE 基因，采用融合PCR技术，将上述所得的四个PCR片段进行融合，得到融合片段 “tuf-PDPE-RDPE-CDPE”(SEQ IDNO：11)，用限制性内切酶PstI同时酶切融合片段和表达载体pEC-XK99E，并进行连接，得到重组表达载体pEC-RPCDPE2。

其次，采用电转化方法将重组质粒pEC-RPCDPE2转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株DPE2。

3.构建谷氨酸棒杆菌重组菌株PDPE

首先，构建重组表达载体pEC-PDPE根据来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子序列(SEQ ID NO：4)设计引物1和2，以来源于Paenibacillus senegalensis的DPE基因序列(SEQ ID NO：1)设计引物3和9，其中引物2和3分别含有约40bp的同源区域，用于PCR片段之间的融合，其中引物1和9中分别含有PstI酶切位点，引物序列如下：

引物1：GACAACTGCAGTGGCCGTTACCCTGCGAATG

引物2：AGTAAGTACCGAATTTCATTGTATGTCCTCCTGGACTTCG

引物3：CGAAGTCCAGGAGGACATACAATGAAATTCGGTACTTACT

引物9：6ACAACTGCAGTTACGGGGTAGATTTCAGGAAGG

用引物1和2以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增tuf启动子，用引物3和9以由江苏金唯智生物技术有限公司提供的重组质粒pUC57-PDPE为模板PCR扩增PDPE基因，采用融合PCR技术，将上述所得的两个PCR片段进行融合，得到融合片段“tuf-PDPE”，用限制性内切酶PstI同时酶切融合片段和表达载体pEC-XK99E，并进行连接，得到重组表达载体pEC-PDPE。

其次，采用电转化方法将重组质粒pEC-PDPE转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株PDPE。

最终重组菌株DPE1和DPE2中均组合有三个DPE，而重组菌株PDPE中仅含有一个DPE。

实施例2、质粒形式的组合DPE操纵子在谷氨酸棒杆菌中的表达

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养

选用100mL BHI培养基(脑心浸粉37g/L，卡那霉素25ng/mL)，在30℃、200rmp 条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE1和DPE2进行培养12-24h，4℃、8000rmp离心 15min收集菌体，用ddH₂O浓缩菌液至5mL，超声破碎制备成粗酶液。

2、酶活性测定

为了测定粗酶酶活性，建立如下反应体系(500ul)：D-果糖：5％，粗酶：0.1mg，MnCl₂：1mM；反应10min，加入NaOH终止反应，并进行液相色谱检测。

采用上述步骤分别分析了组合DPE和单个DPE的粗酶活性，数据显示由重组菌株DPE1获得的粗酶液酶活性为21.2U/mg，由重组菌株DPE2获得的粗酶液酶活性为19.4 U/mg，由重组菌株PDPE获得的粗酶液酶活性为6.5U/mg，结果标明同工酶组合表达策略有助于提高催化效率近三倍。

实施例3、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株以染色体整合形式表达组合DPE操作子

1、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE3

首先，构建整合位点载体pK18-ldhA拟将DPE组合操纵子整合至染色体的乳酸脱氢酶基因(ldhA)位点，根据谷氨酸棒杆菌中乳酸脱氢酶基因(ldhA)上下游序列信息，设计引物9，引物10，引物11和引物12，其中引物9和引物10用于扩增ldhA的上游基因片段，引物11和引物12用于扩增ldhA的下游基因片段，引物10和引物11有约 40bp左右的同源区域，用于上下游片段的融合，引物9和引物12分别含有EcoRI和 HindIII酶切位点。引物序列如下：

引物9：TACCGGAATTCCGGCGCATTTCATGAATGACAAG

引物10：CGCCAAAGATTTAGAAGCTCGAGCGGTTATTTCATTTTCGATCCCACTTCCTG

引物11：TGGGATCGAAAATGAAATAACCGCTCGAGCTTCTAAATCTTTGGCGCCTAGTTG

引物12：TACTCAAGCTTCGTAGGTGAGTTCTTCGTCGGT

用引物9和引物10以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增得到上游片段ldhA1，用引物11和引物12以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增得到上游片段ldhA2，以扩增得到的ldhA1和ldhA2片段为模板，采用引物9和引物12扩增得到融合基因片段 “ldhA1-ldhA2”，采用限制性内切酶EcoRI和HindIII同时切割融合片段“ldhA1-ldhA2” 和载体pK18mobsacB(A.et al.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived fromthe Escherichia coli plasmids pK18 and pK19：selection of defined deletions inthe chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene.1994.145：69-73.)，采用T4连接酶进行连接，获得整合位点载体 pK18-ldhA。

其次，用实施例1中所述的引物1和引物8以实施例1中所构建的表达载体 pEC-RPCDPE为模板扩增DPE组合操纵子RPCDPE，并用限制性内切酶PstI同时酶切 RPCDPE片段和整合位点载体pK18-ldhA，采用T4连接酶进行连接，获得DPE基因整合载体pK18-ldhA-RPCDPE。

再次，采用电转化方法将载体pK18-ldhA-RPCDPE转至谷氨酸棒杆菌13032中，挑选阳性克隆并进行PCR验证，获得染色体整合有DPE组合操纵子的谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE3。

2、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE4

用实施例1中所述的引物1和引物9以实施例1中所构建的表达载体pEC-PDPE为模板扩增由tac启动子和来源于Paenibacillus senegalensis的DPE基因DPE组合操纵子“tac-PDPE”，并用限制性内切酶PstI同时酶切“tac-PDPE”片段和整合位点载体pK18-ldhA，采用T4连接酶进行连接，获得DPE基因整合载体pK18-ldhA-PDPE。采用电转化方法将载体pK18-ldhA-PDPE转至谷氨酸棒杆菌13032中，挑选阳性克隆并进行PCR验证，获得染色体整合有DPE组合操纵子的谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE4。

最终获得染色体中含有由三个DPE组成的操纵子的重组菌株DPE3以及只含有单个DPE的重组菌株DPE4

实施例4、染色体整合形式的组合DPE操纵子在谷氨酸棒杆菌中的表达

采用如实施例2中所述的方法对谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE3和DPE4制备粗酶液，并测定粗酶活性。

高效液相色谱分析结果显示，由谷氨酸棒杆菌DPE4获得的粗酶液酶活性为2.7 U/mg，由谷氨酸棒杆菌DPE3获得的粗酶液酶活性为10.4U/mg，酶活性提高近4倍。

实施例5、含有组合DPE操纵子的谷氨酸棒杆菌重组菌株在D-阿洛酮糖合成中的应用

1、采用如实施例2所述的培养方法对谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE1和DPE3进行培养，破碎，制备成粗酶液。

2、酶法催化D-果糖合成D-阿洛酮糖

建立如下反应体系1：D-果糖：50％，粗酶液：500mg/L，MnCl₂：lmM；55℃，反应 1h；每间隔1h取样，样品加入NaOH终止反应，并进行高效液相色谱分析检测。

由图3(a)可知，由谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE1制备的粗酶液，反应2h达到平衡，转化率为30.1％(摩尔转化率)；由谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE3制备的粗酶液，反应4h达到平衡，转化率为29.6％(摩尔转化率)。

建立如下反应体系2：D-果糖：70％，粗酶液：500mg/L，MnCl₂：1mM；控制温度55 ℃，每间隔1h取样，样品加入NaOH终止反应，并进行高效液相色谱分析检测。

由图3(b)可知，由谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE1制备的粗酶液，反应4h达到平衡，转化率为27.5％(摩尔转化率)；由谷氨酸棒杆菌重组菌株DPE3制备的粗酶液，反应6h达到平衡，转化率为27.1％(摩尔转化率)。

同时通过改变反应体系中的温度如45℃、50℃、60℃，金属离子添加Co²⁺或者无金属离子，均可以通过延长转化时间，采用由重组菌株DPE1或者DPE3制备的粗酶制剂反应达到平衡，转化率不低于27％(摩尔转化率)。

实施例6、含有来源于类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis DPE(PDPE)基因重组菌株的构建

首先，根据NCBI来源于类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis DPE基因序列(NCBI WP 010270828)，经密码子优化后，获得所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，并交由江苏金唯智生物技术有限公司合成该序列。江苏金唯智生物技术有限公司交付该基因时，该基因已连接至载体pUC57中。

其次，采用NdeI和XhoI酶切同时酶切pUC57-PDPE和pET21a的方法，再用T4连接酶对酶切后的PDPE和pET21a片段进行连接，获得重组表达载体pET21-PDPE。

再次，将重组表达载体pET21-PDPE转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得携带有PDPE基因的重组大肠杆菌，记作PDPE1。

实施例7、源于类芽孢杆菌Paenibacillus senegalensis DPE特性表征

挑取实施例6中重组大肠杆菌PDPE1至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养；以1％的接种量接入1L相同的LB培养基中，37℃200rpm 继续培养4-5h，待培养物O.D.达到0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.5mmol/L的 IPTG，于20℃，100rpm过夜诱导培养。6000rpm离心收集菌体，用去离子水洗涤三次，用100ml无菌水重悬菌体，高压破碎，15000rpm离心收集上清液，即为粗酶液，通过 SDS-PAGE确认单体的大小为约33.2千道尔顿(KD)(图4)。

将粗酶液经过0.45μm的微孔滤膜过滤，然后通过以Binding buffer(25mM Tris-HCL，300mM NaCI，40mM咪唑，pH 8.0)平衡的NTA-Ni柱；用该缓冲液冲洗10个柱体积后，以Elution buffer(25mM Tris-HCL，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。洗脱液用超滤管(Amicon Ultra 15，Millipore)进行脱盐和浓缩，最终得到纯度90％以上的重组PDPE酶。

测定PDPE的酶活性，建立如下反应体系：取0.25μl的纯化好的PDPE酶，0.5ml 1％的D-果糖溶液(20mM HEPES，pH 8.0)于55℃反应10min或1h(充分反应)，然后 100℃处理5min灭活酶的活性。用0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱按如下条件进行：安捷伦高效液相色谱仪1200；分析柱：Waters Sugar-Pak1分析柱；流动相：水；流速：0.4ml/min；柱温：80℃；检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，将上述样品进行分析，上样量为20μl，经数据分析，该酶的酶活性为25U/mg。

PDPE酶学性质测定，最适温度的测定：按照上述反应体系，以1％果糖为底物，分别于40、45、50、55、60、65℃下反应10min，然后100℃处理5min灭活。以60℃ 下的酶活性定义为100％，计算各温度下的相对酶活，数据分析可知，该酶反应温度为 55℃时酶活性最高(图5A)。

最适pH的测定：按照上例中的标准反应，以1％果糖为底物，分别于pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下反应10min，然后100℃处理5min灭活。以pH 8.0 下酶活性定义为100％，计算各pH下的相对酶活，数据分析可知，该酶反应最适pH 为8.0(图5B)。

金属离子对酶活的影响：按照上例中的标准反应，以1％果糖为底物，分别于含有1mM Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺的缓冲液中反应10min，然后100 ℃处理5min灭活。以不含任何金属离子时的酶活性定义为100％，计算不同离子下的相对酶活。数据分析可知，该金属离子Co²⁺和Mn²⁺对酶活性提高较高(图5C)。

温度对酶稳定性的影响：按照上例中的标准反应，首先将PDPE分别于50、55、60 ℃下保温30、60、90、120、150、180、240、300、360min，同时将PDPE和1mM MnCl₂分别于50、55、60℃下保温30、60、90、120、150、180、240、300、360min，然后以1％果糖为底物，60℃下反应10min，100℃处理5min灭活。以不经热处理的酶在反应温度为55℃时的酶活定义为100％，计算各温度下保温不同时间时的相对酶活。数据分析可知，反应液中添加Mn²⁺有利于提高PDPE的稳定性，将PDPE和1mM MnCl₂置于55℃下，保温360min，仍保留80％的酶活性(图5D)。

目前通过提高外源基因的拷贝数有利于从转录水平提高外源基因在宿主体内的表达强度，已经被作为一种基因工程策略应用于菌种改造、抗体制备等领域。但是同一基因在宿主体内的多拷贝表达，基因序列之间非常容易发生重组，造成遗传稳定性差等稳定。本发明提出的同工酶基因组合策略，原理上同提高外源基因拷贝数类似，不同的是，采用的催化同一反应的同工酶，避免同一基因的多次出现，同工酶基因序列之间往往相似性非常低，不易发生重组，有利于增强遗传稳定性，所以本发明提出的同工酶组合表达策略更适合于酶的高效制备。本发明实验结果标明采用同工酶组合表达策略提高D- 阿洛酮糖3-差向异构酶近3倍，有助于高效制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及含有 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的全细胞催化剂，为D-阿洛酮糖的工业化生产提供基础。除此之外，本发明所述的同工酶组合表达策略还可以应用于其他酶如醛酮异构酶、酮糖差向异构酶、氧化还原酶、糖苷水解酶、糖基转移酶，醛缩酶等的高效制备，进而应用于功能糖的生物合成。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种高效制备 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的方法及其应用

<130> 2017

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> Paenibacillus senegalensis

<400> 1

atgaaattcg gtacttactt cgcttactgg gaacagtctt gggacaccga ctacctgaaa 60

tacgttaaaa aagttgctga cctgggtttc gacgttctgg aagttggtgc tgctggtatc 120

gttaacatgt ctgacgacgc tctgtctgct ctgaaatctg aagctgaaaa ctacgctatc 180

accctgaccg ctggtatcgg tctgccgaaa cagttcgacg tttcttctga aaacgaatct 240

gttcgtcagg acggtatcgc tttcatgaaa aaaatcctgg acgctctgca caaagctggt 300

atcaaagcta tcggtggtac tatctactct tactggccgg ttgactactc tgctccgatc 360

aacaaaccgg ctgttcgtaa acagtctatc aaatctatgc aggaactggc tgactacgct 420

gctcagtacg acatcaccct gctggttgaa tctctgaacc gtttcgaaca gttcctggtt 480

aacgacgcta aagaagctgt tgactacgtt aaagctgtta acaaaccgaa cgttaaagtt 540

atgctggact ctttccacat gaacatcgaa gaagactacc tgggtgacgc tatccgttac 600

accggtgact acctgggtca cttccacatc ggtgaatgca accgtaaagt tccgggtaaa 660

ggtcacatgc cgtggtctga aatcggtcag gctctgcgtg acatccagta cgacggttgc 720

gttgttatgg aaccgttcgt tcgtccgggt ggtatcgttg gttctgacat caaagtttgg 780

cgtgacctgt ctgacaacgc tgacgaagct aaactggacg ctgacatcaa agaatctctg 840

gaattcgtta aacagacctt cctgaaatct accccgtaa 879

<210> 2

<211> 876

<212> DNA

<213> Ruminococcus sp.

<400> 2

atgaaatatg gtatttatta cgcttattgg gaaaaggaat ggaatggaga ttacaaatat 60

tatatagata aaatttcaaa attaggtttt gatattctgg aaatttcttg cggcgctttt 120

tctgactatt acacgaaaga tcaggagtta attgatattg gaaaatatgc gaaagaaaaa 180

ggcgtaacat tgacagcagg gtatggacct cattttaatg aaagcctgtc atcttcagaa 240

cccaatacgc agaaacaagc aatcagtttt tggaaagaga cgctccggaa attgaagtta 300

atggatattc atattgttgg aggcgcactc tatggttatt ggcctgtaga ttattccaaa 360

ccttttgata agaaaaggga tttagagaat tccattaaaa acatgaaaat tattagtcag 420

tatgctgaag aatatgacat aatgatgggg atggaagttc ttaaccgttt tgaaggctat 480

atgttgaata catgcgatga agcgttggca tacgttgaag aggttggctc ttctaatgtt 540

ggtgttatgt tagatacttt tcacatgaat atagaggaag ataatatagc agcagccatt 600

cgtaaagcag gagataggct ttatcacttc catataggag aaggaaatcg taaagtacca 660

ggaaaaggta tgcttccttg gaatgagata ggacaggcat tgcgagatat aaactaccaa 720

catgcagcag ttatggagcc atttgtaatg cagggaggaa cagtagggca tgacattaaa 780

atatggagag atatcattgg aaactgttct gaagttacat tagatatgga cgctcaaagt 840

gcgttgcact ttgtaaaaca tgtatttgaa gtctaa 876

<210> 3

<211> 882

<212> DNA

<213> Clostridium cellulolyticum

<400> 3

atgaaacatg gtatatacta cgcatattgg gaacaagaat gggaagctga ttacaaatac 60

tatattgaga aggttgcaaa gcttggtttt gatattctag agattgcagc ttcaccgcta 120

cctttttaca gtgacattca gattaatgag ctcaaggcat gtgcccatgg caatggaatt 180

acacttacgg taggccatgg gcctagtgca gaacaaaacc tgtcttctcc cgaccccgat 240

attcgcaaaa atgctaaagc tttttatacc gatttactca aacgacttta caagctggat 300

gtacatttga taggtggggc tttatattct tattggccga tagattacac aaagacaatt 360

gataaaaaag gcgattggga acgcagcgtt gaaagtgttc gagaagttgc taaggtggcc 420

gaagcctgtg gagtggattt ctgcctagag gttcttaata gatttgagaa ttatttaatt 480

aacacagcac aagagggtgt agattttgta aaacaggttg accataacaa tgtaaaggta 540

atgcttgata ccttccatat gaatattgag gaagatagta tcggaggtgc aatcaggact 600

gcgggctctt acttgggaca tttacacact ggcgaatgta atcgtaaagt tcccggcaga 660

ggaagaattc catgggtaga aattggtgag gctcttgctg acataggtta taacggtagt 720

gttgttatgg aaccttttgt tagaatgggc ggaactgtcg gatctaatat taaggtttgg 780

cgtgacatta gtaacggtgc agatgagaaa atgctggata gagaagcaca ggccgcactt 840

gatttctcca gatatgtatt agaatgtcat aaacactcct ga 882

<210> 4

<211> 200

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180

gaagtccagg aggacataca 200

<210> 5

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaccctgc aaggcaatgt tcgatgttgg gcttcatttt gagggtttgg ttgagtttca 60

agggtcgtag gataataatg ggatcc 86

<210> 6

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtacctcta tctggtgccc taaacggggg aatattaacg ggcccagggt ggtcgcacct 60

tggttggtag gagtagcatg ggatcc 86

<210> 7

<211> 292

<212> PRT

<213> Paenibacillus senegalensis

<400> 7

Met Lys Phe Gly Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Glu Gln Ser Trp Asp Thr

1 5 10 15

Asp Tyr Leu Lys Tyr Val Lys Lys Val Ala Asp Leu Gly Phe Asp Val

20 25 30

Leu Glu Val Gly Ala Ala Gly Ile Val Asn Met Ser Asp Asp Ala Leu

35 40 45

Ser Ala Leu Lys Ser Glu Ala Glu Asn Tyr Ala Ile Thr Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Leu Pro Lys Gln Phe Asp Val Ser Ser Glu Asn Glu Ser

65 70 75 80

Val Arg Gln Asp Gly Ile Ala Phe Met Lys Lys Ile Leu Asp Ala Leu

85 90 95

His Lys Ala Gly Ile Lys Ala Ile Gly Gly Thr Ile Tyr Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Val Asp Tyr Ser Ala Pro Ile Asn Lys Pro Ala Val Arg Lys Gln

115 120 125

Ser Ile Lys Ser Met Gln Glu Leu Ala Asp Tyr Ala Ala Gln Tyr Asp

130 135 140

Ile Thr Leu Leu Val Glu Ser Leu Asn Arg Phe Glu Gln Phe Leu Val

145 150 155 160

Asn Asp Ala Lys Glu Ala Val Asp Tyr Val Lys Ala Val Asn Lys Pro

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Ser Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Tyr Leu Gly Asp Ala Ile Arg Tyr Thr Gly Asp Tyr Leu Gly His Phe

195 200 205

His Ile Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly His Met Pro

210 215 220

Trp Ser Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Gln Tyr Asp Gly Cys

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Pro Gly Gly Ile Val Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Asp Asn Ala Asp Glu Ala Lys Leu

260 265 270

Asp Ala Asp Ile Lys Glu Ser Leu Glu Phe Val Lys Gln Thr Phe Leu

275 280 285

Lys Ser Thr Pro

290

<210> 8

<211> 291

<212> PRT

<213> Ruminococcus sp.

<400> 8

Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Asn Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Asp Lys Ile Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ser Cys Gly Ala Phe Ser Asp Tyr Tyr Thr Lys Asp Gln

35 40 45

Glu Leu Ile Asp Ile Gly Lys Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu

50 55 60

Thr Ala Gly Tyr Gly Pro His Phe Asn Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu

65 70 75 80

Pro Asn Thr Gln Lys Gln Ala Ile Ser Phe Trp Lys Glu Thr Leu Arg

85 90 95

Lys Leu Lys Leu Met Asp Ile His Ile Val Gly Gly Ala Leu Tyr Gly

100 105 110

Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Lys Pro Phe Asp Lys Lys Arg Asp Leu

115 120 125

Glu Asn Ser Ile Lys Asn Met Lys Ile Ile Ser Gln Tyr Ala Glu Glu

130 135 140

Tyr Asp Ile Met Met Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Met Leu Asn Thr Cys Asp Glu Ala Leu Ala Tyr Val Glu Glu Val Gly

165 170 175

Ser Ser Asn Val Gly Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu

180 185 190

Glu Asp Asn Ile Ala Ala Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Tyr

195 200 205

His Phe His Ile Gly Glu Gly Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Met

210 215 220

Leu Pro Trp Asn Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln

225 230 235 240

His Ala Ala Val Met Glu Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Val Gly

245 250 255

His Asp Ile Lys Ile Trp Arg Asp Ile Ile Gly Asn Cys Ser Glu Val

260 265 270

Thr Leu Asp Met Asp Ala Gln Ser Ala Leu His Phe Val Lys His Val

275 280 285

Phe Glu Val

290

<210> 9

<211> 293

<212> PRT

<213> Clostridium cellulolyticum

<400> 9

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile

35 40 45

Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val

50 55 60

Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp

65 70 75 80

Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu

85 90 95

Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg

115 120 125

Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly

130 135 140

Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile

145 150 155 160

Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu

195 200 205

His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro

210 215 220

Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser

225 230 235 240

Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu

260 265 270

Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu

275 280 285

Cys His Lys His Ser

290

<210> 10

<211> 3009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180

gaagtccagg aggacataca atgaaattcg gtacttactt cgcttactgg gaacagtctt 240

gggacaccga ctacctgaaa tacgttaaaa aagttgctga cctgggtttc gacgttctgg 300

aagttggtgc tgctggtatc gttaacatgt ctgacgacgc tctgtctgct ctgaaatctg 360

aagctgaaaa ctacgctatc accctgaccg ctggtatcgg tctgccgaaa cagttcgacg 420

tttcttctga aaacgaatct gttcgtcagg acggtatcgc tttcatgaaa aaaatcctgg 480

acgctctgca caaagctggt atcaaagcta tcggtggtac tatctactct tactggccgg 540

ttgactactc tgctccgatc aacaaaccgg ctgttcgtaa acagtctatc aaatctatgc 600

aggaactggc tgactacgct gctcagtacg acatcaccct gctggttgaa tctctgaacc 660

gtttcgaaca gttcctggtt aacgacgcta aagaagctgt tgactacgtt aaagctgtta 720

acaaaccgaa cgttaaagtt atgctggact ctttccacat gaacatcgaa gaagactacc 780

tgggtgacgc tatccgttac accggtgact acctgggtca cttccacatc ggtgaatgca 840

accgtaaagt tccgggtaaa ggtcacatgc cgtggtctga aatcggtcag gctctgcgtg 900

acatccagta cgacggttgc gttgttatgg aaccgttcgt tcgtccgggt ggtatcgttg 960

gttctgacat caaagtttgg cgtgacctgt ctgacaacgc tgacgaagct aaactggacg 1020

ctgacatcaa agaatctctg gaattcgtta aacagacctt cctgaaatct accccgtaag 1080

gtaccctgca aggcaatgtt cgatgttggg cttcattttg agggtttggt tgagtttcaa 1140

gggtcgtagg ataataatgg gatccatgaa atatggtatt tattacgctt attgggaaaa 1200

ggaatggaat ggagattaca aatattatat agataaaatt tcaaaattag gttttgatat 1260

tctggaaatt tcttgcggcg ctttttctga ctattacacg aaagatcagg agttaattga 1320

tattggaaaa tatgcgaaag aaaaaggcgt aacattgaca gcagggtatg gacctcattt 1380

taatgaaagc ctgtcatctt cagaacccaa tacgcagaaa caagcaatca gtttttggaa 1440

agagacgctc cggaaattga agttaatgga tattcatatt gttggaggcg cactctatgg 1500

ttattggcct gtagattatt ccaaaccttt tgataagaaa agggatttag agaattccat 1560

taaaaacatg aaaattatta gtcagtatgc tgaagaatat gacataatga tggggatgga 1620

agttcttaac cgttttgaag gctatatgtt gaatacatgc gatgaagcgt tggcatacgt 1680

tgaagaggtt ggctcttcta atgttggtgt tatgttagat acttttcaca tgaatataga 1740

ggaagataat atagcagcag ccattcgtaa agcaggagat aggctttatc acttccatat 1800

aggagaagga aatcgtaaag taccaggaaa aggtatgctt ccttggaatg agataggaca 1860

ggcattgcga gatataaact accaacatgc agcagttatg gagccatttg taatgcaggg 1920

aggaacagta gggcatgaca ttaaaatatg gagagatatc attggaaact gttctgaagt 1980

tacattagat atggacgctc aaagtgcgtt gcactttgta aaacatgtat ttgaagtcta 2040

aggtacctct atctggtgcc ctaaacgggg gaatattaac gggcccaggg tggtcgcacc 2100

ttggttggta ggagtagcat gggatccatg aaacatggta tatactacgc atattgggaa 2160

caagaatggg aagctgatta caaatactat attgagaagg ttgcaaagct tggttttgat 2220

attctagaga ttgcagcttc accgctacct ttttacagtg acattcagat taatgagctc 2280

aaggcatgtg cccatggcaa tggaattaca cttacggtag gccatgggcc tagtgcagaa 2340

caaaacctgt cttctcccga ccccgatatt cgcaaaaatg ctaaagcttt ttataccgat 2400

ttactcaaac gactttacaa gctggatgta catttgatag gtggggcttt atattcttat 2460

tggccgatag attacacaaa gacaattgat aaaaaaggcg attgggaacg cagcgttgaa 2520

agtgttcgag aagttgctaa ggtggccgaa gcctgtggag tggatttctg cctagaggtt 2580

cttaatagat ttgagaatta tttaattaac acagcacaag agggtgtaga ttttgtaaaa 2640

caggttgacc ataacaatgt aaaggtaatg cttgatacct tccatatgaa tattgaggaa 2700

gatagtatcg gaggtgcaat caggactgcg ggctcttact tgggacattt acacactggc 2760

gaatgtaatc gtaaagttcc cggcagagga agaattccat gggtagaaat tggtgaggct 2820

cttgctgaca taggttataa cggtagtgtt gttatggaac cttttgttag aatgggcgga 2880

actgtcggat ctaatattaa ggtttggcgt gacattagta acggtgcaga tgagaaaatg 2940

ctggatagag aagcacaggc cgcacttgat ttctccagat atgtattaga atgtcataaa 3000

cactcctga 3009

<210> 11

<211> 2837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180

gaagtccagg aggacataca atgaaattcg gtacttactt cgcttactgg gaacagtctt 240

gggacaccga ctacctgaaa tacgttaaaa aagttgctga cctgggtttc gacgttctgg 300

aagttggtgc tgctggtatc gttaacatgt ctgacgacgc tctgtctgct ctgaaatctg 360

aagctgaaaa ctacgctatc accctgaccg ctggtatcgg tctgccgaaa cagttcgacg 420

tttcttctga aaacgaatct gttcgtcagg acggtatcgc tttcatgaaa aaaatcctgg 480

acgctctgca caaagctggt atcaaagcta tcggtggtac tatctactct tactggccgg 540

ttgactactc tgctccgatc aacaaaccgg ctgttcgtaa acagtctatc aaatctatgc 600

aggaactggc tgactacgct gctcagtacg acatcaccct gctggttgaa tctctgaacc 660

gtttcgaaca gttcctggtt aacgacgcta aagaagctgt tgactacgtt aaagctgtta 720

acaaaccgaa cgttaaagtt atgctggact ctttccacat gaacatcgaa gaagactacc 780

tgggtgacgc tatccgttac accggtgact acctgggtca cttccacatc ggtgaatgca 840

accgtaaagt tccgggtaaa ggtcacatgc cgtggtctga aatcggtcag gctctgcgtg 900

acatccagta cgacggttgc gttgttatgg aaccgttcgt tcgtccgggt ggtatcgttg 960

gttctgacat caaagtttgg cgtgacctgt ctgacaacgc tgacgaagct aaactggacg 1020

ctgacatcaa agaatctctg gaattcgtta aacagacctt cctgaaatct accccgtaaa 1080

tgaaatatgg tatttattac gcttattggg aaaaggaatg gaatggagat tacaaatatt 1140

atatagataa aatttcaaaa ttaggttttg atattctgga aatttcttgc ggcgcttttt 1200

ctgactatta cacgaaagat caggagttaa ttgatattgg aaaatatgcg aaagaaaaag 1260

gcgtaacatt gacagcaggg tatggacctc attttaatga aagcctgtca tcttcagaac 1320

ccaatacgca gaaacaagca atcagttttt ggaaagagac gctccggaaa ttgaagttaa 1380

tggatattca tattgttgga ggcgcactct atggttattg gcctgtagat tattccaaac 1440

cttttgataa gaaaagggat ttagagaatt ccattaaaaa catgaaaatt attagtcagt 1500

atgctgaaga atatgacata atgatgggga tggaagttct taaccgtttt gaaggctata 1560

tgttgaatac atgcgatgaa gcgttggcat acgttgaaga ggttggctct tctaatgttg 1620

gtgttatgtt agatactttt cacatgaata tagaggaaga taatatagca gcagccattc 1680

gtaaagcagg agataggctt tatcacttcc atataggaga aggaaatcgt aaagtaccag 1740

gaaaaggtat gcttccttgg aatgagatag gacaggcatt gcgagatata aactaccaac 1800

atgcagcagt tatggagcca tttgtaatgc agggaggaac agtagggcat gacattaaaa 1860

tatggagaga tatcattgga aactgttctg aagttacatt agatatggac gctcaaagtg 1920

cgttgcactt tgtaaaacat gtatttgaag tctaaatgaa acatggtata tactacgcat 1980

attgggaaca agaatgggaa gctgattaca aatactatat tgagaaggtt gcaaagcttg 2040

gttttgatat tctagagatt gcagcttcac cgctaccttt ttacagtgac attcagatta 2100

atgagctcaa ggcatgtgcc catggcaatg gaattacact tacggtaggc catgggccta 2160

gtgcagaaca aaacctgtct tctcccgacc ccgatattcg caaaaatgct aaagcttttt 2220

ataccgattt actcaaacga ctttacaagc tggatgtaca tttgataggt ggggctttat 2280

attcttattg gccgatagat tacacaaaga caattgataa aaaaggcgat tgggaacgca 2340

gcgttgaaag tgttcgagaa gttgctaagg tggccgaagc ctgtggagtg gatttctgcc 2400

tagaggttct taatagattt gagaattatt taattaacac agcacaagag ggtgtagatt 2460

ttgtaaaaca ggttgaccat aacaatgtaa aggtaatgct tgataccttc catatgaata 2520

ttgaggaaga tagtatcgga ggtgcaatca ggactgcggg ctcttacttg ggacatttac 2580

acactggcga atgtaatcgt aaagttcccg gcagaggaag aattccatgg gtagaaattg 2640

gtgaggctct tgctgacata ggttataacg gtagtgttgt tatggaacct tttgttagaa 2700

tgggcggaac tgtcggatct aatattaagg tttggcgtga cattagtaac ggtgcagatg 2760

agaaaatgct ggatagagaa gcacaggccg cacttgattt ctccagatat gtattagaat 2820

gtcataaaca ctcctga 2837

Claims

1.一种同工酶串联表达的基因片段的构建方法，其特征在于，将催化同一反应的2个以上的同工酶编码基因串联组合并由一个启动子启动，或将催化同一反应的2个以上的同工酶编码基因分别由单独的启动子启动并串联组合。

2.权利要求1所述的构建方法，其特征在于，同工酶编码基因为D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因，所述的启动子为tuf，H34或H36。

3.权利要求2所述构建方法，其特征在于，D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因编码氨基酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：7；b)SEQ ID NO：8；c)SEQ ID NO：9；d)与SEQ ID NO：7具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；e)与SEQ ID NO：8具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；f)与SEQ ID NO：9具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列。

4.一株重组菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.14524。

5.一株重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求1-3任一所述方法获得的基因片段。

6.权利要求5所述的重组菌株，其特征在于(a)或(b)；

(a)所述的基因片段构建于载体，载体转化宿主菌株；

(b)所述的基因片段整合至宿主菌株染色体上。

7.权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述的载体是pEC-XK99E或pXMJ19或pVWEx2，所述的宿主菌株为谷氨酸棒状杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌或酿酒酵母。

8.一种生产D-阿洛酮糖的方法，培养权利要求4-6任一所述重组菌株，利用重组菌株以D-果糖为底物进行催化。

9.权利要求8所述的生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，催化的反应体系为，D-果糖的浓度为1-700g/L、优选的D-果糖的浓度为500-700g/L、最优选的D-果糖的浓度为500g/L，所述反应体系中的催化剂为全细胞催化剂或粗酶液，全细胞催化剂为1-50g细胞干重/L，粗酶液为10-1000mg/L，优选的粗酶液为500mg/L，反应体系pH为7-9，优选的pH为7.5，所述反应体系还含有金属离子Co²⁺和/或Mn²⁺，所述的催化的反应条件为，温度为45-60℃，优选的温度为55℃，所述的催化的催化时间为1-10小时，优选的时间4-6小时。

10.一种生产D-阿洛酮糖的方法，培养重组菌株，利用重组菌株以D-果糖为底物进行催化，所述催化的反应体系为，D-果糖的浓度为1-700g/L，优选的D-果糖的浓度为500g/L，金属离子为Co²⁺和/或Mn²⁺，全细胞催化剂为1-50g细胞干重/L，粗酶液为10-1000mg/L，优选的粗酶液为500mg/L，反应体系pH为7-9，优选的pH为7.5，所述的催化的反应条件为，温度为45-60℃，优选的温度为55℃，所述重组菌株为将含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶编码基因的载体转化目标菌株得到的菌株，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因编码氨基酸序列是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)：a)SEQ ID NO：7；b)SEQ ID NO：8；c)SEQ ID NO：9；d)与SEQ IDNO：7具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；e)与SEQ IDNO：8具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列；f)与SEQ IDNO：9具有70％或以上，优选90％以上，更优选99％以上同源性的氨基酸序列。