DE60319842T2

DE60319842T2 - Glucosedehydrogenase

Info

Publication number: DE60319842T2
Application number: DE60319842T
Authority: DE
Inventors: Koji Sode
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: US7244581B2; AU2003242384A1; EP1535996B1; EP1535996A4; EP1535996A1; US20060073580A1; WO2003106668A1; ATE389713T1; DE60319842D1; JPWO2003106668A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte Glucosedehydrogenase (GDH), die ein Enzym mit Pyrrolchinolinchinon (PQQ) als Coenzym ist, wobei bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind. Das erfindungsgemäße, modifizierte Enzym ist bei der Quantifizierung von Glucose zur Verwendung in der klinischen Diagnose und Nahrungsmittelanalyse nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Die Glucosekonzentration ist ein wichtiger Indikator bei der klinischen Diagnose als wichtiger Marker für Diabetes. Außerdem ist die Quantifizierung der Glucosekonzentration ein wichtiger Indikator zur Überwachung des Fermentationsproduktionsprozesses, bei dem Bakterien verwendet werden. Die Quantifizierung von Glucose wurde herkömmlicherweise durch enzymatische Verfahren unter Verwendung von Glucoseoxidase (GOD) oder Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH) durchgeführt. Heutzutage zieht die Verwendung von Glucosedehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym (PQQGDH) die Aufmerksamkeit bei der Glucosequantifizierung auf sich. PQQGDH besitzt eine hoch oxidative Aktivität gegenüber Glucose, und es erfordert keinen Sauerstoff als Elektronenakzeptor, da PQQGDH ihr Coenzym trägt. Daher ist PQQGDH ein viel versprechendes Enzym für die Anwendung bei Glucosetests, beispielsweise als Erkennungsvorrichtung eines Glucosesensors.
PQQGDH ist eine Glucosedehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, und sie katalysiert die Reaktion der Oxidation von Glucose, um Gluconolacton zu produzieren. Es sind zwei Arten von PQQGDHs bekannt: membrangebundene und wasserlösliche. Die membrangebundene PQQGDH ist ein Einzelpeptidprotein mit einem ungefähren Molekulargewicht von 87 kDa, und man findet sie in einer breiten Vielfalt von Gram-negativen Bakterien. Andererseits fand man wasserlösliche PQQGDH in einigen Stämmen von Acinetobacter calcoaceticus (Biosci. Biotech. Biochem. (1995), 59 (8), 1548–1555), und ihr Strukturgen wurde cloniert und ihre Aminosäuresequenz bestimmt (Mol. Gen. Genet. (1989), 217: 430–436). Wasserlösliche, von A. calcoaceticus stammende PQQGDH ist ein wasserlösliches Homodimerenzym, das aus zwei 50 kDa-Untereinheiten besteht. Es benötigt PQQ und Ca²⁺ für seine Aktivität und zeigt eine Enzymaktivität, die so hoch wie von 2200 E/mg–7400 E/mg liegt. Die isoelektrischen Punkte sind ungefähr 9,2 und 10,2 für das Apoenzym ohne gebundenes PQQ bzw. Holoenzym, was zeigt, dass das Enzym ein basisches Protein ist (K. Matsushita, et al. (1995) Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1548–1555). Außerdem wurden die Ergebnisse der Röntgenstrukturanalyse von wasserlöslicher PQQGDH veröffentlicht, die die Konformation der wasserlöslichen PQQGDH sowie die voraussichtliche Lokalisierung von PQQ und Ca²⁺ aufzeigen (A. Oubrie, et al. (1999) J. Mol. Bio., 289, 319–333, A. Oubrie, et al. (1999) The EMBO Journal, 18 (19), 5187–5194 und A. Oubrie, et al. (1999), PNAS 96 (21), 11787–11791).
EP-A-1167519 (SODE, KOJI), veröffentlicht am 2. Januar 2002, offenbart eine modifizierte Glucosedehydrogenase von Acinetobacter calcoaceticus mit Pyrrolchinolin als Coenzym, die mindestens einen Aminosäurerest durch einen anderen in einer spezifischen Region ersetzt hat und verbesserte Wärmestabilität besitzt.
Die wasserlösliche Wildtyp-PQQGDH zeigt durch Substrathemmung bei einer Glucosekonzentration von 100 mM oder mehr eine merkliche Herabsetzung ihrer Aktivität. Aus diesem Grund ist die quantitative Messung der Substratkonzentration bei einer hohen Substratkonzentration schwierig. Der Mechanismus der Substrathemmung ist bisher nicht bekannt.
Daher zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, eine modifizierte, wasserlösliche PQQGDH bereitzustellen, die eine geringe Herabsetzung der Enzymaktivität aufgrund von Substrathemmung zeigt.
Offenbarung der Erfindung
Als Ergebnis der ausgiebigen Forschung zur Modifizierung der herkömmlichen wasserlöslichen PQQGDH, um eine PQQGDH zu entwickeln, die in der Lage ist, Glucose sogar bei hohen Glucosekonzentrationen zu quantifizieren, hat der Erfinder erfolgreich ein Enzym mit geringerer Substrathemmung durch Einführen von Aminosäuremutationen an bestimmten Regionen der wasserlöslichen PQQGDH erhalten.
Hier wird eine Glucosedehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym beschrieben, wobei eine oder mehrere Aminosäuren in den Aminosäurenresten 325–353 der wasserlöslichen PQQGDH, die von Acinetobacter calcoaceticus stammt, durch andere Aminosäuren ersetzt sind und wobei sie eine Inhibitionskonstante (Ksi) von 200 mM oder mehr besitzt.
Wie hier verwendet, bedeutet die Inhibitionskonstante (Ksi) die höhere der Substratkonzentrationen, die die Hälfte der maximalen beobachteten Enzymaktivität zeigt. Unter den Bedingungen, bei denen die Substrathemmung bei der Enzymaktivität beobachtet werden kann, bedeutet die Inhibitionskonstante einen enzymspezifischen Wert, der durch folgende Formel bestimmt wird: V = Vmax/[1 + (Km/S) + (S/K'si)],wobei V die Reaktionsgeschwindigkeit ist; Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist; Km die Michaelis-Menten-Konstante ist; S die Substratkonzentration ist; Ksi ein theoretischer Wert der Inhibitionskonstante ist. Je höher der Ksi-Wert, desto höher ist die Substratkonzentration, bei der die Substrathemmung beobachtet wird, und die Substrathemmung wird verringert. Da es schwierig ist, den Ksi-Wert in Gegenwart von Verunreinigungen genau zu messen, wird der vorstehend beschriebene beobachtbare Ksi-Wert hier verwendet.
Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch eine spezifische Theorie gebunden zu sein, wird vorhergesagt, dass der Aminosäurebereich 349–377 an der Interaktion der Substratglucose beteiligt ist, da diese Region der Region entspricht, die eine 4D5A–Schleife nach der togologischen Vorhersage bildet, basierend auf der PQQGD-Konformation, die von A. Oubrie et al. gezeigt wurde.
In dieser Beschreibung bedeutet der Begriff „entsprechen" unter Bezugnahme auf Aminosäurereste oder -Regionen, dass einige Aminosäurereste oder -Regionen eine äquivalente Funktion in einem oder mehreren Proteinen besitzen, die strukturell ähnlich sind, aber nicht identisch. Beispielsweise soll eine bestimmte Region in wasserlöslicher PQQGDH, die von anderen Organismen als Acinetobacter calcoaceticus stammt, „der Region der Aminosäurereste 325–353 der wasserlöslichen PQQGDH entsprechen, die von Acinetobacter calcoaceticus stammt", wenn die Aminosäuresequenz einer derartigen Region eine hohe Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz in der 325–353-Region der wasserlöslichen PQQGDH aufweist, die von Acinetobacter calcoaceticus stammt, und dieselbe Funktion kann basierend auf der Sekundärstruktur der relevanten Bereiche in den Proteinen vernunftgemäß vorhergesagt werden. Außerdem soll der Aminosäurerest 17 der relevanten Region „dem Aminosäurerest 341 der wasserlöslichen PQQGDH entsprechen, die von Acinetobacter calcoaceticus stammt". Die Nummerierung der Aminosäuren in dieser Beschreibung beginnt vom Anfangsmethionin als +1-Position.
Vorzugsweise ist in der Glucosedehydrogenase der vorliegenden Erfindung mindestens ein Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Met341, Thr342, Tyr343, Ile344, Cys345 oder Ala350 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt.
Stärker bevorzugt besitzt die Glucosedehydrogenase der vorliegenden Erfindung mindestens eine Mutation, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Met341Trp, Met341Phe, Thr342Asn, Thr342Ile, Thr342Asp, Thr342Lys, Tyr343Asp, Ile344Asn, Cys345Arg und Ala350Pro der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz.
In einem weiteren Aspekt besitzt die modifizierte PQQGDH der vorliegenden Erfindung eine vorstehend beschriebene Mutation und besitzt auch eine andere Mutation, in der Asp143 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 durch einen anderen Aminosäurerest, insbesondere durch Glutaminsäure, ersetzt ist. Die Beteiligung von Asp143 bei der Erkennung und Bindung eines Substrats durch PQQGDH wird in der öffentlichen japanischen Patentoffenbarung Nr. 2001-346587 beschrieben. Im Allgemeinen kann jedoch keine Vorhersage im Hinblick auf die Änderung der Substratspezifität und Enzymaktivität gemacht werden, die durch gleichzeitiges Ändern der Aminosäurereste in der 4D5A-Schleifendomäne und/oder anderen Domänen verursacht werden kann. Daher war es in der vorliegenden Erfindung eine überraschende Entdeckung, dass sowohl die verbesserte Spezifität für Glucose als auch hohe Enzymaktivität gleichzeitig durch Einführen von Doppelmutationen erreicht werden können.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Glucosedehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym bereit, umfassend eine der Sequenzen wie folgt:
Cys Gly Glu Xaa Thr Tyr Ile
(wobei Xaa Phe oder Trp ist);
Gly Glu Met Xaa Tyr Ile Cys
(wobei Xaa Asp Lys, Ile oder Asn ist);
Glu Met Thr Asp Ile Cys Trp;
Met Thr Tyr Asp Cys Trp Pro;
Thr Tyr Ile Arg Trp Pro Thr und
Pro Thr Val Pro Pro Ser Ser
Die Erfindung stellt auch ein Gen, das die erfindungsgemäße PQQGDH codiert, einen Vektor und eine Transformante, umfassend das erfindungsgemäße Gen, ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen PQQGDH sowie einen Glucose-Testkit und einen Glucose-Sensor bereit, die die erfindungsgemäße PQQGDH umfassen.
Da das erfindungsgemäße PQQGDH-Enzym einen niedrigen Spiegel der Substrathemmung durch Glucose zeigt, ist es zur Messung des Glucosespiegels auch bei hohen Glucosekonzentrationen nützlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Konstruktion des in der Erfindung verwendeten pGB2-Plasmids.
2 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion einer Mutante, die das erfindungsgemäße, modifizierte Enzym codiert.
3 zeigt das SV-Diagramm des erfindungsgemäßen, modifizierten Enzyms Tyr343Asp.
4 zeigt das SV-Diagramm des erfindungsgemäßen, modifizierten Enzyms Cys345Arg.
Detaillierte Erklärung der Erfindung
Herstellungsverfahren der modifizierten PQQGDH
Die Sequenz des Gens, das das wasserlösliche Wildtyp-PQQGDH-Protein codiert, das von Acinetobacter calcoaceticus stammt, ist in SEQ ID NO: 2 definiert.
Gene, die modifizierte PQQGDHs der vorliegenden Erfindung codieren, können konstruiert werden, indem die Nucleotidsequenzen, die bestimmte Aminosäuren der wasserlöslichen Wildtyp-PQQGDH codieren, durch die Nucleotidsequenzen, die die Aminosäuren, die einzusetzen sind, codieren, ersetzt werden. Eine breite Palette von Verfahren für ortsspezifische Mutagenese wurde im Fachgebiet sorgfältig ausgearbeitet. Vgl. beispielsweise Sambrook et al., „Molecular cloning; A Laborstory Manual", zweite Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York.
Das auf diese Weise erhaltene, mutierte Gen wird in einen Expressionsvektor (wie ein Plasmid) eingebaut und in einem geeigneten Wirt (wie E. coli) transformiert. Eine breite Palette von Wirt-Vektor-Systemen wurde im Fachgebiet entwickelt, um exogene Proteine zu exprimieren. Beispielsweise können Bakterien, Hefe und gezüchtete Zellen als Wirte verwendet werden.
So lange wie ihre Glucosedehydrogeneaseaktivität beibehalten wird, kann die erfindungsgemäße, modifizierte PQQGDH weiter Deletionen, Substitutionen oder Additionen von anderen Aminosäureresten enthalten. Im Fachgebiet steht eine breite Palette von Verfahren für die ortsspezifische Mutagenese zur Verfügung. Vgl. beispielsweise Sambrook et al., „Molecular cloning; A Laborstory Manual", zweite Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York.
Außerdem kann der Fachmann eine Region in einer wasserlöslichen, von anderen Bakterien stammenden PQQGDH bestimmen, die den Aminosäureresten 325–353 der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entspricht, indem die Anordnung der Primärstruktur der Proteine verglichen wird oder indem die aus den Primärstrukturen der Enzyme vorhergesagten Sekundärstrukturen verglichen werden. Daher können zusätzliche modifizierte PQQGDHs mit verringerter Substrathemmung erhalten werden, indem Aminosäurereste in dieser Region durch andere Aminosäurereste ersetzt werden. Derartige modifizierte PQQGDHs liegen ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Nach der Züchtung der Transformanten, die die modifizierte PQQGDH exprimieren, die wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, können die Zellen durch Zentrifugation gesammelt werden und dann durch die French-Presse aufgebrochen werden, oder die periplasmatischen Enzyme können durch osmotischen Schock in die Kultur freigesetzt werden. Nach der Ultrazentrifugation können lösliche Fraktionen, die PQQGDH enthalten, erhalten werden. Alternativ kann exprimierte PQQGDH in die Kultur sekretiert werden, indem ein geeignetes Wirt-Vektorsystem verwendet wird.
Die lösliche, wie vorstehend beschrieben erhaltene Fraktion wird dann durch Kationenaustauschchromatographie gereinigt. Die Reinigung kann durch Befolgen der allgemeinen, in den im Fachgebiet bekannten Fachbüchern beschriebenen Anweisungen durchgeführt werden. Zur Proteinreinigung steht eine breite Palette von Säulen für die Kationenaustauschchromatographie zur Verfügung, und irgendeine davon kann in dieser Erfindung verwendet werden, einschließlich CM-5PW, CM-Toyopearl 650M, SP-5PW (Toso Co.) und S-Sepharose, Mono-S, S-Resource (Pharmacia Corp.). Die Säule wird mit einem geeigneten Puffer äquilibriert, die Probe wird auf die Säule aufgetragen, und dann werden die nicht absorbierten Materialien abgewaschen. Geeignete Puffer sind beispielsweise Phosphatpuffer oder MOPS-Puffer.
Dann können die in der Säule absorbierten Substanzen durch Auftragen eines Puffers, der eine höhere Salzkonzentration enthält, eluiert werden. Die Salzkonzentration kann allmählich oder linear oder in einer Kombination davon geändert werden, indem Puffer verwendet werden, die verschiedene Salzkonzentrationen enthalten. Die Eluierung der Probe wird durch ein Absorptiometer überwacht, und die Lösung wird in geeignete Volumina fraktioniert. Die Enzymaktivität wird für jede Fraktion gemessen, und die gewünschten Fraktionen werden gesammelt, um eine gereinigte Zubereitung des erfindungsgemäßen, modifizierten Enzyms zu erhalten.
Außerdem können herkömmliche, im Fachgebiet bekannte Verfahren wie Filtration, Dialyse, Gelfiltrationschromatographie oder Affinitätschromatographie vor oder nach der Kationenaustauschchromatographie verwendet werden, falls erforderlich.
Messung der Enzymaktivität
Die PQQGDH der vorliegenden Erfindung mit dem Coenzym PQQ katalysiert die Oxidation von Glucose, um Gluconolacton zu produzieren. Die Enyzmaktivität kann durch eine Farbentwicklungsreaktion eines Redoxfarbstoffs quantifiziert werden, um die Menge an PQQ, das mit einer Glucoseoxidation durch PQQGDH reduziert wird, zu messen. Beispiele von farbentwickelnden Reagenzien schließen PMS (Phenazinmethosulfat), DCIP (2,6-Dichlorphenolindophenol), Kaliumferricyanid und Ferrocen ein.
Bewertung der Substrathemmung
Der Grad der Substrathemmung der PQQGDH der vorliegenden Erfindung kann durch ihre Inhbitionskonstante (Ksi) bewertet werden. Ksi ist die höhere der Substratkonzentrationen, die die Hälfte des höchsten Spiegels der Enzymaktivität zeigen, wenn die Enzymaktivität unter Verwendung von verschiedenen Glucosekonzentrationen gemessen wird.
Bewertung der Substratspezifität
Die Glucosespezifität der vorliegenden Erfindung kann durch Messen der relativen Enzymaktivität im Hinblick auf die Aktivität für Glucose, wie vorstehend beschrieben, bewertet werden, indem eine Vielzahl von Zuckern wie 2-Desoxy-D-glucose, Mannose, Allose, 3-O-Methyl-D-glucose, Galactose, Xylose, Lactose und Maltose als Substrat verwendet wird.
Glucose-Test-Kit
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Glucose-Testkit bereit, der die erfindungsgemäße, modifizierte PQQGDH enthält. Der erfindungsgemäße Glucose- Testkit kann eine ausreichende Menge der modifizierten PQQGDH enthalten, um mindestens einen Test durchzuführen. Neben der modifizierten PQQGDH kann der Kit typischerweise für den Test erforderliche Puffer, einen Mediator, eine Glucosestandardlösung zur Erstellung einer Kalibrierungskurve und eine Gebrauchsanweisung umfassen. Die modifizierte PQQGDH kann in einer Vielzahl von Formen bereitgestellt werden, beispielsweise als gefriergetrocknetes Reagenz oder als geeignete Stammlösungen. Vorzugsweise kann die modifizierte PQQGDH der vorliegenden Erfindung nicht nur in Form eines Holoenzyms bereitgestellt werden, sondern kann auch in Form eines Apoenzyms bereitgestellt werden und vor dem Gebrauch in ein Holoenzym umgewandelt werden.
Glucosesensor
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Glucosesensor bereit, der die erfindungsgemäße, modifizierte PQQGDH enthält. Kohlenstoff, Gold oder Platin kann als Elektrode verwendet werden, und das Enzym der vorliegenden Erfindung wird auf der Elektrode immobilisiert. Die Immobilisierungsverfahren schließen beispielsweise Verfahren, die Vernetzungsreagenzien, den Einschluss in eine makromolekulare Matrix, Beschichten mit einer Dialysemembran verwenden, und Verfahren ein, die Photovernetzungspolymere, elektrisch leitende Polymere und Redoxpolymere verwenden. Das Enzym kann auch in einem Polymer immobilisiert oder auf der Elektrode zusammen mit einem Elektronenmediator wie Ferrocen oder dessen Derivat adsorbiert werden. Kombinationen des Vorstehenden können ebenfalls verwendet werden. Vorzugsweise wird die modifizierte PQQGDH der vorliegenden Erfindung auf einer Elektrode in Form eines Holoenzyms immobilisiert, kann aber auch in Form eines Apoenzyms immobilisiert werden, und PQQ wird als andere Schicht oder in Lösung bereitgestellt. Typischerweise wird die modifizierte PQQGDH der vorliegenden Erfindung auf einer Elektrode unter Verwendung von Glutaraldeyd immobilisiert, dann werden die freien funktionalen Glutaraldeyd-Einheiten durch Behandlung mit einem Reagenz mit Amingruppen blockiert.
Die Messung der Glucosekonzentration erfolgt, wie nachstehend beschrieben. Puffer, PQQ, CaCl₂ und ein Mediator werden in eine Zelle mit konstanter Temperatur gegeben und bei konstanter Temperatur gehalten. Kaliumferricyanid und Phenazinmethosulfat können als Mediator verwendet werden. Eine Elektrode, in der die modifizierte PQQGDH der vorliegenden Erfindung immobilisiert ist, wird als Arbeitselektrode zusammen mit einer Gegenelektrode (z. B. Platin) und einer Referenzelektrode (z. B. Ag/AgCl-Elektrode) verwendet. An die Kohlenstoffelektrode wird eine konstante Spannung angelegt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert erreicht, wird eine Glucose enthaltende Probe zugegeben und der Stromanstieg wird gemessen. Die Glucosekonzentration in der Probe kann unter Verwendung einer Kalibrierungskurve berechnet werden, die durch Glucoselösungen mit Standardkonzentrationen erstellt wird.
Die nachstehend beschriebenen Arbeitsbeispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne die vorliegende Erfindung zu begrenzen.
Beispiel 1
Konstruktion des Gens, das das modifizierte PQQGDH-Enzym codiert
Die Mutagenese erfolgte basierend auf dem Strukturgen der PQQGDH, die von Acinetobacter calcoaceticus stammt (SED ID NO: 2). Das pGB2-Plasmid wurde konstruiert, indem das Strukturgen der von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH in die Mehrfachclonierungsstelle des pTrc99A-Vektors (Pharmacia)(1) eingebaut wurde. Die PQQGDH codierende Wildtyp-Gensequenz wurde durch eine geänderte Gensequenz, die eine modifizierte PQQGDH codiert, durch Standardverfahren ersetzt, wie früher beschrieben. Die ortsspezifische Mutagenese erfolgte unter Verwendung des pGB2-Plasmids, wie in 2 dargestellt. Die Sequenzen der für die Mutagenese verwendeten, synthetischen Oligonucleotide sind nachstehend dargestellt. Um eine Mutante zu konstruieren, die zwei Mutationen enthält, wurden zwei Oligonucleotidprimer gleichzeitig für die Mutagenese verwendet.
Eine Matrize wurde hergestellt, indem das KpnI-HindIII-Fragment, das einen Teil des Gens enthält, das die von Acinetobacter calcoaceticus stammende PQQGDH codiert, in den pKF18k-Plasmidvektor (TaKaRa) eingebaut wurde. Es wurde ein Gemisch aus Matrize (50 fMol), Selektionsprimer (5 pMol), enthalten im Mutan-Express-Km-Kit, phosphoryliertem Zielprimer (50 pMol) und Anlagerungspuffer, enthalten im Kit (1/10 des Gesamtvolumens (20 μl)) hergestellt, und die Plasmid-DNA wurde zu einem Einzelstrang denaturiert, indem 3 Minuten bei 100°C erhitzt wurde. Der Selektionsprimer wurde für die Reversion der Doppel-Amber-Mutation auf dem Kanamycin-Resistenzgen des pKF18k-Plasmids konstruiert. Die Plasmid-DNA wurde 5 Minuten zum Anlagern der Primer auf Eis gestellt. Ein Komplementärstrang wurde synthetisiert, indem die folgenden Reagenzien zugegeben wurden: 3 μl Extensionspuffer, enthalten im Kit, 1 μl T4-DNA-Ligase, 1 μl T4-DNA-Polymerase und 5 μl sterilisiertes Wasser. E.coli-BMH71-18mutS, ein Stamm, dem der Reparaturmechanismus für eine DNA-Fehlpaarung fehlt, wurde mit der synthetisierten DNA transformiert und über Nacht unter kräftigem Schütteln gezüchtet, um das Plasmid zu amplifizieren.
Dann wurde jedes Plasmid aus den Bakterien extrahiert und in E.coli-MV1184 transformiert, und das Plasmid wurde aus den Kolonien extrahiert. Die Sequenz des Plasmids wurde bestimmt, um die erfolgreiche Einführung der gewünschten Mutationen zu bestätigen. Das KpnI-HindIII-Genfragment, das die Wildtyp-PQQGDH auf dem pGB2-Plasmid codiert, wurde durch das Fragment ersetzt, das die Mutation enthält, um eine Reihe mutierter PQQGDH-Gene zu konstruieren.
Beispiel 2
Herstellung des modifizierten Enzyms
Ein Gen, das die Wildtyp- oder modifizierte PQQGDH codiert, wurde in die Mehrfachclonierungsstelle von pTrc99A (Pharmacia) eingebaut, und das konstruierte Plasmid wurde in E.coli DH5α transformiert. Die Transformanten wurden in 450 ml L-Brühe unter Verwendung eines Sakaguchi-Kolbens bei 37°C unter kräftigem Schütteln gezüchtet und dann in 71 L-Brühe, enthaltend 1 mM CaCl₂ und 500 μM PQQ angeimpft. Nach drei Stunden Züchtung wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,3 mM hinzugefügt, und die Züchtung erfolgte für weitere 1,5 Stunden. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert (5000xg, 10 min, 4°C) und das Pellet wurde zweimal mit 0,85% NaCl gewaschen. Die Zellen wurden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert, mit der French-Presse (110 MPa) aufgebrochen und zweimal zentrifugiert, um die Zelttrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde einer Ultrazentrifugation (40,000 UpM, 90 min, 4°C) unterzogen, und der Überstand wurde als wasserlösliche Fraktion gesammelt. Diese Fraktion wurde über Nacht bei 4°C gegen A-Puffer (10 mM MOPS-NaCl-Puffer (pH 7,0)) dialysiert, um eine Rohzubereitung zu erhalten.
Beispiel 3
Messung der Enzymaktivität
Die Enzymaktivität wurde in MOPS-NaOH-Puffer (pH 7,0), enthaltend PMS (Phenazinmethosulfat)-DCIP (2,6-Dichlorphenolindophenol) gemessen. Änderungen bei der Absorption von DCIP wurden mit einem Spektrometer bei 600 nm aufgezeichnet, und die Reduktionsrate der Absorption wurde als Reaktionsrate des Enzyms definiert. In dieser Messung wurde die Enzymaktivität, die 1 μMol DCIP in einer Minute reduzierte, als 1 Einheit betrachtet. Der molare Absorptionskoeffizient von DCIP bei einem pH-Wert von 7,0 betrug 16,3 mM^–1.
Beispiel 4
Bewertung der Substrathemmung

Jede Rohenzymzubereitung der Wildtyp-PQQGDH und der modifizierten PQQGDHs, die in Beispiel 3 erhalten wurden, wurden 1 Stunde oder mehr in ein Holoenzym in Gegenwart von 1 μM PQQ und 1 mM CaCl₂ auf dieselbe Weise umgewandelt, wie vorstehend beschrieben. Die Lösung wurde in Aliquots von jeweils 187 μl aufgeteilt und mit 3 μl Aktivierungsreagenzien (6 mM DCIPA 48 μl, 600 mM PMS 8 μl, 10 mM Phosphatpuffer pH 7,0 16 μl) und 10 μl D-Glucose mit verschiedenen Konzentrationen gemischt. Die Enzymaktivität wurde bei Raumtemperatur gemessen, wie vorstehend beschrieben. Die Enzymaktivität wurde gegen die Substratkonzentration aufgetragen und die Km-, Vmax- und Ksi-Werte wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Das SV-Diagramm für Tyr343Asp und das SV-Diagramm für Cys345Arg sind in 3 bzw. 4 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die erfindungsgemäße, modifizierte PQQGDH einen höheren Ksi-Wert als die Wildtyp-PQQGDH und eine signifikante Verringerung der Substrathemmung zeigt. Tabelle 1

	Km (mM)	Vmax (E/mg Protein)	Ksi (mM)	Ksi/Km
Wildtyp	23	154	196	8
Met341Phe	36	619	394	10
Met341Trp	38	89	458	12
Thr342Asn	32	300	500	15
Thr342Ile	39	87	228	6
Thr342Asp	35	196	556	16
Thr342Lys	23	300	202	9
Tyr343Asp	280	11	830	3
Ile344Asn	61	60	535	9
Cys345Arg	65	6	1402	22
Ala350Pro	n. b.	2	250	n. b.

Beispiel 5
Reinigung des Enzyms

Die in Beispiel 2 erhaltene Rohenzymzubereitung wurde in einer mit TSKgel CM-TOYOPEARL 650M (Toso Co.) gefüllten Kationenaustauschchromatographiesäule adsorbiert. Die Säule wurde mit 750 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, gewaschen, und das Enzym wurde mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend von 0 M bis 0,2 M NaCl, eluiert. Die Flussrate betrug 5 ml/min. Fraktionen, die GDH-Aktivität zeigten, wurden gesammelt und über Nacht gegen 10 mM MOPS-NaOH-Puffer (pH 7,0) dialysiert. Auf diese Weise wurde modifiziertes PQQGDH-Protein gereinigt, das bei der Elektrophorese eine einzelne Bande zeigte. Die Enzymaktivität und Substrathemmung des gereinigten Enzyms wurden in Gegenwart von 0,6 mM PMS gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die erfindungsgemäßen, modifizierten Enzyme Thr342Asn und Thr342Asp zeigten Enzymaktivität, die vergleichbar mit oder höher war als der Wildtyp, sowie einen höheren Ksi-Wert. Tabelle 2

	Km (mM)	Vmax (E/mg Protein)	kcat (sec^–1)	kcat/Km (mM^–1 sec^–1)	Ksi (mM)	Ksi/Km
Wildtyp	27	8899	7451	276	250	9
Thr342Asn	14	10158	8505	608	522	37
Thr342Asp	28	5166	4283	153	332	12

Beispiel 6
Konstruktion des Enzyms mit Doppelmutationen
Ein Enzym mit den Doppelmutationen Asp143Glu/Thr342Asn wurde konstruiert, und seine Merkmale wurden untersucht. Von dem modifizierten Enzym mit der Asp143G1u-Mutation ist bekannt, dass es eine höhere Substratspezifität für Glucose besitzt. Die Substrathemmung des Enzyms mit Doppelmutationen wurde auf dieselbe Weise wie Beispiel 5 bestimmt und die Ergebnisse waren wie folgt: Ksi = 600 mM, Km = 26 mM und Ksi/Km = 23. Diese Werte waren äquivalent zu denjenigen des erfindungsgemäßen, modifizierten Enzyms, wie in Beispiel 5 angegeben, und waren höher als diejenigen des Wildtyp-Enzyms.
Dann wurde die Substratspezifität dieses Enzyms untersucht. Die Rohenzymzubereitungen der Wildtyp- und der in Beispiel 2 erhaltenen modifizierten PQQGDH wurden 1 Stunde oder mehr in Gegenwart von 1 μM PQQ, 1 mM CaCl₂ in ein Holoenzym umgewandelt. Diese Lösung wurde in Aliquots von 187 μl aufgeteilt und mit 3 μl Aktivierungsreagenz, enthaltend einen Elektronenakzeptor (6 mM DCIP, 600 mM PMS, 10 mM Phosphatpuffer pH 7,0), gemischt und das Substrat wurde zugegeben (Endkonzentration: 0,06 mM DCIP, 0,6 mM PMS). Zehn μl Glucose, Lactose oder Maltose wurden als Substrat zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben, und die Proben wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Enzymaktivität wurde auf dieselbe Weise gemessen wie Beispiel 3. Die Werte wurden als relative Aktivität zur Aktivität für Glucose (100) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Das modifizierte Enzym mit den Doppelmutationen Thr342Asn und Asp143Glu zeigte eine höhere Substratspezifität für Glucose als entweder das Wildtyp- oder das modifizierte Enzym mit einer Einzelmutation Asp143Glu.
Außerdem besitzt das modifizierte Enzym mit einer Einzelmutation Thr342Asn einen zu demjenigen des Wildtypenzyms äquivalenten Grad an Substratspezifität (Daten nicht gezeigt). Tabelle 3

Glucose Lactose Maltose

Wildtyp 100% 54% 58%

Asp143Glu 100% 32% 10%

Asp143Glu/Thr342Asn 100% 20%
Außerdem wurde die Enzymaktivität dieser Doppelmutante in Gegenwart von 0,06 mM DCIP als Elektronenakzeptor und 10 mM Glucose als Substrat auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 gemessen. Das modifizierte Enzym mit den Doppelmutationen Thr342Asn und Asp143Glu zeigte eine höhere Enzymaktivität als das Wildtyp-Enzym. Tabelle 4

Wildtyp 100%

Thr342Asn 126%

Asp143Glu 54%

Asp143Glu/Thr342Asn 291%
Beispiel 7
Herstellung des Enzymsensors und dessen Bewertung
20 mg Kohlenstoffpaste wurden zu 5 Einheiten des modifizierten Enzyms zugegeben und gefriergetrocknet. Das Gemisch wurde auf die Oberfläche einer mit etwa 40 mg Kohlenstoffpaste gefüllten Kohlenstoffpastenelektrode aufgetragen, und die Elektrode wurde auf einem Filterpapier poliert. Diese Elektrode wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur mit MOPS-Puffer (pH 7,0), enthaltend 1% Glutaraldehyd, behandelt und dann 20 Minuten bei Raumtemperatur mit MOPS-Puffer (pH 7,0), enthaltend 20 mM Lysin, behandelt, um Glutaraldeyd zu blockieren, das nicht reagiert hat. Die Elektrode wurde eine Stunde oder mehr bei Raumtemperatur in 10 mM MOPS-Puffer (pH 7,0) äquilibriert, dann bei 4°C gelagert.
Die Glucosekonzentration wurde unter Verwendung des so hergestellten Glucosesensors gemessen. Die Glucosekonzentration wurde im Bereich von 5 mM bis 50 mM unter Verwendung des mit der erfindungsgemäßen, modifizierten PQQGDH hergestellten Glucosesensors quantifiziert.
Industrielle Anwendbarkeit
Die modifizierte, wasserlösliche PQQGDH der vorliegenden Erfindung kann aufgrund ihrer niedrigen Substrathemmung für die Glucosemessung in Gegenwart hoher Glucosekonzentrationen genutzt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Modifizierte Glucosedehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, in der (a) Met341 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und die einen Ksi-Wert von 200 mM oder mehr hat; (b) Met341 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Tryptophan oder Phenylalanin ersetzt ist; (c) Thr342 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und die einen Ksi-Wert von 200 mM oder mehr hat; (d) Thr342 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Asparaginsäure, Lysin, Isoleucin oder Asparagin ersetzt ist; (e) Tyr343 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und die einen Ksi-Wert von 200 mM oder mehr hat; (f) Tyr343 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Asparaginsäure ersetzt ist; (g) Ile344 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und die einen Ksi-Wert von 200 mM oder mehr hat; (h) Ile344 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Asparagin ersetzt ist; (i) Cys345 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und die einen Ksi-Wert von 200 mM oder mehr hat; (j) Cys345 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Arginin ersetzt ist; (k) Ala350 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und die einen Ksi-Wert von 200 mM oder mehr hat; (l) Ala350 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Prolin ersetzt ist; (m) ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Met341, Thr342, Tyr343, Ile344, Cys345 und Ala350 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und in der Asp143 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist; (n) ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Met341, Thr342, Tyr343, Ile344, Cys345 und Ala350 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist und in der Asp143 durch Glutaminsäure ersetzt ist; oder (o) Thr342 der in SEQ ID NO: 1 definierten Aminosäuresequenz durch Asparaginsäure, Lysin, Isoleucin oder Asparagin ersetzt ist, und in der Asp143 durch Glutaminsäure ersetzt ist.
Glucosedehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym umfassend die folgende Aminosäuresequenz: (a) Cys Gly Glu Xaa Thr Tyr Ile wobei Xaa Phe oder Trp ist; (b) Gly Glu Met Xaa Tyr Ile Cys wobei Xaa Asp, Lys, Ile oder Asn ist; (c) Glu Met Thr Asp Ile Cys Trp; (d) Met Thr Tyr Asp Cys Trp Pro; (e) Thr Tyr Ile Arg Trp Pro Thr; oder (f) Pro Thr Val Pro Pro Ser Ser.
Gen, das eine in Anspruch 1 oder 2 beanspruchte modifizierte Glucosedehydrogenase codiert.
Vektor, der das in Anspruch 3 beanspruchte Gen enthält.
Transformante, die das in Anspruch 3 beanspruchte Gen enthält.
Transformante wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei das in Anspruch 3 beanspruchte Gen in ihrem Chromosom integriert ist.
Verfahren zur Herstellung einer wasserlöslichen PQQGDH, umfassend das Züchten der Transformante wie in Anspruch 6 beansprucht und das Herstellen der wasserlöslichen Fraktion aus den Zellen der Transformante.
Glucose-Assay-Kit umfassend die modifizierte Glucosedehydrogenase wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht.
Glucosesensor umfassend die modifizierte Glucosedehydrogenase wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht.