CN102676509B - 一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用。本发明提供的一种DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD。本发明的实验证明，本发明的阿拉伯糖诱导表达载体可以表达外源基因，且在以糖质为原料的发酵工程中具有很好的应用前景。

Description

一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种阿拉伯糖诱导的表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌属于高GC含量的革兰氏阳性菌，具有较强的氨基酸和有机酸的合成能力，可以生产多种化学物质，是一种重要的工业微生物。通过基因工程改造的方法调节谷氨酸棒杆菌胞内的代谢网络或者通过代谢工程方法为谷氨酸棒杆菌构建新的代谢途径，可以获得具有高生产强度菌株，其可以生产各种生物物质，如泛酸，木糖醇，海藻糖和聚羟基丁酸脂等。基因工程或代谢工程的基本方法是在加强表达途径中的关键酶基因或者诱导表达新的代谢途径基因。这些基因都是在启动子的调控下表达，其表达强度和调控严谨性依赖于启动子的元件。到目前为止，乳糖诱导表达的启动子及其衍生启动子被广泛应用于谷氨酸棒杆菌。这些启动子在诱导物存在的条件下可以迅速激活启动子的转录，然而它们在谷氨酸棒杆菌中的表达强度低于其在大肠杆菌中的表达强度，而且还有较高水平的本底表达，不能够提供严紧性的调节。研究人员已经通过突变P_tａｃ启动子-10区的核甘酸序列和利用强组成型表达的启动子调节阻遏蛋白的表达的方法，来提高启动子的P_ｔａｃ表达水平和调节的严紧性（Journal ofMicrobiologly Methods,2010，80，86-92；Plasmid，2010，2，85-91）。但是，由于谷氨酸棒杆菌对诱导剂的渗透能力较低，使得这些启动子的表达水平仍然相对较低。作为诱导剂的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）由于价格较高而且对细胞有潜在的毒性，使其不能够被广泛的应用于工业大规模的蛋白表达或者生物材料的生产。尽管谷氨酸棒杆菌中许多的启动子的调节机制被广泛研究（Journal ofBiotechnology，2003，104，287-99；Journal of Biotechnology，2011，90，1641-1654），到目前为止，在谷氨酸棒杆菌中仍缺乏一种可以严谨性调节，高效表达，而且满足工业生产需要的表达载体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD。

上述的DNA片段中，所述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom为序列表中序列1自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列1自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述调控蛋白基因araC为序列表中序列1自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述调控蛋白基因启动子P_c为序列表中序列1自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述阿拉伯糖启动子P_BAD为序列表中序列1自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段。

上述的DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第5239-8046位。

本发明的另一个目的是提供一种表达载体。

本发明提供的表达载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌ori pUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1、氯霉素抗性基因cat、权利要求1或2所述的DNA片段和转录终止子rrnB。

上述表达载体具体为自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌oripUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1、氯霉素抗性基因cat、谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD和转录终止子rrnB。

上述的表达载体中，所述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1为序列表中序列1自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述氯霉素抗性基因cat为序列表中序列1自5’末端第4410-5069位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述转录终止子rrnB为序列表中序列1自5’末端第67-492位核苷酸所示的双链DNA片段。

上述的表达载体中，在所述阿拉伯糖启动子P_BAD和所述转录终止子rrnB之间还包括多克隆位点，所述多克隆位点自5’末端至3’末端依次为HindIII、PstI、SalI、XbaI、BamHI、AvaI、XmaI、SmaI、EcoRI。

上述的表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。

本发明的第三个目的是提供一种制备上述表达载体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将序列1自5’末端第5239-8046位核苷酸插入pXMJ19的NarI和PstI酶切位点间中得到的载体。

上述的表达载体在表达外源基因中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述外源基因为β-半乳糖苷酶基因、upp基因、绿色荧光蛋白编码基因、odhI基因；

所述β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

所述upp基因的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第727-1362位核苷酸；

所述绿色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4；

所述odhI基因的核苷酸序列为序列表中的序列5。

upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，能够将5-FU转化为5-fluoro-UMP，5-fluoro-UMP最终被代谢为有毒的化合物5-fluoro-dUMP，5-fluoro-dUMP是胸苷酸合成酶的强烈抑制剂，因此能够产生细胞毒性，而5-FU却不会对upp基因缺失的菌株产生毒性。upp基因在菌种遗传改造中被用为一种筛选标记。

odhI基因编码产物是酮戊二酸脱氢酶复合物的抑制蛋白，通过该蛋白抑制酮戊二酸的活性，减少酮戊二酸向三羧酸循环的流量，为谷氨酸的合成提供更多的前体物质。

本发明的第四个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将序列表中的序列5插入上述的表达载体的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体。

含有上述重组载体的重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组菌为将上述的重组载体导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中得到。

上述重组菌在制备谷氨酸中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，与现有的IPTG诱导的表达载体pXMJ19相比，本发明的阿拉伯糖诱导表达载体的优点在于如下几点：

1、本发明中的表达载体在不添加诱导剂阿拉伯糖条件下，能够完全抑制目的基因的表达，没有渗漏或本底表达，利于有毒蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达；

2、本发明中的表达载体对目的基因的表达水平的调控依赖于阿拉伯糖的诱导浓度，可以在0.001％-0.4％的阿拉伯糖浓度范围内实现有效的诱导表达；

3、本发明中的表达载体在谷氨酸棒杆菌中可以提供较高的目标蛋白表达，其表达水平高于目前广泛使用的P_tac启动子2倍，而且该启动子的诱导表达不受其它碳源的代谢抑制调节，因此，在以糖质为原料的发酵工程中具有很好的应用前景；

4、本发明中的表达载体即使在亚饱和的阿拉伯糖诱导浓度条件下，启动子可以调节目的基因在细胞群体中的每一个细胞中进行均一性表达，不存在诱导和非诱导的混合细胞亚群体的现象。

附图说明

图1为araC-P_BAD基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

图2为P_hom基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

图3为araE基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

图4为表达载体pWYE1088的质粒电泳图

图5为表达载体pWYE1088的构建方法流程示意图

图6为表达载体pWYE1088表达半乳糖苷酶活性分析图

图7为表达载体pWYE1088与表达载体pXMJ19表达半乳糖苷酶活性的比较图

图8为upp基因在抑制和诱导表达条件下谷氨酸棒杆菌在含有5-氟尿嘧啶平板上的生长情况

图9为绿色荧光蛋白在阿拉伯糖诱导条件下细胞群体中的表达情况

图10为odhI基因在阿拉伯糖和IPTG诱导条件下谷氨酸棒杆菌产谷氨酸的发酵图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088的构建

1、阿拉伯糖启动子和调控基因（araC-P_BAD）的PCR扩增

根据已知araC-P_BAD的序列（GenBank登陆号：AY048746），分别设计针对该序列片段的上游引物WZ279和下游引物WZ280，同时在引物两端引入NarI和PstI的酶切位点（其中划线部分为酶切位点）。

以质粒ｐKD46（Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products.Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA.2000,97:6640-6645.公众可从中国科学院微生物研究所获得）为模板，上述WZ279和WZ280为引物，扩增araC基因序列和启动子P_c以及启动子P_BAD序列。PCR反应体系组成如下：模板1μL,10×buffer 10μL,dNTP8μL,引物WZ2791μL,引物WZ280 1μL,Pyrobest^TM Taq 1μL,H₂O补至100μL。PCR反应程序：94℃预变性3min,1个循环；94℃40s，55℃40s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到1230bp左右的特异性条带，见图1，经过测序，该片段具有序列表中序列1自5’末端第6821-8046位核苷酸，命名为araC-P_BAD序列的PCR产物。

表1本发明所使用的引物

2、表达载体pWYE1067的构建

将araC-P_BAD序列的PCR产物用酶NarI和PstI进行酶切消化，同时将pXMJ19质粒（Jakoby,M.,Ngouoto-Nkili,C.,Burkovski,A.Construction and applicationof new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnology Techniques 1999，13(6):437-441.公众可从中国科学院微生物研究所获得）同样用内切酶NarI和PstI进行酶切消化，37℃作用3h，两个反应的反应体系如下：10×buffer 10μL，NarI5μL，PstI 5μL，PCR产物（或pXMJ19质粒）30-50μL，H₂O补至100μL。在T4连接酶的作用下连接消化的araC-P_BAD序列的PCR产物和酶切处理的pXMJ19质粒，4℃连接过夜，反应体系如下：10×连接buffer 1μL，PCR酶切回收产物5μL，pXMJ19质粒回收产物1μL，T4DNA连接酶1μL，H₂O补至10μL。将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml的LB液体培养基在37℃继续培养，然后提取质粒。

将质粒用NarI和PstI进行酶切消化，得到1230bp左右的特异性条带的为阳性重组质粒，将该重组质粒送去测序，结果为该重组质粒为将序列表中序列1自5’末端第6821-8046位核苷酸插入pXMJ19质粒的NarI和PstI酶切位点间得到的载体，将该重组质粒命名为pWYE1067质粒。

3、P_hom启动子和araE基因的扩增

根据已知谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组的序列（GenBank登陆号：NC_003450），分别设计针对P_hom启动子序列设计上游引物WZ291，在其5-端引入ClaI酶切位点；下游引物WZ292。

上述WZ291和WZ292为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032（ATCC购买，ATCC Number：13032）基因组为模板扩增，得到P_hom启动子PCR产物。

P_hom启动子PCR产物在1.3％琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到130bp左右的特异性条带，见图2。

根据已知大肠杆菌W3110基因组的序列（GenBank登陆号：AP009048.1），分别设计针对araE基因的上游引物WZ293，下游引物WZ294，在该引物5-端引入ClaI酶切位点。

上述WZ293和WZ294为引物，以大肠杆菌W3110（DSM购买，DSM No.5911）为模板扩增，得到araE基因PCR产物。araE基因PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到1440bp左右的特异性条带，见图3。

将P_hom启动子PCR产物和araE基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条件切下后回收。以P_hom启动子PCR产物和araE基因PCR产物的回收产物为模板，以WZ291和WZ294为扩增引物，进行重叠延伸PCR，获得1560bp左右的P_hom::araE的融合片断，该片段为序列表中序列1自5’末端第5239-6800位核苷酸。

4、表达载体pWYE1088的构建

将P_hom::araE融合片断用酶ClaI进行酶切消化，同时将pWYE1067质粒同样用内切酶ClaI进行酶切消化，37℃作用3h，两个反应的反应体系如下：10×buffer 10μL，ClaI 5μL，P_hom::araE融合片断（或pWYE1067）30-50μL，H₂O补至100μL。线性化的pWYE1067用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，反应体系为：线性化的pWYE1067片段40μL，10×buffer 10μL，碱性磷酸酶2U,H₂O补至100μL,37℃处理2h。

在T4连接酶的作用下连接消化的P_hom::araE融合片断和磷酸化处理的pWYE1067质粒，4℃连接过夜，反应体系如下：10×连接buffer 1μL，P_hom::araE融合片断5μL，pWYE1067质粒回收产物1μL，T4DNA连接酶1μL，H₂O补至10μL。将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml的LB液体培养基在37℃继续培养，然后提取质粒，进行琼脂糖凝胶电泳检测（图4）。

将上述质粒送去测序，该质粒为将该片段为序列表中序列1自5’末端第5239-8046位核苷酸插入pXMJ19的NarI和PstI酶切位点间得到的载体，命名为pWYE1088，即为阿拉伯糖诱导表达载体。

pWYE1088的核苷酸序列为序列表中的序列1，pWYE1088为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌ori pUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1、氯霉素抗性基因cat、谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD、多克隆位点和转录终止子rrnB；

上述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段；

上述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1为序列表中序列1自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段；

上述氯霉素抗性基因cat为序列表中序列1自5’末端第4410-5069位核苷酸所示的双链DNA片段；其表达与质粒5’-3’顺序相反；

上述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom为序列表中序列1自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的双链DNA片段；

上述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列1自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段；

上述调控蛋白基因araC为序列表中序列1自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段；其蛋白的表达与质粒5’-3’顺序相反；

上述调控蛋白基因启动子P_c为序列表中序列1自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段；其表达与质粒5’-3’顺序相反；

上述阿拉伯糖启动子P_BAD为序列表中序列1自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段；

上述多克隆位点自5’末端至3’末端依次为HindIII、PstI、SalI、XbaI、BamHI、AvaI、XmaI、SmaI、EcoRI的识别位点，为序列表中序列1自5’末端第6-57位核苷酸所示的双链DNA片段；

上述转录终止子rrnB为序列表中序列1自5’末端第67-492位核苷酸所示的双链DNA片段。

阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088的构建流程见图5。

实施例2、阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088应用

一、利用阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088表达β-半乳糖苷酶基因

1、含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒构建

根据已知大肠杆菌的序列（GenBank登陆号：AP009048.1）分别设计针对lacZ基因的上游引物WZ231和下游引物WZ232，同时在引物两端引入PstI和SmaI的酶切位点。

以大肠杆菌W3110（DSM购买,DSM No.5911）的染色体为模板，上游引物WZ231和下游引物WZ232为引物，扩增得到3075bp的lacZ基因（β-半乳糖苷酶基因）序列，经过测序为序列2。

将lacZ基因的PCR产物用PstI和SmaI酶进行酶切处理pWYE1088载体用同样的酶进行酶切处理，酶切反应体系为：10×buffer 10μL，PstI 5μL，SmaI 5μL，lacZ基因的PCR产物（pWYE1088载体）30-50μL，H₂O补至100μL。在T4连接酶的作用下连接消化的lacZ基因序列的PCR产物和酶切处理的pWYE1088质粒，4℃连接过夜，反应体系如下：10×连接buffer 1μL，lacZ基因的PCR酶切回收产物5μL，pWYE1088质粒回收产物1μL，T4DNA连接酶1μL，H₂O补至10μL。将连接产物转化ATCC13032感受态细胞，鉴定阳性克隆，提取质粒，将该质粒送去测序，该质粒为将序列2插入pWYE1088载体的PstI和SmaI酶切位点得到的载体，命名为pWYE1088-lacZ；将含有

pWYE1088-lacZ的谷氨酸棒杆菌ATCC13032命名为ATCC13032/pWYE1088-lacZ。

采用同样的方法将序列2插入pXMJ19的PstI和SmaI酶切位点得到的载体pXMJ19-lacZ，将含有pXMJ19-lacZ的谷氨酸棒杆菌ATCC13032命名为ATCC13032/pXMJ19-lacZ。

2、β-半乳糖苷酶活性的测定

β-半乳糖苷酶活性用ONPG法进行检测，具体方法如下：

将ATCC13032/pWYE1088-lacZ培养至OD₆₀₀光密度达到0.4，加入不同浓度的阿拉伯糖进行诱导表达，诱导表达4h后收集菌体1.5mL，然后取出0.5mL菌液稀释10倍测定OD₆₀₀的光密度值。将剩余的1ml菌液10,000×g离心5min，弃上清，用50mMPBS buffer(pH 7.2)缓冲液洗两遍，再用Z-buffer(40mM NaH₂PO₄，60mM Na₂HPO₄，10mM KCl，1mM MgSO₄，50mM β-mercaptoethanol，pH 7.0)悬浮至1ml，在冰上超声破碎，离心去除细胞碎片。取50μL的样品加入0.2mL的ONPG和0.8mL的Z-buffer混匀，置于37℃反应并记录反应起始时间。待样品呈现淡黄色时，再加入1mL的1M的Na₂CO₃终止反应，记录反应终止时间，样品放置于，用紫外分光光度计测定OD₄₂₀值，根据公式：酶活Miller Unit=1000×OD_420nm/(OD_600nm×t×V)(t，反应时间；V，反应中菌液体积)，计算β-半乳糖苷酶的活性。

β-半乳糖苷酶活的定义为每个细胞每分钟分解１μmolONPG所需要的酶量。

以ATCC13032/pXMJ19-lacZ菌体为对照，不同的是用浓度为摩尔浓度为0.1、1.0、2.0ｍM的IPTG诱导，计算酶活。

ATCC13032/pWYE1088-lacZ经浓度为2%、1%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%（质量百分含量）的阿拉伯糖诱导后的β-半乳糖苷酶的活性结果如图6所示，浓度为2%、1%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%、0.02%、0.005%、0.002%、0.001%的阿拉伯糖诱导后的β-半乳糖苷酶的活性分别为651.2、664.2、645.7、660.1、449.3、392.3、405.8、307.6、263.8、109.3、30.3、9.3Miller Unit；可以看出，lacZ基因的表达水平的调控依赖于阿拉伯糖的诱导浓度，可以在0.001％-0.4％的阿拉伯糖浓度范围内实现有效的诱导表达（图6）。

ATCC13032/pXMJ19-lacZ菌体诱导的酶活如图7所示，用摩尔浓度为0.1、1.0、2.0ｍM的IPTG诱导ATCC13032/pXMJ19-lacZ菌体的酶活分别为38.8、175.3、204.7Miller Unit，用摩尔浓度0.1ｍM、1.0ｍM、2.0ｍM的阿拉伯糖诱导ATCC13032/pWYE1088-lacZ菌体的酶活分别为74.6、382.6、421.5Miller Unit，可以看出，ATCC13032/pWYE1088-lacZ的β-半乳糖苷酶表达水平高于目前广泛使用的P_tac启动子（ATCC13032/pXMJ19-lacZ菌体）2倍。

将ATCC13032/pWYE1088-lacZ菌分别在含有200mM葡萄糖、蔗糖、果糖、葡萄糖酸、核糖为碳源的无机盐培养基CGX（20g(NH₄)₂SO₄，0.5g KH₂PO₄，0.5g K₂HPO₄，0.25g MgSO₄·7H₂O，10mg FeSO₄·7H₂O，0mg MnSO₄·H₂O，1mg ZnSO₄·7H₂O，0.2mg CuSO₄，0.02mg NiCl₂，0.2mg生物素）中进行培养，用质量百分比浓度为0.1％和0.2％的阿拉伯糖诱导ATCC13032/pWYE1088-lacZ菌体的酶活结果如表2所示，可以看出，该启动子的诱导表达不受其它碳源的抑制调节。

表2不同碳源对阿拉伯糖启动子表达的影响

二、利用载体pWYE1088中的P_BAD启动子和pXMJ19的P_tac启动子调节upp基因的表达

1、载体的构建

根据已知谷氨酸棒杆菌ATCC13032的序列（GenBank登陆号：NC_003450）分别设计针对upp基因的上游引物WZ739和下游引物WZ740，同时在引物两端引入HindIII和EcoRI的酶切位点。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体为模板，上述WZ739和WZ740为引物，扩增得到717bp的含有upp基因的PCR产物，经过测序为序列3自5’末端第727-1362位核苷酸。

将含有upp基因的PCR产物用HindIII和EcoRI酶进行酶切处理，pWYE1088载体用同样的酶进行酶切处理，酶切反应体系为：10×buffer 10μL，HindIII 5μL，EcoRIμL，含有upp基因的PCR产物（pWYE1088载体）30-50μL，H₂O补至100μL。在T4连接酶的作用下将消化的含有upp基因序列的PCR产物和酶切处理的pWYE1088质粒，4℃连接过夜，反应体系如下：10×连接buffer 1μL，upp基因的PCR酶切回收产物5μL，pWYE1088质粒回收产物1μL，T4DNA连接酶1μL，H₂O补至10μL。将连接产物转化DH5α感受态细胞，鉴定阳性克隆。

提取质粒送去测序，结果为该质粒为将序列3自5’末端第727-1362位核苷酸插入pWYE1088的HindIII和EcoRI酶切位点得到的载体，命名为pWYE1088-upp质粒。

采用同样的方法将序列3自5’末端第727-1362位核苷酸插入pXMJ19的HindIII和EcoRI酶切位点得到的载体，得到pXMJ19-upp质粒。

2、upp基因的表达

ATCC13032Δupp基因突变株通过以下的操作获得：首先，以序列3自5’末端第１-704位的704ｂｐ片段与序列3自5’末端第1474-2139位的666ｂｐ片段为模板，以WZ733CGCGGATCCGCTTCGGCAATCATCAGTC和WZ736CCGGAATTCTGGGTATTTTGCGTCCTC为引物，通过overlape PCR进行扩增，得到1370bp的融合片段，将融合片段插入敲除载体pK18mobsacB（Schafer A.,Tauch A.,Jager W.,Kalinowski J.,Thierbach G,Puhler,A.Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from theEscherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene 1994,145(1):69-73.公众可从中国科学院微生物研究所获得）的BamHI和EcoRI位点间得到敲除载体，将该敲除载体导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032，通过在含有卡那霉素和蔗糖的平板上进行两次筛选得到突变菌株。提取突变菌株的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，将PCR产物进行测序，结果显示该突变菌株基因组中不含有序列3自5’末端第727-1362位的upp基因。

将构建的pXMJ19-upp和pWYE1088-upp质粒，分别电转化入ATCC13032Δupp基因突变株中，得到ATCC13032Δupp/pXMJ19-upp和ATCC13032Δupp/pWYE1088-upp。

将ATCC13032Δupp/pXMJ19-upp和ATCC13032Δupp/pWYE1088-upp的单菌落分别接种于LB液体培养液中，30℃摇菌过夜。收集菌体，用2mM磷酸缓冲液洗涤菌体两次，经菌体用磷酸缓冲液稀释到OD₆₀₀达到0.1，得到ATCC13032Δupp/pXMJ19-upp菌液和ATCC13032Δupp/pWYE1088-upp菌液。

取100uL的菌液分别涂布在含有20μM的5-氟尿嘧啶的无机盐培养基CGX（20g(NH₄)₂SO₄，0.5g KH₂PO₄，0.5g K₂HPO₄，0.25g MgSO₄·7H₂O，10mg FeSO₄·7H₂O，0mg MnSO₄·H₂O，1mg ZnSO₄·7H₂O，0.2mg CuSO₄，0.02mgNiCl₂，0.2mg生物素，4g/L葡萄糖）上。分别添加1mM的IPTG（诱导pXMJ19-upp）和阿拉伯糖（诱导pWYE1088-upp）诱导upp基因的表达。结果如图8显示，在不添加IPTG的条件下，将ATCC13032Δupp/pXMJ19-upp菌液在含有5-氟尿嘧啶的无机盐培养基上的生长明显受到抑制，而在不添加阿拉伯糖的条件下，ATCC13032Δupp/pWYE1088-upp菌液能够正常生长，证明阿拉伯糖启动子在诱导剂不存在的条件下可以严紧的抑制目的基因的表达。当添加阿拉伯糖时，upp基因的诱导表达使得重组菌不能够在含有5-氟尿嘧啶的无机盐培养基上生长。

三、流式细胞仪分析绿色荧光蛋白（GFP）在细胞群体中的表达

1、构建携带绿色荧光蛋白的表达载体pWYE1067-gfp和pWYE1088-gfp

根据已知含有绿色荧光蛋白基因序列的质粒pAD123分别设计针对gfpmut3a基因的上游引物WZ743和下游引物WZ746，同时在引物两端引入HindIII和EcoRI的酶切位点。

以pAD123质粒（Dunn,A.K.,Handelsman J.A vector for promoter trappingin Bacillus cereus.Gene 1999,226(2):297-305.公众可从中国科学院微生物研究所获得）DNA为模板，上述WZ743和WZ746为引物，扩增717bp的gfpmut3a基因序列，经过测序，其核苷酸序列为序列4。

将gfpmut3a基因的PCR产物用HindIII和EcoRI酶进行酶切处理，pWYE1088载体用同样的酶进行酶切处理，酶切反应体系为：10×buffer 10μL，HindIII 5μL，EcoRI 5μL，gfpmut3a基因的PCR产物（pWYE1088载体）30-50μL，H₂O补至100μL。在T4连接酶的作用下连接消化的gfpmut3a基因序列的PCR产物和酶切处理的pWYE1088质粒，4℃连接过夜，反应体系如下：10×连接buffer 1μL，gfpmut3a基因的PCR酶切回收产物5μL，pWYE1067或pWYE1088质粒回收产物1μL，T4DNA连接酶1μL，H₂O补至10μL。将连接产物转化DH5α感受态细胞，鉴定阳性克隆。

提取质粒送去测序，结果为该质粒为将序列4插入pWYE1088的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pWYE1088-gfpmut3a质粒。

2、流式细胞仪测定绿色荧光蛋白的表达

将pWYE1088-gfpmut3a质粒转入ATCC13032中，得到ATCC13032/pWYE1088-gfpmut3a。

将ATCC13032/pWYE1088-gfpmut3a在LB液体培养基中，于30℃振荡培养。当OD₆₀₀值达到0.4，在培养中分别添加质量百分含量为0％，0.002％，0.02％，0.02％和0.2％的阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的合成。在诱导2h后，收集菌体。用磷酸缓冲液洗涤菌体两次，悬浮菌体至OD₆₀₀值为0.2。用流式细胞仪在488nm波长下计数50，000个。

结果如图9所示，当表达阿拉伯糖转运蛋白时，即使在低浓度阿拉伯糖诱导条件下，绿色荧光蛋白能够在谷氨酸棒杆菌的群体中进行均一性表达。

四、应用阿拉伯糖诱导表达载体pWYE1088进行谷氨酸棒杆菌的谷氨酸发酵

1、构建携带odhI基因的表达载体pWYE1088-odhI

根据已知谷氨酸棒杆菌基因组的序列（GenBank登陆号：NC_003450），分别设计针对odhI基因的上游引物WZ741,在该引物5-端引入HindIII酶切位点；下游引物WZ742,在该引物5-端引入EcoRI酶切位点。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，上述WZ741和WZ742为引物，扩增432bpodhI基因，经过测序为序列5。

PCR反应体系组成如下：模板1μL,10×buffer 10μL,dNTP 8μL,引物F 1μL,引物R 1μL,Pyrobest^TM Taq 1μL,H₂O补至100μL。PCR反应程序：94℃预变性3min,1个循环；94℃40s，54℃40s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。将odhI基因的PCR产物用酶HindIII和EcoRI进行酶切消化，同时将pWYE1088质粒用同样的内切酶进行酶切消化，37℃作用3h。在T4连接酶的作用下连接消化的odhI基因的PCR产物和酶切处理的pWYE1088质粒，4℃连接过夜。将连接产物转化ATCC13032感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml的LB液体培养基在37℃继续培养，然后提取质粒。将该质粒送去测序，结果为该质粒为将序列5插入pWYE1088质粒的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pWYE1088-odhI。将含有该质粒的阳性克隆命名为ATCC13032/pWYE1088-odhI。

采用同样的方法将序列5插入pXMJ19的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pXMJ19-odhI质粒，将pXMJ19-odhI质粒导入ATCC13032中，得到ATCC13032/pXMJ19-odhI。

2、谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵

将分别ATCC13032/pXMJ19-odhI和ATCC13032/pWYE1088-odhI的单菌落接种于CGIII斜面培养基（每升含有10g蛋白胨，10g酵母提取物，25g氯化钠20g葡萄糖），30℃培养过夜。从斜面培养基中挑一满环菌接种于30ml CGIII液体培养基中振荡培养16h。以5％接种量接菌于30ml CGX液体培养基中，该培养基中每升含有：20g(NH₄)₂SO₄，0.5g KH₂PO₄，0.5g K₂HPO₄，0.25g MgSO₄·7H₂O，10mg FeSO₄·7H₂O，0mg MnSO₄·H₂O，1mg ZnSO₄·7H₂O，0.2mg CuSO₄，0.02mg NiCl₂，0.2mg生物素。4g/L葡萄糖作为底糖，添加2%CaCO₃自动调节发酵液中的pH值。细胞的生长通过监测600nm的光密度值，葡萄糖的浓度通过SBA-40D生物传感仪进行测定，通过2,4-二硝基氟苯柱前衍生的方法，利用高效液相色谱对发酵液上清进行谷氨酸的测定。

发酵结果如图10所示，A为ATCC13032/pXMJ19-odhI的发酵结果，B为ATCC13032/pWYE1088-odhI的发酵结果，在非生物素限制条件下，当1ｍＭIPTG诱导表达odhI基因时，谷氨酸棒杆菌能够积累4.6mM的谷氨酸；而当1ｍＭ阿拉伯糖诱导表达odhI基因时，谷氨酸棒杆菌能够积累6.3mM的谷氨酸。

Claims (10)

1.一种DNA片段，依次包括谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom、阿拉伯糖转运蛋白基因araE、调控蛋白基因araC、调控蛋白基因启动子P_c、阿拉伯糖启动子P_BAD；

所述谷氨酸棒杆菌的组成型启动子P_hom为序列表中序列1自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述阿拉伯糖转运蛋白基因araE为序列表中序列1自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述调控蛋白基因araC为序列表中序列1自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述调控蛋白基因启动子P_c为序列表中序列1自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述阿拉伯糖启动子P_BAD为序列表中序列1自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的双链DNA片段。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：

所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第5239-8046位。

3.一种表达载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌ori pUC、谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1、氯霉素抗性基因cat、权利要求1或2所述的DNA片段和转录终止子rrnB；

所述大肠杆菌ori pUC的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第967-1539位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述谷氨酸棒杆菌的复制起点ori pBL1为序列表中序列1自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述氯霉素抗性基因cat为序列表中序列1自5’末端第4410-5069位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述转录终止子rrnB为序列表中序列1自5’末端第67-492位核苷酸所示的双链DNA片段。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：

在所述DNA片段的阿拉伯糖启动子P_BAD和所述转录终止子rrnB之间还包括多克隆位点，所述多克隆位点自5’末端至3’末端依次为HindIII、PstI、SalI、XbaI、BamHI、AvaI、XmaI、SmaI、EcoRI。

5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。

6.一种制备权利要求3-5任一所述表达载体的方法，包括如下步骤：将序列1自5’末端第5239-8046位核苷酸插入pXMJ19中得到的载体。

7.权利要求3或4所述的表达载体在表达外源基因中的应用；

所述外源基因为β-半乳糖苷酶基因、upp基因、绿色荧光蛋白编码基因、odhI基因；

所述β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2；

所述upp基因的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第727-1362位核苷酸；

所述绿色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4；

所述odhI基因的核苷酸序列为序列表中的序列5。

8.一种重组载体，为将序列表中的序列5插入权利要求3或4所述的表达载体中得到的载体。

9.含有权利要求8所述重组载体的重组菌。

10.权利要求9所述的重组菌在制备谷氨酸中的应用。

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