CN104271754A - 氨基酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
通过在培养基中培养如下棒状细菌,使选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸在培养物中生成并累积,并从该培养物中收集该氨基酸,由此可以高效地制造该氨基酸,在所述棒状细菌中,通过向亲株的染色体DNA上存在的编码具有L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-鸟氨酸摄取活性的蛋白质的1个以上基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,并且所述棒状细菌能够生产该氨基酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用具有生成并累积选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的能力的棒状细菌(coryneform bacterium)进行的该氨基酸的制造方法。
背景技术
已知在氨基酸的发酵生产中,使氨基酸向细胞内的摄取活性降低或丧失时,可以防止排出到微生物的细胞外的氨基酸再次摄取到细胞内并被代谢,因此其生产率提高。
例如,关于L-谷氨酸,报道了一种使用使L-谷氨酸向细胞内的摄取活性降低或丧失的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的L-谷氨酸的制造方法(专利文献1)。另外,关于芳香族氨基酸,报道了一种使用使芳香族氨基酸向细胞内的摄取活性降低或丧失的谷氨酸棒杆菌的芳香族氨基酸的制造方法(专利文献2)。
作为具有氨基酸向细胞内的摄取活性的蛋白质,在大肠杆菌中,鉴定有3种L-精氨酸向细胞内的周质结合蛋白依赖型摄取蛋白质(非专利文献1)。
在棒状细菌中,报道了具有L-甲硫氨酸及L-丙氨酸(非专利文献2)、L-谷氨酸(非专利文献3及非专利文献4)、L-异亮氨酸(非专利文献5)、芳香族氨基酸(非专利文献6)、L-赖氨酸(非专利文献7)等氨基酸向细胞内的摄取活性的蛋白质。
然而,关于谷氨酸棒杆菌的NCgl1278、NCgl1277及NCgl1276,在非专利文献8中仅描述了,其分别被命名为BAB98725、BAB98724、BAB98723,并基于已知的氨基酸序列的同源性被分类为ATP结合盒(ABC)超家族,而未报道这些蛋白质具有氨基酸的摄取活性。另外,也没有通过使这些蛋白质的活性降低或丧失而使氨基酸的生产率提高这样的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2000-270872号公报
专利文献2:日本专利第3036819号公报
非专利文献
非专利文献1:THE JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,2007年,第373卷,P251~P267
非专利文献2:BIOCHEMISTRY,2008年,第47卷,第48期,p12698~p12709
非专利文献3:APPLLIED MICROBIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY,2003年,第60卷,第6期,p738~p742
非专利文献4:THE JOURNAL OF BACTERIOLOGY,1995年,第177卷,第5期,p1152~p1158
非专利文献5:ARCHIVES OF MICROBIOLOGY,1998年,第169卷,第4期,p303~p312
非专利文献6:THE JOURNAL OF BACTERIOLOGY,1995年,第177卷,第20期,p5991~p5993
非专利文献7:MOLECULAR MICROBIOLOGY,1991年,第5卷,第12期,p2995~p3005
非专利文献8:HANDBOOK OF CORYNEBACTERIUMGLUTAMICUM,2005年,p165,由L.EGGELING和M.BOTT编辑,CRC PRESS
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于,通过使棒状细菌的选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失而使该氨基酸的生产效率提高。
用于解决课题的手段
本发明涉及以下的(1)~(4)。
(1)一种选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的制造方法,其特征在于,在培养基中培养如下棒状细菌,使选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸在培养物中生成并累积,并从该培养物中收集该氨基酸,在所述棒状细菌中,通过向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由以下[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,并且所述棒状细菌能够生产该氨基酸,
[1]具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质
[2]具有序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质
[3]具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质
[4]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质
[5]由与序列号3所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质
[6]由与序列号4所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质。
(2)如上述(1)所述的制造方法,其特征在于,通过向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由上述(1)的[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,且能够生产该氨基酸的棒状细菌为向亲株的染色体DNA上存在的选自由以下[7]~[9]组成的组中的DNA中引入了1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加的棒状细菌,
[7]具有序列号1所示的核苷酸序列的DNA
[8]与由与序列号1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA在严格条件下杂交,且编码具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质的DNA
[9]由与序列号1所示的核苷酸序列具有80%以上一致性的核苷酸序列构成,且编码具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质的DNA。
(3)如上述(1)或(2)所述的制造方法,其中,棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。
(4)如上述(1)~(3)中任一项所述的制造方法,其中,氨基酸为L-精氨酸或L-瓜氨酸。
发明效果
根据本发明,提供一种使用如下棒状细菌进行的选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的制造方法,所述棒状细菌与亲株相比选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,由此使该氨基酸的生产率提高。
具体实施方式
1.本发明中所使用的棒状细菌
本发明中所使用的棒状细菌为向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由以下[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,且能够生产该氨基酸的棒状细菌,
[1]具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质
[2]具有序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质
[3]具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质
[4]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质
[5]由与序列号3所示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质
[6]由与序列号4所示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质。
另外,作为本发明中所使用的棒状细菌,可以举出向亲株的染色体DNA上存在的选自由以下[7]~[9]组成的组中的DNA中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,该氨基酸的摄取活性降低或丧失,且能够生产该氨基酸的棒状细菌,
[7]具有序列号1所示的核苷酸序列的DNA
[8]与由与序列号1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA在严格条件下杂交,且编码具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质的DNA
[9]由与序列号1所示的核苷酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上一致性的核苷酸序列构成,且编码具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质的DNA。
由序列号2、3和4所示的氨基酸序列构成的蛋白质分别由由序列号1的301~1164、1312~2157和2173~2925所示的核苷酸序列构成的DNA编码。
在本说明书中,基因是指除蛋白质的编码区以外可以含有转录调控区及启动子区等的DNA。
作为转录调控区,可以举出自染色体DNA上的编码区的5’末端起由上游侧100个核苷酸、优选50个核苷酸构成的DNA,作为启动子区,可以举出对应于-10及-35区的区域。
与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,且能够生产该氨基酸的棒状细菌可以举出:通过向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由上述[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中或选自由上述[7]~[9]组成的组中的DNA中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加而得到的(a)与亲株相比,由该基因或该DNA编码的蛋白质的比活性降低到80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的棒状细菌,及(b)与亲株相比,该基因或该DNA的转录量、或者由该基因或该DNA编码的蛋白质的生产量降低到80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的棒状细菌。更优选可以举出该基因或该DNA的一部分或全部缺失的棒状细菌。
向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由上述[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因或选自由上述[7]~[9]组成的组中的DNA中引入的1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,只要是与亲株相比使由该基因或该DNA编码的蛋白质的摄取活性降低或丧失的1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,则核苷酸的种类及数量就没有限制,但是作为核苷酸的缺失,可以举出启动子及转录调控区中1个以上核苷酸、优选10个以上核苷酸、更优选20个以上核苷酸、进一步优选全部区域的缺失,编码区中1个以上核苷酸、优选10个以上核苷酸、更优选20个以上核苷酸、进一步优选100个以上核苷酸、特别优选200个以上核苷酸、最优选编码区全部的缺失。
作为1个以上的核苷酸的取代,可以举出取代自编码区的5’末端起第150个以内的核苷酸、优选第100个以内的核苷酸、更优选第50个以内的核苷酸、特别优选第30个以内的核苷酸、最优选第20个以内的核苷酸从而引入无义密码子的取代。
作为1个以上的核苷酸的添加,可以举出紧接在自编码区的5’末端起第150个以内的核苷酸、优选第100个以内的核苷酸、更优选第50个以内的核苷酸、特别优选第30个以内的核苷酸、最优选第20个以内的核苷酸之后添加1个以上核苷酸、优选50个以上核苷酸、更优选100个以上核苷酸、进一步优选200个以上核苷酸、特别优选500个以上核苷酸、最优选1kb以上的DNA片段,最优选可以举出氯霉素抗性基因及卡那霉素抗性基因等的插入。
在本说明书中,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性是指将选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸、优选L-精氨酸或L-瓜氨酸、更优选L-精氨酸从棒状细菌的细胞外摄取到细胞内的活性。
与亲株相比该氨基酸的摄取活性降低可以通过如下来确认:利用Northern印迹分析或者RT-PCR对编码选自由上述[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因或选自由上述[7]~[9]组成的组中的DNA的转录物量进行定量,并与亲株进行比较,或者利用SDS-PAGE或使用抗体的测定法对由该基因或该DNA编码的蛋白质的生产量进行定量,并与亲株进行比较,等等。
另外,在以该氨基酸为单一碳源在琼脂培养基上培养时,根据一定时间后的菌落的直径与亲株相比小、或没有生长,可以确认与亲株相比该氨基酸的摄取活性降低或丧失。
氨基酸序列或核苷酸序列的一致性可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST[PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OFSCIENCES,1993年,第90卷,第12期,p5873~p5877]或FASTA[METHODS IN ENZYMOLOGY,1990年,第183卷,p63~p98]确定。基于该算法BLAST,开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY,1990年,第215卷,p403~p410]。在基于BLAST利用BLASTN分析核苷酸序列的情况下,参数设为例如Score=100、wordlength=12。另外,在基于BLAST利用BLASTX分析氨基酸序列的情况下,参数设为例如score=50、wordlength=3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下,使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是众所周知的。
上述所谓的“杂交”是指在特定的条件下DNA与具有特定核苷酸序列的DNA或该DNA的一部分杂交。因此,该具有特定核苷酸序列的DNA或该DNA的一部分的核苷酸序列作为Northern印迹分析或Southern印记分析的探针是有用的,或者可以为具有能够用作PCR分析的寡核苷酸引物的长度的DNA。作为用作探针的DNA,可以举出至少100个以上核苷酸、优选200个以上核苷酸、更优选500个以上核苷酸的DNA,但是可以为至少10个以上核苷酸、优选15个以上核苷酸的DNA。
DNA的杂交实验的方法是众所周知的,可以按照例如分子克隆第2版、第3版(2001年),METHODS FOR GENERAL AND MOLECULARBACTERIOLGY,ASM PRESS(1994年),或IMMUNOLOGYMETHODS MANUAL,ACADEMIC PRESS(MOLECULAR)中的记载,以及大量其它的标准教科书确定杂交的条件而进行实验。
另外,也可以通过按照市售的杂交试剂盒附带的说明书获得在严格条件下杂交的DNA。作为市售的杂交试剂盒,可以举出例如利用随机引物法制作探针,并在严格条件下进行杂交的随机引物DNA标记试剂盒(Roche Diagnostics公司制)等。
上述的严格条件可以举出例如将固定有DNA的过滤器和探针DNA在42℃下在含有50%甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特(Denhardt)溶液、10%的硫酸右旋糖苷、及20μg/L的改性鲑鱼精子DNA的溶液中培养一晚,然后在例如约65℃的0.2×SSC溶液中清洗该过滤器的条件。
上述的各种条件也可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的阻断试剂来设定。为了使条件适合,上述阻断试剂的添加可以伴随杂交条件的改变。
作为能够在上述严格条件下杂交的DNA,可以举出例如在使用上述BLAST及FASTA等程序基于上述参数计算时,由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上一致性的核苷酸序列构成的DNA。
在本说明书中,亲株是指作为基因改造及转化等的对象的原株。作为通过基因引入进行转化的对象的原株也称为宿主株。
能够生产该氨基酸是指在培养基中培养本发明中所使用的棒状细菌时,具有达到能够从细胞或培养基中回收该氨基酸的程度的生产该氨基酸能力。
作为能够生产该氨基酸的棒状细菌,在亲株原本具有该性质的情况下,可以举出强化了该性质的棒状细菌;在亲株不具有该性质的情况下,可以举出人工赋予了该性质的棒状细菌。
作为本发明中所使用的棒状细菌,可以举出属于棒杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属或微杆菌(Microbacterium)属的棒状细菌。
作为属于棒杆菌属的微生物,可以举出:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)等,具体而言,可以举出:谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13060、谷氨酸棒杆菌ATCC13826(旧属种黄色短杆菌(Brevibacterium flavum))、谷氨酸棒杆菌ATCC14020(旧属种叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum))、谷氨酸棒杆菌ATCC13869(旧属种乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum))、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、醋谷氨酸棒杆菌ATCC15806、帚石南棒杆菌ATCC15991、力士棒杆菌ATCC13868、百合棒杆菌ATCC15990、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、嗜热产氨棒杆菌ATCC9244等。
作为属于短杆菌属的微生物,可以举出:解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、未成熟短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等,具体而言,可以举出:解糖短杆菌ATCC14066、未成熟短杆菌ATCC14068、玫瑰色短杆菌ATCC13825、生硫短杆菌ATCC19240等。
作为属于微杆菌属的微生物,可以举出嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)等,具体而言,可以举出嗜氨微杆菌ATCC15354等。
2.本发明中所使用的棒状细菌的制造方法
本发明中所使用的棒状细菌可以通过向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由上述[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中或选自由上述[7]~[9]组成的组中的DNA中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,并选择出由此选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的生产量与亲株相比提高了的棒状细菌来制造。
向亲株的染色体DNA上存在的基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加只要是通常的突变处理法、利用重组DNA技术等的基因置换法、细胞融合法或者转导法等可以向棒状细菌的染色体DNA中引入突变的方法就没有限定。
亲株只要是具有生产该氨基酸的能力、且具有该氨基酸的摄取活性的棒状细菌,则可以是野生株,也可以是由该野生株通过人工育种而得到的育种株。
作为人工赋予棒状细菌生成该氨基酸的能力的方法,可以举出:
(a)缓解或消除控制该氨基酸的生物合成的至少一种机制的方法、
(b)强化表达参与该氨基酸的生物合成的至少一种酶的方法、
(c)增加参与该氨基酸的生物合成的至少一种酶基因的拷贝数的方法、
(d)弱化或阻断由该氨基酸的生物合成路径分支到该目标物质以外的代谢产物的至少一个代谢路径的方法、及
(e)选择与野生型株相比对该氨基酸的类似物的抗性度高的细胞株的方法,等;
上述公知的方法可以单独或组合使用。
关于利用上述(a)~(e)中任一者或组合的方法制备具有生产该氨基酸的能力的棒状细菌的方法,在Biotechnology第二版,第6卷,Products of Primary Metabolism(VCH Verlagsgesellschaft mbH,Weinheim,1996)section 14a,14b或Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,79,1-35(2003),Agric.Biol.Chem.,51,2089-2094(1987)、氨基酸发酵、学会出版中心、相田浩等(1986)中记载有大量的例子,另外,除上述以外,具体的制备具有生产氨基酸的能力的棒状细菌的方法在日本特开2003-164297、Agric.Biol.Chem.,39,153-160(1975)、Agric.Biol.Chem.,39,1149-1153(1975)、日本特开昭58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.,4,272-283(1958)、日本特开昭63-94985、Agric.Biol.Chem.,37,2013-2023(1973)、WO97/15673、日本特开昭56-18596、日本特开昭56-144092、日本特表2003-511086及WO2006/001380等中也有大量的报道,可以通过参照上述文献等制备具有生产该氨基酸的能力的棒状细菌。
作为可以通过上述方法制备的具有生产L-精氨酸的能力的棒状细菌,可以举出例如:赋予了D-精氨酸抗性及精氨酸氧肟酸抗性的谷氨酸棒杆菌[AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY,1972年,第36卷,第10期,p1675~p1684]、引入了使argR基因缺失的突变的谷氨酸棒杆菌[日本特开2002-51790号]。
作为具有生产L-鸟氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸的能力的棒状细菌,可以举出例如通过赋予引起arg操纵子的去抑制这样的使argR基因缺失的突变和引起乙酰谷氨酸激酶的脱敏这样的argB基因突变,从而使L-鸟氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸的生产率提高的谷氨酸棒杆菌[W2006/035831;及APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2009年,第75卷,第6期,p1635~p1641]。
作为可以用于制备上述具有生产氨基酸能力的棒状细菌的棒状细菌,只要是可以应用上述(a)~(e)的方法的棒状细菌或具有上述遗传性状的棒状细菌就可以为任一者,可以优选举出上述的属于棒杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属或微杆菌(Microbacterium)属的棒状细菌。
作为突变处理法,可以举出例如:使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的方法(微生物实验手册,1986年,131页,讲谈社科技公司)、紫外线照射法等。
作为利用重组DNA技术向编码选自由上述[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因或选自由上述[7]~[9]组成的组中的DNA中引入1个以上的核苷酸的取代、缺失或添加的基因置换法,可以举出利用同源重组等将该基因整合到亲株的染色体中,进而利用同源重组等置换染色体上本来存在的该基因的方法。
作为向该基因中引入1个以上的核苷酸的取代、缺失或添加的方法,除此以外,还可以举出根据Molecular cloning:a laboratory manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)[以下简称为分子克隆第3版],Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下简称为当代分子生物学实验指南),Nucleic AcidsResearch,10,6487(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982),Gene,34,315(1985),Nucleic Acids Research,13,4431(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等中记载的位点特异性诱变法的方法。
利用重组DNA技术的基因置换可以按照J.Bacteriol.,182,6884(2000)等中记载的方法进行。
通过将引入了突变的基因插入至适当的质粒载体等中来制作重组体质粒。作为质粒载体,可以使用例如在亲株中无法自主复制,且具有对抗生素的抗性标记基因及枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶基因sacB[Mol.Microbiol.,6,1195(1992)]的质粒。
作为将该重组体质粒引入亲株的方法,只要是可以将DNA引入棒状细菌的方法就都可以使用,可以举出例如:电穿孔法[Appl.Microbiol.Biotech.,52,541(1999)]、原生质体法[J.Bacteriol.,159,306(1984)]等。
该重组体质粒由于在亲株中无法自主复制,因此,可以通过获得对与该重组体质粒具有的抗生素抗性标记对应的抗生素显示抗性的菌株,来获得该重组体质粒整合到染色体中而得到的转化株。
另外,可以通过利用与引入了突变的基因一同整合到染色体上的枯草杆菌果聚糖蔗糖酶生产自杀底物的选择法[J.Bacteriol.,174,5462(1992)],来获得亲株的染色体上的该基因被引入了突变的基因置换的菌株。
可以通过以上的方法进行亲株的染色体上的基因置换,但不限于上述的方法,只要是能够置换棒状细菌的染色体上的基因的方法就也可以使用其它的基因置换法。
作为向亲株的染色体上的基因中引入取代、缺失或添加的方法,除此以外还可以举出细胞融合法、转导法,可以举出例如相田浩等人编“氨基酸发酵”,1986年,学会出版中心中记载的方法等。
引入突变的核苷酸的数量及位点如上述1中所记载。
通过向亲株的染色体上的基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加可以以高概率使该基因编码的蛋白质的活性降低或丧失[An Introduction to Genetic Analysis,第7版,Griffiths AJF、Miller JH、Suzuki DT等人.New York:W.H.Freeman;2000]。
编码上述[1]~[6]的蛋白质的基因可以通过例如将由属于棒状细菌的微生物按照齐藤等人的方法[BIOCHIMICA ET BIOPHYSICAACTA,1963年,第72卷,p619~p629]制备的染色体DNA用作模板,将基于序列号1的2173~2925、序列号1的1312~2157或序列号1的301~1164所示的核苷酸序列设计、合成的寡DNA用作引物并利用PCR而获得。
作为可获得的具体的基因,可以举出:具有序列号1的2173~2925所示的核苷酸序列的NCgl1276、具有序列号1的1312~2157所示的核苷酸序列的NCgl1277及具有序列号1的301~1164所示的核苷酸序列的NCgl1278等。
需要说明的是,在2个以上基因在染色体上相邻或包含在操纵子DNA中的情况下,该2个以上基因也可以通过例如将基于序列号1所示的核苷酸序列设计、合成的寡DNA用作引物并利用PCR以1个DNA的形式获得。
另外,通过以上述的DNA的一部分或全部为探针的杂交法、或利用公知的方法化学合成具有该核苷酸序列的DNA的方法等也可以获得。
另外,对各种基因序列数据库检索与编码序列号2、序列号3或序列号4所示的氨基酸序列的DNA的核苷酸序列具有85%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上同源性或一致性的序列,并基于通过该检索所得到的核苷酸序列由具有该核苷酸序列的生物的染色体DNA、cDNA文库等通过上述的方法也可以获得。
DNA的核苷酸序列可以通过使用通常所使用的核苷酸序列的分析方法,例如双脱氧法[PROCEEDINGS OF THE NATIONALACADEMY OF SCIENCES,1977年,第74卷,第12期,p5463~p5467]、373A DNA序列分析仪(Perkinelmer公司制)等核苷酸序列分析装置进行分析来确定。
在确定核苷酸序列的结果是所获得的DNA为部分长度DNA的情况下,可以通过将该部分长度DNA用作探针的针对染色体DNA文库的Southern杂交法等获得全长DNA。
氨基酸向细胞内的摄取活性的测定可以根据THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY,1971年,第246卷,第11期,p3653~p3662中所记载的方法进行。
利用以上的方法可以制备本发明的制造方法中所使用的棒状细菌。
3.本发明的L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸的制造方法
在培养基中培养可以通过上述的方法制备的棒状细菌,使选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸在培养物中生成、累积,并从该培养物中收集该氨基酸,由此可以制造该氨基酸。
本发明的制造方法中所使用的培养基只要含有碳源、氮源、无机盐等本发明的微生物的增值、以及选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的氨基酸的生物合成所需要的营养物质,则可以为合成培养基、天然培养基中的任一者。
作为碳源,只要是使用的微生物能够同化的碳源就可以为任意一种,可以举出例如:葡萄糖、糖蜜、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解物等糖类;乙醇、甘油等醇类;醋酸、乳酸、琥珀酸等有机酸类等。
作为氮源,可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机及有机铵盐类;尿素、胺等氮化合物;以及肉提取物、酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、大豆水解物等含氮有机物。
作为无机盐,可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、碳酸钙等。
此外,可以根据需要加入生物素、硫胺、烟酰胺、烟酸等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸等培养基添加物替代。另外,可以根据需要添加本发明的微生物生长所需要的物质(例如如果是氨基酸营养缺陷型微生物则为所需要的氨基酸)。
培养在震荡培养、深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度为20~50℃,优选为20~42℃,更优选为28~38℃。培养基的pH保持在5~11的范围、优选6~9的中性附近的范围进行培养。培养基的pH的调节使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨、pH缓冲液等进行。
培养时间为5小时~6天,优选为16小时~3天。
在培养物中累积的该氨基酸可以通过通常的纯化方法来收集。例如L-精氨酸可以通过在培养后,利用离心分离等除去菌体及固体物质,然后组合使用活性炭处理、离子交换树脂处理、浓缩、结晶分离等公知的方法来收集。
下面示出本申请发明的实施例,但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
(1)基因破坏用质粒的构建
将具有赋予对卡那霉素的抗性的基因的质粒pHSG299[GENE,1987年,第61卷,p63~p74]用限制酶PstI消化,在切断位点连接含有源自Bacillus subtilis168株的果聚糖蔗糖酶基因sacB的2.6千碱基(以下简称为kb)的DNA片段[MOLECULAR MICROBIOLOGY,1992年,第6卷,第9期,p1195~p1202],从而得到质粒pESB30。
将pESB30用限制酶BamHI消化,萃取纯化后,将该DNA片段的两末端使用DNA平端化试剂盒(DNA blunting kit、Takara Bio公司制)按照所附的方法进行平滑化。使平滑化的DNA片段在Taq聚合酶(Boehringer Mannheim公司制)及dTTP存在下在70℃反应2小时,在3’末端添加胸腺嘧啶1个碱基,从而制备可以用于PCR片段克隆的DAN片段pESB30-T。
(2)argF基因破坏株生成用质粒的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的染色体DNA为模板,以由序列号5所示的核苷酸序列构成的DNA和由序列号6所示的核苷酸序列构成的DNA为引物组,使用Pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene公司制)及所附的缓冲剂进行PCR。将通过PCR而得到的约1.4kb的DNA片段用BamHI消化,然后进行萃取纯化。
将该DNA片段和预先利用BamHI消化的pUC119(Takara Bio公司制)混合,使用DNA连接反应试剂盒(Takara Bio公司制),进行DNA连接酶反应。使用该反应产物根据分子克隆第3版中记载的方法转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺公司制)。
由该转化体根据碱SDS法(分子克隆第3版中记载的方法)制备质粒。将该质粒利用NcoI消化后,通过进行DNA连接酶反应使其自环化,然后转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺公司制),与上述同样地制备质粒。
对该质粒的结构通过多种限制酶消化模式进行研究,结果确认,该质粒在编码argF的DNA中含有缺失369碱基对的DNA片段。将该质粒用作模板,将由序列号5所示的核苷酸序列构成的DNA及由序列号6所示的核苷酸序列构成的DNA用作引物组,进行PCR,从而得到约1.0kb的DNA片段。使该DNA片段在Taq DNA聚合酶(BoehringerMannheim公司制)及dATP存在下在72℃反应10分钟,在3’末端添加腺嘌呤1个碱基。
将该DNA片段和前面生成的pESB30-T混合,进行DNA连接酶反应。使用该反应产物转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺公司制)从而由所得到的转化体制备质粒。将该质粒命名为pEargF。
(3)argF基因破坏株的制备
使用如上制备的质粒pEargF,根据Rest等人的方法[APPLLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY,1999年,第52卷,第4期,p541~p545]利用电穿孔法转化缺失转座子的谷氨酸棒杆菌ATCC13032株(以下称为DOI-3株),并选择卡那霉素抗性株。
制备该卡那霉素抗性株的染色体DNA,利用Southern杂交(分子克隆第3版)进行研究,结果确认,pEargF通过Campbell类型的同源重组而被整合。
在这样的菌株中,含有染色体上本来存在的argF基因的区域和具有其中pEargF上缺失了argF基因的结构的区域相邻存在,在其之间容易发生第2次的同源重组。
由于sacB基因编码的果聚糖蔗糖酶使蔗糖成为自杀底物,因此,具有sacB基因的微生物在含有蔗糖的培养基中无法生长。但是,在含有染色体上本来存在的argF基因的区域和具有其中pEargF上缺失了argF基因的结构的区域之间发生了第2次同源重组的菌株中,任一DNA区域均与sacB一同脱落缺失,因此,该菌株在含有蔗糖的培养基中也可以生长。这样可以得到具有缺失了染色体DNA上本来存在的argF基因的结构的微生物。
利用这个将上述转化株涂布在蔗糖琼脂培养基[在水1L中含有100g蔗糖、7g肉提取物、10g蛋白胨、3g氯化钠、5g酵母提取物(Difco公司制)、及15g细菌培养用琼脂(Difco公司制)的调节为pH 7.2的培养基]上,在30℃下培养1天并选择生长的菌落。将该菌株命名为DOI-3argF株。
(4)argF基因破坏株的营养缺陷型的确认
DOI-3argF株在argF基因内具有缺失,因此为L-瓜氨酸及L-精氨酸营养缺陷型。这根据DOI-3argF株在基本培养基中不生长,但是在基本培养基中添加了50mg/L的L-精氨酸或50mg/L的L-瓜氨酸的培养基中生长得到确认。
实施例2
(1)NCgl1278基因破坏株生成用质粒的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的染色体DNA为模板,以由序列号7所示的核苷酸序列构成的DNA和由序列号8所示的核苷酸序列构成的DNA为反应1的引物组,以由序列号9所示的核苷酸序列构成的DNA和由序列号10所示的核苷酸序列构成的DNA为反应2的引物组,独立地进行反应1和反应2的PCR。
将通过PCR所得到的约1.0kb的DNA片段萃取、纯化。以由反应1所得到的DNA片段和由反应2所得到的DNA片段为模板DNA,以由序列号7所示的核苷酸序列构成的DNA和由序列号10所示的核苷酸序列构成的DNA为反应3的引物组,进行PCR。将通过PCR所得到的约1.0kb的DNA片段纯化,用限制酶FbaI消化,并再次纯化。
将该DNA片段和预先利用限制酶BamHI消化并利用碱性磷酸酶(Takara Bio公司制)脱磷酸化的pESB30混合,进行DNA连接酶反应。用该反应产物转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺公司制),并由该转化株制备质粒。将该质粒命名为pdel1278。
(2)argF及NCgl1278基因破坏株的制备
使用制备的质粒pdel1278,与实施例1同样地利用电穿孔法转化DOI-3argF株,从而得到卡那霉素抗性株。下面,使用与实施例1中所记载的方法同样的方法制备其中NCgl1278的ORF缺失的菌株,将其命名为DOI-3argF_Del1278株。
(3)NCgl1278基因产物的L-瓜氨酸及L-精氨酸摄取活性的确认
如表1所示,DOI-3argF_Del1278株在含有50mg/L的L-精氨酸的基本培养基琼脂板上或含有50mg/L的L-瓜氨酸的基本培养基琼脂板上不生长,在含有50mg/L的丙氨酰精氨酸的基本培养基琼脂板上生长,因此结论是NCgl1278为编码参与L-精氨酸及L-瓜氨酸向细胞内的摄取的蛋白质的基因。
在非专利文献8中,描述了NCgl1278与作为紧接在下游的2个基因的由序列号1的1312~2157所示的核苷酸序列构成的NCgl1277、由序列号1的2173~2925所示的核苷酸序列构成的NCgl1276一同分类为ATP结合盒(ABC)超家族。
由此启示,NCgl1276、NCgl1277及NCgl1278的基因产物构成分类为ATP结合超家族的转运蛋白,并参与L-精氨酸及L-瓜氨酸向细胞内的摄取活性。
[表1]
基本培养基中添加的氨基酸或二肽 | DOI-3argF株 | DOI-3argF_Del1278株 |
未添加 | × | × |
L-精氨酸 | ○ | × |
L-瓜氨酸 | ○ | × |
L-丙氨酰-L-精氨酸 | ○ | ○ |
○生长、×未生长
实施例3
(1)L-精氨酸生产株的制备
由谷氨酸棒杆菌的L-精氨酸生产菌株RB26株(W2006/035831)制备染色体DNA,以其为模板,以由序列号11所示的核苷酸序列构成的DNA和由序列号12所示的核苷酸序列构成的DNA为引物组进行PCR,从而得到对应于含有argC、argJ及argB基因的全长约3.7kb的区域的DNA片段。表明在RB26株中,argB中含有来自L-精氨酸的反馈抑制效果弱化的突变(A26V)(专利文献3)。
将该3.7kb的DNA片段用限制酶SalI及KpnI消化后,进行纯化,与预先用限制酶SalI及KpnI消化后纯化的质粒pCS299P[APPLLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY,2004年,第63卷,第5期,p592~p601]混合,进行DNA连接酶反应,由此连接而得到质粒pCS_argCJB26。
利用与实施例2中制备DOI-3argF_Del1278株的方法同样的方法,以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为亲株,制备缺失了NCgl1278的菌株,将该菌株命名为ATCC13032_Del1278株。
利用上述质粒pCS_argCJB26将谷氨酸棒杆菌ATCC13032株及ATCC13032_Del1278株通过电穿孔法转化,选择成为卡那霉素抗性的转化株。将这些转化体分别命名为13032/pCS_argCJB26株及13032_Del1278/pCS_argCJB26株。
(2)NCgl1278基因的缺失对L-精氨酸生产造成的影响
将ATCC13032/pCS_argCJB26株及ATCC13032_Del1278/pCS_argCJB26株在含有50mg/L卡那霉素的BY琼脂培养基(在水1L中含有7g肉提取物、10g蛋白胨、3g氯化钠、5g酵母提取物、15g细菌培养用琼脂,调节为pH7.2的培养基)中在30℃培养24小时。
将在含有50mg/L卡那霉素的BY琼脂培养基上生长的菌体分别接种于包含含有50mg/L卡那霉素的种子培养基(在水1L中含有25g蔗糖、20g玉米浆、20g蛋白胨、10g酵母提取物、0.5g七水硫酸镁、2g磷酸二氢钾、3g尿素、8g硫酸铵、1g氯化钠、20mg烟酸、10mg七水硫酸铁、10mg泛酸钙、1mg七水硫酸锌、1mg五水硫酸铜、1mg硫胺盐酸盐、100μg生物素,利用氢氧化钠水溶液调节为pH7.2后,加入碳酸钙10g而得到的培养基)6ml的厚壁试验管,在32℃下震荡的同时培养24小时。
将所得到的种子培养液2mL分别接种于含有基础培养培养基(在水1L中含有60g葡萄糖、5g玉米浆、30g硫酸铵、8g氯化钾、2g尿素、0.5g磷酸二氢钾、0.5g磷酸氢二钾、1g七水硫酸镁、1g氯化钠、20mg七水硫酸铁、20mg烟酸、20mgβ-丙氨酸、10mg五水硫酸锰、10mg硫胺盐酸盐、200μg生物素,利用氢氧化钠水溶液调节为pH7.7后,加入碳酸钙30g而得到的培养基)20mL的带挡板烧瓶,在32℃下震荡的同时培养48小时。
通过离心分离从培养物中除去菌体,将上清液中的L-精氨酸的累积量利用高效液相色谱(HPLC)定量。HPLC分析中,分离柱使用AQ-312(YMC公司制),流动相使用含有柠檬酸钠2.94g/L、硫酸钠1.42g/L、乙腈233mL/L及月桂基硫酸钠3g/L的pH6.0的溶液,在60℃下进行。氨基酸的检测、定量中,将来自分离柱的洗脱液和反应液(含有硼酸18.5g/L、NaOH 11g/L、邻苯二甲醛0.6g/L、巯基乙醇2ml/L及Brige-353mL/L的溶液)混合后,利用激发波长345nm、吸收波长455nm的荧光分析进行。将结果示于表2。
[表2]
菌株 | L-精氨酸累积量(g/L) |
ATCC13032/pCS_argCJB26株 | 1.1±0.09 |
ATCC13032Del1278株/pCS_argCJB26株 | 1.9±0.22 |
产业实用性
利用本发明,可以高效地制造选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸。
序列表独立文本
序列号5-人工序列的说明:合成DNA
序列号6-人工序列的说明:合成DNA
序列号7-人工序列的说明:合成DNA
序列号8-人工序列的说明:合成DNA
序列号9-人工序列的说明:合成DNA
序列号10-人工序列的说明:合成DNA
序列号11-人工序列的说明:合成DNA
序列号12-人工序列的说明:合成DNA
Claims (4)
1.一种选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的制造方法,其特征在于,在培养基中培养如下棒状细菌,使选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸在培养物中生成并累积,并从该培养物中收集该氨基酸,在所述棒状细菌中,通过向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由以下[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,并且所述棒状细菌能够生产该氨基酸,
[1]具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质
[2]具有序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质
[3]具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质
[4]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质
[5]由与序列号3所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质
[6]由与序列号4所示的氨基酸序列具有80%以上一致性的氨基酸序列构成,且具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质。
2.如权利要求1所述的制造方法,其特征在于,通过向亲株的染色体DNA上存在的编码选自由权利要求1的[1]~[6]组成的组中的蛋白质的1个以上基因中引入1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加,由此与亲株相比,选自由L-精氨酸、L-瓜氨酸及L-鸟氨酸组成的组中的1种以上氨基酸的摄取活性降低或丧失,且能够生产该氨基酸的棒状细菌为向亲株的染色体DNA上存在的选自由以下[7]~[9]组成的组中的DNA中引入了1个以上的核苷酸的缺失、取代或添加的棒状细菌,
[7]具有序列号1所示的核苷酸序列的DNA
[8]与由与序列号1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的DNA在严格条件下杂交,且编码具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质的DNA
[9]由与序列号1所示的核苷酸序列具有80%以上一致性的核苷酸序列构成,且编码具有该氨基酸的摄取活性的蛋白质的DNA。
3.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,棒状细菌为谷氨酸棒杆菌。
4.如权利要求1~3中任一项所述的制造方法,其中,氨基酸为L-精氨酸或L-瓜氨酸。
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