CN103834679B - 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统 - Google Patents

一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统 Download PDF

Info

Publication number
CN103834679B
CN103834679B CN201410057876.XA CN201410057876A CN103834679B CN 103834679 B CN103834679 B CN 103834679B CN 201410057876 A CN201410057876 A CN 201410057876A CN 103834679 B CN103834679 B CN 103834679B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alr
antibiotic
pjyw
corynebacterium
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410057876.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103834679A (zh
Inventor
王小元
胡瑾瑜
李颜颜
胡晓清
谭延镇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201410057876.XA priority Critical patent/CN103834679B/zh
Publication of CN103834679A publication Critical patent/CN103834679A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103834679B publication Critical patent/CN103834679B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统，属于微生物基因工程领域。本发明通过构建alr敲除载体和用于质粒回补的表达载体，在方便实验室研究利用的同时，可实现发酵过程不再依赖抗生素。通过验证，本发明提供的表达系统在无抗生素添加条件下发酵时菌体内质粒稳定性；用于构建对支链氨基酸‑缬氨酸合成途径主要基因ilvBNC的过表达载体时，显著提高了其缬氨酸产量。本发明提供的棒状杆菌表达系统具有广泛的应用价值。

Description

一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统
技术领域
本发明公开了一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统，尤其是一种不依赖抗生素为选择压力的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭表达系统及其构建方法与应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术
棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高度GC含量的放线菌。自人们首次分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来（Kinoshita等，1957年），棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别。
由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学、生物化学和遗传学的知识，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。应用表达载体对氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因的过表达，是代谢工程最常用的策略之一。
目前普遍使用的棒状杆菌表达载体多使用抗生素抗性如KmR，TetR等作为选择标记，在发酵过程中添加相当浓度的相应抗生素以维持质粒在菌体中的存在。抗生素作为最为传统的选择标记，其所提供的稳定的筛选压力及其相较于其他系统更为广泛的适用性使其依然为实验室研究水平最有力，最方便有效的工具之一。然而抗生素的添加不仅限制了特定发酵产品的使用范围，其在发酵培养基中较大的添加量亦占发酵生产成本的较大比例。单一使用抗生素作为选择标记的载体并不利于实验室研究成果向工业化生产的转化。因此，构建一种既含有抗生素标记，有利于实验室研究级别的各项试验，又含有另一种选择标记，不需要添加额外的物质即能维持其在菌体中稳定存在并表达的载体，使其同时适用于科研及工业生产，对发酵行业具有重要的意义。可替代抗生素抗性作为选择压力以维持载体在菌体内稳定存在的方法，目前应用较为广泛的有质粒解离后致死系统（PSK）、Operator-repressor titration(ORT)、Auxotrophy complementation(AC)等。
在本发明中，我们以黄色短杆菌ATCC14067为基础，利用其alr构建了一套表达系统，该系统既含有KmR作为其抗性选择标记，同时无需添加抗生素即可保证表达载体在菌体内的稳定存在及组成表达。本发明首先验证了该系统在无抗生素添加条件下发酵时菌体内质粒稳定性；并构建了对支链氨基酸-缬氨酸合成途径主要基因ilvBNC的过表达载体，提高了其缬氨酸产量。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题是提供既含有抗生素抗性，方便实验室研究，同时又可不依赖抗生素为选择压力在发酵过程中稳定存在的的棒状杆菌表达系统，包括表达载体pJYW-4或pJYW-5，及alr缺陷型表达宿主。
所述表达载体pJYW-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述表达载体pJYW-5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述表达宿主是将alr敲除载体转化入棒状杆菌，通过同源重组获得的alr缺陷型表达宿主，所述alr敲除载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述表达载体是大肠杆菌-棒状杆菌穿梭表达载体pJYW-4或pJYW-5，包括筛选标记、复制子片段、组成型启动子及多克隆位点；可回补宿主菌的alr（编码丙氨酸消旋酶的基因）缺陷，从而使载体可以在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能。
所述表达载体pJYW-4或pJYW-5含有使质粒能在棒状杆菌宿主中复制并稳定存在的repA+per片段，其中per从2598位到2383位；repA从4704位到3241位。
所述表达载体pJYW-4或pJYW-5含有用于载体连接表达基因转化子筛选的抗性标记卡那霉素标记抗性基因kan，从5234位到6028位。
所述表达载体pJYW-4或pJYW-5含有用于在无抗生素添加情况下维持质粒在菌体内稳定存在的选择标记alr，从9位到1587位。
所述表达载体pJYW-4或pJYW-5含有用于控制基因表达的终止子序列，其中Terminator1从1941位到1984位，Terminator2从2116位到2143位。
所述表达载体pJYW-4或pJYW-5含有使质粒能在棒状杆菌宿主中进行组成型表达的启动子片段，从1592位到1655位。
所述表达载体pJYW-4或pJYW-5含有用于表达连接的MCS，包括11个酶切位点，从1656位到1723位。
本发明所解决的第二个技术问题是提供表达载体pJYW-4、pJYW-5的构建方法，主要步骤为：
（1）用限制酶Bstz17I和SmaI双酶切载体pEC-XK99E，去除含lacIq基因及Ptrc启动子的DNA片段，将大片段自身环化，构建成的重组质粒大小5306bp，命名为pJYW-1；所述pEC-XK99E的构建参考文献Oliver Kirchner,Andreas Tauch,2003.Tools for geneticengineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum；
（2）以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，alr-P-(+)和alr-P-(-)为引物，通过PCR扩增1598bp的alr基因及其原启动子，在片段两端分别引入BglII及PstI；PCR产物用BglII及PstI酶切，并连接到用BamHI及PstI酶切后的pJYW-1上，构建完成的质粒大小为6880bp，命名为pJYW-2；
（3）以MCS-F及MCS-R为引物，寡核苷酸链退火反应人工合成MCS片段，连入以AatII及PstI酶切后的pJYW-2，构建完成的质粒命名为pJYW-3，大小6942bp；AatII为上一步与PstI一起引入的位点；
（4）分别以tac-F/tac-R及tacM-F/tacM-R为引物，以寡核苷酸链退火反应人工合成tac及tacM启动子片段，分别连入以AatII及NotI酶切的pJYW-3上，构建的重组质粒分别命名为pJYW-4、pJYW-5，其大小均为7003bp。
本发明所解决的第三个技术问题是提供alr缺陷型表达宿主的构建方法，主要步骤为：
以C.glutamicumATCC13032基因组为模板，分别以Alr-S-(+)/(-)及Alr-X-(+)/(-)为引物扩增各1000bp的alr基因上下游片段alr-U、alr-D；以pDTW-202（Jinyu Hu,Yanzhen Tan,YanyanLi,Xiaoqing Hu,Daqing Xu,Xiaoyuan Wang,2013.Construction and application of an efficientmultiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.）为模板，kan-lox-F/R为引物扩增kan抗性基因片段。alr-U以XhoI、BamHI酶切，alr-D以XbaI及PstI酶切，kan片段以BamHI、XbaI酶切，三片段一起连入以XhoI及PstI酶切的pBluescript II SK(+)，构建完成的质粒命名为pJYW-6。将alr敲除载体转化宿主菌，通过同源重组获得alr基因缺陷的宿主菌。
本发明所解决的第四个技术问题是提供所述敲除载体pJYW-6在构建alr缺陷菌株中的应用，是通过同源重组及位点特异重组获得所需宿主菌株。
本发明要解决的第五个技术问题是利用所述表达系统表达缬氨酸合成途径基因ilvBNC，用于无抗生素条件下表达提升缬氨酸产量，主要步骤为：
（1）扩增ilvBNC基因片段，在两端分别引入NotI及HpaI酶切位点；将PCR产物片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体，得到重组表达质粒；
（2）将重组表达质粒转入通过alr敲除载体敲除了alr基因的棒状杆菌，发酵产缬氨酸。
本发明的有益效果：该表达系统不依赖表达载体自身的抗生素抗性即可维持其稳定的存在于棒状杆菌细胞内并能够高效组成型表达。此外，本发明构建的表达载体具有两种筛选标记，既含有抗生素抗性标记，方便科学研究，同时又可不依赖抗生素为选择压力，能在发酵过程中稳定存在，便于工业化应用。
附图说明
图1表达载体pJYW-4、pJYW-5的构建。
图2表达载体pJYW-4、pJYW-5及敲除载体pJYW-6的物理图谱。
图3表达系统可用性验证。
图4利用该表达系统构建表达质粒示意图及氨基酸产量变化示意。
具体实施方式
实施例1表达载体pJYW-4、pJYW-5的构建
第一步：用限制酶Bstz17I和SmaI双酶切载体pEC-XK99E（Oliver Kirchner,Andreas Tauch,2003.Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacteriumglutamicum.），去除含lacIq基因及Ptrc启动子的DNA片段，将大片段自身环化，构建成的重组质粒大小5306bp，命名为pJYW-1；
第二步：以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，alr-P-(+)和alr-P-(-)为引物，通过PCR扩增1598bp的alr基因及其原启动子，在片段两端分别引入BglII及PstI。PCR产物用BglII及PstI酶切，并连接到用BamHI及PstI酶切后的pJYW-1上，构建完成的质粒大小为6880bp，命名为pJYW-2；
第三步：以MCS-F及MCS-R为引物，寡核苷酸链退火反应人工合成MCS片段，连入以AatII及PstI酶切后的pJYW-2，构建完成的质粒命名为pJYW-3，大小6942bp；AatII为上步与PstI一起引入的位点。
第四步：分别以tac-F/tac-R及tacM-F/tacM-R为引物，以寡核苷酸链退火反应人工合成tac及tacM启动子片段，分别连入以AatII及NotI酶切的pJYW-3上，构建的重组质粒分别命名为pJYW-4、pJYW-5，其大小均为7003bp（图1）。
实施例2alr敲除载体pJYW-6的构建
以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，分别以Alr-S-(+)/(-)及Alr-X-(+)/(-)为引物扩增各1000bp的alr基因上下游片段alr-U、alr-D；以pDTW-202（Jinyu Hu,Yanzhen Tan,YanyanLi,Xiaoqing Hu,Daqing Xu,Xiaoyuan Wang,2013.Construction and application of an efficientmultiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.）为模板，kan-lox-F/R为引物扩增kan抗性基因片段。alr-U以XhoI、BamHI酶切，alr-D以XbaI及PstI酶切，kan片段以BamHI、XbaI酶切，三片段一起连入以XhoI及PstI酶切的pBluescriptIISK(+)，构建完成的质粒命名为pJYW-6（图2）。
实施例3所构建的表达系统的可用性验证
在一株可产缬氨酸的菌株YTW-102（Jinyu Hu,Yanzhen Tan,Yanyan Li,Xiaoqing Hu,Daqing Xu,Xiaoyuan Wang,2013.Construction and application of an efficientmultiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.）基础上，利用敲除载体敲除其alr，构建完成的菌株命名为YTW-103。在基本培养基中测定了三株菌YTW-102、YTW-103、YTW-103/pJYW-4的生长情况，结果如图3所示。同时分析了在无抗生素条件下发酵培养后菌体中质粒维持情况，采用方法为菌种在无抗生素条件下以基本培养基培养后稀释恰当倍数，分别涂布含30mg/L或不含卡那霉素的LBHIS（Jinyu Hu,Yanzhen Tan,Yanyan Li,Xiaoqing Hu,Daqing Xu,Xiaoyuan Wang,2013.Construction and application of an efficientmultiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.）培养基平板，观察相同稀释条件下两种平板单菌落个数差异，实验平板单菌落计数结果如表1所示。
由图3可见本表达系统所构建的菌体生长情况良好，YTW-103/pJYW-4生长优于其他几株菌，甚至好于YTW-102；而且在无抗生素环境下培养质粒可较稳定的存在于菌体中。一般认为菌落数在30-300间时菌落计数结果较为准确。在10-5条件下结果较为理想；虽然不同样品平行性较差，但综合考虑，本表达系统中质粒维持率很高。说明本发明构建的表达系统可以保证质粒在菌体中的稳定存在。
实施例4以构建的表达系统表达缬氨酸合成途径基因ilvBNC
为验证构建的表达系统的实际应用性，构建了表达缬氨酸合成途径基因ilvBNC并将其用于YTW-103内无抗生素条件下表达提升缬氨酸产量。
首先，以一株高产缬氨酸生产菌JHI3-156（Lianghong Yin,Xiaoqing Hu,Daqing Xu,JianfeiNing,Jian Chen,Xiaoyuan Wan,2012.Co-expression of feedback-resistant threonine dehydrataseand acetohydroxy acid synthase increase L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum.）基因组为模板，ilvBNC-(+)/(-)为引物，扩增ilvBNC基因片段，在两端分别引入NotI及HpaI酶切位点；将PCR产物片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的pJYW-4，完成表达质粒构建pJYW-4-ilvBNC。
然后，将pJYW-4-ilvBNC转入YTW-103，构建基因工程菌株YTW-103/pJYW-4-ilvBNC。将YTW-103、YTW-103/pJYW-4与YTW-103/pJYW-4-ilvBNC分别于基本培养基中发酵，测定其缬氨酸产量。
氨基酸产量变化见图4：经72小时培养，YTW-103/pJYW-4-ilvBNC的OD562约为11，经HPLC分析其产缬氨酸约2.6g/L，比产量约为0.56g/g；相同培养条件下，YTW-103/pJYW-4生长情况略好，其最终OD562约32，缬氨酸产量3.4g/L，比产量约0.25g/g。而YTW-103经培养可达最终OD562约28，其产缬氨酸3.28g/L，比产量约0.28g/g。两者相比YTW-103/pJYW-4-ilvBNC较YTW-103与YTW-103/pJYW-4其产量提升100%。
表1无抗生素添加条件下发酵中质粒稳定性数据
表2本发明涉及引物
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种应用棒状杆菌表达系统表达缬氨酸合成途径基因ilvBNC并发酵生产缬氨酸的方法，其特征在于，所述棒状芽孢杆菌表达系统通过质粒回补基因组alr基因缺陷，从而使表达载体在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能；所述表达系统包括alr基因缺陷型表达宿主和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的表达载体；所述方法主要步骤为：
(1)扩增ilvBNC基因片段，在两端分别引入NotI及HpaI酶切位点；将PCR产物片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体，得到重组表达质粒；
(2)将重组表达质粒转入通过alr敲除载体敲除了alr基因的棒状杆菌，发酵产缬氨酸。
CN201410057876.XA 2014-02-20 2014-02-20 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统 Active CN103834679B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410057876.XA CN103834679B (zh) 2014-02-20 2014-02-20 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410057876.XA CN103834679B (zh) 2014-02-20 2014-02-20 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103834679A CN103834679A (zh) 2014-06-04
CN103834679B true CN103834679B (zh) 2016-08-17

Family

ID=50798575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410057876.XA Active CN103834679B (zh) 2014-02-20 2014-02-20 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103834679B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480057A (zh) * 2014-12-04 2015-04-01 江南大学 一株产l-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用
CN106190921B (zh) * 2016-08-08 2019-07-26 天津科技大学 一种谷氨酸棒状杆菌与应用
CN106591210B (zh) * 2017-01-19 2019-05-10 江南大学 一种表达vgb基因的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
EP3604530A4 (en) 2017-03-21 2020-11-25 Wuhan Grand Hoyo Co., Ltd. PROMOTOR OF A CONSTITUTIVE CORYNEBACTERIUM EXPRESSION VECTOR THAT IS TESTED ON THE BASIS OF TRANSCRIPTOME SEQUENCING, SCREENING PROCEDURES FOR IT AND APPLICATIONS THEREOF
CN107164369B (zh) * 2017-03-21 2019-09-20 武汉远大弘元股份有限公司 一种棒状杆菌组成型表达载体启动子、含有该启动子及lrp基因的表达载体
CN107164370B (zh) * 2017-03-21 2019-09-20 武汉远大弘元股份有限公司 一种棒状杆菌组成型表达载体启动子、含有该启动子及gnd基因的表达载体
CN107164371B (zh) * 2017-03-21 2019-09-20 武汉远大弘元股份有限公司 一种基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子
CN111321100B (zh) * 2020-02-28 2022-03-25 江南大学 一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌
CN111440797B (zh) * 2020-04-10 2021-10-22 江南大学 诱导型启动子的获得及其应用
CN114561417B (zh) * 2022-04-27 2022-08-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60131538T2 (de) * 2000-07-24 2008-10-23 Evonik Degussa Gmbh Alanine-racemase (alr) aus corynebacterium glutamicum
WO2002008437A2 (en) * 2000-07-24 2002-01-31 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-glutamic acid using coryneform bacteria
WO2008095889A1 (en) * 2007-02-06 2008-08-14 Basf Plant Science Gmbh Use of alanine racemase genes to confer nematode resistance to plants
CN102203277B (zh) * 2008-08-21 2014-03-12 诺维信公司 微流体装置筛选方法
CN101693901B (zh) * 2009-10-26 2011-10-05 江南大学 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法
CN101838663B (zh) * 2009-12-18 2013-05-22 江南大学 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法
CN103275918B (zh) * 2013-06-07 2015-08-26 安徽华恒生物科技股份有限公司 高产dl-丙氨酸的生产菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103834679A (zh) 2014-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103834679B (zh) 一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统
CN103298930B (zh) 改进的启动子和用其产生l-赖氨酸的方法
EP2811028B1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung rekombinanter Corynebakterien enthaltend das durch Propionat induzierbare ilvBN-Operon
CN103492553A (zh) 用于生产尸胺的方法和重组微生物
CN103409446A (zh) 一种棒状杆菌基因连续敲除系统及其构建方法和应用
CN101946002A (zh) 具有提高的l-苏氨酸生产率的大肠杆菌菌株和利用其生产l-苏氨酸的方法
CN102851307A (zh) 在蜂房哈夫尼菌中稳定的重组表达质粒载体及其应用
JP2017023147A (ja) 発酵法による目的物質の製造法
CN102757975B (zh) 一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法
Yang et al. Development of a defined medium for Corynebacterium glutamicum using urea as nitrogen source
WO2015132213A1 (de) Verfahren zur herstellung von endständigen aminocarbonsäuren und aminoaldehyden mittels eines rekombinaten mikroorganismus
US9506072B2 (en) Regulated gene expression systems and constructs thereof
CN109666617A (zh) 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
CN102676509B (zh) 一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用
CN106318964B (zh) 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造
US20170166944A1 (en) Isolated polynucleotide including promoter region, host cell including the same, and method of expressing target gene using the host cell
US20150118720A1 (en) Process for producing amino acid
CN102234667A (zh) 赖氨酸的三级发酵制备
US20230002796A1 (en) Method for inducing microbial mutagenesis to produce lactic acid
CN115449518B (zh) 基于mdh基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途
US9157086B2 (en) Shuttle vectors for Corynebacterium and Escherichia coli
CN115506035B (zh) 启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库
US20240052382A1 (en) Process control for 3-hydroxypropionic acid production by engineered strains of aspergillus niger
RU2012144556A (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА
RU2794946C1 (ru) Новый промотор и способ получения желаемого вещества с его использованием

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: No.8, Huilu Dongyuan, guhuashan Road, Liangxi District, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee after: Jiangnan University

Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province

Patentee before: Jiangnan University

CP02 Change in the address of a patent holder