EP2294188A1 - Neuartige varianten pqq-abhängiger glukosedehydrogenase mit verbesserter substratspezifität - Google Patents

Neuartige varianten pqq-abhängiger glukosedehydrogenase mit verbesserter substratspezifität

Info

Publication number
EP2294188A1
EP2294188A1 EP09768932A EP09768932A EP2294188A1 EP 2294188 A1 EP2294188 A1 EP 2294188A1 EP 09768932 A EP09768932 A EP 09768932A EP 09768932 A EP09768932 A EP 09768932A EP 2294188 A1 EP2294188 A1 EP 2294188A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
spqqgdh
glucose
amino acids
vector
koz65
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09768932A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Walter Weichel
Volker Moehrle
Markus Schindler
Rainhard Koch
Rolandas Meskys
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Intellectual Property GmbH
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Technology Services GmbH filed Critical Bayer Technology Services GmbH
Publication of EP2294188A1 publication Critical patent/EP2294188A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01069—Gluconate 5-dehydrogenase (1.1.1.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/05—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a quinone or similar compound as acceptor (1.1.5)
    • C12Y101/05002—Quinoprotein glucose dehydrogenase (1.1.5.2)

Definitions

  • the present invention relates to PQQ-dependent glucose dehydrogenases (sPQQGDH), methods for their production and identification, genes encoding the sPQQGDH according to the invention, vectors for producing the genes, and glucose sensors comprising a glucose dehydrogenase according to the invention.
  • sPQQGDH PQQ-dependent glucose dehydrogenases
  • the enzymatic determination of glucose is of great importance in medical diagnostics.
  • the detection of glucose in the urine or in the blood to determine or follow-up of metabolic diseases is necessary.
  • the conversion rate of an enzyme is usually expressed in units of activity (U);
  • the specific activity (U / mg) usually refers to the amount of glucose in micromol that is oxidized by one milligram of enzyme per minute under specified reaction conditions.
  • GDH glucose dehydrogenases
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP + nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • glucose dehydrogenases contains pyrroloquinoline quinone (PQQ) bound as an electron acceptor in the enzyme.
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • Two structurally distinct glucose dehydrogenases of this type have been described, a membrane-anchored form mPQQGDH (AM Cleton-Jansen et al, J. Bacteriol 170 [5], 2121-2125 (1988)) and a smaller, soluble form sPQQGDH (AM Cleton-Jansen et al., Mol. Gen. Genet. 217 [2-3], 430-436 (1989)).
  • Latter is due to their high spec. Activity, their insensitivity to oxygen and the tightly bound, stable cofactor enzyme, which is particularly suitable for the production of test systems for the determination of glucose.
  • this enzyme is used in a number of commercial blood glucose meters, despite a lower substrate specificity that this enzyme has compared to the other enzymes mentioned.
  • this enzyme is desirable to have variants of this enzyme which have a higher substrate specificity.
  • the sPQQGDH In addition to the glucose substrate, the sPQQGDH also converts other sugars to the corresponding lactone, preferably disaccharides, whose reducing sugar is glucose, but also other reducing sugars. Since such sugars are not normally present in human blood, an enzyme assay based on sPQQGDH usually gives a result that corresponds to the glucose concentration. In the context of certain medical therapies, however, substances are administered whose degradation products include maltose, which is oxidized by the sPQQGDH and thus undesirably contributes to the measurement result (T. G. Schleis, Pharmacotherapy 27 [9], 1313-1321 (2007)). With the administration of xylose and galactose in diagnostic procedures or as an additive to medicines, these sugars are even recorded. It therefore makes sense to appropriately suppress these ancillary activities of the sPQQGDH.
  • the object thus is to provide glucose dehydrogenases which enable reliable determination of glucose even in the presence of a mixture of glucose and other sugars.
  • the object is to provide glucose dehydrogenases, with which glucose can be reliably determined in the presence of maltose.
  • a further object is to provide a method by which such glucose dehydrogenases can be prepared and identified which are particularly suitable for the determination of glucose in the presence of other sugars, in particular in the presence of maltose.
  • sPQQ glucose dehydrogenases in which three to five amino acids are inserted in the region of the substrate binding region, have a glucose specificity which is better than the starting form of the enzyme.
  • An object of the present invention are therefore sPQQ glucose dehydrogenases having an improved glucose specificity compared to the starting form of the enzyme, characterized in that three to five amino acids are inserted in the region of the substrate binding region.
  • the sPQQGDH according to the invention can be encoded by genes which are produced by mutagenesis from wild-type strains naturally occurring, such as Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41 (K.Kojima K. et al, Biotechnology Letters 22, 1343-1347 (2000)) and other strains of the genus Acinetobacter (PJ Bouvet PJ and OM Bouvet, Res. Microbiol., 140 [8], 531-540 (1989)), in particular those which are characterized by increased Thermostabi quality as described in EP 1623025 Al Acinetobacter sp. Tribes, to be won.
  • Preferred strains are those described in EP 1623025 Al Acinetobacter sp.
  • Preferred for mutagenesis are amino acid regions whose distances from the substrate are not more than 5 angstroms, e.g. the positions Q76, D143, Q168, Y343 and the adjacent amino acid residues. For example, before or after one of the specified
  • Positions are made an insertion of three or more amino acids to change the spatial nature of the substrate binding site. Particularly preferred is a
  • the sPQQGDH according to the invention are characterized, as shown in Table 1, by increased substrate specificity (lower maltose / glucose ratio and lower level of interference of glucose in a glucose / maltose mixture).
  • the present invention further provides a method for the production and identification of sPQQGDH, which show increased substrate specificity compared to the wild type.
  • the method according to the invention allows the generation of a multiplicity of variants by means of local random mutagenesis, with three, four, five or more inserted amino acids at a desired site of the sPQQGDH sequence.
  • the enzymes produced are screened for substrate specificity and the best variants selected.
  • the inventive method is characterized in that in a first step, a vector is prepared in which a suitable sequence area in front of and behind the desired
  • Insertion site was deleted and replaced by a unique for this vector restriction site.
  • vector DNA which is opened with this restriction enzyme, in a second step double-stranded, oligonucleotide sequences produced by PCR amplification are inserted, which contain the desired insertion in addition to the sequence deleted in the vector, so that a gene product is produced which has no further amino acid sequence
  • Double-stranded fragment contains the three or more additional, randomized codons for
  • recombinant vectors which have been prepared in the manner described above are transformed into suitable host bacteria and the host bacteria are propagated in a suitable nutrient medium.
  • the methods for cloning genes from microorganisms and their expression in another host, as well as the techniques for isolating and altering nucleic acids, are known to the person skilled in the art (see, for example, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Vol 1, Sambrook, J. and Russel, DW, 3rd edition, CSHL Press 2001).
  • the cultivation of microorganisms and the purification of recombinant enzymes thereof are state of the art (see ibid, Vol. 3).
  • the bacterial colonies are tested for their activity against various sugars and the best ones identified. According to the invention, not only a test is carried out with respect to the activity towards the individual sugars but also with respect to the interference of different sugars.
  • the activities may be considered specific activities, i. Conversion rates, which are implemented by a defined amount of enzyme per unit time, can be determined.
  • the specific activity U / mg usually refers to the amount of glucose in micromoles that is oxidized by one milligram of enzyme per minute under specified reaction conditions.
  • glucose is present in excess of the enzyme in order to eliminate the influence of the glucose concentration on the reaction rate.
  • the conversion rate is determined by monitoring the degradation of a reactant or the formation of a product over time. The time tracking can e.g. done photometrically.
  • reaction rates and turnover rates reference may be made to textbooks of physical chemistry (e.g., Peter Atkins, Physical Chemistry, W.H. Freeman & Co., 7th Edition, 2002).
  • the individual colonies are divided and an enzyme test (determination of the specific activity) with glucose as substrate and a second enzyme test with a second sugar, e.g.
  • Maltose performed as a substrate. Opposed to the colonies with the highest activities Glucose with at the same time least activity towards the second sugar (eg maltose) also determines the activity against a mixture of glucose and the second sugar (eg maltose). It turned out, surprisingly, in the study of some variants with very low relative reactivity to maltose as the sole substrate, that this property of one variant is not necessarily associated with an independent property, namely the reliable discrimination of glucose and maltose, when both sugars are present as a mixture , This can lead both to the overestimation and to the underestimation of the glucose concentration present in this mixture.
  • V R ⁇ ren the rate at which glucose degraded by the observed enzyme and V Miscnung the rate at which glucose degraded in a mixture with each other sugar .
  • the rates can be determined, for example, photometrically (see examples 3, 4, 7 and 9).
  • Positive values in this context mean that the enzyme activity is higher on a mixture than on glucose alone; So apparently both sugars are oxidized. Negative values may be interpreted as oxidizing the interfering sugar, but decreasing the activity of the enzyme for glucose. Both effects are undesirable for an enzyme to be used for the specific quantification of glucose.
  • the method according to the invention makes it possible to produce and identify variants of sPQQGDH whose substrate specificity has changed compared with the starting form of the enzyme.
  • the method according to the invention can also be modified and / or expanded in such a way that instead of the substrate specificity or in addition to this, other biochemical properties such as eg thermostability are tested and thus variants improved with respect to the starting form the other biochemical properties are identified.
  • the method according to the invention thus makes it possible to select variants of sPQQGDH with particularly advantageous properties.
  • the present invention also relates to genes which encode the sQQQGDH according to the invention and vectors for generating the genes.
  • the present invention furthermore relates to a glucose sensor comprising an sPQQGDH according to the invention for the determination of glucose.
  • a glucose sensor comprising an sPQQGDH according to the invention for the determination of glucose.
  • the construction and operation of glucose-based dehydrogenase-based glucose sensors are known to those skilled in the art (see, for example, EP146332A1). Thereafter, such a glucose sensor comprises an electrode system of a working electrode, a counter electrode and a reference electrode on an insulating plate, on which an enzymatic reaction layer is applied, which includes a glucose dehydrogenase and an electron acceptor in contact with the electrode system.
  • Suitable working electrodes include carbon, gold, platinum and similar electrodes on which an enzyme according to the invention is immobilized by cross-linking agent: embedding in a polymer matrix, jacketing with a dialysis membrane, using a photocrosslinkable polymer, an electrically conductive polymer or a redox polymer, fixing the enzyme in a polymer or adsorbing on the electrode with an electron mediator including ferrocene or its derivatives or any combination thereof.
  • sPQQGDH according to the invention are immobilized on the electrode in the form of a holoenzyme, although they may also be immobilized as an apoenzyme and provided with PQQ as a separate layer or in a solution.
  • sPQQGDHs of the present invention are immobilized on a carbon electrode with glutaraldehyde and then treated with an amine-containing reagent to block the glutaraldehyde.
  • the counter electrode e.g. a platinum electrode and as a reference electrode e.g. an Ag / AgCl electrode can be used.
  • the amount of glucose can be measured as follows: PQQ, CaCl 2 and a mediator are placed in a thermostat cell containing a buffer and left at a constant temperature. Suitable mediators include, for example, potassium ferricyanide and phenazine methasulfate.
  • An electrode on which an sQQQGDH of the present invention has been immobilized is used as a working electrode in combination with a counter electrode (eg, a platinum electrode) and a reference electrode (eg, Ag / AgCl electrode). After to When a steady state current has been applied to the working electrode, a glucose-containing sample is added to measure the increase in current. The glucose level of the sample can be read from a calibration curve made with glucose solutions at standard concentrations.
  • Example 1 Preparation of a vector for insertion of additional amino acids between Q168 and L169
  • a gene for an sPQQGDH must be available in an expression plasmid which can be propagated in microorganisms which permits induced expression of sPQQGDH and which can be used to carry out the desired mutations.
  • a variety of plasmids and microorganisms are known in the art, which can be used for this purpose.
  • a construct based on the commercially available vector pASK-IBA3 (IBA GmbH, Göttingen) was used.
  • pASK-IBA3 the sPQQGDH gene from the strain Acinetobacter sp. KOZ65 cloned in the following way. From genomic DNA of Acinetobacter sp.
  • KOZ65 was probed with the two oligonucleotides GDH-U3 (5'-TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGC TAAAATTAC-3 '; SEQ ID 19) and GDH-L5 (5'TTCAGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATC-S'; SEQ ID 20) by means of a PCR reaction (Phusion DNA Polymerase, Finnzymes Oy) according to the manufacturer's instructions generated a 1, 46 kb long DNA fragment. The fragment was purified and then incubated with the restriction enzyme Bsal. The vector pASK-IBA3 was opened with the restriction enzyme HindIII.
  • the restriction enzyme was denatured by heat treatment and the resulting DNA overhangs were filled in with T4 DNA polymerase in the presence of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. Subsequently, the DNA was purified and incubated with the restriction enzyme Bsal. The thus released, 1 14 bp fragment was discarded; into the 3.1 kb vector fragment, the PCR amplicon was ligated with the sOQ65GDH gene from KOZ65. The ligation product was transformed into transformation competent cells of the E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the vector pAI3B-KOZ65 prepared in this way is suitable for the inducible expression of KOZ65 sPQQGDH.
  • the nucleotide sequence of the vector pAI3B-KOZ65 is given under SEQ ID 21, the amino acid sequence of the coded sPQQGDH under SEQ ID 22.
  • the vector pAI3B-KOZ65-U was first prepared.
  • plasmid DNA of the vector pAI3B-KOZ65 was used as template for a PCR amplification A with the primers IBA-For (5'-TAGAGTTATTTTACCACTCCCT-3 ', SEQ ID 23) and Ecol09-Up (5'-GGTTAGGTCCCTGATCACCAATCG-3'; SEQ ID 24) and a PCR amplification B with the primers BfuA-US 1 (5 '-CACAGGTACACCTGCCGCCACT-S', SEQ ID 25) and Ecol 09-Down (5'-TACGAGGACCCAACAGGAACTGAGC-S '; SEQ ID 26).
  • the amplificate formed from A was purified and cut with the restriction enzymes XbaI and EcoO109I.
  • the resulting 588 base pair (bp) fragment was isolated.
  • the B-derived amplicon was purified and cut with the restriction enzymes BfuAI and EcoO109I.
  • the resulting 353 bp fragment was also isolated.
  • the vector pAI3B-KOZ65 was cut with the restriction enzymes BfuAI and XbaI.
  • the resulting, 3567 bp fragment was isolated on an agarose gel.
  • Kits and reagents from New England Biolabs GmbH (Frankfurt), Invitrogen (Karlsruhe), Qiagen (Hilden) and Roche Diagnostics (Mannheim) were used according to the manufacturer's instructions for the work steps described. Additional methods were taken from the set of methods of Sambrook and Russell (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Sambrook, J. and Russel, DW, 3rd edition, CSHL Press 2001).
  • the vector pAI3B-KOZ65-U (SEQ ID 27) now contains a unique EcoO109I restriction site (RG'GNCCY).
  • EcoO109I generates 3 bp long 5 'overhangs in which the middle nucleotide is arbitrary; in pAI3B-KOZ65-U it is an A on the coding strand.
  • the DNA coding for the amino acids R166 to Pl82 and another nucleotide are deleted in pAI3B-KOZ65-U, which leads to a frame shift. The attempt to express this gene therefore leads to a truncated polypeptide without function (SEQ ID 28).
  • the vector is suitable for the uptake of synthetic, double-stranded DNA fragments that result in the recovery of a functional sPQQGDH gene with insertions between positions Q 168 and L 169, as further described in Example 2.
  • Example 2 Preparation of sPQQGDH Insertional Mutants
  • EarV2 random (5'-CGACGTAACCAGNNKNNNNKKNTKCTGGCTTACCTG-3 ', SEQ ID 29)
  • EarV2-Lower (5'-GTGTGCTGTGCCTGGTTCGGCAGGAACAGGTAAGCCAG-3 '; SEQ ID 30)
  • EarV2-UpAmp (5'-CCTACCTACGACTCTTCCGACGTAACCAG-S'; SEQ ID 31)
  • EarV2-LoAmp (5'-CCATGCTCTTCAGTCGGAGTGTGCTGTGCC-3 '; SEQ ID 32).
  • NNK NNK NNK NNK N stands for a mixture of all four nucleotides (dATP (A), dCTP (C), dGTP (G), dTTP (T)) in the synthesis of the oligonucleotide at the respective position, while K stands for G or T.
  • the sequence NNK allows codons for all 20 amino acids but only for one of the three stop codons, reducing the likelihood of incomplete gene products.
  • Oligonucleotide EarV2 random contains the coding sequence from Rl 66 to Ll 72, the opposite strand oligonucleotide EarV2-Lower overlaps in the range Ll 69 to Ll 72 and extends to Tl 81.
  • EarV2-UpAmp overlaps for 12 bp at the 3 'end with the 5 'end of EarV2 random oligonucleotide while EarV2-LoAmp oligonucleotide overlaps at the 3' end with the 5 'end of EarV2-Lower oligonucleotide for also 12 bp.
  • the latter two oligonucleotides each contain an Earl interface (CTCTTCN 'NNN).
  • the oligonucleotides EarV2 random and EarV2-Lo wer in the presence of 10 mM Tris-HCl pH 7.9 at 25 0 C, 10 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (Buffer NEB2) (in a PCR machine GeneAmp 9600, Perkin-Elmer) heated to 90 0 C and cooled to 10 0 C for 5 min.
  • Buffer NEB2 in a PCR machine GeneAmp 9600, Perkin-Elmer
  • the thus formed, partially double-stranded pieces of DNA were synthesized by addition of all four DNA nucleotides and the Klenow fragment of DNA polymerase from E. coli by incubation for 15 min at room temperature to complete double strands.
  • the reaction mixture was used in a PCR reaction with the oligonucleotides EarV2-UpAmp and EarV2-LoAmp to amplify the resulting duplex. Since the overlap of the amplifying oligonucleotides EarV2-UpAmp and EarV2-LoAmp to the newly formed double strand is only 12 bp each, the first two amplification cycles were not with the thermostable polymerase of the PCR kit but with the Klenow fragment of the DNA polymerase from E. coli to obtain the binding of the oligonucleotides EarV2-UpAmp and EarV2-LoAmp used as primers.
  • the mixture was brought to 94 0 C for 1 min and then placed on ice. Then 1 ⁇ L of DNA polymerase (Klenow fragment) was added and incubated for 3 min at 18 ° C and 1 min at 25 ° C. Thereafter, the batch was brought again for 1 min at 94 ° C and then placed on ice, 1 ul DNA polymerase (Klenow fragment) was added and incubated for 3 min at 18 ° C and 1 min at 25 ° C. Only then the following amplification program was in the PCR machine carried out (20 cycles): 1 min 94 0 C, 1 min 52 0 C, 1 min 72 ° C.
  • reaction was purified by column chromatography (PCR Purification Kit, Qiagen) and cut with Earl. The reaction mixture was then added on an agarose gel (4% agarose) and the desired 64 bp fragment (SEQ ID 33) was isolated from the gel and purified.
  • the vector pAI3B-KOZ65-U described in Example 1 was cut with EcoO109I and subsequently dephosphorylated with alkaline phosphatase according to the manufacturer's instructions (New England Biolabs) in order to prevent recircularization of the vector. Subsequently, the 64 bp fragment and the dephosphorylated, EcoO109I linearized vector in a ratio of 5 to 1 overnight at 16 0 C were ligated. The 5'-overhangs formed by EcoO109I and Earl are compatible in this way in such a way that the 64 bp fragment can be ligated in the desired orientation relative to the vector, but not in the other orientation with the vector.
  • ligation products are excluded with misoriented insertions, but not the formation of multimers, each with the correct orientation.
  • genes do not lead to the expression of functional sPQQGDH proteins, because there is a frame shift.
  • the resulting ligation product was transformed into E. coli OH5a. From the transformation mixture, 1/25, 4/25 and 20/25 were plated on a 20 cm ⁇ 20 cm agar plate to obtain a colony density of about 1000-5000 colonies per plate at least at one dilution.
  • This example shows the preparation of a library whose clones express sPQQGDH variants with four additional amino acids each.
  • the preparation of libraries with different length of insertion has been carried out in the same way.
  • each individual culture was transferred to a new culture vessel, also in an MTP, in which 150 ⁇ L LB medium with ampicillin was present.
  • MTP LB medium with ampicillin
  • a pipetting robot was used, which performs 96 pipetting operations in parallel.
  • this medium contained 200 ng / mL anhydrotetracycline to induce the expression of the sPQQGDH gene.
  • MTPs were shaken at 28 ° C. overnight. In order to detect the enzyme activity of a large number of colonies, a test was used in which the digestion of the cells is not required.
  • DCPIP dichlorophenolindophenol
  • the glucose test solution contained the following components (in parentheses: final concentration in the assay): 50 mM glucose (30 mM), 750 ⁇ M DCPIP (450 ⁇ M), 1.5 ⁇ M PQQ (0.9 ⁇ M), 1 mM CaCl 2 (0 , 6 mM), 0.1% NaN 3 (0.06%), silicone defoamer (Fluka # 85390) 62.5 ppm (37.5 ppm), 50 mM tris- (hydroxymethyl) -aminomethane-HCl (TRIS-HCl ) pH 7.6 (30 mM). In the case of the maltose test solution, no glucose but maltose was present in the same concentration.
  • Example 3 From a screening as described in Example 3, 188 colonies were selected in which both the activity on glucose and the ratio of activities on glucose and maltose appeared particularly promising, on two new MTPs together with cultures of the parent strain £ .co // - DH5 ⁇ :: pAI3B-KOZ65 and, as described in Example 3, first grown at 37 ° C and then induced at 28 ° C overnight. For induction, two plates of each MTP were applied to get enough culture volume for the screening experiment. After induction, the parallel grown cultures of approximately 200 ⁇ L each were combined and mixed.
  • FIG. 4 shows the result of this follow-up of selected colonies (second screening) for the screening described in example 3.
  • Example 5 Culture of strains expressing variant forms of sPQQGDH Initially, one of four selected colonies of a library with three additional amino acids between each of the positions Q168 and L169 was precultured as follows: 2 mL TB medium (at 100 ⁇ g / mL Ampicillin) were inoculated with the colony to be tested and shaken overnight at 37 0 C and 225 rpm. For the main culture, 50 ml of TB medium (100 ⁇ g / ml ampicillin) were inoculated with the mature preculture. The culture was shaken at 37 ° C. and 225 rpm until an optical density at 605 nm (OD 6 Qs) of about 1 was reached.
  • 2 mL TB medium at 100 ⁇ g / mL Ampicillin
  • 50 ml of TB medium 100 ⁇ g / ml ampicillin
  • anhydrotetracycline (AHT) stock solution was induced by the addition of an anhydrotetracycline (AHT) stock solution.
  • AHT anhydrotetracycline
  • the inductor was dissolved in DMF.
  • the final concentration of AHT in the culture was 0.2 g / ml, the induction was carried out for 24 hours at 27 0 C and 225 rpm.
  • the harvesting of the cells was carried out by centrifugation of the main culture at 3220 xg for 15 min at 4 ° C.
  • the cell sediments were resuspended in 10-20 ml of 50 mM 3-morpholino-propanesulfonic acid buffer (MOPS) pH 7.6 and 2.5 mM CaCl 2 and disrupted by treatment with ultrasound until clear clarification of the cell suspension was detectable , Cell debris and any existing inclusion bodies were centrifuged at 48,745 xg for 10 min at 4 0 C.
  • MOPS 3-morpholino-propanesulfonic acid buffer
  • the supernatants from Example 5 were diluted 1: 5 to 10 or 50 ml with column buffer (10 mM MOPS pH 7.6 + 2.5 mM CaCl 2 ) and dried over a cation exchanger (Toyopearl CM-650M, TOSOH BIOSEP GmbH). separated by chromatography. For this purpose, a 10 x 1.42 cm column with about 16 mL column bed is used; the flow rate was 4 mL / min. The column was equilibrated with 10 column volumes of buffer followed by sample application.
  • column buffer 10 mM MOPS pH 7.6 + 2.5 mM CaCl 2
  • a cation exchanger Toyopearl CM-650M, TOSOH BIOSEP GmbH
  • Nitro blue tetrazolium chloride was prepared separately: 1 1, 7 mL of a solution containing 50 mM PIPES pH 6.5 and 2% Triton X-100 in double distilled (bidist.) Water were added at 450 ⁇ L
  • plasmid DNA was prepared from the respective strain using the QiaPrep Plasmid Isolation Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions and the DNA Sequence at the insertion site from both directions with the primers used oligonucleotides 4472-US1 (5 '-CACCGTTAAAGCTTGGATTATC ⁇ ', SEQ ID 34) and 4831 -DSl (5'-CCTTCATCGAAAGACCATCAG ⁇ 'SEQ ID 35) determined.
  • QiaPrep Plasmid Isolation Kit Qiagen, Hilden
  • flanking amino acids 168Q and 172L are indicated.
  • FIG. 5 shows the result of an interference measurement of five different variants.
  • 5381-06-C12, 5381-05-C4 and 5381-07-F10 are from a library of four additional amino acids, 5152-20-A7 and 5386-13-F10, from a library of five additional amino acids between positions Q168 and L169 .
  • the measurement in none of the clones by more than 8% affected With galactose it is max. 16% and with xylose max. 14% interference.
  • the interference at approximately equimolar amounts (100 mg / dL glucose with 200 mg / dL maltose) has fallen from 63% for KOZ65 to 6% for 5152-20-A7, for lactose the interference is no longer significant.
  • Example 11 Comparison of Variants from Different Libraries
  • libraries of three, four and five additional amino acids were inserted between positions Q168 and L169 of wild-type sPQQGDH from KOZ65 and examines as described in the preceding examples.
  • a library with only two additional amino acids between positions Q 168 and L 169 was created and examined.
  • only ten clones with weak substrate specificity were found (ratio of activities to maltose and glucose between 25 and 75%).
  • Only one clone (5156-13-G12, see Table 4) had increased substrate specificity; but with a lack of spec. Activity on glucose.
  • all libraries with three to five additional amino acids contain clones that have a significantly higher substrate specificity than the wild-type.
  • Figure 1 shows the preparation of a vector for insertion of synthetic DNA fragments. Shown are the positions and orientations (thick black arrows in Ib) of the primers for producing two fragments (PCR 1, PCR 2) from the sPQQGDH gene from KOZ65 (Ia) and the site at which later additional amino acids are to be inserted (" IP "in Ia and I b) Fig.
  • Ic shows schematically the assembly of the vector pAI3B-KOZ65-U (1-2) from the amplified amplicon cleaved with XbaI and EcoO109I and purified from the anterior part of the coding Sequence, the EcoO109I and BfuAI cut and purified amplicon from the middle part of the coding sequence and the Xbal and BfuAI from the starting vector pAI3B-KOZ65 (1-1) cut and purified, 3567 bp vector fragment.
  • the final vector pA13B-KOZ65-U (1-2) is shown in FIG. It can be seen from Fig. Id that translation of sPQQGDH into pAI3B-KOZ65-U stops four amino acid residues after the EcoO109I site when no insertion occurs.
  • Figure 2 shows the preparation of a synthetic, double-stranded piece of DNA from the oligonucleotides described in the text (shown in the figure as arrows, the arrowhead indicates the 3 'end of the sequence, respectively).
  • the lower part shows the oligonucleotides EarV2-Random and EarV2-Lower.
  • the 62 bp primary product is created from these overlapping single strands.
  • the oligonucleotides EarV2-UpAmp and EarV2-LoAmp are used to prepare the 97 bp PCR product whose DNA sequence is shown in the upper part.
  • the encoded protein sequence is found at the bottom of Fig. 2.
  • the location of the two Earl interfaces is shown.
  • the 64 bp fragment released with Earl from the PCR product is ligated into the EcoO109I opened vector.
  • FIG. 3 shows the summary of the data from the screening of a library of variant sPQQGDH clones on the example of two microtiter plates (a and b).
  • abscissa for each colony of an MTP, the approximate velocity is given in arbitrary relative units, with which glucose is transferred from this colony.
  • Y-axis On the ordinate (Y-axis), the quotient of maltose and glucose conversion is plotted. This makes it possible to assess for each colony whether it is able to convert glucose and, if so, whether it allows a better distinction between glucose and maltose than the wild-type KOZ65.
  • Al - H 12 As a symbol of each colony their position on the respective microtiter plate was used, Al - H 12.
  • the positive control KOZ65 is marked with arrows.
  • Figure 4 shows the results of the colonies selected from the screening described in Example 3. Three parameters are considered: the conversion rate to glucose, which is not shown on this picture, should be as high as possible; the interference (here for maltose as interfering sugar) plotted on the abscissa (X axis) should be as close as possible to zero, as is the ratio of maltose to glucose conversion plotted on the ordinate (Y axis). For comparison, some clones in Figs. 3 and 4 are marked in the same way.
  • Figure 5 shows interference studies of various clones with maltose (a), galactose (b) and xylose (c). Shown is the behavior for five purified, variant sPQQGDH preparations Mixtures of glucose and three other sugars. Plotted on the ordinate (Y axis) are the determined interference for mixtures of 100 mg / dL glucose in the measurement batch without further sugar and with 50, 100, 150, 200 or 250 mg / dL (X-axis) of the respective interfering sugar. Each measurement point was determined as a quadruplicate.
  • Figure 6 shows interference studies for KOZ65 (left) and clone 5152-20-A7 (right) on different sugars.
  • a cellobiose
  • b galactose
  • c lactose
  • d maltose
  • e mannose
  • xylose xylose
  • Each measurement series for an interfering sugar also includes a measurement without this sugar, which, like all the other measurements in the series, was based on a glucose value averaged from all measurements without interfering sugars. Due to the inaccuracy of measurement in enzymatic tests, therefore, the individual graphs do not necessarily start from zero, which theoretically should be the case.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige PQQ abhängige lösliche Glukose Dehydrogenasen (sPQQGDH), die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Substratspezifität aufweisen, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Identifikation.

Description

Neuartige Varianten PQQ-abhängiger Glukosedehydrogenase mit verbesserter Substratspezifität
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind PQQ-abhängige Glukosedehydrogenasen (sPQQGDH), Verfahren zur ihrer Herstellung und Identifikation, Gene, welche die erfindungsgemäßen sPQQGDH kodieren, Vektoren zur Herstellung der Gene, sowie Glukosesensoren umfassend eine erfindungsgemäße Glukosedehydrogenase.
Die enzymatische Bestimmung von Glukose hat in der medizinischen Diagnostik eine große Bedeutung. Hier ist der Nachweis von Glukose im Harn oder im Blut zur Feststellung bzw. Verlaufskontrolle von Stoffwechselerkrankungen notwendig. Bei Diabetes mellitus, der Zuckerkrankheit, ist es unter Umständen erforderlich, die Blutzuckerkonzentration mehrmals täglich zu bestimmen. Dies erfolgt bei der überwiegenden Zahl der auf dem Markt befindlichen Messgeräte mit einem enzymatischen Verfahren, bei dem Glukose oxidiert wird und der dabei entstehende Wasserstoff (2 H+ und 2 e") amperometrisch quantifiziert wird (P. Vadgama, J.Med.Eng Technol. 5 [6], 293-298 (1981), K.S. Chua und LK. Tan, Clin.Chem. 24 [1], 150-152 (1978)).
Es gibt einige unterschiedliche Enzyme, die für diesen Zweck geeignet sind, die aber mit verschiedenen Kofaktoren zur primären Aufnahme der Elektronen arbeiten und auch unterschiedliche bio- chemische Eigenschaften aufweisen wie Spezifität, Stabilität oder Umsatzrate. Die Umsatzrate eines Enzyms wird üblicherweise in Aktivitätseinheiten (U) angegeben; bei Glukose-oxidierenden Enzymen bezeichnet die spezifische Aktivität (U/mg) üblicherweise die Menge an Glukose in Mikromol, die von einem Milligramm Enzym pro Minute unter festgelegten Reaktionsbedingungen oxidiert wird.
Häufig verwendete Enzyme sind Glukosedehydrogenasen (GDH). Im Fall der NAD(P)+- abhängigen GDH ist der Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) oder Nicotinamid- adenin-dinukleotidphosphat (NADP+) (H. E. Pauly und G. Pßeiderer, Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 356 [10], 1613-1623 (1975)), beides recht instabile Verbindungen, die der Reaktion zugesetzt werden müssen, da sie nicht an das Enzym gebunden sind.
Eine weitere Klasse von Glukosedehydrogenasen enthält als Elektronenakzeptor im Enzym gebundenes Pyrrolochinolinchinon (PQQ). Es wurden zwei strukturell voneinander verschiedene Glukosedehydrogenasen dieses Typs beschrieben, eine Membran-verankerte Form mPQQGDH (A.M Cleton-Jansen et al, J. Bacteriol. 170 [5], 2121-2125 (1988)) und eine kleinere, lösliche Form sPQQGDH (A.M. Cleton-Jansen et al., Mol.Gen.Genet. 217 [2-3], 430-436 (1989)). Letztere ist aufgrund ihrer hohen spez. Aktivität, ihrer Unempfindlichkeit gegenüber Sauerstoff und des fest gebundenen, stabilen Kofaktors ein Enzym, was zur Herstellung von Testsystemen zur Glukosebestimmung besonders geeignet ist. In etlichen kommerziellen Blutzuckermessgeräten kommt daher dieses Enzym zum Einsatz, ungeachtet einer geringeren Substratspezifität, die dieses Enzym im Vergleich zu den anderen genannten Enzymen aufweist. Aufgrund der letztgenannten Einschränkung wäre es natürlich wünschenswert, Varianten dieses Enzyms zur Verfügung zu haben, die eine höhere Substratspezifität besitzen.
Außer dem Substrat Glukose setzt die sPQQGDH auch andere Zucker zum entsprechenden Lakton um, vorzugsweise Disaccharide, deren reduzierender Zucker die Glukose ist, aber auch andere reduzierende Zucker. Da solche Zucker im menschlichen Blut normalerweise nicht vorkommen, liefert ein Enzymtest auf Basis der sPQQGDH in der Regel ein der Glukosekonzentration entsprechendes Ergebnis. Im Rahmen bestimmter medizinischer Therapien werden aber Stoffe verabreicht, zu deren Abbauprodukten Maltose gehört, die von der sPQQGDH oxidiert wird und damit unerwünschterweise zum Messergebnis beiträgt (T. G. Schleis, Pharmacotherapy 27 [9], 1313-1321 (2007)). Bei der Gabe von Xylose und Galaktose bei diagnostischen Verfahren oder als Zuschlagstoff zu Medikamenten werden diese Zucker selbst miterfasst. Es ist daher sinnvoll, diese Nebenaktivitäten der sPQQGDH auf geeignete Weise zu unterdrücken.
In der Literatur und auch in Patentschriften sind einige Versuche beschrieben, die Substratspezifität der sPQQGDH durch Einführung von Mutationen zu verbessern (S. Igarashi et al, Biomol. Eng 21 [2], 81-89 (2004)). Dazu wurden einzelne Aminosäuren im Bereich des kataly- tischen Zentrums (EP1666586A1 ) aber auch an anderen Stellen des Enzyms (US7132270B2) durch gezielte Mutagenese gegen andere Aminosäuren ausgetauscht oder einzelne Aminosäuren durch Insertion hinzugefügt (EPl 367120A2). Es werden darüber hinaus Kombinationen verschiedener Mutationen beschrieben (EP1666586A1, US7132270B2). Desweiteren wurden Varianten beschrieben, bei denen an einer Stelle der sPQQGDH zwei Aminosäuren eingefügt wurden. Allerdings konnten dadurch keine signifikanten Verbesserungen der Substratspezifität erzielt werden (WO2006085509).
Trotz dieser Ergebnisse besteht weiterhin Bedarf für Varianten der sPQQGDH, da bislang noch keine Varianten beschrieben wurden, die bei ausreichend hoher Reaktivität mit Glukose eine genügende Diskriminierung zwischen Glukose und anderen Zuckern erlauben. Wichtig ist hierbei insbesondere die Fähigkeit des Enzyms, auch beim Vorliegen einer Mischung aus Glukose und anderen Zuckern die Glukosekonzentration zuverlässig bestimmbar zu machen. Keine der beschriebenen Varianten zeigt diese Eigenschaft in ausreichendem Maß. Ausgehend vom Stand der Technik stellt sich damit die Aufgabe, Glukosedehydrogenasen bereitzustellen, die eine zuverlässige Bestimmung von Glukose auch beim Vorliegen einer Mischung aus Glukose und anderen Zuckern ermöglichen. Es stellt sich insbesondere die Aufgabe, Glukosedehydrogenasen bereitzustellen, mit denen Glukose in Gegenwart von Maltose zuverlässig bestimmt werden kann. Ferner stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem solche Glukosedehydrogenasen hergestellt und identifiziert werden können, die besonders zur Glukosebestimmung in Gegenwart von anderen Zuckern, insbesondere in Gegenwart von Maltose geeignet sind.
Überraschend wurde gefunden, dass sPQQ-Glukosedehydrogenasen, bei denen im Bereich der Substratbinderegion drei bis fünf Aminosäuren insertiert sind, eine gegenüber der Ausgangsform des Enzyms verbesserte Glukosespezifität aufweisen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher sPQQ-Glukosedehydrogenasen mit einer gegenüber der Ausgangsform des Enzyms verbesserten Glukosespezifität, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Bereich der Substratbinderegion drei bis fünf Aminosäuren insertiert sind.
Die erfindungsgemäßen sPQQGDH können über Gene kodiert werden, die durch Mutagenese aus in der Natur vorkommenden, beschriebenen Wildtypstämmen wie Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41 (K. Kojima K. et al, Biotechnology Letters 22, 1343-1347 (2000)) sowie weiteren Stämmen der Gattung Acinetobacter (PJ. Bouvet PJ. und O. M. Bouvet, Res. Microbiol. 140 [8], 531-540 (1989)), insbesondere solchen, die sich durch erhöhte Thermostabi lität auszeichnen wie die in EP 1623025 Al beschriebenen Acinetobacter sp. Stämme, gewonnen werden. Bevorzugte Stämme sind die in EP 1623025 Al beschriebenen Acinetobacter sp. Stämme PT 16, KOZ62, KOZ65, PTN69, KG 106, PTN26, PTl 5, KGN80, KG 140, KGN34, KGN25 und KGN 100; besonders bevorzugt ist der Stamm KOZ65.
Um die erfindungsgemäßen sPQQGDH gewinnen zu können, muss in einem solchermaßen geeigneten sPQQGDH-Gen eine Insertion von Codons an der der Substratbindestelle entsprechenden Position erfolgen. Die räumliche Struktur einiger sPQQGDH ist bekannt und in öffentlichen Datenbanken hinterlegt (A. Oubrie et al, J. Mol. Biol. 289 [2], 319-333 (1999); A. Oubrie et al, EMBO J. 18 [19], 5187-5194 (1999)). Somit kann die Entfernung einzelner Aminosäurepositionen zum gebundenen Substrat abgeschätzt werden. Solche Abschätzungen sind beispielsweise mit Visualierungsprogrammen für Proteine wie dem Software-Programm Cn3D möglich, das im Internet verfügbar ist (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml). Die Sequenz der veröffentlichten Röntgenstruktur basiert auf der sPQQGDH aus Acinetobacter calcoaceticus, die 455 Aminosäuren lang ist. Die Ausgangsform der besonders bevorzugten sPQQGDH aus dem Stamm KOZ65 besitzt 456 Aminosäuren, wie auch das Enzym aus Acinetobacter baumannii. Dafür ist in beiden Fällen ein zusätzlicher Glutaminrest hinter der Position 289 verantwortlich. Im Folgenden beziehen sich Angaben zur Position von einzelnen Amino- säuren aber dennoch auf die kürzere, in der Röntgenstruktur verwendete Sequenz der sPQQGDH aus dem Stamm Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41. Die dort befindliche Aminosäure wird vor der Position im Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren angegeben.
Für eine Mutagenese bevorzugt sind Aminosäurebereiche, deren Abstände zum Substrat nicht mehr als 5 Ängstrom betragen, wie z.B. die Positionen Q76, D143, Q168, Y343 und die jeweils benachbarten Aminosäurereste. So kann beispielsweise vor oder nach einer der angegebenen
Positionen eine Insertion von drei oder mehr Aminosäuren vorgenommen werden, um die räumliche Beschaffenheit der Substratbindestelle zu verändern. Besonders bevorzugt ist eine
Insertion zusätzlicher Aminosäuren zwischen den Positionen Q 168 und Ll 69. Varianten von KOZ65 mit Insertionen an dieser Stelle zeigten überraschenderweise zu einem großen Anteil deutlich verringerte Aktivität auf Maltose im Vergleich zu Glukose. Besonders bevorzugt sind sPQQGDH mit den in der Tabelle 1 aufgeführten Insertionssequenzen zwischen den Positionen
Q168 und L169. Zum Vergleich ist in der ersten Zeile der Wildtyp angegeben. Die erfindungsgemäßen sPQQGDH zeichnen sich wie in der Tabelle 1 dargestellt durch eine erhöhte Substratspezifität (geringeres Verhältnis Maltose/Glukose und geringerer Betrag der Interferenz von Glukose in einer Glukose/Maltose-Mischung) aus.
Tabelle 1:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung und Identifikation von sPQQGDH, die gegenüber dem Wildtyp erhöhte Substratspezifität zeigen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt mittels lokaler Zufallsmutagenese die Erzeugung einer Vielzahl von Varianten, mit drei, vier, fünf oder mehr insertierten Aminosäuren an einer gewünschten Stelle der sPQQGDH-Sequenz. Die erzeugten Enzyme werden einem Screening hinsichtlich der Substratspezifität unterzogen und die besten Varianten ausgewählt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt ein Vektor hergestellt wird, bei dem ein geeigneter Sequenzbereich vor und hinter der gewünschten
Insertionsstelle deletiert wurde und durch eine für diesen Vektor singuläre Restriktionsschnittstelle ersetzt wurde. In Vektor-DNA, die mit diesem Restriktionsenzym geöffnet wird, werden in einem zweiten Schritt doppelsträngige, mittels PCR-Amplifikation hergestellte Oligonukleotidsequenzen insertiert, welche außer der im Vektor deletierten Sequenz die gewünschte Insertion enthalten, sodass ein Genprodukt entsteht, welches hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz keine weiteren
Veränderungen als die Insertion von drei oder mehr Aminosäuren an der gewünschten Stelle enthält. Das mittels PCR aus synthetischen Oligonukleotiden hergestellte, zu inserierende
Doppelstrangfragment enthält dabei die drei oder mehr zusätzlichen, randomisierten Codons zur
Veränderung der Substratspezifität, aber auch die Codons, die in dem Vektor deletiert wurden. Es wurden dazu die Codons ausgewählt, die sich in E. coli besonders gut exprimieren lassen. Die
Nukleotidsequenz weicht daher neben dem Insertionsbereich von der des sPQQGDH-Gens aus
KOZ65 ab, nicht aber die Aminosäuresequenz.
Bei der Insertion von drei zusätzlichen Aminosäuren sind 8000 Enzymvarianten denkbar, bei vier zusätzlichen Aminosäuren sind es 160.000 und bei fünf zusätzlichen Aminosäuren sind es 3,2 Millionen Varianten. Bei der Synthese der mutagenen Oligonukleotide können daher neben völlig randomisierten Sequenzen solche verwendet werden, die an einigen oder allen Positionen degenerierte Codons für die jeweils zu inserierenden Aminosäuren enthalten. Das kann dazu genutzt werden, um die Zahl der Möglichkeiten insgesamt zu reduzieren, um Stop-Codons zu vermeiden oder um einzelne Aminosäuren an bestimmten Positionen zu bevorzugen.
In einem dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden rekombinante Vektoren, die auf die oben beschriebene Weise hergestellt wurden, in geeignete Wirtsbakterien transformiert und die Wirtsbakterien in einem geeigneten Nährmedium vermehrt. Die Methoden zur Klonierung von Genen aus Mikroorganismen und ihrer Ausprägung in einem anderen Wirt sowie die Techniken zur Isolierung und Veränderung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Molecular Cloning - A Lab oratory Manual; Vol. 1; Sambrook, J. und Rüssel, D. W.; 3. Auflage, CSHL Press 2001). Ebenso sind die Anzucht von Mikroorganismen und die Aufreinigung von rekombinanten Enzymen daraus Stand der Technik (siehe ebenda; Vol. 3).
In einem vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Bakterienkolonien hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber verschiedenen Zuckern getestet und dabei die besten identifiziert. Erfindungsgemäß erfolgt hierbei nicht nur ein Test hinsichtlich der Aktivität gegenüber den einzelnen Zuckern sondern auch hinsichtlich der Interferenz von verschiedenen Zuckern.
Die Aktivitäten können als spezifische Aktivitäten, d.h. Umsatzraten, die von einer definierten Menge an Enzym pro Zeiteinheit umgesetzt werden, bestimmt werden. Bei Glukose-oxidierenden Enzymen bezeichnet die spezifische Aktivität (U/mg) üblicherweise die Menge an Glukose in Mikromol, die von einem Milligramm Enzym pro Minute unter festgelegten Reaktionsbedingungen oxidiert wird. Dabei liegt Glukose in der Regel im Überschuss gegenüber dem Enzym vor, um den Einfluss der Glukosekonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit zu eliminieren. Die Ermittlung der Umsatzrate geschieht durch zeitliche Verfolgung des Abbaus eines Edukts oder der Bildung eines Produkts. Die zeitliche Verfolgung kann z.B. photometrisch erfolgen. Zur Ermittlung von Reaktionsgeschwindigkeiten und Umsatzraten sei auf Lehrbücher der Physikalischen Chemie (z.B. Peter Atkins, Physical Chemistry, W. H. Freeman & Co; 7. Auflage, 2002) verwiesen.
Zunächst werden die einzelnen Kolonien geteilt und ein Enzymtest (Ermittlung der spezifischen Aktivität) mit Glukose als Substrat und ein zweiter Enzymtest mit einem zweiten Zucker, z.B.
Maltose als Substrat durchgeführt. Bei den Kolonien mit den höchsten Aktivitäten gegenüber Glukose bei gleichzeitig geringsten Aktivitäten gegenüber dem zweiten Zucker (z.B. Maltose) wird auch die Aktivität gegenüber einer Mischung von Glukose und dem zweiten Zucker (z.B. Maltose) bestimmt. Es stellte sich nämlich bei der Untersuchung einiger Varianten mit sehr geringer relativer Reaktivität auf Maltose als einzigem Substrat überraschenderweise heraus, dass diese Eigenschaft einer Variante nicht zwingend mit einer unabhängigen Eigenschaft, nämlich der verlässlichen Diskriminierung von Glukose und Maltose einhergeht, wenn beide Zucker als Mischung vorliegen. Dabei kann es sowohl zur Überschätzung als auch zur Unterschätzung der in dieser Mischung vorhandenen Glukosekonzentration kommen. Bei der Suche nach Enzymen, die zur Bestimmung von Glukosekonzentrationen in Messproben eingesetzt werden sollen, ist daher eine hohe Glukosespezifität auf Mischungen von Glukose und anderen Zuckern von entscheidender Bedeutung, oder anders formuliert, eine möglichst geringe Interferenz des betreffenden Zuckers. Die Interferenz eines Zuckers berechnet sich aus der Enzymaktivität, die auf einer Mischung von Glukose und interferierendem Zucker gemessen wird, abzüglich der Aktivität, die auf der gleichen Konzentration Glukose allein gemessen wird, normalisiert auf diese Glukoseaktivität (siehe Gl. 1 ).
j V Mischung — V Referenz ,f^ < . >.
~ V Referenz
In Gleichung 1 bedeutet / die Interferenz von Glukose mit einem anderen Zucker, VRφren: die Geschwindigkeit, mit welcher Glukose durch das betrachtete Enzym abgebaut wird und VMiscnung die Geschwindigkeit, mit welcher Glukose in einer Mischung mit dem jeweiligen anderen Zucker abgebaut wird. Die Geschwindigkeiten können z.B. photometrisch bestimmt werden (siehe hierzu Beispiele 3, 4, 7 und 9).
Positive Werte bedeuten in diesem Zusammenhang, dass die Enzymaktivität auf einer Mischung höher ist als auf Glukose allein; also offenbar beide Zucker oxidiert werden. Negative Werte können dahingehend interpretiert werden, dass der interferierende Zucker zwar auch oxidiert wird, aber die Aktivität des Enzyms für Glukose dadurch herabgesetzt wird. Beide Effekte sind für ein Enzym, das zur spezifischen Quantifizierung von Glukose verwendet werden soll, unerwünscht.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Varianten der sPQQGDH herstellen und identifizieren, deren Substratspezifität gegenüber der Ausgangsform des Enzyms verändert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich auch dahingehend modifizieren und/oder erweitern, dass anstelle der Substratspezifität oder zusätzlich dazu andere biochemische Eigenschaften wie z.B. Thermostabilität getestet und damit gegenüber der Ausgangform verbesserte Varianten hinsichtlich der anderen biochemischen Eigenschaften identifiziert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht so, Varianten der sPQQGDH mit besonders vorteilhaften Eigenschaften auszuwählen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind zudem Gene, welche die erfindungsgemäßen sPQQGDH kodieren, und Vektoren zur Erzeugung der Gene.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Glukose-Sensor umfassend eine erfindungsgemäße sPQQGDH zur Bestimmung von Glukose. Der Aufbau und die Funktionsweise von Glukose-Sensoren auf Basis von Glukose-Dehydrogenasen sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z.B. EPl 146332 Al). Danach umfasst ein solcher Glukose-Sensor ein Elektrodensystem aus einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode auf einer isolierenden Platte, auf das eine enzymatische Reaktionsschicht aufgebracht ist, die eine Glukose-Dehydrogenase und einen Elektronenakzeptor in Kontakt mit dem Elektrodensystem beinhaltet.
Geeignete Arbeitselektroden schließen Kohle, Gold, Platin und ähnliche Elektroden ein, auf denen ein erfindungsgemäßes Enzym mittels quervernetzendem Agens immobilisiert wird: Einbettung in eine Polymermatrix, Ummanteln mit einer Dialysemembran, Verwendung eines photovernetzbaren Polymers, eines elektrisch leitfahigen Polymers oder eines Redoxpolymerisats, Fixieren des Enzyms in einem Polymer oder Adsorbieren auf der Elektrode mit einem Elektronen vermittler einschließlich Ferrocen oder dessen Abkömmlinge oder eine beliebige Kombination davon. Erfindungsgemäße sPQQGDH werden vorzugsweise in Form eines Holoenzyms auf der Elektrode immobilisiert, obwohl sie auch als Apoenzym immobilisiert werden können und PQQ als eine separate Schicht oder in einer Lösung bereitgestellt wird. Üblicherweise werden erfindungsgemäße sPQQGDH auf einer Kohleelektrode mit Glutaraldehyd immobilisiert und dann mit einem aminhaltigen Reagens behandelt, um das Glutaraldehyd zu blockieren. Als Gegenelektrode kann z.B. eine Platinelektrode und als Referenzelektrode z.B. eine Ag/AgCI-Elektrode verwendet werden.
Die Glukosemenge können folgendermaßen gemessen werden: PQQ, CaCl2 und ein Mediator werden in eine Thermostatzelle, die einen Puffer enthält, gegeben und bei einer konstanten Temperatur belassen. Geeignete Mediatoren schließen zum Beispiel Kaliumferricyanid und Phenazinmethasulfat ein. Eine Elektrode, auf der eine erfindungsgemäße sPQQGDH immobilisiert worden ist, wird als Arbeitselektrode in Kombination mit einer Gegenelektrode (z.B. eine Platinelektrode) und einer Referenzelektrode (z.B. Ag/AgCI-Elektrode) verwendet. Nachdem zum Aufbau eines stationären Stroms an die Arbeitselektrode eine konstante Spannung angelegt worden ist, wird eine glukosehaltige Probe zugegeben, um das Ansteigen der Stromstärke zu messen. Die Glukosemenge der Probe kann von einer Eichkurve, die mit Glukoselösungen in Standardkonzentrationen erstellt wurde, abgelesen werden.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher ausgeführt ohne sie jedoch auf die Beispiele zu beschränken.
Beispiele
Die in den folgenden Beispielen aufgeführten Chemikalien sind käuflich erhältlich, z.B. bei der Fa. Sigma-Aldrich, bzw. bei den jeweils angegebenen Firmen.
Beispiel 1: Herstellung eines Vektors zur Insertion von zusätzlichen Aminosäuren zwischen Q168 und L169
Für die Herstellung von erfindungsgemäßen Varianten muss ein Gen für eine sPQQGDH in einem Expressionsplasmid zur Verfügung stehen, das in Mikroorganismen vermehrt werden kann, die induzierte Ausprägung der sPQQGDH gestattet und das zur Durchführung der gewünschten Mutationen verwendet werden kann. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Plasmiden und Mikroorganismen bekannt, die für diesen Zweck eingesetzt werden können. In diesem und allen weiteren Beispielen wurde ein Konstrukt auf der Basis des kommerziell erhältlichen Vektors pASK-IBA3 (IBA GmbH, Göttingen) verwendet. In pASK-IBA3 wurde das sPQQGDH-Gen aus dem Stamm Acinetobacter sp. KOZ65 in folgender Weise kloniert. Aus genomischer DNA von Acinetobacter sp. KOZ65 wurde mit den beiden Oligonukleotiden GDH-U3 (5'- TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGC TAAAATTAC-3'; SEQ ID 19) und GDH- L5 (5 '-TTCAGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATC-S '; SEQ ID 20), mit Hilfe einer PCR- Reaktion (Phusion DNA Polymerase, Finnzymes Oy) nach den Angaben des Herstellers ein 1 ,46 kb langes DNA-Fragment generiert. Das Fragment wurde gereinigt und anschließend mit dem Restriktionsenzym Bsal inkubiert. Der Vektor pASK-IBA3 wurde mit dem Restriktionsenzym Hindlll geöffnet. Das Restriktionsenzym wurde durch Hitzebehandlung denaturiert und die entstandenen DNA-Überhänge wurden mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von dATP, dCTP, dGTP und dTTP aufgefüllt. Anschließend wurde die DNA gereinigt und mit dem Restriktionsenzym Bsal inkubiert. Das so freigesetzte, 1 14 bp lange Fragment wurde verworfen; in das 3,1 kb große Vektorfragment wurde das PCR-Amplifikat mit dem sPQQGDH-Gen aus KOZ65 ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in transformations-kompetente Zellen des E.coli Stamms DH5α transformiert. Der auf diese Weise hergestellte Vektor pAI3B-KOZ65 ist zur induzierbaren Expression von sPQQGDH des Typs KOZ65 geeignet. Die Nukleotidsequenz des Vektors pAI3B- KOZ65 ist unter SEQ ID 21 angegeben, die Aminosäuresequenz des davon kodierten sPQQGDH unter SEQ ID 22.
Um drei oder mehr Aminosäuren zwischen Q 168 und L 169 einfügen zu können wurde zunächst der Vektor pAI3B-KOZ65-U hergestellt. Dazu wurde Plasmid-DNA des Vektors pAI3B-KOZ65 als Matrize für eine PCR-Amplifikation A mit den Primern IBA-For (5'- TAGAGTTATTTTACCACTCCCT-3'; SEQ ID 23) und Ecol09-Up (5'- GGTTAGGTCCCTGATCACCAATCG-3'; SEQ ID 24) sowie eine PCR-Amplifikation B mit den Primern BfuA-US l (5 '-CACAGGTACACCTGCCGCCACT-S ' ; SEQ ID 25) und Ecol 09-Down (5 '-TACGAGGACCCAACAGGAACTGAGC-S ' ; SEQ ID 26) verwendet. Das aus A entstandene Amplifϊkat wurde gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoO109I geschnitten. Das dabei entstehende, 588 Basenpaare (bp) große Fragment wurde isoliert. Das aus B entstandene Amplifikat wurde gereinigt und mit den Restriktionsenzymen BfuAI und EcoO109I geschnitten. Das dabei entstehende, 353 bp große Fragment wurde ebenfalls isoliert. Der Vektor pAI3B- KOZ65 wurde mit den Restriktionsenzymen BfuAI und Xbal geschnitten. Das dabei entstehende, 3567 bp große Fragment wurde über ein Agarosegel isoliert. Für die dargestellten Arbeitsschritte wurden Kits und Reagenzien der Firmen New England Biolabs GmbH (Frankfurt), Invitrogen (Karlsruhe), Qiagen (Hilden) und Roche Diagnostics (Mannheim) nach den Angaben der Hersteller verwendet. Darüber hinaus gehende Methoden wurden der Methodensammlung von Sambrook und Russell (Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Sambrook, J. und Rüssel, D. W.; 3. Auflage, CSHL Press 2001) entnommen.
Die drei Fragmente wurden anschließend ligiert und durch chemische Transformation in E.coli- DH5α übertragen. Von 12 Kolonien wurde Plasmid-DNA präpariert und durch geeignete Restriktionsverdaus daraufhin überprüft, ob das gewünschte Plasmid entstanden war, was bei 9 Isolaten der Fall war. Durch Sequenzierung von vier dieser Klone wurde bestätigt, dass in allen Fällen keine weiteren als die in Figur I e dargestellten Veränderungen stattgefunden haben.
Der Vektor pAI3B-KOZ65-U (SEQ ID 27) enthält nun eine singuläre EcoO109I- Restriktionsschnittstelle (RG'GNCCY). EcoO109I erzeugt 3 bp lange 5 '-Überhänge, in denen das mittlere Nukleotid beliebig ist; bei pAI3B-KOZ65-U ist es ein A auf dem kodierenden Strang. Die für die Aminosäuren R166 bis Pl 82 kodierende DNA sowie ein weiteres Nukleotid sind in pAI3B- KOZ65-U deletiert, was zu einer Leserasterverschiebung führt. Der Versuch, dieses Gen auszuprägen führt daher zu einem verkürzten Polypeptid ohne Funktion (SEQ ID 28). Der Vektor ist für die Aufnahme von synthetischen, doppelsträngigen DNA-Fragmenten geeignet, die zur Wiederherstellung eines funktionsfähigen sPQQGDH-Gens mit Insertionen zwischen den Positionen Q 168 und L 169 führen, wie in Beispiel 2 näher beschrieben.
Beispiel 2 - Herstellung von sPQQGDH-Insertionsmutanten Zur Herstellung von Insertionsmutanten mit vier zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen Q 168 und L 169 wurden vier synthetische Oligonukleotide benutzt: EarV2-Random (5'- CGACGTAACCAGNNKNNKNNKNNKCTGGCTTACCTG-3'; SEQ ID 29), EarV2-Lower (5'- GTGTGCTGTGCCTGGTTCGGCAGGAACAGGTAAGCCAG-3'; SEQ ID 30), EarV2-UpAmp (5 '-CCTACCTACGACTCTTCCGACGTAACCAG-S ' ; SEQ ID 31) und EarV2-LoAmp (5'- CCATGCTCTTCAGTCGGAGTGTGCTGTGCC-3'; SEQ ID 32). In Fig. 2 ist die Strategie zur Herstellung eines doppelsträngigen Insertionsfragments aus diesen Oligonukleotiden schematisch dargestellt. Die Sequenz der vier einzufugenden Aminosäuren ist in diesem Fall randomisiert: NNK NNK NNK NNK. N steht dabei fϋr eine Mischung aller vier Nukleotide (dATP (A), dCTP (C), dGTP (G), dTTP (T)) bei der Synthese des Oligonukleotids an der jeweiligen Position, während K für G oder T steht. Mit der Sequenz NNK sind Codons für alle 20 Aminosäuren möglich aber nur für eines der drei Stopcodons, was die Wahrscheinlichkeit unvollständiger Genprodukte verringert. Andere Kombinationen von Nukleotiden an den einzelnen Positionen sind frei wählbar, um z.B. die möglichen Aminosäuren an einer Codonposition einzuschränken. Oligonukleotid EarV2-Random enthält die kodierende Sequenz von Rl 66 bis Ll 72, das den Gegenstrang darstellende Oligonukleotid EarV2-Lower überlappt im Bereich Ll 69 bis Ll 72 und reicht bis Tl 81. Oligonukleotid EarV2-UpAmp überlappt für 12 bp am 3 '-Ende mit dem 5 '-Ende von Oligonukleotid EarV2-Random während Oligonukleotid EarV2-LoAmp am 3 '-Ende mit dem 5'-Ende von Oligonukleotid EarV2-Lower für ebenfalls 12 bp überlappt. Die beiden letztgenannten Oligonukleotide enthalten jeweils eine Earl-Schnittstelle (CTCTTCN 'NNN).
Zunächst wurden die Oligonukleotide EarV2-Random und EarV2-Lower in Gegenwart von 10 mM Tris-HCl pH 7,9 bei 25 0C, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (Puffer NEB2) in einer PCR-Maschine (GeneAmp 9600, Perkin-Elmer) auf 90 0C aufgeheizt und über 5 min auf 10 0C abgekühlt. Die dadurch gebildeten, teilweise doppelsträngigen DNA-Stücke wurden nach Zugabe aller vier DNA-Nukleotide und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aus E.coli durch Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur zu kompletten Doppel strängen aufsynthetisiert. Danach wurde die Reaktionsmischung in eine PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden EarV2- UpAmp und EarV2-LoAmp eingesetzt, um den erhaltenen Doppelstrang zu amplifizieren. Da die Überlappung der amplifizierenden Oligonukleotiden EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp zum neu gebildeten Doppelstrang nur jeweils 12 bp beträgt, wurden die ersten beiden Amplifikationszyklen nicht mit der thermostabilen Polymerase des PCR-Kits sondern mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aus E.coli durchgeführt, um die Bindung der als Primer eingesetzten Oligonukleotiden EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp zu erhalten. Dazu wurde der Ansatz für 1 min auf 94 0C gebracht und anschließend auf Eis gesetzt. Dann wurde 1 μL DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) zugegeben und für 3 min bei 18°C und 1 min bei 25°C inkubiert. Danach wurde der Ansatz erneut für 1 min auf 94°C gebracht und anschließend auf Eis gesetzt, 1 μL DNA- Polymerase (Klenow-Fragment) zugegeben und für 3 min bei 18°C und 1 min bei 25°C inkubiert. Erst dann wurde in der PCR-Maschine folgendes Amplifikationsprogramm durchgeführt (20 Zyklen): 1 min 94 0C, 1 min 52 0C, 1 min 72°C.
Nach der PCR-Amplifikation wurde die Reaktion über Säulenchromatographie gereinigt (PCR- Purification Kit, Qiagen) und mit Earl geschnitten. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend auf einem Agarosegel (4 % Agarose) aufgetrennt und das gewünschte 64 bp-Fragment (SEQ ID 33) wurde aus dem Gel isoliert und gereinigt.
Der in Beispiel 1 beschriebene Vektor pAI3B-KOZ65-U wurde mit EcoO109I geschnitten und an- schließend mit alkalischer Phosphatase nach Herstellerangaben (New England Biolabs) dephosphoryliert um Rezirkularisierung des Vektors zu verhindern. Anschließend wurden das 64 bp-Fragment und der dephosphorylierte, mit EcoO109I linearisierte Vektor im Verhältnis 5 zu 1 über Nacht bei 16 0C ligiert. Die von EcoO109I und Earl gebildeten 5 '-Überhänge sind dabei in der Weise kompatibel, dass das 64 bp-Fragment in der gewünschten Orientierung relativ zum Vektor, nicht aber in der anderen Orientierung mit dem Vektor ligiert werden kann. Damit sind Ligationsprodukte mit falsch orientierten Insertionen ausgeschlossen, nicht aber die Bildung von Multimeren mit jeweils der richtigen Orientierung. Derartige Gene führen aber nicht zur Ausprägung funktionaler sPQQGDH Proteine, weil dabei eine Leserasterverschiebung auftritt. Das entstandene Ligationsprodukt wurde in E.coli-OH5a transformiert. Vom Transformationsansatz wurden 1/25, 4/25 und 20/25 auf je eine 20 cm x 20 cm große Agarplatte ausplattiert um bei wenigstens einer Verdünnung eine Koloniedichte von etwa 1000 - 5.000 Kolonien pro Platte zu erzielen.
In diesem Beispiel wird die Herstellung einer Bibliothek dargestellt, deren Klone sPQQGDH- Varianten mit jeweils vier zusätzlichen Aminosäuren ausprägen. Die Herstellung von Bibliotheken mit anderer Länge der Insertion ist in gleicher Weise durchgeführt worden.
Beispiel 3 - Screening einer Varianten-Bibliothek
Zur Auswahl von geeigneten Varianten aus einer nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellten Bibliothek wurden von zwei Agarplatten mit insgesamt ca. 4000 Kolonien mit Hilfe eines Kolonie-Pick-Automaten QPix (Fa. Genetix) 2200 Kolonien aufgenommen und in Mikrotiterplatten (MTP) mit jeweils 200 μL LB-Medium mit Ampicillin ad 100 μg/mL pro Gefäß (Well) übertragen. Zusätzlich wurden auf 4 MTP insgesamt acht Wells mit Kulturen des Ausgangsstamms £.co//-DH5α::pAI3B-KOZ65 angeimpft. Die MTP wurden mit einer gasdurchlässigen Folie (Airpore Sheets, Qiagen) verschlossen und für 5 h bei 37 0C geschüttelt. Anschließend wurden 50 μL von jeder Einzelkultur in ein neues Kulturgefäß, ebenfalls in einer MTP, übertragen, in dem 150 μL LB-Medium mit Ampicillin vorlagen. Dazu wurde ein Pipettierroboter benutzt, der 96 Pipettiervorgänge parallel ausführt. Zusätzlich enthielt dieses Medium 200 ng/mL Anhydrotetracyclin, um die Ausprägung des sPQQGDH-Gens zu induzieren. Diese MTP wurden bei 28 0C über Nacht geschüttelt. Um die Enzymaktivität einer großen Anzahl von Kolonien feststellen zu können, wurde ein Test verwendet, bei dem ein Aufschluss der Zellen nicht erforderlich ist: Nach Aktivierung des Enzyms durch Zugabe von PQQ kann die Oxidation des Zuckers direkt aufgrund der Entfärbung von Dichlorphenolindophenol (DCPIP) bei dessen Reduktion verfolgt werden. Für ein Screening wurden aus allen Wells jeweils 40 μL der induzierten Kultur mit 60 μL Glukose-Testlösung und weitere 40 μL mit 60 μL Maltose-Testlösung vermischt, wobei eine MTP entweder nur Glukose- Testlösung oder nur Maltose-Testlösung enthielt. Auch hierzu wurde der Pipettierroboter verwendet. Auf diese Weise konnte jeder Einzelkultur eine stets gleichbleibende Position auf allen Kultur- und Messplatten zugeordnet werden. Die Glukose-Testlösung enthielt folgende Komponenten (in Klammern: Endkonzentration im Messansatz): 50 mM Glukose (30 mM), 750 μM DCPIP (450 μM), 1 ,5 μM PQQ (0,9 μM), 1 mM CaCl2 (0,6 mM), 0,1 % NaN3 (0,06 %), Silikonentschäumer (Fluka # 85390) 62,5 ppm (37,5 ppm), 50 mM Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan-HCl (TRIS-HCl) pH 7,6 (30 mM). Im Fall der Maltose-Testlösung war keine Glukose sondern Maltose in der gleichen Konzentration vorhanden.
Von jeder MTP mit Kulturen wurden auf diese Weise zwei Messplatten erzeugt, eine für Glukose, eine für Maltose. Von jeder Messplatte wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 605 nm zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Vermischen von Kultur und Testlösung bestimmt (Eppendorf-Biophotometer): nach 1 min, nach 7 min, nach 12 min und nach 18 min. Auf diese Weise konnte von jeder ursprünglich isolierten Kolonie eine Enzymkinetik für Glukose und eine für Maltose als Substrat aufgenommen werden. Daraus ließ sich sowohl die relative Aktivität der Klone untereinander mit Glukose als Substrat als auch das Verhältnis der Aktivitäten auf Glukose und Maltose für jeden einzelnen Klon ermitteln. Figur 3 zeigt das Ergebnis einer solchen Messung für die MTP 13 und 22 aus dem Screening einer Bibliothek mit fünf zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen Q 168 und L 169. Es ist zu erkennen, dass etwa 2/3 der getesteten Kolonien einen Glukose-Umsatz von weniger als 50 relativen Einheiten aufweisen, was unterhalb der Anzeigegenauigkeit des Tests liegt. Bei diesen Kolonien ist keine signifikante Ausprägung von sPQQGDH nachweisbar, was auf zu geringes Wachstum der Kultur, mangelnde Induktion des sPQQGDH-Gens, unproduktive Doppelinsertionen oder Insertion von Aminosäurekombinationen zurückzuführen ist, die keine enzymatische Aktivität des gebildeten Proteins mehr erlauben. Von den übrigen Kolonien weist der überwiegende Anteil eine geringere Aktivität auf Maltose im Vergleich zu Glukose auf. Ergebnisse aus primären Screenings wie in Fig. 3 gezeigt zeigen eine ähnlich hohe Umsatzrate vieler Varianten im Vergleich zum Ausgangsklon £l.co//-DH5α::pAI3B- KOZ65. Die relative Aktivität ist jedoch immer nachzuprüfen, weil dieser auf sehr viele Einzelmessungen ausgelegte Test oberhalb einer gewissen Umsatzrate nicht mehr differenzieren kann. sPQQGDH aus Varianten hat in aller Regel eine niedrigere Umsatzrate verglichen mit der sPQQGDH aus KOZ65 als das gezeigte Screening vermuten lassen würde.
Beispiel 4 - Verfeinertes Screening von einzelnen Kolonien
Aus einem Screening wie in Beispiel 3 beschrieben wurden 188 Kolonien ausgewählt, bei denen sowohl die Aktivität auf Glukose als auch das Verhältnis der Aktivitäten auf Glukose bzw. Maltose besonders vielversprechend erschienen, auf zwei neuen MTP zusammen mit Kulturen des Ausgangsstamms £.co//-DH5α::pAI3B-KOZ65 angeordnet und wie in Beispiel 3 beschrieben zunächst bei 37°C angezogen und dann bei 28°C über Nacht induziert. Für die Induktion wurden von jeder MTP zwei Platten angelegt, um genügend Kulturvolumen für das Screeningexperiment zu bekommen. Nach der Induktion wurden die parallel gewachsenen Kulturen von je ca. 200 μL vereinigt und gemischt. Von jeder dieser induzierten Kulturen wurden jeweils 40 μL auf Messplatten übertragen, in denen jeweils 60 μL der in Beispiel 3 beschriebenen Testlösungen vorlag, allerdings mit folgenden Zuckern: G - 50 mM Glukose, M - 50 mM Maltose, GM - 50 mM Glukose und 50 mM Maltose, GGaI - 50 mM Glukose und 50 mM Galaktose bzw. GXyI - 50 mM Glukose und 50 mM Xylose. Diese Platten wurden unmittelbar nach dem Mischen von Kultur und Messlösung über 30 min im Abstand von 30 sec gemessen, um eine Kinetik jeder einzelnen Kultur zu erhalten. Aus den so erhaltenen Daten kann für jede Kultur die Umsatzgeschwindigkeit auf Glukose und Maltose allein, das Verhältnis der Aktivitäten auf Glukose und Maltose und vor allem der Einfluss von Maltose, Galaktose und Xylose auf die Umsetzung von Glukose (Interferenz) abgeschätzt werden. In Figur 4 ist das Ergebnis dieser Nachuntersuchung ausgewählter Kolonien (2. Screening) für das in Beispiel 3 geschilderte Screening dargestellt.
An zwei Kolonien von MTP 13 des ersten Screenings (13-G3 und 13-B2; in Fig. 3 und 4 jeweils mit einem Rechteck markiert) ist beispielhaft gezeigt, dass Kolonien mit einem vielversprechenden Verhältnis von Maltose- zu Glukoseaktivität (Fig. 3) stark abweichendes Interferenzverhalten aufweisen können: 13-G3 erfährt negative Interferenz durch Maltose, 13-B2 positive Interferenz. Insgesamt wurden auf Basis der beiden geschilderten Screenings 28 Kolonien zur weiteren Untersuchung ausgewählt.
Beispiel 5 - Anzucht von Stämmen, die Variante Formen der sPQQGDH ausprägen Zunächst wurde von vier ausgewählten Kolonien einer Bibliothek mit jeweils drei zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen Q168 und L169 je eine Vorkultur wie folgt hergestellt: 2 mL TB-Medium (mit 100 μg/mL Ampicillin) wurden mit der zu prüfenden Kolonie beimpft und über Nacht bei 37 0C und 225 rpm geschüttelt. Für die Hauptkultur wurden 50 mL TB-Medium (100 μg/mL Ampicillin) mit der ausgewachsenen Vorkultur beimpft. Die Kultur wurde bei 37 0C und 225 rpm geschüttelt, bis eine optische Dichte bei 605 nm (OD6Qs) von ca. 1 erreicht war. Dann wurde die Ausprägung des Enzyms durch Zusatz einer Anhydrotetracyclin (AHT)-Stammlösung induziert. Der Induktor war dazu in DMF gelöst. Die Endkonzentration des AHT in der Kultur betrug 0,2 μg/mL, die Induktion erfolgte über 24 Stunden bei 270C und 225 rpm. Das Ernten der Zellen erfolgte durch Zentrifugation der Hauptkultur bei 3220 x g für 15 min bei 4°C. Die Zellsedimente wurden je nach Menge in 10 - 20 mL 50 mM 3-Morpholino- propansulfonsäure-Puffer (MOPS) pH 7,6 und 2,5 mM CaCl2 resuspendiert und durch Behandlung mit Ultraschall aufgeschlossen, bis eine deutliche Klärung der Zellsuspension feststellbar war. Zelltrümmer und evtl. vorhandene Inclusion Bodies wurden bei 48.745 x g für 10 min bei 4 0C abzentrifugiert.
Beispiel 6 - Reinigung der Varianten sPQQGDH
Die Überstände aus Beispiel 5 wurde mit Säulenpuffer (10 mM MOPS pH 7,6 + 2,5 mM CaCl2) 1 :5 auf 10 bzw. 50 mL verdünnt und über einen Kationenaustauscher (Toyopearl CM-650M, Fa. TOSOH BIOSEP GmbH) chromatographisch getrennt. Hierzu wird eine 10 x 1,42 cm-Säule mit ca. 16 mL Säulenbett eingesetzt; die Flussrate betrug 4 mL/min. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumen Puffer äquilibriert, danach erfolgte der Probenauftrag. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumen Puffer gewaschen, anschließend wurde die sPQQGDH mittels eines linearen Salzgradienten von 0 bis 0,4 M NaCl in Säulenpuffer eluiert und das Eluat wurde in Fraktionen zu 1 oder 3 mL aufgefangen. sPQQGDH eluierte unter diesen Bedingungen als nahezu homogenes Protein, so dass keine weitere Reinigung mehr erforderlich war. Zur Proteinbestimmung wurde die OD280 der Lösung bestimmt. Mit gereinigtem sPQQGDH-Protein aus KOZ65 war zuvor durch gravimetrische Analyse festgestellt worden, dass die OD28o einer 1 mg/mL sPQQGDH-Lösung (PQQ-freies Apoenzym) 1 ,27 beträgt.
Beispiel 7 - Ermittlung der Enzymaktivität von sPQQGDH- Varianten
Zur genauen Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde folgender Test verwendet. Von den zu untersuchenden Enzymlösungen wurde je eine Verdünnungsreihe in folgendem Puffer angefertigt: 50 mM Piperazin-l ,4-bis-(2-ethansulfonsäure) (PIPES) pH 6,5, 0,1 % Triton X-I OO, 1 mM CaCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 3 μM PQQ. Der als Substrat dienende Zucker, der Elektronenmediator N-Methylphenazoniummethasulfat (PMS) und das Nachweisreagenz
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) wurden separat angesetzt: 1 1 ,7 mL einer Lösung mit 50 mM PIPES pH 6,5 und 2% Triton X-100 in zweifach destilliertem (bidest.) Wasser wurden mit 450 μL
0,9 M D-Glukose, 450 μL 6 mM PMS und 450 μL 6,6 mM NBT (alle Substanzen ebenfalls in bidest. Wasser gelöst) gemischt, im Dunkeln bei 25 0C aufbewahrt und innerhalb einer Stunde verbraucht. Wenn die Enzymaktivität auf anderen Zuckern als Glukose gemessen werden soll, werden diese anstelle der Glukose in einer Konzentration von 0,9 M eingesetzt. Die Endkonzentrationen der einzelnen Reaktionspartner in der Messlösung betrugen: Zuckersubstrat: 30 mM, PMS: 200 μM und NBT: 220 μM. 725 μL der vorgewärmten Testlösung wurden mit 25 μL verdünnter Enzymlösung in einer Küvette gemischt und die Entstehung von Formazan wurde bei 570 nm und 25 0C über 3 min verfolgt. Bei der Umsetzung von 1 μmol Glukose entsteht 0,5 μmol Formazan, dessen molarer Extinktionskoeffizient ε =40.200 IvT1Cm"1 ist. Damit kann die Enzymkonzentration in der Probe über folgenden Zusammenhang ermittelt werden: 1 U/mL sPQQGDH entspricht einer Änderung der OD570 um 1 ,493 min"1. Eine Verdünnungsreihe der einzelnen Proben ist notwenig, weil Messungen, bei denen Werte kleiner als 0,05 U/mL oder größer als 0,7 U/mL ermittelt werden, verworfen werden müssen, da außerhalb dieses Bereichs keine ausreichende Linearität der Messung gewährleistet ist. Die Konzentration der Ausgangsprobe wurde dann unter Berücksichtigung der verwendeten Verdünnungsstufe berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2:
Beispiel 8 - Bestimmung der Insertionssequenz
Um die bei einer interessanten Variante tatsächlich zwischen den Positionen Q 168 und L 169 eingefügten Aminosäuren zu ermitteln, wurde aus dem betreffenden Stamm Plasmid-DNA mit Hilfe des QiaPrep Plasmid-Isolation Kit (Qiagen, Hilden) nach den Angaben des Herstellers präpariert und die DNA-Sequenz an der Insertionsstelle von beiden Richtungen mit den als Primer verwendeten Oligonukleotiden 4472-US1 (5 '-CACCGTTAAAGCTTGGATTATC^ ' ; SEQ ID 34) und 4831 -DSl (5 '-CCTTCATCGAAAGACCATCAG^ ' ; SEQ ID 35) ermittelt. Das 3 '-Ende der Sequenz von 4472-US 1 befindet sich 58 bp vor der Insertionsstelle, das 3 '-Ende der Sequenz von 4831 -DSl befindet sich 82 bp hinter der Insertionsstelle. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3:
Zur Orientierung sind die flankierenden Aminosäuren 168Q und 172L (vorher 169L) und deren Codons mit angegeben.
Beispiel 9 - Ermittlung der Interferenz durch andere Zucker als Glukose
Während bei der Bestimmung der spezifischen Aktivität von sPQQGDH üblicherweise eine Substratkonzentration von 30 mM im Testansatz verwendet wird, ist für die Ermittlung von Interferenz eine niedrigere Konzentration der in Frage stehenden Zucker sinnvoll; etwa in der Größenordnung wie sie bei potentiellen späteren Anwendungen auftritt. Die physiologische Konzentration von Glukose im Blut beträgt etwa 100 mg/dL, was ca. 5,6 mM entspricht. Aus diesem Grund wurden die nachfolgend geschilderten Experimente mit einer Glukosekonzentration von 100 mg/dL und 50 bis 250 mg/dL des interferierenden Zuckers durchgeführt. In einigen Fällen wurden aber auch andere Konzentrationen und Verhältnisse der beiden Zucker zueinander untersucht.
In Fig. 5 ist das Ergebnis einer Interferenzmessung von fünf verschiedenen Varianten dargestellt. 5381-06-C12, 5381-05-C4 und 5381-07-F10 stammen aus eine Bibliothek mit vier zusätzlichen Aminosäuren, 5152-20-A7 und 5386-13-F10 aus einer Bibliothek mit fünf zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen Q168 und L169. In allen Fällen ist nur noch ein geringer Einfluss der getesteten Zucker nachweisbar: im Fall der Maltose wird selbst bei 250 mg/dL Maltose (1,3-fache molare Menge im Vergleich zu Glukose) die Messung bei keinem der Klone um mehr als 8 % beeinflusst. Bei Galaktose sind es maximal 16 % und bei Xylose max. 14 % Interferenz.
Beispiel 10 - Vergleich der Interferenzen verschiedener Zucker auf KOZ65 und Klon 5152- 20-A7
Um einen direkten Vergleich zwischen der sPQQGDH ohne Insertionsmutation aus KOZ65 zu ziehen wurden gereinigte, Variante sPQQGDH aus Klon 5152-20-A7 und gereinigtes Enzym aus KOZ65 auf Mischungen von Glukose und den Zuckern Maltose, Galaktose, Xylose, Laktose, Cellobiose oder Mannose untersucht. Für jeden Messpunkt wurden Quadruplikate aufgenommen. Fig. 6 zeigt, dass die starke Interferenz durch Maltose, Cellobiose und Laktose beim Ausgangsenzym aus KOZ65 in dem von Variante 5152-20-A7 ausgeprägten Enzym unterdrückt ist. Insbesondere bei Maltose ist die Interferenz bei etwa äquimolaren Mengen (100 mg/dL Glucose mit 200 mg/dL Maltose) von 63 % bei KOZ65 auf 6 % bei 5152-20-A7 zurückgegangen, bei Laktose ist die Interferenz nicht mehr signifikant.
Beispiel 11 - Vergleich von Varianten aus unterschiedlichen Bibliotheken Um die Allgemeingültigkeit der erfindungsgemäßen Methode zur Herstellung von sPQQGDH- Varianten mit verbesserter Substratspezifität zu zeigen, wurden Bibliotheken mit drei, vier und fünf zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen Q168 und L169 der Wildtyp-sPQQGDH aus KOZ65 angelegt und untersucht, wie es in den vorangehenden Beispielen beschrieben wurde. Zum Vergleich wurde auch eine Bibliothek mit nur zwei zusätzlichen Aminosäuren zwischen den Positionen Q 168 und L 169 angelegt und untersucht. Dabei wurden allerdings nur zehn Klone mit schwacher Verbesserung der Substratspezifität gefunden (Verhältnis der Aktivitäten auf Maltose und Glukose zwischen 25 und 75 %). Lediglich ein Klon (5156- 13-G l 2; siehe Tabelle 4) hatte eine erhöhte Substratspezifität; allerdings bei mangelnder spez. Aktivität auf Glukose. Wie aus der folgenden Tabelle 4 hervorgeht, enthalten jedoch alle Bibliotheken mit drei bis fünf zusätzlichen Aminosäuren Klone, die eine deutlich höhere Substratspezifität als der Wildtyp aufweisen.
Tabelle 4:
(n.d.: nicht durchgeführt)
Figur 1 zeigt die Herstellung eines Vektors zur Insertion von synthetischen DNA-Fragmenten. Gezeigt sind die Positionen und Orientierungen (dicke schwarze Pfeile in Ib) der Primer zur Herstellung zweier Fragmente (PCR 1 , PCR 2) aus dem sPQQGDH-Gen aus KOZ65 (Ia) und die Stelle, an der später zusätzliche Aminosäuren eingefügt werden sollen („IP" in Ia und I b). Fig. Ic zeigt schematisch die Zusammenfügung des Vektors pAI3B-KOZ65-U (1-2) aus dem mit Xbal und EcoO109I geschnittenen und gereinigten Amplifikat aus dem vorderen Teil der kodierenden Sequenz, dem mit EcoO109I und BfuAI geschnittenen und gereinigten Amplifikat aus dem mittleren Teil der kodierenden Sequenz und dem mit Xbal und BfuAI aus dem Ausgangsvektor pAI3B-KOZ65 (1-1 ) geschnittenen und gereinigten, 3567 bp langen Vektorfragment. Der fertige Vektor pA13B-KOZ65-U (1 -2) ist in Fig. I e dargestellt. Aus Fig. Id ist ersichtlich, dass die Translation der sPQQGDH in pAI3B-KOZ65-U vier Aminosäurereste nach der EcoO109I- Schnittstelle stoppt, wenn keine Insertion erfolgt.
Figur 2 zeigt die Herstellung eines synthetischen, doppelsträngigen DNA-Stücks aus den im Text beschriebenen Oligonukleotiden (in der Figur als Pfeile dargestellt; die Pfeilspitze deutet jeweils das 3 '-Ende der Sequenz an). Im unteren Teil sind die Oligonukleotide EarV2-Random und EarV2-Lower dargestellt. Im ersten Schritt wird aus diesen überlappenden Einzelsträngen das 62 bp lange Primär-Produkt erstellt. Im zweiten Schritt wird daraus mit Hilfe der Oligonukleotide EarV2-UpAmp und EarV2-LoAmp das 97 bp lange PCR-Produkt hergestellt, dessen DNA- Sequenz im oberen Teil dargestellt ist. Die davon kodierte Proteinsequenz findet sich am unteren Rand von Fig. 2. In der DNA-Sequenz ist die Lage der beiden Earl-Schnittstellen dargestellt. Das mit Earl aus dem PCR-Produkt freigesetzte 64 bp lange Fragment wird in den mit EcoO109I geöffneten Vektor ligiert.
Figur 3 zeigt die Zusammenfassung der Daten aus dem Screening einer Bibliothek varianter sPQQGDH-Klone am Beispiel von zwei Mikrotiterplatten (a und b). Auf der Abszisse (X-Achse) ist für jede Kolonie einer MTP die ungefähre Geschwindigkeit in willkürlichen relativen Einheiten angegeben, mit der Glukose von dieser Kolonie umgesetzt wird. Auf der Ordinate (Y-Achse) ist der Quotient aus Maltose- und Glukoseumsatz aufgetragen. Damit lässt sich für jede Kolonie abschätzen ob sie in der Lage ist Glukose umzusetzen und wenn ja, ob sie eine bessere Unterscheidung von Glukose und Maltose erlaubt als der Wildtyp KOZ65. Als Symbol einer jeden Kolonie wurde deren Position auf der jeweiligen Mikrotiterplatte benutzt, Al - H 12. Die Positivkontrolle KOZ65 ist mit Pfeilen gekennzeichnet.
Figur 4 zeigt die Ergebnisse der aus dem in Beispiel 3 beschriebenen Screening ausgewählten Kolonien. Dabei werden drei Parameter betrachtet: die auf diesem Bild nicht dargestellte Umsatzrate auf Glukose sollte möglichst hoch sein; die auf der Abszisse (X-Achse) aufgetragene Interferenz (hier für Maltose als interferierenden Zucker) sollte, wie auch das auf der Ordinate (Y- Achse) aufgetragene Verhältnis von Maltose- zu Glukoseumsatz, möglichst nahe bei Null liegen. Zum Vergleich sind einige Klone in Fig. 3 und 4 in gleicher Weise markiert.
Figur 5 zeigt Interferenzstudien verschiedener Klone mit Maltose (a), Galaktose (b) und Xylose (c). Gezeigt wird für fünf gereinigte, Variante sPQQGDH-Präparationen das Verhalten gegenüber Mischungen aus Glukose und drei anderen Zuckern. Auf der Ordinate (Y-Achse) aufgetragen sind die ermittelte Interferenz für Mischungen von 100 mg/dL Glukose im Messansatz ohne weitere Zucker sowie mit 50, 100, 150, 200 oder 250 mg/dL (X-Achse) des jeweiligen interferierenden Zuckers. Jeder Messpunkt wurde als Quadruplikat bestimmt.
Figur 6 zeigt Interferenzstudien für KOZ65 (links) und Klon 5152-20-A7 (rechts) auf verschiedenen Zuckern. Für Cellobiose (a), Galaktose (b), Laktose (c), Maltose (d), Mannose (e) und Xylose (f) ist auf der Ordinate (Y-Achse) aufgetragen, wie stark diese Zucker bei verschiedenen Konzentrationen die Aktivität der sPQQGDH aus KOZ65 bzw. 5152-20-A7 in Gegenwart von 100 mg/dL Glukose (Inhibitorkonzentration [mg/dL] auf der X-Achse) beeinflussen. Zu jeder Messreihe für einen interferierenden Zucker gehört auch eine Messung ohne diesen Zucker, die wie alle anderen Messungen der Reihe auf einen aus allen Messungen ohne interferierende Zucker gemittelten Glukosewert bezogen wurde. Aufgrund der Messungenauigkeit bei enzymatischen Tests beginnen daher die einzelnen Graphen nicht unbedingt bei Null, was theoretisch der Fall sein sollte.

Claims

Patentansprüche
1. Lösliche Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glukosedehydrogenase (sPQQGDH), dadurch gekennzeichnet dass sie gegenüber einer sPQQGDH eines der Wildtypstämme aus der Gattung Acinetobacter sp. wie zum Beispiel Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41 eine Insertion von drei bis fünf Aminosäuren im Bereich der Substratbinderegion aufweist.
2. sPQQGDH nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsstelle einen Abstand zur Substratbinderegion von nicht mehr als 5 Ängstrom aufweist.
3. sPQQGDH nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsstelle zwischen den Positionen Q168 und L169 bezogen auf die Sequenz des Wildtyps Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41 liegt.
4. sPQQGDH nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Mutagenese aus einem Stamm der Reihe PT 16, KOZ62, KOZ65, PTN69, KG 106, PTN26, PT15, KGN80, KG140, KGN34, KGN25, KGN100 hervorgeht.
5. sPQQGDH nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Insertion von 3 Aminosäuren, wobei die insertierten Aminosäuren ein A oder G an Position 1, ein Y, F oder W an Position 2 und ein Q, L, V oder I an Position 3 aufweisen.
6. sPQQGDH nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Insertion von 4 Aminosäuren, wobei die insertierten Aminosäuren ein A oder G an Position 1 , ein G, D oder L an Position 2, ein R oder A an Position 3 und ein M oder V an Position 4 aufweisen.
7. sPQQGDH einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Insertion von 5 Aminosäuren, wobei die insertierten Aminosäuren ein A, M, S oder V an Position 1 , ein E, G oder S an Position 2, ein H, K, R, S oder T an Position 3, ein F, H, I, L, N, V oder Y an Position 4 und ein F, H, L, N, Q, T oder Y an Position 5 aufweisen.
8. sPQQGDH einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Insertionssequenz aus der Reihe SEQ ID 1 bis SEQ ID 18.
9. Gen, das eines der Proteine nach einem Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
10. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er im Bereich der Insertionsstelle eine singuläre Restriktionsschnittstelle aufweist, sodass Oligonukleotidsequenzen an dieser Stelle insertiert werden können, die eine sPQQGDH nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodieren.
1 1. Vektor nach Anspruch 10 mit der Sequenz SEQ ID 27.
12. Verfahren zur Herstellung und Identifizierung von sPQQGDH nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt ein Vektor mit einer im Bereich der Insertionsstelle singulären Restriktionsschnittstelle hergestellt wird, in einem zweiten Schritt eine Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotidsequenzen in den Vektor insertiert wird, in einem dritten Schritt die so gewonnenen rekombinanten Vektoren in Wirtsbakterien transformiert und die Bakterien vermehrt werden, in einem vierten Schritt die von den Bakterien produzierten sPQQGDH einem Screening unterzogen werden, derart, dass die Aktivität der sPQQGDH auf mindestens zwei verschiedene Zucker einzeln als auch die Interferenz mindestens eines Zuckers mit mindestens einem zweiten bestimmt wird, und in einem fünften Schritt diejenigen sPQQGDH ausgewählt werden, die gegenüber der unmodifizierten sPQQGDH des Wildstammes eine verbesserte Substratspezifität aufweisen.
13. Glukosesensor umfassend eine sPQQGDH der Ansprüche 1 bis 8.
EP09768932A 2008-06-26 2009-06-17 Neuartige varianten pqq-abhängiger glukosedehydrogenase mit verbesserter substratspezifität Withdrawn EP2294188A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008030435A DE102008030435A1 (de) 2008-06-26 2008-06-26 Neuartige Varianten PQQ-abhängiger Glukosehydrogenase mit verbesserter Substratspezifität
PCT/EP2009/004350 WO2009156083A1 (de) 2008-06-26 2009-06-17 Neuartige varianten pqq-abhängiger glukosedehydrogenase mit verbesserter substratspezifität

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2294188A1 true EP2294188A1 (de) 2011-03-16

Family

ID=40972803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP09768932A Withdrawn EP2294188A1 (de) 2008-06-26 2009-06-17 Neuartige varianten pqq-abhängiger glukosedehydrogenase mit verbesserter substratspezifität

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8580547B2 (de)
EP (1) EP2294188A1 (de)
JP (1) JP2011525361A (de)
CN (2) CN103540572A (de)
DE (1) DE102008030435A1 (de)
WO (1) WO2009156083A1 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2465936A1 (de) 2010-12-20 2012-06-20 LEK Pharmaceuticals d.d. Enzymatische Synthese von Statinen und deren Zwischenprodukte
JP6194251B2 (ja) 2010-12-20 2017-09-06 レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー 医薬品有効成分およびこれの中間体の酵素的合成
CN105331591B (zh) 2015-10-29 2020-02-28 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置
CN109085269B (zh) * 2018-08-15 2021-03-09 江苏省原子医学研究所 PQQ与Lys及Arg反应行为研究的方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005048B1 (en) 1999-10-05 2006-02-28 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Glucose sensor
AU1596602A (en) 2000-10-27 2002-05-06 Peter Kratzsch Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase
US7476525B2 (en) 2002-05-27 2009-01-13 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
DE10320259A1 (de) 2003-05-07 2004-11-25 Bayer Technology Services Gmbh Neuartige Glukose Dehydrogenase und ihre Herstellung
EP1666586B1 (de) 2003-09-08 2009-10-21 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Pyrrolochinolin-chinon (pqq)-abhängige glucosedehydrogenase-modifikation mit ausgezeichneter substratspezifität
JP2007000020A (ja) * 2005-06-21 2007-01-11 Toyobo Co Ltd 基質特異性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
WO2006085509A1 (ja) * 2005-02-08 2006-08-17 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha 基質特異性に優れた改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2007043983A (ja) * 2005-08-11 2007-02-22 Toyobo Co Ltd 基質特異性に優れた改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
JP2006217810A (ja) * 2005-02-08 2006-08-24 Toyobo Co Ltd 基質特異性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2009156083A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102008030435A1 (de) 2010-01-07
JP2011525361A (ja) 2011-09-22
CN102076846A (zh) 2011-05-25
WO2009156083A1 (de) 2009-12-30
US20110236920A1 (en) 2011-09-29
US8580547B2 (en) 2013-11-12
CN103540572A (zh) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60029775T2 (de) Glukose-dehydrogenase
DE60223635T2 (de) Reagenzien, Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Analyten
JP5969392B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法およびそれに用いる酵母形質転換体
EP2010649B1 (de) Verbesserte mutanten pyrrolochinolin-chinon-abhängiger löslicher glucose-dehydrogenase
JP6526572B2 (ja) 熱安定性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
WO2013065770A1 (ja) 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
EP2294188A1 (de) Neuartige varianten pqq-abhängiger glukosedehydrogenase mit verbesserter substratspezifität
EP1367120A2 (de) Modifizierte Pyrroloquinolin Quinon-abhängige Glukose Dehydrogenase mit höherer Substratspezifität und Stabilität
DE60319842T2 (de) Glucosedehydrogenase
EP3112461B1 (de) Flavinbindende glucosedehydrogenase mit verbesserter spezifischer aktivität
JP6101011B2 (ja) フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
EP0464832B1 (de) Klonierung der N-Methylhydantoinase
WO2010094632A1 (de) Schnelle reaktionskinetik von enzymen mit niedriger aktivität in trockenen chemieschichten
JP6934720B2 (ja) 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
EP0966544B1 (de) Test-kit für tuberkulose-diagnose etc.
JP2023015399A (ja) グルコース測定方法およびグルコースセンサ
EP2398909B1 (de) Schnelle reaktionskinetik von enzymen mit niedriger aktivität in trockenen chemieschichten
EP1623025B1 (de) Glukose dehydrogenase und ihre herstellung
US8748145B2 (en) Mutants of pyrroloquinoline quinine-dependent soluble glucose dehydrogenase
US7381540B2 (en) Composition for measuring glucose having improved substrate specificity
DE60200426T2 (de) Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol
JP2005270082A (ja) グルコース脱水素酵素

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20110126

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA RS

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20120316

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: BAYER INTELLECTUAL PROPERTY GMBH

RIC1 Information provided on ipc code assigned before grant

Ipc: C12Q 1/32 20060101AFI20131002BHEP

Ipc: C12N 9/04 20060101ALI20131002BHEP

Ipc: C12Q 1/00 20060101ALI20131002BHEP

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20131204

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20140415