JP2019531759A - 目的物質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
glutamicumのfpr2-cysIXHDNYZ遺伝子クラスタは、同化型硫黄還元に関与する(Rueckert
C. et al., Functional genomics and expression analysis of the Corynebacterium glutamicum fpr2-cysIXHDNYZ gene cluster involved in assimilatory sulphate reduction. BMC Genomics. 2005 Sep 13;6:121)。具体的には、cysIXHDNYZ遺伝子にコードされるCysIXHDNYZタンパク質は、硫酸塩や亜硫酸塩等の無機硫黄化合物の還元に関与することが証明されている。また、fpr2遺伝子にコードされるFpr2タンパク質は、亜硫酸塩の還元のための電子伝達に関与することが示唆されている。また、SsuRは、有機硫黄化合物の利用に関与する遺伝子の発現を活性化する。
以下の工程:目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、L−システイン生合成酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
前記目的物質が、L−メチオニン、生合成にS−アデノシルメチオニンを要求する代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供することである。
前記cysI遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(1a)配列番号89に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1b)配列番号89に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(1c)配列番号89に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysX遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(2a)配列番号91に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2b)配列番号91に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(2c)配列番号91に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysH遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(3a)配列番号93に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3b)配列番号93に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(3c)配列番号93に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysD遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(4a)配列番号95に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4b)配列番号95に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(4c)配列番号95に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysN遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(5a)配列番号97に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5b)配列番号97に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(5c)配列番号97に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysY遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(6a)配列番号99に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6b)配列番号99に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(6c)配列番号99に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysZ遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(7a)配列番号101に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7b)配列番号101に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(7c)配列番号101に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記fpr2遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(8a)配列番号103に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8b)配列番号103に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(8c)配列番号103に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質。
、および/または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、前記方法を提供することである。
前記cysR遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(9a)配列番号105に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9b)配列番号105に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質;および
(9c)配列番号105に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質;
前記ssuR遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(10a)配列番号107に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10b)配列番号107に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質;および
(10c)配列番号107に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質。
前記方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法を提供することである。
本明細書に記載の微生物は、L−システイン生合成酵素の活性が増大するように改変された、目的物質を生産する能力を有する微生物である。目的物質を生産する能力を、「目的物質生産能」ともいう。
「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を生産することができる微生物を意味してよい。
には、培地(例えば、目的物質の前駆体を含有する培地)で培養したときに、目的物質を生産し、回収できる程度に培地中に蓄積することができる微生物を意味してよい。また、「目的物質生産能を有する微生物」とは、具体的には、反応液中で目的物質の前駆体に作用させたときに、目的物質を生産し、回収できる程度に反応液中に蓄積することができる微生物を意味してよい。
g/L以上、0.05 g/L以上、または0.09 g/L以上の量の目的物質を培地または反応液に蓄積することができ得る。
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株(ATCC 27325)やMG1655株(ATCC 47076)等のエシェリヒア・コリK-12株;エシェリヒア・コリK5株(ATCC 23506);BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株;およびそれらの派生株が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010))。
Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of Americaまたはatcc.org)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
の変換を触媒する酵素が挙げられる。例えば、3−デヒドロシキミ酸(3-dehydroshikimic acid)は、シキミ酸経路の一部によって生産され得る。当該シキミ酸経路の一部は、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−リン酸シンターゼ(3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate synthase;DAHP synthase)、3−デヒドロキナ酸シンターゼ(3-dehydroquinate synthase)、および3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ(3-dehydroquinate dehydratase)により触媒されるステップを含んでいてよい。3−デヒドロシキミ酸は、3−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ(3-dehydroshikimate dehydratase;DHSD)の作用によりプロトカテク酸(protocatechuic acid)へと変換され得る。プロトカテク酸は、O−メチルトランスフェラーゼ(O-methyltransferase;OMT)または芳香族アルデヒドオキシドレダクターゼ(aromatic aldehyde oxidoreductase)(例えば、芳香族カルボン酸レダクターゼ(aromatic carboxylic acid reductase;ACAR))の作用により、それぞれ、バニリン酸(vanillic acid)またはプロトカテクアルデヒド(protocatechualdehyde)へと変換され得る。バニリン酸またはプロトカテクアルデヒドは、それぞれ、ACARまたはOMTの作用により、バニリンへと変換され得る。すなわち、目的物質生合成酵素として、具体的には、例えば、DAHP synthase、3-dehydroquinate synthase、3-dehydroquinate dehydratase、DHSD、OMT、ACARが挙げられる。
タンパク質を意味してよい(EC 4.2.1.10)。3-dehydroquinate dehydrataseをコードする遺伝子を、「3-dehydroquinate dehydratase遺伝子」ともいう。3-dehydroquinate dehydrataseとしては、aroD遺伝子にコードされるAroDタンパク質が挙げられる。AroDタンパク質等の3-dehydroquinate dehydrataseとしては、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。3-dehydroquinate dehydrataseとして、具体的には、E. coliのAroDタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のaroD遺伝子の塩基配列を配列番号5に、同遺伝子がコードするAroDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号6に示す。
dehydratase等)をコードする遺伝子の発現は、tyrR遺伝子にコードされるチロシンリプレッサーTyrRにより抑制される。よって、シキミ酸経路の酵素の活性は、チロシンリプレッサーTyrRの活性を低下させることによっても、増大させることができる。E. coli K-12
MG1655株のtyrR遺伝子の塩基配列を配列番号9に、同遺伝子がコードするTyrRタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に示す。
、植物、微生物の各種OMTが挙げられる。Homo sapiensのOMT遺伝子には4つの転写バリアントおよび2種のOMTアイソフォームが知られている。それら4つの転写バリアント(transcript variant 1-4;GenBank Accession No. NM_000754.3, NM_001135161.1, NM_001135162.1, NM_007310.2)の塩基配列を配列番号11〜14に、長いOMTアイソフォーム(MB-COMT;GenBank Accession No. NP_000745.1)のアミノ酸配列を配列番号15に、短いOMTアイソフォーム(S-COMT;GenBank Accession No. NP_009294.1)のアミノ酸配列を配列番号16に、それぞれ示す。配列番号16は、配列番号15のN末端50アミノ酸残基を欠くアミノ酸配列に相当する。OMTとしては、さらに、Bacteroidetes門細菌(すなわちBacteroidetes門に属する細菌)のOMTが挙げられる。Bacteroidetes門細菌としては、Niastella属、Terrimonas属、またはChitinophaga属等に属する細菌が挙げられる(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2007), 57, 1828-1833)。Niastella属細菌としては、Niastella koreensisが挙げられる。Niastella koreensisのOMT遺伝子の塩基配列を配列番号142に、同遺伝子がコードするOMTのアミノ酸配列を配列番号143に示す。
or positive side-chain charge at pH 7.4)に置換される変異が挙げられる。変異型OMTは、これらの変異のいずれか一方を有していてもよく、両方を有していてもよい。
Thr, Trp, Tyrが挙げられる。「ロイシン残基よりも疎水性インデックス(hydropathy index)が低いアミノ酸残基」としては、特に、Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His,
Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyrから選択されるアミノ酸残基が挙げられ、さらに特には、Tyrが挙げられる。
Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valが挙げられる。「pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基」としては、特に、AlaやGlnが挙げられる。
al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991;Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987)。
T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。
リン)の生成を測定し、プロダクトの生成と比較することにより、OMTがプロダクトを選択的に生成するかどうかを決定できる。
No.1, p478-485)。Nocardia sp. NRRL 5646株は、Nocardia iowensisに分類されている。ACARとしては、さらに、Nocardia brasiliensisやNocardia vulneris等の、他のNocardia属細菌のACARも挙げられる。Nocardia brasiliensis ATCC 700358のACAR遺伝子の塩基配列を配列番号17に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号18に示す。また、Nocardia brasiliensis ATCC 700358のバリアントACAR遺伝子の一例の塩基配列を配列番号19に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号20に示す。
. 2009, Vol.75, No.9, pp.2765-2774)も挙げられる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032株のPPT遺伝子の塩基配列を配列番号23に、同遺伝子がコードするPPTのアミノ酸配列を配列番号24に、それぞれ示す。
sulfoxide)、ヘルシニル−L−システインスルホキシド(hercynyl-L-cysteine sulfoxide)、およびエルゴチオネインへと変換され得る。また、ヘルシニンは、egt1遺伝子に
コードされるEgt1タンパク質の作用により、ヘルシニル−L−システインスルホキシドへと変換され得る。すなわち、L−ヒスチジンからエルゴチオネインへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、EgtDは、SAMをメチル基供与体としてヒスチジンをメチル化してヘルシニンを生成するSAM依存的ヒスチジン−N,N,N−メチルトランスフェラーゼ(S-adenosyl-l-methionine (SAM)-dependent histidine N,N,N-methyltransferase)である。
ornithine transaminase;argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(acetylornithine deacetylase;argE)が挙げられる。L−アルギニン生合成酵素としては、上記例示したL−オルニチン生合成酵素や、カルバモイルリン酸シンターゼ(carbamoyl phosphate synthetase;carAB)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyl transferase;argF, argI)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argininosuccinate synthetase;argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argininosuccinate lyase;argH)が挙げられる。L−アルギニンは、アルギニンデカルボキシラーゼ(arginine decarboxylase;speA;EC 4.1.1.19)の作用によりアグマチン(agmatine)へ、次いでアグマチンウレオヒドロラーゼ(agmatine ureohydrolase;speB;EC 3.5.3.11)の作用によりプトレシン(putrescine)へと変換され得る。また、L−オルニチンは、オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase;speC;EC 4.1.1.17)の作用によりプトレシンへと変換され得る。プトレシンは、スペルミジンシンターゼ(spermidine synthase;speE;EC 2.5.1.16)の作用によりスペルミジンへ、次いでスペルミンシンターゼ(spermine synthase;EC 2.5.1.22)の作用によりスペルミンへと変換され得る。アグマチンは、また、アグマチン/トリアミンアミノプロピルトランスフェラーゼ(agmatine/triamine aminopropyl transferase)の作用によりアミノプロピルアグマチン(aminopropylagmatine)へ、次いでアミノプロピルアグマチンウレオヒドロラーゼ(aminopropylagmatine ureohydrolase)の作用によりスペルミジンへと変換され得る。すなわち、L−アルギニンまたはL−オルニチンからポリアミンへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、spermidine synthase、spermine synthase、およびagmatine/triamine aminopropyl transferaseは、いずれも、SAMの脱炭酸によって生じ得る脱炭酸SAM(decarboxylated S-adenosyl methionine;dcSAM)からプロピルアミン基を対応する基質へと転移する反応を触媒する。
の、CysIXHDNYZタンパク質、Fpr2タンパク質、CysKタンパク質が挙げられる。L−システインからL−メチオニンへの変換を触媒する酵素としては、シスタチオニン−γ−シンターゼ(cystathionine-gamma-synthase)やシスタチオニン−β−リアーゼ(cystathionine-beta-lyase)が挙げられる。
Env. Microbiol., 2009, Vol.75, p2765-2774.)。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、alcohol dehydrogenase(ADH)も挙げられる。また、バニリン生合成経路の中間体である3−デヒドロシキミ酸は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(shikimate dehydrogenase)の作用によりシキミ酸へと変換され得る。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、shikimate dehydrogenaseも挙げられる。
。同活性を、「バニリン酸デメチラーゼ活性」ともいう。バニリン酸デメチラーゼをコードする遺伝子を、「バニリン酸デメチラーゼ遺伝子」ともいう。バニリン酸デメチラーゼとしては、vanAB遺伝子にコードされるVanABタンパク質が挙げられる(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれ、バニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。バニリン酸デメチラーゼ活性を低下させる場合、例えば、vanAB遺伝子の両方を破壊等してもよく、片方のみを破壊等してもよい。C. glutamicum ATCC 13869株のvanAB遺伝子の塩基配列を配列番号29と31に、同遺伝子がコードするVanABタンパク質のアミノ酸配列を配列番号30と32に、それぞれ示す。なお、vanAB遺伝子は、通常、vanK遺伝子とvanABKオペロンを構成している。よって、バニリン酸デメチラーゼ活性を低下させるためにvanABKオペロンをまとめて破壊等(例えば、欠損)してもよい。その場合、改めて宿主にvanK遺伝子を導入してもよい。例えば、菌体外に存在するバニリン酸を利用する場合であって、vanABKオペロンをまとめて破壊等(例えば、欠損)した場合は、改めてvanK遺伝子を導入するのが好ましい。
質、NCgl0313タンパク質、NCgl2709タンパク質、NCgl0219タンパク質、NCgl2382タンパク質が挙げられる。yqhD遺伝子およびNCgl0324遺伝子は、いずれも、vanillyl alcohol dehydrogenaseをコードする。yqhD遺伝子は、例えば、E. coli等の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌に見出され得る。NCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子、NCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子は、例えば、C. glutamicum等のコリネ型細菌に見出され得る。E. coli K-12 MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列を配列番号37に、同遺伝子がコードするYqhDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号38に示す。C. glutamicum ATCC 13869株のNCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子の塩基配列を配列番号39、41、43に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号40、42、44に、それぞれ示す。また、C. glutamicum ATCC 13032株のNCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子の塩基配列を配列番号45、47に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号46、48に、それぞれ示す。1種のADHの活性を低下させてもよく、2種またはそれ以上のADHの活性を低下させてもよい。例えば、NCgl0324タンパク質、NCgl2709タンパク質、およびNCgl0313タンパク質の内の1種またはそれ以上の活性を低下させてよい。特に、少なくとも、NCgl0324タンパク質の活性を低下させてもよい。
MG1655のaroE遺伝子の塩基配列を配列番号49に、同遺伝子がコードするAroEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号50に示す。
た、バニリンをプロトカテクアルデヒドの生物変換により製造する場合は、特に、OMTの活性を増強するのが好ましい場合がある。
微生物は、L−システイン生合成酵素の活性が増大するように改変できる。具体的には、微生物は、L−システイン生合成酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変できる。L−システイン生合成酵素の活性が増大するように微生物を改変することによって、同微生物の目的物質生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物を用いた目的物質の生産を増大させることができる。また、L−システイン生合成酵素の活性が増大するように微生物を改変することによって、同微生物のSAMを生成または再生する能力を向上させることができ得る。すなわち、微生物の目的物質生産能の増大は、具体的には、同微生物のSAMを生成または再生する能力の増大によるものであってもよい。
するタンパク質のアミノ酸配列を配列番号89、91、93、95、97、99、101、103、および141に、それぞれ示す。1種のL−システイン生合成酵素の活性を増大させてもよく、2種またはそれ以上のL−システイン生合成酵素の活性を増大させてもよい。例えば、CysIXHDNYZタンパク質、Fpr2タンパク質、およびCysKタンパク質の内の1種またはそれ以上の活性を増大させてもよく、CysIXHDNYZタンパク質およびFpr2タンパク質の内の1種またはそれ以上の活性を増大させてもよい。
L−システイン生合成酵素遺伝子またはその制御遺伝子のホモログは、例えば、コリネ型細菌等の生物の染色体を鋳型にして、上記例示したL−システイン生合成酵素遺伝子またはその制御遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2〜3回洗浄する条件を挙げることができる。
合、例えば、各プログラム(例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX)の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
以下に、L−システイン生合成酵素またはその制御因子等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
子の転写量(mRNA量)が増大すること、および/または、遺伝子の翻訳量(タンパク質の量)が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
Ra)、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド;pCRY30(特開平3-210184);pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX(特開平2-72876、米国特許5,185,262号);pCRY2およびpCRY3(特開平1-191686);pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844(特開昭58-192900);pCG1(特開昭57-134500);pCG2(特開昭58-35197);pCG4およびpCG11(特開昭57-183799);pVK7(特開平10-215883);pVK9(WO2007/046389);pVS7(WO2013/069634);pVC7(特開平9-070291)が挙げられる。
目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989);Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987))や、ファージを用いる方法(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987);Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
様プロモーター(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
1988, 73, 227-235)。さらに、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)。mRNAの量は、例えば、非改変株の、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
い。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各微生物種の基準株(type strain)が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、微生物の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株(すなわち微生物が属する種の基準株)と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、E. coli K-12 MG1655株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含されてよい。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および/または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量(mRNA量)または翻訳量(タンパク質の量)を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含されてよい。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含されてよい。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、または0%に低下してよい。
によっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、本明細書に記載するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の微生物を利用して目的物質を製造する方法である。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物の発酵により製造することができる。すなわち、本明細書に記載の方法の一態様は、微生物の発酵により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「発酵法」ともいう。また、本明細書に記載の微生物の発酵により目的物質を製造する工程を、「発酵工程」ともいう。
として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉の加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、クエン酸、コハク酸、グルコン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。なお、炭素源としては、特に、植物由来原料を用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、精製物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の5炭糖、グルコース等の6炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して5炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して6炭糖を生成させてもよい。また、キシロースは、例えば、微生物にグルコース等の6炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、6炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、1種の炭素源を用いてもよく、2種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物を利用した生物変換により製造することもできる。すなわち、本明細書に記載の方法の別の態様は、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「生物変換法」ともいう。また、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する工程を、「生物変換工程」ともいう。
−チロシンは、いずれも、例えば、フェルラ酸、4−ビニルグアイアコール、または4−エチルグアイアコールを生産するための前駆体として用いてよい。L−アルギニンおよびL−オルニチンは、いずれも、例えば、ポリアミンを生産するための前駆体として用いてよい。L−アルギニンおよびグリシンは、いずれも、例えば、クレアチンを生産するための前駆体として用いてよい。前駆体としては、1種の前駆体を用いてもよく、2種またはそれ以上の前駆体を組み合わせて用いてもよい。前駆体が塩の形態を取り得る化合物である場合、前駆体は、フリー体として用いてもよく、塩として用いてもよく、それらの混合物として用いてもよい。すなわち、「前駆体」とは、特記しない限り、フリー体の前駆体、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。前駆体の塩としては、1種の塩を用いてもよく、2種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
換する工程であってよい。生物変換工程は、具体的には、目的物質の前駆体を含有する培地で微生物を培養し、目的物質を該培地中に生成蓄積する工程であってもよい。
上、または1.5ppm以上である条件を意味してよい。酸素濃度は、具体的には、例えば、飽和酸素濃度に対し、1〜50%、または5%程度に制御されてよい。反応液のpHは、例えば、通常6.0〜10.0、または6.5〜9.0であってよい。反応温度は、例えば、15〜50℃、15〜45℃、または20〜40℃であってよい。反応時間は、例えば、5分〜200時間であってよい。カラム法の場合、反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。また、変換反応は、例えば、細菌や酵母等の微生物の培養に用いられる通常の条件等の培養条件で行うこともできる。変換反応においては、菌体は、生育してもよく、しなくてもよい。すなわち、生物変換法の第2の態様における変換反応については、同態様においては菌体が生育してもしなくてもよいこと以外は、生物変換法の第1の態様における培養についての記載を準用できる。そのような場合、菌体を取得するための培養条件と、変換反応の条件は、同一であってもよく、なくてもよい。反応液中の前駆体の濃度は、フリー体の重量に換算して、例えば、0.1 g/L以上、1 g/L以上、2 g/L以上、5 g/L以上、10 g/L以上、または15 g/L以上であってもよく、200 g/L以下、100
g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応液中の菌体の濃度は、例えば、600nmにおける光学密度(OD)に換算して、1以上であってもよく、300以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
本明細書に記載の微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)目的物質が製造される場合、製造された目的物質をさらに他の目的物質に変換することができる。すなわち、本発明は、微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)第1の目的物質(すなわち、目的物質A)を製造する工程、および製造された第1の目的物質Aを第2の目的物質(すなわち、目的物質B)に変換する工程を含む、第2の目的物質Bを製造する方法を提供する。
する微生物を利用することにより、4−エチルグアイアコールに変換することができる。上述したバニリン製造法に関する記載は、他の目的物質を製造する方法にも準用できる。
コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。バニリン酸からプロトカテク酸への変換反応は、バニリン酸デメチラーゼにより触媒される。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれバニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。vanK遺伝子は、バニリン酸取り込み系をコードし、vanAB遺伝子とvanABKオペロンを構成している(M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865)。よって、まず、vanABKオペロンを欠損させることにより、C.
glutamicum 2256株からバニリンやバニリン酸等の目的物質の資化能を欠損した株(FKS0165株)を構築した。手順を以下に示す。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号51および52の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号53および54の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号52および53は一部が相補的な配列となっている。次にvanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびvanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔvanABK56と命名した。
上記で得られたpBS4SΔvanABK56はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔvanABK56を電気パルス法にてC. glutamicum 2256株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地(グルコース 5 g/L、Polypeptone 10
g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 15 g/L、NaOHでpH7.5に調整)に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔvanABK56が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のvanABK遺伝子群と欠損型のvanABK遺伝子群の両方を有する。
組成)で一夜培養し、培養液をS10寒天培地(スクロース 100 g/L、ポリペプトン 10 g/L、酵母エキス 10 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・4-5H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆蛋白加水分解液1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 20 g/L、NaOHを用いてpH7.5に調整:オートクレーブ120℃20分)に塗布し31.5℃で培養した。出現したコロニーのうち、カナマイシン感受性を示す株をCM-Dex寒天培地上で純化した。純化した株よりゲノムDNAを調製し、配列番号55および56の合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによってvanABK遺伝子の欠損を確認し、該株をFKS0165株とした。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKS0165株を親株として、アルコールデヒドロゲナーゼホモログ遺伝子であるNCgl0324遺伝子(adhC)、NCgl0313遺伝子(adhE)、NCgl2709遺伝子(adhA)を欠損した株(FKFC14株)を以下の手順で構築した。
<2−1−1>NCgl0324遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhCの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号57および58の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号59および60の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号58および59は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhCと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhCを電気パルス法にてC. glutamicum FKS0165株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhCが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0324遺伝子と欠損型のNCgl0324遺伝子の両方を有する。
<2−2−1>NCgl0313遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhEの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号63および64の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た
。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号65および66の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号64および65は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhEと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhEはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhEを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC5株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhEが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0313遺伝子と欠損型のNCgl0313遺伝子の両方を有する。
<2−3−1>NCgl2709遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhAの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号69および70の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号71および72の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号70および71は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhAと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhAを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC11株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生
育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhAが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl2709遺伝子と欠損型のNCgl2709遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14株を親株として、プロトカテク酸ジオキシゲナーゼαサブユニットおよびβサブユニットをコードするNCgl2314遺伝子(pcaG)およびNCgl2315遺伝子(pcaH)を欠損したFKFC14ΔpcaGH株を外注により構築した。FKFC14ΔpcaGH株は、以下の手順でも構築することができる。
pcaG遺伝子とpcaH遺伝子は隣接しており、まとめて欠損させることが可能である。C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号75および76の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号77および78の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物を得る。配列番号76および77は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物およびNCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256pcaGHと命名する。
上記で得られたpBS4SΔ2256pcaGHはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256pcaGHを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256pcaGHが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。該1回組換え株は、野生型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子と、欠損型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14ΔpcaGH株を親株として、Crpファミリー
の発現制御タンパク質をコードするNCgl0120遺伝子(cysR)のプロモーター領域がP2プロモーターに置換されたAp1_0007株を外注により構築した。同株におけるP2プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号108(942-1034位がP2プロモーターに相当)に示す。Ap1_0007株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号81および82の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0120遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C.
glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号83および84の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0120遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P2プロモーター領域を含む配列番号85のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号85のDNA断片を鋳型として、配列番号86および87の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P2プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号82および86は一部が相補的な配列となっている。配列番号83および87は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0120遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl0120遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP2プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP2::NCgl0120と命名する。
上記で得られたpBS4SP2::NCgl0120はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP2::NCgl0120を電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14ΔpcaGH株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP2::NCgl0120が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
<5−1>プラスミドpEPlac-COMT2の構築
Homo sapiensのOMT遺伝子には2種のOMTアイソフォーム(すなわち、短いOMTアイソフォーム(S-COMT)と長いOMTアイソフォーム(MB-COMT))が知られている。S-COMTのアミノ酸配列を配列番号16に、S-COMTをコードする野生型cDNAの塩基配列を配列番号112に、それぞれ示す。S-COMTの野生型cDNAをEscherichia coli(E. coli)での発現用にコドン最適化し、ATG Service Gen(Russian Federation, Saint-Petersburg)のサービスを利用して化学合成した。後のクローニングを容易にするため、遺伝子のDNA断片は、3’末端および5’末端にそれぞれNdeIおよびSacIの制限酵素サイトを付加して合成した。このコドン最適化されたS-COMTのcDNAを「COMT2遺伝子」ともいう。COMT2遺伝子を含む合成されたDNA断片の塩基配列を配列番号113に示す。COMT2遺伝子を含む合成されたDNA断片は、pUC57ベクター(GenScript)に挿入された状態で得た。
S. V. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 88(3):719-726)のNdeI−SacI制限サイトに再クローニングした。pELACベクターは、pET22b(+)(Novagen)のBglII−XbaI断片を、PlacUV5プロモーターを含む合成BglII−XbaI断片で置換することにより構築した。COMT2遺伝子をpELACベクターに挿入するため、T4 DNA ligase(Fermentas, Lithuania)によるライゲーション反応を供給元の推奨する通りに実施した。ライゲーション反応物をエタノールで処理し、得られた沈殿を水に溶解してから、エレクトロポレーション(Micro Pulser, BioRad)により供給元の推奨する条件でE. coli TG1の菌体に導入した。菌体を、アンピシリン(200 mg/L)を添加したLAプレート(Sambrook J. and Russell D. W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rded.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に塗布し、37℃で一晩培養した。得られたコロニーをPCR解析により試験し、要求されるクローンを選択した。COMT2遺伝子を含むコロニーの選択には、プライマーP1およびP2(配列番号115および116)を利用した。ベクター特異的プライマーP1とCOMT2遺伝子の末端用のリバースプライマーP2を用いることにより、713 bpのDNA断片が得られた。こうして、ベクターpEPlac-COMT2を構築した。クローニングされたCOMT2遺伝子の配列は、プライマーP1およびP3(配列番号115および117)を利用して決定した。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号118および119の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、cspB遺伝子のプロモーター領域とSD配列を含むPCR産物を得た。一方、プラスミドpEPlac-COMT2を鋳型として、配列番号120および121の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、COMT2遺伝子を含むPCR産物を得た。次に、これらの断片をIn Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpVK9ベクター(WO2007/046389)に挿入した。なお、pVK9はコリネ型細菌とE. coliのシャトルベクターである。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン25μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9::PcspB-hsomtと命名した。
プラスミドpVK9::PcspB-hsomtを有するC. glutamicum FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0007/pVK9::PcspB-hsomt株を外注により構築した。これらの株は、以下の手順でも構築することができる。
14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomtおよびAp1_0007/pVK9::PcspB-hsomtと命名する。
FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0007/pVK9::PcspB-hsomt株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地4 mLを含む試験管に接種し、前培養として31.5℃で20時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.5 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地50 mLを含むバッフル付き三角フラスコに接種し、31.5℃で20時間振とう培養を行った。得られた培養液を8000 rpmで5分間遠心し、上清を除去し、菌体を滅菌生理食塩水に懸濁した。菌体懸濁液の光学密度(OD)を測定し、600 nmでのODが50になるように生理食塩水で菌体懸濁液を希釈した。希釈した菌体懸濁液5 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地(グルコース 75 g/L、MgSO4・7H2O 0.6 g/L、(NH4)2SO4 6.3 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、FeSO4・7H2O 12.5 mg/L、MnSO4・4-5H2O 12.5 mg/L、Yeast Extract 2.5 g/L、Vitamin B1 150μg/L、Biotin 150μg/L、プロトカテク酸 6.9 g/L、KOHでpH7に調整後、CaCO3 37.5 g/L(180℃で3時間乾熱滅菌したもの)と混合)20 mLを含むバッフル付き三角フラスコに接種し、31.5℃で24時間振とう培養を行った。
UPLC分析条件
カラム:KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex)
オーブン温度: 40 ℃
移動相(A):0.1% トリフルオロ酢酸
移動相(B):0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %):(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速:1.5 mL/min
次いで、FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0007/pVK9::PcspB-hsomt株におけるNCgl0120遺伝子(cysR)の発現量をデジタルPCRにより解析した。
FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0007/pVK9::PcspB-hsomt株について実施例<7>で培養開始から5時間後に取得した250μLの菌体を含む培養液を500μLのRNA Protect Bacteria Reagent(QIAGEN)と混合し、-80℃に一旦保存した。凍結混合物を室温で融解後、リゾチームを含有する200μLのTE緩衝液(10mM トリス、1mM EDTA、pH8.0)および10μLのプロテアーゼK(20mg/mL)を添加して混合した後、室温で40分間インキュベートした。この後の作業はRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて実施した。処理物に1%2−メルカプトエタノールを含有するRLT緩衝液を700μL添加して混合し、遠心して上清を得た。上清に500μLのエタノールを添加して混合し、キット付属のカラムにアプライし
、カラムを遠心した。カラムを350μLのRW1緩衝液で洗浄後、80μLのDNaseI溶液をカラムにアプライし、室温で15分間DNase処理を実施した。さらに、カラムを350μLのRW1緩衝液で洗浄し、500μLのRPE緩衝液で2回洗浄した後、RNaseフリーの滅菌水で溶出し、RNAを取た。得られたRNAをNanoDrop(Thermo Fisher Scientific)を用いて定量し、BioAnalyer(Agilent Technologies)とRNA 6000 Nano Kit(Agilent Technologies)を用いた電気泳動により分析し、得られたRNAが十分な純度であることを確認した。
逆転写には、PrimeScript RT Reatent Kit with gDNA Eraser(タカラバイオ)を用いた。RNA 1μgに1μLのgDNA Eraser、2μLの5×DNA Eraser Bufferを添加し、滅菌水で総量10μLにした後、42℃で2分間インキュベートし、染色体DNAを分解した。反応液に4μLの5×PrimeScript Buffer2、1μLのPrimeScript RT Emzyme MixI、1μLのRT Primer Mix、および4μLの滅菌水を加え、37℃で15分および85℃で5秒インキュベートし、cDNAを取た。
NCgl0120遺伝子(cysR)のPCR増幅のために、2.2μLのcDNA(鋳型RNAとして110ng相当)、11μLの2xEvaGreen Mix(BIORAD)、各々0.44μLの配列番号122および123のプライマー(5μM)、7.92μLの滅菌水を混合して総量22μLにし、Automated Droplet Generator(BIORAD)とAutomated Droplet Generator oil for EvaGreen(BIORAD)を用いドロップレットを調製した。また、コントロールとしての16S rRNAのPCR増幅のために、同一の手順(ただし、2.2μLの10,000倍希釈したcDNA(鋳型RNAとして11pg相当)と各々0.44μLの配列番号124および125のプライマー(5μM)を鋳型およびプライマーとして用いた)によりドロップレットを調製した。
調製したドロップレットをS1000 Thermal Cycler(BIORAD)にセットし、PCR(95℃で5分変性後、95℃で30秒および60℃で1分を40サイクル、次いで、4℃で5分および90℃で5分、最後に4℃にホールド)を実施した。全てのPCRステップで、Ramp Rateは2℃/秒に設定した。
PCR後のサンプルをドロップレットリーダーQX200 Drollet Digital PCR system(BIORAD)にセットし、各々20μLのサンプル(NCgl0120遺伝子(cysR)について鋳型RNAとして100ngに相当、16S rRNAについて鋳型RNAとして10pgに相当)を装置に流した。結果をソフトウェアQuantaSoftで解析し、鋳型RNA 100ng当たりのNCgl0120遺伝子(cysR)のコピー数を算出した。16S rRNAについては、鋳型RNA 10pg当たりのコピー数をソフトウェアQuantaSoftで算出した後、算出した値を100ng当たりの値に換算した。さらに、FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株での値を「1」とした時のAp1_0007/pVK9::PcspB-hsomt株におけるNCgl0120遺伝子(cysR)の相対コピー数を算出した。
Corynebacterium glutamicum Ap1_0007株を親株として、NCgl2048遺伝子のプロモーター領域がP8プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が弱化されたBp1_0112株を外注により構築した。同株におけるP8プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号110(901-1046位がP8プロモーターに相当)に示す。Bp1_0112株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号126および127の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号128および129の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P8プロモーター領域を含む配列番号130のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号130のDNA断片を鋳型として、配列番号131および132の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P8プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号127および131は一部が相補的な配列となっている。配列番号128および132は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP8プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG
100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP8::NCgl2048と命名する。
上記で得られたpBS4SP8::NCgl2048はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP8::NCgl2048を電気パルス法にてC. glutamicum Ap1_0007株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP8::NCgl2048が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Bp1_0112株を親株として、O-acetylserine (thiol)-lyaseをコードするNCgl2473遺伝子(cysK)のプロモーター領域がP6プロモーターに置換されたDp2_0157株を外注により構築した。P6プロモーターの塩基配列を配列番号135に示す。Dp2_0157株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号136および137の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2473遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号138および139の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2473遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P6プロモーターを含む配列番号135のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。配列番号135および137は一部が相補的な配列となっている。配列番号135および138は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2473遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl2473遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP6プロモーターを含む配列番号135のDNA断片をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4S_P6:: NCgl2473と命名する。
上記で得られたpBS4S_P6:: NCgl2473はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4S_P6:: NCgl2473を電気パルス法にてC. glutamicum Bp1_0112株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4S_P6:: NCgl2473が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
流にP6プロモーターが存在することを確認し、該株をDp2_0157株とする。
プラスミドpVK9::PcspB-omt35を外注により得た。プラスミドpVK9::PcspB-omt35は、C.
glutamicumのコドン使用にコドン最適化されたNiastella koreensisのOMT遺伝子を保有する。この遺伝子を「omt35遺伝子」、この遺伝子にコードされるOMTを「OMT35」ともいう。omt35遺伝子の塩基配列を配列番号147に、OMT35のアミノ酸配列を配列番号143に示す。プラスミドpVK9::PcspB-omt35は、以下の手順でも構築することができる。
100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン25μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の構造が挿入されていたものをpVK9::PcspB-omt35と命名する。
プラスミドpVK9::PcspB-omt35を、電気パルス法にてC. glutamicum Bp1_0112株およびDp2_0157株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株を同寒天培地にて純化し、それぞれ、Bp1_0112_RbおよびDp2_0157_Rbと命名した。
Bp1_0112_Rb株およびDp2_0157_Rb株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地0.5 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、前培養として30℃で16時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.1 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地(グルコース 75 g/L、MgSO4・7H2O
0.6 g/L、(NH4)2SO4 6.3 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、FeSO4・7H2O 12.5 mg/L、MnSO4・4-5H2O 12.5 mg/L、Yeast Extract 2.5 g/L、Vitamin B1 150μg/L、Biotin 150μg/L、プロトカテク酸 6.9 g/L、KOHでpH7に調整後、CaCO3 30 g/L(180℃で3時間乾熱滅菌したもの)と混合)0.4 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、30℃で24時間振とう培養を行った。
UPLC分析条件
カラム:KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex)
オーブン温度: 40 ℃
移動相(A):0.1% トリフルオロ酢酸
移動相(B):0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %):(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速:1.5 mL/min
配列番号1:Escherichia coli MG1655のaroG遺伝子の塩基配列
配列番号2:Escherichia coli MG1655のAroGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:Escherichia coli MG1655のaroB遺伝子の塩基配列
配列番号4:Escherichia coli MG1655のAroBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:Escherichia coli MG1655のaroD遺伝子の塩基配列
配列番号6:Escherichia coli MG1655のAroDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:Bacillus thuringiensis BMB171のasbF遺伝子の塩基配列
配列番号8:Bacillus thuringiensis BMB171のAsbFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:Escherichia coli MG1655のtyrR遺伝子の塩基配列
配列番号10:Escherichia coli MG1655のTyrRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11〜14:Homo sapiensのOMT遺伝子の転写バリアント1〜4の塩基配列
配列番号15:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(MB-COMT)のアミノ酸配列
配列番号16:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(S-COMT)のアミノ酸配列
配列番号17:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号18:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号20:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Escherichia coli MG1655のentD遺伝子の塩基配列
配列番号22:Escherichia coli MG1655のEntDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPT遺伝子の塩基配列
配列番号24:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPTタンパク質のアミノ酸配列
配列番号25:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanK遺伝子の塩基配列配列番号26:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpcaK遺伝子の塩基配列配列番号28:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPcaKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanA遺伝子の塩基配列配列番号30:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanB遺伝子の塩基配列配列番号32:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaG遺伝子の塩基配列
配列番号34:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaH遺伝子の塩基配列
配列番号36:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Escherichia coli MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列
配列番号38:Escherichia coli MG1655のYqhDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324遺伝子の塩基配列
配列番号40:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324タンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313遺伝子の塩基配列
配列番号42:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313タンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709遺伝子の塩基配列
配列番号44:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709タンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219遺伝子の塩基配列
配列番号46:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219タンパク質のアミノ酸配列
配列番号47:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382遺伝子の塩基配列
配列番号48:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382タンパク質のアミノ酸配列
配列番号49:Escherichia coli MG1655のaroE遺伝子の塩基配列
配列番号50:Escherichia coli MG1655のAroEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号51〜84:プライマー
配列番号85:P2プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号86および87:プライマー
配列番号88:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysI遺伝子の塩基配列配列番号89:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号90:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysX遺伝子の塩基配列配列番号91:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号92:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysH遺伝子の塩基配列
配列番号93:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号94:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysD遺伝子の塩基配列配列番号95:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号96:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysN遺伝子の塩基配列配列番号97:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysNタンパク質のアミノ酸配列
配列番号98:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysY遺伝子の塩基配列配列番号99:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysYタンパク質のアミノ酸配列
配列番号100:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysZ遺伝子の塩基配列
配列番号101:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysZタンパク質のアミノ酸配列
配列番号102:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のfpr2遺伝子の塩基配列
配列番号103:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のFpr2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号104:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysR遺伝子の塩基配列
配列番号105:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号106:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のssuR遺伝子の塩基配列
配列番号107:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のSsuRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号108:P2プロモーターを含む塩基配列
配列番号109:P4プロモーターを含む塩基配列
配列番号110:P8プロモーターを含む塩基配列
配列番号111:P3プロモーターを含む塩基配列
配列番号112:Homo sapiensのS-COMTをコードするcDNAの塩基配列
配列番号113:COMT2遺伝子を含む合成DNA断片の塩基配列
配列番号114:pELACベクター
配列番号115〜129:プライマー
配列番号130:P8プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号131および132:プライマー
配列番号133:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048遺伝子の塩基配列
配列番号134:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048タンパク質のアミノ酸配列
配列番号135:P6プロモーターを含む塩基配列
配列番号136〜139:プライマー
配列番号140:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysK遺伝子の塩基配列
配列番号141:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号142:Niastella koreensisのOMT遺伝子の塩基配列
配列番号143:Niastella koreensisのOMTのアミノ酸配列
配列番号144および145:プライマー
配列番号146:omt35遺伝子を含むDNA断片の塩基配列
配列番号147:omt35遺伝子(コドン最適化されたNiastella koreensisのOMT遺伝子)の塩基配列
Claims (30)
- 目的物質の製造方法であって、
以下の工程:目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、L−システイン生合成酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
前記目的物質が、L−メチオニン、生合成にS−アデノシルメチオニンを要求する代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。 - 前記製造が、炭素源を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記製造が、前記微生物を利用して前記目的物質の前駆体を該目的物質に変換することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記変換が、前記微生物の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、前記目的物質を該反応液中に生成蓄積させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記菌体が、前記微生物の培養液に含まれる菌体、該培養液から回収された菌体、該培養液の処理物に含まれる菌体、該回収された菌体の処理物に含まれる菌体、またはそれらの組み合わせである、請求項5に記載の方法。
- 前記前駆体が、プロトカテク酸、プロトカテクアルデヒド、L−トリプトファン、L−ヒスチジン、L−フェニルアラニン、L−チロシン、L−アルギニン、L−オルニチン、グリシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記目的物質を回収することを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記L−システイン生合成酵素が、cysI遺伝子、cysX遺伝子、cysH遺伝子、cysD遺伝子、cysN遺伝子、cysY遺伝子、cysZ遺伝子、fpr2遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子にコードされる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の通りである、請求項9に記載の方法:
前記cysI遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(1a)配列番号89に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1b)配列番号89に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(1c)配列番号89に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysX遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(2a)配列番号91に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2b)配列番号91に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(2c)配列番号91に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysH遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(3a)配列番号93に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3b)配列番号93に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(3c)配列番号93に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysD遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(4a)配列番号95に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(4b)配列番号95に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(4c)配列番号95に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysN遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(5a)配列番号97に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(5b)配列番号97に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(5c)配列番号97に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysY遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(6a)配列番号99に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(6b)配列番号99に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(6c)配列番号99に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記cysZ遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(7a)配列番号101に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(7b)配列番号101に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(7c)配列番号101に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;
前記fpr2遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(8a)配列番号103に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(8b)配列番号103に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質;および
(8c)配列番号103に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、硫黄の利用に関与する機能を有するタンパク質。 - 前記L−システイン生合成酵素の活性が、該L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより増大した、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を増大させること、および/または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現が、該遺伝子の正の発現制御因子の活性を増大させることにより増大した、請求項11または12に記載の方法。
- 前記正の発現制御因子が、cysR遺伝子、ssuR遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項13に記載の方法。
- 少なくともcysR遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大した、請求項14に記載の方法。
- 以下の通りである、請求項14または15に記載の方法:
前記cysR遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(9a)配列番号105に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(9b)配列番号105に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質;および
(9c)配列番号105に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質;
前記ssuR遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする:
(10a)配列番号107に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(10b)配列番号107に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質;および
(10c)配列番号107に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、L−システイン生合成酵素をコードする遺伝子の発現を正に制御する機能を有するタンパク質。 - 前記微生物が、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する細菌、コリネ型細菌、または酵母である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌である、請求項17に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項18に記載の方法。
- 前記微生物が、エシェリヒア(Escherichia)属細菌である、請求項17に記載の方法。
- 前記微生物が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項20に記載の方法。
- 前記代謝物が、バニリン、バニリン酸、メラトニン、エルゴチオネイン、ムギネ酸、フェルラ酸、ポリアミン、グアイアコール、4−ビニルグアイアコール、4−エチルグアイアコール、およびクレアチンからなる群より選択される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質の生合成に関与する酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質の生合成に関与する酵素が、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−リン酸シンターゼ、3−デヒドロキナ酸シンターゼ、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、3−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、O−メチルトランスフェラーゼ、芳香族アルデヒドオキシドレダクターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素が、バニリン酸デメチラーゼ、プロトカテク酸3,4−ジオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- バニリンの製造方法であって、
請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法。 - 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌である、請求項28に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項28に記載の方法。
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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"Deregulation of S-adenosylmethionine biosynthesis and regeneration improves methylation in the E. co", MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. Volume 15, Number 61, JPN6021041738, 11 April 2016 (2016-04-11), pages 1 - 17, ISSN: 0004701488 * |
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