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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind PQQ-abhängige Glukosedehydrogenasen
(sPQQGDH), Verfahren zur ihrer Herstellung und Identifikation, Gene,
welche die erfindungsgemäßen sPQQGDH kodieren, Vektoren
zur Herstellung der Gene, sowie Glukosesensoren umfassend eine erfindungsgemäße
Glukosedehydrogenase.
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Die
enzymatische Bestimmung von Glukose hat in der medizinischen Diagnostik
eine große Bedeutung. Hier ist der Nachweis von Glukose
im Harn oder im Blut zur Feststellung bzw. Verlaufskontrolle von
Stoffwechselerkrankungen notwendig. Bei Diabetes mellitus, der Zuckerkrankheit,
ist es unter Umständen erforderlich, die Blutzuckerkonzentration
mehrmals täglich zu bestimmen. Dies erfolgt bei der überwiegenden
Zahl der auf dem Markt befindlichen Messgeräte mit einem
enzymatischen Verfahren, bei dem Glukose oxidiert wird und der dabei
entstehende Wasserstoff (2H+ und 2e–) amperometrisch quantifiziert
wird (P. Vadgama, J. Med. Eng Technol. 5 [6], 293–298
(1981), K. S. Chua und I. K. Tan, Clin. Chem. 24 [1], 150–152
(1978)).
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Es
gibt einige unterschiedliche Enzyme, die für diesen Zweck
geeignet sind, die aber mit verschiedenen Kofaktoren zur primären
Aufnahme der Elektronen arbeiten und auch unterschiedliche biochemische
Eigenschaften aufweisen wie Spezifität, Stabilität
oder Umsatzrate. Die Umsatzrate eines Enzyms wird üblicherweise
in Aktivitätseinheiten (U) angegeben; bei Glukose-oxidierenden
Enzymen bezeichnet die spezifische Aktivität (U/mg) üblicherweise
die Menge an Glukose in Mikromol, die von einem Milligramm Enzym
pro Minute unter festgelegten Reaktionsbedingungen oxidiert wird.
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Häufig
verwendete Enzyme sind Glukosedehydrogenasen (GDH). Im Fall der
NAD(P)+-abhängigen GDH ist der
Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+)
oder Nicotinamidadenin-dinukleotidphosphat (NADP+)
(H. E. Pauly und G. Pfleiderer, Hoppe Seglers. Z. Physiol
Chem. 356 [10], 1613–1623 (1975)), beides recht
instabile Verbindungen, die der Reaktion zugesetzt werden müssen,
da sie nicht an das Enzym gebunden sind.
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Eine
weitere Klasse von Glukosedehydrogenasen enthält als Elektronenakzeptor
im Enzym gebundenes Pyrrolochinolinchinon (PQQ). Es wurden zwei
strukturell voneinander verschiedene Glukosedehydrogenasen dieses
Typs beschrieben, eine Membran-verankerte Form mPQQGDH (A.
M Cleton-Jansen et al., J. Bacteriol. 170 [5], 2121–2125
(1988)) und eine kleinere, lösliche Form sPQQGDH
(A. M Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 [2–3],
430–436 (1989)). Letztere ist aufgrund ihrer hohen
spez. Aktivität, ihrer Unempfindlichkeit gegenüber
Sauerstoff und des fest gebundenen, stabilen Kofaktors ein Enzym,
was zur Herstellung von Testsystemen zur Glukosebestimmung besonders
geeignet ist. In etlichen kommerziellen Blutzuckermessgeräten
kommt daher dieses Enzym zum Einsatz, ungeachtet einer geringeren
Substratspezifität, die dieses Enzym im Vergleich zu den
anderen genannten Enzymen aufweist. Aufgrund der letztgenannten
Einschränkung wäre es natürlich wünschenswert,
Varianten dieses Enzyms zur Verfügung zu haben, die eine
höhere Substratspezifität besitzen.
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Außer
dem Substrat Glukose setzt die sPQQGDH auch andere Zucker zum entsprechenden
Lakton um, vorzugsweise Disaccharide, deren reduzierender Zucker
die Glukose ist, aber auch andere reduzierende Zucker. Da solche
Zucker im menschlichen Blut normalerweise nicht vorkommen, liefert
ein Enzymtest auf Basis der sPQQGDH in der Regel ein der Glukosekonzentration
entsprechendes Ergebnis. Im Rahmen bestimmter medizinischer Therapien
werden aber Stoffe verabreicht, zu deren Abbauprodukten Maltose
gehört, die von der sPQQGDH oxidiert wird und damit unerwünschterweise
zum Messergebnis beiträgt (T. G. Schleis, Pharmacotherapy
27 [9], 1313–1321 (2007)). Bei der Gabe von Xylose
und Galaktose bei diagnostischen Verfahren oder als Zuschlagstoff
zu Medikamenten werden diese Zucker selbst miterfasst. Es ist daher
sinnvoll, diese Nebenaktivitäten der sPQQGDH auf geeignete
Weise zu unterdrücken.
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In
der Literatur und auch in Patentschriften sind einige Versuche beschrieben,
die Substratspezifität der sPQQGDH durch Einführung
von Mutationen zu verbessern (
S. Igarashi et al., Biomol.
Eng 21 [2], 81–89 (2004)). Dazu wurden einzelne
Aminosäuren im Bereich des katalytischen Zentrums (
EP 1666586 A1 )
aber auch an anderen Stellen des Enzyms (
US 7132270 B2 ) durch gezielte
Mutagenese gegen andere Aminosäuren ausgetauscht oder einzelne
Aminosäuren durch Insertion hinzugefügt (
EP 1367120 A2 ).
Es werden darüber hinaus Kombinationen verschiedener Mutationen
beschrieben (
EP 1666586
A1 ,
US 7132270
B2 ).
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Trotz
dieser Ergebnisse besteht weiterhin Bedarf für Varianten
der sPQQGDH, da bislang noch keine Varianten beschrieben wurden,
die bei ausreichend hoher Reaktivität mit Glukose eine
genügende Diskriminierung zwischen Glukose und anderen
Zuckern erlauben. Wichtig ist hierbei insbesondere die Fähigkeit
des Enzyms, auch beim Vorliegen einer Mischung aus Glukose und anderen
Zuckern die Glukosekonzentration zuverlässig bestimmbar
zu machen. Keine der beschriebenen Varianten zeigt diese Eigenschaft
in ausreichendem Maß.
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Ausgehend
vom Stand der Technik stellt sich damit die Aufgabe, Glukosedehydrogenasen
bereitzustellen, die eine zuverlässige Bestimmung von Glukose
auch beim Vorliegen einer Mischung aus Glukose und anderen Zuckern
ermöglichen. Es stellt sich insbesondere die Aufgabe, Glukosedehydrogenasen
bereitzustellen, mit denen Glukose in Gegenwart von Maltose zuverlässig bestimmt
werden kann. Ferner stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen,
mit dem solche Glukosedehydrogenasen hergestellt und identifiziert werden
können, die besonders zur Glukosebestimmung in Gegenwart
von anderen Zuckern, insbesondere in Gegenwart von Maltose geeignet
sind.
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Überraschend
wurde gefunden, dass sPQQ-Glukosedehydrogenasen, bei denen im Bereich
der Substratbinderegion zwei bis fünf Aminosäuren
insertiert sind, eine gegenüber der Ausgangsform des Enzyms
verbesserte Glukosespezifität aufweisen.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher sPQQ-Glukosedehydrogenasen
mit einer gegenüber der Ausgangsform des Enzyms verbesserten
Glukosespezifität, dadurch gekennzeichnet, dass in dem
Bereich der Substratbinderegion zwei bis fünf Aminosäuren
insertiert sind.
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Die
erfindungsgemäßen sPQQGDH können über
Gene kodiert werden, die durch Mutagenese aus in der Natur vorkommenden,
beschriebenen Wildtypstämmen wie Acinetobacter calcoaceticus
LMD 79.41 (
K. Kojima K. et al., Biotechnology Letters 22,
1343–1347 (2000)) sowie weiteren Stämmen
der Gattung Acinetobacier (
P. J. Bouvet P. J. und O. M.
Bouvet, Res. Microbiol. 140 [8], 531–540 (1989)),
insbesondere solchen, die sich durch erhöhte Thermostabilität
auszeichnen wie die in
EP
1623025 A1 beschriebenen Acinetobacter sp. Stämme,
gewonnen werden. Bevorzugte Stämme sind die in
EP 1623025 A1 beschriebenen
Acinetobacter sp. Stämme PT16, KOZ62, KOZ65, PTN69, KG106,
PTN26, PT15, KGN80, KG140, KGN34, KGN25 und KGN100; besonders bevorzugt
ist der Stamm KOZ65.
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Um
die erfindungsgemäßen sPQQGDH gewinnen zu können,
muss in einem solchermaßen geeigneten sPQQGDH-Gen eine
Insertion von Codons an der der Substratbindestelle entsprechenden
Position erfolgen. Die räumliche Struktur einiger sPQQGDH
ist bekannt und in öffentlichen Datenbanken hinterlegt
(A. Oubrie et al., J. Mol. Biol. 289 [2], 319–333
(1999); A. Oubrie et al., EMBO J. 18 [19], 5187–5194 (1999)).
Somit kann die Entfernung einzelner Aminosäurepositionen
zum gebundenen Substrat abgeschätzt werden. Solche Abschätzungen
sind beispielsweise mit Visualierungsprogrammen für Proteine
wie dem Software-Programm Cn3D möglich, das im Internet
verfügbar ist (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml).
Die Sequenz der veröffentlichten Röntgenstruktur
basiert auf der sPQQGDH aus Acinelobacier calcoaceticus, die 455
Aminosäuren lang ist. Die Ausgangsform der besonders bevorzugten
sPQQGDH aus dem Stamm KOZ65 besitzt 456 Aminosäuren, wie
auch das Enzym aus Acinetobacter baumannii. Dafür ist in
beiden Fällen ein zusätzlicher Glutaminrest hinter
der Position 289 verantwortlich. Im Folgenden beziehen sich Angaben
zur Position von einzelnen Aminosäuren aber dennoch auf
die kürzere, in der Röntgenstruktur verwendete
Sequenz der sPQQGDH aus dem Stamm Acinetobacter calcoaceticus LMD
79.41. Die dort befindliche Aminosäure wird vor der Position
im Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren angegeben.
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Für
eine Mutagenese bevorzugt sind Aminosäurebereiche, deren
Abstände zum Substrat nicht mehr als 5 Ǻngstrom
betragen, wie z. B. die Positionen Q76, D143, Q168, Y343 und die
jeweils benachbarten Aminosäurereste. So kann beispielsweise
vor oder nach einer der angegebenen Positionen eine Insertion von zwei
oder mehr Aminosäuren vorgenommen werden, um die räumliche
Beschaffenheit der Substratbindestelle zu verändern. Besonders
bevorzugt ist eine Insertion zusätzlicher Aminosäuren
zwischen den Positionen Q168 und L169. Varianten von KOZ65 mit Insertionen
an dieser Stelle zeigten überraschenderweise zu einem großen
Anteil deutlich verringerte Aktivität auf Maltose im Vergleich
zu Glukose. Besonders bevorzugt sind sPQQGDH mit den in der Tabelle
1 aufgeführten Insertionssequenzen zwischen den Positionen
Q168 und L169. Zum Vergleich ist in der ersten Zeile der Wildtyp
angegeben. Die erfindungsgemäßen sPQQGDH zeichnen
sich wie in der Tabelle 1 dargestellt durch eine erhöhte
Substratspezifität (geringeres Verhältnis Maltose/Glukose
und geringerer Betrag der Interferenz von Glukose in einer Glukose/Maltose-Mischung)
aus. Tabelle 1:
| Klon | Sequenz
der Insertion | SEQ
ID | spez.
Aktivität auf Glukose [U/mg] | Verhältnis
der Aktivitäten Maltose/Glukose bei 30 mM | Interferenz
(5 mM Glukose/5 mM Maltose) |
| Referenz:
wt-GDH KOZ65 | | | 3000 | 90.0 | 63 |
| 5145-17-E10 | AYQ | 1 | 240 | 7.4 | –5,8 |
| 5145-20-E7 | AWL | 2 | 131 | 10.5 | –4 |
| 5146-08-E9 | AFV | 3 | 236 | 6.5 | –4.7 |
| 5146-10-E4 | GYI | 4 | 351 | 5.9 | –9.9 |
| 5181-09-G12 | AYV | 5 | 738 | 5.4 | –10.8 |
| 5181-13-A12 | AFQ | 6 | 188 | 13.7 | –15.7 |
| 5138-11-A2 | AGRM | 7 | 101 | 9.5 | 15,5 |
| 5152-21-E1 | GLAV | 8 | 166 | 11.7 | –20.7 |
| 5152-20-A7 | MGRFL | 9 | 530 | 7.95 | 5.6 |
| 5381-05-C4 | VSTFF | 10 | 264 | 9.5 | 1.2 |
| 5381-06-C12 | VSKNH | 11 | 229 | 10 | 3.8 |
| 5381-07-F10 | SSRNH | 12 | 203 | 9.5 | 4.2 |
| 5381-09-A11 | SGRIL | 13 | 411 | 6.6 | 5.3 |
| 5386-08-D10 | VGRLT | 14 | 272 | 6.4 | 5.7 |
| 5386-13-F10 | AERNY | 15 | 110 | 7.6 | 0.2 |
| 5386-19-B9 | MESHN | 16 | 111 | 8.2 | 7.8 |
| 5388-15-G8 | VGHVT | 17 | 296 | 6.2 | 3.8 |
| 5388-19-F3 | VGRYQ | 18 | 188 | 7.3 | 4.8 |
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung
und Identifikation von sPQQGDH, die gegenüber dem Wildtyp
erhöhte Substratspezifität zeigen. Das erfindungsgemäße
Verfahren erlaubt mittels lokaler Zufallsmutagenese die Erzeugung
einer Vielzahl von Varianten, mit zwei, drei, vier, fünf oder
mehr insertierten Aminosäuren an einer gewünschten
Stelle der sPQQGDH-Sequenz. Die erzeugten Enzyme werden einem Screening
hinsichtlich der Substratspezifität unterzogen und die
besten Varianten ausgewählt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass in einem ersten Schritt ein Vektor hergestellt wird, bei dem
ein geeigneter Sequenzbereich vor und hinter der gewünschten
Insertionsstelle deletiert wurde und durch eine für diesen
Vektor singuläre Restriktionsschnittstelle ersetzt wurde.
In Vektor-DNA, die mit diesem Restriktionsenzym geöffnet
wird, werden in einem zweiten Schritt doppelsträngige,
mittels PCR-Amplifikation hergestellte Oligonukleotidsequenzen insertiert,
welche außer der im Vektor deletierten Sequenz die gewünschte
Insertion enthalten, sodass ein Genprodukt entsteht, welches hinsichtlich
seiner Aminosäuresequenz keine weiteren Veränderungen
als die Insertion von zwei oder mehr Aminosäuren an der
gewünschten Stelle enthält. Das mittels PCR aus
synthetischen Oligonukleotiden hergestellte, zu insertierende Doppelstrangfragment
enthält dabei die zwei oder mehr zusätzlichen,
randomisierten Codons zur Veränderung der Substratspezifität,
aber auch die Codons, die in dem Vektor deletiert wurden. Es wurden
dazu die Codons ausgewählt, die sich in E. coli besonders
gut exprimieren lassen. Die Nukleotidsequenz weicht daher neben dem
Insertionsbereich von der des sPQQGDH-Gens aus KOZ65 ab, nicht aber
die Aminosäuresequenz.
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Bei
der Insertion von zwei zusätzlichen Aminosäuren
sind 400 Enzymvarianten denkbar, bei drei zusätzlichen
Aminosäuren sind es 8000 und bei fünf zusätzlichen
Aminosäuren sind es 3,2 Millionen Varianten. Bei der Synthese
der mutagenen Oligonukleotide können daher neben völlig
randomisierten Sequenzen solche verwendet werden, die an einigen
oder allen Positionen degenerierte Codons für die jeweils
zu insertierenden Aminosäuren enthalten. Das kann dazu
genutzt werden, um die Zahl der Möglichkeiten insgesamt
zu reduzieren, um Stop-Codons zu vermeiden oder um einzelne Aminosäuren
an bestimmten Positionen zu bevorzugen.
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In
einem dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden rekombinante Vektoren, die auf die oben beschriebene Weise
hergestellt wurden, in geeignete Wirtsbakterien transformiert und
die Wirtsbakterien in einem geeigneten Nährmedium vermehrt.
Die Methoden zur Klonierung von Genen aus Mikroorganismen und ihrer
Ausprägung in einem anderen Wirt sowie die Techniken zur
Isolierung und Veränderung von Nukleinsäuren sind
dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Molecular Cloning – A
Laboratory Manual; Vol. 1; Sambrook, J. und Russel, D. W., 3. Auflage,
CSHL Press 2001). Ebenso sind die Anzucht von Mikroorganismen
und die Aufreinigung von rekombinanten Enzymen daraus Stand der
Technik (siehe ebenda; Vol. 3).
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In
einem vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden die Bakterienkolonien hinsichtlich ihrer Aktivität
gegenüber verschiedenen Zuckern getestet und dabei die
besten identifiziert. Erfindungsgemäß erfolgt
hierbei nicht nur ein Test hinsichtlich der Aktivität gegenüber
den einzelnen Zuckern sondern auch hinsichtlich der Interferenz
von verschiedenen Zuckern.
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Die
Aktivitäten können als spezifische Aktivitäten,
d. h. Umsatzraten, die von einer definierten Menge an Enzym pro
Zeiteinheit umgesetzt werden, bestimmt werden. Bei Glukose-oxidierenden
Enzymen bezeichnet die spezifische Aktivität (U/mg) üblicherweise
die Menge an Glukose in Mikromol, die von einem Milligramm Enzym
pro Minute unter festgelegten Reaktionsbedingungen oxidiert wird.
Dabei liegt Glukose in der Regel im Überschuss gegenüber
dem Enzym vor, um den Einfluss der Glukosekonzentration auf die
Reaktionsgeschwindigkeit zu eliminieren. Die Ermittlung der Umsatzrate
geschieht durch zeitliche Verfolgung des Abbaus eines Edukts oder
der Bildung eines Produkts. Die zeitliche Verfolgung kann z. B.
photometrisch erfolgen. Zur Ermittlung von Reaktionsgeschwindigkeiten
und Umsatzraten sei auf Lehrbücher der Physikalischen Chemie (z.
B. Peter Atkins, Physical Chemistry, W. H. Freeman & Co; 7. Auflage,
2002) verwiesen.
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Zunächst
werden die einzelnen Kolonien geteilt und ein Enzymtest (Ermittlung
der spezifischen Aktivität) mit Glukose als Substrat und
ein zweiter Enzymtest mit einem zweiten Zucker, z. B. Maltose als
Substrat durchgeführt. Bei den Kolonien mit den höchsten
Aktivitäten gegenüber Glukose bei gleichzeitig
geringsten Aktivitäten gegenüber dem zweiten Zucker
(z. B. Maltose) wird auch die Aktivität gegenüber
einer Mischung von Glukose und dem zweiten Zucker (z. B. Maltose)
bestimmt. Es stellte sich nämlich bei der Untersuchung
einiger Varianten mit sehr geringer relativer Reaktivität
auf Maltose als einzigem Substrat überraschenderweise heraus,
dass diese Eigenschaft einer Variante nicht zwingend mit einer unabhängigen
Eigenschaft, nämlich der verlässlichen Diskriminierung
von Glukose und Maltose einhergeht, wenn beide Zucker als Mischung
vorliegen. Dabei kann es sowohl zur Überschätzung
als auch zur Unterschätzung der in dieser Mischung vorhandenen
Glukosekonzentration kommen. Bei der Suche nach Enzymen, die zur
Bestimmung von Glukosekonzentrationen in Messproben eingesetzt werden
sollen, ist daher eine hohe Glukosespezifität auf Mischungen von
Glukose und anderen Zuckern von entscheidender Bedeutung, oder anders
formuliert, eine möglichst geringe Interferenz des betreffenden
Zuckers. Die Interferenz eines Zuckers berechnet sich aus der Enzymaktivität,
die auf einer Mischung von Glukose und interferierendem Zucker gemessen
wird, abzüglich der Aktivität, die auf der gleichen
Konzentration Glukose allein gemessen wird, normalisiert auf diese
Glukoseaktivität (siehe Gl. 1).
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In
Gleichung 1 bedeutet I die Interferenz von Glukose mit einem anderen
Zucker, VReferenz die Geschwindigkeit, mit
welcher Glukose durch das betrachtete Enzym abgebaut wird und VMischung die Geschwindigkeit, mit welcher
Glukose in einer Mischung mit dem jeweiligen anderen Zucker abgebaut
wird. Die Geschwindigkeiten können z. B. photometrisch
bestimmt werden (siehe hierzu Beispiele 3, 4, 7 und 9).
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Positive
Werte bedeuten in diesem Zusammenhang, dass die Enzymaktivität
auf einer Mischung höher ist als auf Glukose allein; also
offenbar beide Zucker oxidiert werden. Negative Werte können
dahingehend interpretiert werden, dass der interferierende Zucker
zwar auch oxidiert wird, aber die Aktivität des Enzyms
für Glukose dadurch herabgesetzt wird. Beide Effekte sind
für ein Enzym, das zur spezifischen Quantifizierung von
Glukose verwendet werden soll, unerwünscht.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Varianten
der sPQQGDH herstellen und identifizieren, deren Substratspezifität
gegenüber der Ausgangsform des Enzyms verändert
ist. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt
sich auch dahingehend modifizieren und/oder erweitern, dass anstelle
der Substratspezifität oder zusätzlich dazu andere
biochemische Eigenschaften wie z. B. Thermostabilität getestet
und damit gegenüber der Ausgangform verbesserte Varianten
hinsichtlich der anderen biochemischen Eigenschaften identifiziert
werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht
so, Varianten der sPQQGDH mit besonders vorteilhaften Eigenschaften
auszuwählen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind zudem Gene, welche die erfindungsgemäßen sPQQGDH
kodieren, und Vektoren zur Erzeugung der Gene.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Glukose-Sensor umfassend
eine erfindungsgemäße sPQQGDH zur Bestimmung von
Glukose. Der Aufbau und die Funktionsweise von Glukose-Sensoren auf
Basis von Glukose-Dehydrogenasen sind dem Fachmann aus dem Stand
der Technik bekannt (siehe z. B.
EP 1146332 A1 ). Danach umfasst ein solcher
Glukose-Sensor ein Elektrodensystem aus einer Arbeitselektrode,
einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode auf einer isolierenden
Platte, auf das eine enzymatische Reaktionsschicht aufgebracht ist,
die eine Glukose-Dehydrogenase und einen Elektronenakzeptor in Kontakt
mit dem Elektrodensystem beinhaltet.
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Geeignete
Arbeitselektroden schließen Kohle, Gold, Platin und ähnliche
Elektroden ein, auf denen ein erfindungsgemäßes
Enzym mittels quervernetzendem Agens immobilisiert wird: Einbettung
in eine Polymermatrix, Ummanteln mit einer Dialysemembran, Verwendung
eines photovernetzbaren Polymers, eines elektrisch leitfähigen
Polymers oder eines Redoxpolymerisats, Fixieren des Enzyms in einem
Polymer oder Adsorbieren auf der Elektrode mit einem Elektronenvermittler
einschließlich Ferrocen oder dessen Abkömmlinge oder
eine beliebige Kombination davon. Erfindungsgemäße
sPQQGDH werden vorzugsweise in Form eines Holoenzyms auf der Elektrode
immobilisiert, obwohl sie auch als Apoenzym immobilisiert werden
können und PQQ als eine separate Schicht oder in einer
Lösung bereitgestellt wird. Üblicherweise werden
erfindungsgemäße sPQQGDH auf einer Kohleelektrode
mit Glutaraldehyd immobilisiert und dann mit einem aminhaltigen Reagens
behandelt, um das Glutaraldehyd zu blockieren. Als Gegenelektrode
kann z. B. eine Platinelektrode und als Referenzelektrode z. B.
eine Ag/AgCl-Elektrode verwendet werden.
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Die
Glukosemenge können folgendermaßen gemessen werden:
PQQ, CaCl2 und ein Mediator werden in eine
Thermostatzelle, die einen Puffer enthält, gegeben und
bei einer konstanten Temperatur belassen. Geeignete Mediatoren schließen
zum Beispiel Kaliumferricyanid und Phenazinmethasulfat ein. Eine
Elektrode, auf der eine erfindungsgemäße sPQQGDH
immobilisiert worden ist, wird als Arbeitselektrode in Kombination mit
einer Gegenelektrode (z. B. eine Platinelektrode) und einer Referenzelektrode
(z. B. Ag/AgCl-Elektrode) verwendet. Nachdem zum Aufbau eines stationären
Stroms an die Arbeitselektrode eine konstante Spannung angelegt
worden ist, wird eine glukosehaltige Probe zugegeben, um das Ansteigen
der Stromstärke zu messen. Die Glukosemenge der Probe kann
von einer Eichkurve, die mit Glukoselösungen in Standardkonzentrationen
erstellt wurde, abgelesen werden.
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher
ausgeführt ohne sie jedoch auf die Beispiele zu beschränken.
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Beispiele
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Die
in den folgenden Beispielen aufgeführten Chemikalien sind
käuflich erhältlich, z. B. bei der Fa. Sigma-Aldrich,
bzw. bei den jeweils angegebenen Firmen.
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Beispiel 1: Herstellung eines Vektors
zur Insertion von zusätzlichen Aminosäuren zwischen
Q168 und L169
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Für
die Herstellung von erfindungsgemäßen Varianten
muss ein Gen für eine sPQQGDH in einem Expressionsplasmid
zur Verfügung stehen, das in Mikroorganismen vermehrt werden
kann, die induzierte Ausprägung der sPQQGDH gestattet und
das zur Durchführung der gewünschten Mutationen
verwendet werden kann. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Plasmiden
und Mikroorganismen bekannt, die für diesen Zweck eingesetzt
werden können. In diesem und allen weiteren Beispielen
wurde ein Konstrukt auf der Basis des kommerziell erhältlichen
Vektors pASK-IBA3 (IBA GmbH, Göttingen) verwendet. In pASK-IBA3
wurde das sPQQGDH-Gen aus dem Stamm Acinetobacter sp. KOZ65 in folgender
Weise kloniert. Aus genomischer DNA von Acinetobacter sp. KOZ65
wurde mit den beiden Oligonukleotiden GDH-U3 (5'-TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGC
TAAAATTAC-3'; SEQ ID 19) und GDH-L5 (5'-TTCAGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATC-3';
SEQ ID 20), mit Hilfe einer PCR-Reaktion (Phusion DNA Polymerase,
Finnzymes Oy) nach den Angaben des Herstellers ein 1,46 kb langes
DNA-Fragment generiert. Das Fragment wurde gereinigt und anschließend
mit dem Restriktionsenzym BsaI inkubiert. Der Vektor pASK-IBA3 wurde
mit dem Restriktionsenzym HindIII geöffnet. Das Restriktionsenzym
wurde durch Hitzebehandlung denaturiert und die entstandenen DNA-Überhänge
wurden mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von dATP, dCTP, dGTP und
dTTP aufgefüllt. Anschließend wurde die DNA gereinigt
und mit dem Restriktionsenzym BsaI inkubiert. Das so freigesetzte,
114 bp lange Fragment wurde verworfen; in das 3,1 kb große
Vektorfragment wurde das PCR-Amplifikat mit dem sPQQGDH-Gen aus
KOZ65 ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in transformations-kompetente Zellen
des E. coli Stamms DH5α transformiert. Der auf diese Weise
hergestellte Vektor pAI3B-KOZ65 ist zur induzierbaren Expression
von sPQQGDH des Typs KOZ65 geeignet. Die Nukleotidsequenz des Vektors pAI3B-KOZ65
ist unter SEQ ID 21 angegeben, die Aminosäuresequenz des
davon kodierten sPQQGDH unter SEQ ID 22.
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Um
zwei oder mehr Aminosäuren zwischen Q168 und L169 einfügen
zu können wurde zunächst der Vektor pAI3B-KOZ65-U
hergestellt. Dazu wurde Plasmid-DNA des Vektors pAI3B-KOZ65 als
Matrize für eine PCR-Amplifikation A mit den Primern IBA-For
(5'-TAGAGTTATTTTACCACTCCCT-3'; SEQ ID 23) und Eco109-Up (5'-GGTTAGGTCCCTGATCACCAATCG-3';
SEQ ID 24) sowie eine PCR-Amplifikation B mit den Primern BfuA-US1
(5'-CACAGGTACACCTGCCGCCACT-3'; SEQ ID 25) und Eco109-Down (5'-TACGAGGACCCAACAGGAACTGAGC-3';
SEQ ID 26) verwendet. Das aus A entstandene Amplifikat wurde gereinigt und
mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoO109I geschnitten. Das dabei
entstehende, 588 Basenpaare (bp) große Fragment wurde isoliert.
Das aus B entstandene Amplifikat wurde gereinigt und mit den Restriktionsenzymen
BfuAI und EcoO109I geschnitten. Das dabei entstehende, 353 bp große
Fragment wurde ebenfalls isoliert. Der Vektor pAI3B-KOZ65 wurde
mit den Restriktionsenzymen BfuAI und XbaI geschnitten. Das dabei
entstehende, 3567 bp große Fragment wurde über
ein Agarosegel isoliert. Für die dargestellten Arbeitsschritte
wurden Kits und Reagenzien der Firmen New England Biolabs GmbH (Frankfurt),
Invitrogen (Karlsruhe), Qiagen (Hilden) und Roche Diagnostics (Mannheim)
nach den Angaben der Hersteller verwendet. Darüber hinaus
gehende Methoden wurden der Methodensammlung von Sambrook und Russell
(Molecular Cloning – A Laboratory Manual; Sambrook,
J. und Russel, D. W.; 3. Auflage, CSHL Press 2001) entnommen.
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Die
drei Fragmente wurden anschließend ligiert und durch chemische
Transformation in E. coli-DH5α übertragen. Von
12 Kolonien wurde Plasmid-DNA präpariert und durch geeignete
Restriktionsverdaus daraufhin überprüft, ob das
gewünschte Plasmid entstanden war, was bei 9 Isolaten der
Fall war. Durch Sequenzierung von vier dieser Klone wurde bestätigt,
dass in allen Fällen keine weiteren als die in 1e dargestellten Veränderungen
stattgefunden haben.
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Der
Vektor pAI3B-KOZ65-U (SEQ ID 27) enthält nun eine singuläre
EcoO109I-Restriktionsschnittstelle (RG'GNCCY). EcoO109I erzeugt
3 bp lange 5'-Überhänge, in denen das mittlere
Nukleotid beliebig ist; bei pAI3B-KOZ65-U ist es ein A auf dem kodierenden
Strang. Die für die Aminosäuren R166 bis P182
kodierende DNA sowie ein weiteres Nukleotid sind in pAI3B-KOZ65-U
deletiert, was zu einer Leserasterverschiebung führt. Der
Versuch, dieses Gen auszuprägen führt daher zu
einem verkürzten Polypeptid ohne Funktion (SEQ ID 28).
Der Vektor ist für die Aufnahme von synthetischen, doppelsträngigen
DNA-Fragmenten geeignet, die zur Wiederherstellung eines funktionsfähigen
sPQQGDH-Gens mit Insertionen zwischen den Positionen Q168 und L169
führen, wie in Beispiel 2 näher beschrieben.
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Beispiel 2 – Herstellung von
sPQQGDH-Insertionsmutanten
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Zur
Herstellung von Insertionsmutanten mit vier zusätzlichen
Aminosäuren zwischen den Positionen Q168 und L169 wurden
vier synthetische Oligonukleotide benutzt: EarV2-Raudom (5'-CGACGTAACCAGNNKNNKNNKNNKCTGGCTTACCTG-3';
SEQ ID 29), EarV2-Lower (5'-GTGTGCTGTGCCTGGTTCGGCAGGAACAGGTAAGCCAG-3';
SEQ ID 30), EarV2-UpAmp (5'-CCTACCTACGACTCTTCCGACGTAACCAG-3'; SEQ
ID 31) und EarV2-LoAmp (5'-CCATGCTCTTCAGTCGGAGTGTGCTGTGCC-3'; SEQ
ID 32). In 2 ist die Strategie zur Herstellung
eines doppelsträngigen Insertionsfragments aus diesen Oligonukleotiden
schematisch dargestellt. Die Sequenz der vier einzufügenden
Aminosäuren ist in diesem Fall randomisiert: NNK NNK NNK
NNK. N steht dabei für eine Mischung aller vier Nukleotide
(dATP (A), dCTP (C), dGTP (G), dTTP (T)) bei der Synthese des Oligonukleotids
an der jeweiligen Position, während K für G oder
T steht. Mit der Sequenz NNK sind Codons für alle 20 Aminosäuren
möglich aber nur für eines der drei Stopcodons,
was die Wahrscheinlichkeit unvollständiger Genprodukte
verringert. Andere Kombinationen von Nukleotiden an den einzelnen
Positionen sind frei wählbar, um z. B. die möglichen
Aminosäuren an einer Codonposition einzuschränken.
Oligonukleotid EarV2-Random enthält die kodierende Sequenz
von R166 bis L172, das den Gegenstrang darstellende Oligonukleotid
EarV2-Lower überlappt im Bereich L169 bis L172 und reicht
bis T181. Oligonukleotid EarV2-UpAmp überlappt für
12 bp am 3'-Ende mit dem 5'-Ende von Oligonukleotid EarV2-Random
während Oligonukleotid EarV2-LoAmp am 3'-Ende mit dem 5'-Ende
von Oligonukleotid EarV2-Lower für ebenfalls 12 bp überlappt.
Die beiden letztgenannten Oligonukleotide enthalten jeweils eine
EarI-Schnittstelle (CTCTTCN'NNN).
-
Zunächst
wurden die Oligonukleotide EarV2-Random und EarV2-Lower in Gegenwart
von 10 mM Tris-HCl pH 7,9 bei 25°C, 10 mM MgCl2,
50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (Puffer NEB2) in einer PCR-Maschine
(GeneAmp 9600, Perkin-Elmer) auf 90°C aufgeheizt und über
5 min auf 10°C abgekühlt. Die dadurch gebildeten,
teilweise doppelsträngigen DNA-Stücke wurden nach
Zugabe aller vier DNA-Nukleotide und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
aus E. coli durch Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur
zu kompletten Doppelsträngen aufsynthetisiert. Danach wurde
die Reaktionsmischung in eine PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden
EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp eingesetzt, um den erhaltenen Doppelstrang
zu amplifizieren. Da die Überlappung der amplifizierenden
Oligonukleotiden EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp zum neu gebildeten
Doppelstrang nur jeweils 12 bp beträgt, wurden die ersten
beiden Amplifikationszyklen nicht mit der thermostabilen Polymerase
des PCR-Kits sondern mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
aus E. coli durchgeführt, um die Bindung der als Primer
eingesetzten Oligonukleotiden EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp zu erhalten.
Dazu wurde der Ansatz für 1 mm auf 94°C gebracht
und anschließend auf Eis gesetzt. Dann wurde 1 μL
DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) zugegeben und für 3 mm
bei 18°C und 1 min bei 25°C inkubiert. Danach
wurde der Ansatz erneut für 1 mm auf 94°C gebracht
und anschließend auf Eis gesetzt, 1 μL DNA-Polymerase
(Klenow-Fragment) zugegeben und für 3 mm bei 18°C
und 1 min bei 25°C inkubiert. Erst dann wurde in der PCR-Maschine
folgendes Amplifikationsprogramm durchgeführt (20 Zyklen):
1 mm 94°C, 1 mm 52°C, 1 mm 72°C.
-
Nach
der PCR-Amplifikation wurde die Reaktion über Säulenchromatographie
gereinigt (PCR-Purification Kit, Qiagen) und mit EarI geschnitten.
Das Reaktionsgemisch wurde anschließend auf einem Agarosegel
(4% Agarose) aufgetrennt und das gewünschte 64 bp-Fragment
(SEQ ID 33) wurde aus dem Gel isoliert und gereinigt.
-
Der
in Beispiel 1 beschriebene Vektor pAI3B-KOZ65-U wurde mit EcoO109I
geschnitten und anschließend mit alkalischer Phosphatase
nach Herstellerangaben (New England Biolabs) dephosphoryliert um
Rezirkularisierung des Vektors zu verhindern. Anschließend
wurden das 64 bp-Fragment und der dephosphorylierte, mit EcoO109I
linearisierte Vektor im Verhältnis 5 zu 1 über
Nacht bei 16°C ligiert. Die von EcoO109I und EarI gebildeten
5'-Überhänge sind dabei in der Weise kompatibel,
dass das 64 bp-Fragment in der gewünschten Orientierung
relativ zum Vektor, nicht aber in der anderen Orientierung mit dem
Vektor ligiert werden kann. Damit sind Ligationsprodukte mit falsch
orientierten Insertionen ausgeschlossen, nicht aber die Bildung
von Multimeren mit jeweils der richtigen Orientierung. Derartige
Gene führen aber nicht zur Ausprägung funktionaler
sPQQGDH Proteine, weil dabei eine Leserasterverschiebung auftritt.
Das entstandene Ligationsprodukt wurde in E. coli-DH5α transformiert.
Vom Transformationsansatz wurden 1/25, 4/25 und 20/25 auf je eine
20 cm × 20 cm große Agarplatte ausplattiert um
bei wenigstens einer Verdünnung eine Koloniedichte von
etwa 1000–5.000 Kolonien pro Platte zu erzielen.
-
In
diesem Beispiel wird die Herstellung einer Bibliothek dargestellt,
deren Klone sPQQGDH-Varianten mit jeweils vier zusätzlichen
Aminosäuren ausprägen. Die Herstellung von Bibliotheken
mit anderer Länge der Insertion ist in gleicher Weise durchgeführt
worden.
-
Beispiel 3 – Screening einer
Varianten-Bibliothek
-
Zur
Auswahl von geeigneten Varianten aus einer nach dem in Beispiel
2 beschriebenen Verfahren hergestellten Bibliothek wurden von zwei
Agarplatten mit insgesamt ca. 4000 Kolonien mit Hilfe eines Kolonie-Pick-Automaten
QPix (Fa. Genetix) 2200 Kolonien aufgenommen und in Mikrotiterplatten
(MTP) mit jeweils 200 μL LB-Medium mit Ampicillin ad 100 μg/mL
pro Gefäß (Well) übertragen. Zusätzlich
wurden auf 4 MTP insgesamt acht Wells mit Kulturen des Ausgangsstamms
E. coli-DH5α::pAI3B-KOZ65 angeimpft. Die MTP wurden mit
einer gasdurchlässigen Folie (Airpore Sheets, Qiagen) verschlossen
und für 5 h bei 37°C geschüttelt. Anschließend
wurden 50 μL von jeder Einzelkultur in ein neues Kulturgefäß,
ebenfalls in einer MTP, übertragen, in dem 150 μL
LB-Medium mit Ampicillin vorlagen. Dazu wurde ein Pipettierroboter
benutzt, der 96 Pipettiervorgänge parallel ausführt.
Zusätzlich enthielt dieses Medium 200 ng/mL Anhydrotetracyclin,
um die Ausprägung des sPQQGDH-Gens zu induzieren. Diese
MTP wurden bei 28°C über Nacht geschüttelt.
-
Um
die Enzymaktivität einer großen Anzahl von Kolonien
feststellen zu können, wurde ein Test verwendet, bei dem
ein Aufschluss der Zellen nicht erforderlich ist: Nach Aktivierung
des Enzyms durch Zugabe von PQQ kann die Oxidation des Zuckers direkt
aufgrund der Entfärbung von Dichlorphenolindophenol (DCPIP)
bei dessen Reduktion verfolgt werden. Für ein Screening
wurden aus allen Wells jeweils 40 μL der induzierten Kultur
mit 60 μL Glukose-Testlösung und weitere 40 μL
mit 60 μL Maltose-Testlösung vermischt, wobei
eine MTP entweder nur Glukose-Testlösung oder nur Maltose-Testlösung
enthielt. Auch hierzu wurde der Pipettierroboter verwendet. Auf
diese Weise konnte jeder Einzelkultur eine stets gleichbleibende
Position auf allen Kultur- und Messplatten zugeordnet werden. Die
Glukose-Testlösung enthielt folgende Komponenten (in Klammern:
Endkonzentration im Messansatz): 50 mM Glukose (30 mM), 750 μM
DCPIP (450 μM), 1,5 μM PQQ (0,9 μM),
1 mM CaCl2 (0,6 mM), 0,1% NaN3 (0,06%),
Silikonentschäumer (Fluka # 85390) 62,5 ppm (37,5 ppm),
50 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-HCl (TRIS-HCl) pH 7,6 (30
mM). Im Fall der Maltose-Testlösung war keine Glukose sondern
Maltose in der gleichen Konzentration vorhanden.
-
Von
jeder MTP mit Kulturen wurden auf diese Weise zwei Messplatten erzeugt,
eine für Glukose, eine für Maltose. Von jeder
Messplatte wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge
von 605 nm zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Vermischen von
Kultur und Testlösung bestimmt (Eppendorf-Biophotometer):
nach 1 min, nach 7 min, nach 12 mm und nach 18 mm. Auf diese Weise
konnte von jeder ursprünglich isolierten Kolonie eine Enzymkinetik
für Glukose und eine für Maltose als Substrat
aufgenommen werden. Daraus ließ sich sowohl die relative
Aktivität der Klone untereinander mit Glukose als Substrat
als auch das Verhältnis der Aktivitäten auf Glukose
und Maltose für jeden einzelnen Klon ermitteln. 3 zeigt das Ergebnis einer solchen Messung
für die MTP 13 und 22 aus dem Screening einer Bibliothek
mit fünf zusätzlichen Aminosäuren zwischen
den Positionen Q168 und L169. Es ist zu erkennen, dass etwa 2/3
der getesteten Kolonien einen Glukose-Umsatz von weniger als 50
relativen Einheiten aufweisen, was unterhalb der Anzeigegenauigkeit
des Tests liegt. Bei diesen Kolonien ist keine signifikante Ausprägung
von sPQQGDH nachweisbar, was auf zu geringes Wachstum der Kultur,
mangelnde Induktion des sPQQGDH-Gens, unproduktive Doppelinsertionen
oder Insertion von Aminosäurekombinationen zurückzuführen
ist, die keine enzymatische Aktivität des gebildeten Proteins
mehr erlauben. Von den übrigen Kolonien weist der überwiegende
Anteil eine geringere Aktivität auf Maltose im Vergleich
zu Glukose auf. Ergebnisse aus primären Screenings wie
in 3 gezeigt zeigen eine ähnlich
hohe Umsatzrate vieler Varianten im Vergleich zum Ausgangsklon E.
coli-D1-15α::pAI3B-KOZ65. Die relative Aktivität
ist jedoch immer nachzuprüfen, weil dieser auf sehr viele
Einzelmessungen ausgelegte Test oberhalb einer gewissen Umsatzrate
nicht mehr differenzieren kann. sPQQGDH aus Varianten hat in aller
Regel eine niedrigere Umsatzrate verglichen mit der sPQQGDH aus
KOZ65 als das gezeigte Screening vermuten lassen würde.
-
Beispiel 4 – Verfeinertes Screening
von einzelnen Kolonien
-
Aus
einem Screening wie in Beispiel 3 beschrieben wurden 188 Kolonien
ausgewählt, bei denen sowohl die Aktivität auf
Glukose als auch das Verhältnis der Aktivitäten
auf Glukose bzw. Maltose besonders vielversprechend erschienen,
auf zwei neuen MTP zusammen mit Kulturen des Ausgangsstamms E. coli-DH5α::pAI3B-KOZ65
angeordnet und wie in Beispiel 3 beschrieben zunächst bei
37°C angezogen und dann bei 28°C über
Nacht induziert. Für die Induktion wurden von jeder MTP
zwei Platten angelegt, um genügend Kulturvolumen für
das Screeningexperiment zu bekommen. Nach der Induktion wurden die
parallel gewachsenen Kulturen von je ca. 200 μL vereinigt
und gemischt. Von jeder dieser induzierten Kulturen wurden jeweils 40 μL
auf Messplatten übertragen, in denen jeweils 60 μL
der in Beispiel 3 beschriebenen Testlösungen vorlag, allerdings
mit folgenden Zuckern: G – 50 mM Glukose, M – 50
mM Maltose, GM – 50 mM Glukose und 50 mM Maltose, GGal – 50
mM Glukose und 50 mM Galaktose bzw. GXyl – 50 mqM Glukose
und 50 mM Xylose. Diese Platten wurden unmittelbar nach dem Mischen
von Kultur und Messlösung über 30 min im Abstand
von 30 sec gemessen, um eine Kinetik jeder einzelnen Kultur zu erhalten.
Aus den so erhaltenen Daten kann für jede Kultur die Umsatzgeschwindigkeit
auf Glukose und Maltose allein, das Verhältnis der Aktivitäten
auf Glukose und Maltose und vor allem der Einfluss von Maltose,
Galaktose und Xylose auf die Umsetzung von Glukose (Interferenz)
abgeschätzt werden. In 4 ist das
Ergebnis dieser Nachuntersuchung ausgewählter Kolonien
(2. Screening) für das in Beispiel 3 geschilderte Screening
dargestellt.
-
An
zwei Kolonien von MTP 13 des ersten Screenings (13-G3 und 13-B2;
in 3 und 4 jeweils mit
einem Rechteck markiert) ist beispielhaft gezeigt, dass Kolonien
mit einem vielversprechenden Verhältnis von Maltose- zu
Glukoseaktivität (3) stark
abweichendes Interferenzverhalten aufweisen können: 13-G3 erfährt
negative Interferenz durch Maltose, 13-B2 positive Interferenz.
Insgesamt wurden auf Basis der beiden geschilderten Screenings 28
Kolonien zur weiteren Untersuchung ausgewählt.
-
Beispiel 5 – Anzucht von Stämmen,
die variante Formen der sPQQGDH ausprägen
-
Zunächst
wurde von vier ausgewählten Kolonien einer Bibliothek mit
jeweils drei zusätzlichen Aminosäuren zwischen
den Positionen Q168 und L169 je eine Vorkultur wie folgt hergestellt:
2 mL TB-Medium (mit 100 μg/mL Ampicillin) wurden mit der
zu prüfenden Kolonie beimpft und über Nacht bei
37°C und 225 rpm geschüttelt. Für die
Hauptkultur wurden 50 mL TB-Medium (100 μg/mL Ampicillin)
mit der ausgewachsenen Vorkultur beimpft. Die Kultur wurde bei 37°C
und 225 rpm geschüttelt, bis eine optische Dichte bei 605
nm (OD605) von ca. 1 erreicht war. Dann
wurde die Ausprägung des Enzyms durch Zusatz einer Anhydrotetracyclin(AHT)-Stammlösung
induziert. Der Induktor war dazu in DMF gelöst. Die Endkonzentration
des AHT in der Kultur betrug 0,2 μg/mL, die Induktion erfolgte über
24 Stunden bei 27°C und 225 rpm.
-
Das
Ernten der Zellen erfolgte durch Zentrifugation der Hauptkultur
bei 3220 × g für 15 min bei 4°C. Die
Zellsedimente wurden je nach Menge in 10–20 mL 50 mM 3-Morpholinopropansulfonsäure-Puffer
(MOPS) pH 7,6 und 2,5 mM CaCl2 resuspendiert
und durch Behandlung mit Ultraschall aufgeschlossen, bis eine deutliche
Klärung der Zellsuspension feststellbar war. Zelltrtimmer
und evtl. vorhandene Inclusion Bodies wurden bei 48.745 × g
für 10 mm bei 4°C abzentrifugiert.
-
Beispiel 6 – Reinigung der varianten
sPQQGDH
-
Die Überstände
aus Beispiel 5 wurde mit Säulenpuffer (10 mM MOPS pH 7,6
+ 2,5 mM CaCl2) 1:5 auf 10 bzw. 50 mL verdünnt
und über einen Kationenaustauscher (Toyopearl CM-650M,
Fa. TOSOH BIOSEP GmbH) chromatographisch getrennt. Hierzu wird eine
10 × 1,42 cm-Säule mit ca. 16 mL Säulenbett
eingesetzt; die Flussrate betrug 4 mL/min. Die Säule wurde
mit 10 Säulenvolumen Puffer äquilibriert, danach
erfolgte der Probenauftrag. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumen
Puffer gewaschen, anschließend wurde die sPQQGDH mittels
eines linearen Salzgradienten von 0 bis 0,4 M NaCl in Säulenpuffer
eluiert und das Eluat wurde in Fraktionen zu 1 oder 3 mL aufgefangen.
sPQQGDH eluierte unter diesen Bedingungen als nahezu homogenes Protein,
so dass keine weitere Reinigung mehr erforderlich war. Zur Proteinbestimmung
wurde die OD280 der Lösung bestimmt.
Mit gereinigtem sPQQGDH-Protein aus KOZ65 war zuvor durch gravimetrische
Analyse festgestellt worden, dass die OD280 einer
1 mg/mL sPQQGDH-Lösung (PQQ-freies Apoenzym) 1,27 beträgt.
-
Beispiel 7 – Ermittlung der Enzymaktivität
von sPQQGDH-Varianten
-
Zur
genauen Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde folgender
Test verwendet. Von den zu untersuchenden Enzymlösungen
wurde je eine Verdünnungsreihe in folgendem Puffer angefertigt:
50 mM Piperazin-1,4-bis-(2-ethansulfonsäure) (PIPES) pH
6,5, 0,1% Triton X-100, 1 mM CaCl
2, 0,1%
Rinderserumalbumin (BSA) und 3 μM PQQ. Der als Substrat
dienende Zucker, der Elektronenmediator N-Methylphenazoniummethasulfat
(PMS) und das Nachweisreagenz Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)
wurden separat angesetzt: 11,7 mL einer Lösung mit 50 mM
PIPES pH 6,5 und 2% Triton X-100 in zweifach destilliertem (bidest.) Wasser
wurden mit 450 μL 0,9 M D-Glukose, 450 μL 6 mM
PMS und 450 μL 6,6 mM NBT (alle Substanzen ebenfalls in
bidest. Wasser gelöst) gemischt, im Dunkeln bei 25°C
aufbewahrt und innerhalb einer Stunde verbraucht. Wenn die Enzymaktivität
auf anderen Zuckern als Glukose gemessen werden soll, werden diese
anstelle der Glukose in einer Konzentration von 0,9 M eingesetzt.
Die Endkonzentrationen der einzelnen Reaktionspartner in der Messlösung
betrugen: Zuckersubstrat: 30 mM, PMS: 200 μM und NBT: 220 μM.
725 μL der vorgewärmten Testlösung wurden
mit 25 μL verdünnter Enzymlösung in einer
Küvette gemischt und die Entstehung von Formazan wurde
bei 570 nm und 25°C über 3 mm verfolgt. Bei der
Umsetzung von l μmol Glukose entsteht 0,5 μmol
Formazan, dessen molarer Extinktionskoeffizient ε = 40.200
M
–1cm
–1 ist.
Damit kann die Enzymkonzentration in der Probe über folgenden
Zusammenhang ermittelt werden: 1 U/mL sPQQGDH entspricht einer Änderung
der OD
570 um 1,493 min
–1.
Eine Verdünnungsreihe der einzelnen Proben ist notwenig,
weil Messungen, bei denen Werte kleiner als 0,05 U/mL oder größer
als 0,7 U/mL ermittelt werden, verworfen werden müssen,
da außerhalb dieses Bereichs keine ausreichende Linearität
der Messung gewährleistet ist. Die Konzentration der Ausgangsprobe
wurde dann unter Berücksichtigung der verwendeten Verdünnungsstufe berechnet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2:
| Klon | Volumen [mL] | Enzym [mg/mL] | Enzymaktivität
auf | Maltose [U/mL]/Glucose [U/mL] | spez. Aktivität [U/mg] |
| Glucose [U/mL] | Maltose [U/mL] |
| 5146-10-E4 | 6 | 0,124 | 43,6 | 2,6 | 0,059 | 351,6 |
| 5146-08-E9 | 3 | 0,044 | 10,4 | 0,68 | 0,065 | 236,4 |
| 5145-20-E7 | 3 | 0,036 | 4,7 | 0,495 | 0,105 | 130,6 |
| 5145-17-E10 | 5 | 0,053 | 12,7 | 0,935 | 0,074 | 239,6 |
-
Beispiel 8 – Bestimmung der Insertionssequenz
-
Um
die bei einer interessanten Variante tatsächlich zwischen
den Positionen Q168 und L169 eingefügten Aminosäuren
zu ermitteln, wurde aus dem betreffenden Stamm Plasmid-DNA mit Hilfe
des QiaPrep Plasmid-Isolation Kit (Qiagen, Hilden) nach den Angaben
des Herstellers präpariert und die DNA-Sequenz an der Insertionsstelle
von beiden Richtungen mit den als Primer verwendeten Oligonukleotiden
4472-US1 (5'-CACCGTTAAAGCTTGGATTATC-3'; SEQ ID 34) und 4831-DS1
(5'-CCTTCATCGAAAGACCATCAG-3'; SEQ ID 35) ermittelt. Das 3'-Ende
der Sequenz von 4472-US1 befindet sich 58 bp vor der Insertionsstelle,
das 3'-Ende der Sequenz von 4831-DS1 befindet sich 82 bp hinter
der Insertionsstelle. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse sind in
der folgenden Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle
3:
-
Zur
Orientierung sind die flankierenden Aminosäuren 168Q und
172L (vorher 169L) und deren Codons mit angegeben.
-
Beispiel 9 – Ermittlung der Interferenz
durch andere Zucker als Glukose
-
Während
bei der Bestimmung der spezifischen Aktivität von sPQQGDH üblicherweise
eine Substratkonzentration von 30 mM im Testansatz verwendet wird,
ist für die Ermittlung von Interferenz eine niedrigere Konzentration
der in Frage stehenden Zucker sinnvoll; etwa in der Größenordnung
wie sie bei potentiellen späteren Anwendungen auftritt.
Die physiologische Konzentration von Glukose im Blut beträgt
etwa 100 mg/dL, was ca. 5,6 mM entspricht. Aus diesem Grund wurden
die nachfolgend geschilderten Experimente mit einer Glukosekonzentration
von 100 mg/dL und 50 bis 250 mg/dL des interferierenden Zuckers
durchgeführt. In einigen Fällen wurden aber auch
andere Konzentrationen und Verhältnisse der beiden Zucker
zueinander untersucht.
-
In 5 ist das Ergebnis einer Interferenzmessung
von fünf verschiedenen Varianten dargestellt. 5381-06-C12,
5381-05-C4 und 5381-07-F10 stammen aus eine Bibliothek mit vier
zusätzlichen Aminosäuren, 5152-20-A7 und 5386-13-F10
aus einer Bibliothek mit fünf zusätzlichen Aminosäuren
zwischen den Positionen Q168 und L169. In allen Fällen
ist nur noch ein geringer Einfluss der getesteten Zucker nachweisbar:
im Fall der Maltose wird selbst bei 250 mg/dL Maltose (1,3-fache
molare Menge im Vergleich zu Glukose) die Messung bei keinem der
Klone um mehr als 8% beeinflusst. Bei Galaktose sind es maximal
16% und bei Xylose max. 14% Interferenz.
-
Beispiel 10 – Vergleich der Interferenzen
verschiedener Zucker auf KOZ65 und Klon 5152-20-A7
-
Um
einen direkten Vergleich zwischen der sPQQGDH ohne Insertionsmutation
aus KOZ65 zu ziehen wurden gereinigte, variante sPQQGDH aus Klon
5152-20-A7 und gereinigtes Enzym aus KOZ65 auf Mischungen von Glukose
und den Zuckern Maltose, Galaktose, Xylose, Laktose, Cellobiose
oder Mannose untersucht. Für jeden Messpunkt wurden Quadruplikate
aufgenommen. 6 zeigt, dass die starke Interferenz
durch Maltose, Cellobiose und Laktose beim Ausgangsenzym aus KOZ65
in dem von Variante 5152-20-A7 ausgeprägten Enzym unterdrückt
ist. Insbesondere bei Maltose ist die Interferenz bei etwa äquimolaren
Mengen (100 mg/dL Glucose mit 200 mg/dL Maltose) von 63% bei KOZ65
auf 6% bei 5152-20-A7 zurückgegangen, bei Laktose ist die
Interferenz nicht mehr signifikant.
-
Beispiel 11 – Vergleich von Varianten
aus unterschiedlichen Bibliotheken
-
Um
die Allgemeingültigkeit der erfindungsgemäßen
Methode zur Herstellung von sPQQGDH-Varianten mit verbesserter Substratspezifität
zu zeigen, wurden Bibliotheken mit zwei, drei, vier und fünf
zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen
Q168 und L169 der WildtypsPQQGDH aus KOZ65 angelegt und untersucht,
wie es in den vorangehenden Beispielen beschrieben wurde. Wie aus
der folgenden Tabelle 4 hervorgeht, enthalten alle Bibliotheken
Klone, die eine deutlich höhere Substratspezifität
als der Wildtyp aufweisen. Tabelle 4:
| Klon | Sequenz
der Insertion | spez.
Aktivität [U/mg] | Verhältnis M/G bei 30 mM | Interferenz
(5 mM Gluk./5mM Inhib.) |
| Maltose | Galaktose | Xylose |
| wt-GDH KOZ65 | – | 3000 | 90.0 | 63 | 5 | 5 |
| 5156-13-G12 | NG | 43 | 20.2 | n.
d. | n.
d. | n.
d. |
| 5145-17-E10 | AYQ | 240 | 7.4 | –5,8 | n.
d. | n.
d. |
| 5145-20-E7 | AWL | 131 | 10.5 | –4 | n.
d. | n.
d. |
| 5146-08-E9 | AFV | 236 | 6.5 | –4.7 | n.
d. | n.
d. |
| 5146-10-E4 | GYI | 351 | 5.9 | –9.9 | n.
d. | n.
d. |
| 5181-01-C12 | GYV | 680 | 6.2 | –24.6 | n.
d. | n.
d. |
| 5181-02-E2 | AFI | 753 | 6.2 | –30.6 | n.
d. | n.
d. |
| 5181-09-G12 | AYV | 738 | 5.4 | –10.8 | n.
d. | n.
d. |
| 5181-13-A12 | AFQ | 188 | 13.7 | –15.7 | n.
d. | n.
d. |
| 5138-11-A2 | AGRM | 101 | 9.5 | 15,5 | n.
d. | n.
d. |
| 5138-13-D10 | GDRW | 338 | 10.6 | n.
d. | n.
d. | n.
d. |
| 5152-21-E1 | GLAV | 166 | 11.7 | –20.7 | n.
d. | n.
d. |
| 5151-01-D4 | MSAKG | 149 | 13.4 | 20.9 | n.
d. | n.
d. |
| 5151-09-C11 | LSGKR | 41 | 15.7 | 14.5 | n.
d. | n.
d. |
| 5151-09-G5 | QSRGS | 78 | 13.3 | 16.2 | n.
d. | n.
d. |
| 5151-18-B10 | FGGTY | 108 | 17.1 | 32.2 | n.
d. | n.
d. |
| 5152-20-A7 | MGRFL | 530 | 7.95 | 5.6 | 17 | 15 |
| 5381-01-A2 | ASRIN | n.
d. | 26.8 | 9.5 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-01-F8 | AGRSN | n.
d. | 17.4 | 4.4 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-01-F9 | SGRIF | n.
d. | 10.8 | 7.7 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-03-05 | AARYN | 208 | 20.5 | 17.1 | 17 | 19 |
| 5381-04-B6 | SGTTI | n.
d. | 14.1 | 7.1 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-04-C7 | AGKFH | n.
d. | 17.2 | 4.8 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-04-F3 | TGRIY | n.
d. | 8.9 | 8.6 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-05-C4 | VSTFF | 264 | 9.5 | 1.2 | 6 | 1 |
| 5381-06-C12 | VSKNH | 229 | 10 | 3.8 | 13 | 7 |
| 5381-07-F10 | SSRNH | 203 | 9.5 | 4.2 | 14 | 13 |
| 5381-07-G12 | ASKFH | n.
d. | 16.1 | 10.5 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-08-Cl | ASKNN | 299 | 15.9 | 10.9 | 19 | 7 |
| 5381-08-F4 | TGRIL | n.
d. | 7.3 | 5.3 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-08-H8 | AGRIN | n.
d. | 13.1 | 6.5 | n.
d. | n.
d. |
| 5381-09-A11 | SGRIL | 411 | 6.6 | 5.3 | 13 | 13 |
| 5381-11-H8 | SGKYH | 255 | 13.5 | 6.3 | 19 | 13 |
| 5386-05-C4 | MGRYN | 163 | 8.8 | 10.8 | 15 | 4 |
| 5386-08-D10 | VGRLT | 272 | 6.4 | 5.7 | 17 | 1 |
| 5386-11-A7 | TGRFN | 177 | 11.3 | 5.4 | 18 | 4 |
| 5386-13-F10 | AERNY | 110 | 7.6 | 0.2 | –3 | –4 |
| 5386-19-B9 | MESHN | 111 | 8.2 | 7.8 | 3 | 4 |
| 5388-15-G8 | VGHVT | 296 | 6.2 | 3.8 | 26 | 8 |
| 5388-19-F3 | VGRYQ | 188 | 7.3 | 4.8 | 16 | 14 |
- (n. d.: nicht durchgeführt)
-
1 zeigt die Herstellung eines Vektors
zur Insertion von synthetischen DNA-Fragmenten. Gezeigt sind die
Positionen und Orientierungen (dicke schwarze Pfeile in 1b)
der Primer zur Herstellung zweier Fragmente (PCR 1, PCR 2) aus dem
sPQQGDH-Gen aus KOZ65 (1a) und die Stelle, an der später
zusätzliche Aminosäuren eingefügt werden
sollen („IP” in 1a und 1b). 1c zeigt
schematisch die Zusammenfügung des Vektors pAI3B-KOZ65-U
(1-2) aus dem mit XbaI und EcoO109I geschnittenen und gereinigten
Amplifikat aus dem vorderen Teil der kodierenden Sequenz, dem mit
EcoO109I und BfuAI geschnittenen und gereinigten Amplifikat aus
dem mittleren Teil der kodierenden Sequenz und dem mit XbaI und
BfuAI aus dem Ausgangsvektor pAI3B-KOZ65 (1-1) geschnittenen und
gereinigten, 3567 bp langen Vektorfragment. Der fertige Vektor pAI3B-KOZ65-U
(1-2) ist in 1e dargestellt. Aus 1d ist
ersichtlich, dass die Translation der sPQQGDH in pAI3B-KOZ65-U vier
Aminosäurereste nach der EcoO1091-Schnittstelle stoppt,
wenn keine Insertion erfolgt.
-
2 zeigt
die Herstellung eines synthetischen, doppelsträngigen DNA-Stücks
aus den im Text beschriebenen Oligonukleotiden (in der Figur als
Pfeile dargestellt; die Pfeilspitze deutet jeweils das 3'-Ende der Sequenz
an). Im unteren Teil sind die Oligonukleotide EarV2-Random und EarV2-Lower
dargestellt. Im ersten Schritt wird aus diesen überlappenden
Einzelsträngen das 62 bp lange Primär-Produkt
erstellt. Im zweiten Schritt wird daraus mit Hilfe der Oligonukleotide
EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp das 97 bp lange PCR-Produkt hergestellt,
dessen DNA-Sequenz im oberen Teil dargestellt ist. Die davon kodierte
Proteinsequenz findet sich am unteren Rand von 2.
In der DNA-Sequenz ist die Lage der beiden EarI-Schnittstellen dargestellt. Das
mit EarI aus dem PCR-Produkt freigesetzte 64 bp lange Fragment wird
in den mit EcoO109I geöffneten Vektor ligiert.
-
3 zeigt die Zusammenfassung der Daten
aus dem Screening einer Bibliothek varianter sPQQGDH-Klone am Beispiel
von zwei Mikrotiterplatten (a und b). Auf der Abszisse (X-Achse)
ist für jede Kolonie einer MTP die ungefähre Geschwindigkeit
in willkürlichen relativen Einheiten angegeben, mit der
Glukose von dieser Kolonie umgesetzt wird. Auf der Ordinate (Y-Achse)
ist der Quotient aus Maltose- und Glukoseumsatz aufgetragen. Damit
lässt sich für jede Kolonie abschätzen
ob sie in der Lage ist Glukose umzusetzen und wenn ja, ob sie eine
bessere Unterscheidung von Glukose und Maltose erlaubt als der Wildtyp
KOZ65. Als Symbol einer jeden Kolonie wurde deren Position auf der
jeweiligen Mikrotiterplatte benutzt, A1 – H12. Die Positivkontrolle
KOZ65 ist mit Pfeilen gekennzeichnet.
-
4 zeigt
die Ergebnisse der aus dem in Beispiel 3 beschriebenen Screening
ausgewählten Kolonien. Dabei werden drei Parameter betrachtet:
die auf diesem Bild nicht dargestellte Umsatzrate auf Glukose sollte
möglichst hoch sein; die auf der Abszisse (X-Achse) aufgetragene
Interferenz (hier für Maltose als interferierenden Zucker)
sollte, wie auch das auf der Ordinate (Y-Achse) aufgetragene Verhältnis
von Maltose- zu Glukoseumsatz, möglichst nahe bei Null
liegen. Zum Vergleich sind einige Klone in 3 und 4 in
gleicher Weise markiert.
-
5 zeigt Interferenzstudien verschiedener
Klone mit Maltose (a), Galaktose (b) und Xylose (c). Gezeigt wird
für fünf gereinigte, variante sPQQGDH-Präparationen
das Verhalten gegenüber Mischungen aus Glukose und drei
anderen Zuckern. Auf der Ordinate (Y-Achse) aufgetragen sind die
ermittelte Interferenz für Mischungen von 100 mg/dL Glukose
im Messansatz ohne weitere Zucker sowie mit 50, 100, 150, 200 oder 250
mg/dL (X-Achse) des jeweiligen interferierenden Zuckers. Jeder Messpunkt
wurde als Quadruplikat bestimmt.
-
6 zeigt
Interferenzstudien für KOZ65 (links) und Klon 5152-20-A7
(rechts) auf verschiedenen Zuckern. Für Cellobiose (a),
Galaktose (b), Laktose (c), Maltose (d), Mannose (e) und Xylose
(f) ist auf der Ordinate (Y-Achse) aufgetragen, wie stark diese
Zucker bei verschiedenen Konzentrationen die Aktivität
der sPQQGDH aus KOZ65 bzw. 5152-20-A7 in Gegenwart von 100 mg/dL
Glukose (Inhibitorkonzentration [mg/dL] auf der X-Achse) beeinflussen.
Zu jeder Messreihe für einen interferierenden Zucker gehört
auch eine Messung ohne diesen Zucker, die wie alle anderen Messungen
der Reihe auf einen aus allen Messungen ohne interferierende Zucker
gemittelten Glukosewert bezogen wurde. Aufgrund der Messungenauigkeit
bei enzymatischen Tests beginnen daher die einzelnen Graphen nicht
unbedingt bei Null, was theoretisch der Fall sein sollte.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
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- - EP 1367120 A2 [0007]
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