CN102234667A - 赖氨酸的三级发酵制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了发酵L-赖氨酸的方法，其包括将表达二氢吡啶二羧酸合成酶变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后向第三发酵罐持续流加糖，之后向第三发酵罐持续流加糖和氮源。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵L-赖氨酸的方法，其包括将表达二氢吡啶二羧酸合成酶变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后向第三发酵罐持续流加糖，之后向第三发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品等。
背景技术
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。
用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。
二氢吡啶二羧酸合成酶变体是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡二氢吡啶二羧酸合成酶及其部分变体已经被公开(可参见NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号AAC75531.1；也可参见中国专利ZL94194962)，但是该酶的其他变体的研究却没有报道，也没有启示在新的位点上突变。
本发明人经过长期艰苦研究，除了令人意外地发现了新的二氢吡啶二羧酸合成酶之外，本发明人更详细地研究了适合含有该酶的工程菌发酵的方法，在实际生产中增加了赖氨酸的产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵L-赖氨酸的方法，其包括将表达二氢吡啶二羧酸合成酶变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后向第三发酵罐持续流加糖，之后向第三发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵L-赖氨酸的方法，其包括：
(1)将表达二氢吡啶二羧酸合成酶变体的工程菌接入第一发酵罐于30-33℃培养8-12小时，其中所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体相对于野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的活性提高；
(2)将步骤(1)获得的培养液以3-7％(体积)的接种量接种于第二发酵罐，于36-40℃培养8-12小时；
(3)将步骤(2)获得的培养液以10-20％(体积)的接种量接种于第三发酵罐，于36-40℃培养1-5小时；
(4)向第三发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.2-0.35％(重量)，进行10-18小时；和
(5)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.3-0.5％(重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.1-0.25％(重量)，进行30-65小时，优选50-55小时。
在本文中，“第一”、“第二”和“第三”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，即第一发酵罐、第二发酵罐和第三发酵罐之间是互不相同的。在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液(接入的菌液)体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。
第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方可以是相同的，也可以是不同的，优选是相同的。优选在本发明第一方面的方法中，第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，KH2PO4 30-80公斤，MgSO4·7H2O 3-15公斤，FeSO4·7H2O 0.1-1公斤，MnSO4·7H2O 0.1-1公斤，生物素5-30克，和叶酸3-10克。在本发明的具体实施方式中，第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，KH2PO4 45公斤，MgSO4·7H2O 7公斤，FeSO4·7H2O 0.5公斤，MnSO4·7H2O0.5公斤，生物素12克，和叶酸5克。
优选在本发明第一方面的方法中，第三发酵罐的培养基配方为：每300立方米培养基中含，蔗糖10000-15000公斤，玉米浆10000-15000公斤，KH2PO4700-1200公斤，MgSO4·7H2O 5-220公斤，FeSO4·7H2O 5-25公斤，MnSO4·7H2O5-220公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。在本发明的具体实施方式中，第三发酵罐的培养基配方为：每300立方米培养基中含，蔗糖12000公斤，玉米浆12000公斤，KH2PO4 1000公斤，MgSO4·7H2O 100公斤，FeSO4·7H2O 12公斤，MnSO4·7H2O 120公斤，生物素200克，和叶酸85克。
步骤(4)和(5)的部分培养条件(如，温度，pH等)与步骤(3)的可以相同也可以不同。优选步骤(4)和(5)中的温度与步骤(3)中的温度相同，即均为36-40℃，优选均为38-39℃。步骤(3)中，不进行流加操作；而在步骤(4)和(5)中，pH则维持在6.5至7.8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。
在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质(如，培养液)的重量的百分比量。步骤(4)和(5)中的糖可以是葡萄糖、果糖或者蔗糖。本发明人发现，尽管通常蔗糖被微生物同化的效果弱于葡萄糖，从而影响发酵效果，但是在本发明中，在其他发酵条件相同的情况下，流加葡萄糖和流加蔗糖之间没有显著的区别。因此，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)和(5)中的糖是蔗糖。在步骤(4)中，蔗糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.2-0.35％(重量)，优选为0.27-0.33％(重量)。在步骤(5)中，蔗糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.3-0.5％(重量)，优选为0.42-0.48％(重量)。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤(5)中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵，如硫酸铵。在步骤(5)中，硫酸铵的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.1-0.25％(重量)，优选为0.17-0.23％(重量)。
在本发明中，野生型二氢吡啶二羧酸合成酶是本领域技术人员所知晓的，其序列如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号AAC75531.1所示。
优选本发明第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体，如其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
优选本发明第一方面的发酵方法中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M13K、V60L和A83G。在本发明的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
本领域技术人员可以根据二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体由如SEQ ID No：2所示的多核苷酸编码。
所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明第一方面的方法中，工程菌是棒状杆菌。由于棒状杆菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入棒状杆菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行DNA重组操作。在本发明的具体实施方式中，工程菌是Corynebacterium glutamicum。
在第二方面，本发明提供了根据本发明得到的产品。具体而言，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的发酵液，其中L-赖氨酸的含量不低于155g/L，优选不低于170g/L。该发酵液可以直接干燥成为L-赖氨酸饲料添加剂。
本发明具有以下有益效果：发酵方法适合表达二氢吡啶二羧酸合成酶变体的工程菌产生赖氨酸；赖氨酸的发酵产量在工业化生产中得到了很有效的提高；发酵生产的时间较短，提高了单位时间的产量；发酵需要控制的参数较少，简化了操作，更适宜工业化的标准化生产；变体酶与野生型酶结构差异不大，都可以顺利降解，无安全隐患。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1二氢吡啶二羧酸合成酶变体基因的制备
根据我们设计的序列，通过商业途径委托上海生工生物技术有限公司合成编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体基因并构建入大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pMS2(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 67189)中。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南进行，简要过程如下：
通过DNA自动合成仪，合成二氢吡啶二羧酸合成酶变体基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(购自TaKaRa公司)将这些核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这5个核酸片段后于65℃变性5分钟，退火降温至16℃，加入T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接12小时。然后，取1μL上述连接产物在50μL反应体积中进行PCR扩增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No：3所示(引入了EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQ ID No：4所示(引入了Xba I内切酶位点)，反应条件为：以94℃变性4分钟，然后以94℃变性30秒、63℃退火60秒并72℃延伸30秒进行35个循环，最后以72℃延伸4分钟并降温至4℃。
琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约0.9kb大小的片段，用EcoR I和Xba I双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的pMS2质粒用T4DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌Top10 F’中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证，相应核苷酸序列如序列表的SEQ ID No：1所示，顺序编码了如SEQ ID No：2所示的二氢吡啶二羧酸合成酶变体的完整ORF，由公司将构建好的质粒(命名为pMS2-dap)以及相应大肠杆菌转化株(命名为E.coli-dap)寄回。
实施例2棒状杆菌的发酵实验
通过电转化法将pMS2-dap质粒转入L-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 31269)中，其简要过程是：将棒状杆菌在50mL LB液体培养基中振荡培养至OD500达到0.7，离心收集菌体，用0℃预冷的10％(V/V)甘油溶液洗涤后将菌体重悬于200μL预冷的10％(V/V)甘油溶液中，加入pMS2-dap质粒，混合均匀后转移入0.1cm电击杯中，于1.8kV持续5ms的条件进行电击，然后立即加入1mL含0.5％(M/M)葡萄糖的液体LB培养基，于42℃温浴5分钟，然后涂布在含100μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素的固体LB培养基上于30℃培养36小时。生长出的转化菌株提取总DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳发现有约0.9kb大小的片段，表明已经将如序列表的SEQ ID No：1所示的基因构建体导入了棒状杆菌工程菌中。同时将pMS2质粒电转化入L-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌，形成阴性对照菌。
将上述电转化的阳性棒状杆菌工程菌和阴性对照菌分别在液体LB培养基中振荡培养至OD500达到0.5，以5％的接种量接入赖氨酸发酵培养基(每升培养基配方为：40g蔗糖，20g NH4Cl，2g CaCl2，1g KH2PO4，1g蛋白胨，500mgMgSO4·7H2O，15mg FeSO4·7H2O，10mg MnSO4·7H2O，200μg生物素，和50μg叶酸，用Tris-HCl调节至pH7.3)中以30℃振荡(150rpm)培养72小时。离心收集培养基上清液(即，发酵液)，用纸层析法分离并定量培养基中的L-赖氨酸。结果发现，阳性棒状杆菌工程菌的发酵培养基中L-赖氨酸的含量达到了19.6g/L，而阴性对照菌的发酵培养基中L-赖氨酸的含量仅为12.0g/L，表明导入了如序列表的SEQ ID No：1所示的基因构建体，产量提高了63.3％，高于现有技术中导入野生型吡啶核苷酸转氢酶的工程菌的产量提高比率。
实施例3L-赖氨酸的三级发酵实例1
第一级制备：将实施例2的转化有pMS2-dap质粒的棒状杆菌工程菌以0.5％的接种量接入20立方米发酵罐(其中的培养基配方为：葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，KH2PO4 45公斤，MgSO4·7H2O 7公斤，FeSO4·7H2O 0.5公斤，MnSO4·7H2O 0.5公斤，生物素12克，和叶酸5克，用水定容至18立方米)，于31℃饱和通气培养10小时，提高菌体密度。期间，用葡萄糖累积的活菌量显著优于使用蔗糖。
第二级制备：将20立方米发酵罐的培养液以5％的接种量注入50立方米发酵罐(其中培养基配方与上相同)，于38℃饱和通气培养10小时，使菌体适宜产酸。
第三级制备：将50立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐(其中的培养基配方为：蔗糖12000公斤，玉米浆12000公斤，KH2PO4 1000公斤，MgSO4·7H2O 100公斤，FeSO4·7H2O 12公斤，MnSO4·7H2O 120公斤，生物素200克，和叶酸85克，用水定容至300立方米)，于38℃饱和通气培养3小时。然后，每小时流加1000公斤蔗糖，持续15小时，期间排出蒸汽以保持体积；之后，每小时流加1500公斤蔗糖和650公斤硫酸铵，持续发酵50小时，期间排出蒸汽以保持体积。流加期间，加入NaOH和浓盐酸使pH维持在6.5至7.8之间，即低于低限时加碱，高于高限时加酸。流加时，可以放出1立方米培养液溶解100公斤蔗糖或硫酸铵，流加入。发酵完毕，薄层层析检测其中产L-赖氨酸159g/L，达到工业应用的标准。
实施例4L-赖氨酸的三级发酵实例2
基本同实施例3，所不同的是，将50立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐，于39℃饱和通气2.5小时。然后，每小时流加1100公斤蔗糖，持续12小时；之后，每小时流加1500公斤蔗糖和700公斤硫酸铵，持续发酵55小时，薄层层析检测其中产L-赖氨酸177g/L。
实施例5L-赖氨酸的三级发酵实例3
基本同实施例3，所不同的是，将50立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐，于39℃搅拌培养3小时。然后，每小时流加1100公斤蔗糖，持续18小时；之后，每小时流加1500公斤蔗糖和700公斤硫酸铵，持续发酵50小时，薄层层析检测其中产L-赖氨酸170g/L。
Claims (10)
1.发酵L-赖氨酸的方法，其包括：
(1)将表达二氢吡啶二羧酸合成酶变体的工程菌接入第一发酵罐于30-33℃培养8-12小时，其中所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体相对于野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的活性提高；
(2)将步骤(1)获得的培养液以3-7％(体积)的接种量接种于第二发酵罐，于36-40℃培养8-12小时；
(3)将步骤(2)获得的培养液以10-20％(体积)的接种量接种于第三发酵罐，于36-40℃培养1-5小时；
(4)向第三发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.2-0.35％(重量)，进行10-18小时；和
(5)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.3-0.5％(重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.1-0.25％(重量)，进行30-65小时，优选50-55小时。
2.权利要求1所述的方法，其中第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，KH2PO4 30-80公斤，MgSO4·7H2O 3-15公斤，FeSO4·7H2O 0.1-1公斤，MnSO4·7H2O 0.1-1公斤，生物素5-30克，和叶酸3-10克。
3.权利要求2所述的方法，其中第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，KH2PO4 45公斤，MgSO4·7H2O 7公斤，FeSO4·7H2O 0.5公斤，MnSO4·7H2O0.5公斤，生物素12克，和叶酸5克。
4.权利要求1所述的方法，其中第三发酵罐的培养基配方为：每300立方米培养基中含，蔗糖10000-15000公斤，玉米浆10000-15000公斤，KH2PO4 700-1200公斤，MgSO4·7H2O 5-220公斤，FeSO4·7H2O 5-25公斤，MnSO4·7H2O 5-220公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。
5.权利要求4所述的方法，其中第三发酵罐的培养基配方为：每300立方米培养基中含，蔗糖12000公斤，玉米浆12000公斤，KH2PO4 1000公斤，MgSO4·7H2O100公斤，FeSO4·7H2O 12公斤，MnSO4·7H2O 120公斤，生物素200克，和叶酸85克。
6.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)和(5)中的温度与步骤(3)中的温度相同，优选为38-39℃。
7.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)和(5)中的糖是蔗糖；和/或，其中步骤(5)中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵。
8.权利要求1所述的方法，其中工程菌是棒状杆菌，优选是Corynebacteriumglutamicum。
9.权利要求1所述的方法，其中二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M13K、V60L和A83G，最优选二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
10.权利要求1-9之任一所述的方法制备的发酵液，其中L-赖氨酸的含量不低于155g/L，优选不低于170g/L。
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Date of cancellation: 20210126 Granted publication date: 20120815 Pledgee: Yongning County Branch of China Agricultural Development Bank Pledgor: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2020640000002 |
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Denomination of invention: Three stage fermentation of lysine Effective date of registration: 20210127 Granted publication date: 20120815 Pledgee: Yongning County Branch of China Agricultural Development Bank Pledgor: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2021640000001 |
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Date of cancellation: 20220129 Granted publication date: 20120815 Pledgee: Yongning County Branch of China Agricultural Development Bank Pledgor: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2021640000001 |
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Denomination of invention: Preparation of lysine by tertiary fermentation Effective date of registration: 20220323 Granted publication date: 20120815 Pledgee: Yongning County Branch of China Agricultural Development Bank Pledgor: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2022640000002 |
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Date of cancellation: 20230315 Granted publication date: 20120815 Pledgee: Yongning County Branch of China Agricultural Development Bank Pledgor: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd.|INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd.|Heilongjiang Yipin Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022640000002 |
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Denomination of invention: Preparation of Lysine through Tertiary Fermentation Granted publication date: 20120815 Pledgee: Yongning County Branch of China Agricultural Development Bank Pledgor: NINGXIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd.|INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH Co.,Ltd.|Heilongjiang Yipin Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024640000005 |