CN116555138B - 乙酰辅酶a合成酶acs突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用 - Google Patents

乙酰辅酶a合成酶acs突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2‑吡咯烷酮生产中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过在底盘菌中过表达大肠杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶，实现高效的乙酰辅酶A循环，减少了发酵过程中乙酸积累。进一步对乙酰辅酶A合成酶进行酶工程改造，通过突变提高了乙酰辅酶A合成酶的催化活性，进而进一步提高了2‑吡咯烷酮的产量，使构建的重组菌发酵96h的2‑吡咯烷酮产量达14.47～18.34g/L。

Description

乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用
技术领域
本发明涉及乙酰辅酶A合成酶ACS突变体及其在2-吡咯烷酮生产中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
2-吡咯烷酮(2-Pyrrolidone,2P)，又称2-氧代吡咯烷、γ-丁内酰胺，是一类具有一个五元内酰胺环的吡咯烷类化合物，广泛存在于天然产物和各类人工合成的化合物当中。2-吡咯烷酮是生产聚乙烯吡咯烷酮、锦纶-4和脑复康(酰胺吡咯烷酮)的原料，在医药领域和工业领域具有广泛且重要的用途。
2-吡咯烷酮可由化学法或生物法合成。其中化学法合成通常由γ-丁内酯经氨化而得。以丁二醇为原料，在200℃下，在铜催化剂存在下，生成γ-丁内酯，再与氨(或胺)反应，可制得2-吡咯烷酮。另一种化学合成方法为以4-羟基丁酰胺为原料，在高压和高温下脱水进行制备。
近年来已经有一些国内外的文献报道了关于使用微生物生产2-吡咯烷酮。目前产量最高的是，Tong Un Chae通过对大肠杆菌的改造，产量可达54g/L。通过过表达乙酰辅酶A转移酶基因act，可将γ-氨基丁酸转化为γ-氨基丁酸辅酶A(γ-GABA-CoA)，γ-氨基丁酸辅酶A可自反环化生成2-吡咯烷酮。
目前生物法的不足：产量比较低、发酵工艺复杂、成本高等缺陷，难以商业应用。在合成2-吡咯烷酮时，乙酰辅酶A转移酶是其关键性酶。使用乙酰辅酶A转移酶将γ-氨基丁酸转化为γ-氨基丁酸辅酶A时，需要乙酰辅酶A作为辅酶A供体，因此若乙酰辅酶A不足会严重影响2-吡咯烷酮的合成。同时在2-吡咯烷酮合成过程中，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A转移酶催化下将产生大量的乙酸，乙酸积累可显著影响细菌生长并降低目标产物产量。
发明内容
本发明提供一株产2-吡咯烷酮的谷氨酸棒杆菌底盘菌株，在谷氨酸棒杆菌FF10的基础上，表达了来源于Butyricicoccus faecihominis菌株的辅酶A转移酶，并进行了如下改进：
(1)敲除丙酮酸脱氢酶poxB，并增加乌头酸水合酶的表达；
(2)敲除磷酸乙酰转移酶，并增强6-磷酸果糖激酶的表达；
(3)敲除转录调节因子iolR和/或sugR，并过表达谷氨酸脱羧酶。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌FF10公开于公开号为CN114752544B的专利中。
在一种实施方式中，以pCES为载体，表达所述辅酶A转移酶；所述辅酶A转移酶具有Genbank登录号MCQ5130945.1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述丙酮酸脱氢酶poxB具有Genbank登录号CAF21272.1所示的氨基酸序列；所述乌头酸水合酶具有Genbank登录号BAB98933.1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述磷酸乙酰转移酶具有Genbank登录号：CAF20775.1所示的氨基酸序列；所述6-磷酸果糖激酶具有Genbank登录号：BAB98643.1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述转录调节因子iolR具有Genbank登录号ASW12947.1所示的氨基酸序列；所述转录调节因子sugR具有Genbank登录号ASW14321.1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶为谷氨酸脱羧酶GAD MUT128，是具有D38N/I89V/D92N//E93Q/S153T/D202N/P268T/E294R/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451*突变的谷氨酸脱羧酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，已公开于公开号为CN114752589B的专利中。
在一种实施方式中，所述底盘菌株还敲除了乙酸辅酶A转移酶actA，并表达了乙酰辅酶A合成酶。
在一种实施方式中，所述乙酸辅酶A转移酶actA的Genbank登录号为CAF21230.1。
在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶来源于大肠杆菌MG1655。
在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶acs的Genbank登录号为NP_418493.1。
在一种实施方式中，用SEQ ID NO.10所示的启动子Ptuf强化乙酰辅酶A合成酶的表达。
在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶是以SEQ ID NO.2所示序列为出发序列，进行了如下至少一处突变：
(1)将第72位天冬氨酸变为酪氨酸；
(2)将第155位异亮氨酸变为苏氨酸；
(3)将第167位丝氨酸变为苏氨酸。
本发明还要求保护乙酰辅酶A合成酶突变体，所述突变体含有SEQ ID NO.4、SEQIDNO.6、SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
本发明还要求保护所述底盘菌株在发酵生产2-吡咯烷酮中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述谷氨酸棒杆菌在CGXII培养基中发酵。
有益效果：本发明通过在底盘菌中过表达大肠杆菌来源的乙酰辅酶A合成酶，实现高效的乙酰辅酶A循环，减少了发酵过程中乙酸积累。进一步对乙酰辅酶A合成酶进行酶工程改造，通过突变提高了乙酰辅酶A合成酶的催化活性，进而进一步提高了2-吡咯烷酮的产量。
附图说明
图1为2-吡咯烷酮的合成途径以及参与的基因。
图2为2-吡咯烷酮的摇瓶发酵。
图3为乙酰辅酶A合成酶ACS及突变体酶活。
图4为携带乙酰辅酶A合成酶ACS突变体的2-吡咯烷酮摇瓶发酵结果。
具体实施方式
培养基：
CGXII培养基：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 20g/L，尿素5g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，CaCl2·2H2O 13.3mg/L，MOPS 42g/L，生物素0.2mg/L，微量元素溶液1ml/L，运用KOH将pH调节到7.0；其中，微量元素溶液：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·1H2O10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO4·5H2O 313mg/L，NiCl·6H2O 20mg/L。
检测方法：
利用液相色谱检测2-吡咯烷酮产量：安捷伦液相色谱仪1290，配备光电二极管阵列检测器，色谱柱：InfinityLab Poroshell 120EC C18(2.7μm,4.6×100mm，安捷伦)；流动相采用95％水-乙腈(含0.1％甲酸)混合溶液：甲醇(90:10)等度洗脱5min；流速0.3mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；进样量1uL。
乙酸的液相色谱检测条件为：使用Bio-Rad HPX-87H有机酸醇分析柱，柱温为60℃，流速0.5mL/min，使用波长为210nm紫外检测器进行测量。
乙酰辅酶A合成酶酶活检测方法：酶活检测反应体系体积为3mL，组成成分为：150μmol Tris–HCl(pH 8.5)、300μmol盐酸羟胺；15μmol MgCl2；15μmol醋酸钠；1μmol辅酶A；10μmol ATP二钠盐；酶溶液。反应后加入乙酰异羟肟酸，在波长520nm条件下测定所得溶液的吸光度。酶活单位(U)定义为每分钟产生1μmol乙酰辅酶A所需的酶量。
实施例1高产2-吡咯烷酮的谷氨酸棒杆菌工程菌株底盘细胞的构建
图1为2-吡咯烷酮的合成途径，敲除了前体GABA的代谢途径和一些支路途径，增强合成途径中一些关键基因表达，构建能够合成2-吡咯烷酮的谷氨酸棒杆菌。具体如下：
(1)构建谷氨酸棒杆菌FF14：
1)构建重组质粒pK18-ΔpoxB::acn，敲除丙酮酸脱氢酶poxB，同时增加乌头酸水合酶(acn)的表达：以谷氨酸棒杆菌FF10(菌株公开于公开号为CN114752544B的专利中)基因组为模板分别克隆poxB基因(Genbank登录号CAF21272.1)上下游1000bp的同源臂，克隆含启动子的乌头酸水合酶(Genbank登录号BAB98933.1)的编码基因，构建在poxB基因上下游同源臂之间，与Pk18mobsacB骨架通过Gibson方法相连，构建重组质粒pK18-ΔpoxB::acn，将获得的重组质粒pK18-ΔpoxB::acn转化至谷氨酸棒杆菌FF10感受态细胞中，重组得到菌株FF10/ΔpoxB::acn，命名为FF11。
2)按照步骤1)相同策略构建敲除磷酸乙酰转移酶(Genbank登录号：CAF20775.1)，并增强6-磷酸果糖激酶pfka(Genbank登录号：BAB98643.1)表达的重组质粒pK18-Δpta::pfka，将构建的重组质粒pK18-Δpta::pfka转化至步骤1)构建的FF11感受态细胞中，重组得到菌株FF11/Δpta::pfka，命名为FF12。
3)按照上述相同策略构建敲除转录调节因子iolR(Genbank登录号为ASW12947.1)，并过表达GAD MUT 128突变体(序列公开于公开号CN114752589B的专利中)基因的重组质粒pK18-ΔiolR::GADmut，增强γ-氨基丁酸的合成，将构建的重组质粒pK18-ΔiolR::GADmut转化至步骤2)构建的FF12感受态细胞中，得到重组菌株FF12/ΔiolR::GADmut，命名为FF13。
4)按照上述相同策略构建敲除转录调节因子sugR(Genbank登录号为ASW14321.1)，并过表达GAD MUT 128突变体基因的重组质粒pK18-ΔsugR::GADmut，增强γ-氨基丁酸的合成，将构建的重组质粒pK18-ΔiolR::GADmut转化至FF13感受态细胞中，得到重组菌株FF13/ΔsugR::GADmut，命名为FF14。
(2)构建重组质粒pK18-△actA::acs，敲除乙酸辅酶A转移酶actA(Genbank登录号为CAF21230.1)，并过表达大肠杆菌MG1655来源的乙酰辅酶A合成酶acs(Genbank登录号为NP_418493.1)：
以步骤(1)构建的谷氨酸棒杆菌FF14基因组为模板分别克隆乙酸辅酶A转移酶actA(Genbank登录号为CAF21230.1)上下游1000bp的同源臂；以大肠杆菌MG1655基因组为模板克隆乙酰辅酶A合成酶acs(Genbank登录号为NP_418493.1)，乙酰辅酶A合成酶acs扩增引物为：
acsEc-Ptuf-F：
GTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGACATACAatgagccaaattcacaaacacaccattc；
acsEc-actADn-R：gttgccgtaaatgtcagcctcgatgagaccgttttacgatggcatcgcgatagcctgc；
使用SEQ ID NO.10所示的启动子Ptuf增强乙酰辅酶A合成酶acs的表达，启动子Ptuf的扩增引物为：
Ptuf-actAUp-F：
gaaaaagtccgattacctgaggaggtattcaCAGATGTTATTGCTGAGCGCAACGGCAC；
Ptuf-BBR：TGTATGTCCTCCTGGACTTCGTGGTGGCTAC；
将启动子Ptuf和乙酰辅酶A合成酶acs片段构建在actA基因上下游同源臂之间，与Pk18mobsacB骨架通过Gibson方法相连，构建重组质粒pK18-△actA::acs。
(3)将获得的重组质粒pK18-△actA::acs转化至步骤(1)构建的谷氨酸棒杆菌FF14感受态细胞中，重组得到菌株FF14/△actA::acs，命名为P1。
按照步骤(2)相同策略构建敲除乙酸辅酶A转移酶actA(Genbank登录号为CAF21230.1)，并过表达枯草芽孢杆菌168来源的乙酰辅酶A合成酶acsA(Genbank登录号为CAB14946.1)的重组质粒pK18-△actA::acsA，乙酰辅酶A合成酶acsA扩增引物为：
acsA-Ptuf-F：GTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGACATACAatgaacttgaaagcgttaccagcaatag；acsA-actADn-R：gttgccgtaaatgtcagcctcgatgagaccgttttaatcctccattgttgacagatctc；
将构建的重组质粒pK18-△actA::acsA转化至步骤(1)构建的谷氨酸棒杆菌FF14感受态细胞中，重组得到菌株FF14/△actA::acsA，命名为P2。
实施例2辅酶A转移酶重组质粒和重组菌的构建
辅酶A转移酶(ACT)催化GABA生成2-吡咯烷酮，是2-吡咯烷酮生产菌中的关键性酶。选择来自Butyricicoccus faecihominis菌株的act基因(Genbank登录号为MCQ5130945.1)设计扩增引物：
ACTF:CATGTGTCAATTGAAAGGACATCAACGATGCGTTCTCTGGAGGGAGTCCG，ACTR:CTACTGCCGCCAGGCAGCGGCCGCTTTAAATCGCACCGCAGGCTGCCAG，
以合成的基因作为模板，通过PCR进行扩增得到目的片段，经DNA纯化试剂盒纯化后，通过Gibson将PCR扩增产物和质粒pCES(质粒公开于论文《Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacteriumglutamicum》)的主干片段相连，转化至E.coli DH5α中，测序验证其构建成功。将携带ACT编码序列的表达载体pCES-ACT分别转化到实施例1构建的谷氨酸棒杆菌工程菌株P1和P2中，得到2-吡咯烷酮生产重组菌P1pCES-ACT和P2 pCES-ACT。
实施例3利用谷氨酸棒杆菌工程菌株发酵生产2-吡咯烷酮
将实施例2中构建的2-吡咯烷酮生产重组菌，用于一步法从葡萄糖发酵生产2-吡咯烷酮。以FF14 pCES-ACT菌株为对照。将菌株FF14 pCES-ACT、P1 pCES-ACT和P2 pCES-ACT分别接种在BHIS培养基中，用试管于30℃培养12小时，获得菌浓为OD600为5.0的种子液；将种子液以10％的接种量接种至装液量50mL CGXII培养基的500mL摇瓶中，于30℃，200rpm发酵96小时。
图2显示了摇瓶发酵96小时2-吡咯烷酮产量和乙酸含量。发酵96小时后，与FF14pCES-ACT相比，过表达不同来源乙酰辅酶A合成酶的P1 pCES-ACT和P2 pCES-ACT乙酸积累量发生显著下降，从1.56g/L分别降低为0.136g/L和0.232g/L。
同时，P1 pCES-ACT和P2 pCES-ACT的2-吡咯烷酮产量均得到提高，从10.31g/L分别提高到13.86g/L和12.17g/L，由此可见大肠杆菌MG1655来源的乙酰辅酶A合成酶效果更好。
实施例4乙酰辅酶A合成酶acs的突变体的构建
对大肠杆菌MG1655来源的乙酰辅酶A合成酶(SEQ ID NO.2所示)进行酶工程改造，其中MUT1是在SEQ ID NO.2的基础上将第72位天冬氨酸变为酪氨酸，获得SEQ ID NO.4所示的突变体。MUT2是在SEQ ID NO.2的基础上将第72位天冬氨酸变为酪氨酸，并将第155位异亮氨酸变为苏氨酸，获得SEQ ID NO.6所示的突变体。MUT3是在SEQ ID NO.2的基础上将第72位天冬氨酸变为酪氨酸，将第155位异亮氨酸变为苏氨酸，并将第167位丝氨酸变为苏氨酸，获得SEQ ID NO.8所示的突变体。
将乙酰辅酶A合成酶ACS突变体通过序列对其基因合成，分别获得SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7所示的编码突变体MUT1、MUT2、MUT3的基因片段，以合成的基因序列为模板，设计ACS突变体基因通用克隆引物：
acs-pET-F：CTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAttacgatggcatcgcgatagcctgcttc；
acs-pET-R：AGCCATCATCATCATCATCACagccaaattcacaaacacaccattcctgc；
设计pET质粒载体克隆引物：
pET-BBF：GTGATGATGATGATGATGGCTGC；
pET-BBR：TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；
分别克隆片段和载体，将ACS突变体重新构建到pET质粒中，验证正确获得重组质粒。将重组质粒分别转化进大肠杆菌BL21(DE3)后，在LB培养基中于37℃振荡培养。当OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导基因表达。在25℃诱导8小时后，通过离心收获细胞。将收获的细胞重新悬浮在结合缓冲液(20mMTris-HCl[pH 7.8]、500mM氯化钠和10mM咪唑)中，接着通过超声破碎。收集破碎后的上清液，通过镍亲和层析来纯化ACS。纯化后的蛋白利用HisTrap HP 5-ml脱盐柱进行脱盐。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白纯化质量。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定蛋白质浓度。纯化后，测量其酶活，图3显示：野生型乙酰辅酶A合成酶ACS酶活为4.21mU/mg，突变体ACS MUT1酶活为4.6mU/mg，突变体ACS MUT2酶活为6.15mU/mg，突变体ACS MUT3酶活为7.33mU/mg。
实施例5乙酰辅酶A合成酶突变体在2-吡咯烷酮生产中的应用
按实施例1的方法分别构建携带实施例4突变体编码基因的重组质粒
pK18-△actA::acsMut1 pK18-△actA::acsMut2和pK18-△actA::acsMut3，分别转化至谷氨酸棒杆菌FF14感受态细胞中，重组得到菌株FF14/△actA::acsMut1(命名为P3)、FF14/△actA::acsMut2(命名为P4)、FF14/△actA::acsMut3(命名为P5)。
按实施例3的方法将上述重组菌株进行发酵，如图4所示，与携带野生型乙酰辅酶A合成酶ACS的P1 pCES-ACT相比较，菌株P3、P4和P5的2-吡咯烷酮产量均得到提高，从13.86g/L分别提高到14.47g/L、17.29g/L和18.34g/L。产量最高的P5 pCES-ACT相比P1pCES-ACT，2-吡咯烷酮产量提高了32.3％，相比较FF14 pCES-ACT的2-吡咯烷酮产量提高了77.9％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一株产2-吡咯烷酮的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌FF10的基础上，表达了来源于Butyricicoccus faecihominis的辅酶A转移酶，并进行了（1）~（4）所示改进：
（1）敲除丙酮酸脱氢酶poxB，并增加乌头酸水合酶的表达；
（2）敲除磷酸乙酰转移酶，并增强6-磷酸果糖激酶的表达；
（3）敲除转录调节因子iolR和sugR，并过表达谷氨酸脱羧酶；所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
（4）敲除了乙酸辅酶A转移酶，并表达了乙酰辅酶A合成酶；
所述乙酸辅酶A转移酶的氨基酸序列如Genbank登录号：CAF21230.1所示；所述丙酮酸脱氢酶poxB的氨基酸序列如Genbank登录号：CAF21272.1所示；所述乌头酸水合酶的的氨基酸序列如Genbank登录号：BAB98933.1所示；所述磷酸乙酰转移酶的氨基酸序列如Genbank登录号：CAF20775.1所示；所述6-磷酸果糖激酶的氨基酸序列如Genbank登录号：BAB98643.1所示；所述转录调节因子iolR的氨基酸序列如Genbank登录号：ASW12947.1所示；所述转录调节因子sugR的氨基酸序列如Genbank登录号：ASW14321.1所示；所述辅酶A转移酶的氨基酸序列如Genbank登录号：MCQ5130945.1所示；
所述乙酰辅酶A合成酶为（a）或（b）：
（a）氨基酸序列如Genbank登录号NP_418493.1所示；
（b）以SEQ ID NO.2所示序列为出发序列，进行了（i）~（iii）任一突变：
（i）将第72位天冬氨酸变为酪氨酸；
（ii）将第155位异亮氨酸变为苏氨酸；
（iii）将第167位丝氨酸变为苏氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pCES为载体，表达所述辅酶A转移酶。
3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，用SEQ ID NO.10所示的启动子Ptuf强化乙酰辅酶A合成酶的表达。
4.一种发酵生产2-吡咯烷酮的方法，其特征在于，以权利要求1~3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌为发酵菌株，在CGXII培养基中发酵；
所述CGXII培养基：葡萄糖 50g/L，(NH4)2SO4 20g/L，尿素 5g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，CaCl2·2H2O 13.3mg/L，MOPS 42g/L，生物素 0.2mg/L，微量元素溶液 1ml/L；其中，微量元素溶液：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·1H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O1g/L，CuSO4·5H2O 313mg/L，NiCl·6H2O 20mg/L。
5.权利要求1~3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，或权利要求4所述的方法在生产含2-吡咯烷酮的产品中的应用。
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