CN114561417B - 用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及工业生物技术领域，具体涉及一种用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其在阿洛酮糖制备中的应用。本发明在产乙酸量低的菌株中，通过表达载体向宿主细胞导入D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，实现高效表达。重组菌株乙酸积累量低，比较容易进行放大培养，非常适合大规模制备DPE蛋白，应用于阿洛酮糖生物制备体系中，同时该菌株避免培养过程中添加抗生素，更加安全。

Description

用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及工业生物技术领域，具体涉及一种用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其在阿洛酮糖制备中的应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是果糖的差向异构体，其甜度为蔗糖的70%，然而能量值仅为0.4kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3%，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；D-阿洛酮糖被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道α-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积，在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面也有很高的医疗价值。美国食品及药品管理局(FDA)于2011年正式批准D-阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，因此，D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖C3位羟基的差向异构，采用DPE催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖是非常高效的D-阿洛酮糖制备方法。采用微生物表达DPE酶，往往采用质粒表达形式，为了维持质粒的稳定性，发酵液中需要添加抗生素，不利于食品安全；如专利CN104160023B中培养表达DPE的谷氨酸棒杆菌需要添加10微克/毫升的卡那霉素，对食品和环境安全构成一定威胁。采用染色体整合形式表达DPE酶，受拷贝数限制，难以提升酶的表达水平，因此如何实现DPE酶在宿主菌株中安全高水平表达是迫切需要解决的问题。另外，DPE酶大多是中性偏碱酶，而谷氨酸棒杆菌高密度发酵过程中会积累大量乙酸，对DPE酶的酶活产生一定不利影响。

谷氨酸棒杆菌被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株，被广泛应用于谷氨酸等氨基酸大规模发酵制备，该宿主菌株具有遗传背景清晰，工业应用潜力巨大等优势，目前也有报道将其应用于制备酶制剂，对于DPE的工业化制备具有广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级谷氨酸棒杆菌菌株，所述菌株D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达水平高，且适合高密度发酵，培养过程中无需添加抗生素，符合食品安全规定。为达此目的，本发明采用以下技术方案。

本发明首先提供一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株的构建方法，包括如下步骤：

将出发菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中敲除其内源丙氨酸消旋酶基因，构建D-丙氨酸缺陷型谷氨酸棒杆菌重组菌株；

通过向宿主细胞导入D-丙氨酸消旋酶表达元件进行回补，作为筛选标记；

同时向宿主细胞导入D-阿洛酮糖3-差向异构酶以进行过表达。

优选地，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

另外优选地，控制所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达是SEQ ID No.2所示的tuf启动子。

还优选地，出发菌株谷氨酸棒杆菌是低乙酸合成谷氨酸棒杆菌，具体是谷氨酸棒杆菌M19。

第二方面，本发明提供上述方法获得的高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株。更具体地，所述获得的谷氨酸棒杆菌株（Corynebacterium glutamicum）Cg1-C3，已于2021年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年10月22日，（地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNo.23642。

在该具体的菌株中，其原始出发菌株谷氨酸棒杆菌M19筛选自土壤样品，其特点是该菌株高密度发酵过程中产乙酸能力较弱，明显低于常见谷氨酸棒杆菌菌株，如C. glutamicum 13032。本发明通过基因改造进一步构建获得本发明的高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株的构建方法，其中敲除了宿主菌株的D-丙氨酸消旋酶，并通过表达载体向宿主细胞导入D-丙氨酸消旋酶表达元件进行回补，代替卡那霉素作为筛选标记，使得宿主细胞不含有抗生素基因，培养时不需要加入抗生素，是一种食品级安全的宿主细胞；同时通过表达载体向宿主细胞导入D-阿洛酮糖3-差向异构酶（SEQ ID No.1）以及控制其表达的tuf启动子（SEQ ID No.2），实现了宿主细胞对该酶的高效表达。

第三方面，本发明提供利用第一方面所述的高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用。

具体的实施方式中，将所述食品安全级菌株在培养基中发酵，使D-阿洛酮糖3-差向异构酶积累于菌体细胞内，通过收集细胞获得具有D-阿洛酮糖转化能力的谷氨酸棒杆菌菌体，进一步破碎可获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

在一个具体实施方式中，培养基的成分为(NH₄)₂SO₄(5g/L),urea (5g/L), KH₂PO₄(1g/L), K₂HPO₄ (1g/L), MgSO₄∙7H₂O (0.25g/L), CaCl₂ (10mg/L), FeSO₄∙7H₂O (10mg/L), MnSO₄∙H₂O (0.1mg/L), ZnSO₄∙7H₂O (1mg/L), CuSO₄∙5H₂O (0.2mg/L), NiCl₂∙6H₂O(20μg/L), 生物素 (0.4mg/L),)，培养基中添加初始葡萄糖（20g/L），采用流加策略补充碳源葡萄糖，氨水调节pH，通气和转速联动，控制发酵罐中溶氧不低于20%，发酵液残糖控制1%以下，发酵48h。

第四方面，第一方面所述的食品安全级菌株在制备D-阿洛酮糖中的应用。优选地，其以果糖为底物，以所述菌株的全细胞或破碎液为催化剂进行转化反应获得的D-阿洛酮糖。更优选地，果糖浓度为50-75%，催化反应的条件为60℃、200rpm水浴中进行。

本发明构建获得表达DPE的重组谷氨酸棒杆菌，该菌株避免培养过程中添加抗生素，更加安全；同时重组菌株乙酸积累量低，比较容易进行放大培养，非常适合大规模制备DPE蛋白，应用于阿洛酮糖生物制备体系中。

附图说明

图1重组菌株制备阿洛酮糖3-差向异构酶。

图2 酶法催化D-果糖生成D-阿洛酮糖过程曲线。

图3全细胞催化制备d-阿洛酮糖过程曲线。

本发明的谷氨酸棒杆菌株（Corynebacterium glutamicum）Cg1-C3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年10月22日，保藏编号为CGMCC No.23642。

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物和基因由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

本发明的“细胞干重”的含义是，发酵培养获得的细胞经冷冻干燥后，称量计算所得到的细胞重量。

本发明的“粗酶液”的含义是，发酵培养所获得的细胞，收集后，经超声破碎，离心所得到的上清液。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、低乙酸合成谷氨酸棒杆菌菌株的获取

发酵培养基中乙酸浓度严重影响蛋白表达，因此获得低乙酸合成的菌株，对于蛋白表达至关重要。针对当前广泛采用谷氨酸棒杆菌菌株13032和已专利公开的谷氨酸棒杆菌M19（CN202110967055.X），分别测试其乙酸合成。具体操作如下：

1、谷氨酸棒杆菌种子液的培养

选用100mL BHI培养基（脑心浸粉37 g/L)，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌M19和13032进行培养24h。

2、配制发酵培养基CGXII，其配方为：(NH₄)₂SO₄(5g/L)，urea (5g/L)，KH₂PO₄ (1g/L)，K₂HPO₄ (1g/L)，MgSO₄∙7H₂O (0.25g/L)，CaCl₂ (10mg/L)，FeSO₄∙7H₂O (10mg/L)， MnSO₄∙H₂O (0.1mg/L)，ZnSO₄∙7H₂O (1mg/L)，CuSO₄∙5H₂O (0.2mg/L)，NiCl₂∙6H₂O (20μg/L)， 生物素 (0.4mg/L)，培养基中添加初始葡萄糖（20 g/L），发酵48h。

3、高效液相色谱检测乙酸生成量。发现谷氨酸棒菌株M19合成乙酸量为0.8g/L,而谷氨酸棒杆菌13032乙酸生成量达到3.6 g/L,菌株谷氨酸棒菌株M19的乙酸的能力明显低于常见谷氨酸棒杆菌菌株13032。由于DPE为中性偏碱酶，其酶活在乙酸环境中较低，因此菌株M19更有助于D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）维持活性。

实施例2、构建丙氨酸缺陷型谷氨酸棒杆菌重组菌株

通过敲除谷氨酸棒杆菌M19中的丙氨酸消旋酶基因，构建D-丙氨酸缺陷型谷氨酸棒杆菌重组菌株，构建过程包括以下步骤：

1、构建丙氨酸消旋酶基因（alr）敲除载体pK18alr

1.1根据Genbank谷氨酸棒杆菌lar基因（Genbank号：1018592）的上游区域alr-up（863bp）和alr基因下游区域alr-down（953bp）的核苷酸序列设计基因敲除引物，引物序列如下：

Delalr-1: GACCGGAATTCTAGCTTCAGCGTCTGGTTCGGAGA

Delalr-2: CTGCTCCTTAAACGTATTCACTTAATCCAGGTCAATTTTGGTGGTCA

Delalr-3: TGACCACCAAAATTGACCTGGATTAAGTGAATACGTTTAAGGAGCAG

Delalr-4: GACTCAAGCTTGGATGACGATGTCGGTATTTGCA

1.2以谷氨酸棒杆菌M19的基因组DNA为模板，扩增alr-up和alr-down同源臂片段，并采用融合PCR方法获得融合片段up-down。

1.3采用酶切连接方法将融合片段up-down构建至敲除载体pK18mobsacB中，得到丙氨酸消旋酶基因（tpi）敲除载体，命名为pK18alr。

2、获得无丙氨酸消旋酶活性的重组谷氨酸棒杆菌

向谷氨酸棒杆菌M19中导入敲除载体pK18alr，得到无丙氨酸消旋酶活性的重组谷氨酸棒杆菌，具体过程如下：

2.1制备谷氨酸棒杆菌电转感受态细胞，将基因敲除载体pK18alr，将菌液涂布于含有卡那抗生素的固体培养基中，放置于30℃培养箱中培养36h。

2.2挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，进行菌落PCR验证，获取阳性克隆

2.3挑取阳性克隆，划线于含有10％蔗糖的LB平板上，放置30℃培养箱中培养24h，此步骤的目的是在于通过蔗糖致死性，筛选卡那缺失克隆。

2.4从蔗糖平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证，验证丙氨酸消旋酶基因是否敲除。

2.5保存经PCR验证正确的菌株，即无丙氨酸消旋酶活性的重组谷氨酸棒杆菌。

实施例3、构建携带丙氨酸消旋酶和DPE基因的重组质粒

1、构建携带丙氨酸消旋酶重组质粒

根据数据库中谷氨酸棒杆菌基因组中丙氨酸消旋酶基因alr序列设计引物，扩增含有启动子，丙氨酸消旋酶和终止子的序列“Promoter-alr-Terminator”，采用酶切连接方法构建至重组表达载体pEC-XK99E中，获得重组表达载体pEC-alr。所采用的引物序列为：

ECalr-1：GATCCCCCGGGCCTTTGTGGTCTGGCATGAAG，

EC-alr-2：AACGCGGATCCCAAAATCACCACATCGCCAGC。

2、构建同时携带丙氨酸消旋酶和DPE基因重组质粒

PCR扩增RDPE基因（其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示），扩增谷氨酸棒杆菌来源的tuf启动子（其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示），采用融合PCR方法将二者融合获得片段“tuf-RDPE”,随后将融合片段采用酶切连接策略，构建至载体pEC-alr中，得到重组质粒pEC-alr-dpe。

实施例4、表达DPE的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建

向无丙氨酸消旋酶活性的重组谷氨酸棒杆菌中导入携带丙氨酸消旋酶基因和DPE基因的载体pEC-alr-dpe，得到表达DPE的谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-C3，过程如下：

1、制备谷氨酸棒杆菌电转感受态细胞，将重组载体pEC-alr-dpe电转化进入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，46℃热激6min，随后放入30℃摇床中复苏45min，将菌液涂布于含有卡那抗生素（25ug/mL）的固体培养基BHIS（脑心浸粉：51g/L，山梨醇：91g/L）中，放置于30℃培养箱中培养36h。

2、挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，进行菌落PCR验证，获得阳性克隆。

3、保存经PCR验证正确的菌株，命名为Cgl-C3。该重组菌株已于2021年10月22日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号（邮政编码100101）的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23642。

实施例5、表达DPE的谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养

选用100mL BHI培养基（脑心浸粉37 g/L,卡那霉素 25 ng/mL)，葡萄糖20g/L，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgl-C3和13032-DPE进行培养 48h，4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用ddH₂O浓缩菌液至5mL，超声破碎制备成粗酶液。

2、酶活性测定

为了测定粗酶酶活性，建立如下反应体系（1mL）：D-果糖：1%，粗酶：10 ul，MnCl₂：1mM；60℃，反应10min，煮沸终止反应，并进行液相色谱检测。

实验结果显示重组菌株C.glutamicum13032-DPE获得的酶活性为6100 U/L，重组菌株Cgl-C3获得的酶活性为9200 U/L,相比提升近50%。

进一步测定了二者发酵终止时上清中乙酸含量，发现重组菌株Cgl-C3乙酸产量明显低于重组菌株13032-DPE，发现重组菌株Cgl-C3在丰富培养基BHI中乙酸产量为0.5g/L,而重组菌株13032-DPE在丰富培养基BHI中乙酸浓度达到2.6g/L，由于发酵过程中培养基中乙酸含量会显著影响蛋白表达，尤其不适合pH中性偏碱酶的DPE的表达。因此，重组菌株Cgl-C3更加适合表达DPE蛋白。

实施例6、高密度发酵制备DPE

1、采用如实施例5所示方法制备5L发酵种子液，配制发酵培养基CGXII，其配方为：(NH₄)₂SO₄(5g/L)，urea (5g/L)，KH₂PO₄ (1g/L)，K₂HPO₄ (1g/L)，MgSO₄∙7H₂O (0.25g/L)，CaCl₂ (10mg/L)，FeSO₄∙7H₂O (10mg/L)，MnSO₄∙H₂O (0.1mg/L),，ZnSO₄∙7H₂O (1mg/L)，CuSO₄∙5H₂O (0.2mg/L)，NiCl₂∙6H₂O (20μg/L)，生物素 (0.4mg/L)，培养基中添加初始葡萄糖（20g/L），采用流加策略补充碳源葡萄糖，氨水调节pH，通气和转速联动，控制发酵罐中溶氧不低于20%，发酵液残糖控制1%以下，发酵48h。

2、发酵结束时，测定菌体浓度和粗酶活性。采用高密度发酵制备DPE时，如图1所示，随着发酵时间的延长，菌体浓度也不断积累，当发酵48h时，菌体浓度OD600达到80，DPE酶活性达到80000 U/L以上，因此，DPE酶活性与菌体浓度呈正相关。

实施例7、利用破碎粗酶液制备D-阿洛酮糖

建立反应体系75%果糖或者50%果糖，1mM MnCl₂，1mL实施例5中所述粗酶液，加入水补齐至50mL,在60℃、200rpm水浴摇床中反应，分别于2、4、6、8h取1mL反应液煮沸10min灭酶，稀释适当倍数后，HPLC检测D-果糖转化率，计算D-阿洛酮糖生成量。图2表明，反应6h均可达到平衡，底物D-果糖的转化率为30±2％。

实施例8、全细胞催化制备D-阿洛酮糖

如实施例5所示，获得发酵液细胞，离心后，用水重悬，获得重选后的细胞，建立如下反应体系：D-果糖：75%，菌体浓度OD600=20，MnCl₂：1mM； 控制温度60℃，每间隔1h取样，并进行高效液相色谱分析检测。

由图3可知，重组菌株进行全细胞反应，反应8h均达到平衡，转化率为30±2%。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 1

ATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATTGGGAAAAGGAATGGAATGGAGATTACAAATATTATATAGATAAAATTTCAAAATTAGGTTTTGATATTCTGGAAATTTCTTGCGGCGCTTTTTCTGACTATTACACGAAAGATCAGGAGTTAATTGATATTGGAAAATATGCGAAAGAAAAAGGCGTAACATTGACAGCAGGGTATGGACCTCATTTTAATGAAAGCCTGTCATCTTCAGAACCCAATACGCAGAAACAAGCAATCAGTTTTTGGAAAGAGACGCTCCGGAAATTGAAGTTAATGGATATTCATATTGTTGGAGGCGCACTCTATGGTTATTGGCCTGTAGATTATTCCAAACCTTTTGATAAGAAAAGGGATTTAGAGAATTCCATTAAAAACATGAAAATTATTAGTCAGTATGCTGAAGAATATGACATAATGATGGGGATGGAAGTTCTTAACCGTTTTGAAGGCTATATGTTGAATACATGCGATGAAGCGTTGGCATACGTTGAAGAGGTTGGCTCTTCTAATGTTGGTGTTATGTTAGATACTTTTCACATGAATATAGAGGAAGATAATATAGCAGCAGCCATTCGTAAAGCAGGAGATAGGCTTTATCACTTCCATATAGGAGAAGGAAATCGTAAAGTACCAGGAAAAGGTATGCTTCCTTGGAATGAGATAGGACAGGCATTGCGAGATATAAACTACCAACATGCAGCAGTTATGGAGCCATTTGTAATGCAGGGAGGAACAGTAGGGCATGACATTAAAATATGGAGAGATATCATTGGAAACTGTTCTGAAGTTACATTAGATATGGACGCTCAAAGTGCGTTGCACTTTGTAAAACATGTATTTGAAGTCTAA 876

<210> 2

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<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 2

TGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGACATACA 200

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

GACCGGAATTCTAGCTTCAGCGTCTGGTTCGGAGA 35

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<212> DNA

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CTGCTCCTTAAACGTATTCACTTAATCCAGGTCAATTTTGGTGGTCA 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

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TGACCACCAAAATTGACCTGGATTAAGTGAATACGTTTAAGGAGCAG 47

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GACTCAAGCTTGGATGACGATGTCGGTATTTGCA 34

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<212> DNA

<213> 人工序列

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GATCCCCCGGGCCTTTGTGGTCTGGCATGAAG 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

AACGCGGATCCCAAAATCACCACATCGCCAGC 32

Claims (8)

1.一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株的构建方法，其特征在于，

将出发菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中敲除其内源丙氨酸消旋酶基因，构建D-丙氨酸缺陷型谷氨酸棒杆菌重组菌株；

通过向宿主细胞导入D-丙氨酸消旋酶表达元件进行回补，作为筛选标记；

同时向宿主细胞导入D-阿洛酮糖3-差向异构酶以进行过表达；

其中，所述出发菌株谷氨酸棒杆菌是保藏编号为CGMCC No.22679的谷氨酸棒杆菌M19；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，控制所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达是SEQ ID No.2所示的tuf启动子。

3.如权利要求1或2所述构建方法获得的食品安全级菌株。

4.如权利要求3所述的食品安全级菌株，其特征在于，已于2021年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23642。

5.如权利要求3所述的食品安全级菌株在生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述食品安全级菌株在培养基中发酵，使D-阿洛酮糖3-差向异构酶积累于菌体细胞内，通过收集细胞获得具有D-阿洛酮糖转化能力的谷氨酸棒杆菌菌体，进一步破碎获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

7.如权利要求3所述的食品安全级菌株在制备D-阿洛酮糖中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，其以果糖为底物，以所述食品安全级菌株的全细胞或破碎液为催化剂进行转化反应获得的D-阿洛酮糖。

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