KR20140091742A - 발효법에 의한 목적 물질의 제조법 - Google Patents

발효법에 의한 목적 물질의 제조법 Download PDF

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Abstract

목적 물질인 2-케토글루타르산 또는 이의 유도체를 생산하는 능력을 갖고, 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 능력을 갖고, 또한, 크실로네이트데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성이 부여 또는 증강된 세균을, 탄소원으로서 크실로스를 함유하는 배지에서 배양하여 목적 물질을 당해 배지 중에 생성 축적시키고, 당해 배지로부터 목적 물질을 채취함으로써 목적 물질을 제조한다.

Description

발효법에 의한 목적 물질의 제조법{METHOD FOR PRODUCING TARGET SUBSTANCE BY FERMENTATION}
본 발명은, 미생물을 사용한 발효법에 의한 L-아미노산 등의 목적 물질의 제조법에 관한 것으로서, 상세하게는 크실로스를 원료로 하여 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
세균을 사용한 발효법에 의해 L-아미노산 등의 목적 물질을 제조하기 위해서는, 야생형 세균(야생주)을 사용하는 방법, 야생주로부터 유도된 영양 요구주를 사용하는 방법, 야생주로부터 여러가지 약제 내성 변이주로서 유도된 대사 조절 변이주를 사용하는 방법, 영양 요구주와 대사 조절 변이주의 양쪽의 성질을 가진 주를 사용하는 방법 등이 있다.
예를 들면, L-글루탐산은 주로 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속에 속하는 소위 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산균 또는 이들 변이주를 사용한 발효법에 의해 제조되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 1참조). 그 밖의 균주를 사용한 발효법에 의한 L-글루탐산의 제조법으로서는, 바실루스속, 스트렙토마이세스속, 페니실리움속 등의 미생물을 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 1 참조), 슈도모나스속, 아스로박터속, 세라티아속, 칸디다속 등의 미생물을 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 바실루스속, 아에로박터·아에로게네스(현 엔테로박터·아에로게네스) 등의 미생물을 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 3 참조), 에스케리키아·콜라이의 변이주를 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 4 참조) 등이 알려져 있다. 또한, 클렙시엘라속, 에르위니아속 또는 판토에아속, 엔테로박터속에 속하는 미생물을 사용한 L-글루탐산의 제조법도 개시되어 있다(예를 들면, 특허문헌 5 내지 7 참조).
최근, 목적 물질의 발효 생산에 재조합 DNA 기술을 이용하는 것이 실시되고 있다. 예를 들면, L-아미노산 생합성계 효소를 코드화하는 유전자의 발현을 증강하고(특허문헌 8, 특허문헌 9), 또는 L-아미노산 생합성계로의 탄소원의 유입을 증강함(특허문헌 10)으로써 세균의 L-아미노산 생산성을 향상시키는 것이 실시되고 있다.
종래, 발효법에 의한 물질의 공업 생산에 있어서는, 탄소원으로서 당류, 즉, 글루코스, 프룩토스, 슈크로스, 폐당밀(blackstrap molasses), 전분 가수분해물 등이 사용되었지만, 다소 고가라서 최근에는 식물 유래의 바이오매스 원료 등의 사용도 진행되고 있다.
이러한 바이오매스 원료로서 현재는 스타치(starch), 유지 등의 가식부(可食部) 원료의 사용이 주이지만, 장래적으로는 비가식부 원료, 구체적으로는 셀룰로스·헤미셀룰로스, 리그닌 등으로의 이행이 필요하다. 비가식부 바이오매스의 셀룰로스·헤미셀룰로스는 열이나 산 등을 사용하는 전(前)처리 행정, 셀룰라제 효소에 의한 당화 처리 행정 등을 거쳐 5탄당, 6탄당의 당으로 변환되어 발효의 원료로서 사용할 수 있다(특허문헌 11, 12). 이러한 5탄당, 6탄당의 혼합당을 아미노산 발효 등의 원료로 한 경우, 에스케리키아·콜라이는 글루코스를 우선적으로 자화(資化)하는 것이 알려져 있고, 결과적으로, 2단계 증식(디옥시)을 나타내거나 생육이 지연되는 현상이 확인되고 있다(비특허문헌 2, 3).
에스케리키아·콜라이에 있어서는, xylA 유전자가 코드화하는 크실로스이소머라제, xylB 유전자가 코드화하는 크실룰로키나제에 의한 크실로스 자화 경로가 알려져 있고, 에스케리키아·콜라이, 코리네박테리움·글루타미쿰에 도입하여, 크실로스로부터 L-아미노산을 생산할 수 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 5, 특허문헌 13, 비특허문헌 7).
한편, 이러한 종래 알려져 있는 경로를 경유하지 않고 크실로스로부터 크실론산을 경유하여, 2-케토글루타르산에 5단계로 이르는 경로가 카울로박터·크레센투스(Caulobacter crescentus)나 할로페락스·볼카니(Haloferax volcanii)에 존재하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 또한, 당해 경로를 에스케리키아·콜라이로 발현시킨 예가 알려져 있다(비특허문헌 8, 특허문헌 14).
특허문헌 1: 미국 특허 제3,220,929호 명세서 특허문헌 2: 미국 특허 제3,563,857호 명세서 특허문헌 3: 일본 특허 특공소32-9393호 공보 특허문헌 4: 일본 공개특허 특개평 5-244970호 공보 특허문헌 5: 일본 공개특허 특개2000-106869호 공보 특허문헌 6: 일본 공개특허 특개2000-189169호 공보 특허문헌 7: 일본 공개특허 특개2000-189175호 공보 특허문헌 8: 미국 특허 제5,168,056호 명세서 특허문헌 9: 미국 특허 제5,776,736호 명세서 특허문헌 10: 미국 특허 제5,906,925호 명세서 특허문헌 11: 일본 공표특허 특표평9-507386호 공보 특허문헌 12: 일본 공표특허 특표평11-506934호 공보 특허문헌 13: 유럽 특허 제1577396호 명세서 특허문헌 14: 미국 특허 제7,923,226호 명세서
비특허문헌 1: 아카시 쿠니히코 등 저서, 아미노산 발효, 학회출판센터, 195-215페이지, 1986년 비특허문헌 2: Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 Jul; 56(1-2): 120-125 비특허문헌 3: Gonzalez, R., Biotechnol. Prog. 2002 Jan-Feb; 18(1): 6-20 비특허문헌 4: Song S. et al., J. Bacteriol. 1997 Nov; 179(22): 7025-7032 비특허문헌 5: Tao H., et al., J. Bacteriol. 2001 May; 183(10): 2979-2988 비특허문헌 6: Stephens, C. et al., J. Bacteriol.2007 Mar; 189(5): 2181-2185 비특허문헌 7: Gopinath, V. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011 Jul 28 비특허문헌 8: Huaiwei, L et al., Bioresour Technol. 2011 Aug 22
본 발명은, 크실로스를 함유하는 배지에서 효율적으로 L-글루탐산 등의 목적 물질을 생산할 수 있는 미생물, 및 이를 사용한 목적 물질의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 5탄당, 6탄당 자화능을 갖는 아미노산 생산균의 육종 개발을 목적으로 하고, 크실로스로부터 크실론산을 경유하여, 2-케토글루타르산에 이르는 경로를 이용하여, 미생물의 육종 개발에 대하여 검토하였다. 그 결과, 본 경로를 발현시킨 미생물이 효율적으로 크실로스를 자화할 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 세균을, 탄소원으로서 크실로스를 함유하는 배지에서 배양하여, 목적 물질을 당해 배지 중에 생성 축적시키고, 당해 배지로부터 목적 물질을 채취하는, 목적 물질의 제조 방법으로서,
상기 목적 물질은 2-케토글루타르산 또는 이의 유도체이고,
상기 세균은, 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 능력을 갖고, 또한, 크실로네이트데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성이 부여 또는 증강된 것을 특징으로 하는, 방법.
(2) 상기 세균은, 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제를 각각 코드화하는 유전자가 발현 가능한 형태로 도입됨으로써, 이들 효소 활성이 부여 또는 증강된 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(3) 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제의 각각을 코드화하는 유전자가 카울로박터(Caulobacter)속, 에스케리키아(Escherichia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum)속, 악티노플라네스(Actinoplanes)속, 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 조벨리아(Zobellia), 써모바실루스(Thermobacillus)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 아조스피릴리움(Azospirillum)속, 할로모나스(Halomonas)속, 바실루스(Bacillus)속, 또는 아스페르길루스(Aspergillus)속에 속하는 미생물 유래인, 상기 방법.
(4) 상기 세균은, 하기 중 어느 하나에 의해 크실로스로부터 크실론산을 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 상기 방법:
(A) 크실로스데히드로게나제 활성, 또는 크실로스데히드로게나제 및 크실로노락토나제 활성을 부여 또는 증강시킴, 또는,
(B) 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 반응을 촉매할 수 있는 글루코스데히드로게나제 활성을 가짐.
(5) 상기 글루코스데히드로게나제는 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 하고, 또한, 상기 세균은, 피롤로퀴놀린퀴논 생산능을 갖거나, 또는 피롤로퀴놀린퀴논을 함유하는 배지에서 배양됨으로써 글루코스데히드로게나제 활성을 갖는, 상기 방법.
(6) 상기 세균은, 크실로스데히드로게나제, 또는 크실로스데히드로게나제 및 크실로노락토나제를 각각 코드화하는 유전자가 발현 가능한 형태로 도입됨으로써, 크실로스로부터 크실론산을 생성할 수 있는, 상기 방법.
(7) 상기 세균은, 2-케토글루타르산데히드로게나제의 활성이 저하되도록 추가로 개변(改變)된 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(8) 상기 세균은, 석신산데히드로게나제의 활성이 저하되도록 추가로 개변된 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(9) 상기 세균이 장내 세균 또는 코리네형(coryneform) 세균인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(10) 상기 세균이 판토에아(Pantoea)속 세균인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(11) 상기 세균이 판토에아·아나나티스(Pantoea ananatis)인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(12) 상기 세균이 에스케리키아(Escherichia)속 세균인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(13) 상기 세균이 에스케리키아·콜라이(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(14) 상기 세균이 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(15) 상기 세균이 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(16) 상기 2-케토글루타르산 유도체가, L-글루탐산, L-글루타민, L-아르기닌, L-시트룰린, L-오르니틴, L-프롤린, 푸트레신, 및 γ-아미노부티르산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 물질인, 상기 방법.
도 1은, icd 유전자 결손주를 이용한 씨. 크레센투스(C. crescentus) 유래 NXA 오페론 발현주 생육 상보 시험의 결과를 도시한 도면이다. E1-αKG, M9-αKG, M9-Xyl, E1-Xyl은 각각 2-케토글루타르산 또는 크실로스를 단일 탄소원으로서 포함하는 M9 최소 배지 및 E1 합성 배지를 나타낸다.
도 2는, E.coli ccrNXA 오페론을 발현시키는 이. 콜라이(E. coli) L-글루탐산 생산균의 L-글루탐산 생산 배양 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 이. 콜라이(E. coli) 고유의 크실로스 자화 경로 결손주를 숙주로 한 ccrNXA 오페론 발현주에 의한 L-글루탐산 생산 배양의 결과를 도시한 도면이다.
도 4는, 중카피(medium copy)형 벡터를 사용한 ccrNXA 오페론 발현주에 의한 L-글루탐산 생산 배양의 결과를 도시한 도면이다.
도 5는, 각종 미생물 유래의 xylD 호모로그 유전자 발현주에 의한 L-글루탐산 생산 배양의 결과를 도시한 도면이다. Atu, Hse, Amis, Aor은 각각 Agrobacterium tumefaciens, Herbaspirillum seropedicae, Actinoplanes missouriensis, Aspergillus oryzae를 나타낸다.
도 6은, 각종 미생물 유래의 xylX 호모로그 발현주에 의한 L-글루탐산 생산 배양의 결과를 도시한 도면이다. Art, Atu, Cne, Zga, Tco, Selo는 각각 Arthrobacter globiformis, Agrobacterium tumefaciens, Cupriavidus necator, Zobellia galactanivorans, Thermobacillus composti, Pseudomonas elodea를 나타낸다.
도 7은, 각종 미생물 유래의 xylA 호모로그 발현주에 의한 L-글루탐산 생산 배양 결과를 도시한 도면이다. Hbo, Abr는 각각 Halomonas boliviensis, Azospirillum brasilense를 나타낸다.
본 발명은, 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 세균을, 탄소원으로서 크실로스를 함유하는 배지에서 배양하여 목적 물질을 당해 배지 중에 생성 축적시키고, 당해 배지로부터 목적 물질을 채취하는 목적 물질의 제조 방법으로서,
상기 목적 물질은 2-케토글루타르산 또는 이의 유도체이고,
상기 세균은, 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 능력을 갖고, 또한, 크실로네이트데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시크실로네이트-2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성이 부여 또는 증강된 것을 특징으로 하는, 방법이다.
목적 물질은 2-케토글루타르산(α-케토글루타르산, αKG) 또는 이의 유도체이다. 2-케토글루타르산의 유도체로서는 L-글루탐산, L-글루타민, L-아르기닌, L-시트룰린, L-오르니틴, L-프롤린, 푸트레신, 및 γ-아미노부티르산이 열거된다.
「목적 물질 생산능」이란, 본 발명에 사용하는 세균을 배지에서 배양하였을 때에, 상기 목적 물질을 세포 또는 배지로부터 회수할 수 있는 정도로 생산하는 능력을 갖는 것을 말한다. 바람직하게는, 동일한 조건에서 배양된 야생주 또는 비개변주보다 다량의 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 것을 말한다. 세균은, 2종류 이상의 목적 물질의 생산능을 갖는 것이라도 좋다.
또한, 상기 목적 물질은, 프리체(free form) 및/또는 이의 염, 예를 들면 황산염, 염산염, 탄산염, 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염을 포함한다.
<1> 본 발명의 세균
본 발명의 세균은, 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 능력을 갖고, 또한, 크실로네이트데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성이 부여 또는 증강된 세균이다.
본 발명의 세균은, 크실로네이트데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성을 본래 갖지 않지만 이들 효소 활성이 부여된 세균이어도 좋고, 이들 효소 활성을 본래 갖고 있지만 이들 효소 활성이 증강된 세균이어도 좋다.
크실로스로부터 크실론산을 생성하는 능력은, 예를 들면,
1) 크실로스데히드로게나제 활성을 부여 또는 증강하는 것, 또는
2) 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 반응을 촉매할 수 있는 글루코스데히드로게나제 활성을 갖는 것,
중 어느 하나 또는 양쪽에 의해 달성된다.
1)에 해당하는 미생물로서는 에스케리키아속 세균, 코리네형 세균이, 2)에 해당하는 미생물로서는 판토에아속 세균 등이 열거된다.
1)에 관해서는 크실로스데히드로게나제 활성에 추가하여 크실로노락토나제를 더욱 강화하여도 좋다.
각 속에 속하는 세균에 대해서는 후술한다.
크실로스로부터 생성되는 크실론산은 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제에 의해 2-케토글루타르산으로 변환된다. 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제에 의해, 2-케토글루타르산에 이르는 경로는 Weimberg pathway라고도 불리고 있다(J. Biol. Chem., 236: 629-636). 본 명세서에서는 Weimberg pathway, 및 Weimberg pathway에 추가하여, 크실로스데히드로게나제 및/또는 크실로노락토나제에 의해 크실로스로부터 크실론산에 이르는 경로를 포함하여, NXA(Novel Xylose Assimilation) 경로라고 기재하는 경우가 있다.
세균이 Weimberg pathway를 갖고 있는지, 또는 동일 경로가 도입되었는지의 여부는 세균 추출물의 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제의 효소 활성을 측정하거나, 또는 Weimberg pathway를 보지하지 않은 주에서는 축적되는 크실론산을 자화하고 있는 것을 확인함으로써 결정할 수 있다. 또한, 세균이 NXA 경로를 보지하는지, 또는 동일 경로가 도입되었는지의 여부는 상기 각 효소에 추가하여, 크실로스데히드로게나제, 및/또는 크실로노락토나제의 효소 활성을 측정함으로써 결정할 수 있다. 또한, 이러한 효소 활성은 크실로스로부터 생성되는 크실론산을 측정함으로써도 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 크실로네이트데히드라타제(xylonate dehydratase)는 다음 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이며(EC4.2.1.82), D-크실로-알도네이트 데히드라타제(D-xylo-aldonate dehydratase), D-크실로네이트 데히드라타제(D-xylonate dehydratase), 및 D-크실로네이트 히드로-리아제(D-xylonate hydro-lyase)라고도 불린다.
D-크실론산→2-데하이드로-3-데옥시-D-크실로네이트+H2O
크실로네이트데히드라타제 활성은, 예를 들면, D-크실론산 용액과 피검시료를 혼합하여 반응시킨 후, 1% 세미카르바지드 염산염(semicarbazide hydrochloride) 수용액과 1.5% 아세트산 나트륨 수용액으로 이루어지는 반응 정지 액을 가하여 반응을 정지시키고, 희석액 250nm에서의 흡수를 측정함으로써 측정할 수 있다(Dahms, A.S., et al., Methods Enzymol. 1982; 90 Pt E: 302-5).
본 발명에 있어서, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제(2-케토-3-데옥시-xylonate dehydratase)는 이하의 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다(EC4.2.1.-).
2-데하이드로-3-데옥시-D-크실로네이트 →
2-옥소글루타르산 세미알데히드 + H2O
2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성은, 예를 들면, 기질인 2-케토-3-데옥시크실론산 용액과 피검시료를 혼합하여 반응시킨 후, 2-케토-3-데옥시크실론산의 감소를 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제(2-케토glutaric semialdehyde dehydrogenase)는 이하의 반응을 가역적으로 촉매하는 산화환원 효소이다(EC1.2.1.26).
2-옥소글루타르산 세미알데히드+NAD(P)→2-옥소글루타르산+NAD(P)H
2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성은, 예를 들면, NAD(P)의 환원을 측정함으로써 활성 측정이 가능하다. 예를 들면, 피로인산(pH8.5), NAD(P)와 피검시료의 혼합액에 2-케토글루타르산 세미알데히드를 가하여 340nm에서의 흡수를 측정함으로써 이 효소의 활성을 측정할 수 있다(Adams, E., et al,(1967) J. Biol. Chem. 242, 1802-1814).
크실로스데히드로게나제(D-크실로스-1-데히드로게나제, D-xylose 1-dehydrogenase)는 펜토스와 글루쿠론산의 상호 변환 효소의 하나이며, 다음 반응을 가역적으로 촉매하는 산화환원 효소이다(EC1.1.1.175).
D-크실로스+NAD(P)+→D-크실로노락톤+NAD(P)H+H+
D-크실로스-1-데히드로게나제 활성은, 예를 들면, 크실로스, 피검시료, 및 NAD(P)를 혼합하여 반응시켜 340nm에서의 흡수를 측정함으로써 측정할 수 있다(Stephens, C. et al., J. Bacteriol., 2007, 189(5): 181-2185).
또한, 카울로박터·크레센투스의 크실로스데히드로게나제는, D-크실로스→크실론산의 활성을 촉매하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 크실로노락토나제(xylonolactonase)는 이하의 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다(EC3.1.1.68).
D-크실로노락톤→D-크실론산
크실로노락토나제 활성은, 예를 들면, 크실로노락톤과 피검시료를 혼합하여 반응시켜 잔존하는 크실로노락톤을 하이드록사메이트법에 의해 정량함으로써 측정할 수 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol., 29: 375-379, 1988; Appl. Microbiol., Biotechnol., 27:333-336, 1988).
크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제의 각 효소를 코드화하는 유전자는 Weimberg pathway를 갖는 미생물이면 어느 것이어도 좋지만, 예를 들면, 카울로박터(Caulobacter)속, 에스케리키아(Escherichia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum)속, 악티노플라네스(Actinoplanes)속, 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 조벨리아(Zobellia)속, 써모바실루스(Thermobacillus)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 아조스피릴리움(Azospirillum)속, 할로모나스(Halomonas)속, 바실루스(Bacillus)속 등에 속하는 세균, 또는 아스페르길루스(Aspergillus)속에 속하는 사상균 등의 미생물 유래의 유전자가 열거된다.
카울로박터속 세균으로서는 카울로박터·크레센투스가 열거된다.
카울로박터·크레센투스로서는 CB-15주, CB-13주가 알려져 있고, 각각 ATCC 19089, ATCC33532로서 아메리칸·타입·컬처·콜렉션(주소 P. O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)에 보존되어 있다. 또한, NA-1000주(J. Bacteriol., 192: 3678-88(2010)), K31주도 사용하는 것이 가능하다.
카울로박터·크레센투스 CB15주, NA1000주, K31주의 게놈 서열은 각각 GenBank Accession Nos. AE005673, CP001340, CP000927로 등록되어 있다.
카울로박터·크레센투스 CB15주, NA1000주, 및 K31주 유래의 각 효소의 유전자는 GenBank에 하기의 Gene symbol로 등록되어 있다.
Figure pct00001
또한, 카울로박터·크레센투스 유래의 크실로스데히드로게나제 유전자, 및 2-케토글루타릭 세미알데히드데히드로게나제 유전자는 각각 ccrxylB, ccrxylA라고 기재하는 경우가 있다.
또한, NXA 경로(Novel Xylose Assimilation)의 효소로서는 카울로박터속 이외에, 예를 들면, 하이포크레아 제코리나(트리코더마 레쎄이)[Hypocrea jecorina(Trichoderma ressei)]의 크실로스 데히드로게나제(xylose dehydrogenase)(FEMS Microbiol Lett. 277, 249-254(2007)); 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 ycbD(2-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제(2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase), III형); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 2-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제(2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase), II형), 아조스피릴룸 브라실렌세(Azospirillum brasilense)의 2-케토글루타릭 세미알데히드 데히드로게나제(2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase), I형, II형, III형(이상, J. Bac. Chem., 282, 6685-6695, 2007), 및 이들 호모로그가 열거된다.
특히, 크실로네이트데히드라타제에 관해서는 에스케리키아속 세균, 예를 들면, 에스케리키아·콜라이의 yjhG 유전자, yagF 유전자를 사용하여도 좋다. 에스케리키아·콜라이의 yjhG 유전자는 서열번호 34에, yagF 유전자는 서열번호 36에 나타낸다. 또한, 크실로네이트데히드라타제에 관해서는 아그로박테리움속, 헤르바스피릴룸속, 악티노플라네스속, 아스페르길루스속에 속하는 미생물, 예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스(Arobacterium tumefaciens), 헤르바스피릴룸 세로페디카에(Herbaspirillum seropedicae), 악티로플라네스 미쏘우리엔시스(Actinoplanes missouriensis), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)의 xylD 유전자 호모로그를 사용하여도 좋다.
또한, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제에 관해서는 아그로박테리움속, 슈도모나스속, 조벨리아속, 써모바실루스속, 아스로박터속에 속하는 세균, 예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스 A(Agrobacterium tumefaciensA), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 슈도모나스 엘로데아(Pseudomonas elodea), 조벨리아 갈락타니보란스(Zobellia galactanivorans), 써모바실루스 콤포스티(Thermobacillus composti), 아스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)의 xylX 유전자 호모로그를 사용하여도 좋다.
또한, 2-케토글루타릭 세미알데히드데히드로게나제에 관해서는 아조스피릴리움속, 할로모나스속, 바실루스속에 속하는 세균의 유전자, 예를 들면, 아조스피릴룸 브라실렌세(Azospirillum brasilense), 할로모나스 볼리비엔시스(Halomonas boliviensis)의 xylA 유전자 호모로그, 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 ycbD를 사용하여도 좋다.
상기의 각 유전자의 염기서열 및 이들이 코드화하는 아미노산 서열은 표 11에 기재한다.
후술하는 바와 같이, 카울로박터·크레센투스에서는 NXA 경로의 5개 효소의 유전자는 오페론 구조를 갖는다. 이 오페론의 염기서열은 GenBank에 AAK22808_Caulobacter_crescentus의 accession No.로 등록되어 있다. 서열번호 23에 이 오페론의 염기서열을 나타낸다. 이 오페론에 의해 코드화되는 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 2-케토글루타릭 세미알데히드데히드로게나제, 크실로스데히드로게나제, 및 크실로노락토나제의 아미노산 서열을 각각 서열번호 24 내지 27에 나타낸다. 또한, 이 오페론 중의 xylD 유전자 염기서열 및 이에 의해 코드화되는 크실로네이트데히드라타제의 아미노산 서열을 각각 서열번호 28 및 29에 나타낸다. 서열번호 28의 염기서열은 서열번호 23의 5509 내지 7296 위치에 상당한다.
또한, xylX의 개시 코돈으로서 2개소(箇所)가 제안되어 있지만, 서열번호 23에서는 1175 내지 1177 위치를 개시 코돈으로서 기재하였다. xylD의 개시 코돈도 2개소가 제안되어 있고, 서열번호 28의 1 내지 3 위치, 또는 13 내지 15 위치를 개시 코돈으로서 사용하여도 좋다. 13 내지 15 위치가 개시 코돈인 경우에는 서열번호 29의 크실로네이트데히드라타제의 아미노산 서열은 5 위치의 Leu으로부터 시작된다.
글루코스데히드로게나제는 본래 이하의 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이지만(EC1.1.1.119), 「크실로스로부터 크실론산을 생성하는 반응을 촉매할 수 있는 글루코스데히드로게나제」란, 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 함으로써 D-크실로스를 D-크실로노락톤으로 변환할 수 있는 효소를 의미한다.
β-D-글루코스+NADP→D-글루코노-1,5-락톤+NADPH+H+
피롤로퀴놀린퀴논은 미생물이 원래 지닌 능력에 의해 생산되어도 좋고, 배지 중에 첨가되어도 좋다(Appl Environ Microbiol. 2009 May; 75(9) 2784-2791).
본 발명에서는, 2-케토글루타르산 또는 이의 유도체를 생산하는 세균으로서, 2-케토글루타르산의 분해 경로를 약화 또는 소실시키는 것이 바람직하다. 2-케토글루타르산의 분해 경로의 약화 또는 소실로서는, α-케토글루타르산데히드로게나제 및/또는 석신산데히드로게나제의 활성을 약화 또는 소실시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, α-케토글루타르산데히드로게나제(이하, 「α-KGDH」라고 하는 경우가 있다) 활성이란, α-케토글루타르산(2-옥소글루타르산)을 산화적으로 탈탄산하고, 석시닐-CoA(succinyl-CoA)을 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 상기 반응은 α-KGDH(E1o: α-케토글루타레이트 데히드로게나제(α-ketoglutarate dehydrogenase), EC:1.2.4.2), 디하이드로리포아미드 S-석시닐트랜스퍼라제(E2o: 디히드로리포아미드-S-석시닐트랜스퍼라제(dihydrolipoamide-S-succinyltransferase); EC:2.3.1.61), 디하이드로리포아미드 데히드로게나제(E3: 디히드로리포아미드 데히드로게나제(dihydrolipoamide dehydrogenase); EC:1.8.1.4)의 3종의 효소에 의해 촉매된다. 즉, 이들 3종류의 서브유니트는 각각 이하의 반응을 촉매하고, 이들 3개의 반응을 합한 반응을 촉매하는 활성을 α-KGDH 활성이라고 한다. α-KGDH 활성의 확인은, Shiio 등의 방법(Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980)에 따라 측정할 수 있다.
E1o: 2-옥소글루타레이트+[디히드로리포일리신-잔기 석시닐트랜스퍼라제]리포일리신=[디히드로리포일리신-잔기 석시닐트랜스퍼라제]S-석시닐디히드로리포일리신+CO2 {2-oxoglutarate+[dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine=[dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase]S-succinyldihydrolipoyllysine+CO2}
E2o: CoA+ 엔자임 N6-(S-석시닐디히드로리포일)리신=석시닐-CoA+엔자임 N6-(디히드로리포일)리신 {CoA+enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine=succinyl-CoA+enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine}
E3: 단백질 N6-(디히드로리포일)리신+NAD+=단백질 N6-(리포일)리신+NADH+H+ {protein N6-(dihydrolipoyl)lysine+NAD+=protein N6-(lipoyl)lysine+NADH+H+}
또한, α-KGDH는 옥소글루타르산데히드로게나제(oxoglutarate dehydrogenase), 2-옥소글루타르산데히드로게나제(2-oxoglutarate dehydrogenase)이라고도 불린다.
장내 세균과(科), 예를 들면, 판토에아·아나나티스에서는 이의 3종 각각의 효소 활성을 갖는 서브유니트 단백질이 복합체를 형성하고 있다. 그리고, 각 서브유니트는 각각 sucA, sucB 및 lpd에 의해 코드화되고, sucA , sucB 유전자는, 석시네이트데히드로게나제 철-황단백질 유전자(sdhB)의 하류에 존재한다(미국 특허 제6,331,419호). 또한, 이 특허에는 이들 유전자는 엔테로박터·아글로메란스 AJ13355의 유전자로서 기재되어 있지만, 이 균주는 나중에 판토에아·아나나티스로 재분류된다.
장내 세균의 α-KGDH를 코드화하는 유전자로서, 판토에아·아나나티스의 sucA, sucB 및 하류에 존재하는 sucC 유전자의 염기서열 및 각 서브유니트의 아미노산 서열은 EP2100957A1에 개시되어 있다. 또한, 에스케리키아·콜라이의 α-KGDH를 코드화하는 sucA, sucB 및 sucC 유전자는 각각 Genbank NP_415254, NP_415255에 개시되어 있다.
또한, 코리네형 세균에서는, E1o 서브유니트는 odhA 유전자(sucA 유전자라고도 불리는 GenBank Accession No. NC_003450의 NCgl1084로서 등록되어 있다)에 의해 코드화되고, E3 서브유니트는 lpd 유전자(GenBank Accession No. Y16642)에 의해 코드화되어 있다. 한편, E2o 서브유니트는 E1o 서브유니트와 함께 2기능성 단백질로서 odhA 유전자에 코드화되거나(Usuda et al., Microbiology 1996 142, 3347-3354 참조), 또는 odhA 유전자와는 별도의 GenBank Accession No. NC_003450의 NCgl2126으로서 등록되어 있는 유전자에 의해 코드화된다고 추측되고 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는 odhA 유전자는 E1o 서브유니트를 코드화하는 유전자이지만, 아울러 E2o를 코드화하여도 좋다.
브레비박테리움·락토페르멘툼의 odhA 유전자의 염기서열 및 E1o 서브유니트의 아미노산 서열(WO2006/028298), 상기 GenBank Accession No. NC_003450의 NCgl2126의 염기서열 및 이 서열에 의해 코드화되는 E2o 서브유니트의 아미노산 서열, 및 상기 GenBank Accession No. NC_003450의 NCgl1084의 염기서열 및 이 서열에 의해 코드화되는 E1o 서브유니트의 서열은 EP2100957A1에 개시되어 있다.
본 발명에서는, α-KGDH 서브유니트의 각각을 코드화하는 유전자 및 이들을 포함하는 유전자 클러스터를 총칭하여 「α-KGDH 코드화하는 유전자」라고 하는 경우가 있다.
석신산데히드로게나제(이하, 「SDH」라고 기재하는 경우가 있다)는 EC:1.3.99.1 이하의 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다. 본 발명에 있어서, SDH 활성이란 이 반응을 촉매하는 활성을 의미한다.
석신산+FAD→푸마르산+FADH2
SDH는 미생물종에 따라 3개 또는 4개의 서브유니트 구조로 구성되며, 이들 중 적어도 1종의 단백질을 정상적으로 기능하지 않도록 개변함으로써 활성을 저하 또는 결실시킬 수 있다. 구체적으로는, SDH는 이하의 서브유니트(괄호 안은 서브유니트를 코드화하는 유전자명)로 구성되어 있고, 종류에 따라서는 membrane anchor protein을 sdhC 단독으로, 또는 sdhC와 sdhD로 코드화되는 것이 있다.
SDHA: 플라보프로테인 서브유니트(flavoprotein subunit)(sdhA)
SDHB: Fe-S 프로테인 서브유니트(Fe-S protein subunit)(sdhB)
SDHC: 멤브레인 앵커 프로테인(membrane anchor protein)(sdhC)
SDHD: 멤브레인 앵커 프로테인(membrane anchor protein)(sdhD)
또한, SDH 서브유니트 복합체는 SDH와 푸마르산리덕타제의 양쪽 활성을 갖는 경우가 있다. 예를 들면, 코리네형 세균의 SDH 서브유니트 복합체는 SDH와 푸마르산리덕타제의 양쪽 활성을 갖는다(WO2005/021770).
SDH 활성의 확인은 2,6-디클로로인도페놀(2,6-dichloroindophenol)(DCIP)의 환원을 지표로서 측정함으로써 실시할 수 있다. 구체적인 방법은 Tatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch Microbiol (2005) 183:317-324에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서는, SDH 서브유니트의 각각을 코드화하는 유전자, 및 이들을 포함하는 오페론을 총칭하여 「SDH를 코드화하는 유전자」라고 하는 경우가 있다.
장내 세균의 SDH를 코드화하는 유전자로서, 판토에아·아나나티스의 유전자의 염기서열 및 각 서브유니트는 WO2008/075483에 개시되어 있다.
코리네형 세균의 SDH를 코드화하는 유전자로서는, 예를 들면, 코리네박테리움·글루타미쿰의 sdh 오페론(GenBank accession No.NCgl0359(sdhC） NCgl0360(sdhA) NCgl0361(sdhB)), 및 브레비박테리움·플라붐의 sdh 오페론(일본 공개특허 특개2005-095169호, EP1672077A1, WO2008/075483)의 서열이 개시되어 있다.
α-KGDH, SDH의 활성을 저하 또는 결손시키기 위해서는, 후술하는 L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성 저하에 대하여 기재한 방법을 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 미생물로서는, 크실로스를 세포 내에 흡수하는 효소의 활성이 강화되어도 좋다.
크실로스를 세포 내에 흡수하는 효소로서는 D-크실로스퍼미아제가 열거되고, D-크실로스퍼미아제를 코드화하는 유전자로서는 xylE 유전자가 열거된다. D-크실로스퍼미아제를 코드화하는 에스케리키아·콜라이 유래의 xylE 유전자의 염기서열, 및 이 유전자가 코드화하는 아미노산 서열을 각각 서열번호 30, 31에 나타낸다.
또한, 본 발명의 미생물로서는, 크실로스 이소머라제(xylA) 및 또는 크실룰로스키나제(xylB)를 약화시키는 것이 바람직하다. 또한, 에스케리키아·콜라이의 크실로스 이소머라제(xylA), 크실룰로스키나제(xylB) 유전자는 NC000913.1 gi: 16131436, 16131435에 각각 개시되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 크실론산이 배지 중에 축적하는 경우가 있고, 특히 에스케리키아·콜라이에서는 크실로네이트데히드라타제의 활성을 더욱 강화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 활성으로서 10㎛ol/min/mg-protein 이상, 바람직하게는 15㎛ol/min/mg-protein 이상, 더욱 바람직하게는 17㎛ol/min/mg-protein 이상 강화되는 것이 바람직하다.
다음에, 미생물에 목적 효소의 활성을 부여하거나 미생물의 목적 효소의 활성을 증대시키는 방법을 설명한다.
미생물이 원래 목적 효소의 활성을 갖지 않는 경우에는, 이 효소를 코드화하는 유전자를 이 미생물에 도입함으로써 이 효소 활성을 부여할 수 있다. 또한, 미생물이 목적 효소의 활성을 갖는 경우에는 목적 효소를 코드화하는 외래 유전자를 도입하거나, 목적 효소를 코드화하는 내인성의 유전자의 카피수를 증대시키거나, 또는 목적 효소 유전자의 프로모터 등의 발현 제어 서열을 개변하는 등을 하여, 이 유전자의 발현량을 증대시킴으로써 목적 효소 활성을 증대시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 「목적 효소 유전자를 도입한다」란, 원래 목적 효소 활성을 갖지 않는 미생물에 목적 효소 유전자를 도입할 뿐만 아니라, 당해 효소 활성을 갖는 미생물에 외래 유전자를 도입하는 것, 및 목적 효소 활성을 갖는 미생물에 내인성 유전자를 도입하여, 내인성의 목적 효소 유전자의 발현량을 증대시키는 것도 포함한다.
목적 효소 유전자를 도입하기 위해서는, 예를 들면, 이 유전자를 적당한 벡터 상에 클로닝하고, 수득된 벡터를 사용하여 숙주 미생물을 형질 전환한다.
형질 전환에 사용하는 벡터로서는, 사용하는 미생물로 자율 복제 가능한 플라스미드가 열거된다. 예를 들면, 장내 세균군에 속하는 미생물 중에서 자율 복제 가능한 플라스미드로서 pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29, pTWV228, pTWV229(pHSG, pSTV, pTWV는 다카라바이오사에서 입수 가능), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218(pMW는 니혼진사에서 입수 가능) 등이 열거된다. 또한, 코리네형 세균용의 플라스미드로서는 pAM330(일본 공개특허 특개소58-67699호 공보), pHM1519(일본 공개특허 특개소58-77895호 공보), pSFK6(일본 공개특허 특개2000-262288호 공보 참조), pVK7(미국 특허출원공개 명세서 2003-0175912), pAJ655, pAJ611, pAJ1844(일본 공개특허 특개소58-192900호 공보), pCG1(일본 공개특허 특개소57-134500호 공보), pCG2(일본 공개특허 특개소58-35197호 공보), pCG4, pCG11(일본 공개특허 특개소57-183799호 공보), pHK4(일본 공개특허 특개평5-7491호 공보) 등이 열거된다.
형질 전환법으로서는, 예를 들면, 에스케리키아·콜라이 K-12에 대하여 보고되어 있는 수용균 세포를 염화 칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증대시키는 방법(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), 바실루스·서브틸리스에 대하여 보고되어 있는 증식 단계의 세포로부터 컴피턴트 셀을 조제하여 DNA를 도입하는 방법(Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167) 등이 열거된다. 또는, 바실루스·서브틸리스, 방선균류 및 효모에 대하여 알려져 있는 DNA 수용균의 세포를, 재조합 DNA를 용이하게 흡수하는 프로토플라스트 또는 스페로플라스트의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용균에 도입하는 방법(Chang, S. and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）도 응용할 수 있다. 또한, 전기 펄스법(일본 공개특허 특개평2-207791호 공보)에 의해서도 미생물의 형질 전환을 실시할 수도 있다.
또한, 목적 효소 유전자의 도입은 숙주 미생물의 염색체 상에의 도입에 의해서 달성할 수 있다. 미생물의 염색체 상에 목적 효소 유전자를 도입하기 위해서는, 트랜스포손이나 Mini-Mu를 사용하여 염색체 상에 랜덤으로 도입하는 방법(일본 공개특허 특개평2-109985호 공보, US5,882,888, EP805867B1)이나, 염색체 DNA 상에 다중 카피(multiple copy) 존재하는 서열을 표적으로 이용하여 상동 재조합에 의해 실시하는 것도 가능하다. 염색체 DNA 상에 다카피 존재하는 서열로서는 반복성 DNA, 전이 인자의 단부에 존재하는 역반복(inverted repeat)을 이용할 수 있다. 또는, Red 드리븐 인테그레이션법(WO2005/010175)을 사용함으로써 목적 유전자를 염색체 상에 도입하는 것도 가능하다. 또한, P1 파지 등의 파지를 사용한 트랜스덕션(transduction)이나, 접합 전달 벡터에 의한 염색체 상에의 목적 유전자의 도입도 가능하다. 또한, WO03/040373에 기재되어 있는 바와 같이, 목적 물질 생산에 불필요한 유전자를 표적으로 하여 목적 효소 유전자를 도입하는 것도 가능하다. 이러한 방법으로 표적서열에 목적 효소 유전자를 1카피 또는 다카피 도입할 수 있다.
염색체 상에 이들 유전자가 전이된 것의 확인은 목적 유전자 또는 이의 일부와 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션을 실시함으로써 확인할 수 있다.
목적 유전자가 도입되는 카피수는 1카피 이상이면 어느 것이라도 좋지만, 2카피 이상, 보다 바람직하게는 3카피 이상, 더 바람직하게는 5카피 이상인 것이 바람직하다. 목적 유전자 중에서도 특히 크실로네이트데히드라타제 유전자는 2카피 이상 도입되는 것이 바람직하다.
또한, 목적 효소 유전자는 하기에 설명하는 바와 같이, 프로모터 등의 발현 조절 서열의 치환, 변이와 조합함으로써 활성을 최적화하는 것이 가능하다. 특히, 크실로네이트데히드라타제 유전자는 상기의 다카피화 대신에, 또는 다카피화와 더불어 발현 조절 서열의 치환, 변이에 의해 고발현시키는 것이 바람직하다.
목적 효소 유전자의 발현량을 증대시키는 방법으로서는 염색체 DNA 상 또는 플라스미드 상에서, 목적 효소 유전자의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 적절한 강도로 치환함으로써 이 유전자의 발현을 증강시키는 방법이 열거된다. 예를 들면, thr 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, pL 프로모터, tac 프로모터 등이 자주 사용되는 프로모터로서 알려져 있다. 또한, 후술하는 실시예에서 사용하고 있는 tac 프로모터의 베리언트(PtacA 프로모터, PtacB 프로모터)도 사용할 수 있다. 프로모터 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는 Goldstein과 Doi의 논문(Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128) 등에 기재되어 있다.
또한, 국제공개 WO00/18935에 개시되어 있는 바와 같이, 유전자의 프로모터영역에 수염기의 염기 치환을 도입하여 적절한 강도로 개변하는 것도 가능하다. 발현 조절 서열의 치환은, 예를 들면, 온도 감수성 플라스미드를 사용한 유전자 치환과 동일하게 하여 실시할 수 있다. 에스케리키아·콜라이나, 판토에아·아나나티스에 사용할 수 있는 온도 감수성 복제 기점을 갖는 벡터로서는, 예를 들면, WO 99/03988호 국제공개팜플렛에 기재된 온도 감수성 플라스미드 pMAN997이나 이의 유도체 등이 열거된다. 또한, λ파지의 레드 리콤비나제(Red recombinase)를 이용한 「Red 드리븐 인테그레이션법(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법(Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645)이나, Red 드리븐 인테그레이션법과 λ파지 유래의 절제 시스템(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호 참조) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법에 의해서도 발현 조절 서열의 치환을 실시할 수 있다. 또한, 발현 조절 서열의 개변은 상술한 바와 같은 유전자의 카피수를 높이는 방법과 조합하여도 좋다.
또한, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈 사이의 스페이서, 특히, 개시 코돈의 바로 상류의 서열에서의 여러 개의 뉴클레오티드의 치환이 mRNA의 번역 효율에 상당히 영향을 미치는 것이 알려져 있고, 이들을 개변함으로써 번역량을 향상시키는 것이 가능하다.
상기 증폭 플라스미드 또는 염색체 상에 목적 유전자를 도입하는 경우, 이들 유전자를 발현시키기 위한 프로모터는 사용하는 미생물에서 기능하는 것이면 어느 프로모터이어도 좋고, 사용하는 유전자 자신의 프로모터이어도 좋고, 개변한 것이라도 좋다. 사용하는 미생물로 강력하게 기능하는 프로모터를 적절히 선택하거나, 프로모터의 -35, -10 영역을 콘센서스 서열에 가까이함으로써도 유전자 발현량의 조절이 가능하다.
목적 효소의 활성이 증강되었는지 여부의 확인은 개변주와 친주(親株) 또는 비개변주의 목적 효소의 활성을 비교함으로써 실시할 수 있다. 개변주의 효소 활성이 친주 또는 비개변주보다 상승하고 있으면 이 효소의 활성이 증강된다. 또한, 친주가 목적 효소의 활성을 갖지 않는 경우에는, 개변주로 목적 효소의 활성을 검출할 수 있으면 이 효소의 활성이 증강된다.
목적 효소 유전자는, 상기의 서열 정보, 또는 이의 미생물에 있어서 공지된 유전자 또는 단백질의 서열 정보에 기초하여 제작된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR법, 또는 상기 서열 정보에 기초하여 제작된 올리고뉴클레오티드를 프로브로 하는 하이브리디제이션법에 의해, 목적 효소를 유지하는 미생물의 염색체 DNA 또는 염색체 DNA 라이브러리로부터 취득할 수 있다.
또한, 목적 효소, 및 이를 코드화하는 유전자는, 효소 활성을 유지하고 있는 한, 이들 호모로그나 인위적 개변체 등, 또는 보존적 변이를 갖는 단백질 또는 이를 코드화하는 것이면 좋다.
상기와 같은 호모로그, 인위적 개변체 또는 보존적 변이를 갖는 단백질 또는 이들을 코드화하는 유전자를 보존적 베리언트라고 기재한다.
목적 효소의 보존적 베리언트로서는, 예를 들면, 상기 각 효소의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 등을 포함하는 서열을 갖는 단백질이어도 좋다.
「1 또는 여러 개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 5개를 의미한다. 또한, 보존적 변이의 대표적인 것은 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는 Phe, Trp, Tyr 사이에서, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는 Leu, Ile, Val 사이에서, 극성 아미노산인 경우에는 Gln, Asn 사이에서, 염기성 아미노산인 경우에는 Lys, Arg, His 사이에서, 산성 아미노산인 경우에는 Asp, Glu 사이에서, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는 Ser, Thr 사이에서 서로 치환하는 변이이다. 보존적 치환이라고 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는 Ala로부터 Ser 또는 Thr으로의 치환, Arg로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp로부터 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및 Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환이 열거된다. 또한, 상기한 바와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는 유전자가 유래하는 미생물의 개체 차이, 종류의 차이에 근거하는 경우 등 천연에서 발생하는 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다. 이러한 단백질은, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해 코드화되는 단백질의 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하도록 야생형 유전자의 염기서열을 개변함으로써 취득할 수 있다.
또한, 상기와 같은 보존적 변이를 갖는 단백질은 아미노산 서열 전체에 대하여, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖고, 또한, 야생형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질이어도 좋다. 또한, 본 명세서에 있어서 「상동성」 (homology)」은 「동일성」 (identity)을 가리키는 경우가 있다.
야생형의 목적 효소 유전자는 상기와 같은 아미노산 서열을 코드화하는 것이면, 카울로박터·크레센투스나 할로페락스·볼카니 등의 유전자에 한정되지 않고, 임의의 코돈을 그것과 등가의 코돈으로 치환한 것이어도 좋다.
또한, 야생형 유전자는 상기의 각 효소 유전자의 상보 서열 또는 이 상보 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 야생형의 목적 효소와 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA라도 좋다. 여기에서, 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리 하이브리다이즈하고, 이보다 상동성이 낮은 DNA끼리 하이브리다이즈하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리다이제이션의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1% SDS, 더 바람직하게는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도, 온도로 1회, 보다 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
프로브로서는 각 유전자의 상보 서열의 일부를 사용할 수도 있다. 이러한 프로브는 공지된 유전자 서열에 기초하여 제작된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 이들 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 프로브로서 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리다이제이션의 세정 조건은 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS가 열거된다.
상기한 각 단백질의 보존적 베리언트 및 이를 코드화하는 유전자에 관한 기재는, 후술하는 목적 물질 생산균에 대하여 기재한 것 이외의 유전자에 대해서도 마찬가지로 적용된다.
본 발명에 사용하는 미생물은, 본래 목적 물질 생산능을 갖는 것이어도 좋고, 변이법이나 재조합 DNA 기술 등을 이용한 육종에 의해 목적 물질 생산능을 부여받은 것이어도 좋다.
본 발명에 사용되는 미생물로서는, 세균, 예를 들면, 에스케리키아속, 판토에아속, 엔테로박터속 등의 장내 세균과에 속하는 미생물이나, 코리네박테리움·글루타미쿰, 브레비박테리움·락토페르멘툼 등의 코리네형 세균, 바실루스·서브틸리스 등의 바실루스속 세균이 열거되지만 이들에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 「코리네형 세균」이란, 종래 브레비박테리움속으로 분류되었지만, 현재 코리네박테리움속으로 분류되는 세균도 포함하며(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)), 또한, 코리네박테리움속과 매우 근연(近緣)한 브레비박테리움속 세균을 포함한다. 이러한 코리네형 세균의 예로서 이하의 것이 열거된다.
코리네박테리움·아세토아시도필룸
코리네박테리움·아세토글루타미쿰
코리네박테리움·알카노리티쿰
코리네박테리움·칼루나에
코리네박테리움·글루타미쿰
코리네박테리움·릴리움
코리네박테리움·멜라쎄콜라
코리네박테리움·써모아미노게네스(코리네박테리움·에피시엔스)
코리네박테리움·헤르큘리스
브레비박테리움·디바리카툼
브레비박테리움·플라붐
브레비박테리움·임마리오필룸
브레비박테리움·락토페르멘툼(코리네박테리움·글루타미쿰)
브레비박테리움·로세움
브레비박테리움·사카롤리티쿰
브레비박테리움·티오게니탈리스
코리네박테리움·암모니아게네스
브레비박테리움·알붐
브레비박테리움·세리눔
마이크로 박테리움·암모니아필룸
구체적으로는 하기와 같은 균주를 예시할 수 있다.
코리네박테리움·아세토아시도필룸 ATCC13870
코리네박테리움·아세토글루타미쿰 ATCC15806
코리네박테리움·알카노리티쿰 ATCC21511
코리네박테리움·칼루나에 ATCC15991
코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
코리네박테리움·릴리움 ATCC15990
코리네박테리움·멜라쎄콜라 ATCC17965
코리네박테리움·써모아미노게네스 AJ12340(FERM BP-1539)
코리네박테리움·헤르큘리스 ATCC13868
브레비박테리움·디바리카툼 ATCC14020
브레비박테리움·플라붐 ATCC13826, ATCC14067
브레비박테리움·임마리오필룸 ATCC14068
브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869(코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13869)
브레비박테리움·로세움 ATCC13825
브레비박테리움·사카롤리티쿰 ATCC14066
브레비박테리움·티오게니탈리스 ATCC19240
코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC6871, ATCC6872
브레비박테리움·알붐 ATCC15111
브레비박테리움·세리눔 ATCC15112
미크로 박테리움·암모니아필룸 ATCC15354
이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면, 아메리칸·타입·컬처·콜렉션(ATCC: 주소 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America)에서 분양을 받을 수 있다. 즉, 각 균주마다 대응하는 등록 번호가 부여되어 있고, 이 등록 번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다(http://www.atcc.org/). 각 균주에 대응하는 등록 번호는 아메리칸·타입·컬처·콜렉션의 카탈로그에 기재되어 있다. 또한, AJ12340주는 1987년 10월 27일자로 통상성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(현 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터, 주소 우편 번호 305-5466 일본 이바라키현 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반찌 1 쥬오 다이6)에 FERM BP-1539의 수탁 번호로 부다페스트 조약에 기초하여 기탁되어 있다.
장내 세균과에 속하는 미생물로서는, 에스케리키아속, 엔테로박터속, 판토에아속, 클렙시엘라속, 세라티아속, 에르위니아속, 살모네라균속, 모르가넬라속 등에 속하고, 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터 베이스에 기재되어 있는 분류에 의해 장내 세균과에 속하는 것을 이용할 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). 장내 세균과의 친주로서는, 그 중에서도 에스케리키아속 세균, 엔테로박터속 세균, 판토에아속 세균을 사용하는 것이 바람직하다.
에스케리키아속 세균의 친주로서는, 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 나이트하르트 등의 저서(Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1)에 열거된 것을 이용할 수 있다. 그 중에서는, 예를 들면, 에스케리키아·콜라이가 열거된다. 에스케리키아·콜라이로서는 구체적으로는, 프로토타입의 야생주 K12주 유래의 에스케리키아·콜라이 W3110(ATCC 27325), 에스케리키아·콜라이 MG1655(ATCC 47076) 등이 열거된다.
특히, 판토에아속 세균, 에르위니아속 세균, 엔테로박터속 세균은, γ-프로테오박테리아로 분류되는 세균이며, 분류학적으로 대단히 근연하다(J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067). 최근, DNA-DNA 하이브리다이제이션 실험 등에 의해, 엔테로박터속에 속하는 세균에는, 판토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans) 또는 판토에아·디스페르사(Pantoea dispersa) 등으로 재분류되어 있는 것이 있다(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989; 39(3). p. 337-345), 또한, 에르위니아속에 속하는 세균에는 판토에아·아나나스(Pantoea ananas), 판토에아·스테와르티로 재분류되어 있는 것이 있다(International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43(1). p.162-173 참조). 또한, 판토에아·아나나스는 후에 추가로 판토에아·아나나티스로 재분류된다.
엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터·아글로메란스(Enterobacter agglomerans)(현재는 판토에아·아나나티스 등으로 재분류되어 있다), 엔테로박터·아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등이 열거된다. 구체적으로는 유럽 특허출원공개 952221호 명세서에 예시된 균주를 사용할 수 있다. 엔테로박터속의 대표적인 주로서 엔테로박터·아글로메란스 ATCC12287주(현재는 판토에아·아나나티스로 재분류되어 있다)가 열거된다.
판토에아속 세균의 대표적인 균주로서 판토에아·아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스테와르티(Pantoea stewartii), 판토에아·아글로메란스, 판토에아·시트레아(Pantoea citrea)가 열거된다. 구체적으로는 하기의 균주가 열거된다.
판토에아·아나나티스 AJ13355주(FERM BP-6614)(유럽 특허출원공개 0952221호 명세서)
판토에아·아나나티스 AJ13356주(FERM BP-6615)(유럽 특허출원공개 0952221호 명세서)
또한, 이들 균주는 유럽 특허출원공개 0952221호 명세서에는 엔테로박터·아글로메란스로서 기재되어 있지만, 현재는 상기한 바와 같이 16S rRNA의 염기서열 해석 등에 의해 판토에아·아나나티스로 재분류되어 있다.
판토에아·아나나티스 AJ13355주는 시즈오카현 이와타시의 토양에서, 저pH로서 L-글루탐산 및 탄소원을 포함하는 배지에서 증식할 수 있는 주로서 분리된 주이다. 또한, 이 주로부터 점성 물질 저생산 변이주로서 선택된 주가 SC17주이다(미국 특허 제6,596,517호). AJ13355주는 평성 10년 2월 19일에, 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(현 명칭, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터, 주소 우편번호 305-8566 일본 이바라키현 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반찌 1 쥬오 다이6)에 수탁 번호 FERM P-16644로서 기탁되어, 평성 11년 1월 11일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제 기탁에 이관되고, 수탁 번호 FERM BP-6614가 부여되어 있다. 또한, SC17주는 프라이빗 번호 AJ416이 부여되어, 평성 21년 2월 4일에 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(현 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터 주소 우편번호 305-8566 일본 이바라키현 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반찌 1 쥬오 다이6)에 국제 기탁되어, 수탁 번호 FERM BP-11091이 부여되어 있다.
또한, 판토에아·아나나티스의 L-글루탐산 생산균으로서 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주, AJ13601주, NP106주, 및 NA1주가 열거된다. SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주는 SC17주 유래의 sucA 유전자 결손주인 SC17sucA주(미국 특허 제6,596,517호)에, 에스케리키아·콜라이 유래의 시트르산 신타제 유전자(gltA), 포스포엔올피루브산 카복실라제 유전자(prpC), 및 글루타메이트 데히드로게나제 유전자(gdhA)를 포함하는 플라스미드 RSFCPG, 및 브레비박테리움·락토페르멘툼 유래의 시트르산 신타제 유전자(gltA)를 포함하는 플라스미드 pSTVCB를 도입하여 수득한 주이다. AJ13601주는 이 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주로부터 저pH 하에서 고농도의 L-글루탐산에 내성을 나타내는 주로서 선택된 주이다. 또한, NP106주는 AJ13601주로부터 플라스미드 RSFCPG+pSTVCB를 탈락시킨 주이다(WO2010/027045). AJ13601주는 1999년 8월 18일에, 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(현 명칭, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터 주소 우편번호 305-8566 일본 이바라키현 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반찌 1 쥬오 다이6)에 수탁 번호 FERM P-17516으로 기탁되어, 2000년 7월 6일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제 기탁에 이관되고, 수탁 번호 FERM BP-7207이 부여되어 있다. 이 주는 분리된 당시에는 엔테로박터·아글로메란스로 동정되어, 엔테로박터·아글로메란스로서 기탁되었지만, 16S rRNA의 염기서열 해석 등에 의해 판토에아·아나나티스로 재분류되어 있다.
NA1주는 상기 RSFCPG의 gltA 유전자를 메틸시트르산 신타제 유전자(prpC)로 치환하는 구조를 갖는 RSFPPG(WO2008/020654)를 갖는 NP106주에 상당하는 주이다(WO2010/027045).
에르위니아속 세균으로서는, 에르위니아·아밀로보라, 에르위니아·카로토보라가 열거되고, 클렙시엘라속 세균으로서는 클렙시엘라·플란티콜라가 열거된다. 구체적으로는 하기의 균주가 열거된다.
에르위니아·아밀로보라 ATCC15580주
에르위니아·카로토보라 ATCC15713주
클렙시엘라·플란티콜라 AJ13399주(FERM BP-6600)(유럽 특허출원공개 955368호 명세서)
클렙시엘라·플란티콜라 AJ13410주(FERM BP-6617)(유럽 특허출원공개 955368호 명세서)
이하, 상기와 같은 미생물에 목적 물질 생산능을 부여하는 방법, 또는 상기와 같은 미생물의 목적 물질 생산능을 증강하는 방법에 대하여 설명한다.
목적 물질 생산능을 부여하기 위해서는, 영양 요구성 변이주, 목적 물질의 아날로그 내성주 또는 대사 제어 변이주의 취득이나, 목적 물질의 생합성계 효소의 발현이 증강된 재조합주의 창제 등, 종래, 코리네형 세균 또는 에스케리키아속 세균 등의 아미노산 생산균의 육종에 채용된 방법을 적용할 수 있다(아미노산 발효, (주) 학회 출판 센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제 77 내지 100페이지 참조). 여기에서, 목적 물질 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 아날로그 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은 단독이어도 좋고, 2종 또는 3종 이상이어도 좋다. 또한, 발현이 증강되는 목적 물질 생합성계 효소도 단독이어도 좋고, 2종 또는 3종 이상이어도 좋다. 또한, 영양 요구성, 아날로그 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와 생합성계 효소의 증강이 조합되어도 좋다.
목적 물질 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, 아날로그 내성주, 또는 대사 제어 변이주를 취득하기 위해서는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉, X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하고, 수득된 변이주 중에서 영양 요구성, 아날로그 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, 또한, 목적 물질 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다. 또한, 목적 물질 생산균은 유전자 재조합에 의해 목적 물질의 생합성계 효소의 효소 활성을 증강함으로써도 실시할 수 있다.
이하, 목적 물질 생산능을 부여하는 방법, 및 목적 물질 생산능이 부여된 미생물에 대하여 예시한다.
육종에 의해 목적 물질 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, 목적 물질 생합성에 관여하는 효소를 코드화하는 유전자의 발현이 증강되도록 개변하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, 글루탐산데히드로게나제(gdhA), 글루타민신테타제(glnA), 글루탐산신타제(gltBD), 아코니티산히드라타제(acnA, acnB), 시트르산신타제(gltA), 포스포엔올피루브산카복실라제(ppc), 피루브산카복실라제, 피루브산데히드로게나제(aceEF, lpdA), 피루브산키나제(pykA, pykF), 포스포엔올피루브산신타제(ppsA), 엔올라제(eno), 포스포글리세로뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세린산키아나제(pgk), 글리세르알데히드-3-인산데히드로게나제(gapA), 트리오스인산 이소머라제(tpiA), 프룩토스비스인산알돌라제(fbp), 포스포프룩토키나제(pfkA, pfkB), 글루코스인산이소머라제(pgi), 메틸시트르산 신타제(prpC) 등이 열거된다. 또한, 효소명 뒤의 괄호안은 유전자명이다(이하의 기재에 있어서도 같음).
상기한 유전자 발현의 증강은 상술한 NXA 경로의 효소 활성 증강에 대하여 기재한 방법에 의해 실시할 수 있다.
상기 효소 유전자 중, 시트르산신타제 유전자, 피루브산데히드로게나제 유전자, 및/또는 글루탐산데히드로게나제 유전자의 발현이 증강하도록 개변된 미생물로서는 WO00/18935호 팜플렛, 유럽 특허출원공개 1010755호 명세서 등에 기재된 미생물을 예시할 수 있다.
L-글루탐산 생산능을 부여하기 위한 개변은, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기되어 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시하여도 좋다. L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서는 2-옥소케토글루타르산 데히드로게나제, 석신산 데히드로게나제, 이소시트르산 리아제, 아세토하이드록시산신타제, 아세토락트산 신타제, 포름산아세틸 트랜스퍼라제, 락트산 데히드로게나제, 글루탐산 데카복실라제, 1-피롤린 데히드로게나제, 아세틸-CoA 하이드라제(WO2006/057450) 등이 열거된다.
목적 효소의 활성을 저하 또는 결손시키는 방법으로서는, 통상의 변이 처리법 또는 유전자 재조합 기술에 의해, 게놈 상의 상기 효소의 유전자에 세포 중의 당해 효소의 활성이 저하 또는 결손되도록 하는 변이를 도입하면 좋다. 이러한 변이의 도입은, 예를 들면, 유전자 재조합에 의해, 게놈 상의 효소를 코드화하는 유전자를 결손시키거나, 프로모터나 샤인-달가르노(SD) 서열 등의 발현 조절 서열을 개변하거나 하는 등에 의해 달성된다. 또한, 게놈 상의 효소를 코드화하는 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 또한 시종 코돈을 도입하는 것(논센스 변이), 1 내지 2염기 부가·결실하는 프레임 시프트 변이를 도입하는 것, 유전자의 일부분, 또는 모든 영역을 결실시킴으로써도 달성할 수 있다(J. Biol. Chem. 272: 8611-8617 (1997)). 또한, 코드화 영역의 전체 또는 일부가 결실된 변이 효소를 코드화하는 유전자를 구축하여, 상동 재조합 등에 의해 당해 유전자로 게놈 상의 정상 유전자를 치환하는 것, 또는 트랜스포손, IS 인자를 당해 유전자에 도입함으로써도 효소 활성을 저하 또는 결손시킬 수 있다.
예를 들면, 상기한 효소의 활성을 저하 또는 결손시키는 변이를 유전자 재조합에 의해 도입하기 위해서는 이하와 같은 방법이 사용된다. 목적 유전자의 부분 서열을 개변하여 정상적으로 기능하는 효소를 생산하지 않도록 한 변이형 유전자를 제작하고, 당해 유전자를 포함하는 DNA로 장내 세균과에 속하는 세균으로 형질 전환하여, 변이형 유전자와 게놈 상의 유전자로 재조합을 일으키게 함으로써 게놈 상의 목적 유전자를 변이형으로 치환할 수 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환은, 「Red 드리븐 인테그레이션법(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)), Red 드리븐 인테그레이션법과 λ파지 유래의 절제 시스템(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호, 러시아 출원 2006134574호 참조) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제6303383호; 일본 공개특허 특개평05-007491호 공보). 또한, 상술한 바와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 부위 특이적 변이 도입은, 숙주 상에서 복제 능력을 갖지 않는 플라스미드를 사용하여도 실시할 수 있다.
또한, 코리네형 세균에 있어서 L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법으로서 yggB 유전자(NCgl 1221; NP_600492. Reports small-conductance...[gi: 19552490])를 증폭하는 방법, 코드화 영역 내에 변이를 도입한 변이형 yggB 유전자를 도입하는 방법을 사용하는 것도 가능하다(WO2006/070944).
또한, L-글루탐산 생산능을 향상시키는 방법으로서, D-크실로스-5-인산포스포케톨라제(D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase）및/또는 프룩토스-6-인산포스포케톨라제(fructose-6-phosphate phosphoketolase)를 코드화하는 유전자(이들을 합쳐서 포스포케톨라제라고 부른다)를 도입하는 방법이 열거된다. 예를 들면, 포스포케톨라제 활성이 상승된 미생물로서는 이하의 미생물이 열거된다(WO2006/016705).
브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869ΔsucA(pVK9-xfp),
브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869ΔsucA(pVK9-PS2_xpkA)
L-글루탐산 생산능은, 6-포스포글루콘산데히드라타제 활성 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산알돌라제 활성, 또는 이들 양쪽의 활성을 증강시킴으로써도 부여할 수 있다. 6-포스포글루콘산데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산알돌라제 활성을 상승시킨 미생물로서는, 일본 공개특허 특개2003-274988에 개시된 미생물을 들 수 있다. 또한, L-글루탐산 생산능은, L-글루탐산 배출 유전자인 yhfK, ybjL 유전자를 증폭함으로써도 부여할 수 있다(WO2005/085419, WO2008/133161).
또한, 본 발명에 사용하는 L-글루탐산 생산 미생물로서는, 산성 조건 하에서 배양하였을 때에 액체 배지 중에 L-글루탐산의 포화 농도를 초과하는 양의 L-글루탐산을 축적하는 능력(이하, 산성 조건 하에서의 L-글루탐산 축적능이라고 하는 경우가 있다)을 갖는 미생물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 유럽 공개공보 1078989호 기재의 방법에 의해, 저pH 환경 하에서 L-글루탐산에 대한 내성이 향상된 균주를 취득함으로써, 포화 농도를 초과하는 양의 L-글루탐산을 축적하는 능력을 부여할 수 있다.
L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키는 다른 방법으로서, 유기산 아날로그나 호흡 저해제 등에 대한 내성을 부여하는 방법이나, 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성을 부여하는 방법도 열거된다. 예를 들면, 모노플루오로아세트산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소50-113209), 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소57-065198), 우레아제를 약화시키는 방법(일본 공개특허 특개소52-038088), 말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소52-038088), 벤조피론 또는 나프토퀴논류에 대한 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소56-1889), HOQNO 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소56-140895), α-케토말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소57-2689), 구아니딘 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소56-35981), 페니실린에 대한 감수성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개평4-88994) 등이 열거된다.
이러한 내성균의 구체예로서는 하기와 같은 균주가 열거된다.
브레비박테리움·플라붐 AJ3949(FERMBP-2632; 일본 공개특허 특개소50-113209호 참조)
코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11628(FERM P-5736; 일본 공개특허 특개소57-065198호 참조)
브레비박테리움·플라붐 AJ11355(FERM P-5007; 일본 공개특허 특개소56-1889호 공보 참조)
코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11368(FERM P-5020; 일본 공개특허 특개소56-1889호 공보 참조)
브레비박테리움·플라붐 AJ11217(FERM P-4318; 일본 공개특허 특개소57-2689호 공보 참조)
코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11218(FERM P-4319; 일본 공개특허 특개소57-2689호 공보 참조)
브레비박테리움·플라붐 AJ11564(FERM P-5472; 일본 공개특허 특개소56-140895 공보 참조)
브레비박테리움·플라붐 AJ11439(FERM P-5136; 일본 공개특허 특개소56-35981호 공보 참조)
코리네박테리움·글루타미쿰 H7684(FERM BP-3004; 일본 공개특허 특개평04-88994호 공보 참조)
브레비박테리움·락토페르멘툼 AJ11426(FERM P-5123; 일본 공개특허 특개평56-048890호 공보 참조)
코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11440(FERM P-5137; 일본 공개특허 특개평56-048890호 공보 참조)
브레비박테리움·락토페르멘툼 AJ11796(FERM P-6402; 일본 공개특허 특개평58-158192호 공보 참조)
L-글루타민 생산능을 갖는 미생물로서 바람직한 예는 글루탐산데히드로게나제 활성을 강화한 세균, 글루타민 신세타제(glnA) 활성을 강화한 세균, 글루타미나제 유전자를 파괴한 세균이다(유럽 특허출원공개 1229121호, 1424398호 명세서). 글루타민 신세타제의 활성 증강은 글루타민아데니닐 트랜스퍼라제(glnE)의 파괴, PII 제어 단백질(glnB)의 파괴에 의해서도 달성할 수 있다. 또한, 에스케리키아속에 속하고, 글루타민 신세타제의 397 위치의 티로신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 변이형 글루타민 신세타제를 갖는 균주도 적합한 L-글루타민 생산균으로서 예시할 수 있다(미국 특허출원공개 제2003-0148474호 명세서).
L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강하는 다른 방법으로서, 6-디아조-5-옥소-노르류신 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개평3-232497), 퓨린 아날로그 내성 및 메티오닌설폭시드 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소61-202694), α-케토말레인산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허 특개소56-151495) 등이 열거된다. L-글루타민 생산능을 갖는 코리네형 세균의 구체예로서 이하의 미생물이 열거된다.
브레비박테리움·플라붐 AJ11573(FERM P-5492; 일본 공개특허 특개소56-161495)
브레비박테리움·플라붐 AJ11576(FERM BP-10381; 일본 공개특허 특개소56-161495)
브레비박테리움·플라붐 AJ12212(FERM P-8123; 일본 공개특허 특개소61-202694)
L-프롤린 생산능을 갖는 미생물로서는, 예를 들면, L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 γ-글루타밀 키나제를 유지하는 세균이나 L-프롤린 분해계가 약화된 세균이 열거된다. L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 γ-글루타밀키나제를 코드화하는 DNA를 사용하여 세균을 개변하는 방법은 Dandekar, A. M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)에 개시되어 있다. 또한, L-프롤린 분해계가 약화된 세균을 수득하는는 방법으로서는, 예를 들면, 프롤린 데히드로게나제 유전자에 효소 활성을 저하시키는 변이를 도입하는 방법이 열거된다. L-프롤린 생산능을 갖는 세균의 예로서는, 에스케리키아·콜라이 NRRL B-12403주 및 NRRL B-12404주(영국 특허 2075056), VKPM B-8012주(미국 특허공개 2002-0058315), 및 독일 특허 3127361호에 개시된 플라스미드 돌연 변이체나 Bloom F.R. 등의 문헌(The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34)에 개시된 플라스미드 변이체를 유지하는 균주 등이 열거된다.
또한, L-프롤린 생산능을 갖는 미생물로서 바람직한 것은 3,4-데하이드록시프롤린, 및 아자티딘-2-카르복실레이트에 내성인 주인 에스케리키아·콜라이 702주(VKPMB-8011)나, 702주의 ilvA 결손주인 702ilvA주(VKPMB-8012주)나, b2682 및 b2683, b1242 또는 b3434 유전자에 코드화되는 단백질의 활성을 증강한 에스케리키아·콜라이 등도 열거된다(일본 공개특허 특개2002-300874호 공보).
코리네형 세균의 L-프롤린 생산균으로서는 ＤL-3,4-데하이드로프롤린 내성주(FERM BP-1219. 미국 특허 4224409호 공보), 시트르산 합성 효소 활성이 이의 친주의 1.4배 이상으로 상승한 주(FERM P-5332, FERM P-5333, FERM P-5342, FERMP-5343 특허 1426823호), 아세트산 요구성이 부여된 주(FERM P-5931)가 열거된다.
L-아르기닌 생산능을 갖는 미생물로서는 α-메틸메티오닌, p-플루오로페닐알라닌, D-아르기닌, 아르기닌하이드록사믹산, AEC(S-(2-아미노에틸)-시스테인), α-메틸세린, β-2-티에닐알라닌, 또는 설파구아니딘에 내성을 갖는 에스케리키아·콜라이 변이주(일본 공개특허 특개소56-106598호 공보 참조) 등이 열거된다. 또한, L-아르기닌에 의한 피드백 저해에 내성 변이를 갖고, 또한, 높은 활성을 갖는 N-아세틸글루탐산 신타제를 유지하는 L-아르기닌 생산균인, 에스케리키아·콜라이 237주(러시아 특허출원 제2000117677호)도 적합한 L-아르기닌 생산주이다. 이 주는 2000년 4월 10일에 러시안·내셔널·콜렉션·오브·인더스트리얼·마이크로오거니즘(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)에 VKPM B-7925의 수탁 번호로 기탁되어, 2001년 5월 18일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁에 이관되었다. 237주의 유도체로, 아세트산 자화능을 향상시킨 L-아르기닌 생산균인 에스케리키아·콜라이 382주(일본 공개특허 특개2002-017342호 공보)를 사용할 수도 있다. 에스케리키아·콜라이 382주는 2000년 4월 10일 Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)에 VKPM B-7926의 수탁 번호로 기탁되어 있다.
또한, L-아르기닌 생산능을 갖는 미생물로서 L-아르기닌 생합성에 관여하는 효소를 코드화하는 유전자의 발현량을 향상시킨 미생물을 사용할 수 있다. 예를 들면, L-아르기닌 생합성계 효소로서는 N-아세틸글루탐산 신타제(argA), N-아세틸글루타밀인산 리덕타제(argC), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루탐산키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴디아세틸라제(argE), 오르니틴카르바모일 트랜스퍼라제(argF), 아르기니노석신산 신타제(argG), 아르기니노석신산 리아제(argH) 카르바모일인산 신타제(carAB)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 열거된다. N-아세틸글루탐산 신타제(argA)는, 야생형의 15위치 내지 19위치에 상당하는 아미노산 서열이 치환된 L-아르기닌에 의한 피드백 저해가 해제된 변이형의 유전자를 사용하면 보다 적합하다(유럽 출원공개 1170361호 명세서).
코리네형 세균의 L-아르기닌 생산균으로서는 L-아르기닌 생산능을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 코리네형 세균 야생주; 설파제, 2-티아졸알라닌 또는α-아미노-β-하이드록시발레르산 등의 약제에 내성을 갖는 코리네형 세균; 2-티아졸알라닌 내성에 추가하여, L-히스티딘, L-프롤린, L-트레오닌, L-이소류신, L-메티오닌 또는 L-트립토판 요구성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허 특개소54-44096호); 케토말론산, 플루오로말론산 또는 모노플루오로아세트산에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허 특개소57-18989호); 아르기니놀에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허 특개소 62-24075호); 또는 X-구아니딘(X는 지방산 또는 지방쇄의 유도체)에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허 특개평2-186995호) 등이 열거된다.
또한, L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네형 세균은 5-아자우라실, 6-아자우라실, 2-티오우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-아자시토신, 6-아자시토신 등에 내성인 변이주; 아르기닌하이드록사메이트, 2-티오우라실에 내성인 변이주, 아르기닌하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성인 변이주(일본 공개특허 특개소49-126819호); 히스티딘아날로그 또는 트립토판아날로그에 내성인 변이주(일본 공개특허 특개소52-114092호); 메티오닌, 히스티딘, 트레오닌, 프롤린, 이소류신, 리신, 아데닌, 구아닌 또는 우라실(또는 우라실 전구체)의 적어도 하나에 요구성을 갖는 변이주(일본 공개특허 특개소52-99289호 참조); 아르기닌하이드록사메이트에 내성인 변이주(일본국 특허 특공소51-6754호); 석신산 요구성 또는 핵산 염기아날로그에 내성인 변이주(일본 공개특허 특개소58-9692호); 아르기닌 분해능이 결손ㄷ되, 아르기닌의 안타고니스트 및 카나바닌에 내성을 갖고, 리신을 요구하는 변이주(일본 공개특허 특개소52-8729호); 아르기닌, 아르기닌하이드록사메이트, 호모아르기닌, D-아르기닌, 카나바닌 내성, 아르기닌하이드록사메이트 및 6-아자우라실 내성의 변이주(일본 공개특허 특개소53-143288호); 및 카나바닌 내성의 변이주(일본 공개특허 특개소53-3586호) 등으로서 육종할 수 있다.
L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네형 세균의 구체예로서는 하기와 같은 균주가 열거된다.
브레비박테리움·플라붐 AJ11169(FERM P-4161)
브레비박테리움·락토페르멘툼 AJ12092(FERM P-7273)
브레비박테리움·플라붐 AJ11336(FERM P-4939)
브레비박테리움·플라붐 AJ11345(FERM P-4948)
브레비박테리움·락토페르멘툼 AJ12430(FERM BP-2228)
또한, 아르기닌 리프레서인 ArgR을 결손된 주(미국 특허출원공개 2002-0045223호, 세포 내의 글루타민 신테타제 활성을 상승시킨 주(미국 특허출원공개 2005-0014236호 공보)를 사용할 수 있다.
L-시트룰린, L-오르니틴도 L-아르기닌과 생합성 경로가 공통되고, N-아세틸글루탐산 신타제(argA), N-아세틸글루타밀인산 리덕타제(argC), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루탐산 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 데아세틸라제(argE)의 효소 활성을 상승시킴으로써 이들의 생산능을 부여할 수 있다(국제공개 2006-35831호 팜플렛).
γ-아미노부티르산(GABA; gamma-aminobutiric acid) 생산균으로서는 글루탐산 데카복실라제의 활성을 증강시킨 주(Microb Cell Fact. 2010 Nov 12; 9:85. Amino Acids. 2010 Nov; 39(5): 1107-16 US20100324258호 공보)를 사용할 수 있다.
푸트레신 생산균으로서는 4-히드록시부티레이트 리덕타제(4-hydroxybutyrate reductase); 석시닐-CoA 리덕타제(알데히드 형성)(succinyl-CoA reductase(aldehyde forming)); 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 강화한 주(WO2011047101호 공보), 감마-아미노부티르알데히드 데히드로게나제(gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 강화한 주(FEBS Lett. 2005 Aug 1; 579(19): 4107-12.)를 사용할 수 있다.
<2> 목적 물질의 제조 방법
상기와 같은 세균을, 탄소원으로서 크실로스를 함유하는 배지에서 배양하여, 목적 물질을 당해 배지 중에서 생성 축적시키고, 당해 배지로부터 목적 물질을 채취함으로써 목적 물질을 제조할 수 있다.
배양에 사용하는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기염류, 그 이외에 필요에 따라 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지 모두 사용할 수 있다.
탄소원으로서는 크실로스를 포함하는 한, 다른 탄소원, 예를 들면, 글루코스, 글리세롤, 프룩토스, 슈크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 전분 가수분해물, 당밀 등의 당류를 사용할 수 있고, 그 이외에 아세트산, 시트르산 등의 유기산, 에탄올 등의 알코올류도 단독 또는 다른 탄소원과 병용하여 사용할 수 있다.
크실로스와 다른 탄소원의 혼합 비율은 어느 것이어도 좋지만, 크실로스: 다른 탄소원(중량비)은 바람직하게는 1:0.1 내지 100, 보다 바람직하게는 1:0.1 내지 10, 보다 바람직하게는 1:0.1 내지 5, 보다 바람직하게는 1:1 내지 5, 더 바람직하게는 1:1 내지 3이다.
배지 중의 탄소원의 농도로서는, 목적 물질을 제조하는데 적합한 농도이면 어떤 농도로 사용하여도 좋다. 배지 중의 탄소원 농도로서는, 바람직하게는 0.1w/v% 내지 50w/v% 정도, 보다 바람직하게는 0.5w/v% 내지 40w/v% 정도, 특히 바람직하게는 1w/v% 내지 30w/v% 정도이다.
크실로스, 또는 크실로스와 글루코스와 같은 6탄당의 혼합물은 바이오매스가 충분히 이용되지 않은 공급원으로부터 수득할 수 있다. 이들 5탄당, 6탄당은 증기 및/또는 농산 가수분해, 희산 가수분해, 셀룰라제와 같은 효소를 사용하여 가수분해, 또는 알칼리 처리에 의해 식물 바이오매스로부터 유리될 수 있다. 기질이 셀룰로스계 재료인 경우, 셀룰로스는 동시에 또는 개별적으로 당에 가수분해되어 목적 물질의 생산에 사용할 수 있다. 헤미셀룰로스는 일반적으로 셀룰로스보다도 당에 가수분해되기 쉽기 때문에 셀룰로스계 재료를 미리 가수분해하여 5탄당을 분리하고, 계속해서 증기, 산, 알칼리, 셀룰라제 또는 이들 조합에 의한 처리에 의해 셀룰로스를 가수분해하여 6탄당을 생성시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서의 배지 중에 포함되는 크실로스는, 미생물에 글루코스, 갈락토스, 아라비노스로부터의 변환 경로를 보유시켜 각 헥소스로부터 크실로스(D-크실로스)로 변환시킴으로써 공급하여도 좋다.
질소원으로서는 암모니아, 우레아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염 또는 질산염 등을 사용할 수 있다. 유기 미량 영양소로서는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또는 이들을 함유하는 펩톤, 카자미노산, 효모 엑기스, 대두 단백 분해물 등을 사용할 수 있고, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보충하는 것이 바람직하다. 무기염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 사용할 수 있다.
배양은, 바람직하게는, 발효 온도 20 내지 45℃, pH를 3 내지 9로 제어하고, 통풍 배양을 실시한다. 또한, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또는 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 바람직하게는 10시간 내지 120시간 정도 배양함으로써 배양액 중 또는 균체 내에 목적 물질이 축적된다.
또한, 목적 물질이 L-글루탐산인 경우, L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여 배지 중에서 L-글루탐산을 석출시키면서 생성, 축적시키도록 배양을 실시할 수도 있다. L-글루탐산이 석출되는 조건으로서는, 예를 들면, pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 더 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0을 들 수 있다. 또한, 산성 조건 하에서의 생육의 향상, 및 효율적인 L-글루탐산의 석출을 양립하기 위해서는, pH는 바람직하게는 5.0 내지 4.0, 보다 바람직하게는 4.5 내지 4.0, 더 바람직하게는 4.3 내지 4.0인 것이 바람직하다. 또한, 상기 pH에서의 배양은 배양의 전체 기간이어도 좋고, 일부 기간이어도 좋다.
채취되는 목적 물질은 목적 물질 이외에 미생물 균체, 배지 성분, 수분 및 미생물의 대사 부산물을 포함하여도 좋다. 채취된 목적 물질의 순도는 50% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상이다(JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878)).
배양 종료 후의 배양액으로부터 목적 물질을 채취하는 방법은 공지된 회수 방법에 따라서 실시하면 좋다. 예를 들면, 종래부터 주지되어 있는 이온 교환 수지법(Nagai, H. et al.: Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), 막 분리법(일본 공개특허 특개평9-164323호, 일본 공개특허 특개평9-173792호), 정석법(WO2008/078448, WO2008/078646), 그 밖의 방법을 조합함으로써 목적 물질을 채취할 수 있다.
또한, 목적 물질이 배지 중에 석출되는 경우에는, 원심 분리 또는 여과 등에 의해 회수할 수 있다. 또한, 배지 중에 석출된 목적 물질은 배지 중에 용해되어 있는 목적 물질을 정석(晶析)한 후에 함께 단리하여도 좋다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 더 구체적으로 설명한다.
이하의 실시예에서 사용한 배지 조성을 이하에 나타낸다.
〔LB 배지〕
박토트립톤 10g/L, 효모 엑기스 5g/L, NaCl 5g/L, pH 7.0
〔LBGM9〕
LB 배지에, 최소 배양 성분(글루코스 5g/L, 황산마그네슘 2mM, 인산칼륨 3g/L, 염화나트륨 0.5g/L, 염화암모늄 1g/L, 인산2나트륨 6g/L)을 첨가한 것
〔MSII-Glucose 배지〕
A구
글루코스 40g/L
MgSO4·7H2O 0.5g/L
B구
(NH4)2SO4 20g/L
KH2PO4 2g/L
NaCl 0.5g/L
효모 엑기스 2g/L
CaCl2·7H2O 0.25g/L
FeSO4·7H2O 20mg/L
MnSO4·nH2O 20mg/L
Trace element※ 4ml/l
L-Lys 200mg/L
DL-Met 200mg/L
DAP 200mg/L
A구, B구를 각각 120℃, 20분 오토클레이브한 후 혼합한다.
※Trace element
CaCl2·2H2O 0.66g/L
ZnSO4·7H2O 0.18g/L
CuSO4·5H2O 0.16g/L
MnSO4·4H2O 0.15g/L
CoCl2·6H2O 0.18g/L
H3BO3 0.10g/L
Na2MoO4 0.30g/L
〔MSII-Xylose 배지〕
MSII-Glucose 배지의 글루코스(40g/L)를 크실로스(40g/L)로 치환한 것.
〔MSII-GX 배지〕
MSII-Glucose 배지의 글루코스(40g/L)를 글루코스(20g/L)와 크실로스(20g/L)의 혼합물로 치환한 것.
〔MSII-SX 배지〕
MSII-Glucose 배지의 글루코스(40g/L)를 슈크로스(20g/L)와 크실로스(20g/L)의 혼합물로 치환한 것.
〔E1 합성 배지〕
A구
NH4Cl 20mM
MgSO4·7H2O 2mM
Na2HPO4 40mM
KH2PO4 30mM
CaCl2 0.01mM
FeSO4·7H2O 0.01mM
MnSO4·4-5H2O 0.01mM
Citrate 5mM
pH Free
필터 멸균
B-1구
탄소원 50(또는 100)mM
필터 멸균
B-2구
티아민-HCl 1mM
필터(0.22㎛) 멸균 후, B-1에 첨가
C구
MES-NaOH(pH6.8) 50mM
필터(0.22㎛) 멸균
A 내지 C구는 모두 5배 농도의 용액을 조제하고, 스톡 솔루션(Stock solution)으로 한다.
〔CM-Dex 배지〕
폴리펩톤 10g/L
효모 엑기스 10g/L
글루코스 5g/L
KH2PO4 1g/L
요소 3g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·5H2O 0.01g/L
콩 여액(대두 가수분해물) 1.2g/L(T-N)
KOH를 사용하여 pH7.5로 조정.
〔Glc 배지〕
글루코스 80g/L
(NH4)2SO4 30g/L
KH2PO4 1g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·5H2O 0.01g/L
비타민B1 200㎍/L
비오틴 60㎍/L
콩 여액(대두 가수분해물) 0.48g/L(T-N)
KOH를 사용하여 pH8.0으로 조정.
〔Xyl 배지(비오틴 제한)〕
Glc 배지의 글루코스(80g/L)를 크실로스(80g/L)로 치환하고, 또한 비오틴을 제외한 것.
〔MS 배지〕
A구
글루코스 또는 크실로스 40g/L
글루코스와 크실로스(1:1) 40g/L
MgSO4·7H2O 1g/L
B구
(NH4)2SO4 20g/L
KH2PO4 1g/L
효모 엑기스 2g/L
FeSO4·7H2O 10mg/L
MnSO4·nH2O 10mg/L
A구, B구를 각각 120℃, 20분 오토클레이브한 후 혼합하고, 약전 탄산칼슘 50g/L을 가한다.
〔실시예 1〕판토에아·아나나티스로의 NXA 경로의 도입
(1) NXA 경로 도입용 플라스미드 pTWV228Ptac_ccrNXA의 구축
NXA 경로가 보고되어 있는 공지의 세균으로서 씨. 크레센투스(C. crescentus)(Stephens, C. et al., J. Bacteriol. 2007, 189(5): 181-2185)가 알려져 있다. 씨. 크레센투스(C. crescentus)의 NXA 경로의 각 효소를 코드화하는 유전자의 취득에 있어서 이하의 방법을 채용하였다.
씨. 크레센투스(C. crescentus)의 게놈은 약 4Mb이며, 5개의 유전자가 오페론 구조를 이루고 있다(Journal of Bacteriology, 189: 2181-2185, 2007). 씨. 크레센투스(C. crescentus)에서, 게놈 공개 균주(CB-15(ATCC19089). ATCC로부터 입수 가능)로부터 게놈을 추출하고, 각 유전자의 클로닝과 발현 벡터 구축을 시험해 보았다.
클론테크 인-퓨전 클로닝 키트(Clontech In-Fusion Cloning Kit)를 이용하여 발현 벡터의 구축을 실시하였다.
이하 4개의 DNA 단편을 i), ii), iii)에 대해서는 씨. 크레센투스(C. crescentus) CB-15(ATCC19089)의 염색체 DNA를 주형으로서, iv)에 대해서는 pMW119를 주형으로서, PCR로 증폭시켰다. 괄호 안은 PCR에 사용한 프라이머를 나타낸다.
i) tac 프로모터 서열(이하, 「Ptac」라고 기재한다)(PtwvPtacf: 서열번호 1, 0823Ptacr: 서열번호 2)
ii) xylX, ccrxylA, ccrxylB, 및 xylC를 포함하는 단편(Ptac0823f: 서열번호 3, 0819r: 서열번호 4)
iii) xylD와 이의 하류 약 120bp 영역(0819f: 서열번호 5, 219cc0819r: 서열번호 6)
iv) pMW119/SmaI(219f: 서열번호 7, 219r: 서열번호 8)
계속해서, 정제한 i), ii)의 PCR 산물을 주형으로 하고, PtwvPtacf 및 0819r을 프라이머로 하여 이들 PCR 산물이 결합한 단편 Ptac_xylXccrAccrBC를 PCR로 증폭시켰다. 수득된 Ptac_xylXccrAccrBC와, 상기 iii) 및 iv)의 PCR 산물의 3가지를, 클론테크 인-퓨전 클로닝 키트(Clontech In-Fusion Cloning Kit)를 사용하여 인-퓨전(In-Fusion) 반응하고, 반응물로 이. 콜라이(E. coli) JM109주를 형질 전환하여 형질 전환체로부터 목적의 플라스미드 pMW119Ptac_ccrNXA를 취득하였다.
다음에, pMW119Ptac_ccrNXA를 주형에, PtwvPtacf 및 219CC0819r를 프라이머로 하여 Ptac을 포함하는 ccrNXA 오페론을 증폭시켰다. 수득된 증폭 산물과, SmaI로 소화(消化)한 pTWV228을 인-퓨전(In-Fusion) 반응하고, 반응물로 이. 콜라이(E. coli) JM109주를 형질 전환하여 형질 전환체로부터 목적의 플라스미드 pTWV228Ptac_ccrNXA를 취득하였다.
(2) pUT399에 카나마이신 내성 Mini-Mu를 탑재한 플라스미드 pUT-MuKm의 구축
pUT399는 R6K의 복제 기점을 갖고, 접합 전달에 필요한 mob 영역을 포함하고 있고, pir 유전자를 갖지 않는 균주에서는 복제할 수 없는 플라스미드이다(Biomedal사에서 입수 가능: R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 참조, 미국 특허 제7090998호).
pCE1134(일본 공개특허 특개평2-109985호 공보)는 MudII1734를 포함하는 플라스미드이며, Mini-Mu 유닛 내에 Km 내성 유전자와 lacXYZ 유전자를 탑재하고 있다. 이하의 방법에 의해, pCE1134의 Mini-Mu 유닛 내에서 lacXYZ 영역을 결실한 DNA 단편을 조제하여, pUT399에 클로닝하였다.
pCE1134를 주형으로서, 프라이머 attL-F(서열번호 9)와 nptII-R(서열번호 10)을 사용하여, left end와 트랜스포사제를 코드화하는 MuAB 유전자의 리프레서인 MuCts, Km 내성 유전자를 포함하는 단편을 PCR에 의해 취득하였다. 또한, 마찬가지로 pCE1134를 주형으로서, 프라이머 attR-F(서열번호 11)와 attR-R(서열번호 12)을 사용하여 right end를 포함하는 단편을 취득하였다. 이들 2단편을 주형으로서, 프라이머 attL-F와 attR-R를 사용하여 크로스 오버 PCR(cross over PCR)을 실시하고, 수득된 약 2.3kb의 단편을 pUT399의 SmaI 사이트에 도입하였다. 이렇게 하여 플라스미드 pUT-MuKm을 수득하였다.
상기와 같이 하여 구축한 Mini-Mu 유닛은, 전이 유닛 내에 Km 내성 유전자와 클로닝 사이트로서 8염기 인식의 NotI 사이트를 갖기 때문에, 각종 유전자가 클로닝 가능하다.
(3) pTWV228Ptac_ccrNXA의 약제 내성 유전자의 치환
pTWV228Ptac_ccrNXA의 암피실린 내성 유전자를 λRed법에 의해 카나마이신 내성 유전자로 치환하였다.
pUT_MuKm을 주형으로서, 프라이머 Ap-Km-fw(서열번호 13)와 Ap-Km-rv(서열번호 14)를 사용하여, 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 서열(ntpII 단편)을 증폭시켰다.
PCR 반응은 프라임스타 HS 폴리머라제(PrimeSTAR HS polymerase)(다카라바이오)를 사용하고, 이 효소에 부속의 프로토콜에 따라 실시하였다.
pTWV228Ptac_ccrNXA를 갖는 이. 콜라이(E. coli) JM109에, 헬퍼 플라스미드인 RSF_Red_TER(US20090286290A1, WO2008/075483)를 도입하고, 50ml LB(1mM IPTG, 100mg/L 암피실린, 25mg/L 클로람페니콜을 포함한다) 배지에서 37℃로 OD660값이 0.4가 될 때까지 배양하였다.
상기 RSF_Red_TER은 λ-의존적 인테그레이션(Red-driven integration)을 일으키기(λRed법) 위한 헬퍼 플라스미드이며, lacI 유전자에 의해 λ의 gam, bet 및 exo의 각 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 또한, 이 플라스미드는 레반스크라제 유전자(sacB)를 포함하고 있고, 이 유전자에 의해, 슈크로스를 포함하는 배지에서 세포로부터 플라스미드를 탈락시킬 수 있다. 또한, 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하고 있다.
상기한 바와 같이 하여 배양한 균체를 집균한 후, 10% 글리세롤 용액으로 2회 원심 세정하고, 1mL 10% 글리세롤 용액에 현탁하였다. 그 후에 상기에서 수득된 ntpII 단편으로 일렉트로포레이션법에 의해 형질 전환하고, 40mg/L의 카나마이신을 포함한 LB 한천 배지에서 형질 전환체를 선발하였다. 수득된 형질 전환체를 LB(1mM IPTG, 10% 슈크로스, 40mg/L 카나마이신을 포함한다) 한천 배지에 식종계대하고, 37℃에서 하룻밤 배양하여 단일 클론을 취득하였다. 수득된 형질 전환체가 100mg/L인 암피실린을 포함한 LB 한천 배지 상에서 생육 불가능한 것을 확인하고, pTWV228Ptac_ccrNXA의 암피실린 내성 유전자가 카나마이신 내성 유전자로 치환된 것을 확인하였다. 수득된 플라스미드를 pTWVPtac_ccrNXA_Km으로 하였다.
(4) xylD를 포함하는 플라스미드의 구축
클론테크 인-퓨전 클로닝 키트(Clontech In-Fusion Cloning Kit)를 이용하여 구축을 실시하였다.
우선, 각각의 유전자를 pUC18에 클로닝한 플라스미드를 주형으로 하고, xylD_IFS_5742-10-5(서열번호 15)와 xylD_IFS_5742-10-6(서열번호 16)을 프라이머로 하여 xylD를 포함하는 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 구체적으로는 이하의 방법으로 SfiI 사이트를 제거한 pUC18에 클로닝하였다.
씨. 크레센투스(C. crescentus) CB-15주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, CC0819-01F_4691-88-7 (서열번호 17) 및 CC0819-01R_5659-9-1(서열번호 18), 및 CC0819-02F_5659-9-2(서열번호 19) 및 CC0819-02R_4691-88-10(서열번호 20)을 프라이머로 하는 PCR에 의해, 각각 1130 bp 및 653 bp의 단편을 증폭시켰다. 계속해서, 인비트로 어셈블(in vitro assemble)법(Nature Methods 6(5), 343-345, 2009)으로, SmaI로 소화한 pUC18과, 상기 2개의 증폭 단편을 어셈블함으로써 SfiI 사이트가 제거되어, xylD 유전자가 삽입된 pUC18-xylD를 수득하였다.
한편, pSTV28-Ptac-Ttrp을 상법에 따라 SmaI로 소화하였다. xylD 유전자의 DNA 단편과 벡터 DNA 단편을 인-퓨전(In-Fusion) 반응하고, 반응물로 이. 콜라이(E. coli) JM109주를 형질 전환하여 형질 전환체로부터 목적의 플라스미드, pSTVPtac_xylD_Ttrp을 취득하였다.
pSTV28-Ptac-Ttrp은 이하와 같이 하여 구축하였다.
서열번호 32의 서열을 갖는 tac 프로모터 및 trp 터미네이터의 서열을 갖는 DNA 단편(PtacTtrp)을 합성하고, pMW219 벡터의 KpnI-BamHI 사이에 연결함으로써 pMW219-Ptac-Ttrp을 수득하였다. KpnI 및 BamHI로 각각 소화한 pSTV28과 pMW219-Ptac-Ttrp을 등량 혼합하고, 라이게이션 반응 후 JM109를 형질 전환하여, Cm 내성이 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 추출하였다. 수득된 플라스미드에 대하여, KpnI와 BamHI에 의한 더블 다이제스쳔(double digestion)에 의해 상정되는 단편 길이 약 400bp와 3 kb(정확하게는 389bp와 2994bp)에 1개씩 밴드가 있는 것을 확인하고, pSTV28-Ptac-Ttrp을 수득하였다.
(4) NXA 경로가 도입된 판토에아·아나나티스에 의한 L-글루탐산 생산
상기 pTWVPtac_ccrNXA_Km으로, 일렉트로포레이션법(미국 특허 6682912호 참조)에 의해 피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주를 형질 전환하였다. pTWVPtac_ccrNXA_Km을 도입한 주는 LBGM9에 카나마이신을 최종 농도 40mg/L이 되도록 첨가한 플레이트 배지를 사용하였다.
약제를 첨가한 LBGM9 플레이트에, 34℃에서 하룻밤 배양한 피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주, 및 각 형질 전환주의 균체를 1/6 플레이트만큼 긁어내어, MSII-Xylose, 또는 MSII-GX 배지 5ml를 포함한 큰 시험관에 식균하고, 34℃, 120rpm에서 48시간 배양하여, 잔당, L-글루탐산(Glu) 및 크실론산의 축적량을 측정하였다. 결과를 표 2, 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주를 글루코스와 크실로스의 혼합 탄소원(MSII-GX 배지)으로 배양하였을 때에는 글루탐산 수율은 25.7%이었다(표 2). 이 때, 크실론산의 축적이 관찰되고, 크실로스는 대부분 크실론산으로 변환되는 것이 시사되었다. 피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주에서 크실론산의 축적이 관찰된 것은 피. 아나나티스(P. ananatis)의 글루코스데히드로게나제의 활성에 의한 것이라고 추측된다.
한편, 피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주에 pTWVPtac_ccrNXA_Km을 도입한 주에서는, 글루코스와 크실로스의 혼합 탄소원(MSII-GX 배지)에서 배양하였을 때에, 친주와 비교하여 매우 높은 글루탐산 수율을 나타내었다(수율 69.9%). 친주에 있어서, 크실로스로부터 글루탐산이 거의 생성되지 않은 것을 고려하여, pTWVPtac_ccrNXA_Km 도입주의 글루코스로부터의 글루탐산 수율이 친주와 동등하다고 가정하면, 크실로스로부터 NXA 경로를 통한 글루탐산 수율은 86% 정도라고 어림잡을 수 있다. 실제로, 크실로스를 단일 탄소원으로서 배양하였을 때에는 (MSII-Xylose), pTWVPtac_ccrNXA_Km 도입주는 수율 80%로 Glu를 생성하였다(표 3).
〔실시예 2〕에스케리키아·콜라이로의 NXA 경로의 도입
(1) 이. 콜라이(E. coli)에서의 NXA 경로 발현
TCA 사이클 중의 효소이고, 이소시트르산으로부터 αKG를 생성하는 이소시트르산데히드로게나제의 결손주(Δicd)를 사용하여, 크실로스를 단일 탄소원으로 한 최소 배지에서의 생육 상보에 의한 NXA 경로의 발현을 시험하였다. icd 유전자 결손주는 αKG를 생성할 수 없기 때문에 크실로스를 단일 탄소원으로 한 최소 배지에서는 생육할 수 없지만, NXA 경로의 도입에 의해 크실로스로부터 αKG를 생성할 수 있으면, 이 배지에서 생육 가능하다.
구체적으로는 케이오 콜렉션(Keio Collection)주의 icd 유전자 결손주인 JW1122주(http://cgsc.biology.yale.edu/Person.php?ID=99553, E. coli Genetic Resource Center at Yale CGSC, The Coli Genetic Stock Center로부터 입수 가능)를 숙주 균주로 하고, 플라스미드에 의해 NXA 경로를 도입, 발현시킴으로써 NXA 경로가 이. 콜라이(E. coli)에서도 기능할 수 있는지 여부를 검토하였다.
표 4에 구축한 플라스미드와 icd 유전자 결손주에서의 생육 상보의 결과를 기재하였다. 씨. 크레센투스(C. crescentus) 유래의 NXA 경로 오페론(xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, xylD)과 tac프로모터(tacpromoter)를 조합한 플라스미드 pMW119Ptac_ccrNXA(실시예 1에서 작제)를 도입한 균주가, 크실로스를 단일 탄소원으로 한 M9 최소 배지(플레이트)(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에서 생육하는 것을 확인하였다.
같은 검토를 액체 배양에서도 실시하였다. 36련(連) 배양 장치를 사용하고, 경시적으로 크실로스 또는 αKG를 단일 탄소원으로서 포함하는 M9 최소 배지 및 E1 합성 배지에서의 생육(O.D.)을 측정하였다. 결과를 도 1에 도시하였다. 플레이트에서의 배양과 마찬가지로, 벡터 컨트롤주가 크실로스 단일 탄소원의 M9나 E1 배지에서 생육되지 않는 것에 반해, NXA 경로 도입주에서는 양호하게 생육되었다. 이들 결과는 본 균주가 크실로스를 NXA 경로 유래로 자화함으로써 생육된 것, 즉, 씨. 크레센투스(C. crescentus) 유래 NXA 경로가 이. 콜라이(E. coli)에서도 기능한 것이라고 생각되었다.
Figure pct00004
(2) 이. 콜라이(E. coli) L-글루탐산 생산주에서의 NXA 경로 발현
이. 콜라이(E. coli) L-글루탐산 생산균주로서 αKGDH 결손주인 MG1655ΔsucA(미국 특허출원공개 제20050106688호)를 사용하였다. 이 균주에, pMW119Ptac_ccrNXA 또는 컨트롤로서 pMW119를 도입하여, MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA 및 MG1655ΔsucA/pMW119를 수득하였다. 이들 균주를 탄소원으로서 글루코스(40g/L), 크실로스(40g/L), 또는 글루코스 및 크실로스(각 20g/L)를 첨가한 MS 배지에서 플라스크 배양하였다. 탄소원으로서 글루코스만을 포함하는 배지에서는 24시간, 다른 배지에서는 48시간 배양하였다. 결과를 도 2에 도시하였다. 도면에 기재된 균주명에 붙인 325, 425 및 513은 클론 번호를 나타낸다.
탄소원을 글루코스 및 크실로스의 혼합계로 하였을 경우, 컨트롤 균주(MG1655ΔsucA/pMW119)가 L-글루탐산을 15 내지 16g/L 축적하는 것에 반해, ccrNXA 오페론 발현주(MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA)에서의 L-글루탐산 축적은 12g/L 전후가 되고, L-글루탐산의 축적, 수율은 저하되는 경향을 보였다. 탄소원으로서 크실로스 단독의 경우도 같았다. 부생물에 대하여, 유기산류 및 크실론산에 대하여 분석하였다. 그 결과, 주로 아세트산과 크실론산이 축적되는 것을 알 수 있었다.
(3) 이. 콜라이(E. coli)에서의 NXA 경로의 율속점(律速点) 해석
상기한 바와 같이, 이. 콜라이(E. coli) L-글루탐산 생산주에서는 ccrNXA 오페론 발현주의 배양 상청액 중에 NXA 경로의 중간체인 크실론산이 검출된 사실로부터, 흡수된 크실로스의 일부가 NXA 경로를 경유할 가능성이 높다고 생각되었다. 또한, 이하의 과제가 추측되었다.
i) 균체 내에 흡수된 크실로스는 이. 콜라이(E. coli) 고유의 크실로스 자화계와 NXA 경로 양쪽이 이용 가능하지만, 고유계 최초의 효소인 크실로스 이소머라제(XylA)와 NXA 경로 최초의 효소인 크실로스데히드로게나제(XDH)의 활성 또는 기질 특이성의 차이로, 일정량이 고유계에 이용되고, NXA 경로를 경유하는 대사 플럭스의 유량이 적다고 하는 가능성.
ii) NXA 경로 상에 율속점 또는 미분류의 바이패스 경로가 있고, αKG가 생성되지 않을 가능성.
i)에 대하여는, ccrNXA 오페론 발현 벡터를 저카피형(pMW119)에서 중카피형(pTWV228)으로 변경함으로써 NXA 경로의 각 효소량을 증가시키고, NXA 경로로의 기질의 인입량을 증가시킴으로써 개선할 수 있는 가능성이 생각되었다.
ii)에 대하여는, 율속점의 해석과 그 결과를 기초로 한 육종 개량을 실시함으로써 개선할 수 있는 가능성이 고려되었다.
이상의 사실로부터,
a) 이. 콜라이(E. coli) 고유 크실로스 자화 경로 결손주(ΔsucAΔxylA)를 숙주로 하고, 또한 ccrNXA 오페론을 발현시켜 강제적으로 탄소 플럭스가 NXA 경로를 경유하는 균주의 구축과 배양 평가, 및 b) 중카피형 벡터를 사용한 ccrNXA 오페론 발현 벡터의 구축과 그 발현 벡터를 사용한 균주의 구축 및 배양 평가, 및 c) 율속점의 해석을 실시하였다.
프라이머 xylA-H1P1-5742-5-1(서열번호 21) 및 xylA-H2P2-5742-5-2(서열번호 22)를 사용하여 MG1655ΔsucA로부터, λ-Red법에 의해 이. 콜라이(E. coli) 고유 크실로스 자화 유전자 xylA를 결손시켜 MG1655ΔsucAΔxylA주를 수득하였다. 이 균주에 pMW119Ptac_ccrNXA를 도입하여 xylA를 결손한 ccrNXA 오페론 발현주를 수득하였다.
도 3에, xylA를 결손한 ccrNXA 오페론 발현주를 (3)과 동일하게 하여 배양하였을 때의 L-글루탐산 배양 결과를 도시하였다. 도 3 중, 「ccrNXA」는 pMW119Ptac_ccrNXA를 나타내고, 거기에 계속되는 숫자는 클론 번호를 나타낸다.
ΔsucAΔxylA주의 벡터 컨트롤주가 크실로스를 자화할 수 없고, 글루코스로부터만 균체 형성과 L-글루탐산 생산을 할 수 있는 것에 반해, ccrNXA 오페론 발현주에서는, 크실로스의 소비와 크실로스 유래라고 생각되는 L-글루탐산 생산이 보였다. 한편, L-글루탐산 축적량은 모델 균주(ΔsucA주)에는 미치지 않는 것, 및 NXA 경로의 대사 중간체인 크실론산이 축적되는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, NXA 경로 전체의 대사 플럭스량이 부족할 가능성이 시사되었다. 또한, αKG의 부생이 보이지 않은 사실로부터, GDH의 활성 발현에 필요한 NADPH의 공급은 이 단계에서는 문제가 되지 않고 있는 것을 생각할 수 있었다.
계속해서, 중카피형 벡터를 사용하여 ccrNXA 오페론 발현 벡터를 구축하였다. pMW119Ptac_ccrNXA를 주형으로 하고, PtwvPtacf(서열번호 1)와 0819r(서열번호 4)을 프라이머로 하여, tac 프로모터 영역을 포함하는 ccrNXA 오페론을 증폭시켰다. pTWV228을 SmaI로 소화하고, tac 프로모터 영역을 포함하는 ccrNXA 오페론의 PCR 단편과 함께 인-퓨전(In-Fusion) 반응을 실시하고, 반응물로 이. 콜라이(E. coli) JM109주를 형질 전환하여 형질 전환체로부터 목적의 플라스미드 pTWVPtac_ccrNXA를 취득하였다. 이 플라스미드를 MG1655ΔsucA주에 도입하고, 수득된 주를 (3)과 같이 하여 배양을 실시하였다. 결과를 도 4에 도시하였다. 도면 중, 「ΔsucA」는 MG1655ΔsucA주를, 「/pTWV」 및 「/v」는 pTWV228을 유지하고 있는 것을 각각 나타낸다. 또한, pTWV110 내지 pTWV119는 pTWV228Ptac_ccrNXA의 클론 번호를 나타낸다.
글루코스만을 탄소원으로 하였을 경우에는, 중카피형 ccrNXA 오페론 발현주는 컨트롤주와 거의 동등한 L-글루탐산을 축적한 한편, 글루코스 및 크실로스의 혼합 배양계에서는 L-글루탐산 축적은 오히려 저하되는 경향을 보였다. 또한, 형제주 사이에서의 성적에도 편차가 보였다. 고려되는 이유의 하나로 중카피형 발현 벡터의 탈락을 생각할 수 있었다. 또한, 지금까지의 균주와 마찬가지로 크실론산의 축적이 관찰되었다.
ccrNXA 오페론의 카피수 증가에 의해, NXA 경로의 각 효소의 활성이 증가하는지를 확인하기 위해서, NXA 경로의 최초의 효소인 XDH 활성을 측정하였다. 결과를 표 5에 기재하였다. 표 5에 기재된 균주의 「7513」 및 「1110」은 각각 클론 번호를 나타낸다.
Figure pct00005
중카피 발현 벡터 도입주에서는 저카피 발현 벡터 도입주에 비해 XDH 활성이 약 7배로 상승하였다. 이. 콜라이(E. coli) 고유의 크실로스 이소머라제(XylA)와 XDH의 분기점에서 실제의 균체 내에서 어떻게 크실로스가 분배되는지에 대해서는 확인할 수 없고, 여전히 NXA 경로의 최초 효소인 XDH 활성이 부족할 가능성도 생각되었다. 그러나, XDH 활성이 상승하여도 L-글루탐산 축적 향상 등의 효과를 찾아낼 수 없는 점이나, 크실론산의 축적 등으로 NXA 경로 중 어느 하나 또는 복수의 효소가 율속이 될 가능성이 생각되었다.
그래서, NXA 경로의 율속점에 대한 해석을 실시하였다. 대사 중간체로서 크실론산이 축적된 점에서, 적어도 크실로스로부터 크실론산에 이르기까지의 대사 경로보다도, 크실론산으로부터 αKG에 이르는 경로에 율속점이 있다고 생각하였다. 또한, ccrNXA 오페론의 구조상, 크실로스로부터 크실론산에 이르는 경로는 오페론의 3번째와 4번째에 위치하는 유전자에 의해 코드화되어 있는 것에 반해, 크실론산으로부터 αKG에 이르는 경로는 오페론의 1번째, 2번째, 5번째에 위치하는 유전자에 의해 코드화되어 있다. XDH는 오페론의 3번째에 위치하고, 그 활성은 인 비트로(in vitro)에서 검출할 수 있지만, 오페론의 5번째에 위치하는 유전자에 의해 코드화되는 효소(XylD)의 활성을 검출할 수 있으면, NXA 오페론 전체가 전사, 번역되어 있는 것의 방증도 된다고 생각하였다. 그래서, 크실론산으로부터 αKG에 이르는 3개의 반응 중 어느 하나가 율속점이라고 추측하고, 이하와 같은 실험을 실시하였다.
xylD, xylX 및 ccrxylA 유전자를 각각 단독 발현하는 플라스미드 pSTVPtac_xylD_Ttrp, pSTVPtac_xylX_Ttrp, 및 pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp을 이하와 같이 하여 작제하였다.
pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp은 SfiI 사이트를 제외한 xylX를 pUC18에 클로닝한 플라스미드인 pUC18-xylX를 주형으로 하고, xylX-IFS-5742-10-1(서열번호 38) 및xylX-IFA-5742-10-2(서열번호 39)를 프라이머에 사용한 PCR에 의해 xylX 단편을 작제하고, SmaI로 소화한 pSTV28-Ptac-Ttrp에 인-퓨전 클로닝(in-fusion cloning)법으로 클로닝함으로써 작제하였다.
pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp은 SfiI 사이트를 제외한 ccrxylA를 pUC18에 클로닝한 플라스미드인 pUC18-ccrxylA를 주형으로 하고, xylA_IFS_5742-10-3(서열번호 40) 및 xylA_IFA_5742-10-4(서열번호 41)를 프라이머에 사용한 PCR에 의해 ccrxylA 단편을 작제하고, SmaI로 소화한 pSTV28-Ptac-Ttrp에 인-퓨전 클로닝(in-fusion cloning)법으로 클로닝함으로써 작제하였다.
STV28-Ptac-xylD-Ttrp은 SfiI 사이트를 제외한 xylD를 pUC18에 클로닝한 플라스미드인 pUC18-xylD를 주형으로 하고, xylD_IFS_5742-10-5(서열번호 42), xylD_IFA_5742-10-6(서열번호 43)을 프라이머에 사용한 PCR에 의해 xylD 단편을 작제하고, SmaI로 소화한 pSTV28-Ptac-Ttrp에 인-퓨전 클로닝(in-fusion cloning)법으로 클로닝함으로써 작제하였다.
상기 플라스미드 pUC18-xylX, pUC18-ccrxylA, pUC18-xylD는 각각 이하와 같이 하여 작제하였다.
씨. 크레센투스(C. crescentus) CB-15주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, CC0823-01F_4691-87-1 (서열번호 44) 및 CC0823-01R_4691-87-2(서열번호 45), 및 CC0823-02F_4691-87-3(서열번호 46) 및 CC0823-02R_4691-87-4(서열번호 47)를 프라이머로 하는 PCR에 의해 각각 900bp 및 280bp의 단편을 증폭시켰다. 계속해서, 인 비트로 어셈블(in vitro assemble)법(Nature Methods 6(5), 343-345, 2009)으로, SmaI로 소화한 pUC18과, 상기 2개의 증폭 단편을 어셈블함으로써 SfiI 사이트가 제거되어, xylX 유전자가 삽입된 pUC18-xylX를 수득하였다.
씨. 크레센투스(C. crescentus) CB-15주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, CC0822-01F_4691-87-5 (서열번호 48) 및 CC 480822-01R_5659-8-7(서열번호 49), CC0822-02F_5659-8-8(서열번호 50) 및 CC0822-02R_5659-8-9(서열번호 51), CC0822-03F_5659-8-10(서열번호 52) 및 CC0822-03R_5659-8-11(서열번호 53), CC0822-04F_5659-8-12(서열번호 54) 및 CC0822-04R_5659-8-13(서열번호 55), 및 CC0822-05F_5659-8-14(서열번호 56) 및 CC0822-05R_4691-87-14(서열번호 57)를 프라이머로 하는 PCR에 의해, 각각 11v02(175 bp), 12v02(325 bp), 13v02(260 bp), 14v02(193 bp) 및 15v02(544 bp)의 5개의 단편을 증폭시켰다. 다음에, 11v02 및 12v02의 2단편을 주형으로 하고, CC0822-01F_4691-87-5 및 CC0822-02R_5659-8-9를 프라이머로 하는 크로스오버 PCR에 의해 이들 2단편을 연결하였다. 마찬가지로, 13v02 및 14v02의 2단편을 주형으로 하고, CC0822-03F_5659-8-12 및 CC0822-04R_5659-8-13을 프라이머로 하는 크로스오버 PCR에 의해 이들 2단편을 연결하였다. 이들 2단편과, 상기 15v02 단편을 인 비트로 어셈블(in vitro assemble)법(Nature Methods 6(5), 343-345,2009)으로 연결하였다. 수득된 연결 단편을 주형으로 하고, CC0822-01F_4691-87-5 및 CC0822-05R_4691-87-14를 프라이머에 사용한 PCR에 의해 연결 단편을 증폭시켰다. 계속해서, 인 비트로 어셈블(in vitro assemble)법(Nature Methods 6(5), 343-345, 2009)으로, SmaI로 소화한 pUC18과, 상기 연결 단편을 어셈블함으로써 SfiI 사이트가 제거되어, ccrxylA 유전자가 삽입된 pUC18-ccrxylA를 수득하였다.
씨. 크레센투스(C. crescentus) CB-15주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, CC0819-01F_4691-88-7 (서열번호 17) 및 CC0819-01R_5659-9-1(서열번호 18), 및 CC0819-02F_5659-9-2(서열번호 19) 및 CC0819-02R_4691-88-10(서열번호 20)을 프라이머로 하는 PCR에 의해 각각 1130bp 및 653bp의 단편을 증폭시켰다. 계속해서, 인 비트로 어셈블(in vitro assemble)법(Nature Methods 6(5), 343-345, 2009)으로, SmaI로 소화한 pUC18과, 상기 2개의 증폭 단편을 어셈블함으로써 SfiI 사이트가 제거되어, xylD 유전자가 삽입된 pUC18-xylD를 수득하였다.
ccrNXA 오페론 발현주(MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA)와, 상기 xylD, xylX, ccrxylA 유전자를 각각 단독 발현하는 플라스미드를 유지하는 주(MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylD_Ttrp, MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylX_Ttrp 및 MG1655ΔsucA/pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp)로부터 조효소(粗酵素) 추출액을 조제하고, ccrNXA 오페론 발현주 유래의 조효소 추출액에 벡터 유지주, 또는 xylD, xylX, ccrxylA의 각 유전자의 단독 발현주 유래의 조효소 추출액을 각각 첨가하여, 크실론산으로부터의 αKG 생성 활성을 측정하였다. 결과를 표 6에 기재하였다. 표 6 중, 균주명에 붙인 「1110」은 클론 번호를 나타낸다.
Figure pct00006
xylD 유전자 단독 발현주의 조효소 추출액을 첨가한 계에 있어서, αKG 생성 활성의 상승이 관찰되었다. 이 결과로, xyld 유전자가 코드화하는 크실로네이트데히드라타제(XylD)가 이. 콜라이(E. coli)로 이종 발현에 의해 구축한 NXA 경로 상의 율속점일 가능성이 시사되었다.
효소 활성의 측정으로부터, ccrNXA 오페론 발현주에서, xyld 유전자의 발현을 더욱 강화함으로써 경로 전체의 대사 플럭스가 개선될 가능성이 있는 사실로부터, xyld 유전자 발현 벡터를 ccrNXA 오페론 발현주에 도입함으로써 xyld 유전자 발현 강화주를 구축하고, 글루코스 및 크실로스를 탄소원으로 한 L-글루탐산 생산 배양 평가를 실시하였다. ccrNXA 오페론 발현주로서는 MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA와 MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA를 사용하였다.
배양은 (3)과 동일하게 하여 실시하였다.
결과를 표 7에 나타낸다. xylD 유전자 발현 강화주에서 L-글루탐산 축적 및 수율이 대폭 향상되고, L-글루탐산 축적은 컨트롤주 15 내지 16g/L에 대하여 23 내지 25g/L, 대(對) 소비당(糖) 수율은 컨트롤주 37 내지 40%에 대하여 57 내지 60%에 달하였다. 또한, 대사 중간체인 크실론산은 xyld 유전자 발현 강화주에서는 보이지 않았다. 한편, xyld 유전자 발현 강화의 효과는 중카피형의 ccrNXA 오페론 발현 벡터를 탑재한 발현주에서만 보이고, 저카피형 벡터에 의한 발현주에서는 보이지 않았다. 이들 결과로부터, 벡터의 카피수 증가에 의한 NXA 경로 전체의 활성 증가와 xyld 유전자 발현 재강화에 의한 본 경로의 율속점의 해소가, L-글루탐산 생성량의 향상에 관련되었다고 생각되었다. 또한, xyld 유전자 발현 강화주의 크실론산으로부터의 αKG 생성 활성을 측정한 바, 강화 전에 비해 약 10배 상승하였다(표 8). 표 7, 표 8에 기재된 균주명에 붙여진 「1110」, 「17」, 「19」는 각각 클론 번호를 나타낸다.
Figure pct00007
Figure pct00008
〔실시예 3〕코리네박테리움·글루타미쿰에 대한 NXA 경로의 도입
(1) NXA 경로 도입용 플라스미드 pVK9Peftu_ccrNXA의 구축
신장 인자 Tu(EF-Tu) 유전자 tuf의 프로모터 서열(WO2008114721, 서열번호 33, 이하, 「Peftu」라고 기재한다)의 하류에 xylD를 연결한 서열을 갖는 플라스미드를, 클론테크 인-퓨전 클로닝 HD 키트(Clontech In-Fusion Cloning HD Kit)(Clontech사)를 이용하여 구축하였다. 우선, 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주의 염색체 DNA를 주형으로, 프라이머Peftu(Pst)(서열번호 58)와 Peftu_Rv(서열번호 59)를 사용하여 PCR을 실시하여 Peftu 서열을 포함하는 단편을 수득하였다. PCR 반응은 프라임스타 HS 폴리머라제(PrimeSTAR HS polymerase)를 사용하고, 이 효소에 부속의 프로토콜에 따라 실시하였다.
또한, pTWV228Ptac_ccrNXA를 주형으로서, 프라이머 Peftu_xylXABCD_fw(서열번호 60)와 Peftu_xylXABCD_rv(서열번호 61)를 사용하여 PCR를 실시하여, 씨. 크레센투스(C. crescentus)의 xylXABCD 서열을 포함하는 단편을 수득하였다. PCR 반응에는 프라임스타 GXL 폴리머라제(PrimeSTAR GXL polymerase)를 사용하고, 이 효소에 부속의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 실시하였다.
계속해서, 상기에서 수득된 Peftu 단편과 xylXABCD를 포함하는 단편을, PstI와 BamHI로 처리한 pVK9와 혼합하여, 클론테크 인-퓨전 HD 클로닝 키트(Clontech In-fusion HD Cloning Kit)의 프로토콜에 따라 인-퓨전(in-fusion) 반응을 실시하였다. pVK9는, pHSG299(다카라바이오)의 AvaII 부위를 평활 말단화하고, pHK4(일본 공개특허 특개평05-007491)에 포함되는 코리네형 세균 내에서 자율 복제 가능한 영역을 BamHI 및 KpnI로 잘라 평활 말단화된 단편을 삽입한 셔틀 벡터이다(일본 공개특허 특개2007-97573호, 미국 특허출원공개 20050196846호). 상기 인-퓨전(in-fusion) 반응액으로 이. 콜라이(E. coli) JM109를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 LB 배지에 카나마이신을 최종 농도 50mg/L이 되도록 첨가한 한천 배지에서 선발하였다. 수득된 형질 전환체로부터 목적의 플라스미드 pVK9Peftu_ccrNXA를 취득하였다.
(2) NXA 경로가 도입된 코리네박테리움·글루타미쿰에 의한 L-글루탐산 생산
상기 pVK9Peftu_ccrNXA로, 전기 펄스법(일본 공개특허 특개평2-207791)에 의해 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주를 형질 전환하였다. pVK9Peftu_ccrNXA를 도입한 주는, CM-Dex 배지에 카나마이신을 최종 농도 25mg/L이 되도록 첨가한 한천 배지를 사용하여 선발하였다. 또한, 대조주로서 pVK9로 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주를 형질 전환한 주도 같은 방법에 의해 선발하였다.
수득된 형질 전환주의 크실로스 자화 능력 및 L-글루탐산 생산능을, 사카구치(坂口) 플라스크를 사용한 배양을 실시함으로써 검증하였다. 카나마이신을 최종 농도 25mg/L이 되도록 첨가한 CM-Dex 한천 배지에서, 31.5℃에서 하루 낮밤 배양한 형질 전환주의 균체를 1/6 플레이트 만큼 긁어내어, Glc 배지 20ml를 포함하는 사카구치 플라스크에 식균하고, 미리 건열 멸균해 둔 탄산칼슘 1g을 첨가한 후, 31.5℃, 120rpm에서 24시간 진탕 배양하였다. 수득된 배양액 1ml를, Xyl 배지(비오틴 제한) 20ml를 포함하는 사카구치 플라스크에 식균하고, 미리 건열 멸균해 둔 탄산칼슘 1g을 첨가한 후, 31.5℃, 120 rpm에서 73시간 진탕 배양을 실시하였다. 결과를 표 9에 나타냈다.
씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주에 pVK9를 도입한 주는 Xyl 배지에서 거의 증식하지 않고, L-글루탐산 생산도 관찰되지 않았다. 한편, 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주에 pVK9Peftu_ccrNXA를 도입한 주는 Xyl 배지에서 증식하고, L-글루탐산을 축적하였다. 이 결과로부터, 코리네형 세균에 NXA 경로를 도입함으로써 크실로스 자화 능력이 향상되고, 또한 크실로스로부터 L-글루탐산이 생성되는 것을 발견하였다.
Figure pct00009
(3) xyld 유전자 발현 재강화주의 구축
pVK9Peftu_ccrNXA를 유지하는 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주에서는 크실론산이 축적된 것으로부터, xyld 유전자 산물의 활성이 부족하다는 것이 추찰되었다. 그래서, pVK9Peftu_ccrNXA 플라스미드 상에 xyld 유전자를 1카피 추가로 도입함으로써, xyld 유전자가 재강화된 NXA 경로 발현용 플라스미드를 구축하기로 하였다.
(4) xyld 유전자 발현용 플라스미드 pVS7PmsrA_xylD의 구축
msrA(펩티드 메티오닌 설폭시드 리덕타제 A(peptide methionine sulfoxide reductase A)) 유전자의 프로모터 서열(이하, 「PmsrA」라고 기재한다)의 하류에 씨. 크레센투스(C. crescentus)의 xyld 유전자를 연결한 서열을 갖는 플라스미드를, 클론테크 인-퓨전 클로닝 HD 키트(Clontech In-Fusion Cloning HD Kit)를 이용하여 구축하였다.
우선, 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주의 염색체 DNA를 주형에, 프라이머PmsrA(Pst)(서열번호 62)와 PmsrAR(서열번호 63)을 사용하여 PCR를 실시하여, PmsrA 서열을 포함하는 단편을 수득하였다. 또한, pTWV228Ptac_ccrNXA를 주형으로서, 프라이머 PmsrA_xylD_fw(서열번호 64)와 Peftu_xylXABCD_rv를 사용하여 PCR를 실시하여, 씨. 크레센투스(C. crescentus)의 xyld 유전자 서열을 포함하는 단편을 수득하였다. PCR 반응은 프라임스타 HS 폴리머라제(PrimeSTAR HS polymerase)를 사용하고, 이 효소에 부속의 프로토콜에 따라 실시하였다.
계속해서, 상기에서 수득된 PmsrA 단편과 xyld 유전자를 포함하는 단편을 PstI와 BamHI로 처리한 셔틀 벡터 pVS7(구축 방법은 이하에 나타낸다)과 혼합하여, 클론테크 인-퓨전 HD 클로닝 키트(Clontech In-fusion HD Cloning Kit)의 프로토콜에 따라 인-퓨전(in-fusion) 반응을 실시한 후, 이 반응액으로 이. 콜라이(E. coli) JM109를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 LB 배지에 스펙티노마이신을 최종 농도 25mg/L이 되도록 첨가한 한천 배지에서 선발하였다. 수득된 형질 전환체로부터 목적의 플라스미드 pVS7PmsrA_xylD를 취득하였다.
pVS7은 pVC7(일본 공개특허 특개2000-201692, EP1004671)의 클로람페니콜 내성 유전자가 스펙티노마이신 내성 유전자로 치환된 플라스미드이다. 스펙티노마이신 내성 유전자는 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)에서 시판되고 있는 에스케리키아·콜라이 ECE101E주로부터, 플라스미드 pDG1726을 조제하고, 당해 플라스미드로부터 카세트로 취출함으로써 취득할 수 있다. pDG1726을 주형으로서, 프라이머SpcR-F(서열번호 65)와 SpcR-R(서열번호 66)을 사용하여 PCR에 의해 스펙티노마이신 내성 유전자를 증폭시켰다. 수득된 유전자 단편을, SmaI 처리한 pVC7과 혼합하여, 다카라바이오 주식회사의 라이게이션 믹스(Ligation Mix) <마이티 믹스(Mighty Mix)>의 프로토콜에 따라 라이게이션 반응을 실시하고, 이 반응액으로 이. 콜라이(E. coli) JM109를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 LB 배지에 스펙티노마이신을 최종 농도 25mg/L가 되도록 첨가한 한천 배지에서 선발하였다. 수득된 형질 전환체로부터 pVC7에 스펙티노마이신 내성 유전자가 삽입된 pVC7-spc를 취득하였다. 또한, pVC7-spc를 주형으로서, 프라이머 spc(GTG start)-F(서열번호 67)와 spc(stop)-R(서열번호 68)을 사용하여 PCR를 실시하여, 스펙티노마이신 내성 유전자를 증폭시켰다.
한편, pVC7을 주형으로서, 프라이머 Spc-pVC7-Cm-F(서열번호 69)와 Spc-pVC7-Cm-R(서열번호 70)를 사용하여 PCR를 실시하여, pVC7로부터 클로람페니콜 내성 유전자가 제거된 DNA 단편을 수득하였다. 당해 DNA 단편과, 상기에서 pVC7-spc으로부터 조제된 스펙티노마이신 내성 유전자의 DNA 단편을 혼합하여, 클론테크 인-퓨전 HD 클로닝 키트(Clontech In-fusion HD Cloning Kit)의 프로토콜에 따라 인-퓨전(in-fusion) 반응을 실시한 후, 이 반응액으로 이. 콜라이(E. coli) JM109를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 LB 배지에 스펙티노마이신을 최종 농도 25mg/L가 되도록 첨가한 한천 배지에서 선발하였다. 수득된 형질 전환체로부터 pVS7을 취득하였다.
(5) xyld 유전자 재강화 플라스미드 pVK9Peftu_ccrNXA+D의 구축
pVS7PmsrA_xylD를 주형으로서, 프라이머 ME_Spc_fw(서열번호 71)와 ME_Peftu_xylXABCD_rv(서열번호 72)를 사용하여, 스펙티노마이신 내성 유전자(Spc)와 PmsrA_xylD를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 수득된 DNA 단편을, 에피센트레(Epicentre)사의 Ez-Tn5TM 커스텀 트랜스포솜 컨스트럭션 키트(Custom Transposome Construction Kit)의 프로토콜에 따라, 인 비트로(in vitro)에서 pVK9Peftu_ccrNXA에 삽입하여 이. 콜라이(E. coli) DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 카나마이신과 스펙티노마이신을 최종 농도로 각각 50mg/L, 25mg/L이 되도록 첨가한 LB한천 배지에서 선발하였다. 수득된 형질 전환체로부터 플라스미드를 추출하고, 플라스미드 상의 Spc-PmsrA_xylD 서열 주변의 염기서열을 확인함으로써, Spc-PmsrA_xylD 서열의 삽입 개소가 Peftu_ccrNXA 서열 상에서는 없는 것이 확인된 플라스미드를 pVK9Peftu_ccrNXA+D로 하였다.
(6) xyld 유전자가 재강화된 NXA 경로 도입주의 L-글루탐산 생산
전기 펄스법으로 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13869주에 pVK9Peftu_ccrNXA+D를 도입하고, 카나마이신 25mg/L를 포함하는 CMDex 한천 배지에 도포하였다. 31.5℃에서 배양 후 생육한 주에 대하여, (2)와 같은 방법으로 L-글루탐산 생산능을 검증하였다. 그 결과를 표 10에 나타냈다.
pVK9Peftu_ccrNXA+D를 유지하는 주에서는, pVK9Peftu_ccrNXA를 유지하는 주와 비교하여 D-크실론산의 축적량이 적고, 한편, 보다 많은 L-글루탐산이 축적되었다. 이로써, xyld 유전자를 재강화함으로써 보다 효율적으로 NXA 경로를 통하여 D-크실로스로부터 L-글루탐산을 생산시킬 수 있는 것이 나타났다.
Figure pct00010
〔실시예 4〕
(1) NXA 경로 유전자의 대체
이상의 실시예에서는, NXA 경로가 보고되어 있는 공지된 세균 씨. 크레센투스(C. crescentus)의 유전자 xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, xylD를 이용하여, NXA 경로를 통하여 크실로스로부터 글루탐산을 생성할 수 있는 것을 나타내었다. 이하의 실시예에서는 씨. 크레센투스(C. crescentus) 이외의 생물종으로부터 xylD, xylX, ccrxylA의 호모로그 유전자를 취득하고, 씨. 크레센투스(C. crescentus)의 유전자와 대체 가능한지 여부를 검증하였다. 유전자원으로서 표 11에 나타낸 생물종을 선택하였다. 아울러 각 유전자의 Gene symbol(GenBank)을 나타냈다. 또한, 표 12에 각 유전자의 염기서열 및 이것에 코드화되는 아미노산 서열의 서열표에서의 서열번호를 나타냈다. 표 12 중 「오리지널」은 천연형 유전자의 염기서열을, 「최적화 후」는 이. 콜라이(E. coli)의 코돈 출현 빈도(codon usage)에 맞춰서 코돈을 최적화한 염기서열을 각각 나타낸다.
또한, 이하의 기재에 있어서, xylD, xylX 및 xylA의 각 유전자 호모로그가 코드화하는 효소를 각각 XylD, XylX, XylA라고 기재하는 경우가 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
(2) XylD, XylX, XylA 활성 검출용 플라스미드 pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km, pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km, pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km의 구축
클론테크 인-퓨전 클로닝 키트(Clontech In-Fusion Cloning Kit)를 이용하여 구축을 실시하였다.
우선, pTWVPtac_ccrNXA_Km을 주형으로 하고, Ptac_xylXABC_F(서열번호 111)와 Ptac_xylXABC_R(서열번호 112)을 프라이머로 하여, xylD를 제외한 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을 클론테크 인-퓨전 HD 클로닝 키트(Clontech In-fusion HD Cloning Kit)의 프로토콜에 따라 인-퓨전(In-Fusion) 반응하고, 반응물로 이. 콜라이(E. coli) JM109주를 형질 전환하여 형질 전환체으로부터 목적의 플라스미드 pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km을 취득하였다.
pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km은 Ptac_xylABCD_F(서열번호 113)와 Ptac_xylABCD_R(서열번호 114)을, pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km은 Ptac_xylXBCD_F(서열번호 115)와 Ptac_xylXBCD_R(서열번호 116)을 프라이머로서, 상기와 같은 방법에 의해 구축하였다.
(3) XylD, XylX, XylA 활성 검출용 판토에아·아나나티스의 구축
상기 pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km으로, 일렉트로포레이션법에 의해 피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주를 형질 전환하였다. 구축한 주를 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylD로 하였다. 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylD의 배양에는 LBGM9에 카나마이신을 최종 농도 40mg/L, 테트라사이클린을 최종 농도 12.5 mg/L가 되도록 첨가한 플레이트 배지를 사용하였다.
마찬가지로 pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km 또는 pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Km으로 피. 아나나티스(P. ananatis) NA1주를 형질 전환하여 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylX주, 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔccrxylA주를 구축하였다.
(4) xylD, xylX, xylA 호모로그 발현 플라스미드의 구축
yjhG, yagF 발현용 플라스미드 pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp, pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp은 이하와 같이 하여 작제하였다.
pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp은 이. 콜라이(E. coli) MG1655주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, yjhG_F(서열번호 117) 및 yjhG_R(서열번호 118)을 프라이머로 사용한 PCR에 의해 yjhG 단편을 증폭시키고, SmaI로 소화한 pSTV28-Ptac-Ttrp에 인-퓨전 클로닝(In-Fusion cloning)법으로 클로닝함으로써 작제하였다.
pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp은 yagF_F(서열번호 119) 및 yagF_R(서열번호 120)를 프라이머고 사용하여 상기와 같은 방법에 의해 작제하였다.
xylD(Hse) 발현용 플라스미드 pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp은 이하와 같이 하여 작제하였다. tac 프로모터, xylD(Hse) 및 trp 터미네이터의 서열을 갖는 DNA 단편(Ptac-xylD(Hse)-Ttrp)을 합성하여, EcoRV로 소화한 pUC57 벡터(써모피셔사이언티픽사에서 구입)에 연결함으로써 pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp을 수득하였다. DNA 단편을 합성할 때에 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현에 적합하도록 코돈 최적화를 실시하였다. EcoRI와 KpnI로 각각 소화한 pSTV28과 pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp을 등량 혼합하여 라이게이션 반응 후 JM109를 형질 전환하고, Cm 내성이 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여 pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp을 수득하였다.
xylD (Amis), xylD(Aor), xylX(Cne), xylX(Zga), xylX(Tco), xylA(Abr), ycbD의 각각을 발현하는 플라스미드 pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp, pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp도 같은 방법으로 작제하였다. 단, YcbD에 대해서는 코돈 최적화를 실시하지 않았다.
xylD(Atu) 발현용 플라스미드 pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp은 이하와 같이 하여 작제하였다. tac 프로모터, xylD(Atu) 및 trp 터미네이터의 서열을 갖는 DNA 단편(Ptac-xylD(Atu)-Ttrp)을 합성하여, EcoRV로 소화한 pJET1.2 벡터(써모피셔사이언티픽사에서 구입)에 연결함으로써 pJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp을 수득하였다. DNA 단편을 합성할 때에 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현에 적합하도록 코돈 최적화를 실시하였다. EcoRI와 KpnI로 각각 소화한 pSTV28과 pJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp을 등량 혼합하여, 라이게이션 반응 후 JM109를 형질 전환하고, Cm 내성이 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여 pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp을 수득하였다.
xylX(Atu), xylA(Hbo)의 각각을 발현하는 플라스미드 pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrp도 같은 방법으로 작제하였다.
xylX(Art) 발현용 플라스미드 pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp은 이하와 같이 하여 제작하였다. tac 프로모터, xylX(Art) 및 trp 터미네이터의 서열을 갖는 DNA 단편(Ptac-xylX(Art)-Ttrp)을 합성하여, EcoRV로 소화한 pCC1 벡터(에피센트레(Epicentre)사에서 구입)에 연결함으로써 pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrp을 수득하였다. DNA 단편을 합성할 때에 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현에 적합하도록 코돈 최적화를 실시하였다. EcoRI와 KpnI로 각각 소화한 pSTV28과 pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrp을 등량 혼합하여, 라이게이션 반응 후 JM109를 형질 전환하고, Cm 내성이 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여 pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp을 수득하였다.
(5) xylD 호모로그의 활성 검출
pSTV28-Ptac-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp, pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp, pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp 또는 pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp으로, 일렉트로포레이션법(미국 특허 6682912호 참조)에 의해 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylD주를 형질 전환하였다. 각 형질 전환주의 배양에는 LBGM9에 카나마이신을 최종 농도 40mg/L, 테트라사이클린을 최종 농도 12.5 mg/L, 클로람페니콜을 최종 농도 25mg/L가 되도록 첨가한 플레이트 배지를 사용하였다.
약제를 첨가한 LBGM9 플레이트에, 34℃에서 하룻밤 배양한 각 형질 전환주의 균체를 1/6 플레이트만큼 긁어내어, MSII-SX 배지 5ml를 포함하는 큰 시험관에 식균하고, 34℃, 120rpm에서 48시간 배양하여 L-글루탐산(Glu)의 축적량을 측정하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.
피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylD에 pSTV28-Ptac-Ttrp을 도입한 주에서는 L-글루탐산 축적량은 6.9 g/L이었는데 반해, 다른 형질 전환주에서는 11.1g/L 내지 23.1g/L의 L-글루탐산이 축적되었다. pSTV28-Ptac-Ttrp을 도입한 주에서는 크실로스로부터 L-글루탐산이 거의 생성되지 않고, 다른 형질 전환주에서는 NXA 경로를 통하여 크실로스로부터 L-글루탐산이 생성되었다고 생각된다. 즉, xylD는 씨. 크레센투스(C. crescentus) 이외의 어떤 생물종 유래의 xylD 호모로그로도 대체 가능한 것이 나타났다.
(6) xylX 호모로그의 활성 검출
pSTV28-Ptac-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp 또는 pSTV28-Ptac-xylX(Selo)-Ttrp으로, 일렉트로포레이션법에 의해 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylX주를 형질 전환하였다. 각 형질 전환주의 배양에는 LBGM9에 카나마이신을 최종 농도 40mg/L, 테트라사이클린을 최종 농도 12.5 mg/L, 클로람페니콜을 최종 농도 25mg/L가 되도록 첨가한 플레이트 배지를 사용하였다.
약제를 첨가한 LBGM9 플레이트에, 34℃에서 하룻밤 배양한 각 형질 전환주의 균체를 1/6 플레이트만큼 긁어내어, MSII-SX 배지 5ml를 포함하는 큰 시험관에 식균하고, 34℃, 120rpm에서 48시간 배양하여 L-글루탐산(Glu)의 축적량을 측정하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
피. 아나나티스(P. ananatis) NA2 ΔxylX에 pSTV28-Ptac-Ttrp을 도입한 주에서는 L-글루탐산 축적량은 8.7 g/L이었는데 반해, 다른 형질 전환주에서는 20.5g/L 내지 27.8g/L의 L-글루탐산이 축적되었다. pSTV28-Ptac-Ttrp을 도입한 주에서는 크실로스로부터 L-글루탐산이 거의 생성되지 않고, 다른 형질 전환주에서는 NXA 경로를 통하여 크실로스로부터 L-글루탐산이 생성되었다고 생각되었다. 즉, xylX는 씨. 크레센투스(C. crescentus) 이외의 어떤 생물종 유래의 xylX 호모로그로도 대체 가능한 것이 나타났다.
(7) xylA 호모로그의 활성 검출
pSTV28-Ptac-Ttrp, pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp, pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp, pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrp 또는 pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp으로, 일렉트로포레이션법에 의해 피. 아나나티스(P. ananatis) NA2ΔccrxylA주를 형질 전환하였다. 각 형질 전환주의 배양에는 LBGM9에 카나마이신을 최종 농도 40mg/L, 테트라사이클린을 최종 농도 12.5 mg/L, 클로람페니콜을 최종 농도 25mg/L이 되도록 첨가한 플레이트 배지를 사용하였다.
약제를 첨가한 LBGM9 플레이트에, 34℃에서 하룻밤 배양한 각 형질 전환주의 균체를 1/6 플레이트만큼 긁어내어, MSII-SX 배지 5ml를 포함한 큰 시험관에 식균하고, 34℃, 120rpm에서 48시간 배양하여 L-글루탐산(Glu)의 축적량을 측정하였다. 결과를 도 7에 도시하였다.
피. 아나나티스(P. ananatis) ΔccrxylA에 pSTV28-Ptac-Ttrp을 도입한 주에서는 L-글루탐산 축적량은 1.0g/L이었는데 반해, 다른 형질 전환주에서는 18.1g/L 내지 30.7 g/L의 L-글루탐산이 축적되었다. pSTV28-Ptac-Ttrp을 도입한 주에서는 크실로스로부터 L-글루탐산이 거의 생성되지 않고, 다른 형질 전환주에서는 NXA 경로를 통하여 크실로스로부터 L-글루탐산이 생성되었다고 생각되었다. 즉, xylA는 씨. 크레센투스(C. crescentus) 이외의 어떤 생물종 유래의 ccrxylA 호모로그로도 대체 가능한 것이 나타났다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의해, 크실로스 원료를 사용하여, 발효법에 의해 목적 물질을 효율적으로 제조할 수 있다.
통상 산업성 공업 기술원 생명공학공업 기술 연구소 FERMBP-7207 19990818
SEQUENCE LISTING <110> AJINOMOTO CO., INC. <120> METHOD FOR PRODUCING TARGET SUBSTANCE BY FERMENTATION <130> D313-11346 <150> JP 2011-247031 <151> 2011-11-11 <150> US 61/558,685 <151> 2011-11-11 <160> 120 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PtwvPtacf <400> 1 gaattcgagc tcggtaccca gatctccctg ttgacaatta 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0823Ptacr <400> 2 aggaattcac tcacgcccac cctcctgtgt gaaattgtta 40 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ptac0823f <400> 3 taacaatttc acacaggagg gtgggcgtga gtgaattcc 39 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0819r <400> 4 gcggggcgtg cggttagaca tggcggacct catgctgggg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0819f <400> 5 ccccagcatg aggtccgcca tgtctaaccg cacgccccgc 40 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 219cc0819r <400> 6 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<211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ap-Km-rv <400> 14 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt cgctcataga 60 aggcggcggt ggaatcgaaa 80 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer xylD_IFS_5742-10-5 <400> 15 acacaaggag actcccatgt ctaaccgcac gccccgccgg 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer xylD_IFS_5742-10-6 <400> 16 ggaactggcg gctccctcag tggttgtggc ggggcagctt 40 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CC0819-01F_4691-88-7 <400> 17 gtcgactcta gaggatcccc atgtctaacc gcacgccccg ccggt 45 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CC0819-01R_5659-9-1 <400> 18 aaccaggaac ccggccttct ctgc 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CC0819-02F_5659-9-2 <400> 19 tcccgtacca cgagccgctg gcag 24 <210> 20 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CC0819-02R_4691-88-10 <400> 20 cgaattcgag ctcggtaccc tcagtggttg tggcggggca gctt 44 <210> 21 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer xylA-H1P1-5742-5-1 <400> 21 acgacatcat ccatcacccg cggcattacc tgattatgga gttcaatatg tgaagcctgc 60 ttttttat 68 <210> 22 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer xylA-H2P2-5742-5-2 <400> 22 atcgggccaa cggactgcac agttagccgt tatttgtcga acagataatg cgctcaagtt 60 agtataaa 68 <210> 23 <211> 8296 <212> DNA <213> Caulobacter crescentus <220> <221> CDS <222> (1175)..(2329) <220> <221> CDS <222> (2346)..(3782) <220> <221> CDS <222> (3788)..(4534) <220> <221> CDS <222> (4659)..(5528) <400> 23 caggacttca gacccgcgag gctgtagggg tcgtcaaagg ccttggccag gaccggcggc 60 acctcgcgct tggacaggcc gacgtcgcgc accggctggg tgccgatgtc gacggccttc 120 ttgcccgcct cgccccagcg gccggacggt tcctcgggct tggccggcgg cttgacctgg 180 gcgtgggcgc tggaggccag cagcacggcg gcggctccgg ccatgatcag cagcttgttc 240 ggcatcaaaa gcgccctccc gacaaaacac gccacgggaa cggcaagcct cgccgccggt 300 tcccgcccgc aagtccctcg gcacgaactc taaggcctgc gcacgatcca tcgccaccac 360 aaagcgtgtc atcccggccg aagcgcagcg gagagccggg acccagggcc acaagcacgg 420 cgcttcgtca ccccctgggt cccggatagc gctccgcgct tccgggatga cacgggttta 480 agcacttggg tgagaagccc tagttcggcg cgccgcccgc ttccaggtcg aacgcggcgt 540 cgaaggcgtc gtcgccagga accgtccctt ccagggcggc gtcgaacagg tcttcgagcg 600 atgaccagat gaaggccatc tgctccatga tcgtcgggac gctggccgga tcgaagccgg 660 ggtagaggtc ttccaccagc cacaggcccg tgccgggatc gaaggcgaag cggcagccga 720 tcaggcggaa ctgggcgcgg gccatggtct cgaacagggc cgtcaggtcg cgggcggcgt 780 ccaggtcgtc gtggtccagc accaggcagc ggatctgcag ccagccgtgg tcgggcagca 840 ggtagaaggc gccctcgtcc tgatcctcgc ccgaaacctc cagcccccgg tcgatggctt 900 cgacgacata gccggccgcg cggcaggtgt cggtgagcgc ggccagcagg gcggcttcct 960 ggtcaggggt caggtcggtc atgggcaaga ggtccaggtc gtggtttgtc ggcggcttct 1020 agcatggacc gcccgcgccc gtgaggccga ggatttcgcg ctggtcagac aacctacttg 1080 ccgtccccac atgttagcgc taccaagtgc cgacgaacgc gcgccgccga cggtgtcggc 1140 gcttcagacg ctcgagtttt ggggagacga cgcc gtg ggc gtg agt gaa ttc ctg 1195 Val Gly Val Ser Glu Phe Leu 1 5 ccg gaa gat tgg aaa gcc gcg acc ctg ctg ggg cgc atc gac ttt ggc 1243 Pro Glu Asp Trp Lys Ala Ala Thr Leu Leu Gly Arg Ile Asp Phe Gly 10 15 20 gaa ggc ccg acg ccg gtg ctg gtg cgc ggc ggc cgc gtc gag gac gtc 1291 Glu Gly Pro Thr Pro Val Leu Val Arg Gly Gly Arg Val Glu Asp Val 25 30 35 tcg aag atc gcc ccc acc gtc gct gac ctg atg aac gcc ttc cag ccc 1339 Ser Lys Ile Ala Pro Thr Val Ala Asp Leu Met Asn Ala Phe Gln Pro 40 45 50 55 ggc gcg gtg atc ccg cgc ggc gag gac aag ggt ccg ctg gaa gcc ctc 1387 Gly Ala Val Ile Pro Arg Gly Glu Asp Lys Gly Pro Leu Glu Ala Leu 60 65 70 gac atc cgc cca gtc tgg gaa gac ccg gac ggc gcc gcg ccg gtc aag 1435 Asp Ile Arg Pro Val Trp Glu Asp Pro Asp Gly Ala Ala Pro Val Lys 75 80 85 ctg ttg gcc ccc gtc gac ctg caa tgc ctg aag gcc gcc ggc gtg acc 1483 Leu Leu Ala Pro Val Asp Leu Gln Cys Leu Lys Ala Ala Gly Val Thr 90 95 100 ttc gcg gtc tcg acc ctt gag cgg gtc atc gag gag cgc gcg cgc ggc 1531 Phe Ala Val Ser Thr Leu Glu Arg Val Ile Glu Glu Arg Ala Arg Gly 105 110 115 gac gcc ggc gag gcg ctg aag atc cgc acc ctg ctg gcc gaa cgc atg 1579 Asp Ala Gly Glu Ala Leu Lys Ile Arg Thr Leu Leu Ala Glu Arg Met 120 125 130 135 ggc ggc gac ctc aag agc gtc gag ccg ggc tcg cag ggc gcc cag cgc 1627 Gly Gly Asp Leu Lys Ser Val Glu Pro Gly Ser Gln Gly Ala Gln Arg 140 145 150 ctg aag gac gcc ctg atc gcc gac ggc ctg tgg tcg cag tat ctg gaa 1675 Leu Lys Asp Ala Leu Ile Ala Asp Gly Leu Trp Ser Gln Tyr Leu Glu 155 160 165 gtg gcg atc ggc ccg gac gcc gag atc ttc acc aag ggc ccg acc ctg 1723 Val Ala Ile Gly Pro Asp Ala Glu Ile Phe Thr Lys Gly Pro Thr Leu 170 175 180 tcc tcg atg ggc tgg ggc gac cag gtc ggc gtc cgc tat gac agc cac 1771 Ser Ser Met Gly Trp Gly Asp Gln Val Gly Val Arg Tyr Asp Ser His 185 190 195 tgg aac aat ccc gag ccg gaa gtc gtg ctg ctg tgc gac ggt tcg ggc 1819 Trp Asn Asn Pro Glu Pro Glu Val Val Leu Leu Cys Asp Gly Ser Gly 200 205 210 215 ctg atc cgc ggc gcg gcg ctg ggc aac gac gtc aat ctg cgc gac ttc 1867 Leu Ile Arg Gly Ala Ala Leu Gly Asn Asp Val Asn Leu Arg Asp Phe 220 225 230 gaa ggt cgt tcg gcc ctg ctg ctc agc aag gcc aag gac aac aac gcc 1915 Glu Gly Arg Ser Ala Leu Leu Leu Ser Lys Ala Lys Asp Asn Asn Ala 235 240 245 agc tgc gcc atc ggt ccg ttc ttc cgc ctg ttc gac gag acc ttc ggc 1963 Ser Cys Ala Ile Gly Pro Phe Phe Arg Leu Phe Asp Glu Thr Phe Gly 250 255 260 ctg gac gac gtc cgt tcg gcc gag gtc gag ctg aag atc acc ggc cgc 2011 Leu Asp Asp Val Arg Ser Ala Glu Val Glu Leu Lys Ile Thr Gly Arg 265 270 275 gac aac ttc gtg ctc gac ggc aag tcg aac atg agc ctg atc agc cgc 2059 Asp Asn Phe Val Leu Asp Gly Lys Ser Asn Met Ser Leu Ile Ser Arg 280 285 290 295 gac ccg gcc gtg ctg gcc gga cag gcc tat ggc aag cag cac cag tat 2107 Asp Pro Ala Val Leu Ala Gly Gln Ala Tyr Gly Lys Gln His Gln Tyr 300 305 310 ccg gac ggc ttt gct ttg ttc ctg ggc acc atg ttc gcc ccg atc cag 2155 Pro Asp Gly Phe Ala Leu Phe Leu Gly Thr Met Phe Ala Pro Ile Gln 315 320 325 gac cgc gac acc ccc ggc cag ggt ttc acc cac aag gtc ggc gac cgc 2203 Asp Arg Asp Thr Pro Gly Gln Gly Phe Thr His Lys Val Gly Asp Arg 330 335 340 gtg cgt gtc tcg acg ccg aag ctg ggc gtg ctc gag aac gaa gtc acc 2251 Val Arg Val Ser Thr Pro Lys Leu Gly Val Leu Glu Asn Glu Val Thr 345 350 355 acc tgc gac aag gcc aag ccg tgg acg ttc ggc atc tcg gcc ctg atc 2299 Thr Cys Asp Lys Ala Lys Pro Trp Thr Phe Gly Ile Ser Ala Leu Ile 360 365 370 375 cgc aac ctg gcc ggc cgc ggc ctc ctc taa tcgaaagctt cccgcg atg acc 2351 Arg Asn Leu Ala Gly Arg Gly Leu Leu Met Thr 380 385 gac acc ctg cgc cat tac atc ggc ggc gaa cgc gtc gcg gcc gac gcc 2399 Asp Thr Leu Arg His Tyr Ile Gly Gly Glu Arg Val Ala Ala Asp Ala 390 395 400 ccg gcc gag agc ctg aac ccg tcc aac acc aac gac gtc gtc gcc aag 2447 Pro Ala Glu Ser Leu Asn Pro Ser Asn Thr Asn Asp Val Val Ala Lys 405 410 415 gtc ccg atg ggc ggc cag gcc gag gtc gac gcc gcc gtc gac gcc gcg 2495 Val Pro Met Gly Gly Gln Ala Glu Val Asp Ala Ala Val Asp Ala Ala 420 425 430 cgc aag gcc ttc ccg gcc 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cctggatgat ccggatctgg atgtgaccgc ggattctgtg 1320 ctggttctgc gtggctgcgg tccgaaaggc tatccgggta tgccggaagt tagtaacatg 1380 ccgctgccgg cgaaactgct ggaacagggt gtgcgcgata tggtgcgtgt ttgtgatggc 1440 cgtatgtctg gtacggcata cggcaccgtg gttctgcatg ttgccccgga agcggcagcg 1500 ggcggtccgc tggcacgcgt gcgtaccggc gatatgatta tcctggatgt tgccaatcgc 1560 cgtctggatg cagatgtgcc ggccgaagaa tgggcggcac gtgaaccgag tccggaagcc 1620 gcaaaagcct atgcggcccc gagccgtggt tgggaacgtc tgtacgttga tacggtgggt 1680 caggccgata ccggcgcaga ttgcgatttt ctgcgtggcg cgagcggtga tcgcgtgagt 1740 cgtgaaagcc actga 1755 <210> 82 <211> 1962 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <220> <221> CDS <222> (1)..(1962) <400> 82 atg tcg tgt cag tca cgc acc tcg tgt gaa ggc tgc tcc tgc agt gac 48 Met Ser Cys Gln Ser Arg Thr Ser Cys Glu Gly Cys Ser Cys Ser Asp 1 5 10 15 ggg ggc agc cgg cca cca gtg aac atc gag gac tgt gag agc gaa ctg 96 Gly Gly Ser Arg Pro Pro Val Asn Ile Glu Asp Cys Glu Ser Glu Leu 20 25 30 ctt gcc ctt cgg agg cgt aca gtg gag ctc gag aaa act 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cga aat cta 480 Ile Gln Glu Thr Ser Arg Arg Pro Thr Ala Cys Ile Asp Arg Asn Leu 145 150 155 160 tcg tat ctg ggc ctg gta gaa att ctc ttc gga tat ccc ttg gac ggt 528 Ser Tyr Leu Gly Leu Val Glu Ile Leu Phe Gly Tyr Pro Leu Asp Gly 165 170 175 gta gtc ctc ctg acg ggc tgc gac aag act act ccc gcc gct ctg atg 576 Val Val Leu Leu Thr Gly Cys Asp Lys Thr Thr Pro Ala Ala Leu Met 180 185 190 gcc gcg gct aca gtg aat atc cca gca ata tgc ttg aat gtc ggc cca 624 Ala Ala Ala Thr Val Asn Ile Pro Ala Ile Cys Leu Asn Val Gly Pro 195 200 205 atg ctt aac ggt tac gtg aag aag gac ctg gcg ggg tcc gga atg gta 672 Met Leu Asn Gly Tyr Val Lys Lys Asp Leu Ala Gly Ser Gly Met Val 210 215 220 ttg tgg acg ggt aga gag atg tat gcg gca ggt gag atc aac aag gag 720 Leu Trp Thr Gly Arg Glu Met Tyr Ala Ala Gly Glu Ile Asn Lys Glu 225 230 235 240 gaa ttc att gac tat gtg tcc aaa ggt aca cca tca gtg gga cat tgt 768 Glu Phe Ile Asp Tyr Val Ser Lys Gly Thr Pro Ser Val Gly His Cys 245 250 255 aac acg atg gga aca gca tca act atg aat gct ttg gca gaa gcg ctt 816 Asn Thr Met Gly Thr Ala Ser Thr Met Asn Ala Leu Ala Glu Ala Leu 260 265 270 gga atg gcc cta cct ggg tcg gct gcc ata ccg gct ccg tat cgt gaa 864 Gly Met Ala Leu Pro Gly Ser Ala Ala Ile Pro Ala Pro Tyr Arg Glu 275 280 285 cgt ggc caa tgt gct tac gaa aca ggt ttg cgt att gtc gaa atg gtt 912 Arg Gly Gln Cys Ala Tyr Glu Thr Gly Leu Arg Ile Val Glu Met Val 290 295 300 cat tcc gat cgg aag ccc agc gat att atg act cga gag gct ttc gag 960 His Ser Asp Arg Lys Pro Ser Asp Ile Met Thr Arg Glu Ala Phe Glu 305 310 315 320 aat gtt att gta gtt aat act gct atc ggc ggc agt acc aat gcc cct 1008 Asn Val Ile Val Val Asn Thr Ala Ile Gly Gly Ser Thr Asn Ala Pro 325 330 335 att cat atc aac gcc att gcc aaa cat att ggg gtt gag gtt tca ctg 1056 Ile His Ile Asn Ala Ile Ala Lys His Ile Gly Val Glu Val Ser Leu 340 345 350 gat gac tgg gac cga ctt gga ttt cat att cca cta ctg cta aac atg 1104 Asp Asp Trp Asp Arg Leu Gly Phe His Ile Pro Leu Leu Leu Asn Met 355 360 365 caa cca gcc ggt gaa ctg ctg gga gag gaa tac tat cgg gcg ggc ggg 1152 Gln Pro Ala Gly Glu Leu Leu Gly Glu Glu Tyr Tyr Arg Ala Gly Gly 370 375 380 cta ccc gcg att atg gcg gag ctg cta gat gct agg aag ctg aac ccg 1200 Leu Pro Ala Ile Met Ala Glu Leu Leu Asp Ala Arg Lys Leu Asn Pro 385 390 395 400 gat gct tta aca tgc aat ggt tac aca gta gcc gag aat gtc cgg gac 1248 Asp Ala Leu Thr Cys Asn Gly Tyr Thr Val Ala Glu Asn Val Arg Asp 405 410 415 aaa cat acc tgg gac cgt cga atg atc aag ccg tac aat gag cca ctt 1296 Lys His Thr Trp Asp Arg Arg Met Ile Lys Pro Tyr Asn Glu Pro Leu 420 425 430 ctg gaa gat gcc ggt ttt ctc cat ctt caa ggc agt ctg ttc cgg tct 1344 Leu Glu Asp Ala Gly Phe Leu His Leu Gln Gly Ser Leu Phe Arg Ser 435 440 445 gct atc atg aag aca tgt gtg ata tcg gag cct ttc cga caa aag ttc 1392 Ala Ile Met Lys Thr Cys Val Ile Ser Glu Pro Phe Arg Gln Lys Phe 450 455 460 ttg gag aat ccc aag gac ccg aat gca ttt gaa ggt acg gtt gta gta 1440 Leu Glu Asn Pro Lys Asp Pro Asn Ala Phe Glu Gly Thr Val Val Val 465 470 475 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tgatgtgccg gaaagccaga ccccgtggca ggaactgttt 1860 cgccgtgaaa ccacgcagct gtctgatggc atggttctgc gcgatgccgt gaaatatcag 1920 cgcctggcac agcgttacga aaacccgcgt cataatcact ga 1962 <210> 85 <211> 1161 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(1161) <400> 85 atg acc ggc tca agg tcc atc gac gct acc gct att ttg cct gaa gac 48 Met Thr Gly Ser Arg Ser Ile Asp Ala Thr Ala Ile Leu Pro Glu Asp 1 5 10 15 ttt gaa aac gcc ctg ctc gtc ggc cgc gta tgg tcg aaa agc gaa ggc 96 Phe Glu Asn Ala Leu Leu Val Gly Arg Val Trp Ser Lys Ser Glu Gly 20 25 30 ggc ccc tgc ccc gtt ctg cta aaa ggc ggc gtg ctt tac gac ctc acc 144 Gly Pro Cys Pro Val Leu Leu Lys Gly Gly Val Leu Tyr Asp Leu Thr 35 40 45 tct att tcg ccg acc atg tct gaa ctt ctg gaa aag acg gat ctg gtg 192 Ser Ile Ser Pro Thr Met Ser Glu Leu Leu Glu Lys Thr Asp Leu Val 50 55 60 gag ctg ctt gca gac acc ggc aca ttc gtg gcg ctt ggc gcg ctc gag 240 Glu Leu Leu Ala Asp Thr Gly Thr Phe Val Ala Leu Gly Ala Leu Glu 65 70 75 80 gcc ttt ctg gat ggc tcc gct ggt gaa ctt ctc gcc ccc aac gat att 288 Ala Phe Leu Asp Gly Ser Ala Gly Glu Leu Leu Ala Pro Asn Asp Ile 85 90 95 cag gcc gtg aag gct gca ggc gtg acc ttc gcc gac agc atg ctg gaa 336 Gln Ala Val Lys Ala Ala Gly Val Thr Phe Ala Asp Ser Met Leu Glu 100 105 110 cgc gtg atc gag gag cag gcc aag ggc gat cca ctt cgc gcg cag gaa 384 Arg Val Ile Glu Glu Gln Ala Lys Gly Asp Pro Leu Arg Ala Gln Glu 115 120 125 ata cgc gga cgg ctg gcg ccg gtt ctc ggc gac aat ctc aag gga ctt 432 Ile Arg Gly Arg Leu Ala Pro Val Leu Gly Asp Asn Leu Lys Gly Leu 130 135 140 gag gcc ggt tcg gaa aaa gca gcc gaa gtg aag aaa ctg ctg cag gaa 480 Glu Ala Gly Ser Glu Lys Ala Ala Glu Val Lys Lys Leu Leu Gln Glu 145 150 155 160 atg ggc ctg tgg tcg caa tat ctg gaa gtt ggc atc ggt ccg gat gcg 528 Met Gly Leu Trp Ser Gln Tyr Leu Glu Val Gly Ile Gly Pro Asp Ala 165 170 175 gag ata ttc tcc aag gcg cag gcc atg gcc tcc gtc ggc tgc ggc gcg 576 Glu Ile Phe Ser Lys Ala Gln Ala Met Ala Ser Val Gly Cys Gly Ala 180 185 190 ctg atc 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cag acg ggg cag cgc tgt acc gca tcg tcg cgt cta 864 Gly Ala Phe Tyr Gln Thr Gly Gln Arg Cys Thr Ala Ser Ser Arg Leu 275 280 285 atc gta cag tcg ggc atc cat gat gcc ttt atc gcg gaa ctc agt cgc 912 Ile Val Gln Ser Gly Ile His Asp Ala Phe Ile Ala Glu Leu Ser Arg 290 295 300 cag atg cag gcg ctc aag gtg ggg cat gcg ctc gcc gag ggg atg cag 960 Gln Met Gln Ala Leu Lys Val Gly His Ala Leu Ala Glu Gly Met Gln 305 310 315 320 att ggc ccc gtc gcc gcc cgg agt cag ctc gaa agc aat ctt tac tac 1008 Ile Gly Pro Val Ala Ala Arg Ser Gln Leu Glu Ser Asn Leu Tyr Tyr 325 330 335 gtg gcg ctc gcc gct gaa gag ggc tgc gat gta ttg ggt gga gag cag 1056 Val Ala Leu Ala Ala Glu Glu Gly Cys Asp Val Leu Gly Gly Glu Gln 340 345 350 ctc aca cgc gac act gaa ggg tat ttc cag gca ccc gca ctt ttc ctt 1104 Leu Thr Arg Asp Thr Glu Gly Tyr Phe Gln Ala Pro Ala Leu Phe Leu 355 360 365 ggg gcg agt aat gcc atg cgt agc gcc cgt gaa gag atc ttc ggc ccc 1152 Gly Ala Ser Asn Ala Met Arg Ser Ala Arg Glu Glu Ile Phe Gly Pro 370 375 380 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Ala 1 5 10 15 Asp Asp Val Ser Glu Asn Thr Asn Pro Ser Asp Val Thr Asp Leu Ile 20 25 30 Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Gly Ala Gln Asp Val Thr Asp Ala Ala Glu 35 40 45 Ala Ala Glu Val Ala Met Pro Ala Trp Ala Gly Ala Thr Pro Gln Leu 50 55 60 Arg Ala Asp Leu Leu Asp Arg Val Ala Ala Glu Ile Thr Arg Arg Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ile Ala Thr Met Leu Ala Cys Glu Glu Gly Lys Val Leu Leu 85 90 95 Glu Ala Leu Gly Glu Val Arg Arg Ala Ala His Val Phe Arg Phe Phe 100 105 110 Ala Gly Glu Ala Leu Arg Leu Thr Gly Asp Ala Leu Ala Ser Val Arg 115 120 125 Pro Gly Val Asp Val Glu Val Thr Arg Glu Pro Leu Gly Ile Val Gly 130 135 140 Ile Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Ile Ala Ile Pro Ala Trp Lys Ile 145 150 155 160 Ala Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Asn Cys Val Ile Phe Lys Pro Ala Glu 165 170 175 Gln Thr Pro Gly Ser Ala His Ile Leu Thr Gln Ile Ile His Glu Ala 180 185 190 Gly Cys Pro Ala Gly Val Phe Asn Leu Val Met Gly Arg Gly Ser Val 195 200 205 Val Gly Glu Ala Met Thr Thr Asp Pro Arg Ile Ser Gly Ile Ser Phe 210 215 220 Thr Gly Ser Val Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Gly Ala Cys Ala Ala 225 230 235 240 Asn Met Lys Lys Leu Gln Leu Glu Met Gly Gly Lys Asn Pro Val Ile 245 250 255 Val Met Asp Asp Ala Asp Leu Glu Thr Ala Val Ser Val Cys Leu Asn 260 265 270 Gly Ala Phe Tyr Gln Thr Gly Gln Arg Cys Thr Ala Ser Ser Arg Leu 275 280 285 Ile Val Gln Ser Gly Ile His Asp Ala Phe Ile Ala Glu Leu Ser Arg 290 295 300 Gln Met Gln Ala Leu Lys Val Gly His Ala Leu Ala Glu Gly Met Gln 305 310 315 320 Ile Gly Pro Val Ala Ala Arg Ser Gln Leu Glu Ser Asn Leu Tyr Tyr 325 330 335 Val Ala Leu Ala Ala Glu Glu Gly Cys Asp Val Leu Gly Gly Glu Gln 340 345 350 Leu Thr Arg Asp Thr Glu Gly Tyr Phe Gln Ala Pro Ala Leu Phe Leu 355 360 365 Gly Ala Ser Asn Ala Met Arg Ser Ala Arg Glu Glu Ile Phe Gly Pro 370 375 380 Cys Ala Ser Val Ile Arg Val Asp Asp Phe Glu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ala Asn Asp Thr Gln Phe Gly Leu Ser Ser Gly Ile Cys Thr Thr Asn 405 410 415 Leu Arg Tyr Ala Arg Glu Phe Lys Arg Arg Ser Ala Ala Gly Met Val 420 425 430 Met Leu Asn Leu Pro Thr Ala Gly Val Asp Tyr His Val Pro Phe Gly 435 440 445 Gly Arg Lys Ala Ser Ser Phe Gly Ser Arg Glu Gln Gly Ser Tyr Ala 450 455 460 Ala Glu Phe Tyr Thr Ser Val Lys Thr Ala Tyr Thr Tyr Ala Gly 465 470 475 <210> 108 <211> 1440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 108 atgggcgaaa tgaacaataa cctgatcggc ggtgtttggc gtgaagccga tgatgtgagt 60 gaaaatacca acccgagcga tgtgacggat ctgattggcc tgtatgcccg cggcggtgca 120 caggatgtta ccgatgcggc cgaagcggcc gaagtggcaa tgccggcctg ggcaggtgca 180 acgccgcagc tgcgtgcgga tctgctggat cgcgttgccg cagaaatcac ccgtcgcgaa 240 gatgaaattg cgacgatgct ggcctgcgaa gaaggcaaag tgctgctgga agccctgggt 300 gaagttcgtc gcgcggccca tgtttttcgt ttctttgcag gtgaagccct gcgtctgacc 360 ggtgatgccc tggcatctgt tcgtccgggc gtggatgttg aagtgacccg cgaaccgctg 420 ggcatcgtgg gtattatcac gccgtggaat ttcccgattg ccatcccggc atggaaaatc 480 gcaccggcgc tggcctatgg caactgcgtt atttttaaac cggcagaaca gaccccgggt 540 agcgcgcata ttctgacgca gattatccac gaagcaggct gtccggcggg tgttttcaat 600 ctggtgatgg gccgtggtag cgtggttggt gaagcgatga ccacggatcc gcgcattagc 660 ggcatctctt ttaccggttc tgttcaagtg ggccgtcagc tggcaggtgc ctgcgcagcg 720 aatatgaaaa aactgcagct ggaaatgggc ggtaaaaacc cggttatcgt gatggatgat 780 gcggatctgg aaaccgccgt tagcgtgtgc ctgaacggcg cgttctatca gaccggtcag 840 cgttgtacgg ccagctctcg cctgattgtg cagtctggca tccatgatgc gtttattgcc 900 gaactgagtc gtcagatgca ggccctgaaa gttggtcacg ccctggcaga aggcatgcag 960 attggtccgg tggccgcacg cagtcagctg gaaagcaatc tgtattacgt tgcgctggcg 1020 gccgaagaag gctgtgatgt gctgggcggt gaacagctga cccgtgatac ggaaggctac 1080 tttcaggcgc cggccctgtt cctgggtgca tctaacgcga tgcgtagtgc ccgcgaagaa 1140 atctttggtc cgtgcgcaag tgttattcgc gtggatgatt tcgaagaagc agttgcgctg 1200 gccaatgata cccagtttgg cctgagtagc ggtatttgta ccacgaacct gcgttatgcg 1260 cgcgaattta aacgtcgcag cgcagcgggc atggtgatgc tgaatctgcc gaccgccggt 1320 gttgattacc acgtgccgtt tggcggtcgt aaagcgtcta gtttcggcag ccgcgaacag 1380 ggttcttatg ccgcagaatt ttacaccagc gtgaaaaccg cctatacgta cgcaggttaa 1440 <210> 109 <211> 1467 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(1467) <400> 109 atg tct gtg atc acg gaa caa aac acg tac ctc aac ttt att aac gga 48 Met Ser Val Ile Thr Glu Gln Asn Thr Tyr Leu Asn Phe Ile Asn Gly 1 5 10 15 gag tgg gtt aag tct caa tca ggc gat atg gtc aaa gtc gaa aac cct 96 Glu Trp Val Lys Ser Gln Ser Gly Asp Met Val Lys Val Glu Asn Pro 20 25 30 gcc gat gtg aat gat att gtc gga tat gta cag aat tca acg gct gaa 144 Ala Asp Val Asn Asp Ile Val Gly Tyr Val Gln Asn Ser Thr Ala Glu 35 40 45 gat gtg gaa cgt gcc gtc acc gcc gcc aat gaa gcc aaa acg gct tgg 192 Asp Val Glu Arg Ala Val Thr Ala Ala Asn Glu Ala Lys Thr Ala Trp 50 55 60 aga aag ctg acg ggt gcc gag cgc ggc caa tac tta tac aaa aca gcg 240 Arg Lys Leu Thr Gly Ala Glu Arg Gly Gln Tyr Leu Tyr Lys Thr Ala 65 70 75 80 gat atc atg gag cag cgc ttg gag gaa atc gcc gcc tgt gca acg cgt 288 Asp Ile Met Glu Gln Arg Leu Glu Glu Ile Ala Ala Cys Ala Thr Arg 85 90 95 gaa atg ggt aaa aca ttg ccg gaa gcg aag gga gaa 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gtc tgg atg gga ccg ata gcc agc aag aat cag 1008 Ser Leu Lys Glu Asp Val Trp Met Gly Pro Ile Ala Ser Lys Asn Gln 325 330 335 ctt gat aac tgc ctg tca tac att gag aaa ggc aaa cag gag ggc gct 1056 Leu Asp Asn Cys Leu Ser Tyr Ile Glu Lys Gly Lys Gln Glu Gly Ala 340 345 350 tcc ctt tta ata gga gga gaa aag ctg gag aac gga aag tat caa aac 1104 Ser Leu Leu Ile Gly Gly Glu Lys Leu Glu Asn Gly Lys Tyr Gln Asn 355 360 365 ggc tat tat gtt cag cct gcc atc ttt gac aat gtg aca tct gag atg 1152 Gly Tyr Tyr Val Gln Pro Ala Ile Phe Asp Asn Val Thr Ser Glu Met 370 375 380 aca att gcc cag gag gaa att ttc ggt ccg gtg atc gcc ttg atc aag 1200 Thr Ile Ala Gln Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ile Ala Leu Ile Lys 385 390 395 400 gtg gac tcg ata gag gag gcg ctg aac atc gcc aat gat gtg aag ttc 1248 Val Asp Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asn Ile Ala Asn Asp Val Lys Phe 405 410 415 ggt tta agt gca tcc atc ttc acg gaa aac atc ggc cga atg ctt tct 1296 Gly Leu Ser Ala Ser Ile Phe Thr Glu Asn Ile Gly Arg Met Leu Ser 420 425 430 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Ala Thr Arg 85 90 95 Glu Met Gly Lys Thr Leu Pro Glu Ala Lys Gly Glu Thr Ala Arg Gly 100 105 110 Ile Ala Ile Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Glu Gly Met Arg Lys Thr Gly 115 120 125 Asp Val Ile Pro Ser Thr Asp Lys Asp Ala Leu Met Phe Thr Thr Arg 130 135 140 Val Pro Leu Gly Val Val Gly Val Ile Ser Pro Trp Asn Phe Pro Val 145 150 155 160 Ala Ile Pro Ile Trp Lys Met Ala Pro Ala Leu Val Tyr Gly Asn Thr 165 170 175 Val Val Ile Lys Pro Ala Thr Glu Thr Ala Val Thr Cys Ala Lys Ile 180 185 190 Ile Ala Cys Phe Glu Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Ile Asn Leu 195 200 205 Val Thr Gly Pro Gly Ser Val Val Gly Gln Gly Leu Ala Glu His Asp 210 215 220 Gly Val Asn Ala Val Thr Phe Thr Gly Ser Asn Gln Val Gly Lys Ile 225 230 235 240 Ile Gly Gln Ala Ala Leu Ala Arg Gly Ala Lys Tyr Gln Leu Glu Met 245 250 255 Gly Gly Lys Asn Pro Val Ile Val Ala Asp Asp Ala Asp Leu Glu Ala 260 265 270 Ala Ala Glu Ala Val Ile Thr Gly Ala Phe Arg Ser Thr Gly Gln Lys 275 280 285 Cys Thr Ala Thr Ser Arg Val Ile Val Gln Ser Gly Ile Tyr Glu Arg 290 295 300 Phe Lys Glu Lys Leu Leu Gln Arg Thr Lys Asp Ile Thr Ile Gly Asp 305 310 315 320 Ser Leu Lys Glu Asp Val Trp Met Gly Pro Ile Ala Ser Lys Asn Gln 325 330 335 Leu Asp Asn Cys Leu Ser Tyr Ile Glu Lys Gly Lys Gln Glu Gly Ala 340 345 350 Ser Leu Leu Ile Gly Gly Glu Lys Leu Glu Asn Gly Lys Tyr Gln Asn 355 360 365 Gly Tyr Tyr Val Gln Pro Ala Ile Phe Asp Asn Val Thr Ser Glu Met 370 375 380 Thr Ile Ala Gln Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ile Ala Leu Ile Lys 385 390 395 400 Val Asp Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asn Ile Ala Asn Asp Val Lys Phe 405 410 415 Gly Leu Ser Ala Ser Ile Phe Thr Glu Asn Ile Gly Arg Met Leu Ser 420 425 430 Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ala Gly Leu Val Arg Ile Asn Ala Glu Ser 435 440 445 Ala Gly Val Glu Leu Gln Ala Pro Phe Gly Gly Met Lys Gln Ser Ser 450 455 460 Ser His Ser Arg Glu Gln Gly Glu Ala Ala Lys Asp Phe Phe Thr Ala 465 470 475 480 Ile Lys Thr Val Phe Val Lys Pro 485 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Ptac_xylXABC_F <400> 111 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<210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer yagF_F <400> 119 cacaaggaga ctcccatgac cattgagaaa attttc 36 <210> 120 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer yagF_R <400> 120 gaactggcgg ctcccttaaa ttccgagcgc ttttttac 38

Claims (16)

  1. 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 세균을, 탄소원으로서 크실로스를 함유하는 배지에서 배양하여, 목적 물질을 당해 배지 중에 생성 축적시키고, 당해 배지로부터 목적 물질을 채취하는, 목적 물질의 제조 방법으로서,
    상기 목적 물질은 2-케토글루타르산 또는 이의 유도체이고,
    상기 세균은, 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 능력을 갖고, 또한, 크실로네이트데히드라타제 활성, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제 활성, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제 활성이 부여 또는 증강된 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세균은, 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제를 각각 코드화하는 유전자가 발현 가능한 형태로 도입됨으로써, 이들 효소 활성이 부여 또는 증강된 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 크실로네이트데히드라타제, 2-케토-3-데옥시크실로네이트데히드라타제, 및 2-케토글루타르산 세미알데히드데히드로게나제를 코드화하는 유전자가 카울로박터(Caulobacter)속, 에스케리키아(Escherichia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum)속, 악티노플라네스(Actinoplanes)속, 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 조벨리아(Zobellia), 써모바실루스(Thermobacillus)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 아조스피릴리움(Azospirillum)속, 할로모나스(Halomonas)속, 바실루스(Bacillus)속, 또는 아스페르길루스(Aspergillus)속에 속하는 미생물 유래인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균은, 하기 중 어느 하나에 의해 크실로스로부터 크실론산을 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법:
    (A) 크실로스데히드로게나제 활성, 또는 크실로스데히드로게나제 및 크실로노락토나제 활성을 부여 또는 증강시킴, 또는,
    (B) 크실로스로부터 크실론산을 생성하는 반응을 촉매할 수 있는 글루코스데히드로게나제 활성을 가짐.
  5. 제4항에 있어서, 상기 글루코스데히드로게나제는 피롤로퀴놀린퀴논을 조효소로 하고, 또한, 상기 세균은, 피롤로퀴놀린퀴논 생산능을 갖거나, 또는 피롤로퀴놀린퀴논을 함유하는 배지에서 배양됨으로써 글루코스데히드로게나제 활성을 갖는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 세균은, 크실로스데히드로게나제, 또는 크실로스데히드로게나제 및 크실로노락토나제를 각각 코드화하는 유전자가 발현 가능한 형태로 도입됨으로써, 크실로스로부터 크실론산을 생성할 수 있는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균은, 2-케토글루타르산데히드로게나제의 활성이 저하되도록 추가로 개변(改變)된 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균은, 석신산데히드로게나제의 활성이 저하되도록 추가로 개변된 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 장내 세균 또는 코리네형(coryneform) 세균인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세균이 판토에아(Pantoea)속 세균인 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세균이 판토에아·아나나티스(Pantoea ananatis)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 세균이 에스케리키아(Escherichia)속 세균인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세균이 에스케리키아·콜라이(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 세균이 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균인 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세균이 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-케토글루타르산 유도체가, L-글루탐산, L-글루타민, L-아르기닌, L-시트룰린, L-오르니틴, L-프롤린, 푸트레신, 및 γ-아미노부티르산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 물질인, 방법.
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