JP5969392B2 - フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法およびそれに用いる酵母形質転換体 - Google Patents
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Description
本発明者等は、このGDHを精製し諸性質を決定した結果、この酵素が新規なフラビン結合型GDHであることを確認し、実際にマルトース、D−ガラクトース、D−キシロース存在下でのD−グルコース測定を実施するとともに、その新規なGDHのアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列情報を取得した。さらに、本来の由来微生物の培養物からでは十分な量の酵素を取得することが困難であるという課題を解決するために、検討を重ねた。
その結果、このフラビン結合型GDHをコードする遺伝子を酵母へと導入して形質転換体を得、この酵母形質転換体を培養した場合に、その培養物からより多くのフラビン結合型GDHを効率的に取得できることを見出した。さらに、驚くべきことに、この酵母形質転換体から得られるフラビン結合型GDHは、本来の由来微生物中で製造されるものと比較して、その耐熱性が顕著に向上していることを見出し、本発明を完成した。
(1)以下の(i)から(iv)の性質:
(i)作用:電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
(ii)分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約80kDaである、
(iii)基質特異性:D−グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びD−ガラクトース、及びD−キシロースに対する反応性が低い、
(iv)50℃、15分間の熱処理において50%以上の残存活性を有する、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
(2)配列番号1または配列番号3で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と85%以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる上記(1)記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
(3)フラビン結合型GDHがケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物に由来し、酵母を宿主として発現されることを特徴とする上記(1)〜(2)記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
(4)配列番号1または配列番号3で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と85%以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を酵母に導入して得られる酵母形質転換体。
(5)酵母がチゴサッカロマイセス属、サッカロマイセス属、ピキア属、カンジダ属に属する、上記(4)記載の酵母形質転換体。
(6)上記(4)〜(5)記載の酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型GDHを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
(7)以下の(A)〜(E)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2で示される塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(D)配列番号4で示される塩基配列からなるDNA;
(E)配列番号2又は配列番号4で示される塩基配列と85%以上相同な塩基配列、
を有し、かつフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするDNAが導入されている酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
本発明に用いるフラビン結合型GDHは、基質特異性に優れ、D−グルコースに対する選択性が極めて高いことを特徴とする。具体的には、本発明に用いるフラビン結合型GDHは、マルトース、D−ガラクトース、D−キシロースに対する反応性が極めて低い。具体的には、D−グルコースに対する反応性を100%とした場合に、マルトース、D−ガラクトースおよびD−キシロースに対する反応性がいずれも2%以下であることを特徴とする。本発明に用いるフラビン結合型GDHは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、D−ガラクトース、D−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にD−グルコース量を測定することが可能となる。
本発明に用いるフラビン結合型GDHとして好ましい酵素の例としては、以下の酵素化学的特徴を有するものが挙げられる。
(1)作用:電子受容体存在下でGDH活性を示す
(2)分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約80kDaである
(3)基質特異性:D-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、D−ガラクトース、D−キシロースに対する反応性が低い
(4)至適pH:pH6.5〜7.0
(5)至適温度:37〜40℃
(6)安定pH範囲:pH3.5〜7.0
(7)40度、15分間の熱処理において80%以上の残存活性を有する、
(8)フラビン化合物を補酵素とする
(9)Km値:D−グルコースに対するKm値が26〜33mMである
上記のような酵素化学的特徴を有するGDHであれば、測定試料に含まれるマルトース、D−ガラクトース、D−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にD−グルコース量を測定することが可能となる。また、血糖値の測定等の臨床診断に応用するために好適なpH範囲、温度範囲で良好に作用するので、診断用測定試薬等の用途に好適に使用することができる。
なお、上記の諸性質パラメータは典型的な例であるが、所定の測定条件においてD−グルコースの測定を行う際に本発明の効果を達成可能である範囲で、上記パラメータのうちには、許容可能な変動の幅を有するものがある。例えば、安定pH範囲や至適pH範囲、至適温度範囲等のパラメータは、所定の測定条件を含む範囲で、上記の典型的な範囲よりやや広くてもよいし、逆に、上記の典型的な範囲よりやや狭い場合でも、測定条件において十分な活性および/または安定性が確保されていればよい。Km値は一般的には小さくなるほど基質特異性が良いとされるが、本発明の酵素としては、所定の測定条件において実質的に十分な基質の選択が実現される範囲の値を有していればよい。
精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質(夾雑タンパク質)を実質的に含まない状態に分離された酵素をいう。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。なお、本明細書中に後述する「MpGDH」、「MjGDH」および「McGDH」は、特に断りの無い限り、精製酵素をいう。
本発明に用いるフラビン結合型GDHとして好ましい酵素の例としては、D−グルコースに対するKm値が26〜33mMであるフラビン結合型GDHが挙げられる。
本発明に用いるフラビン結合型GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
したがって、この原理を利用して、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)および2,6−ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の測定系により、本発明に用いるフラビン結合型GDHの活性を測定することができる。
(反応1) D−グルコ−ス + PMS(酸化型)
→ D−グルコノ−δ−ラクトン + PMS(還元型)
(反応2) PMS(還元型) + DCIP(酸化型)
→ PMS + DCIP(還元型)
具体的には、フラビン結合型GDHの活性は、以下の手順に従って測定する。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 1.79mL、1.25M D−グルコース溶液 0.08mLおよび20mM DCIP溶液 0.01mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、20mM PMS溶液 0.02mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を求め、次式に従いフラビン結合型GDH活性を算出する。この際、フラビン結合型GDH活性は、37℃において濃度50mMのD−グルコース存在下で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義する。
上記の特徴を有し、本発明に用いるフラビン結合型GDHは、ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物から得ることができる。ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物としては、例えば、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属等が挙げられる。Mucor属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型GDHを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、ムコール・プライニ(Mucor prainii)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus)もしくはムコール・シルシネロイデス・f・シルシネロイデス(Mucor circinelloides f. circinelloides)が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111もしくはMucor circinelloides f. circinelloides NISL0117が挙げられる。Absidia属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型GDHを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、アブシジア・シリンドロスポラ(Absidia cylindrospora)、アブシジア・ヒアロスポラ(Absidia hyalospora)を挙げることができる。より具体的には、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218を挙げることができる。Actinomucor属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型GDHを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、アクチノムコール・エレガンス(Actinomucor elegans)を挙げることができる。より具体的には、Actinomucor elegans NISL9082を挙げることができる。なお、上記の菌株はNISL(財団法人 野田産業科学研究所)の保管菌株であり、所定の手続きを経ることにより、分譲を受けることができる。
本発明に用いるフラビン結合型GDHは、配列番号1又は配列番号3で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と85%以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする。配列番号1又は配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型GDHは、上述の各種の性質を有する。また、配列番号1又は配列番号3で示されるアミノ酸配列と85%以上の相同性、好ましくは90%、最も好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号1又は配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型GDHと同様な諸性質を有するGDHも、本発明のフラビン結合型GDHに含まれる。
本発明に用いるフラビン結合型GDHをコードする遺伝子とは、配列番号1又は配列番号3で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と85%以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するフラビン結合型GDHをコードするDNAをいう。または、本発明に用いるフラビン結合型GDHをコードする遺伝子とは、配列番号2又は配列番号4で示される塩基配列からなるDNAをいう。あるいは、本発明に用いるフラビン結合型GDHをコードする遺伝子とは、配列番号2又は配列番号4で示される塩基配列と85%以上の相同性、好ましくは90%、最も好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列を有し、且つフラビン結合型GDH酵素活性をもつタンパク質をコードするDNAをいう。
本発明に用いるフラビン結合型GDHをコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の各宿主に導入して、フラビン結合型GDH遺伝子を含む組換え体DNAが導入されている形質転換体を作製することができる。これらの遺伝子の取得方法や、遺伝子配列、アミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法は、当業者にとって公知であり、一例を後述する。
本発明の形質転換体における宿主の例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属などに属する酵母が挙げられる。これらの属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型GDHを生産する具体的な好ましい微生物としては、チゴサッカロマイセス・ルキシー(Zygosaccharomyces rouxii)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)等が挙げられる。より具体的には、Zygosaccharomyces rouxii IFO1876が挙げられる。
本発明では宿主として酵母を用いる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法(Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255−269(1995))やエレクトロポレーション(J Microbiol Methods 55 (2003)481−484)等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
上記の形質転換により得られる形質転換体を用いて、フラビン結合型GDHを製造する。具体的には、上記の形質転換により得られる酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを取得することができる。
ある有用なタンパク質をコードする遺伝子を異種の宿主に導入することによって生産させる技術は、理論的には公知である。しかしながら、実際には、どのような遺伝子を、どのような異種宿主にどのように導入するかによって、その効果の度合いは一律ではなく、異種宿主へ導入しようとしても導入自体うまくいかないか、異種宿主での発現がうまくいかないことは多くある。すなわち、個々の物質生産において、具体的にどのような遺伝子を、どのような宿主にどのように導入した場合に効率的な製造が可能となるかを見出すことは容易とはいいがたく、効率的な製造を実現し得る遺伝子、宿主、導入方法等の組み合わせを見出すことは、産業上非常に有用である。
本発明の酵母形質転換体を培養することにより、本発明に用いるフラビン結合型GDHの由来微生物(すなわち、ケカビ)を培養して製造を行う場合と比較して、格段に効率の良い酵素の製造を実現できる。具体的には、培養後の菌体内、あるいは菌体外において確認される酵素発現量がより多くなる。さらに、宿主によっては、発現された酵素の分泌パターンが変化し、効率的な製造が行えるようになる。例えば、Mucor属由来のフラビン結合型GDH遺伝子を含む遺伝子発現カセットを用いてチゴサッカロマイセス属の酵母を形質転換して得られる酵母形質転換体を酵母形質転換体を培養することにより生産されるフラビン結合型GDHは、そのほとんどが菌体外に分泌されるようになる。このように、菌体外に目的酵素が分泌生産されるようになることによって酵素の精製工程が非常に効率化されることは、より好ましい本発明の効果である。
例えば、本発明に使用する各種ケカビ由来のフラビン結合型GDHは、本来の由来微生物を培養した場合にはその生産量は十分とはいいがたく、より大スケールでの菌体培養が必要となるとともに、培養した菌体から酵素を抽出するための付加的な工程を必要とすることになる。
本発明の酵母形質転換体の培養は、Saccharomyces cerevisiaeの培養において広く用いられているYPD(バクトペプトン 2%,バクトイースト・エクストラクト 1%,グルコース 2%)液体培地を好適に用いることができると考えられるが、その他にも、添加することにより本発明に用いるフラビン結合型GDHの製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせて用いてもよい。
培地に使用する炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、マルツエキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられる。無機物としては、例えば、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第1鉄、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどの種々の塩が挙げられる。その他、必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。
1.GDH生産菌のスクリーニング
自然界から分離した菌株および微生物保存機関((財)野田産業科学研究所)から分与された保存菌約500株から、GDH生産菌のスクリーニングを行った。マルツエキス培地(マルツエキス2.0%、D−グルコース2.0%、ポリペプトン0.1%、pH6.0)3mlに供試菌株をそれぞれ接種し、3〜5日、30℃で振とう培養した。この培養液を800×g、10分間遠心分離して菌体を沈殿として得た。その後、この菌体を10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)中に懸濁し、ビーズショッカー(安井器械(株)製)により菌体を破砕(2,000rpm、60秒、16回)し、4℃、20,000×g、10分間の遠心によって回収された上清を粗酵素液とした。
以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定して、粗酵素液中のGDH活性を調べた。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 1.79mL、1.25M D−グルコース溶液 0.08mLおよび20mM DCIP溶液 0.01mLを混合し、37℃で5分間保温後、20mM PMS溶液 0.02mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)を測定し、次式に従いGDH活性を算出した。この際、GDH活性は、37℃において濃度50mMのD−グルコ−ス存在下で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を1Uと定義した。
前培養用培地(イーストエキス 2.0 %、グルコース 4%、pH6.0)0.1Lを0.5L容坂口フラスコに入れ、予めプレート培地上で培養したMucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117を、約1cm2分それぞれ接種し、30℃、130rpmで2日間回転振とう培養した。これを種培養として、30L容ジャーファメンターに入れた上記培地20Lに0.2Lずつ接種し(ジャーファメンター2基)、30℃、200rpm、0.5vvmで3日間培養した。培養終了後、培養液40Lをろ布でろ過し、菌体を回収した。次いで、得られた菌体を10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)に懸濁した。
この上清を、緩衝液A(10mM 酢酸緩衝液、2M 硫酸アンモニウム、pH5.0)にて予め平衡化したブチルトヨパール650C(東ソー社製)カラム(26φ×28.5cm)にかけ、緩衝液Aから緩衝液B(10mM 酢酸緩衝液、pH5.0)のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をセントリコンプラス−70(ミリポア社製)で濃縮後、緩衝液C(10mM 酢酸緩衝液、pH4.5)で透析し、予め緩衝液Cで平衡化したSPセファロースFastFlow(GEヘルスケア社製)カラム(26φ×28.5cm)にかけ、緩衝液Cから緩衝液D(10mM 酢酸緩衝液、200mM 塩化カリウム、pH4.5)のリニアグラジエントで溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
以降、各精製酵素について、Mucor prainii NISL0103由来のGDHをMpGDH、Mucor javanicus NISL0111由来のGDHをMjGDH、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117由来のGDHをMcGDHと表記する。
実施例2により得られた各精製GDHの諸性質を調べた。
(a)吸収スペクトルの測定
MpGDH、MjGDHおよびMcGDHを10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)で透析し、250−800nmにおける吸収スペクトルを分光光度計U−3010(日立ハイテクノロジーズ社製)により測定した。測定結果を図1に示す(図1(A)はMpGDHの吸収スペクトル、図1(B)はMjGDHの吸収スペクトル、図1(C)はMcGDHの吸収スペクトルを示す)。いずれのGDHについても、波長340〜350nm付近および波長420〜430nm付近に極大を示す2つのピークが確認され、このような吸収スペクトルの形状がフラビン酵素に特有の形状であることから、本発明のGDHがフラビン結合型タンパク質であることが強く示唆された。
実施例2により得られたMpGDH、MjGDHおよびMcGDHと、Aspergillus niger由来の市販のグルコースオキシダーゼ(GOD、biozyme laboratories社製)を用いて、GDH活性およびGOD活性を測定した。結果を表2に示す。
GDH活性は、実施例1の方法に準じ、GOD活性は、4−アミノアンチピリン(4−AA)、およびN−エチルーN−(2−ヒドロキシー3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)を使用した以下の方法で測定した。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 30.0mL、833mM D−グルコース溶液 6.0mL、25mM 4−AA溶液 0.3mL、40mM TOOS溶液 0.3mLおよび500U/mL POD溶液 0.3mLを混合後、3.0mLを試験管に移し、37℃で5分間保温後、酵素サンプル溶液0.1mLを添加して反応を開始した。酵素反応の進行に伴う555nmにおける吸光度の1分間あたりの増加量(ΔA555)を測定し、次式に従ってGOD活性を算出した。この際、GOD活性は、37℃において濃度131mMのD−グルコース存在下で1分間に1μmolのH2O2を生成する酵素量を1Uと定義した。
上記のフラビン結合型GDHにおける至適pHを調べた。結果を図2に示す(図2(A)はMpGDH、(B)はMjGDH、(C)はMcGDHの結果を示す)。具体的には、100mM 酢酸カリウム緩衝液(pH5.0−5.5、図中△印でプロット)、100mM MES−NaOH緩衝液(pH5.5−6.5、図中斜め四角印でプロット)、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0−8.0、図中丸印でプロット)、100mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5−9.0、図中×印でプロット)を用い、それぞれのpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。
その結果、上記のフラビン結合型GDHはいずれも、pH6.5もしくはpH7.0において最も高い活性を示し、pH7.0付近に至適pHを有していた。個別にみると、MpGDHおよびMcGDHの相対活性が最も高かったのはpH7.0においてであり、その周辺域として、pH6.5−7.5の範囲で最大相対活性値の80%以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。また、MjGDHの相対活性が最も高かったのはpH6.5においてであり、その周辺域として、pH6.0−7.0の範囲で最大相対活性値の80%以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。
実施例1記載の活性測定法に準じ、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。具体的には、100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 1.79mL、1.25M D−グルコース溶液 0.08mLおよび20mM DCIP溶液 0.01mLを混合し、37℃で保温する代わりに各温度で5分間保温後、20mM PMS溶液 0.02mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時、および、2分後の吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量を求めた。結果を図3に示す(図3(A)はMpGDH、(B)はMjGDH、(C)はMcGDHの結果を示す)。いずれも37℃付近で最大の活性を示し、最大活性に対して80%以上の活性を示す温度範囲は30〜40℃であった。以上より、本発明のフラビン結合型GDHの至適温度範囲は、30〜40℃、最も好ましい温度は37℃であると考えられた。
前記活性測定法において、基質であるD−グルコース濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数(Km)を求めた。この結果、D−グルコースに対するKm値は、MpGDHで31.1mM、MjGDHで26.4mM、McGDHで33.2mMであった。
100mM 酢酸カリウム緩衝液(pH5.0)を用いて、本発明のフラビン結合型GDHを各温度で15分間処理した時の熱安定性の結果を図4に示す(図4(A)はMpGDH、(B)はMjGDH、(C)はMcGDHの結果を示す)。本発明のフラビン結合型GDHは、40℃、15分間の熱処理後に80%以上の残存活性を有しており、約40℃まで安定であることがわかった。
次いでこれらのフラビン結合型GDHにおける安定pHを調べた。結果を図5に示す(図5(A)はMpGDH、(B)はMjGDH、(C)はMcGDHの結果を示す)。具体的には、100mM グリシン−HCl緩衝液(pH2.5−3.5、図中四角印でプロット)、100mM 酢酸カリウム緩衝液(pH3.5−5.5、図中△印でプロット)、100mM MES−NaOH緩衝液(pH5.5−6.5、図中斜め四角印でプロット)、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0−8.0、図中丸印でプロット)、100mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5−9.0、図中×印でプロット)を用い、それぞれのpHにおいて25℃で16時間処理した後、フラビン結合型GDHの残存活性をそれぞれ測定した。その結果、いずれも、最大の残存活性を示したpH5.0付近での活性に対し80%以上の活性を示すpH範囲はpH3.5−7.0であった。以上から、これらのフラビン結合型GDHの安定pH範囲はpH3.5−7.0であることが判った。
スーパーセップエース 10〜20%(和光純薬工業社製)を用いたSDS−ポリアクリルアミド電気泳動によりMpGDH、MjGDHおよびMcGDHの分子量を求めた。また、脱糖鎖キット(Enzymatic Deglycosylation Kit、PZM製)を用いて、各フラビン結合型GDHを脱糖鎖処理し、同様に電気泳動に供した。結果を図6に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン1:分子量マーカー(New England Biolabs社製、Protein Ladder(10−250kDa),上から250kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa、15kDa)
レーン2:MpGDH
レーン3:脱糖鎖処理後のMpGDH
レーン4:MjGDH
レーン5:脱糖鎖処理後のMjGDH
レーン6:McGDH
レーン7:脱糖鎖処理後のMcGDH
レーン8:脱糖鎖反応に使用した酵素
実施例1の酵素活性測定方法に準じ、基質としてはD−グルコース、マルトース、D−ガラクトース、D−キシロース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオースをそれぞれ用いて、各基質に対するフラビン結合型GDHの活性を測定した。基質濃度は50mMとした。結果を表3に示す。
これらのフラビン結合型GDHの活性に対する1,10−フェナントロリンの阻害効果を、以下の方法で調べた。実施例1の酵素活性の測定方法に準じ、ただし、終濃度が1mM、5mM、10mM、25mMおよび50mMとなるように1,10−フェナントロリンを添加した場合の酵素活性を求め、1,10−フェナントロリン無添加の阻害率を0%として、その阻害率を計算した。結果を表4に示す。
上述のフラビン結合型GDHを用いて、グルコースの測定を行った。具体的には、100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 1.79mL、D−グルコース溶液(250、750、1,250、1,750、2,500、3,250、4,000、5,000mg/dL) 0.08mLおよび20mM DCIP溶液 0.01mLを混合し、37℃で5分間保温後、20mM PMS溶液 0.02mLおよび0.8U/mL GDH溶液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)とグルコースの終濃度の関係を図7に示す(図7(A)はMpGDHを用いた測定結果、(B)はMjGDHを用いた測定結果、(C)はMcGDHを用いた測定結果を示す)。
100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 1.77mL、D−グルコース溶液(10,000、16,000mg/dL) 0.02mLおよび20mM DCIP溶液 0.01mLを混合した。続いて、マルトース溶液(3,000、6,000、9,000、12,000、15,000mg/dL)もしくはD−ガラクトース溶液(1,500、3,000、4,500、6,000、7,500mg/dL)もしくはD−キシロース溶液(1,000、2,000、3,000、4,000、5,000mg/dL) 0.08mLを添加して37℃で5分間保温した後、20mM PMS溶液 0.02mLおよび2.0U/mL GDH溶液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)、およびグルコースの終濃度の関係を表5〜7に示す。
100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 1.61mL、D−グルコース溶液(10,000、16,000mg/dL) 0.02mLおよび20mM DCIP溶液 0.01mLを混合した。続いて、マルトース溶液(3,000、6,000、9,000、12,000、15,000mg/dL)、D−ガラクトース溶液(1,500、3,000、4,500、6,000、7,500mg/dL)およびD−キシロース溶液(1,000、2,000、3,000、4,000、5,000mg/dL) をそれぞれ0.08mL添加して37℃で5分間保温した後、20mM PMS溶液 0.02mLおよび2.0U/mL のフラビン結合型GDH溶液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量(ΔA600)とグルコースの終濃度の関係を表8〜9に示した。
(1)mRNAの調製
Mucor prainii NISL0103をマルツエキス培地(マルツエキス 2.0%、グルコース 4.0%、ポリペプトン 0.1%、pH6.0)3mLに接種し、2日、30℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からmRNAを得た。
実施例2より得られたMpGDHをスーパーセップエース 10−20%(和光純薬工業社製)に供し、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをQuick−CBB(和光純薬工業社製)を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、LVENFTPPTPAQIE(配列番号5)およびIRNSTDEWANYY(配列番号6)であった。
上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー(プライマーの一例を配列番号7(フォワードプライマー)、配列番号8(リバースプライマー)に示す)を作製した。なお、配列番号7および8に記載の1文字表記において、混合塩基はそれぞれ、h=a+c+t、r=a+g、y=c+t、d=a+g+tを表す。上記(1)にて調製したMucor prainii NISL0103のmRNAをテンプレートとし、PrimeScript RT−PCR Kit(タカラバイオ社製)を用いて、本キットのプロトコールに従ってRT−PCRを行った。逆転写反応には本キット付属のオリゴdTプライマーを、PCRによるcDNA増幅には配列番号7、8に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、800bp程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅DNA断片を精製し、Ligation Convenient Kit(ニッポンジーン社製)を用いて、pT7Blue(ノバジェン社製)に前記増幅DNA断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドpTMGD−1を構築した。
Double−joint PCR(Fungal Genetics and Biology,2004年,第41巻,p973−981)を行い、5’アーム領域〜URA5遺伝子(ウラシル栄養要求性マーカー)〜TDH1プロモーター〜GDH遺伝子〜3’アーム領域をタンデムに連結した遺伝子発現カセットを構築した。なお5’アーム領域、及び3’アーム領域とは、Zygosaccharomyces rouxii IFO1876におけるTDH1遺伝子の上流、及び下流のそれぞれ約1kbの領域である。これをエレクトロポレーションによってZygosaccharomyces rouxii IFO1876のコンピテントセルに対して形質転換を行った。なお、エレクトロポレーションはJ Microbiol Methods 55 (2003)481−484の報告と同様に実施した。ここで得られた菌体を最小培地のプレートにスプレッドし、ウラシル非要求性を指標として酵母形質転換体を取得した。
得られた培養液を50mL容ファルコンチューブに移し、4℃、8,000×g、5分間の条件で遠心分離を行うことで菌体と培養上清を分離し、各々に含まれるGDH活性を測定した。具体的には、得られた菌体を50mLの10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)に再懸濁し、この溶液をマルチビーズショッカー(安井器械社製)により2,000rpm、60秒×8回の菌体破砕を行い、14,000rpm、30分間の遠心分離後、得られた上清画分の酵素活性を測定して「菌体内GDH」の活性とした。また、培養上清中の培地成分を除去する目的で培養上清をPD−10カラム(GE Healthcare社製、スウェーデン)にかけ、10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)にて溶出して得られたGDH画分の酵素活性を測定して「菌体外GDH」の活性とした。
前述の酵素活性測定法により測定を行った結果、「菌体内GDH」の活性は4.6U/mL、「菌体外GDH」の活性は27.6U/mLであった。すなわち、本発明の形質転換体を培養した場合は、生産されるGDHの大半は培養上清中に分泌されることが確認された。そして、このことは、本発明のGDHにおいて、Mucor由来のシグナル配列が異種の宿主である酵母内においても機能し、しかもむしろ本来の由来微生物により達成されるよりも効率良くGDHを培養上清中に分泌させることができたことを意味する。一般には、シグナル配列の機能は、そのタンパク質を生産する宿主に限定的であることが多く、ある宿主において効果的なシグナル配列が異種の宿主に同様の効果を奏することはほとんどないことから、この結果は全く予期せぬ効果であった。
上述の通り、本発明の酵母形質転換体の培養上清からは、植菌後24時間の培養後で27.6U/mLのフラビン結合型GDHが確認されている。また、このGDHは培養上清中にほぼシングルバンドの純度で存在するため、非常に効率的に精製工程を行うことができる。一方、実施例1の表1記載の通り、Mucor属やAbsidia属、Actinomucor属等のケカビ由来の本来のGDH生産微生物を培養して得られる酵素の生産量は、0.001U/mL未満か、0.1〜0.2U/mLのものが多く、最大でも0.714U/mLというレベルにとどまっていた。すなわち、本発明の酵母形質転換体を用いることによって、培養液あたり40〜200倍以上の酵素活性を得ることができ、より小さい設備で効率よく製造を行うことができるようになる。さらには、これら本来のGDH生産微生物の培養工程には、3〜5日という長期間培養工程と、遠心分離で菌体を取得し菌体破砕(酵素抽出)を行う工程、さらに、再度遠心分離して粗酵素液を調製するという工程が含まれるが、本発明の酵母形質転換体を用いることによって、培養日数および、菌体破砕(酵素抽出)工程を大幅に短縮することができるようになり、効率的な製造が可能となる。
本発明の酵母形質転換体の培養上清をMicrocon YM−50(Millipore社製、米国)を用いて50倍濃縮し、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動(スーパーセップエース10〜20%、和光純薬工業社製)に供した。泳動サンプルは以下の通りである。結果を図8に示す。
レーン1:分子量マーカー(New England Biolabs社製、Protein Ladder(10〜250kDa),上から250kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa)
レーン2:コントロール株の培養上清(50倍濃縮サンプル)
レーン3:本発明の酵母形質転換体の培養上清(50倍濃縮サンプル)
なお、本発明に用いるGDHの本来の由来微生物であるケカビが生産するGDHにおいても、このような糖鎖の付加が認められており、図6に示す通り、GDHから糖鎖を外す処理を行う前後で、検出されるバンドの分子量の変化が確認されている。糖鎖を外す前のケカビ由来GDHは、微生物の種類によって若干の幅を有するが、バンドの幅の中心付近に相当する分子量にして約100〜150kDaであり、実施例7に記載の酵母形質転換体に用いられたMpGDHの場合は、約100kDaである。一方、このMpGDHの遺伝子情報を利用して作製した本発明の酵母形質転換体の培養上清中に認められるGDHは、糖鎖を外す前の分子量が、バンドの幅の中心付近に相当する分子量として約200kDaであり、本来の由来微生物中で発現する場合の約2倍に増加していることがわかる。
より具体的な糖鎖の付加状況の詳細については、各種公知の分析方法を用いることにより明らかになるであろうが、上述の分子量変化からも容易に推察されるように、本発明の酵母形質転換体を用いることにより、ケカビ由来GDHと同じポリペプチド配列を有するGDHでありながら、糖鎖の付加状態が大きく異なる新規なGDHを製造することができることがわかった。そして、本発明のGDHにおけるこのような糖鎖の付加状態の変化がGDHの酵素としての性質に顕著な変化をもたらすことにより、実用性に一層優れたGDHを提供することが可能となることは、全く予期せぬ効果であった。
実施例3に準じて、本発明の酵母形質転換体の培養上清から取得された本発明のフラビン結合型GDHにおける至適pH、至適温度範囲、熱安定性、安定pHの範囲、基質特異性等の諸性質を調べた。その結果、本発明の酵母形質転換体が生産する本発明のフラビン結合型GDHは、特にその熱安定性において、ケカビ由来GDHの熱安定性よりも優れていることが確認された。その結果を図9に示す。
図4に示す通り、本来の由来微生物であるケカビによって生産されるGDHは、35℃まではほとんど失活せず、40℃、15分間の処理で80%以上の残存活性を有することを特徴とする。そして、45℃、15分間の処理では残存活性が40〜60%となり、50℃、15分間の処理により、3種のうち2種では完全に失活し、最も耐熱性の高い1種でも約40%まで低下した。そして、55℃以上の熱処理に供した場合は、いずれも完全に失活した。
これに対し、図9に示す通り、本発明の酵母形質転換体の培養上清から取得された本発明のフラビン結合型GDHでは、40℃、15分間の処理ではほぼ100%の活性が残存剤していた。さらに、45℃、15分間の処理でも残存活性が80%を超えており、50℃、15分間の処理でも50%以上、ほぼ60%に近い残存活性が確認された。さらに、ケカビにおいて生産させたものでは15分間の熱処理により完全に失活していた55℃以の熱処理に供した場合においても、約10%の残存活性が確認された。
図10の黒丸のプロットは、本発明の酵母形質転換体により生産されるGDHを50℃での熱処理に供した際の、熱処理時間と残存活性との関係を示す。この結果、本発明の酵母形質転換体により生産されるGDHは、50℃での熱処理を30分間行っても、20%を超える活性が残存していることがわかる。このような熱安定性は、本来の由来微生物が生産するGDHと比較して、顕著に優れている。本来のケカビで生産されるGDHでは達成できなかったこのように高い耐熱性が、酵母形質転換体を用いることにより獲得されるという本発明の知見は、製造・流通時に非常に有利であるとともに、酵素の使用時においても、より広範な温度範囲での用途が可能となるという点で非常に優れた新規な酵素を提供でき、GDHの付加価値を高めることに寄与する。
なお、耐熱性以外のその他の性質においては、本発明の酵母形質転換体の培養上清から取得された本発明のフラビン結合型GDHは、実施例2により得られた精製GDHと同様の性質を有していることが確認された。
本発明においては、宿主として酵母を用いているが、比較のため、酵母以外の宿主を用いて同様に形質転換体を作製し、得られるGDHの耐熱性を比較を行った。比較用の宿主としては、本来の由来微生物と同じカビの一種である麹菌(Aspergillus属)を用いた。
具体的には、Double−joint PCR(Fungal Genetics and Biology,2004年,第41巻,p973−981)を行い、5’アーム領域〜PyrG遺伝子(ウラシル栄養要求性マーカー)〜TEF1プロモーター遺伝子〜フラビン結合型GDH遺伝子〜3’アーム領域から成るカセットを構築し、Aspergillus sojae K.K.1-2株を宿主に、プロトプラスト−PEG法により形質転換を行った。得られた菌株の中から目的の麹菌形質転換体を、PCRで確認して選抜した。
培養後のふすま麹2gに対し、5倍量の10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)を加え、ポリトロンホモジナイザーPT3000(キネマチカ社製)で30秒×8回破砕を行った。破砕後、14,000rpm、30分間遠心分離を行い、得られた上清画分を粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法により、この粗酵素液中のGDH活性を測定したところ、コントロール株を用いて得られた粗酵素液中のGDH活性は0.3U/mLであったのに対し、麹菌形質転換体を用いて得られた粗酵素液中のGDH活性は14.0U/mLであり、麹菌形質転換体において本発明のフラビン結合型GDHが発現されていることが確認された。
レーン1:分子量マーカー(New England Biolabs社製、Protein Ladder(10−250kDa),上から250kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa)
レーン2、3:得られた麹菌形質転換体により生産されたGDH
図6、図8、および図11のバンドを比較した場合、麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来GDHの分子量は、本来の由来微生物であるケカビにより生産されるGDHの分子量に非常に近く、一方、本発明の酵母形質転換体により生産されるケカビ由来GDHの分子量とは大きく異なっていることがわかる。すなわち、このことから推察して、麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来GDHにおける糖鎖の付加状態は、本来の由来微生物であるケカビにより生産されるGDHにおける糖鎖の付加状態に近く、一方、本発明の酵母形質転換体により生産されるケカビ由来GDHの糖鎖の付加状態とは大きく異なっていることが強く示唆された。
実際に、この麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来GDHの耐熱性データを図10に示す。図10の白三角のプロットは、麹菌形質転換体により生産されるGDHを50℃での熱処理に供した際の、熱処理時間と残存活性との関係を示す。この結果、麹菌形質転換体により生産されるGDHは、50℃での熱処理を15分間行うことにより、残存活性が20%未満に低下した。また、30分間の処理では、残存活性が10%未満に低下した。この熱安定性は、本来の由来微生物が生産するGDHと比較して格別向上していないどころか、むしろ低下傾向を示しているとも思われる。
すなわち、ケカビ由来のGDH遺伝子を各種の宿主に導入した場合において、本来の酵素の性質を保持した状態で活性を容易に発現できるとは限らず、まして、本来の酵素の性質よりも優れた状態の酵素として活性を発現させるということは容易に実現できないことである。本発明の酵母形質転換体を用いることによりこれが実現できるという知見は、製造・流通時に非常に有用で、かつ、広範な温度範囲での用途が可能である新規な酵素を提供できるという点で非常に有意義であり、より付加価値の高いGDHの提供に寄与する。
麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来GDHの熱安定性は、本発明の酵母形質転換対により生産されるGDHの熱安定性よりは、図6に示されている本来の由来微生物であるケカビにより生産されるGDHの熱安定性に比較的近いことが認められる。そして、この結果からは各GDHにおける糖鎖の付加状況と熱安定性の類似性と相関を有することが示唆される。すなわち、本発明の酵母形質転換体により生産されるGDHには多量の糖鎖が付加しており、このことにより、本来の由来微生物であるケカビにより生産されるGDHが有し得なかった高い耐熱性を獲得するに至ったのではないかという可能性が推察される。
Claims (6)
- 配列番号1または配列番号3で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と90%以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、
以下の(i)から(iv)の性質:
(i)作用:電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
(ii)分子量:タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が80kDaである、
(iii)基質特異性:D−グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びD−ガラクトース、及びD−キシロースに対する反応性が2%以下である、
(iv)50℃、15分間の熱処理において50%以上の残存活性を有する、
を備える、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。 - フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼがケカビ亜門、ケカビ綱、ケカビ目、又はケカビ科に分類される微生物に由来し、酵母を宿主として発現されることを特徴とする請求項1記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号1または配列番号3で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と90%以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を酵母に導入して得られる酵母形質転換体。
- 酵母がチゴサッカロマイセス属、サッカロマイセス属、ピキア属、カンジダ属に属する、請求項3記載の酵母形質転換体。
- 請求項3又は4記載の酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
- 以下の(A)〜(E)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子:
(A)配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2で示される塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードするDNA;
(D)配列番号4で示される塩基配列からなるDNA;
(E)配列番号2又は配列番号4で示される塩基配列と90%以上同一な塩基配列、
を有し、かつフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするDNAが導入されている酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
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