CN103540572A

CN103540572A - 具有改善的底物特异性的pqq-依赖性葡萄糖脱氢酶的新变体

Info

Publication number: CN103540572A
Application number: CN201310472347.1A
Authority: CN
Inventors: W.韦歇尔; V.莫尔勒; M.欣德勒; R.科克; R.梅斯基斯
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG; Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2008-06-26
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2014-01-29
Also published as: WO2009156083A1; US20110236920A1; US8580547B2; EP2294188A1; JP2011525361A; CN102076846A; DE102008030435A1

Abstract

本申请涉及具有改善的底物特异性的PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的新变体。本发明涉及新的PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶（sPQQGDH），与野生型相比较而言，其具有增加的底物特异性，而且还涉及用于其生产和鉴别的方法。

Description

具有改善的底物特异性的PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的新变体

本申请是申请号为200980124063.5、申请日为2009年6月17日的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明的主题是PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶 (sPQQGDH)，它们的生产和鉴别方法，编码根据本发明的sPQQGDH的基因，生产该基因的载体，以及包含根据本发明的葡萄糖脱氢酶的葡萄糖传感器。

背景技术

葡萄糖的酶测定在医学诊断中是非常重要的。这里，检测尿或血液中的葡萄糖以诊断或监测代谢性疾病的进展是必需的。在糖尿病（也称为糖尿病）的情况中，每天可能需要多次测定血糖浓度。这可以通过市场上绝大多数的计量器通过酶方法实现，在酶方法中葡萄糖被氧化，由此得到的氢(2H⁺和2e^-)进行电流分析定量(P. Vadgama，J.Med.Eng Technol. 5 [6]，293-298 (1981)，K.S. Chua 和I.K. Tan，Clin.Chem. 24 [1]，150-152 (1978))。

存在许多适合这种目的的各种酶，但是这些酶与各种辅助因子共同作用进行电子的主要接收，并且还具有不同的生化性质诸如特异性、稳定性或转换率。酶的转换率通常以活性单位(U)进行报道；在葡萄糖-氧化酶的情况中，比活性 (U/mg) 通常是指在确定的反应条件下每分钟被1毫克酶氧化的以微摩尔计的葡萄糖的量。

通常使用的酶为葡萄糖脱氢酶(GDH)。在NAD(P)⁺-依赖性GDH的情况中，辅助因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP⁺) (H. E. Pauly 和G. Pfleiderer，Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 356 [10]，1613-1623 (1975))，二者均为相当不稳定的必须添加到反应中的化合物，因为它们不与酶结合。

另一类葡萄糖脱氢酶含有作为电子受体与酶结合的吡咯并喹啉醌 (PQQ)。已经描述了这种类型中两种结构相互不同的葡萄糖脱氢酶：膜锚定型，mPQQGDH (A.M Cleton-Jansen等，J. Bacteriol. 170 [5]，2121-2125 (1988))，和较小的可溶型，sPQQGDH (A.M. Cleton-Jansen等，Mol.Gen.Genet. 217 [2-3]，430-436 (1989))。由于后者的高比活性、其对氧的不敏感性以及紧密地结合，其为稳定的辅助因子，为特别适合生产用于葡萄糖测定的测试系统的酶。因此在许多商品化的血糖计量器中，使用这种酶，尽管与提到的其他酶相比，这种酶显示更低的底物特异性。由于最后提到的限制，当然希望拥有具有更高底物特异性的这种酶的变体。

除了底物葡萄糖外，sPQQGDH还将其他糖转化为相应的内酯，优选二糖，其中还原糖为葡萄糖，但也有其他还原糖。由于这种糖正常不存在于人的血液中，基于sPQQGDH的酶测试通常得到对应于葡萄糖浓度的结果。然而，某些医学治疗包含施用物质，该物质的一种分解产物为麦芽糖，麦芽糖被sPQQGDH氧化并且因此不希望地影响测量结果(T.G. Schleis，Pharmacotherapy 27 [9]，1313-1321 (2007))。在诊断方法中或者作为药物的佐剂施用木糖和半乳糖时，测定这些糖自身。因此以适当的方式抑制sPQQGDH的辅助活性是有意义的。

在文献以及在专利说明书中，描述了许多通过引入突变来改善sPQQGDH的底物特异性的尝试 (S. Igarashi等，Biomol. Eng 21 [2]，81-89 (2004))。为此，在酶的催化位点（EP1666586A1）以及在其他位点（US7132270B2）的区域内的单个氨基酸通过定向诱变被其他氨基酸取代，或者通过插入来插入单个氨基酸（EP1367120A2）。此外，描述了各种突变的组合（EP1666586A1，US7132270B2）。另外，已经描述了在sPQQGDH的一个位点插入两个氨基酸的变体。然而，结果没有获得底物特异性的显著改善(WO2006085509)。

尽管存在这些结果，但仍然需要sPQQGDH的变体，因为至今还未描述过在与葡萄糖足够高的反应性下能够充分识别葡萄糖和其他糖的变体。这里重要的是，更特别地，即使在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下，酶使葡萄糖浓度可靠地测定的能力。所描述的变体没有充分地显示这种性质。

发明内容

考虑到现有技术，因此本发明的目的是提供使可靠的葡萄糖测定成为可能的葡萄糖脱氢酶，即使在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下。更特别地，本发明的目的是提供葡萄糖脱氢酶，使用该葡萄糖脱氢酶可以在麦芽糖的存在下可靠地测定葡萄糖。此外，本发明的目的是提供可以生产和鉴别这种葡萄糖脱氢酶的方法，在其他糖的存在下，更特别地在麦芽糖的存在下，该葡萄糖脱氢酶特别适合用于葡萄糖的测定。

现已惊奇地发现，在底物结合区域的范围内插入3-5个氨基酸的sPQQ 葡萄糖脱氢酶，与酶的原型相比显示改善的葡萄糖特异性。

因此，本发明的主题是与酶的原型相比具有改善的葡萄糖特异性的sPQQ 葡萄糖脱氢酶，其特征在于，在底物结合区域的范围内插入3-5个氨基酸。

可以通过所述的天然存在的野生型菌株通过诱变获得的基因编码根据本发明的sPQQGDH，诸如醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) LMD 79.41 (K. Kojima K.等，Biotechnology Letters 22，1343-1347 (2000))，以及不动杆菌(Acinetobacter)属的其他菌株(P.J. Bouvet P.J. 和O.M. Bouvet，Res. Microbiol. 140 [8]，531-540 (1989))，更特别地具有增强的热稳定性的那些，诸如在EP1623025A1中描述的不动杆菌属菌株。优选的菌株为EP1623025A1中描述的不动杆菌属菌株PT16、KOZ62、KOZ65、PTN69、KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25和KGN100；更特别优选的是菌株KOZ65。

为了能够获得根据本发明的sPQQGDH，密码子必须插入到对应于适合这种方式的sPQQGDH基因中的底物结合位点的位置。许多sPQQGDH的空间结构是已知的并且储存于公共数据库中 (A. Oubrie等，J. Mol. Biol. 289 [2]，319-333 (1999)；A. Oubrie等，EMBO J. 18 [19]，5187-5194 (1999))。因此，可以估算各个氨基酸位置与结合底物的距离。这种估算，例如，可能使用蛋白质的可视化程序，诸如由互联网上可以获得的软件程序Cn3D(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)。公开的X-射线结构的序列是基于醋酸钙不动杆菌的sPQQGDH，其长度为455个氨基酸。更优选的来自菌株KOZ65的sPQQGDH的原型具有456个氨基酸，就像鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的酶一样。在两种情况中，这样的原因是由于位置289之后其他的谷氨酰胺残基。以下是与更短的、在X-射线结构中所用的sPQQGDH序列有关的各个氨基酸位置的细节，所述sPQQGDH来源于菌株醋酸钙不动杆菌LMD 79.41。据报道位于那里的氨基酸在该位置前面的氨基酸的单字母密码中。

距离底物不大于5 埃的氨基酸区域，诸如，例如，位置Q76、D143、Q168、Y343和各自邻近的氨基酸残基，对于诱变而言是优选的。因此，3个或更多个氨基酸的插入可以，例如，在一个特定的位置之前或之后出现，以便改变底物结合位点的空间结构。更优选的是在位置Q168和L169之间的其他氨基酸的插入。在该位点具有插入的KOZ65的变体主要令人惊奇地表现出，与葡萄糖相比大比例的显著降低的对麦芽糖的活性。特别优选的是在位置Q168和L169之间具有表1所列的插入序列的sPQQGDH。作为比较，野生型显示于第一行中。如表1所概述，根据本发明的sPQQGDH具有增加的底物特异性（更低的麦芽糖/葡萄糖比和葡萄糖/麦芽糖混合物中更低的葡萄糖干扰值）。

表 1:

Figure 2013104723471100002DEST_PATH_IMAGE001

本发明的主题还进一步是用于生产和鉴别 sPQQGDH的方法，所述sPQQGDH与野生型相比显示增强的底物特异性。通过定域随机诱变，根据本发明的方法可以生成多种变体，该变体在sPQQGDH 序列的所需位点具有3个、4个、5个或更多个插入的氨基酸。将生成的酶进行底物特异性筛选，选择最好的变体。

根据本发明的方法的特征在于，在第一步中生产载体，在该载体中在所需插入位点之前和之后的合适序列区域已经被删除并且被该载体的独特限制位点所替代。在第二步中向使用该限制性内切酶开放的载体-DNA 中插入双链寡核苷酸序列，以便得到基因产品，所述双链寡核苷酸序列通过PCR扩增生产并且除了载体中删除的序列外还含有所需的插入，所述基因产品除了在所需位点的3个或更多个氨基酸的插入外，对于其氨基酸序列，不含有其他改变。借助PCR由合成的寡核苷酸生产的待插入的双链片段含有3个或更多个用于改变底物特异性的其他随机密码子，以及载体中删除的密码子。为此所选择的密码子可以特别好地表达于E. coli.中。因此除了插入区域外，该核苷酸序列与KOZ65的sPQQGDH-基因的核苷酸序列不同，而不是与氨基酸序列不同。

使用3个其他氨基酸的插入时，8000个酶变体是可能的；在使用4个其他氨基酸时，数量为160,000；和在使用5个其他氨基酸时，存在320万个变体。因此除了完全随机的序列，诱变的寡核苷酸的合成可以利用，诸如在某些或所有位置含有对于每个待插入氨基酸的简并密码子的序列。可以这样使用以便减少所有可能性的数量，避免终止密码子或有利于特定位置的个别氨基酸。

在根据本发明方法的第三步中，将以如上所述方式生产的重组载体转换到合适的宿主细菌中，并且该宿主细菌在合适的生长培养基中增殖。由微生物克隆基因的方法和它们在另外的宿主中的表达以及分离和改变核苷酸的技术是本领域技术人员已知的(参见，例如，Molecular Cloning – A Laboratory Manual；第1卷； Sambrook，J.和Russel，D.W.；第3版，CSHL Press 2001)。培养微生物和从其中纯化重组体酶也是本领域已知的(参见同上；第3卷)。

在根据本发明方法的第四步中，测试菌落对各种糖的活性，由此鉴别出最好的。根据本发明，本文不但完成了对各种糖的活性的测试，而且还完成了各种糖的干扰的测试。

可以以比活性测定该活性，即，每时间单位通过确定量的酶转换的转换率。在葡萄糖氧化酶的情况中，比活性 (U/mg) 通常是指在确定的反应条件下每分钟被1毫克酶氧化的以微摩尔计的葡萄糖的量。相对于酶，葡萄糖通常是过量存在的，以便消除葡萄糖浓度对反应速率的影响。通过随时间示踪试剂(Edukts)的分解或产物的形成确定转换率。随时间示踪可以通过例如光度测定进行。为了确定反应速率和转换率，可以参考物理化学教科书(例如，Peter Atkins，Physical Chemistry，W. H. Freeman & Co；第7版，2002)。

最初，分离各个菌落，使用葡萄糖作为底物进行酶试验 (确定比活性)，使用第二种糖例如麦芽糖作为底物进行第二酶试验。在对葡萄糖具有最高活性而同时对第二种糖（例如，麦芽糖）具有最小活性的菌落的情况中，还测定了对葡萄糖和第二种糖（例如，麦芽糖）的混合物的活性。这是因为其特别出现在对作为唯一底物的麦芽糖具有非常低的相对反应性的某些变体的研究中，令人惊奇地，变体的这种性质并不总是伴有独立的性质，即当葡萄糖和麦芽糖两种糖作为混合物存在时对葡萄糖和麦芽糖的可靠识别。这会导致存在于该混合物中的葡萄糖浓度的高估和低估。因此在寻找用于测定测试样品中葡萄糖浓度的酶中，对葡萄糖和其他糖的混合物的高葡萄糖特异性是至关重要的，或者换句话说，所讨论的糖的尽可能低的干扰。糖的干扰通过由葡萄糖和干扰的糖的混合物测定的酶活性减去由相同浓度的葡萄糖单独测定的活性，标准化至该葡萄糖活性进行计算(参见等式1)。

Figure 2013104723471100002DEST_PATH_IMAGE002

(等式1)

在等式1中，I 为葡萄糖与其他糖的干扰，V_参比为葡萄糖被所测定的酶分解的速率，V_混合物为葡萄糖在与各种情况下的其他糖的混合物中的分解速率。该速率可以，例如通过光度测定确定(为此，参见实施例 3、4、7和9)。

在本文中正值表示对混合物的酶活性高于对葡萄糖单独的酶活性，即，两种糖明显都被氧化。负值可以解释为干扰糖也被氧化，但结果降低了酶对葡萄糖的活性的作用。两种作用对用于特异性定量葡萄糖的酶而言都是不希望的。

根据本发明的方法可以生产和鉴别sPQQGDH的变体，其中与酶的原型相比，改变了底物特异性。还可以修饰根据本发明的方法和/或将其扩展到并非底物特异性或除了底物特异性之外的作用，测试其他生化性质，诸如，例如，热稳定性，因此，鉴别与原型相比并且对于其他生化性质改善的变体。根据本发明的方法因此能够选择具有特别有利性质的sPQQGDH的变体。

本发明的主题还是编码根据本发明的sPQQGDH的基因，和用于生成该基因的载体。

本发明的主题还是用于测定葡萄糖的包含根据本发明的sPQQGDH的葡萄糖-传感器。基于葡萄糖脱氢酶的葡萄糖-传感器的设计和操作方式(Funktionsweise)是本领域技术人员由现有技术已知的(参见，例如，EP1146332 A1)。根据这些，这种葡萄糖-传感器包含电极系统，该电极系统在绝缘板上包括工作电极、对电极和参比电极，并且支承酶反应层，所述酶反应层含有葡萄糖脱氢酶和与电极系统接触的电子受体。

合适的工作电极包括碳、金、铂和类似的电极，根据本发明的酶通过交联剂固定在电极上：埋入聚合物基质中，使用透析膜包裹，使用光致交联聚合物、导电聚合物或氧化还原聚合物，将酶固定于聚合物中或者使用包括二茂络铁或其衍生物或其任意组合的电子传递体吸附到电极上。根据本发明的sPQQGDH优选以全酶形式固定在电极上，虽然它们也可以作为酶蛋白固定，PQQ作为分离层或在溶液中提供。根据本发明的sPQQGDH通常使用戊二醛固定在碳电极上，然后使用含有胺的试剂处理，以便封闭戊二醛。例如，铂电极，可以用作对电极，例如Ag/AgCl电极，可以用作参比电极。

可以如下测量葡萄糖的量：将PQQ、CaCl₂和介质加入到含有缓冲液的恒温细胞中，并置于恒温下。合适的介质包括，例如，铁氰化钾和吩嗪硫酸甲酯。根据本发明的sPQQGDH已经固定在其上的电极用作与对电极 (例如，铂电极)和参比电极 (例如，Ag/AgCl 电极)组合的工作电极。在应用恒定的电压在工作电极上建立稳定的电流后，加入含有葡萄糖的样品，以便测量电流强度的增加。可以由使用标准浓度的葡萄糖溶液建立的标准曲线读出样品的葡萄糖量。

下文借助实施例更详细地解释本发明，但本发明不限于实施例。

具体实施方式

实施例

下列实施例中引用的化学品是由例如Fa. Sigma-Aldrich或每种情况下指定的公司商业可获得的。

实施例1：用于在Q168和L169之间插入其他氨基酸的载体的生产

为了生产根据本发明的变体，必须在表达质粒中提供用于sPQQGDH的基因，该表达质粒可以在微生物中增殖以允许sPQQGDH的诱导表达，并且该表达质粒可以用于实施所需的突变。许多可以用于该目的的质粒和微生物是本领域技术人员已知的。在该实施例以及所有其他实施例中，使用基于商业可获得的载体pASK-IBA3 (IBA GmbH，Göttingen)的构建体。可以如下将菌株不动杆菌属 KOZ65的sPQQGDH基因克隆到pASK-IBA3中。根据生产商的说明，使用两种寡核苷酸 GDH-U3 (5'-TGGTAGGTCTCAAATGAATAAACATTTATTGGC TAAAATTAC-3'；SEQ ID 19) 和GDH-L5 (5’-TTCAGCTCTGAGCTTTATATGTAAATCTAATC-3’；SEQ ID 20)，借助PCR反应(Phusion DNA 聚合酶，Finnzymes Oy) 由不动杆菌属 KOZ65的基因组DNA生成1.46 kb长的DNA片段。提纯该片段并随后使用限制性酶BsaI培养。使用限制性内切酶HindIII开放载体pASK-IBA3。通过热处理使限制性内切酶变性，在dATP、dCTP、dGTP和dTTP的存在下使用T4 DNA多聚酶填充得到的DNA突出端。随后提纯DNA并使用限制性酶BsaI培养。清除这样释放的114 bp长的片段；将具有KOZ65的sPQQGDH基因的PCR 扩增子连接到3.1 kb长的载体片段中。将连接产物转化到E. coli菌株DH5α的感受态细胞中。以这种方式生产的载体 pAI3B-KOZ65适合KOZ65型的sPQQGDH的诱导性表达。载体 pAI3B-KOZ65的核苷酸序列报道于SEQ ID 21下；其编码的sPQQGDH的氨基酸序列报道于SEQ ID 22下。

为了能够在Q168和L169之间插入3个或更多个氨基酸，在初期生产载体 pAI3B-KOZ65-U。为此，载体pAI3B-KOZ65的质粒DNA用作使用引物IBA-For (5’-TAGAGTTATTTTACCACTCCCT-3’；SEQ ID 23) 和Eco109-Up (5’-GGTTAGGTCCCTGATCACCAATCG-3’；SEQ ID 24)的PCR扩增A的模板以及用作使用引物BfuA-US1 (5’-CACAGGTACACCTGCCGCCACT-3’；SEQ ID 25) 和Eco109-Down (5’-TACGAGGACCCAACAGGAACTGAGC-3’；SEQ ID 26)的PCR扩增B的模板。提纯由A得到的扩增子，使用限制性内切酶 XbaI和EcoO109I剪切。分离得到的588个碱基对(bp)长的片段。提纯由B得到的扩增子，使用限制性内切酶BfuAI和EcoO109I剪切。同样分离得到的353bp长的片段。使用限制性内切酶 BfuAI和XbaI剪切载体 pAI3B-KOZ65。在琼脂糖凝胶上分离得到的3567 bp长的片段。根据生产商的说明，对概述步骤使用来自Firmen New England Biolabs GmbH (Frankfurt)、Invitrogen (Karlsruhe)、Qiagen (Hilden)和Roche Diagnostics (Mannheim)的试剂盒和试剂。由Sambrook和Russell的步骤文集(Molecular Cloning – A Laboratory Manual； Sambrook，J. 和Russel，D.W.；第3版，CSHL Press 2001)获得其他方法。

随后连接3个片段并通过化学转化将其转移到E. coli-DH5α中。由12个菌落制备质粒DNA，随后通过合适的限制性内切酶消化进行检查以确定是否得到所需的质粒，在9种分离物中是这样的。通过对这些克隆中的四种进行测序，证实在所有的情况下除了图1e概述的改变外没有发生其他改变。

载体 pAI3B-KOZ65-U (SEQ ID 27)仅含有一个唯一的EcoO109I 限制位点 (RG’GNCCY)。EcoO109I生成3 bp长的5’ 突出端，其中中间核苷酸是任意的；在pAI3B-KOZ65-U的情况中，其在编码链上是A。在pAI3B-KOZ65-U中删除编码氨基酸R166-P182的DNA以及其他核苷酸，导致阅读框中移位。因此尝试表达该基因得到没有功能的缩短的多肽(SEQ ID 28)。如实施例2中更详细地描述的那样，该载体适用于掺入合成的、双链DNA片段，该片段导致在位置Q168和L169之间具有插入的功能sPQQGDH基因的复位。

实施例2 – 生产sPQQGDH 插入突变体

为了生产在位置Q168和L169之间具有4个其他氨基酸的插入突变体，使用4种合成寡核苷酸：EarV2-Random (5’-CGACGTAACCAGNNKNNKNNKNNKCTGGCTTACCTG-3’；SEQ ID 29)、EarV2-Lower (5’-GTGTGCTGTGCCTGGTTCGGCAGGAACAGGTAAGCCAG-3’；SEQ ID 30)、EarV2-UpAmp (5’-CCTACCTACGACTCTTCCGACGTAACCAG-3’；SEQ ID 31)和EarV2-LoAmp (5’-CCATGCTCTTCAGTCGGAGTGTGCTGTGCC-3’；SEQ ID 32)。在图2中，对由这些寡核苷酸生产双链插入片段的策略进行了图解说明。在这种情况下，4种所插入的氨基酸序列是随机的：NNK NNK NNK NNK。N在寡核苷酸的合成中在各自位置上是所有4种核苷酸的混合物(dATP (A)、dCTP (C)、dGTP (G)、dTTP (T))，而K为G或T。序列NNK使得所有20种氨基酸具有密码子成为可能，但仅针对三个终止密码子中的一个，降低不完全基因产物的可能性。在个别位置上的核苷酸的其他组合是自由选择的，为了例如限制密码子位置上的可能的氨基酸。寡核苷酸EarV2-Random 含有编码R166-L172的序列；代表互补链的寡核苷酸EarV2-Lower在L169-L172区域内重叠，并且一直延伸到T181。寡核苷酸EarV2-UpAmp在3’端与寡核苷酸EarV2-Random的5’端重叠12bp, 而寡核苷酸EarV2-LoAmp同样在3’端与寡核苷酸EarV2-Lower的5’端重叠12bp。最后提到的寡核苷酸各自含有EarI 限制位点 (CTCTTCN’NNN)。

首先，在PCR机器(GeneAmp 9600，Perkin-Elmer)中在10 mM Tris-HCl（25℃下pH 7.9）、10 mM MgCl₂、50 mM NaCl、1 mM 二硫苏糖醇(缓冲液NEB2)存在下，将寡核苷酸 EarV2-Random和EarV2-Lower加热至90℃并在5分钟内冷却至10℃。在加入所有4种DNA核苷酸和E. coli的DNA聚合酶的Klenow片段后，通过在室温下培养15分钟合成作为结果形成的部分双链DNA碎片以完成双链。然后，使用寡核苷酸 EarV2-UpAmp和EarV2-LoAmp将反应混合物引入PCR反应中，以便扩增获得的双链。由于在每种情况下扩增的寡核苷酸 EarV2-UpAmp和EarV2-LoAmp与新形成的双链的重叠仅为12bp，未使用PRC试剂盒的热稳定聚合酶而是使用E. coli的DNA 聚合酶的Klenow片段进行最初的两个扩增循环，以便实现用作引物的寡核苷酸 EarV2-UpAmp和EarV2-LoAmp的结合。为此，将起始反应升至94℃保持1分钟，随后置于冰上。然后，加入1 µL的DNA 聚合酶 (Klenow 片段) ，在18℃下培养3分钟，在25℃下培养1分钟。然后，将起始反应再次升至94℃保持1分钟，随后置于冰上。加入1 µL的DNA 聚合酶 (Klenow 片段) ，在18℃下培养3分钟，在25℃下培养1分钟。仅在此时在PCR机器中进行下列扩增程序(20 循环)：在94℃下1分钟，在52℃下1分钟，在72℃下1分钟。

在PCR扩增后，通过柱色谱(PCR Purification Kit，Qiagen)提纯反应并使用EarI剪切。随后在琼脂糖凝胶 (4% 琼脂糖) 上分离反应混合物，从凝胶上分离所需的64 bp 片段(SEQ ID 33)并提纯。

使用EcoO109I剪切实施例1所述的载体 pAI3B-KOZ65-U，随后根据生产商的说明 (New England Biolabs) 使用碱性磷酸酶脱磷酸以防止载体的再环化（Rezirkularisierung）。随后在16℃下以5：1的比例将64 bp 片段和使用EcoO109I线性化的脱磷酸载体连接过夜。64 bp 片段可以以相对于载体的所需方向而非其他方向连接于载体，从这个意义上来说，EcoO109I和EarI形成的5’ 突出端是适合的。因此排除具有错误方向的插入的连接产物，而非在每种情况下方向正确的多聚体的形成。然而，这种基因不会导致功能性sPQQGDH蛋白的表达，因为阅读框中发生了移位。将得到的连接产物转化到E. coli-DH5α中。由最初的转化混合物，将1/25、4/25和20/25各自涂布到20 cm x 20 cm大小的琼脂板上，以便通过至少一次稀释，获得每板约1000-5000个菌落的菌落密度。

在该实施例中概述了在每种情况下克隆表达具有4种其他氨基酸的sPQQGDH 变体的库的生产。以相同的方式实施具有其他长度的插入的库的生产。

实施例3 – 筛选变体-库

从根据实施例2所述的方法生产的库中选取合适的变体，借助自动菌落采集器QPix (Fa. Genetix) 从具有总共约4000个菌落的两个琼脂板中采集2200个菌落，转移至微量滴定板 (MTPs)中，在每种情况下，所述微量滴定板每孔(Well)具有含有100 µg/mL氨苄西林的200 µL的LB 培养基。使用原始菌株E. coli-DH5α::pAI3B-KOZ65的培养物另外接种4个MTP上的总共8个孔。使用透气薄膜(Airpore Sheets，Qiagen)密封MTP，在37℃下振摇5小时。随后，将50 µL各个单独培养物转移到同样在MTP中的新的培养容器中，在新的培养容器中存在含有氨苄西林的150 µL LB 培养基。为此，使用平行执行96次移液操作的移液机器人。该培养基另外接受200 ng/mL无水四环素，以便诱导sPQQGDH基因的表达。这些MTP在28℃下振摇过夜。

为了能够评价大量菌落的酶活性，使用不需要破裂细胞的试验：在通过加入PQQ激活酶之后，由于在二氯酚靛酚 (DCPIP)还原后的脱色作用，可以直接追踪糖的氧化。为了进行筛选，从所有孔中，将每个孔的40 µL诱导培养物与60 µL 葡萄糖测试溶液和另外的40 µL与60 µL 麦芽糖测试溶液混合，其中一个MTP仅含有葡萄糖测试溶液或仅含有麦芽糖测试溶液。同样使用移液机器人进行该操作。以这种方式，能够将各个单独的培养物分配到所有培养板和测量板上连续不变的位置。葡萄糖测试溶液含有下列组分(括号内：起始测量溶液中的最终浓度)：50 mM 葡萄糖(30 mM)，750 µM DCPIP (450 µM)，1.5 µM PQQ (0.9 µM)，1 mM CaCl₂ (0.6 mM)，0.1% NaN₃ (0.06%)，62.5 ppm (37.5 ppm) 硅酮消泡剂 (Fluka # 85390)，50 mM 三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(TRIS-HCl)，pH 7.6 (30 mM)。在麦芽糖测试溶液的情况中，不存在葡萄糖，但存在相同浓度的麦芽糖。

对于每个具有培养物的MTP，以这种方式生成两块测量板，一块用于葡萄糖，另一块用于麦芽糖。对于每块测量板，在培养物和测试溶液混合后测定 (Eppendorf-Biophotometer)的不同的时间点在605nm的波长下的光密度：1分钟后，7分钟后，12分钟后和18分钟后。以这种方式，对于每个最初分离的菌落，能够记录葡萄糖作为底物的酶动力学和麦芽糖作为底物的酶动力学。由此，能够确定克隆与作为底物的葡萄糖彼此间的相对活性以及每种单独的克隆对葡萄糖和麦芽糖的活性比。图3显示对于由筛选在位置Q168和L169之间具有5个其他氨基酸的库得到的MTP 13和22的这种测量的结果。很明显，约2/3的测试菌落具有小于50个相对单位的葡萄糖转化率，低于测试的读出准确度。在这些菌落中，没有检测到sPQQGDH的显著表达，其导致非常低的培养物生长、差的sPQQGDH基因诱导，不生产的双插入或氨基酸组合的插入，其不再使形成的蛋白具有酶活性。与葡萄糖相比，绝大部分数量的剩余菌落显示对麦芽糖的更低活性。如图3所示，与原始克隆 E. coli-DH5α::pAI3B-KOZ65相比，初步筛选的结果显示相似的许多变体的高转化率。然而，应当始终检查相对活性，因为在大于某一转化率时，设计用于非常多的单个测定的这个实验不能进行区分。与KOZ65的sPQQGDH相比，变体的sPQQGDH通常具有比由所示筛选所预期的更低的转化率。

实施例4 – 单个菌落的精细筛选

实施例3中所述的筛选用于选择188个菌落，其中对葡萄糖的活性和对葡萄糖或麦芽糖的活性的比例都显示特别有前景，如实施例3所述，将这些菌落与原始菌株E. coli-DH5α::pAI3B-KOZ65的培养物一起安排在两个新的MTP上，开始在37℃下生长，然后在28℃下诱导过夜。为了进行诱导，每个MTP设置两块板，以便得到足够的进行筛选实验的培养物体积。在诱导后，将各自约为200 µL的平行生长的培养物合并并混和。在每种情况下，由每个这些诱导的培养物中，在各种情况下转移40 µL到测量板中，其中在每种情况下存在60 µL实施例3中所述的测试溶液，但是具有下列糖：G – 50 mM 葡萄糖，M – 50 mM 麦芽糖，GM – 50 mM 葡萄糖和50 mM 麦芽糖，GGal – 50 mM 葡萄糖和50 mM 半乳糖，或GXyl – 50 mM 葡萄糖和50 mM 木糖。在培养物和测试溶液混合30分钟后以30秒的间隔迅速测量这些板，以便获得各种单个培养物的动力学。由这样获得的数据，可以估计每个培养物的葡萄糖和麦芽糖单独的转化率、对葡萄糖和麦芽糖活性的比例，以及特别地，麦芽糖、半乳糖和木糖对葡萄糖转化的影响(干扰)。在图4中，显示了选择用于实施例3中所述筛选的菌落(第2次筛选)的这种随访研究的结果。

第一次筛选的MTP 13的两个菌落(13-G3和13-B2；在图3和4中各自使用矩形标记)通过实施例表明，具有有前景的麦芽糖活性对葡萄糖活性的比例的菌落（图3）能够显示强烈地偏离干扰行为：13-G3经历麦芽糖的负干扰；13-B2经历正干扰。

根据两次所述的筛选，选择总共28个菌落用于进一步的研究。

实施例5 –表达变体形式的sPQQGDH的菌株的生长

首先，由四种所选的菌落的每种如下生产预培养物，所述菌落来自在每种情况下在位置Q168和L169之间具有3个其他氨基酸的库：使用所检查的菌落接种2 mL TB 培养基(含有100 μg/mL 氨苄西林)，在37℃和225rpm下振摇过夜。对于主要培养物，使用完全生长的预培养物接种50 mL TB 培养基(100 μg/mL 氨苄西林)。在37℃和225rpm下振摇培养物，直至达到在605 nm (OD₆₀₅)下的光密度约为1。然后，通过加入无水四环素 (AHT) 菌株溶液诱导酶的表达。为此，将诱导物溶解于DMF中。AHT在培养物中的最终浓度为0.2 μg/mL；诱导在27℃和225rpm下进行24小时。

在4℃下通过在3220 x g下将主要培养物离心15分钟收集细胞。根据量，将片状沉淀细胞每次再混悬于用量为10–20 mL的pH 7.6的50 mM 3-吗啉代丙烷磺酸缓冲液(MOPS)中和2.5 mM CaCl₂中，通过超声溶解处理，直至观察到显著澄清的细胞混悬液。在4℃下将细胞碎片和任何存在的包涵体在48,745 x g下离心10分钟。

实施例6 – 变体sPQQGDH 的提纯

使用柱缓冲液(10 mM MOPS，pH 7.6 + 2.5 mM CaCl₂)以1:5将实施例5的上清液稀释至10或50 mL，通过阳离子交换剂(Toyopearl CM-650M，Fa. TOSOH BIOSEP GmbH)进行色谱拆分。为此，使用具有约16 mL柱床的10 x 1.42 cm柱；流速为4 mL/分。使用10倍柱体积的缓冲液平衡柱；然后，应用样品。使用4 倍柱体积的缓冲液洗涤柱；随后，通过线性盐梯度从0-0.4 M 在柱缓冲液中的NaCl洗脱sPQQGDH，以1或3 mL的级分收集洗脱物。在这种条件下洗脱的sPQQGDH事实上为同质蛋白质，所以不需要进一步地提纯。为了测定蛋白质，测定溶液的OD₂₈₀。使用纯净的KOZ65的sPQQGDH蛋白质，先前通过重量分析已经确定，1 mg/mL sPQQGDH溶液(PQQ-游离的酶蛋白)的OD₂₈₀为1.27。

实施例7 – 确定sPQQGDH 变体的酶活性

为了精确地测量酶活性，使用下列试验。在每种情况下制备所研究的酶溶液在下列缓冲液中的稀释系列：50 mM 1,4-哌嗪-二-(2-乙磺酸) (PIPES)，pH 6.5，0.1% Triton X-100，1 mM CaCl₂，0.1% 牛血清白蛋白 (BSA)和3 µM PQQ。糖用作底物，分别制备电子传递体N-甲基phenazoniummethasulfat (PMS) 和检测试剂氯化硝基四氮唑蓝 (NBT)：将11.7 mL的pH 6.5的50 mM PIPES和2% Triton X-100在重蒸馏的(bidest.)水中的溶液与450 µL 0.9 M D-葡萄糖、450 µL 6 mM PMS和450 µL 6.6 mM NBT(所有物质也溶解于重蒸馏的水中)混合，在25℃下保持在暗处，在1小时内用完。当测量对除葡萄糖外的糖的酶活性时，这些糖，而不是葡萄糖，以0.9 M的浓度使用。单个反应物在测试溶液中的最终浓度为：30 mM 糖底物，200 µM PMS，和220 µM NBT。将(725 µL)预热的测试溶液与25 µL稀释的酶溶液在试管中混合，在570nm和25℃下在3分钟内追踪甲簪的发展。1 µmol葡萄糖转化得到0.5 µmol甲簪，其摩尔消光系数为ε = 40,200 M^-1cm^-1。因此，样品中的酶浓度可以通过下列关系确定：1 U/mL sPQQGDH对应1.493 min^-1的OD₅₇₀中的改变。单个样品的稀释系列是必需的，因为其中发现值低于0.05 U/mL或大于0.7 U/mL的测量必须抛弃，因为不能保证在这个范围外的足够测量线性。然后计算原始样品的浓度，考虑所用的稀释水平。结果显示于下列表2中。

表 2:

Figure 2013104723471100002DEST_PATH_IMAGE003

实施例8 – 测定插入序列

为了确定在感兴趣的变体中在位置Q168和L169之间插入的实际氨基酸，根据生产商的说明，借助QiaPrep 质粒分离试剂盒(Qiagen，Hilden) 由所关注的菌株制备质粒DNA，使用用作引物的寡核苷酸 4472-US1 (5’-CACCGTTAAAGCTTGGATTATC-3’；SEQ ID 34) 和4831-DS1 (5’-CCTTCATCGAAAGACCATCAG-3’；SEQ ID 35)由两个方向确定插入位点的DNA 序列。4472-US1序列的3’端位于插入位点的58 bp上游；4831-DS1序列的3’端位于插入位点的82 bp下游。序列分析的结果列于下列表3中。

表 3:

Figure 2013104723471100002DEST_PATH_IMAGE004

为了进行定向，还显示了侧翼氨基酸168Q和172L (先前为169L)以及它们的密码子。

实施例9 – 确定除葡萄糖外的糖的干扰

虽然在起始测试溶液中30 mM的底物浓度通常用于测定sPQQGDH的比活性，但更低浓度的所讨论的糖对于确定干扰是能察觉的；在可能的后续应用中大约以数量级出现。葡萄糖在血液中的生理浓度为约100 mg/dL，相当于约5.6 mM。由此原因，使用100 mg/dL的葡萄糖浓度和50-250 mg/dL的干扰糖进行下文描述的实验。然而在某些情况中，还研究了其他浓度和两种糖相互之间的比例。

在图5中，显示了5种不同变体的干扰测定的结果。5381-06-C12、5381-05-C4和5381-07-F10来源于在位置Q168和L169之间具有4个其他氨基酸的库；5152-20-A7和5386-13-F10来源于在位置Q168和L169之间具有5个其他氨基酸的库。在所有情况中，仍然能检测到所测试糖仅有的较小影响：在麦芽糖的情况中，使用所有克隆的测量受影响不超过8%，即使是在250mg/dL 麦芽糖 (与葡萄糖相比，1.3-倍摩尔量)下。在半乳糖的情况下，干扰最大为16%，而在木糖的情况下，干扰最大为14%。

实施例10 – 使用KOZ65和克隆 5152-20-A7进行的不同糖的干扰的比较

为了对没有插入突变的来自KOZ65的sPQQGDH之间进行直接的比较，在葡萄糖和糖麦芽糖、半乳糖、木糖、乳糖、纤维二糖或甘露糖的混合物中研究纯净的来自克隆 5152-20-A7的变体sPQQGDH和纯净的来自KOZ65的酶。对于每个测量点，一式四份进行记录。图6显示麦芽糖、纤维二糖和乳糖对KOZ65的原始酶的强干扰在通过变体5152-20-A7表达的酶中被抑制。更特别地，在约1等摩尔量下麦芽糖的干扰(100 mg/dL 葡萄糖，含有200 mg/dL 麦芽糖)从KOZ65的63%下降至5152-20-A7的6%；使用乳糖，干扰不再是显著的。

实施例11 – 不同库的变体的比较

为了显示用于生产具有改善的底物特异性的sPQQGDH 变体的根据本发明的方法的一般有效性，建立并研究在KOZ65的野生型sPQQGDH的位置Q168和L169之间具有3个、4个和5个其他氨基酸的库，如先前实施例中所述的那样。为了进行比较，还建立并研究在位置Q168和L169之间仅具有2个其他氨基酸的库。然而，发现仅有10个底物特异性具有轻微改进的克隆(对麦芽糖和葡萄糖的活性比在25-75%之间)。仅有1个克隆(5156-13-G12；参见表4)具有增强的底物特异性，但具有差的对葡萄糖的比活性。然而正如由下表4明显看出，所有具有3-5个其他氨基酸的库含有，显示比野生型明显更高的底物特异性的克隆。

表4:

(n.d.: 未测定)

图1 显示用于合成的DNA片段的插入的载体的生产。显示了用于生产来自KOZ65的sPQQGDH基因 (1a)的两个片段(PCR 1，PCR 2)的引物的位置和方向 (1b中粗的，黑色箭头)以及其他氨基酸随后插入的位置(1a和1b中的"IP")。图1c图解式地显示了编码序列（其已经使用XbaI和EcoO109I进行剪切并提纯）的上部的扩增子、编码序列（其已经使用EcoO109I和BfuAI进行剪切并提纯）中部的扩增子的载体 pAI3B-KOZ65-U (1-2)、3567 bp长的载体片断（其已经由原始载体pAI3B-KOZ65 (1-1) 使用XbaI和BfuAI进行剪切并提纯）的装配。完成的载体 pAI3B-KOZ65-U (1-2)显示于图1e中。由图1d可以看出，当没有发生插入时，pAI3B-KOZ65-U中的sPQQGDH翻译终止在EcoO109I 限制位点之后4个氨基酸残基。

图2显示由文中所述的寡核苷酸进行合成的、双链DNA片段的制备（在图中显示为箭头，箭头方向在每种情况下表示序列的3’端）。在下部，显示了寡核苷酸 EarV2-Random和EarV2-Lower。在第一步中，由这些重叠单链制造62 bp长的初级产物。借助寡核苷酸 EarV2-UpAmp和EarV2-LoAmp，在第二步中由其生产的是97 bp长的PCR产物，其DNA 序列显示于上部。其编码的蛋白质序列见于图2的下缘。在DNA序列中，显示了两个EarI 限制位点的位置。将使用EarI 由PCR产物释放的64 bp长的片段连接于使用EcoO109I开放的载体。

图3 显示使用两个微量滴定板 (a和b)的样本(Beispiel)筛选变体sPQQGDH 克隆的库的数据概要。横座标(X-轴)给出了MTP的每个菌落以任意相对单位计的被该菌落转化的葡萄糖的近似率。在纵座标(Y-轴)上，绘制麦芽糖转化和葡萄糖转化的商(Quotient)。对于每个菌落，这能够评价菌落是否能够转化葡萄糖，并且如果是这样，菌落是否可以比野生型KOZ65更好地区分葡萄糖和麦芽糖。作为每个菌落的象征，使用其在各个微量滴定板上的位置，A1–H12。阳性对照KOZ65用箭头表示。

图4显示由实施例3中所述的筛选选择的菌落的结果。考虑三种参数：对葡萄糖的转化率（未显示在该图中）应当尽可能的高；横座标(X-轴)上绘制的干扰（这里，麦芽糖是干扰糖），以及纵座标(Y-轴) 上绘制的麦芽糖转化与葡萄糖转化的比例应当尽可能地接近0。为了进行比较，以相同的方式标记图3和4中的一些克隆。

图5显示不同克隆与麦芽糖 (a) 、半乳糖 (b)、和木糖 (c)的干扰研究。显示了5种纯净的变体sPQQGDH制品对葡萄糖和三种其他糖的混合物的行为。纵座标(Y-轴)绘制了确定的起始测试溶液中100 mg/dL 葡萄糖不与其它糖的混合物的干扰，以及与50、100、150、200或250 mg/dL (X-轴)的各种干扰糖的混合物的干扰。每个测试点一式四份进行测定。

图6 显示KOZ65 (左)和克隆 5152-20-A7 (右)对各种糖的干扰研究。对于纤维二糖(a)、半乳糖 (b)、乳糖(c)、麦芽糖 (d)、甘露糖(e)和木糖 (f)，在纵座标(Y-轴)上绘制在100 mg/dL 葡萄糖存在下(在X-轴上的抑制剂浓度[mg/dL])这些糖在各种浓度下如何强烈地影响KOZ65的sPQQGDH或5152-20-A7的活性。对于干扰糖，每个测量系列还包括不含这种糖的测量，并且这种测量，像该系列的所有其他测量一样，是基于由所有不含干扰糖的测量平均得到的葡萄糖值。由于酶试验的测量不准确性，单个图形相应地不一定从零起始，虽然理论上是这样。

序列表

<110> 拜耳技术服务 GmbH

<120> 具有改善的底物特异性的PQQ-依赖性葡萄糖脱氢酶的新变体

<130> AFR

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 1

Ala Tyr Gln

1

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 2

Ala Trp Leu

1

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 3

Ala Phe Val

1

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 4

Gly Tyr Ile

1

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 5

Ala Tyr Val

1

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 6

Ala Phe Gln

1

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 7

Ala Gly Arg Met

1

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 8

Gly Leu Ala Val

1

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 9

Met Gly Arg Phe Leu

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 10

Val Ser Thr Phe Phe

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 11

Val Ser Lys Asn His

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 12

Ser Ser Arg Asn His

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 13

Ser Gly Arg Ile Leu

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 14

Val Gly Arg Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 15

Ala Glu Arg Asn Tyr

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 16

Met Glu Ser His Asn

1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 17

Val Gly His Val Thr

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 插入

<400> 18

Val Gly Arg Tyr Gln

1 5

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 19

tggtaggtct caaatgaata aacatttatt ggctaaaatt ac 42

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 20

ttcagctctg agctttatat gtaaatctaa tc 32

<210> 21

<211> 4560

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 表达质粒

<220>

<221> CDS

<222> (139)..(1581)

<220>

<221> sig_肽

<222> (139)..(213)

<220>

<221> mat_肽

<222> (214)..(1581)

<400> 21

ccatcgaatg gccagatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt 60

tattttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120

agataacgag ggcaaaaa atg aat aaa cat tta ttg gct aaa att act tta 171

Met Asn Lys His Leu Leu Ala Lys Ile Thr Leu

-25 -20 -15

tta ggt gct gct cag cta ctt acg ctc aat tca gca ttt gct gat gtc 219

Leu Gly Ala Ala Gln Leu Leu Thr Leu Asn Ser Ala Phe Ala Asp Val

-10 -5 -1 1

cct ctt aca cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa aca gaa agc ttt gat 267

Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Ser Phe Asp

5 10 15

aag aaa gtt ctt cta tct aat tta aat aag cca cat gct ttg ttg tgg 315

Lys Lys Val Leu Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu Leu Trp

20 25 30

gga ccg gat aat caa att tgg tta acg gag cgg gca aca ggt aag att 363

Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly Lys Ile

35 40 45 50

cta aga gtt aat cca gag tcg ggc agt gta aaa aca gtt ttt cag gtt 411

Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe Gln Val

55 60 65

cct gag att gta aat gat gct gat gga caa aac ggt tta ttg ggt ttt 459

Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu Gly Phe

70 75 80

gcc ttt cat cct gac ttt aaa aat aat cct tat atc tat gtt tca ggt 507

Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Val Ser Gly

85 90 95

aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aat caa act 555

Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn Gln Thr

100 105 110

att atc cgt cga tat acc tat aac aag gca aca gat acc ctt gag aaa 603

Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ala Thr Asp Thr Leu Glu Lys

115 120 125 130

cca gta gat tta ttg gca gga tta cct tca tcg aaa gac cat cag tcg 651

Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His Gln Ser

135 140 145

ggt cgt ctt gtg att ggt cca gac caa aag att tac tat acg att ggt 699

Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly

150 155 160

gat cag gga cgt aac cag ctg gct tat tta ttc tta cca aat caa gca 747

Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala

165 170 175

cag cat acg ccg act caa cag gaa ctg agc ggc aaa gac tat cat acc 795

Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Ser Gly Lys Asp Tyr His Thr

180 185 190

tat atg ggt aaa gta ttg cgc tta aat ctg gat gga agt att cca aaa 843

Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile Pro Lys

195 200 205 210

gat aat cca agc ttt aac ggt gta att agc cat att tat acg ctc ggt 891

Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Ile Ser His Ile Tyr Thr Leu Gly

215 220 225

cat cgt aac cca cag ggc ttg gca ttt act cca aat ggt aaa ctg ttg 939

His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys Leu Leu

230 235 240

caa tct gaa cag ggt cca aac tct gat gat gaa att aac ctc att gtc 987

Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu Ile Val

245 250 255

aaa ggt ggt aac tat ggc tgg cca aat gta gcg ggt tat aaa gat gat 1035

Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys Asp Asp

260 265 270

agt ggt tat gcc tat gca aat tat tcg gca gca agc aat aaa gca caa 1083

Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ser Asn Lys Ala Gln

275 280 285 290

att aaa gat tta gga caa aat ggt tta aaa gtg gcg gca ggt gta cct 1131

Ile Lys Asp Leu Gly Gln Asn Gly Leu Lys Val Ala Ala Gly Val Pro

295 300 305

gtg atg aaa gag tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gta ccg ccg tta 1179

Val Met Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro Leu

310 315 320

aaa act tta tat acc gtc caa gat acc tat aac tat aat gac cca act 1227

Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro Thr

325 330 335

tgt ggg gat atg acc tac att tgc tgg cca acg gtt gcg ccg tca tct 1275

Cys Gly Asp Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser Ser

340 345 350

gct tat gtc tat aag gga ggc aaa aaa gca att tct ggt tgg gaa aat 1323

Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Ser Gly Trp Glu Asn

355 360 365 370

aca tta ttg gtt cca tct tta aag cgc ggt gtt att ttc cgt att aag 1371

Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile Lys

375 380 385

cta gat cca act tac agt act act tat gat gat gct gtg ccg atg ttt 1419

Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met Phe

390 395 400

aag agc aac aat cgt tat cgt gac gtg att gca agt cca gat ggg aat 1467

Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly Asn

405 410 415

gtt tta tat gta ttg act gat act tcc gga aat gtc caa aaa gat gat 1515

Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ser Gly Asn Val Gln Lys Asp Asp

420 425 430

ggt tct gta acg aat aca tta gaa aac cca gga tct ctg att aga ttt 1563

Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Arg Phe

435 440 445 450

aca tat aaa gct cag agc tgaaagcttg acctgtgaag tgaaaaatgg 1611

Thr Tyr Lys Ala Gln Ser

455

cgcacattgt gcgacatttt ttttgtctgc cgtttaccgc tactgcgtca cggatctcca 1671

cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc 1731

tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac 1791

gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag 1851

tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc 1911

atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg 1971

actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata 2031

agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa 2091

cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 2151

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 2211

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 2271

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 2331

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 2391

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2451

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 2511

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 2571

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 2631

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 2691

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 2751

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 2811

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 2871

gatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 2931

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggctctcgcg gtatcattgc 2991

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 3051

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 3111

ttggtaggaa ttaatgatgt ctcgtttaga taaaagtaaa gtgattaaca gcgcattaga 3171

gctgcttaat gaggtcggaa tcgaaggttt aacaacccgt aaactcgccc agaagctagg 3231

tgtagagcag cctacattgt attggcatgt aaaaaataag cgggctttgc tcgacgcctt 3291

agccattgag atgttagata ggcaccatac tcacttttgc cctttagaag gggaaagctg 3351

gcaagatttt ttacgtaata acgctaaaag ttttagatgt gctttactaa gtcatcgcga 3411

tggagcaaaa gtacatttag gtacacggcc tacagaaaaa cagtatgaaa ctctcgaaaa 3471

tcaattagcc tttttatgcc aacaaggttt ttcactagag aatgcattat atgcactcag 3531

cgcagtgggg cattttactt taggttgcgt attggaagat caagagcatc aagtcgctaa 3591

agaagaaagg gaaacaccta ctactgatag tatgccgcca ttattacgac aagctatcga 3651

attatttgat caccaaggtg cagagccagc cttcttattc ggccttgaat tgatcatatg 3711

cggattagaa aaacaactta aatgtgaaag tgggtcttaa aagcagcata acctttttcc 3771

gtgatggtaa cttcactagt ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 3831

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 3891

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 3951

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 4011

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 4071

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 4131

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 4191

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 4251

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 4311

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 4371

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 4431

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 4491

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 4551

gacccgaca 4560

<210> 22

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

Met Asn Lys His Leu Leu Ala Lys Ile Thr Leu Leu Gly Ala Ala Gln

-25 -20 -15 -10

Leu Leu Thr Leu Asn Ser Ala Phe Ala Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser

-5 -1 1 5

Gln Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Ser Phe Asp Lys Lys Val Leu Leu

10 15 20

Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln

25 30 35

Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro

40 45 50 55

Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe Gln Val Pro Glu Ile Val Asn

60 65 70

Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu Gly Phe Ala Phe His Pro Asp

75 80 85

Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Val Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro

90 95 100

Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr

105 110 115

Thr Tyr Asn Lys Ala Thr Asp Thr Leu Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu

120 125 130 135

Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile

140 145 150

Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn

155 160 165

Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn Gln Ala Gln His Thr Pro Thr

170 175 180

Gln Gln Glu Leu Ser Gly Lys Asp Tyr His Thr Tyr Met Gly Lys Val

185 190 195

Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe

200 205 210 215

Asn Gly Val Ile Ser His Ile Tyr Thr Leu Gly His Arg Asn Pro Gln

220 225 230

Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly

235 240 245

Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr

250 255 260

Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr

265 270 275

Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ser Asn Lys Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly

280 285 290 295

Gln Asn Gly Leu Lys Val Ala Ala Gly Val Pro Val Met Lys Glu Ser

300 305 310

Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr

315 320 325

Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro Thr Cys Gly Asp Met Thr

330 335 340

Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Lys

345 350 355

Gly Gly Lys Lys Ala Ile Ser Gly Trp Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro

360 365 370 375

Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile Lys Leu Asp Pro Thr Tyr

380 385 390

Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg

395 400 405

Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly Asn Val Leu Tyr Val Leu

410 415 420

Thr Asp Thr Ser Gly Asn Val Gln Lys Asp Asp Gly Ser Val Thr Asn

425 430 435

Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Arg Phe Thr Tyr Lys Ala Gln

440 445 450 455

Ser

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 23

tagagttatt ttaccactcc ct 22

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 24

ggttaggtcc ctgatcacca atcg 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 25

cacaggtaca cctgccgcca ct 22

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 26

tacgaggacc caacaggaac tgagc 25

<210> 27

<211> 4508

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 表达载体

<220>

<221> CDS

<222> (139)..(720)

<220>

<221> sig_肽

<222> (139)..(213)

<220>

<221> mat_肽

<222> (214)..(720)

<400> 27

ccatcgaatg gccagatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt 60

tattttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120

agataacgag ggcaaaaa atg aat aaa cat tta ttg gct aaa att act tta 171

Met Asn Lys His Leu Leu Ala Lys Ile Thr Leu

-25 -20 -15

tta ggt gct gct cag cta ctt acg ctc aat tca gca ttt gct gat gtc 219

Leu Gly Ala Ala Gln Leu Leu Thr Leu Asn Ser Ala Phe Ala Asp Val

-10 -5 -1 1

cct ctt aca cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa aca gaa agc ttt gat 267

Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Ser Phe Asp

5 10 15

aag aaa gtt ctt cta tct aat tta aat aag cca cat gct ttg ttg tgg 315

Lys Lys Val Leu Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu Leu Trp

20 25 30

gga ccg gat aat caa att tgg tta acg gag cgg gca aca ggt aag att 363

Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly Lys Ile

35 40 45 50

cta aga gtt aat cca gag tcg ggc agt gta aaa aca gtt ttt cag gtt 411

Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe Gln Val

55 60 65

cct gag att gta aat gat gct gat gga caa aac ggt tta ttg ggt ttt 459

Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu Gly Phe

70 75 80

gcc ttt cat cct gac ttt aaa aat aat cct tat atc tat gtt tca ggt 507

Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Val Ser Gly

85 90 95

aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aat caa act 555

Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn Gln Thr

100 105 110

att atc cgt cga tat acc tat aac aag gca aca gat acc ctt gag aaa 603

Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ala Thr Asp Thr Leu Glu Lys

115 120 125 130

cca gta gat tta ttg gca gga tta cct tca tcg aaa gac cat cag tcg 651

Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His Gln Ser

135 140 145

ggt cgt ctt gtg att ggt cca gac caa aag att tac tat acg att ggt 699

Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly

150 155 160

gat cag gga ccc aac agg aac tgagcggcaa agactatcat acctatatgg 750

Asp Gln Gly Pro Asn Arg Asn

165

gtaaagtatt gcgcttaaat ctggatggaa gtattccaaa agataatcca agctttaacg 810

gtgtaattag ccatatttat acgctcggtc atcgtaaccc acagggcttg gcatttactc 870

caaatggtaa actgttgcaa tctgaacagg gtccaaactc tgatgatgaa attaacctca 930

ttgtcaaagg tggtaactat ggctggccaa atgtagcggg ttataaagat gatagtggtt 990

atgcctatgc aaattattcg gcagcaagca ataaagcaca aattaaagat ttaggacaaa 1050

atggtttaaa agtggcggca ggtgtacctg tgatgaaaga gtctgaatgg actggtaaaa 1110

actttgtacc gccgttaaaa actttatata ccgtccaaga tacctataac tataatgacc 1170

caacttgtgg ggatatgacc tacatttgct ggccaacggt tgcgccgtca tctgcttatg 1230

tctataaggg aggcaaaaaa gcaatttctg gttgggaaaa tacattattg gttccatctt 1290

taaagcgcgg tgttattttc cgtattaagc tagatccaac ttacagtact acttatgatg 1350

atgctgtgcc gatgtttaag agcaacaatc gttatcgtga cgtgattgca agtccagatg 1410

ggaatgtttt atatgtattg actgatactt ccggaaatgt ccaaaaagat gatggttctg 1470

taacgaatac attagaaaac ccaggatctc tgattagatt tacatataaa gctcagagct 1530

gaaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg cgacattttt tttgtctgcc 1590

gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg 1650

ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct 1710

ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat 1770

cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt 1830

gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg 1890

acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac 1950

cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta 2010

aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca 2070

atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2130

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2190

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 2250

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 2310

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 2370

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 2430

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 2490

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 2550

acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 2610

cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 2670

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 2730

cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 2790

ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga tggaggcgga taaagttgca 2850

ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 2910

ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 2970

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 3030

gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat taatgatgtc tcgtttagat 3090

aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg aggtcggaat cgaaggttta 3150

acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc ctacattgta ttggcatgta 3210

aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga tgttagatag gcaccatact 3270

cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt tacgtaataa cgctaaaagt 3330

tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag tacatttagg tacacggcct 3390

acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct ttttatgcca acaaggtttt 3450

tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc attttacttt aggttgcgta 3510

ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg aaacacctac tactgatagt 3570

atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc accaaggtgc agagccagcc 3630

ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa aacaacttaa atgtgaaagt 3690

gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac ttcactagtt taaaaggatc 3750

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 3810

cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 3870

cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 3930

gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 3990

aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 4050

cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 4110

tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 4170

acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 4230

ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 4290

ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 4350

tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 4410

tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 4470

ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg acccgaca 4508

<210> 28

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

Met Asn Lys His Leu Leu Ala Lys Ile Thr Leu Leu Gly Ala Ala Gln

-25 -20 -15 -10

Leu Leu Thr Leu Asn Ser Ala Phe Ala Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser

-5 -1 1 5

Gln Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Ser Phe Asp Lys Lys Val Leu Leu

10 15 20

Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln

25 30 35

Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro

40 45 50 55

Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe Gln Val Pro Glu Ile Val Asn

60 65 70

Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu Gly Phe Ala Phe His Pro Asp

75 80 85

Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Val Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro

90 95 100

Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr

105 110 115

Thr Tyr Asn Lys Ala Thr Asp Thr Leu Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu

120 125 130 135

Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile

140 145 150

Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr Ile Gly Asp Gln Gly Pro Asn

155 160 165

Arg Asn

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<220>

<221> 多样性特征

<222> (13)..(24)

<223> n 对应于 a, c, g 或 t; k 对应于 g 或 t

<400> 29

cgacgtaacc agnnknnknn knnkctggct tacctg 36

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 30

gtgtgctgtg cctggttcgg caggaacagg taagccag 38

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 31

cctacctacg actcttccga cgtaaccag 29

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> PCR-引物

<400> 32

ccatgctctt cagtcggagt gtgctgtgcc 30

<210> 33

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 具有四个随机位置的插入片段

<220>

<221> 多样性特征

<222> (12)..(23)

<223> n 为 a, c, g 或 t

<400> 33

gacgtaacca gnnnnnnnnn nnnctggctt acctgttcct gccgaaccag gcacagcaca 60

ctcc 64

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 测序引物

<400> 34

caccgttaaa gcttggatta tc 22

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 测序引物

<400> 35

ccttcatcga aagaccatca g 21

Claims

1.可溶性吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(sPQQGDH)，其特征在于，与不动杆菌属(Acinetobacter sp.) 的一种野生型菌株的sPQQGDH相比，其在底物结合区域的范围内具有4-5个氨基酸的插入，其中基于野生型醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) LMD 79.41的序列，所述插入位点位于位置Q168与L169之间，并且其中所述插入选自由下列组成的组：

－具有4个氨基酸的插入，其中插入的氨基酸在位置1具有A或G，在位置2具有G、D或L，在位置3具有R或A，和在位置4具有M或V，

－具有5个氨基酸的插入，其中插入的氨基酸在位置1具有A、M、S或V，在位置2具有E、G或S，在位置3具有H、K、R、S或T，在位置4具有F、H、I、L、N、V或Y，和在位置5具有F、H、L、N、Q、T或Y。

2.如权利要求1所述的sPQQGDH，其特征在于，插入位点距离底物结合区域不超过5埃。

3.如权利要求1-2中任一项所述的sPQQGDH，其特征在于，其通过诱变由PT16、KOZ62、KOZ65、PTN69、KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25、KGN100系列的菌株产生。

4.如权利要求1至3中任一项所述的sPQQGDH，其具有选自系列SEQ ID 1-SEQ ID 18的插入序列。

5.基因，其编码一种如权利要求1至4中任一项所述的蛋白质。

6.载体，其特征在于，其在插入位点的范围内具有一个唯一的限制位点，以便可以在该位点插入编码如权利要求1-4中任一项所述的sPQQGDH的寡核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的载体，其具有序列SEQ ID 27。

8.用于生产和鉴别如权利要求1-4中任一项所述的sPQQGDH的方法，其特征在于，在第一步中生产在插入位点的范围内具有唯一的限制位点的载体，在第二步中将多种不同的寡核苷酸序列插入载体中，在第三步中将这样获得的重组载体转化到宿主细菌中并使细菌增殖，在第四步中筛选细菌产生的sPQQGDH，以便测定sPQQGDH对至少两种不同的糖的单独活性以及至少一种糖与至少另一种糖的干扰作用，和在第五步中选择与未修饰的野生菌株的sPQQGDH相比具有改善的底物特异性的那些sPQQGDH。

9.葡萄糖传感器，其包含权利要求1-4的sPQQGDH。