BRPI0518589B1 - Bactéria corineforme, e, método para produzir um l-aminoácido - Google Patents

Abstract

bactéria corineforme, e, método para produzir um l-aminoácido são descritas bactérias corineformes que possuem a capacidade para produzir l-aminoácidos e estão modificadas de tal modo que a atividade de acetil-coa hidrolase é diminuída. as bactérias são usadas para produzir l-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário tais como ácido l-glutâmico, l-arginina, l- glutamina, l-prolina, l-alanina, l-valina e l-lisina.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário durante fermentação de bactérias corineformes, particularmente os L-aminoácidos ácido L-glutâmico, L-arginina, L- glutamina, L-prolina, L-valina,L-alanina e L-lisina.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] Um L-aminoácido tal como ácido L-glutâmico é gerado por rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário, e tem sido convencionalmente produzido em uma escala industrial por métodos fermentativos utilizando bactérias corineformes, incluindo Brevibacterium e Corynebacterium que possuem a capacidade de produzir L-aminoácido. Para melhorar a produtividade de L-aminoácido- de bactérias corineformes, cepas isoladas de natureza ou de mutantes artificiais das mesmas têm sido usadas. (JP07-121228B, JP07-121228B, JP06-237779A, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2003;79:59-112. J Biotechnol. 2003 Sep 4;104(1-3):155-72. e WO95/34672).

[003] Quando bactérias aeróbicas, especialmente bactérias corineformes, são cultivadas sob condições limitadas de oxigênio, ácidos orgânicos diferentes da substância alvo, tais como ácido lático e ácido acético, se acumulam em quantidades excessivas como subprodutos. Tal acúmulo inibe o crescimento de bactérias e reduz sobremaneira sua produtividade durante a fermentação. Ainda mais, quantidades em excesso de contra-íons que neutralizam tais ácidos orgânicos são necessárias, o que aumenta o custo de produção. Conseqüentemente, a criação de certas cepas que produzem menos ácido acético durante a cultura tem sido desejada, tais como cepas nas quais a atividade de uma enzima que catalisa a produção de ácido acético está reduzida ou eliminada.

[004] Exemplos de um método de fermentação usando uma cepa na qual a atividade de uma enzima que catalisa a produção de ácido acético está reduzida ou eliminada inclui produção de L-aminoácidos usando Escherichia coli que é deficiente nas atividades de fosfoacetiltransferase (pta) e lactato desidrogenase (ldh) (WO99/06532), produção de L-aminoácidos usando a família Enterobacteriaceae que é deficiente na atividade de piruvato oxidase (poxB), e produção de ácido D-pantotênico usando Enterobacteriaceae que é deficiente na atividade de piruvato oxidase (poxB) (WO02/36797).

[005] Acetato cinase (ack) e fosfotransacetilase (pta) têm sido relatadas como enzimas que estão envolvidas na assimilação de ácido acético em bactérias corineformes (Microbiology, 1999 Feb; 145(Pt2):503- 13). Também, uma bactéria corineforme na qual a enzima piruvato oxidase produtora de acetato (poxB) está rompida tem sido relatada. (EP1096013A).

[006] Acetil-CoA hidrolase é uma enzima (3.1.2.1) que produz ácido acético a partir de acetil-CoA e H2O, e a seqüência de nucleotídeos predita para codificar acetil-coA hidrolase de Corynebacterium glutamicum tem sido descrita (EP1108790A). Contudo, não tem havido relatório sobre a clonagem real e a análise de expressão do gene; e portanto a função real do gene ainda não tem sido confirmada.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[007] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma bactéria corineforme que possui uma capacidade melhorada para produzir L-aminoácidos que são gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário, e proporcionar um método de produzir eficientemente os L-aminoácidos acima mencionados usando uma tal bactéria.

[008] Os inventores da presente invenção têm estudado extensivamente para alcançarem os objetivos acima mencionados. Como um resultado, verificaram que pela diminuição da atividade de acetil-CoA hidrolase em uma bactéria corineforme, a capacidade para produzir L- aminoácidos, particularmente ácido L-glutâmico, L-valina, e L-alanina é aumentada, e assim completada a presente invenção.

[009] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma bactéria corineforme possuindo uma capacidade de produção de um L- aminoácido, no qual a citada bactéria corineforme está modificada de tal modo que atividade de acetil-CoA hidrolase está diminuída, e no qual o citado L-aminoácido é um ou mais L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário.

[010] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar a bactéria corineforme como descrito acima, na qual a citada atividade de acetil-CoA hidrolase é diminuída pela introdução de uma mutação em uma região codificadora ou uma região regulatória de expressão de um gene cromossômico de acetil-CoA hidrolase.

[011] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar a bactéria corineforme como descrito acima, na qual a citada atividade de acetil-CoA hidrolase é diminuída pelo rompimento de um gene cromossômico de acetil-CoA hidrolase.

[012] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar a bactéria corineforme como descrito acima, na qual a citada acetil-CoA hidrolase é selecionada do grupo consistindo de: (A) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 24; e (B) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 24, por meio da qual um ou mais aminoácidos na citada proteína são substituídos, deletados, inseridos, ou adicionados, e no qual a citada proteína possui atividade de acetil-CoA hidrolase.

[013] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar a bactéria corineforme como descrito acima, na qual o citado gene de acetil-CoA hidrolase é selecionado do grupo consistindo de: (a) um gene compreendendo nucleotídeos 1037 a 2542 de SEQ ID NO: 23; e (b) um DNA que é capaz de hibridizar sob condições estringentes em um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1037 a 2542 de SEQ ID NO: 23 ou uma sonda preparada a partir do citado polinucleotídeo, e codifica uma proteína possuindo atividade de acetil-CoA hidrolase.

[014] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar a bactéria corineforme como descrito acima, na qual a citada bactéria corineforme é adicionalmente modificada para aumentar a atividade de ácido glutâmico desidrogenase.

[015] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar a bactéria corineforme como descrito acima, na qual o citado L- aminoácido é um ou mais L-aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina e L-lisina.

[016] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para produzir um L-aminoácido compreendendo: cultivar a bactéria corineforme como descrito acima em um meio; e coletar o L-aminoácido do meio, e no qual o citado L- aminoácido é um ou mais L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário.

[017] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método como descrito acima, no qual os citados L- aminoácidos são um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo de ácido L-glutâmico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina e L-lisina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018] Fig. 1 é um esquema mostrando o procedimento de construção de plasmídeo pBS3.

[019] Fig. 2 é um esquema mostrando o procedimento de construção de plasmídeo pBS4.

[020] Fig. 3 é um esquema mostrando o procedimento de construção de plasmídeo pBS5T.

[021] Fig. 4 é um esquema mostrando o procedimento de construção de plasmídeo pΔldh56-1.

[022] Fig. 5 é um esquema mostrando o procedimento de construção de plasmídeo pBS4S::Δach.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[023] Daqui em diante, as modalidades da presente invenção serão descritas em detalhe.

[024] <1> Bactéria corineforme possuindo atividade para produzir L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário

[025] Na presente invenção, exemplos de bactéria corineforme incluem bactéria corineforme convencional, e também incluem bactérias que têm sido classificadas no gênero Brevibacterium, mas são correntemente classificadas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)), bem como as bactérias Brevibacterium que estão muito próximas das bactérias Corynebacterium. Exemplos de tal bactéria corineforme incluem os seguintes: Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum Exemplos específicos de bactéria corineforme são os seguintes. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511 Corynebacterium callunae ATCC15991 Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, ATCC13869 Corynebacterium lilium ATCC15990 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP- 1539) Corynebacterium herculis ATCC13868 Brevibacterium divaricatum ATCC14020 Brevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC14068 Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869 Brevibacterium roseum ATCC13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872 Brevibacterium album ATCC15111 Brevibacterium cerinum ATCC15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354

[026] Estas cepas estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC, endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, cada cepa recebe um único número de registro que está listado no catálogo de ATCC. Cepas podem ser adquiridas usando este número de registro. A cepa AJ12340 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology em Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japão) aos 27 de outubro de 1989 sob as condições do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-1539. A cepa AJ12418 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry aos 5 de janeiro de 1989 sob as condições do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-2205.

[027] "L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário" preferivelmente significa aqueles que possuem esqueletos de carbono derivados de ácido pirúvico. Exemplos de tais L-aminoácidos incluem ácido L-glutâmico, L-arginina, L- glutamina, L-prolina, L-alanina, L-valina e L-lisina. Como aqui usado, "uma capacidade para produzir L-aminoácidos por rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário" refere-se à capacidade da bactéria corineforme da presente invenção de causar acúmulo de um ou mais L- aminoácidos acima mencionados em um meio quando forem cultivadas no meio.

[028] A capacidade para produzir L-aminoácidos pode ser uma capacidade original de uma cepa de tipo selvagem da bactéria corineforme ou uma capacidade que tem sido conferida pro procriação. Ainda mais, a capacidade para produzir L-aminoácidos pode ser conferida por uma modificação que resulta em uma diminuição na atividade de acetil-CoA hidrolase, como discutido mais tarde.

[029] Para conferir a capacidade de produção de L- aminoácido, métodos convencionais que têm sido usados em procriação de bactérias corineformes podem ser empregados, tais como a criação de cepas mutantes de regulação metabólica, ou a criação de cepas recombinantes que possuem atividade intensificada de enzimas biossintéticas de substâncias alvo ("Aminoacid Fermentation", Center for Academic Publications Japan Co., Ltd., 1a ed. publicado aos 30 de maio de 1986, p.77 a 100). Nestes métodos, introdução de uma mutação de regulação metabólica, e intensificação de enzimas biossintéticas de substância alvo podem ser usadas individualmente, ou em combinação. Ainda mais, duas ou mais mutações podem ser introduzidas, e duas ou mais atividades enzimáticas podem ser intensificadas.

[030] Um exemplo de um método para conferir capacidade de produção de ácido L-glutâmico é intensificar a expressão de um gene codificador de uma enzima biossintética de ácido L-glutâmico. Exemplos de enzimas envolvidas em biossíntese de ácido L-glutâmico incluem glutamato desidrogenase, glutamina sintetase, glutamato sintetase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase, piruvato cinase, fosfoenolpiruvato sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato cinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, frutose bisfosfato aldolase, fosfofrutocinase, e glicose fosfato isomerase.

[031] Intensificação da expressão destes genes pode ser realizada pela inserção de um fragmento de DNA contendo um tal gene em um plasmídeo apropriado que é autonomamente replicável em bactéria corineforme, e transformação de células bacterianas com o plasmídeo resultante; pela integração de um tal gene em um cromossomo por recombinação homóloga, conjugação, transposição (EP0756007B, EP0332488A EP0771879A), etc.; ou pela introdução de uma mutação em uma região de promotor de um tal gene (WO/0018935) ou substituição de promotor forte

[032] Quando os genes mencionados acima são introduzidos por um plasmídeo ou integrados em um cromossomo, um promotor para expressão dos genes pode ser qualquer promotor desde que ele seja capaz de funcionar em bactérias corineformes. Exemplos de tais promotores incluem promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor PS2, e promotor pL. Um promotor nativo para cada gene também pode ser usado.

[033] Exemplos de microorganismos modificados de modo que a expressão do gene de citrato sintetase, do gene de fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou do gene de glutamato desidrogenase é/são intensificadas incluem aqueles microorganismos descritos em JP2001- 333769A (EP1078989A), JP2000-106869A (EP955368A), JP2000-189169A (EP952221A), e JP2001-333769A (EP1078989A).

[034] A modificação para conferir a capacidade de produção de ácido L-glutâmico também inclui diminuição ou eliminação de uma atividade de uma enzima que catalisa a síntese de um composto diferente de ácido L-glutâmico, e ramificação de uma rota biossintética de ácido L- glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem isocitrato liase, α-cetoglutarato desidrogenase, fosfotransacetilase, acetato cinase, aceto-hidróxi-ácido sintase, acetolactato sintase, formiato acetiltransferase, lactato desidrogenase, e glutamato descarboxilase.

[035] Para diminuir ou eliminar a atividade das enzimas descritas acima, uma mutação ou deleção que causa um decréscimo ou uma perda da atividade das enzimas pode ser introduzida nos genes das enzimas no cromossomo. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por rompimento de um gene codificador da enzima no cromossomo, ou por modificação de uma seqüência de controle de expressão tal como um promotor ou uma seqüência de Shine Dargarno (SD) do gene. Em adição, atividades de tais enzimas podem ser diminuídas ou eliminadas pela introdução de uma mutação de sentido incorreto que causa uma substituição de aminoácido, uma mutação de não-sentido que gera um códon de terminação, ou uma mutação de deslocamento de matriz que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos na região codificadora, ou por deleção de uma porção do gene (Journal of biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)). Em adição, as atividades de tais enzimas podem ser diminuídas ou eliminadas pela construção de um gene codificador de uma enzima mutante possuindo sua região codificadora deletada ou substituída em um gene cromossômico com o gene resultante por recombinação homóloga. Exemplos de bactéria corineforme na qual a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase está diminuída incluem as cepas descritas em JP7-834672A e JP06-237779.

[036] Em adição, exemplo de um método de conferir capacidade de produção de ácido L-glutâmico inclui um método de modificação de uma cepa para intensificar a expressão de um gene codificador de gene yggB ou para introduzir uma mutação no gene yggB. (NCgl 1221 ; NP_600492. Reports small- conductance...[gi:19552490]) (Pedido de Patente U.S. de No. 60/715131).

[037] A capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser proporcionada por triagem de uma cepa resistente a análogos de ácido orgânico, inibidores respiratórios, ou geradores de superóxido, ou por triagem de uma cepa sensível aos inibidores de síntese de parede celular. Exemplos de tais métodos incluem proporcionar resistência à benzopirona ou naftoquinona (JP56-1889A), proporcionar resistência ao ácido monofluoro-acético (JP 50-113209A), proporcionar resistência à adenina e à timina (JP57-065198), proporcionar resistência a HOQNO (JP56-140895A), proporcionar resistência ao ácido a-ceto-malônico (JP57-2689A), proporcionar resistência à guanidina (JP56-35981A), proporcionar resistência à daunomicina (JP58-158192A), e proporcionar sensibilidade à penicilina (JP04-88994A).

[038] Exemplos específicos de tais bactérias incluem as seguintes cepas Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632; JP 50- 113209A) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; JP 57-065198A) Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; JP56- 1889A) Corynebacterium glutamicum AJ11355 (FERM P-5020; JP56- 1889A) Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; JP57- 2689A) Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; JP57- 2689A) Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM P-5472; JP56- 140895A) Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM P-5136; JP56- 35981A) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; JP04- 88994A) Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P5123 JP56-048890A) Corynebacterium glutamicum AJ11440(FERM P5137 JP56- 048890A) Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P6402 JP58- 158192A)

[039] Um exemplo de um método de conferir capacidade de produção de L-valina inclui um método de modificar uma cepa para intensificar a expressão de um gene codificador de uma enzima biossintética de L-valina. Exemplos de uma enzima biossintética de L-valina incluem enzimas codificadas por um gene de operon ilvBNC, isto é, aceto-hidróxi- ácido sintetase codificada por ilvBN e isomero-redutase codificada por ilvC (WO00/50624). O operon ilvBNC é submetido à repressão transcricional por qualquer combinação de L-valina, L-isoleucina, e L-leucina, de modo que é desejável liberar atenuação para evitar repressão transcricional por L-valina como um produto.

[040] Provisão de capacidade de produção de L-valina às bactérias corineformes pode ser realizada por diminuição ou eliminação da atividade de pelo menos uma enzima que é catalisa uma reação que diminui a produção de L-valina. Por exemplo, capacidade de produção de L-valina pode ser conferida pela diminuição da atividade de treonina desidratase, que catalisa a síntese de L-leucina, ou por diminuição da atividade de uma enzima que catalisa a síntese de D-pantotenato (WO00/50624).

[041] A capacidade de produção de L-valina também pode ser conferida pela provisão de resistência a análogos de aminoácido ou semelhante a uma bactéria corineforme.

[042] Por exemplo, cepas mutantes produtoras de L-valina auxotróficas para L-isoleucina e L-metionina, e resistentes à D-ribose, ribonucleosídeo de purina ou ribonucleosídeo de pirimidina (FERM P-1841, FERM P-29, JP-B-53-025034), cepas mutantes produtoras de L-valina resistentes a policetídeos (FERM P-1763, FERM P-1764; JP-B006-065314), cepas mutantes produtoras de L-valina resistentes à L-valina e sensíveis aos análogos de ácido pirúvico tal como ácido β-fliioro-piπivico (FERM BP- 3006, BP-3007, Patente 3006929) podem ser usadas.

[043] Exemplos de bactérias corineformes possiindo atividade de prodição de L-alanina incliem bactérias corineformes deficientes em atividade de H+-ATPase (Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40), e bactérias corineformes amplificadas com im gene estritiral codificador de ácido aspártico β-descarboxilase (JP-A-7-163383).

[044] Capacidade de prodição de L-arginina pode ser conferida por modificação de bactérias corineformes para intensificar a expressão de im gene codificador de enzima biossintética de L-arginina. Exemplos de enzima biossintética de L-arginina incliem N-acetil-glitamil fosfato reditase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetil-glitamato cinase (argB), acetil-ornitina transaminase (argD), ornitina carbamoil transferase (argF), ácido arginino-siccínico sintetase (argG), ácido arginino- siccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase. Estes genes biossintéticos de arginina existem no operon Arg (argCJBDFRGH), e são regulados por um repressor de arginina codificado por argR. (J Bacteriol. 2002 Dec;184(23):6602-14.) Portanto, rompimento do repressor de arginina resulta em um aumento na expressão do operon Arg, assim intensifica as atividades das enzimas produtoras de L-arginina (US2002-0045223,).

[045] Outro método para conferir capacidade de produção de L-arginina é, por exemplo, pela provisão de resistência a análogos de aminoácido. Exemplos de bactéria corineforme incluem bactérias corineformes resistentes a 2-tiazol-alanina, e auxotróficas para L-histidina, L- prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, ou L-triptofano (JP-A-54- 044096); bactérias corineformes resistentes ao ácido ceto-malônico, ácido fluoro-malônico ou ácido monofluoro-acético (JP-A-57-18989); bactéria corineforme resistente a argininol (JP-B-62-024075); e bactéria corineforme resistente à x-guanidina (x é um ácido graxo ou um derivado de cadeia alifática) (JP-A-2-186995); e bactéria corineforme resistente a arginina hidroxamato e 6-aza-uracila (JP-A-57-150381).

[046] Um exemplo de um método para conferir capacidade de produção de L-glutamina é por modificação de uma bactéria corineforme para intensificar a expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética de L-glutamina. Exemplos de enzima biossintética de L- glutamina incluem glutamina sintetase e ácido glutâmico desidrogenase (US2003-0003550).

[047] Capacidade de produção de L-glutamina também pode ser conferida pela diminuição ou eliminação da atividade de uma enzima que catalisa uma ramificação de reação da rota biossintética de L-glutamina e produção de outros compostos. Por exemplo, a capacidade de produção de L- glutamina pode ser conferida pela diminuição da atividade de glutaminase (US2004-0152175).

[048] Capacidade de produção de L-glutamina também pode ser conferida pela provisão de resistência a análogo de L-aminoácido. Exemplos de tais métodos incluem um método de conferir resistência à 6- diazo-5-oxo-norleucina (JP-A-3-232497), um método de conferir resistência aos análogos de purina e/ou ao metionina sulfóxido (JP-A-61-202694), um método de conferir resistência ao ácido a-ceto-malônico (JP-A-56-151495), e um método de conferir resistência ao peptídeo contendo ácido glutâmico (JP- 2-186994).

[049] Exemplos específicos de bactérias corineformes produtoras de L-glutamina incluem as seguintes cepas. Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, JP56- 161495A) Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381, JP56- 161495A) Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, JP61- 202694A) Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205, JP02- 186994A) Brevibacterium flavum DH18 (FERM P-11116, JP03- 232497A) Corynebacterium melassecola DH344 (FERM P-11117, JP3- 232497A) Corynebacterium glutamicum AJ11574 (FERM P-5493, JP56- 151495A)

[050] Um exemplo de um método de conferir capacidade de produção de L-prolina inclui um método de modificar uma bactéria corineforme para intensificar a expressão de um gene codificação de uma enzima biossintética de L-prolina. Exemplos de enzima biossintética de L- prolina incluem glutamato cinase, Y-glutamil fosfato redutase, e pirolina-5- carboxilato redutase. (J Bacteriol. 1996 Aug;178(15):4412-9.)

[051] Capacidade de produção de L-prolina também pode ser conferida pela diminuição ou eliminação da atividade de uma enzima que catalisa uma ramificação de reação da rota biossintética de L-prolina e produção de outros compostos. Por exemplo, capacidade de produção de L- prolina pode ser conferida pela diminuição da atividade de ornitina- aminotransferase. (J Bacteriol. 1996 Aug;178(15):4412-9.)

[052] Entrementes, L-arginina, L-glutamina, e L-prolina contêm ácido L-glutâmico como um esqueleto de carbono, de modo que a capacidade para produzir estes aminoácidos pode ser conferida pela amplificação de um gene que codifica uma enzima que catalisa uma reação que resulta na produção de cada L-aminoácido a partir de ácido L-glutâmico na bactéria produtora de ácido L-glutâmico mencionada acima.

[053] Ainda mais, visto que L-alanina é sintetizada por β- descarboxilação de ácido L-aspártico, bactéria produtora de L-alanina pode ser obtida pela modificação de bactéria produtora de ácido L-aspártico de modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase seja diminuída.

[054] Procriação para conferir ou intensificar produtividade de L-lisina pode ser realizada pela introdução de uma ou mais mutações como segue. Tais mutações artificiais são como segue: cepas resistentes à S-(2-amino-etil)cisteína (daqui em diante referida como “AEC”); mutantes requerendo aminoácidos tal como L-homo-serina para seu crescimento (veja Publicações de Patente Japonesa de Nos. 4828078 e 566499); mutantes resistentes a AEC e requerendo aminoácidos tais como L- leucina, L-homo-serina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, L-valina, etc. (veja Patentes U.S. 3.708.395 e 3.825.472); mutantes produtoras de L- lisina resistentes a DL-amino-caprolactama, amino-lauril-lactama, análogos de ácido aspártico, drogas sulfa, quinóides e N-lauroil-leucina, e mutantes produtoras de L-lisina resistentes à oxaloacetato descarboxilase ou inibidores de enzima de sistema respiratório (veja Patentes Japonesas Publicadas de Nos. 5053588, 5031093, 52102498, 539394, 5386089, 559783, 559759, 5632995, 5639778, Publicações de Patente Japonesa de Nos. 5343591, 531833); mutantes produtoras de L-lisina requerendo inositol ou ácido acético (veja Patentes Japonesas Publicadas de Nos. 559784, 568692); mutantes produtoras de L-lisina sensíveis a ácido fluoro-pirúvico ou às temperaturas de 34oC ou mais altas (veja Patente Japonesa Publicada de No. 5386090); mutantes produtoras de L-lisina de Brevibacterium ou Corynebacterium resistentes a etileno-glicol (veja Patente U.S. 4.411.997).

[055] Um exemplo de um método para conferir capacidade de produção de L-lisina é intensificar a expressão de um gene codificador de uma enzima biossintética de L-lisina. Exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese de L-lisina incluem, mas não são limitadas às enzimas da rota de diaminopimelato, tais como o gene de di-hidro-dipicolinato sintase (dapA), o gene de aspartocinase (lysC), o gene de di-hidro-dipicolinato redutase (dapB), o gene de diaminopimelato descarboxilase (lysA), o gene de diaminopimelato desidrogenase (ddh) (todos os precedentes; Publicação Internacional de No. 96/40934), o gene de fosfoenol-piruvato carboxilase (ppc) (Pedido de Patente Japonesa Publicada de No. 60-87788), o gene de aspartato aminotransferase (aspC) (Publicação de Patente Japonesa de No. 6-102028), o gene de diaminopimelato epimerase (dapF) (Pedido de Patente Japonesa Publicada de No. 2003-135066), e o gene de aspartato semi-aldeído desidrogenease (asd) (Publicação Internacional de No. 00/61723), e as enzimas de rota de aminoadipato, tal como o gene de homoaconitato hidratase (Pedido de Patente Japonesa Publicada de No. 2000-157276).

[056] Em adição, a bactéria da presente invenção pode possuir atividade decrescida de uma enzima que catalisa uma reação para geração de um composto diferente de L-lisina por ramificação da rota biossintética de L-lisina, ou pode ser deficiente em uma tal enzima. Enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto diferente de L-lisina por ramificação da rota biossintética de L-lisina incluem homo-serina desidrogenase e lisina descarboxilase. Cepas possuindo atividades decrescidas das enzimas são descritas em WO95/23864 e WO 96/178930.

[057] <2> Modificação para decrescer a atividade de acetil-CoA hidrolase

[058] A bactéria corineforme da presente invenção possui uma capacidade para produzir um L-aminoácido gerado pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário como mencionado acima e modificada de modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1) seja diminuída.

[059] A bactéria corineforme da presente invenção pode ser obtida por modificação da bactéria corineforme mencionada acima que possui uma capacidade para produzir L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário de modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase seja diminuída. Quando se procriam as bactérias corineformes da presente invenção, a provisão de capacidade de produção de L-aminoácido às bactérias ou a modificação das bactérias de modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase seja decrescida podem ser realizadas em qualquer ordem.

[060] "Atividade de acetil-CoA hidrolase (ACH)" refere- se à atividade para catalisar a produção de ácido acético a partir de acetil-CoA e H2O. "Modificada de modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase seja diminuída" significa que a atividade de acetil-CoA hidrolase é menor do que a de cepas não-modificadas, incluindo uma bactéria corineforme de tipo selvagem. A atividade de ACH é preferivelmente diminuída em 50% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos, ainda mais preferivelmente 10% ou menos por peso celular unitário em comparação com uma cepa não- modificada. Aqui, uma bactéria corineforme de tipo selvagem que serve como um controle inclui, por exemplo, cepa 2256 Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) ou Corynebacterium glutamicum ATCC13032, e uma cepa não-modificada inclui cepa Δldh de Brevibacterium lactofermentum. A atividade de acetil-CoA hidrolase pode ser medida de acordo com o método de Gergely, J., et al., (Gergely, J., Hele, P. & Ramkrishnan, C.V. (1952) J. Biol. Chem. 198 p323-334). "Decréscimo" inclui quando a atividade tem completamente desaparecido. É preferível que a bactéria corineforme da presente invenção possua atividade de acetil-CoA hidrolase que seja menor do que aquela de uma cepa de tipo selvagem ou não-modificada e causa acúmulo de L-aminoácidos maior do que o de uma cepa de tipo selvagem ou não- modificada.

[061] Exemplos de ACH incluem uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 24, e uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 na qual um ou mais aminoácidos estão substituídos, deletados, inseridos ou adicionados em uma ou mais posições, mas mantém a atividade de ACH. Embora o número de “vários” resíduos de aminoácido aqui referidos possa diferir dependendo das posições na estrutura tridimensional ou dos tipos de resíduos de aminoácido da proteína, ele pode ser preferivelmente 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10, particularmente preferivelmente 2 a 5. O gene ACH preferivelmente codifica uma proteína possuindo homologia de não menor do que 80%, mais preferivelmente não menor do que 90%, ainda mais preferivelmente não menor do que 95%, particularmente preferivelmente não menor do que 97% a uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 24, ao mesmo tempo mantendo atividade de ACH. Substituição de aminoácidos nestes homólogos de ACH é preferivelmente uma substituição conservativa, incluindo substituição de ser ou thr no lugar de ala, substituição de gln, his ou lys no lugar de arg, substituição de glu, gln, lys, his ou asp no lugar de asn, substituição de asn, glu ou gln no lugar de asp, substituição de ser ou ala no lugar de cys, substituição de asn, glu, lys, his, asp ou arg no lugar de gln, substituição de gly, asn, gln, lys ou asp no lugar de glu, substituição de pro no lugar de gly, substituição de asn, lys, gln, arg ou tyr no lugar de his, substituição de leu, met, val ou phe no lugar de ile, substituição de ile, met, val ou phe no lugar de leu, substituição de asn, glu, gln, his ou arg no lugar de lys, substituição de ile, leu, val ou phe no lugar de met, substituição de trp, tyr, met, ile ou leu no lugar de phe, substituição de thr ou ala no lugar de ser, substituição de ser ou ala no lugar de thr, substituição de phe ou tyr no lugar de trp, substituição de his, phe ou trp no lugar de tyr and substituição de met, ile ou leu no lugar de val.

[062] "Modificada de modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase seja diminuída" inclui o caso no qual o número de moléculas de acetil-CoA hidrolase por célula diminui, e o caso no qual a atividade de CoA hidrolase por molécula decresce. Especificamente, estas modificações podem ser realizadas, por exemplo, por rompimento de um gene codificador de acetil-CoA hidrolase em um cromossomo, ou por modificação de uma seqüência regulatória de expressão tal como um promotor e/ou uma seqüência de Shine-Dalgarno (SD). O gene de acetil-CoA hidrolase em um cromossomo inclui, por exemplo, um DNA compreendendo nucleotídeos1037 a 2542 de SEQ ID NO: 23. Em adição, o gene de acetil-CoA hidrolase inclui, por exemplo, um DNA obtenível pelo uso de iniciador SEQ ID 7 e 8 em método de PCR. Em adição, o gene de acetil-CoA hidrolase em um cromossomo pode ser um DNA que é capaz de hibridizar com os nucleotídeos1037 a 2542 de SEQ ID No. 23 ou uma sonda que pode ser preparada a partir de nucleotídeos sob condições estringentes desde que ele codifique uma proteína possuindo atividade de acetil-CoA hidrolase. “Condições estringentes” referem-se às condições sob as quais denominados híbridos específicos são formados e híbridos não-específicos não são formados. Embora seja difícil claramente expressar estas condições por valores numéricos, exemplos de tais condições incluem quando a lavagem for realizada uma vez, preferivelmente duas a três vezes a 60°C e em uma concentração de sal correspondendo a IxSSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1xSSC, 0,1% SDS.

[063] O gene de acetil-CoA hidrolase (daqui em diante, referido como "gene ach") pode ser clonado pro síntese de oligonucleotídeos sintéticos baseados em uma seqüência de nucleotídeos de Corynebacterium glutamicum (por exemplo, SEQ ID No. 23, NCgl2480 de Número de Acesso de GenBank de NC_003450 (uma fita complementar de 2729376 a 2730884 de NC_003450)), e realização de PCR usando um DNA cromossômico de DNA de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Em adição, outra seqüência de nucleotídeos derivada de bactéria corineforme tal como Brevibacterium lactofermentum também está disponível. DNA cromossômico pode ser preparado de uma bactéria corineforme como uma doadora de DNA, por exemplo, pelo método de Saito e Miura (H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), "Biotechnology Experiments Handbook", ed. da The Society for Biotechnology Japan, p.97 a 98, Baifukan, 1992).

[064] O gene ach assim preparado ou uma sua parte pode ser usado para rompimento do gene ach cromossômico. Em adição, o gene ach usado para rompimento do gene ach cromossômico também pode ser um gene possuindo homologia suficiente para causar recombinação homóloga com o gene ach no cromossomo de uma bactéria corineforme alvo (por exemplo, um gene possuindo nucleotídeos 1037 a 2542 de SEQ ID NO: 23). Aqui, homologia suficiente para causar recombinação homóloga é preferivelmente de 80% ou maior, mais preferivelmente 90% ou maior, ainda mais preferivelmente 95% ou maior, particularmente preferivelmente 97% ou maior. Em adição, um DNA que pode hibridizar sob condições estringentes com o gene acima mencionado também pode ser usado para rompimento de gene.

[065] O gene ach pode ser rompido, por exemplo, por preparação de um “gene ach do tipo deleção”, no qual uma seqüência parcial do gene ach é deletado de modo que acetil-CoA hidrolase de funcionamento normal não é produzida, transformação de uma bactéria corineforme com um DNA contendo o gene ach do tipo deleção para causar recombinação entre o gene ach do tipo deleção e o gene ach em um cromossomo. Tal rompimento de gene por substituição de gene utilizando recombinação homóloga já está estabelecido e inclui um método que emprega um DNA linear ou um método que emprega um plasmídeo contendo origem de replicação sensível à temperatura (Patente U.S. 6.303.383, ou JP-A-05-007491). Rompimento de gene por substituição de gene utilizando recombinação homóloga também pode ser realizado pelo uso de um plasmídeo que não é replicável em bactérias corineformes. Um plasmídeo que não é replicável em bactérias corineformes mas é replicável em bactérias Escherichia é preferivelmente utilizado. Exemplos de um tal plasmídeo incluem pHSG299 (Takara Bio) e pHSG399 (Takara Bio).

[066] Um gene ach cromossômico pode ser substituído com um gene ach do tipo deleção, por exemplo, por recombinação homóloga usando sacB (Schafer, A. et al., Gene 145 (1994) 69-73). O gene sacB codifica uma levana sacarase e é usado para efetivamente selecionar cepas nas quais um gene cromossômico alvo é substituído por um gene mutante e uma porção de vetor é curada de um cromossomo.

[067] Um primeiro plasmídeo recombinante é representado pela inserção de um gene ach (mutante) do tipo deleção, gene sacB, e um marcador de seleção tal como um gene resistente a cloranfenicol em um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura. O plasmídeo obtido é introduzido em uma cepa hospedeira de bactéria corineforme. Quando levana sacarase é expressada em células de bactéria corineforme, levana gerada pela conversão de sacarose se torna letal para a bactéria e como conseqüência a bactéria não pode crescer em meio contendo sacarose. Portanto, pela cultura sobre uma placa contendo sacarose, podem ser selecionadas cepas nas quais substituição ocorre entre o gene ach mutante no plasmídeo e um gene ach cromossômico e do qual as outras porções do plasmídeo são curadas da célula.

[068] Exemplos de gene sacB incluem os seguintes. Bacillus subillus : sacB De Número de Acesso de GenBank de X02730 (SEQ ID NO: 19) Bacillus amyloliqufaciens : sacB de Número de Acesso de GenBank de X52988 Zymomonas mobilis : sacB de Número de Acesso de GenBank de L33402 Bacillus stearothermophilus : surB de Número de Acesso de GenBank de U34874 Lactobacillus sanfranciscensis : frfA de Número de Acesso de GenBank de AJ508391 Acetobacter xylinus : lsxA de Número de Acesso de GenBank de AB034152 Gluconacetobacter diazotrophicus : lsdA de Número de Acesso de GenBank de L41732.

[069] Transformação pode ser realizada por métodos convencionais. Por exemplo, um método de tratar células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade de DNA, que tem sido relatado para Escherichia coli (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), e um método de usar células competentes preparadas de células em crescimento para introdução de um DNA, que tem sido relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)) podem ser empregados. Em adição a estes métodos, introdução de um DNA recombinante em células recipientes semelhantes a protoplasto ou esferoplasto, que tem sido relatado aplicável para Bacillus subtilis, actinomicetos, e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)), podem ser empregados. Em adição, transformação de Bactérias corineformes também pode ser realizada pelo método de pulso elétrico (Sugimoto et al., JP2-207791A).

[070] Exemplos de plasmídeos sensíveis à temperatura para bactérias corineformes incluem p48K e pSFKT2 (EP1038966), pHSC4 (Publicação de Patente Francesa Publicada de No. 2667875, 1992 e JP5- 7491A), pBS5T, e assim por diante. Em bactérias corineformes, estes plasmídeos podem se replicar autonomamente pelo menos em uma temperatura de 25°C, mas não se replicam autonomamente em uma temperatura de 37°C. A cepa AJ12571 hospedando pHSC4 foi depositada em National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology em Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japão) aos 26 de agosto de 1991 sob as condições do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-3524.

[071] A cepa transformante é cultivada em uma temperatura na qual a origem de replicação sensível à temperatura não funciona (e.g. 25oC) para obter uma cepa na qual o plasmídeo tem sido introduzido. Então, o transformante é cultivado em uma temperatura alta para curar o plasmídeo sensível à temperatura, e espalhado sobre um meio de placa contendo uma droga antibiótica tal como canamicina. Embora cepas das quais o plasmídeo é curado não crescem em uma placa contendo uma tal droga antibiótica, umas poucas cepas nas quais o gene ach cromossômico é substituído por gene ach mutante podem crescer e aparecer como colônias.

[072] Em uma cepa na qual DNA recombinante contendo o gene ach mutante é integrado no DNA cromossômico, o DNA recombinante causa recombinação com o gene ach que originalmente existe no cromossomo, e os genes de fusão do gene ach cromossômico e do gene ach mutante são inseridos no cromossomo de modo que as outras porções do DNA recombinante (segmento de vetor, origem de replicação sensível à temperatura e marcador de resistência à droga) estejam presentes nos genes de fusão. Então, com o objetivo de deixar apenas o gene ach mutante no DNA cromossômico, uma cópia do gene ach é eliminada juntamente com o segmento de vetor (incluindo a origem de replicação sensível à temperatura e o marcador de resistência à droga) do DNA cromossômico. Neste caso, o gene ach normal é deixado no DNA cromossômico e o gene ach mutante é excisado do DNA cromossômico e o gene ach normal é excisado do DNA cromossômico. Então, uma cepa na qual apenas o gene ach mutante permanece no cromossomo pode ser selecionada pelo uso de PCR, hibridização de Southern, ou semelhante.

[073] Decréscimo da atividade de acetil-CoA hidrolase também pode ser realizado pela modificação de uma seqüência regulatória de expressão tal como promoter, seqüência de Shine-Dalgarno (SD), operador, terminador, e atenuador. Uma seqüência regulatória de expressão em um cromossomo pode ser identificada por programa de computador de análise de gene tal como Genetix, pelos vetores para análise de expressão tal como vetor pesquisador de promotor, e por informação conhecida tal como de banco de dados Genbank. Por exemplo, exemplos de mutações que diminuem a atividade de acetil-CoA hidrolase incluem uma mutação que modifica uma região de promotor do gene de acetil-CoA hidrolase para diminuir a potência e uma mutação que rompe uma seqüência de consenso em uma região de promotor de acetil-CoA hidrolase. Tais mutações podem ser introduzidas pelo uso de plasmídeos sensíveis à temperatura ou vetores suicidas que não são capazes de replicação em uma células hospedeiras.

[074] Decréscimo da atividade de acetil-CoA hidrolase também pode ser realizado pela introdução de substituições de aminoácido (mutação de sentido incorreto) em uma região codificadora de gene de acetil- CoA hidrolase em um cromossomo, introdução de códon de terminação (mutação de não-senso), introdução de uma mutação de deslocamento de matriz pelo qual um ou mais nucleotídeos são adicionados ou deletados, ou por deleção de uma parte do gene (Journal of Biological Chemistry 272:86118617 (1997)).

[075] Exemplos de um método de decrescer a atividade de acetil-CoA hidrolase também inclui um método de tratar bactérias corineformes com irradiação ultravioleta ou com um mutagene usado em um tratamento de mutação ordinária, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitroso- guanidina (NTG) e ácido nitroso, para selecionar cepas possuindo atividade de acetil-CoA hidrolase diminuída. ("Amino Acid Fermentation", Center for Academic Publications Japan Co., Ltd., 1st ed. publicado aos 30 de maio de 1986, p.77 a 100).

[076] Entrementes, cepas adicionalmente modificadas de modo que a atividade de ácido glutâmico desidrogenase (daqui em diante, referida como "GDH") seja intensificada são preferivelmente usadas na presente invenção.

[077] Para amplificar a atividade de GDH em uma bactéria corineforme que possui capacidade de produção de L-aminoácido e tem sido modificada para decrescer a atividade de ACH, um fragmento de gene codificador de GDH é ligado em um vetor que funciona em bactérias corineformes, preferivelmente em um vetor do tipo multi-cópias para preparar um DNA recombinante, e a bactéria corineforme é transformada com o DNA resultante. Como um resultado de um aumento no número de cópias de um gene que codifica GDH nas células dos transformantes, a atividade de GDH é amplificada.

[078] O gene codificador de GDH pode ser derivado de bactérias corineformes ou pode ser derivado de outros organismos tal como Escherichia coli.

[079] A seqüência de nucleotídeos do gene codificador de GDH de bactérias corineformes (gene gdh) já tem sido identificada (por exemplo, SEQ ID NO: 25: Molecular Microbiology (1992) 6(3), 317-326 1999, uma fita complementar de 2194739..2196082 de NC_003450), de modo que o gene gdh possa ser obtido per PCR usando iniciadores planejados baseados na seqüência de nucleotídeos e em DNA cromossômico de bactérias corineformes como um modelo (PCR: reação em cadeia de polimerase; White, T.J. et al.; Trends Genet. 5, 185 (1989)). Genes codificadores de GDH de outros microorganismos também podem ser obtidos na mesma maneira.

[080] <3> Produção de L-aminoácidos usando bactérias corineformes da presente invenção

[081] L-aminoácidos gerados usando ácido pirúvico como um intermediário podem ser produzidos eficientemente pela cultura de bactérias corineformes obtidas como descrito acima em um meio para produzir e causar o acúmulo de tais L-aminoácidos, e coleta de tais L- aminoácidos do meio.

[082] Para produzir tais L-aminoácidos usando as bactérias corineformes da presente invenção, uma cultura pode ser realizada por um método convencional com um meio ordinário contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos, e quantidades traço de nutrientes orgânicos tais como aminoácidos e vitaminas se requeridos. Meio quer natural quer sintético pode ser usado. As fontes de carbono e de nitrogênio usadas no meio de cultura podem ser de qualquer tipo desde que possam ser utilizadas pela cepa da presente invenção.

[083] Exemplos de fontes de carbono incluem açúcares tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisados de amido, e melaço. Em adição, ácidos orgânicos tais como ácido cítrico e malato, alcoóis tal como etanol podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outras fontes de carbono.

[084] Exemplos de fontes de nitrogênio incluem amônia, sais de amônia tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, e acetato de amônio, e nitratos.

[085] Exemplos de nutrientes orgânicos que podem estar presentes em quantidades traço incluem aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, e ácidos nucleicos, e peptona, casaminoácidos, extratos de levedo, e hidrolisato de proteína de feijão-soja contendo estes nutrientes também podem ser usados. No caso no qual cepas mutantes auxotróficas para nutriente que requerem aminoácidos e semelhantes para crescimento são usadas, é preferível que os nutrientes requeridos são suplementados.

[086] Exemplos de sais inorgânicos incluem fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, e sais de manganês.

[087] Cultura é realizada sob condições em uma temperatura de fermentação de 20 a 45°C, enquanto se ajusta o pH para entre 5 e 9. Se o pH diminuir durante a cultura, carbonato de cálcio ou álcali tal como gás amônia pode ser adicionado no meio para neutralização. Cultura por cerca de 10 a 120 horas resulta no acúmulo de quantidades consideráveis de L-aminoácidos.

[088] L-aminoácidos são coletados do meio após completitude da cultura por um método de recuperação conhecido. Por exemplo, após remoção de células da solução de cultura, os L-aminoácidos são coletados por concentração e cristalização.

EXEMPLOS

[089] Daqui em diante, a presente invenção é explicada mais especificamente por meio dos seguintes exemplos não limitantes. Exemplo 1

[090] <1> Construção de vetor de rompimento transportando o gene sacB (A) Construção de pBS3

[091] Um gene sacB (SEQ ID NO: 19) foi obtido por PCR usando um DNA cromossômico de Bacillus subtilis como um modelo e oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 1 e 2 como iniciadores. A PCR foi realizada usando LA taq (fabricado por TaKaRa) como segue: um ciclo de retenção de calor a 94°C por 5 minutos; e 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 49°C por 30 segundos, e alongamento a 72°C por 2 minutos. O produto de PCR obtido foi purificado por um método convencional, e então digerido com BglII e BamHI e extremidade cegada. O fragmento foi inserido em pHSG299 que havia sido digerido com AvaII e extremidade cegada. O DNA obtido foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por TAKARA BIO INC.). Então, as células bacterianas transformadas foram espalhadas sobre meio de ágar LB contendo 25 μg/mL de Canamicina (daqui em diante, abreviado como "Km"), e incubadas por uma noite. Depois, colônias individuais foram isoladas como transformantes. Plasmídeos foram extraídos de transformantes obtidos e o plasmídeo que possuía um inserto do produto de PCR objetivo foi chamado pBS3. Fig. 1 mostra o procedimento de construção de pBS3. (B) Construção de pBS4S

[092] O sítio de reconhecimento SmaI no gene resistente à canamicina em pBS3 foi modificado por substituição de nucleotídeos usando PCR cruzada sem causar substituição de aminoácido de modo que pBS3 não seja cortado por endonuclease SmaI. Primeiro, PCR foi realizada usando pBS3 como um modelo e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 3 e 4 como iniciadores, para deste modo obter um fragmento N-terminal do gene de resistência à canamicina. Por outro lado, para obter um fragmento C-terminal do gene de resistência à canamicina, PCR foi realizada usando pBS3 como um modelo e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 5 e 6 como iniciadores. PCR foi realizada usando Pyrobest DNA Polimerase (fabricada por TAKARA BIO INC.) como segue: um ciclo de retenção de calor a 98°C por 5 minutos; e 25 ciclos de desnaturação a 98°C for 10 segundos, anelamento a 57°C por 30 segundos, e alongamento a 72°C por 1 minuto, para obter o produto de PCR objetivo. SEQ ID NOS: 4 e 5 são uma em relação à outra parcialmente complementares e não contêm o sítio de reconhecimento SmaI. Então, para obter um fragmento de comprimento total do gene mutante de resistência à canamicina sem o sítio de reconhecimento de SmaI, os produtos de gene N- terminal e C-terminal acima mencionados foram misturados juntos em quantidades substancialmente equimolares. PCR foi realizada usando os produtos de gene como um modelo e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 3 e 6 como iniciadores para obter um fragmento de gene de resistência à canamicina modificado em sítio SmaI. A PCR foi realizada usando Pyrobest DNA Polimerase (fabricada por TAKARA BIO INC.) como segue: um ciclo de retenção de calor a 98°C por 5 minutos; e 25 ciclos de desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 57°C por 30 segundos, e alongamento a 72°C por 1,5 minutos,para deste modo obter o produto de PCR objetivo.

[093] O produto de PCR foi purificado por um método convencional, e então digerido com BanII e então inserido no sítio de reconhecimento BanII acima descrito de pBS3. O plasmídeo resultante foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (disponível na Takara Bio). Isto é, as células bacterianas transformadas foram espalhadas sobre meio de ágar LB contendo 25 μg/mL de canamicina, e incubadas por uma noite. Depois, colônias que apareceram foram selecionadas como transformantes. Plasmídeos foram isolados dos transformantes obtidos e o plasmídeo possuindo um inserto de produto de PCR objetivo foi chamado pBS4S. Fig. 2 mostra o procedimento de construção de pBS4S. (C) Construção de pBS5T

[094] Uma origem de replicação sensível à temperatura em bactéria corineforme foi excisada de pHSC4 (JP-A-5-7491) por digestão dela com BamHI e SmaI e extremidade cegada, e inserida no sítio NdeI de extremidade de pBS4S. Usando o DNA resultante, células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricadas por TAKARA BIO INC.) foram transformadas e espalhadas sobre um meio de ágar LB contendo 25 μg/mL de Km, seguido por cultura durante a noite. Então, colônias individuais foram isoladas como transformantes. Plasmídeos foram extraídos de transformantes obtidos e um plasmídeo possuindo um inserto de produto de PCR objetivo foi chamado pBS5T. Fig. 3 mostra um procedimento de construção de pBS5T. Exemplo 2 <Construção de cepa ldh-rompida>

[095] (A) Clonagem de um fragmento para romper o gene de lactato desidrogenase

[096] Um fragmento de gene contendo lactato desidrogenase (daqui em diante, abreviado como "gene ldh") derivado de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum possuindo a ORF deletada foi obtido por PCR cruzada usando DNAs sintéticos planejados baseados em seqüência de nucleotídeos do gene ldh da cepa ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 21: No de Acesso de Banco de Dados do GenBank de NC_003450), como iniciadores. Especificamente, PCR foi conduzida por um método convencional usando um DNA cromossômico de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum como um modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 7 e 8 como iniciadores para obter o fragmento N- terminal do gene ldh. Por outro lado, para obter um fragmento C-terminal do gene ldh, PCR foi realizada por um método convencional usando o DNA cromossômico de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum como um modelo e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 9 e 10 como iniciadores. SEQ ID NOS: 8 e 9 foram uma em relação à outra complementares e planejadas para resultarem em deleção da seqüência inteira de ORF do gene ldh.

[097] Então, para obter um fragmento de gene ldh possuindo uma seqüência interna deletada, os produtos de gene N-terminal e C-terminal de ldh foram misturados em quantidades substancialmente equimolares e PCR foi realizada por um método convencional usando a mistura como um modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 11 e 12 como iniciadores. Após purificação do produto de PCR em uma maneira convencional, os produtos de PCR foram digeridos com SalI. Depois, o produto de PCR foi inserido no sítio SalI de pBS4S acima mencionado. Com o DNA obtido, células competentes de Escherichia coli (fabricadas por TAKARA BIO INC.) foram transformadas e espalhadas sobre meio de ágar LB contendo 100 μM de IPTG, 40 μg/mL de X-Gal, e 25 μg/mL de Km, e seguido por cultura durante a noite. Depois, colônias individuais foram isoladas como transformantes. Plasmídeos foram extraídos de transformantes obtidos, e um plasmídeo possuindo o inserto do produto de PCR objetivo foi chamado pΔIdh56-1. Fig. 4 mostra um procedimento de construção do plasmídeo

[098] (B) Preparação de cepa ldh-rompida

[099] Visto que pΔldh56-1 preparado no item (A) descrito acima não contém uma região que permite replicação autônoma em bactérias corineformes, quando bactérias corineformes são transformadas com o plasmídeo, cepas transformantes possuindo o plasmídeo incorporado no cromossomo por recombinação homóloga aparecem em freqüência extremamente baixa. Assim, cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum foi transformada usando uma solução contendo uma concentração alta de plasmídeo pΔldh56-1 pelo método de pulso elétrico, e então espalhada sobre meio de ágar CM-Dex contendo 25 μg/mL de canamicina (5g/L de glicose, 10 g/L de polipeptona, 10 g/L de extrato de levedo, 1 g/L de KH2PO4, 0,4 g/L de MgSO^HO, 0,01 g/L de FeSO4^7H2O, de 0,01 g/L de MnSO4^7H2O, 3 g/L de uréia, 1,2 g/L de hidrolisatos de feijão-soja, e pH 7,5 (KOH)), e cultivada a 31,5°C por cerca de 30 horas. Colônias que apareceram sobre este meio foram cepas nas quais recombinação homóloga havia ocorrido entre o fragmento de gene ldh do plasmídeo e o gene ldh no cromossomo de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum, e o gene de resistência à canamicina e o gene SacB derivado de plasmídeo foram inseridos no cromossomo.

[0100] Então, estes primeiros recombinantes foram cultivados em meio líquido CM-Dex não contendo canamicina a 31,5°C por uma noite. Após diluição apropriada, os recombinantes foram espalhados sobre meio de ágar Dex-S100 contendo 10% de sacarose (10 g/L de sacarose, 10 g/L de polipeptona, 10 g/L de extrato de levedo, 1 g/L de KH2PO4, 0,4 g/L de MgSO4.7H2O, 0,01 g/L deFeSO4.7H2O, de 0,01 g/L de MnSO4.4H2O, 3 g/L de uréia, 1,2 de g/L hidrolisatos de feijão-soja, 10 μg/L de biotina, e pH 7,5 (KOH)) e cultivados a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como um resultado, foram obtidas cerca de 50 cepas das quais o gene sacB foi curado por uma segunda recombinação e que havia se tornado insensível à sacarose.

[0101] As cepas assim obtidas incluem cepas nas quais o gene ldh cromossômico foi substituído por um derivado do tipicamente mutante de pΔIdh56-1, e cepas nas quais o gene ldh de tipo selvagem cromossômico permaneceu. Se o gene ldh foi um de tipo mutante ou de tipo selvagem foi facilmente checado por sujeição das células obtidas pela cultura sobre meio de ágar Dex-S10 à PCR direta. Usando iniciadores (SEQ ID NOS: 7 e 10) para amplificação por PCR para analisar o gene ldh, uma cepa cujo produto de PCR é menor do que o gene ldh de tipo selvagem que tem sido amplificado usando DNS cromossômico de cepa 2256 de tipo selvagem como um modelo foi selecionada como a cepa ldh-rompida, e chamada cepa 2256Δ(ldh). Esta cepa foi usada como uma cepa parental para preparar a seguinte cepa de gene ach rompida.

[0102] Quando fermentação é realizada sob condições anaeróbicas, uma quantidade considerável de ácido lático se acumula como um subproduto, de modo que é preferível que a atividade de lactato desidrogenase esteja deficiente. (JP11-206385; J Mol Microbiol Biotechnol. 2004;7(4):182-96.) Contudo, ácido L-glutâmico é normalmente produzido sob condições aeróbicas sob as quais a lactato desidrogenase não funciona, e não é necessário romper o gene ldh nas cepas de gene de acetil-CoA hidrolase- rompidas para a produção de ácido L-glutâmico. Exemplo 3

[0103] <Construção de uma cepa de gene de acetil-CoA hidrolase-rompida>

[0104] (A) Clonagem de um fragmento para romper o gene de acetil-CoA hidrolase

[0105] Um fragmento de gene contendo gene de acetil-CoA hidrolase (daqui em diante, o gene é referido como "ach") derivado de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum possuindo a ORF deletada foi obtido por PCR cruzada usando DNAs sintéticos planejados baseados na seqüência de nucleotídeos do gene de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 23: No. de Acesso de Banco de Dados do GenBank de NC_003450). Especificamente, PCR foi realizada por um método convencional usando DNA cromossômico de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum como um modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 13 e 14 como iniciadores para obter o fragmento C-terminal do gene ach. Por outro lado, para obter um fragmento N-terminal, PCR foi realizada por um método convencional usando DNA cromossômico de cepa 2256 de Brevibacterium lactofermentum como um modelo e DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 15 e 16 como iniciadores. SEQ ID NOS: 14 e 15 foram uma em relação à outra parcialmente complementares. Uma reação PCR foi realizada usando KOD-plus (fabricado por TOYOBO Co., LTD.). Após realizar 1 ciclo de retenção a 94°C por 2 minutos, o seguinte foi repetido por 30 ciclos: um ciclo de desnaturação a 94°C por 10 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, e alongamento a 68°C por 50 segundos. Então, para obter um fragmento de gene ach possuindo uma seqüência interna deletada, o fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal do gene ach foram misturados juntos em quantidades substancialmente equimolares. PCR foi realizada por um método convencional usando a mistura como um modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 17 e 18 como iniciadores. Uma reação de PCR foi realizada usando KOD-plus (fabricado por TOYOBO Co., LTD.). Após realização de 1 ciclo de retenção a 94°C por 2 minutos, o seguinte ciclo foi repetido por 30 ciclos: desnaturação a 94°C por 10 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, e alongamento a 68°C por 90 segundos. Após purificação do produto de PCR amplificado por uma maneira convencional, os produtos de PCR foram digeridos com XbaI e inserido no sítio XbaI do pBS4S construído no exemplo 1 (B) acima. Com o DNA resultante, células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricadas por TAKARA BIO INC.) foram transformadas e espalhadas sobre um meio de ágar LB contendo 100 μM de IPTG, 40 μg/mL de X-Gal, e 25 μg/mL de Km, seguido pela cultura por uma noite. Depois, colônias brancas individuais foram isoladas como transformantes. Plasmídeos foram extraídos dos transformantes e um possuindo o produto de PCR objetivo foi chamado pBS4S::Δach. Fig. 5 mostra um procedimento para construir pBS4S::Δ ach.

[0106] (B) Preparação de cepa ach-rompida

[0107] Visto que pBS4S::Δach preparado em (A) acima não contém uma região que permite replicação autônoma em células de bactérias corineformes, quando bactérias corineformes são transformadas com o plasmídeo, cepas com o plasmídeo incorporado em seu cromossomo por recombinação homóloga parecem como transformantes em freqüência extremamente baixa. Assim, cepa 2256 Δ( ldh) de Brevibacterium lactofermentum foi transformada usando uma solução contendo uma concentração alta de plamídeo pBS4S::Δach pelo método de pulso elétrico e espalhada sobre meio de ágar CM-Dex contendo 25 μg/mL de canamicina, e cultivada a 31,5°C por cerca de 30 horas. Cepas que apareceram sobre este meio foram cepas nas quais recombinação homóloga ocorreu entre o fragmento de gene ach do tipo deleção do plasmídeo e o gene ach no cromossomo de cepa 2256 Δ(ldh) de Brevibacterium lactofermentum, e nas quais o gene de resistência à canamicina e o gene SacB derivado do plasmídeo foram inseridos no cromossomo.

[0108] Então, estes primeiros recombinantes foram cultivados em um meio líquido CM-Dex não contendo canamicina a 31,5°C por uma noite. Após diluição apropriada, os recombinantes foram espalhados sobre um meio de ágar Dex-S10 contendo 10% de sacarose, e cultivados a 31,5°C por cerca de 30 horas. Como um resultado, foram obtidas cerca de 50 cepas das quais o gene SacB foi curado do cromossomo por uma segunda recombinação e que haviam se tornado insensíveis à sacarose.

[0109] As cepas assim obtidas incluem aquelas cepas nas quais o gene ach cromossômico foi substituído por um tipo mutante derivado de pBS4S::Δach e aquelas cepas nas quais o gene ach cromossômico de tipo selvagem permaneceu. Se o gene ach foi um de tipo mutante ou um de tipo selvagem foi facilmente confirmado pela sujeição das células obtidas pela cultura sobre meio de ágar Dex-S10 à PCR direta. Sob análise o gene ach usando iniciadores (SEQ ID NOS: 13 e 16), um fragmento de DNA de 2,9 kb para um gene ach de tipo selvagem e um fragmento de DNA de 1,4 kb para um gene ach de tipo mutante foram amplificados. Como um resultado da análise de cepas insensíveis à sacarose pelo método acima, cepas contendo apenas um gene ach de tipo mutante foram selecionadas, e a cepa ach- rompida obtida de cepa 2256 Δ( ldh) foi chamada 2256 Δ( ldh, ach). Exemplo 4

[0110] <Produção de ácido L-glutâmico por cepa ach- rompida>

[0111] (1) Avaliação da capacidade de produção de ácido L-glutâmico da cepa ach-rompida

[0112] Cepa 2256 Δ(ldh) e cepa 2256 Δ(ldh, ach) de Brevibacterium lactofermentum foram cultivadas para a produção de ácido L- glutâmico em um frasco do tipo S como segue. Uma alça de cada uma de cepa 2256 Δ(ldh) e de cepa 2256 Δ(ldh, ach) que haviam sido cultivadas sobre uma placa de ágar CMDex foi inoculada em 300 mL de meio de semente (60 g de glicose, 1,54 g de H3PO4, 1,45 g de KOH, 0,9 g de MgS(V7l I2O, 0,01 g de FeS(')-7l I2O, 670 μg de VBÍ-HCl, 40 μg de Biotina, 1,54 g de hidrolisatos de feijão-soja, 0,28 g de DL-metionina, 0,1 ml de AZ-20R por 1 litro de água purificada (ajustado para pI 7,2 com água amoniacal)), e cultivada com aeração a 1/1 vvm até que açúcar residual fosse completamente consumido enquanto era controlado o pI a 7,2 (NI3), a temperatura a 31,5°C, e PL>0.

[0113] 30 mL do caldo de cultura foram inoculados em 270 mL de meio de cultura principal (80 g de glicose, 3,46 g de KI2PO4, 1 g de MgSO-7112O, 0,01 g de FeSO^I I2O, 0,01 g de Mi)SOU-5l I2O, 230 μg de VBLHCl, 0.35 g de hidrolisados de feijão-soja, e 0,2 mL de AZ-20R por 1 litro de água purificada (ajustado para pI 7,3 com amônia)) e cultivada com aeração a 1/1 vvm enquanto se controlava a temperatura a 31,5°C, pI a 7,3, e PL>0. Antes que o açúcar residual fosse completamente consumido, 70 a 80 mL de uma solução de alimentação composta de 500 g de glicose e 0,2 ml de AZ-20R por 1 L de água purificada foram adicionados e a cultura foi continuada até que o açúcar residual fosse completamente consumido.

[0114] Após completitude da cultura, a quantidade de ácido L-glutâmico (Glu) que havia sido acumulada no caldo de cultura foi analisada em um Biotech Analyzer AS210 (fabricado por Asahi Kasei Corporation.) após diluição apropriada do caldo de cultura. Tabela 1 mostra os resultados.

[0115] Cepa 2256 Δ(ldh, ach) mostrou uma melhoria de cerca de 2% no rendimento em comparação com a cepa 2256 Δ( ldh) (a cepa parental). Em adição, a quantidade de, α-ceto-glutarato (α-KG), que é um precursor de ácido L-glutâmico, que havia se acumulado melhorou cerca de três vezes. Os resultados mostraram que eliminação ou decréscimo da atividade de ACH é efetiva na produção de ácido L-glutâmico. Exemplo 5

[0116] <Produção de L-alanina e de L-valina pela cepa deficiente em ach >

[0117] (1) Avaliação da cultura de cepa deficiente em ach

[0118] Cepa 2256 Δ(ldh) e cepa 256 Δ(ldh, ach) de Brevibacterium lactofermentum foram cultivadas para a produção de L- alanina e de L-valina em um frasco do tipo S como segue. Uma alça de cada uma de a cepa 2256 Δ(ldh) e a cepa 2256 Δ(ldh, ach), que haviam sido cultivadas em uma placa de ágar CMDex, foi inoculada em 300 mL de um meio de semente (60 g de glicose, 1,54 g de H3PO4, 1,45 g de KOH, 0,9 g de MgS(V7l I2O, 0,01 g de FeSO^I I2O, 670 μg de VBÍ-HCl, 40 μg de biotina, 1,54 g de hidrolisatos de feijão-soja, 0,28 g de DL-metionina, 0,1 mL de AZ- 20R por 1 litro de água purificada (ajustado para pI 7,2 com água amoniacal)), e cultivado com aeração a 1/1 vvm até que o açúcar fosse completamente consumido, enquanto eram controlados o pI a 7,2 com amônia, a temperatura a 31,5°C, e PL>0.

[0119] 30 ml do caldo de cultura foram inoculados em 270 mL de meio de cultura principal (80 g de glicose, 3,46 g de KI2PO4, 1 g de MgSO4.7H2O, 0.01 g de FeSO^I I2O, 0,01 g de Mi)SOU-5l I2O, 230 μg de VBLHCl, 0,35 g de hidrolisados de feijão-soja, e 0,2 ml de AZ-20R por 1 litro de água purificada (ajustado para pI 7,3 com amônia)) e cultivado com aeração a 1/1 vvm enquanto eram controlados a temperatura a 31,5°C, o pH a 7,3, e PL>0. Antes que o açúcar residual fosse completamente consumido, 70 a 80 mL de solução de alimentação composta de 500 g de glicose e 0,2 mL de AZ-20R por 1 L de água purificada foram adicionados e cultura foi continuada até que o açúcar residual fosse completamente consumido.

[0120] Após completitude da cultura, as quantidades de L- alanina (Ala) e de L-valina (Val) que haviam se acumulado no caldo de cultura foram analisadas com Amino Acid Analyzer L8500 (fabricado por Hitachi, Ltd.) após diluição apropriada do caldo de cultura. Tabela 2 mostra os resultados.

[0121] 2256 Δ( ldh, ach) mostrou melhoria de cerca de 2,2 vezes da quantidade de L-alanina acumulada, e melhoria de cerca de quatro vezes da quantidade de L-valina acumulada. Os resultados mostraram que a eliminação ou decréscimo de atividade de ACH é efetivo na produção de L- valina e de L-alanina.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0122] De acordo com a presente invenção, é melhorado o rendimento de fermentação de L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário.

Claims (3)

1. Bactéria corineforme transgênica, caracterizado pelo fato de possuir uma capacidade de produção de um L-aminoácido, e que é modificada de tal modo que a atividade de acetil-CoA hidrolase está diminuída em comparação com uma cepa de tipo selvagem ou não modificada como resultado de interrupção do gene cromossômico de acetil CoA hidrolase, e na qual o citado L-aminoácido é um ou mais L-aminoácidos gerados pela rota biossintética usando ácido pirúvico como um intermediário e selecionados a partir do grupo consistindo em ácido L-glutâmico, L-alanina, e L-valina, em que o referido gene da acetil-CoA hidrolase é um gene consistindo nos nucleotídeos 1037 a 2542 da SEQ ID NO: 23 ou sua sequência degenerada que gera uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentada pela SEQ ID NO: 24.

2. Bactéria corineforme transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a citada bactéria corineforme é adicionalmente modificada para aumentar a atividade de ácido glutâmico desidrogenase por transformação com um plasmídeo contendo um gene que codifica a glutamato desidrogenase; integrando o referido gene em um cromossomo por recombinação, conjugação ou transposição homóloga; ou pela introdução de uma mutação em uma região promotora do referido gene ou substituindo um promotor forte, em que o gene da ácido glutâmico desidrogenase é um gene consistindo nos nucleotídeos 573 a 1913 da SEQ ID NO: 25 ou sua sequência degenerada que gera a uma proteína consistindo em uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 26.

3. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender: cultivar a bactéria corineforme transgênica como definida na reivindicação 1 ou 2 em um meio; e coletar o L-aminoácido do meio, e no qual o citado L- aminoácido é um ou mais L-aminoácidos gerados via ácido pirúvico como um intermediário e selecionado a partir do grupo consistindo em L-glutâmico, L- alanina e L-valina.

Images