CN115058408A

CN115058408A - 一种宏基因组来源的高比活耐酸性d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN115058408A
Application number: CN202210409285.9A
Authority: CN
Inventors: 王良; 董方玲; 刘中深; 李伟; 李木子
Original assignee: HEILONGJIANG VOCATIONAL COLLEGE OF BIOLOGY SCIENCE AND TECHNOLOGY
Current assignee: HEILONGJIANG VOCATIONAL COLLEGE OF BIOLOGY SCIENCE AND TECHNOLOGY
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2042-04-19
Also published as: CN115058408B

Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种瘤胃宏基因组来源的高比活耐酸性的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶RM‑DPEase及其编码基因和应用。所述的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶RM‑DPEase的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酶具有很好的热稳定性及酸碱稳定性，且具有很高的催化活性，对D‑果糖的比活为238 U/mg。利用表达该酶的大肠杆菌做全细胞催化剂，在最适条件下3小时可以催化500g/L的果糖得到142g/L的D‑阿洛酮糖，表明该D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶RM‑DPEase在D‑阿洛酮糖的工业化生产中具有很大的应用潜力。

Description

一种宏基因组来源的高比活耐酸性D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种宏基因组来源的高比活耐酸性D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和应用。

背景技术

蔗糖作为一种低成本、高甜度的甜味剂被广泛使用于食品行业中。但是随着人们对健康饮食的日渐重视，蔗糖的高热量、高吸收率、过量摄入容易诱发肥胖、龋齿、高脂血症、糖尿病等危害逐渐被人们认知。因此，急需开发一些既能满足人们对美好生活的向往同时又不会危害健康的低能量蔗糖代替品。

自然界中存在的天然稀有糖可代替蔗糖作为甜味剂，其中D-阿洛酮糖（D-psicose，D-allulose）就是一种较为完美的代糖。D-阿洛酮糖属于还原性的己酮糖，是D-果糖（D-fructose）在C-3的差向异构体。它的甜度约为蔗糖的70%，热量却仅为其的0.3%。在食用后，70%会随着尿液和粪便排出，少数（30%）在大肠被吸收，整个过程产生的能量几乎可以忽略不计。更难得是，D-阿洛酮糖具有多种保健功能，如可以减少碳水化合物的氧化反应和增强脂肪氧化效应而达到减重的效果；具有显著的降血脂的功效，对糖尿病患者和胰岛β-细胞功能缺陷的患者不会造成身体负担；具有清除自由基实现抗氧化和神经保护作用。此外，D-阿洛酮糖具有良好的食品加工特性，为代替传统甜味剂打下了良好的基础。

然而，作为一种稀有糖，D-阿洛酮糖在自然界含量极少，仅发现于特定的细菌和少量的植物中（鼠刺属植物）。D-阿洛酮糖的高效制备成为其大规模推广应用的瓶颈。采用化学合成法合成D-阿洛酮糖存在经济性差、环境污染严重、立体选择性不足等问题，因而不能成为其合成的主流方法。与化学合成法相比，酶催化法具有立体选择性好，反应条件温和，使用剂量低，无需有毒试剂，环境相容性好等优势，不仅有利于降低工业化生产成本，而且符合当下绿色环保的生产原则，是合成D-阿洛酮糖的趋势。

目前用于D-阿洛酮糖的酶法催化合成所用的酶是D-阿洛酮糖3-差向异构酶( D-psicose 3-epimerase，DPEase，EC 5. 3. 1. 3)。该酶是一种典型的己酮糖3-差向异构酶，可以催化D-果糖的C-3 位置的差向异构化制备D-阿洛酮糖。自1993年IZUMORI等从Pseudomonas sp. ST-24 中首次发现DPEase以来，到目前为止仅从Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970，Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA，C. bolteae ATCC BAA613，Arthrobacter globiformis M30，Dorea sp. CAG317，Treponema primitia ZAS-1，Clostridium cellulolyticum H10，Desmospora sp. 8437，Clostridium sp. BNL1100，Clostridium scindens 35704，Flavonifractor plautii等菌株以及热泉宏基因组中获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶并对其进行了性质研究。因此，仍需要进一步挖掘更多来源和更高效酶活的DPEase用于D-阿洛酮糖的工业化生产。

此外，除热泉宏基因组中所获得的DaeM外，所报道的DPEase均为从分离培养菌中获得的。研究表明在自然界中目前可培养的微生物不到其总数的1%。因此，这些未培养微生物中蕴藏着大量潜在的微生物基因资源。采用宏基因组学的方法已从多种不同的环境微生物宏基因组中获得了大量新的蛋白酶，脂肪酶，木聚糖酶，转氨酶等。因此，从特殊环境微生生物宏基因组也可能获得新的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

本发明从山羊瘤胃宏基因组中克隆了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因，命名为RM-DPEase。该基因编码的蛋白RM-DPEase与GenBank数据库中已知的序列最高一致性为60%，与已做过性质的DPEase蛋白一致性均小于46%，表明该基因是一个全新的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因。本发明还对该基因进行了重组表达，重组酶在中酸性条件下具有高活性，在pH 4.0-10.0的范围酶都能保持高度稳定。该酶的最适温度为60℃，在55℃的温度下具有很好的热稳定性。此外，该酶还具有很高的催化活性，对D-果糖的比活为238U/mg。因此，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase所具有的高活性、酸耐受性以及非金属离子依赖的特点，在D-阿洛酮糖的工业化生产中具有很大的应用潜力。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种宏基因组来源的高比活耐酸性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase。

本发明的另一目的是提供上述一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的编码基因。

本发明的再一目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供上述一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的制备方法。

本发明的再一目的提供上述一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种山羊瘤胃内含物宏基因组来源的高比活耐酸性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，上述一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase总共含291个氨基酸，经软件预测无信号肽，理论分子量32.75 kDa，理论等电点为5.17。

进一步的，上述一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适pH为7.0，在pH6.0时仍剩余75.3%的酶活，在pH 5.0时仍剩余46.8%的酶活；该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase在pH 4.0-10.0 之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性仍在86%以上，这说明该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase具有较好的pH稳定性。

进一步的，上述一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适温度为60℃，在40-75℃时剩余65%以上的酶活；在不存在底物的情况下，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase在55℃很稳定，处理一小时后酶活基本不变，60℃处理一小时后仍还剩余80%以上的酶活。

本发明还提供了一种编码上述的山羊瘤胃内含物宏基因组来源的高比活耐酸性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的基因，所述基因为RM-DPEase，其碱基序列如SEQID NO.2所示。

进一步的，上述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase为通过PCR的方法从山羊瘤胃内含物宏基因组中克隆得到；DNA全序列分析结果表明，D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase全长876bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，GC含量54.5 %，编码291个氨基酸组成的多肽(RM-DPEase)，无信号肽序列，包含一个D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化结构域；在GenBank中的比对结果表明，D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase与Blautiasp.(GenBank登录号：MBQ8306817.1) 的预测的sugar phosphate isomerase/epimerase蛋白序列最高一致性为60%，而且数据库中与其相似性大于50%以上的D-阿洛酮糖基因均未做过性质研究，表明RM-DPEase是一个新的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

本发明还提供了一种含有上述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase的重组载体，所述重组载体为pET28a-RM-DPEase；具体的，所述的重组载体为将本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间、使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接而获得；作为本发明的一个最优选的实施方案，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase基因插入到质粒pET28a(+)上的BamHI和HindIII限制性酶切位点之间，从而得到重组表达质粒pET28a-RM-DPEase。

本发明还提供了一种含有上述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase的重组菌株，所述重组菌株选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母的任意一种，优选为大肠杆菌，更优选为BL21(DE3)/ RM-DPEase。

本发明还提供了一种制备上述的山羊瘤胃内含物宏基因组来源的高比活耐酸性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，或得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的表达；

3）回收并纯化所表达的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase。

本发明还提供了上述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase、上述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase、上述的重组载体、上述的重组菌株在生产D-阿洛酮糖中的应用。优选为将重组菌株BL21/RM-DPEase诱导所获得的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，在pH7.0， 60℃的条件下以500 g/L的果糖为底物催化，可得到D-阿洛酮糖142 g/L。

本发明的显著优点在于：

本发明提供了一种性质优良的、适合于在食品和制药工业中应用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase。该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase具有很好的pH耐受性，在pH4.0～10.0非常稳定，在中酸性条件下具有高活性，可以避免在碱性条件反应过程中出现美拉德反应。此外，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase具有很好的热稳定性，在55℃条件下1h后酶活基本不变，可以长时间维持活性，便于使用、运输和储存。此外，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase是一个非金属离子依赖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，可以减少应用过程中金属离子使用和分离成本。此外，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase具有很高的催化效率，对果糖的比活达到238U/mg，可以降低实际使用过程中的用量，节约成本。利用表达该D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的大肠杆菌作全细胞催化剂，在最适条件下，可快速将500g/L的D-果糖催化生成142g/L的D-阿洛酮糖。综上所述，本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase具有耐酸性、非金属离子依赖和高活性的特点，在D-阿洛酮糖的工业生产中具有很大的应用潜力。

附图说明

图1：山羊瘤胃内含物宏基因组DNA的提取。其中，泳道1：DNA Marker；泳道2：提取的宏基因组DNA。

图2：RM-DPEase基因的扩增。其中，泳道1：DNA Marker；泳道2：扩增得到的目的基因。

图3：在大肠杆菌中表达的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的SDS-PAGE分析。其中，泳道M：蛋白质Marker；泳道1：未诱导的含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因载体pET28a-RM-DPEase的大肠杆菌破碎离心上清液；泳道2：诱导的含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因载体pET28a-RM-DPEase的大肠杆菌破碎离心上清液；泳道3：通过镍柱纯化的达到电泳纯的重组RM-DPEase蛋白。

图4：重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase对D-果糖转化的产物液相分析。A：阿洛酮糖标准品；B：果糖标准品；C：RM-DPEase催化后的反应液。

图5：D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适pH。

图6：D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的pH稳定性。

图7：D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适温度。

图8：D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的热稳定性。

图9：含有RM-DPEase重组大肠杆菌细胞浓度对阿洛酮糖产量的影响。

图10：不同D-果糖浓度对D-阿洛酮糖产量与转化率的影响。

图11：不同处理温度和时间对D-阿洛酮糖产量的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明涉及的试验材料和试剂如下：

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株Escherichia coli BL21(DE3) 均购自于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA聚合酶、dNTPs 和PMD18-T载体均购于日本TaKaRa公司；DNA纯化及质粒提取试剂盒购于美国OMEGA公司；D-果糖购于美国Sigma公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)均为英国OXOID公司产品，其余试剂均为国产分析纯。

3、培养基：

（1）LB培养基（g/L）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0。

（2）固体LB培养基（g/L）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂15.0，pH7.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase的克隆

采用液氮研磨加化学试剂裂解的方法，从波尔山羊瘤胃内含物提取获得瘤胃宏基因组（图1），所获得的宏基因组DNA远大于10kb，满足宏基因组测序的要求。将所得到的宏基因组DNA经纯化后送于北京诺禾致源进行测序，经序列分析注释，从中获得一个D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因序列，将其命名为Rumen metagenomic DPEase，简写为RM- DPEase。根据该D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因序列设计合成引物RM-DPEase-F和RM-DPEase-R（下划线为限制性酶切位点）：

RM-DPEase-F：5’-CGCGGATCCATGCAATTCGGAATTTACTATGCTTACTG-3’，

RM-DPEase-R：5’-CGCAAGCTTGGCGGAAAACGTTTCCTTTAAAAACG-3’。

以上述的瘤胃宏基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应参数为：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，53℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30个循环；72℃保温5 min。得到一约900bp片段（图2），并在基因5’和3’端分别引入了BamHI和HindIII酶切位点。将该片段回收后与PMD 18-T载体相连送到上海生工公司测序。

由此得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase的碱基序列全长876bp（SEQID NO.2），起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，GC含量54.5 %，编码291个氨基酸组成的多肽RM-DPEase（SEQ ID NO.1），无信号肽序列，包含一个D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化结构域；在GenBank中的比对结果表明，D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase与Blautiasp.(GenBank登录号：MBQ8306817.1) 的预测的sugar phosphate isomerase/epimerase蛋白序列最高一致性为60%，而且数据库中与其相似性大于50%以上的D-阿洛酮糖基因均未做过性质研究。

实施例2 D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的制备

将测序正确的含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase的PMD 18-T质粒采用BamHI和HindIII进行双酶切回收基因片段，同时将表达载体pET28a也利用BamHI和HindIII进行双酶切回收载体片段。将上述酶切后RM-DPEase基因片段和载体片段采用T4DNA连接酶进行连接得到含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因RM-DPEase的重组质粒pET28a-RM- DPEASE，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/ RM-DPEASE。

取含有重组质粒pET28a-RM-DPEase的BL21菌株，接种于20 mL LB液体培养基（含50 µg/mL的卡那霉素）中，37℃培养过夜。将培养好的菌液按2%（v/v）的接种量接种于200mL LB液体培养基（含50 µg/mL的卡那霉素）中，37℃、220 rpm振荡培养约2~3 h（OD₆₀₀达到0.6）后加入终浓度0.2mmol/L的诱导剂IPTG，25℃ 220 rpm震荡培养126h。培养结束后，12000 rpm离心5 min去上清，用20mMTris-HCl将菌体重新悬浮后超声破碎10min，最后12000rpm离心5min去除细胞碎片，收集上清液。采用亲和层析对目的蛋白进行纯化，将破碎上清液加入镍柱中，采用20-500 mM的咪唑洗脱液进行洗脱，通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和纯度。

SDS-PAGE结果（图3）表明，D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase在大肠杆菌中得到了表达；所表达的D-阿洛酮糖3-差向异构酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90%以上。

实施例3 D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的性质测定

1、D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的活性分析

D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的活性测定：在pH 7.0（0.1 M phosphatebuffer缓冲液），60℃条件下，500 μL的反应体系包括50 μL酶液（0.015 mg/mL），450μL底物D-果糖（100 mM），反应10 min，结束后煮沸终止反应。反应后的溶液中D-果糖和D-阿洛酮糖的含量采用HPLC的方法进行检测：依利特Supersil NH2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相：乙腈-水（70:30，V/V），柱温35℃，进样量10μl，检测器：RI示差折光检测器。D-阿洛酮糖和D-果糖的出峰时间分别为5.7min和6.4min（图4）。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟生成1 μmol D-阿洛酮糖的所需的酶量。

2、重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适pH和pH稳定性的测定

最适pH 测定：将纯化好的重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase在0.1MpH3.0–11.0 的缓冲液中于37℃下进行酶促反应。酶的pH 稳定性测定：将酶液置于0.1M pH3.0–11.0 的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH 7.0 及60℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液分别为：0.1 M phosphate buffer（pH 3.0–7.0），0.1 M Tris-HClbuffer（pH 7.0–9.0）和0.1M glycine-NaOH（pH 9.0–11.0）。以D-果糖为底物，反应10min，测定RM-DPEase的活力。结果表明：D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适pH为7.0，在pH 6.0剩余80.0%的酶活(图5)；D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase在pH 4.0-10.0 之间均很稳定，在此pH范围内处理 60min后剩余酶活性在83% 以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性（图6）。

3、重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的最适温度及热稳定性测定

酶的最适温度的测定：在pH 7.0的缓冲液中，于20–90℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于55℃、60℃和65℃中处理0–60min后，在pH7.0及60℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以D-果糖为底物，反应10min。酶反应最适温度测定结果（图7）表明，D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明（图8），D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase在55℃时稳定性较好，处理60min之后酶活基本不变；60℃下保温60 min，剩余酶活性为83%。

4、重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的V _max和K_m的测定

以不同浓度的D-果糖（10mM，20mM，50mM，80mM，100mM，200mM，500mM，1000mM）为底物，在最适条件（pH7.0，60℃）下测定酶活性，计算相应的反应速度，利用米氏方程双倒数法求得K_m值及V _max。结果表明：D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的V _max为288.02±6.55 μmol/min/mg，K_m为129.16±1.21 mM/mL。

5、不同金属离子对重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase酶活的影响测定

在酶促反应体系中加入1mM的金属离子，研究其对酶活性的影响。在60℃及pH 7.0条件下，以D-果糖为底物测定酶活性。结果表明：Co²⁺和Mn²⁺对该酶活性有轻微的促进作用，Cu²⁺和Zn²⁺对该酶活具有很强的抑制性，Ca²⁺和Fe³⁺对该酶活有一定的抑制，Ni²⁺和Mg²⁺对该酶活性影响甚微。结果表明，RM-DPEase是一个金属离子非依赖型的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，从而在生产过程中不用添加金属离子，简化后续的产物分离程序，最终降低生产成本。

表1 金属离子(1mM)对D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase活性的影响

实施例4 D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的应用

采用上述的重组大肠杆菌菌株BL21/ RM-DPEASE作为全细胞催化剂催化D-果糖生成D-阿洛酮糖不仅可以省去酶的分离纯化的步骤，反应完成后的大肠杆菌可以通过过滤或离心回收并可重复利用，从而降低酶的使用成本。将重组大肠杆菌BL21/ RM-DPEASE接种于含50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30℃，200 rpm培养，待培养液OD₆₀₀约为0.6的时候向其中加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导培养8小时，随后10000 rpm离心5 min，弃上清，用PBS将收集到的菌体洗三次后备用。以D-果糖为底物，在pH 7.0的5 mL反应体系中，研究细胞浓度，D-果糖浓度和温度对D-阿洛酮糖产量以及转化率的影响。其中，所述的5 mL反应体系以0.1 M pH7.0的phosphate buffer作为缓冲液，包含0.5mL诱导后的重组大肠杆菌细胞液（1-20 g/L）和4.5mL底物D-果糖溶液（100-700 g/L）。

1、诱导后的重组大肠杆菌浓度对D-阿洛酮糖产量的影响

在60℃，pH 7.0的条件下，细胞浓度范围为1-20 g/L确定重组全细胞反应催化700g/L的D-果糖转化为D-阿洛酮糖的最佳浓度。结果如图9可知，D-洛酮糖的产量随着重组大肠杆菌细胞浓度的增大而增加，当细胞浓度达到8 g/L时，D-阿洛酮糖的产量趋于稳定。

2、D-果糖浓度对转化率与D-阿洛酮糖产量的影响

在60℃，pH 7.0，细胞浓度为8 g/L的条件下，研究重组菌将浓度范围为100 g/L-700 g/L的D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率和产量。结果如图10所示，随着D-果糖浓度的增加，D-阿洛酮糖的产量增加，而转化率降低。D-果糖浓度为100 g/L时，转化率为30％，而当D-果糖浓度增加至700 g/L时，转化率降至24.3％。在本研究中，综合考虑到D-阿洛酮糖的经济价值和转化率，500 g/L果糖可被选择为工业化实际生产的底物浓度。

3、不同温度对D-阿洛酮糖产量的影响

以500 g/L的D-果糖为底物，pH 7.0，细胞浓度为8 g/L的条件下，研究55℃，60℃和65℃下重组大肠杆菌的催化效率。结果如图11所示，在催化0.5 h后，随着反应时间延长，D-阿洛酮糖含量增加。催化3h后，D-阿洛酮糖含量达到平衡。60℃下的催化效率最高，65℃次之，55℃下的催化效率最低。在65℃，60℃和55℃下催化4 h后，分别获得了142，129和115g/L的D-阿洛酮糖。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龙江生物科技职业学院

<120> 一种宏基因组来源的高比活耐酸性D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和

应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gln Phe Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Ala Asp Lys Trp Gly Val

1 5 10 15

Asp Tyr Leu Pro Phe Val Asp Lys Val Ala Asp Leu Gly Tyr Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Ile Ser Leu Ala Thr Val Arg Glu Met Thr Asp Ala Gln Ile

35 40 45

Asp Ala Met Asn Glu Arg Val Ala Ala Arg Gly Ile Ser Leu Ser Gly

50 55 60

Gly Tyr Gly Pro Lys Glu Ser Gln Asn Leu Ala Ser Pro Asp Glu Lys

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Gly Phe Arg Phe Trp Glu Glu Thr Phe Arg Val Met

85 90 95

Gln Lys Leu Gly Ile Thr Asn Ala Val Gly Gly Leu Tyr Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Val Asp Phe Ala Lys Pro Phe Asp Lys Thr Ala Asp Trp Glu Arg

115 120 125

Ser Val Asn Asn Met Lys Lys Leu Ala Asp Met Ala Ala Gly Phe Gly

130 135 140

Val Thr Thr Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg His Glu Gly Tyr Met

145 150 155 160

Ile Asn Thr Ala Lys Glu Ala Val Ala Tyr Cys Lys Ala Val Asp Lys

165 170 175

Pro Asn Val Lys Val His Ile Asp Thr Tyr His Met Leu Leu Glu Glu

180 185 190

Asp Ser Phe Thr Glu Ala Ile His Thr Ala Gly Asp Leu Ile Gly His

195 200 205

Val His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Leu Pro Gly Gln Gly His Ile

210 215 220

Thr Asn Trp Lys Glu Ile Ala Lys Ala Leu Lys Asp Val His Tyr Asp

225 230 235 240

Gly Arg Ile Val Ala Glu Pro Phe Val Ile His Gly Gly Glu Val Gly

245 250 255

Arg Asp Val Arg Leu Trp Arg Asp Leu Leu Glu Asp Gln Ser Glu Gln

260 265 270

Gln Leu Asp Lys Asp Ala Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Lys Glu Thr

275 280 285

Phe Ser Ala

290

<210> 2

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcaattcg gaatttacta tgcttactgg gcagacaaat ggggtgtcga ctatttaccg 60

ttcgtcgaca aggtggcgga cctgggttat gacatcctgg aaatttctct cgcaaccgtc 120

cgggagatga cggacgcgca gattgatgcc atgaacgaaa gggtcgcggc acgcggcatc 180

tccttaagcg gcggctacgg tccgaaggaa tcccagaact tagcttcccc ggatgaaaaa 240

accgtctccg aaggattccg tttctgggaa gaaaccttcc gtgtcatgca aaaactcggc 300

atcaccaatg ccgtcggcgg actctacagt tactggccgg tcgactttgc caagcccttt 360

gacaaaactg ccgactggga acgcagtgtg aacaatatga agaagctggc cgacatggcc 420

gccggattcg gcgtgaccac cctcggcatg gaagtgttga accgccacga gggatacatg 480

atcaacaccg caaaagaagc ggttgcttac tgcaaggcag tggacaagcc caatgtcaag 540

gtgcatatcg acacctatca catgctgctg gaagaggatt cctttacgga agccatccac 600

acggcaggtg acctgatcgg gcatgtacac gtcggcgaaa acaaccgcag gctccccggc 660

cagggacata tcacgaactg gaaggaaatc gctaaggcct taaaggatgt acactatgac 720

ggcagaatcg tcgccgagcc gttcgtcatt cacggcggtg aagtcggcag ggacgtccgg 780

ctctggcgtg atcttctgga ggaccagtca gagcagcagc tcgacaaaga tgcgaaagca 840

tccctcgcgt ttttaaagga aacgttttcc gcctaa 876

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgcaattcgg aatttactat gcttactg 38

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcaagcttg gcggaaaacg tttcctttaa aaacg 35

Claims

1.一种宏基因组来源的高比活耐酸性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的基因，其特征在于：所述基因为RM-DPEase，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求2所述的基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pET28a-RM-DPEase。

5.一种含有权利要求2所述的基因的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母的任意一种。

7.一种制备如权利要求1所述的高比活耐酸性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求3所述的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase表达；

3）回收并纯化所表达的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase。

8.权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RM-DPEase、权利要求2所述的基因、权利要求3~4任意一项所述的重组载体、权利要求5~6任意一项所述的重组菌株在生产D-阿洛酮糖中的应用。