DE60200426T2 - Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol - Google Patents

Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol Download PDF

Info

Publication number
DE60200426T2
DE60200426T2 DE60200426T DE60200426T DE60200426T2 DE 60200426 T2 DE60200426 T2 DE 60200426T2 DE 60200426 T DE60200426 T DE 60200426T DE 60200426 T DE60200426 T DE 60200426T DE 60200426 T2 DE60200426 T2 DE 60200426T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
sequence
erythrose reductase
erythrose
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE60200426T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60200426D1 (de
Inventor
Tetuya Tsukuba-shi Ookura
Takafumi Ushiku-shi Kasumi
Eiji Omiya-shi Asaba
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NAT FOOD RES INST TSUKUBA
National Food Research Institute
Original Assignee
NAT FOOD RES INST TSUKUBA
National Food Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NAT FOOD RES INST TSUKUBA, National Food Research Institute filed Critical NAT FOOD RES INST TSUKUBA
Application granted granted Critical
Publication of DE60200426D1 publication Critical patent/DE60200426D1/de
Publication of DE60200426T2 publication Critical patent/DE60200426T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität, eine komplementäre DNA, die das Protein codiert, ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches Erythrose-Reduktase-Aktivität besitzt, und ein Verfahren zur Herstellung von Erythritol.
  • Die Erythrose-Reduktase ist ein Enzym, welches Erythrose mit NADPH oder NADH zur Herstellung von Erythritol und NADP+ oder NAD+ reduziert. Das Enzym schließt drei Arten von Isozymen ein, d. h. Typ I, Typ II und Typ III, die nach den Unterschieden in der Mobilität auf nativer PAGE und isoelektrisch fokussierender Elektrophorese klassifiziert werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Erythritol ist ein Süßstoff von hoher Qualität und sehr geringer Kalorienmenge. Erythritol ist ebenfalls nicht kariotisch, so dass es in breitem Umfang als ein Süßstoff für Nahrungsmittel und Getränke verwendet wird.
  • Mehrere Mikroorganismen wie Trichosporonoides und Moniliella werden in breitem Umfang zur industriellen Herstellung von Erythritol aus Glucose verwendet. Mikroorganismen, wie die zu der Gattung Trichosporonoides, Moniliella, etc. gehörenden, werden auf ein Substrat wie Glucose einwirken gelassen (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 6-30591, japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 6-30592, japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 4-11189, japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei-4-635, japanisches Patent Kokai Nr. Hei 10-96, und japanisches Patent Kokai Nr. Hei 9-154589).
  • Es wurde berichtet, dass Erythrose-Reduktase vom Typ I, II und III bei der Herstellung von Erythritol beim Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 involviert sind (FERM BP-1430) (K. Tokuoka, et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 38, 145–155 (1992)) und H. Ishizuka et al., Biosci. Biotech. Bioch. 56, 941–945, 1992.
  • Der Stoffwechselweg von Glucose zu Erythritol im Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 wird in der 1 veranschaulicht.
  • Wie in der 1 veranschaulicht, tritt Glucose in den Pentosephosphat-Shunt ein, um Erythrose-4-Phosphat (Erythrose-4-P) zu erzeugen, nachdem dieses Zuckerphosphat zu Glucose-6-Phosphat (Glc-6-P) oder zu Glyceraldehyd-3-Phosphat durch Glycolyse metabolisiert worden ist.
  • Das Erythrose-4-Phosphat wird dephosphoryliert unter Erzeugung von D-Erythrose und D-Erythrose, welche durch NADPH oder NADH eine Reduktion unter Erzeugung von meso-Erythritol erfährt.
  • Bei dieser Serie von Reaktionen katalysiert die Erythrose-Reduktase vom Typ I, II und III die letztere reduktive Reaktion (d. h. die Reaktion, bei der Erythrose eine Reduktion durch NADPH oder NADH unter Bildung von meso-Erythritol erfährt).
  • Die Berichte bezüglich Erythrose-Reduktasen beschreiben nur ihre enzymologischen Eigenschaften. Die genetische Analyse dieser Enzyme muss noch aufgeklärt werden.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines effizienten Verfahrens zur Herstellung von Erythritol.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die primären Strukturen vom Enzym mit Erythrose-Reduktase-Aktivität aufzuklären und eine komplementäre DNA, die das Protein codiert, zu charakterisieren, um einen Erythritol-erzeugenden Mikroorganismus zu entwickeln und ein Verfahren zur Nutzung dieser bereitzustellen.
  • Wenn man darin erfolgreich ist, die DNA zu erhalten, welche das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert, kann eine große Menge an Proteinen durch Expression der DNA in einer Zelle wie Escherichia coli, Hefezellen, etc., oder einem ähnlichen Mittel, erzeugt werden. Diese Erfindung führt nicht nur zu der Massenproduktion von Erythritol, sondern wird ebenfalls auf die Entwicklung von Mutantenenzymen mit einer höheren Erythritolproduktivität, auf das Klonieren von DNA, die verwandte Enzyme codiert, und dergleichen unter Verwendung von gentechnologischen Techniken angewandt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine umfangreiche Forschung im Hinblick auf das Erreichen des oben beschriebenen Ziels unternommen, und als ein Ergebnis haben sie eine Basensequenz von DNA gefunden, welche ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert. Dieses Protein wird durch einen Mikroorganismus erzeugt, welcher zur Gattung Trichosporonoides gehört.
  • Das heißt, die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben als erstes ein Enzym aus dem Mikroorganismus geerntet und es gereinigt, teilweise die Aminosäuresequenz eines Proteins des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung, wobei das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität durch den Mikroorganismus erzeugt wird, welcher zur Gattung Trichosporonoides gehört, durch Peptid-Mapping decodiert, und eine darauf basierende Sonde hergestellt.
  • Durch die Durchführung einer Northern-Hybridisierung vom Erythritolerzeugenden Mikroorganismus unter Verwendung dieser Sonde wurde der Zeitpunkt, zu dem Erythrose-Reduktase vom Typ III in starkem Maße exprimiert wird, identifiziert. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus mRNA zu dem Zeitpunkt hergestellt, als der Expressionslevel am höchsten war.
  • Dann wurde die cDNA-Bibliothek mit der oben beschriebenen Sonde gescreent, und die Basensequenz von DNA eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität wurde decodiert.
  • Anschließend wurde die cDNA-Bibliothek mit der oben beschriebenen Sonde gescreent, und die Basensequenz von DNA eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität wurde decodiert.
  • Außerdem stellten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung eine Sonde her, basierend auf der Voll-Längen-cDNA der oben erhaltenen Erythrose-Reduktase des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung, und sie führten ein Screenen durch, indem sie eine Hybridisierung unter Verwendung der oben beschriebenen cDNA-Bibliothek unter den in Item (b) von Anspruch 3 und Anspruch 4, oder in Item (d) von Anspruch 5 und Anspruch 6 beschriebenen Bedingungen ausführten. Als ein Ergebnis wurden die Basensequenzen von DNA von Proteinen mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten oder dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung decodiert.
  • Ferner wurde unter Verwendung dieser gescreenten cDNA selbige in einen Escherichia coli-Expressionsvektor eingebracht, und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität wurde als ein mit Histidin-Tag fusioniertes Protein in Escherichia coli exprimiert.
  • Die Aktivität, die Substratspezifität und dergleichen des auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Proteins wurden untersucht, und als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass das rekombinante Protein eine Substratspezifität besaß, die ähnlich der von Erythrose-Reduktase des natürlichen Typs war und ebenfalls eine Enzymaktivität für die Erzeugung eines Zuckeralkohols aufwies.
  • Außerdem wurde bestätigt, dass die Einführung eines Plasmids in auxotrophe Hefe eine genaue Expression induzierte.
  • Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Erkenntnisse bewerkstelligt.
  • Das heißt, in einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Protein mit einer Aminosäuresequenz von SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung vor.
  • In einer zweiten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine DNA vor, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz von SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung codiert.
  • In einer dritten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen zweiten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die DNA eine umfasst, wie sie unten in (a) oder (b) gezeigt ist:
    • (a) Eine DNA, die eine Basensequenz enthält, welche mindestens die Nukleotide Nr. 1 bis 399 der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst.
    • (b) Eine DNA, die mit einer Basensequenz, welche mindestens die Nukleotide Nr. 1 bis 399 der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst, oder mit einer daraus hergestellten Sonde unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und ein Protein mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • In einer vierten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen dritten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  • In einer fünften Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen zweiten Ausführungsform vorgesehen ist, wobei die DNA eine DNA umfasst, welche unten in (c) oder (d) gezeigt ist:
    • (c) Eine DNA, die eine Basensequenz enthält, welche mindestens die Nukleotide Nr. 408 bis 1119 der aus der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst.
    • (d) Eine DNA, welche mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nr. 408 bis 1119 aus der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und ein Protein mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • In einer sechsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen fünften Ausführungsform beschrieben ist, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  • In einer siebten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine Zelle vor, in die eine DNA, wie sie in mindestens einer der obenstehenden zweiten bis sechsten Ausführungsformen beschrieben worden ist, in einer solchen Weise eingeführt worden ist, dass die DNA in der Lage ist, eine Erythrose-Reduktase vom Typ III zu exprimieren.
  • In einer achten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Erythrose-Reduktase Typ III vor, umfassend die Schritte des Kultivierens der Zelle, wie sie oben in der siebten Ausführungsform beschrieben ist, in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von Erythrose-Reduktase vom Typ III in einer Kulturflüssigkeit und des Erntens der Erythrose-Reduktase vom Typ III aus der Kulturflüssigkeit.
  • In einer neunten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung vor.
  • In einer zehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine DNS vor, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung codiert.
  • In einer elften Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen zehnten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die DNA eine umfasst, welche unten in (e) oder (f) gezeigt ist:
    • (e) eine DNA, die eine Basensequenz enthält, umfassend mindestens die Nukleotide Nr. 1 bis 399 der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz;
    • (f) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nr. 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer daraus hergestellten Sonde unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • In einer zwölften Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie oben in der elften Ausführungsform beschrieben ist, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  • In einer dreizehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie oben in der zehnten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die DNA eine DNA umfasst, wie sie in (g) oder (h) unten gezeigt ist:
    • (g) eine DNA, welche eine Basensequenz enthält, die mindestens Nukleotide der Nr. 408 bis 1077 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst;
    • (h) eine DNA, die mit einer Basensequenz, welche mindestens Nukleotide der Nr. 408 bis 1077 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst, unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • In einer vierzehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen dreizehnten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  • In einer fünfzehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine Zelle vor, in die eine DNA, wie sie in mindestens einer der obigen zehnten bis vierzehnten Ausführungsform beschrieben ist, in einer Weise eingeführt worden ist, so dass die DNA zur Exprimierung einer Erythrose-Reduktase vom Typ II in der Lage ist.
  • In einer sechzehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Erythrose-Reduktase vom Typ II vor, umfassend die Schritte des Kultivierens der Zelle, wie sie in der obigen fünfzehnten Ausführungsform beschrieben ist, in einem Medium, um Erythrose-Reduktase vom Typ II in einer Kulturflüssigkeit zu produzieren und zu akkumulieren, und des Erntens der Erythrose-Reduktase vom Typ II aus der Kulturflüssigkeit.
  • In einer siebzehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung vor.
  • In einer achtzehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine DNA, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung codiert, vor.
  • In einer neunzehnten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen achtzehnten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die DNA eine umfasst, welche unten in (i) oder (j) gezeigt ist:
    • (i) eine DNA, welche eine Basensequenz enthält, die mindestens Nukleotide der Nr. 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst;
    • (j) eine DNA, die mit einer Basensequenz hybridisiert, welche mindestens Nukleotide der Nr. 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst, oder mit einer Sonde, die daraus hergestellt ist, unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • In einer zwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen neunzehnten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1 SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  • In einer einundzwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie in der obigen achtzehnten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die DNA eine DNA umfasst, welche unten in (k) oder (l) gezeigt ist:
    • (k) eine DNA, welche eine Basensequenz enthält, die mindestens Nukleotide der Nr. 408 bis 1121 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst;
    • (l) eine DNA, die mit einer Basensequenz, welche mindestens Nukleotide der Nr. 408 bis 1121 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz umfasst, unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • In einer zweiundzwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die DNA vor, wie sie oben in der einundzwanzigsten Ausführungsform beschrieben ist, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  • In einer dreiundzwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine Zelle vor, in die eine DNA, wie sie in mindestens einer der obigen achtzehnten bis zweiundzwanzigsten Ausführungsformen beschrieben ist, in einer Weise eingeführt worden ist, dass die DNA in der Lage ist, eine Erythrose-Reduktase vom Typ I zu exprimieren.
  • In einer vierundzwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Erythrose-Reduktase vom Typ I vor, umfassend die Schritte des Kultivierens der Zelle, wie sie oben in der dreiundzwanzigsten Ausführungsform beschrieben ist, in einem Medium, um Erythrosereduktase vom Typ I in einer Kulturflüssigkeit zu produzieren und zu akkumulieren, und des Erntens der Erythrose-Reduktase vom Typ I aus der Kulturflüssigkeit.
  • In einer fünfundzwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Erythritol vor, umfassend die Schritte des Wirkenlassens eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität, wie in mindestens einer der obigen ersten oder neunten oder siebzehnten Ausführungsform beschrieben, auf D-Erythrose und des Erntens eines produzierten Erythritols.
  • In einer sechsundzwanzigsten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung für Erythritol vor, umfassend die Schritte des Wirkenlassens der Zelle, wie sie in mindestens einem der obigen siebten oder fünfzehnten oder dreiundzwanzigsten Ausführungsform beschrieben ist, auf D-Erythrose, und Ernten eines produzierten Erythritols.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1 ist ein schematisches Diagramm, welches den Erythritol-Biosynthese-Weg veranschaulicht.
  • Die 2 ist ein Elektrophoretogramm, das die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung zeigt, wobei die Spur 1 das Ergebnis bezüglich des Produktes bei 24-stündiger Kultivierung zeigt, die Spur 2 das Ergebnis bezüglich des Produktes bei 48-stündiger Kultivierung zeigt, die Spur 3 das Ergebnis bezüglich des Produktes bei 72-stündiger Kultivierung zeigt und die Spur 4 das Ergebnis bezüglich des Produktes bei 96-stündiger Kultivierung zeigt.
  • Die 3 ist eine Restriktionsenzymkarte der DNA, welche ein Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III codiert, wobei EcoR I, Ban I und BamH I jeweils für die Restriktionsenzyme stehen und die Bezugsziffer in den Klammern die Anzahl an Basen angibt, gezählt vom 5'-Ende.
  • Die 4 ist eine Restriktionsenzymkarte von DNA, die für ein Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ II codiert, wobei EcoR I, Ban I, Acc I, Hind III und Sal I jeweils für Restriktionsenzyme stehen und die Bezugsziffer in den Klammern für die Anzahl von Basen steht, die vom 5'-Ende gezählt sind.
  • Die 5 ist eine Restriktionsenzymkarte von DNA, die für ein Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ I codiert, wobei EcoR I, Ban I, Acc I, Hind III und Sal I jeweils für Restriktionsenzyme stehen und die Bezugsziffer in den Klammern für die Anzahl von Basen steht, die vom 5'-Ende gezählt sind.
  • Die 6 ist ein Elektrophoretogramm, das die Ergebnisse von Western-Blotting bezüglich Erythrose-Reduktase zeigt, worin a das Ergebnis der SDS-PAGE bei der rekombinanten Erythrose-Reduktase zeigt, b das Ergebnis des Western-Blottings zeigt, durchgeführt durch Transferieren des obigen SDS-PAGE-Musters auf eine PVDF-Membran. In a und b in der 6 zeigt die Spur 1 den Molekulargewichtsmarker (kDa), zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II und zeigt die Spur 4 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Die 7 ist ein Elektrophoretogramm, das die Ergebnisse der SDS-PAGE bezüglich Erythrose-Reduktase zeigt, worin a das Ergebnis bezüglich Erythrose-Reduktase vom natürlichen Typ zeigt, b das Ergebnis bezüglich der rekombinanten Erythrose-Reduktase zeigt. ER 1, 2 und 3 in der 7a zeigen die Ergebnisse bezüglich der Erythrose-Reduktase jeweils vom natürlichen Typ I, II und III, und in b zeigt die Spur 1 den Molekulargewichtsmarker (kDa), zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II und zeigt die Spur 4 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Die 8 ist ein Elektrophoretogramm, das die Ergebnisse von nativer PAGE bezüglich Erythrose-Reduktase zeigt, wobei a das Ergebnis bezüglich Erythrose-Reduktase vom natürlichen Typ zeigt, b das Ergebnis bezüglich der rekombinanten Erythrose-Reduktase zeigt. ER 1, 2 und 3 in der 8a zeigen die Ergebnisse bezüglich der Erythrose-Reduktase jeweils vom natürlichen Typ I, II und III, und in b zeigt die Spur 1 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II, und zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Die 9 ist ein Elektrophoretogramm, das die Ergebnisse der IEF-PAGE bezüglich Erythrose-Reduktase zeigt, wobei die Spur 1 das Marker-Protein für den isoelektrischen Punkt zeigt, die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I zeigt, die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II zeigt und die Spur 4 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III zeigt.
  • Die 10 ist ein Elektrophoretogramm, das die Ergebnisse von der SDS-PAGE bezüglich der rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III zeigt, wobei die Spur 1 den Molekulargewichtsmarker (kDa) zeigt, die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III zeigt, exprimiert in S. cerevisiae, und die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III zeigt, exprimiert in E. coli.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität der vorliegenden Erfindung existiert in Hefe, die zur Gattung Trichosporonoides gehört, welcher ein Erythritol erzeugender Mikroorganismus ist. Trichosporonoides megachiliensis ist eine typische Hefe.
  • Als erstes wird eine Beschreibung vorgenommen zum Erhalten von DNA, die für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung codiert.
  • In dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die DNA hergestellt werden, welche ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert, und zwar zum Beispiel indem ein Protein mit einer Enzymaktivität, welches aus einem Erythritol herstellenden Mikroorganismus erhalten wurde, gereinigt wird, teilweise eine Aminosäuresequenz des Proteins decodiert wird, eine Sonde basierend auf der partiell decodierten Aminosäuresequenz hergestellt wird und dann die cDNA-Bibliothek des oben beschriebenen Mikroorganismus unter Verwendung der Sonde gescreent wird, wie durch die Erfinder der vorliegenden Anmeldung begründet.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben als erstes Erythrose-Reduktase vom Typ III aus einem Erythritol erzeugenden Mikroorganismus durch ein herkömmliches Verfahren erzeugt, um eine Sonde zum Screenen herzustellen, haben das Enzym gereinigt und dann die Aminosäuresequenz des Proteins decodiert.
  • Um Erythrose-Reduktase vom Typ III aus dem Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 zu erhalten, können die in H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56(6), 941–945, 1992, beschriebenen Prozeduren angewendet werden.
  • Es kann nicht nur diese Prozedur zur Anwendung kommen, sondern auch eine gängige Prozedur zum Erhalt und zur Reinigung von Protein mittels einer Kombination aus zentrifugaler Abtrennung, Dialyse, verschiedenen Arten der Chromatographie, etc.
  • Die partielle Aminosäuresequenz von der gereinigten Erythrose-Reduktase vom Typ III kann durch Peptidkartierung mittels eines herkömmlichen Verfahrens nach dem Verdau erhalten werden.
  • Die Aminosäuresequenz kann durch den Edman-Abbau bestimmt werden, und die Verwendung eines automatischen Aminosäure-Sequenzier-Gerätes macht die Bestimmung bequemer.
  • Als nächstes haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung eine PCR-Reaktion unter Verwendung eines Primers durchgeführt, der aus der partiell decodierten Aminosäuresequenz entworfen wurde, und der cDNA vom Erythritol herstellenden Mikroorganismus als eine Matrize, um eine Sonde herzustellen.
  • Der Entwurf eines Primers, der auf der partiell decodierten Aminosäuresequenz beruht, kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens durchgeführt werden.
  • Zum Beispiel können unter Bezugnahme auf die Aminosäuresequenzen der Aldo-Keto-Reduktase-Familien Teile der partiell decodierten Aminosäure (siehe SEQ. ID Nr. 6 und 7 in der Sequenzauflistung) gewählt werden, und Sinn-Primer und Anti-Sinn-Primer (siehe SEQ. ID Nr. 4 und 5 in der Sequenzauflistung) können aus den jeweiligen Sequenzen entworfen werden.
  • Die cDNA vom Erythritol erzeugenden Mikroorganismus kann durch Extrahieren von RNA aus der Kulturflüssigkeit vom Erythritol herstellenden Mikroorganismus, Präparieren von mRNA davon und Durchführen einer Reverse-Transkriptions-Reaktion unter Verwendung der mRNA als eine Matrize erhalten werden.
  • Für die Extraktion von RNA ist es zweckdienlich, TRIZOL (hergestellt von Gibco BRL) zu verwenden. Ebenfalls kann mRNA bequem unter Verwendung vom DYNABEADS-mRNA-Reinigungs-Kit (produziert von DYNAL) hergestellt werden.
  • Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen einzelsträngigen cDNA als eine Matrize und des Sinn-Primers (siehe SEQ. ID Nr. 4 in der Sequenzauflistung) und dem Anti-Sinn-Primer (siehe SEQ. ID Nr. 5 in der Sequenzauflistung), im Voraus entworfen, wurde eine Sonde durch PCR-Reaktion amplifiziert. Auf diese Weise waren die Erfinder der vorliegenden Anmeldung darin erfolgreich, ein cDNS-Fragment mit einer Länge von 398 bp als ein PCR-Produkt zu erhalten.
  • Das PCR-Produkt wurde an einen Plasmid-Vektor zur Transformation in Escherichia coli-Zellen ligiert. Plasmide vom Transformanten wurden mittels der DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines Farbstoffterminators und eines ABI-310A-DNA-Sequenzers (Perkin Elmer) zur Untersuchung der partiellen Aminosäuresequenz der Erythrose-Reduktase vom Typ III analysiert.
  • Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass das PCR-Produkt einen Teil der Erythrose-Reduktase vom Typ III codiert. Das PCR-Produkt wurde als eine Sonde für die Plaque-Hybridisierung, wie unten beschrieben, verwendet.
  • Das Fragment entspricht den Basen 184 bis 582 vom N-Terminus der in der SEQ. ID Nr. 1 der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz.
  • Anschließend haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung bei der Herstellung der cDNA-Bibliothek des Erythritol erzeugenden Mikroorganismus im Voraus den Zeitpunkt untersucht, zu dem mRNA der Erythrose-Reduktase vom Typ III in starkem Maße exprimiert.
  • Das Verfahren zur Bestimmung der Menge der Expression von Erythrose-Reduktase vom Typ III schließt die Northern-Hybridisierung und ähnliche Verfahren ein. Zum Beispiel wurde Gesamt-RNA aus dem Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42, der eine unterschiedliche Zeit lang kultiviert wurde, extrahiert, und eine Northern-Hybridisierung wurde unter Verwendung der im Voraus entworfenen Sonde durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde enthüllt, dass das 48-Stunden-Kultivierungsprodukt (Spur 3 in 2) den höchsten mRNA-Expressionsspiegel für Erythrose-Reduktase vom Typ III zeigte.
  • Demzufolge haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung eine cDNA-Bibliothek vom Erythritol erzeugenden Mikroorganismus zu dem Zeitpunkt hergestellt, als die mRNA von Erythrosereduktase vom Typ III am stärksten exprimiert wurde.
  • Eine cDNA-Bibliothek kann hergestellt werden, indem RNA aus einer Kultur eines Erythritol erzeugenden Mikroorganismus extrahiert wird, mRNA gereinigt wird, eine dazu komplementäre doppelsträngige cDNA synthetisiert wird und diese in einen Phagenvektor mit einem Adapter eingebracht wird.
  • Zur Extraktion von RNA ist es zweckdienlich, TRIZOL (hergestellt von Gico BRL) zu verwenden. Ebenfalls kann mRNA in zweckdienlicher Weise unter Verwendung des DYNABEADS-mRNA-Reinigungskits (produziert von DYNAL) hergestellt werden.
  • Die cDNA-Bibliothek kann hergestellt werden, indem das Okayama-Burg-Verfahren, das Gubler-Hoffman-Verfahren und dergleichen gewählt werden. Gleichwohl ist aus Gründen der Bequemlichkeit das letztere Verfahren bevorzugt.
  • In der Praxis ist es bevorzugt und zweckdienlich, das Verfahren der Herstellung einer Bibliothek unter Verwendung des ZAP-Express-cDNA-Synthesekits (produziert von STRATAGENE) gemäß den Instruktionen des Herstellers zu verwenden.
  • Der in dem Kit verwendete ZAP-Express-Vektor der vorliegenden Erfindung ist eine lineare Phagen-DNA. Gleichwohl kann diese durch einen in vivo-Schnitt als ein zirkuläres Plasmid (Phagemid), das das Kanamycin-Resistenz-Gen enthält, herausgenommen werden.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung führten ein Screenen der oben beschriebenen cDNA-Bibliothek für die die Erythrose-Reduktase vom Typ III codierende DNA unter Verwendung der im Voraus erhaltenen Sonde durch.
  • Bei dem Screenen wurde die Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer mit Digoxigenin markierten Sonde durchgeführt.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung decodierten die DNA-Sequenz nach der Umwandlung eines Phagen, welcher gegenüber der Sonde als Ergebnis des Screenens positiv ist, zu einem Plasmid.
  • Zum Beispiel wurden zuerst mehrere Plaques, welche beim Screenen gegenüber der Sonde positiv waren, isoliert, und Phagen wurden amplifiziert. Dann wurde ein Phagemidteil, der ein Insert enthielt, in vivo aus der Phagen-DNA gespalten. Dieser wurde zu der Plasmidform umgewandelt, um die Handhabung einfach zu machen, und es wurde eine Transfektion in Escherichia coli zur Amplifizierung des Plasmids durchgeführt. Danach wurde eine DNA-Sequenzierung bezüglich dieses Plasmids vorgenommen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine Basensequenz einer Gesamtlänge von 1119 bp, gezeigt in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung, durch die DNA-Sequenzierung gefunden.
  • Die Aminosäuresequenz, welche basierend auf dieser Basensequenz bestimmt wurde, ist ebenfalls in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung gezeigt. Die obige Aminosäuresequenz enthält eine partiell decodierte Aminosäuresequenz, und das Protein mit dieser Aminosäuresequenz war das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III.
  • Die 3 zeigt eine Restriktionsenzymkarte der Basensequenz an DNA, welche für Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III codiert. Wie aus der 3 ersichtlich ist, besitzt die Basensequenz eine Ban I-Spaltungsstelle bei der 122. Base vom 5'-Ende, EcoR I-Spaltungsstellen bei der 847. und 1057. Base vom 5'-Ende und eine BamH I-Spaltungsstelle an der 1093. Base.
  • Die Aminosäuresequenz des Erythrose-Reduktase-Proteins vom Typ III (siehe SEQ. ID Nr. 1 der Sequenzauflistung) ist eine neue Aminosäuresequenz) mit einer niedrigen Homologie mit den früher aufgeklärten Aminosäuresequenzen der humanen Aldose-Reduktase und dem Hefe(Saccharomyces cerevisiae)-gcy-Protein.
  • Hieraus wurde deutlich, dass das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III der vorliegenden Erfindung eine neue Aminosäuresequenz besaß.
  • Als nächstes wird die DNA eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
  • Das Protein mit der Erythrose-Reduktase-Aktivität der vorliegenden Erfindung kann mittels des folgenden Verfahrens erhalten werden.
  • Das heißt, unter Verwendung einer Sonde, die basierend auf der Voll-Längen-cDNA der Erythrose-Reduktase vom Typ III des oben beschriebenen Mikroorganismus hergestellt wurde, wurde ein Screenen der cDNA-Bibliothek des Mikroorganismus mit dem Vermögen der Herstellung von Erythrose unter den in Item (b) von Anspruch 3 und Anspruch 4, oder in Item (d) von Anspruch 5 und Anspruch 6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wodurch das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine Basensequenz einer Gesamtlänge von 1077 bp, gezeigt in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung, als die DNA eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung gefunden.
  • Die Aminosäuresequenz, welche basierend auf dieser Basensequenz bestimmt wurde, ist ebenfalls in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung gezeigt. Da die obige Aminosäuresequenz mit der partiell decodierten Aminosäuresequenz identisch ist, war das Protein mit dieser Aminosäuresequenz das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ II.
  • Die 4 zeigt eine Restriktionsenzymkarte der Basensequenz der DNA, welche für das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ II codiert. Wie aus der 4 ersichtlich ist, hat die Basensequenz Ban I-Spaltungsstellen auf den Basenpositionen 61 und 943, gezählt vom 5'-Ende, Acc I-Spaltungsstellen auf den Basenteilen 148 und 520, Hind III-Spaltungsstellen auf den Basenteilen 238 und 563, eine Sal I-Spaltungsstelle auf dem Basenteil 520 und eine EcoR I-Spaltungsstelle auf dem Basenteil 847.
  • Die Aminosäuresequenz des Erythrose-Reduktase-Proteins vom Typ II (siehe SEQ. ID Nr. 2 der Sequenzauflistung) ist eine neue Aminosäuresequenz mit niedriger Homologie im Vergleich zu den früher aufgeklärten Aminosäuresequenzen von humaner Aldose-Reduktase und von Hefe-gcy-Protein.
  • Hieraus wurde deutlich, dass das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ II der vorliegenden Erfindung eine neue Aminosäuresequenz besaß.
  • Nachfolgend wird ein Verfahren zum Erhalt der DNA eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
  • Das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls mittels des gleichen Verfahrens wie das oben beschriebene Verfahren zum Erhalt des Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
  • Das heißt, unter Verwendung einer Sonde, die basierend auf der Voll-Längen-cDNA der Erythrose-Reduktase vom Typ III des oben beschriebenen Mikroorganismus hergestellt wurde, wurde ein Screenen der cDNA-Bibliothek des oben beschriebenen Mikroorganismus unter den in Item (b) von Anspruch 3 und Anspruch 4 oder in Item (d) von Anspruch 5 und Anspruch 6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wodurch das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine Basensequenz einer Gesamtlänge von 1121 bp, gezeigt in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung, als die DNA eines Proteins mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung gefunden.
  • Die Aminosäuresequenz, die basierend auf dieser Basensequenz bestimmt wurde, ist ebenfalls in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung gezeigt.
  • Da die obige Aminosäuresequenz mit einer partiell decodierten Aminosäuresequenz identisch ist, war das Protein mit dieser Aminosäuresequenz das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ I.
  • Die 5 zeigt eine Restriktionsenzymkarte der Basensequenz der DNA, welche Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ I codiert. Wie aus der 5 ersichtlich ist, besitzt die Basensequenz Ban I-Spaltungsstellen auf den Basenteilen 61 und 943, gezählt vom 5'-Ende, Hind III-Spaltungsstellen auf den Basenteilen 238 und 563, eine Acc I-Spaltungsstelle und eine Sal I-Spaltungsstelle auf dem Basenteil 520 und eine EcoR I-Spaltungsstelle auf dem Basenteil 847.
  • Die Aminosäuresequenz des Erythrose-Reduktase-Proteins vom Typ I (siehe SEQ. ID Nr. 3 der Sequenzauflistung) ist eine neue Aminosäuresequenz mit niedriger Homologie im Vergleich mit den früher aufgeklärten Aminosäuresequenzen von humaner Aldose-Reduktase und Hefe-gcy-Protein.
  • Hieraus ergab sich, dass das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ I der vorliegenden Erfindung eine neue Aminosäuresequenz besaß.
  • Das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Aminosäuresequenz umfassen, welche eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversionen an einer oder mehreren Stellen in bezug auf die Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1, 2 oder 3 in der Sequenzauflistung enthält, sofern Erythrose-Reduktase-Aktivität vorliegt.
  • Das Protein, welches die Aminosäuresequenz umfasst, die eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversionen an einer oder mehreren Stellen in bezug auf die Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1, 2 oder 3 in der Sequenzauflistung als solche umfasst, kann zum Beispiel durch ein Verfahren der stellenspezifischen Mutation (Methods in Enzymology, 100, S. 448 (1983)), Mutationsbehandlung und darüber hinaus durch natürlich auftretende Mutation wie einem Unterschied in der Spezies oder dem Stamm eines Organismus und dergleichen erhalten werden. Ebenfalls können sie durch Anweisungsschriften für Experimente bezüglich genetischer Rekombination erhalten werden (Nucleic Acid Res. 10, S. 6487 (1982). Methods in Enzymol. 00, S. 448 (1983)), PCR Methode (Molecular Cloning 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); PCR A Practical Approach IRL Press S. 200 (1991)).
  • Es kann durch Expression des die Sequenz enthaltenden Gens in einer geeigneten Zelle und Untersuchung der Erythrose-Reduktase-Aktivität des Expressionsproduktes bestätigt werden, ob die Aminosäuresequenzen, welche die oben beschriebene Substitution oder dergleichen enthalten, eine Erythrose-Reduktase-Aktivität besitzen. Die Erythrose-Reduktase-Aktivität kann gemessen werden durch Vergleichen der Änderungen in der Menge an NAD(P)H, da das Enzym NAD(P)H als ein Coenzym bei der Reduktion von Erythrose verwendet (siehe 1).
  • Die DNA, welche das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert, des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung, braucht nicht nur DNA zu sein, welche die Basensequenz der Basen Nr. 1 bis 399 enthält, welche aus der Basensequenz ist, die in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschrieben ist, und auf der N-terminalen Domäne ist, wo man voraussagt, dass die NAD(P)H-Bindungsstelle hauptsächlich lokalisiert ist, sondern auch DNA, welche mit einer Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert, welche aus der obigen Basensequenz hergestellt ist, und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • Auch kann die DNA nicht nur DNA sein, die die Basensequenz der Basen Nr. 408 bis 1119 enthält, welche aus der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz ist, und ein Abschnitt auf dem C-Ende ist, wo die Erythrose- oder Erythritol-Bindungsstelle vorliegen kann, sondern auch DNA, welche mit einer Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die aus der obigen Basensequenz hergestellt ist, und ein Protein mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • Die "stringente Bedingung", auf die hierin Bezug genommen wird, steht für eine Bedingung, unter der sich ein sogenanntes spezifisches Hybrid ohne nicht-spezifisches Hybrid bildet.
  • Obgleich diese Bedingung in numerischen Werten nur schwierig zu beschreiben ist, kann zum Beispiel eine Bedingung erwähnt werden, unter der eine Hybridisierung bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird, d. h. der Bedingung des Waschens bei einer gängigen Southern-Hybridisierung.
  • Unter der DNA, welche unter diesen Bedingungen hybridisiert, kann jene, in welcher ein Stopp-Codon in der Mitte erzeugt worden ist, und jene, welche aufgrund der Variation in dem aktiven Zentrum ihre Aktivität verloren hat, eingeschlossen werden. Sie können leicht durch Ligieren dieser an einen kommerziell verfügbaren Expressionsvektor entfernt werden, wobei sie in einem geeigneten Wirt exprimiert werden und die Erythrose-Reduktase-Aktivität des exprimierten Produktes durch das unten beschriebene Verfahren gemessen wird.
  • Die DNA, welche das Protein mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung codiert, kann nicht nur DNA sein, welche die Basensequenz der Basen Nr. 1 bis 399 enthält, welche aus der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz ist und sich auf der N-terminalen Domäne befindet, wo voraussagt, dass die NAD(P)H-Bindungsstelle hauptsächlich lokalisiert ist, sondern auch DNA, welche mit einer Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die aus der obigen Basensequenz hergestellt wurde und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert. Auch kann die DNA nicht nur DNA sein, welche die Basensequenz der Basen Nr. 408 bis 1077 enthält, welche aus der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz ist und in einem Bereich des C-Endes liegt, wo die Erythrose- oder Erythritol-Bindungsstelle vorliegen kann, sondern auch DNA, welche mit einer Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die aus der obigen Basensequenz hergestellt wurde und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • Die hierin angeführte "stringente Bedingung" ist ebenfalls schwierig in numerischen Werten zu beschreiben, wobei zum Beispiel die Bedingung erwähnt werden kann, unter welcher die Hybridisierung bei 60°C und 2 × SSC mit 0,1% SDS durchgeführt wird, d. h. die Bedingung des Waschens bei üblicher Southern-Hybridisierung.
  • Die DNA, welche das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung codiert, kann nicht nur DNS sein, welche die Basensequenz der Basen Nr. 1 bis 399 enthält, welche aus der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz ist und auf der N-terminalen Domäne ist, wo vorausgesagt wird, dass die NAD(P)H-Bindungsstelle hauptsächlich lokalisiert ist, sondern auch DNA, die mit einer Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die aus der obigen Basensequenz hergestellt ist und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • Auch kann die DNA nicht nur DNA sein, die die Basensequenz der Basen Nr. 408 bis 1121 enthält, welche aus der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz ist und auf einem Abschnitt auf dem C-Ende liegt, wo die Erythrose- oder Erythritol-Bindungsstelle vorliegen kann, sondern auch DNA, welche mit einer Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die aus der obigen Basensequenz hergestellt wurde und ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  • Die hierin angeführte "stringente Bedingung" ist ebenfalls schwierig in numerischen Werten zu beschreiben, wobei zum Beispiel die Bedingung erwähnt werden kann, unter welcher eine Hybridisierung bei 60°C und 2 × SSC mit 0,1% SDS durchgeführt wird, d. h. die Bedingung des Waschens bei üblicher Southern-Hybridisierung.
  • Die DNA, welche das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität vom Typ I, II oder III codiert, kann in eine Zelle in einer Form eingeführt werden, bei der die Erythrose-Reduktase-Aktivität vom Typ I, II bzw. III exprimiert.
  • Die Einführung in eine Zelle kann durch Amplifizieren mittels PCR der vollen Länge der DNA, die für die Erythrose-Reduktase vom Typ I, II oder III codiert, mit einem Primer mit einer Restriktions-Enzym-Erkennungsstelle an beiden Enden und Ligieren der amplifizierten DNA in verschiedene Expressionsvektoren an der Restriktions-Enzymstelle durchgeführt werden.
  • Die Zellen wie Escherichia coli, Hefe (Saccharomyces cerevisia und Pichia pastoris) und dergleichen können für die Erythrose-Reduktase-Expression verwendet werden.
  • Als Plasmid ist es wünschenswert, geeignete Expressionsvektoren für eine Produktion in großem Maßstab zu wählen. In dem Fall von Escherichia coli können Plasmide, die mit Histidin-Tag fusioniertes Protein, mit GST (Gluthathion-S-Transferase) fusioniertes Protein, mit Thioredoxin fusioniertes Protein und dergleichen codieren, verwendet werden.
  • Bei der Induktion der Expression kann ein Promoter stromaufwärts der 5'-Stelle inkorporiert werden, und ein Terminator kann stromabwärts der 3'-Stelle der DNA der vorliegenden Erfindung eingebaut werden. Als Promotor und Terminator müssen jene, welche dafür bekannt sind, eine Funktion zur Expression in der Zelle zu besitzen, verwendet werden. Details davon werden in Biseibutsugaku Kisokoza 8, Idenshikogaku, Kyoritsu Shuppan (Fundamental Course on Microbiology 8, Genetic Engineering, Kyoritsu Publishing Co.), Adv. Biochem. Eng. 43, 75–102 (1990), Yeast 8, 423–488 (1992) und dergleichen beschrieben.
  • Wenn zum Beispiel ein Plasmid in Escherichia coli eingeführt wird, ist die Verwendung eines Regulationssystems durch IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) am Lactoseoperon und Lac I für eine eng regulierte Induktion bevorzugt.
  • Die eng regulierte Induktion kann durch die Verwendung von Galactose erreicht werden, wenn Saccharomyces cerevisiae, welche eine auxotrophe Hefe ist, anstelle von E. coli verwendet wird und das Plasmid in die Hefe eingeführt wird.
  • Wie oben beschrieben, kann das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren von Zellen hergestellt werden, in die DNA, die ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert, eingeführt wurde, Durchführen einer Induktion, Ernten der Zellen in dem Stadium, wenn das Protein in ausreichendem Maße exprimiert wird, Abtrennen von rekombinanten Proteinen und Reinigen dieser.
  • Um ein Beispiel zu nehmen, kann eine rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III hergestellt werden, indem die Zellen, in die für das Protein des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung codierende DNA eingebracht wurde, durch Zentrifugation geerntet werden, die Zellen durch Ultrabeschallung aufgebrochen werden, die erhaltenen rekombinanten Proteine durch Affinitätsgelchromatographie mit Histidin-Tag gereinigt werden und das Histidin-Tag mit Enterokinase abgespalten wird.
  • In entsprechender Weise kann rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ II oder I aus Zellen erzeugt werden, in welche DNA, die ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität des zweiten oder dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung codiert, eingeführt worden ist.
  • Die Erythrose-Reduktase-Aktivität kann durch Messung der Absorptionsänderung bei 340 nm in Übereinstimmung mit dem NADPH- oder NADH-Verbrauch bei der Reduzierung von D-Erythrose überwacht werden (siehe 1).
  • Als nächstes wird das Verfahren der Herstellung von Erythritol mit der vorliegenden Erfindung beschrieben. Speziell kann meso-Erythritol erhalten werden, indem das Protein der vorliegenden Erfindung auf D-Erythrose einwirken gelassen wird.
  • Indem man das Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität der vorliegenden Erfindung auf D-Erythrose einwirken lässt, kann eine Reduktionsreaktion der D-Erythrose in Gegenwart von NADPH oder NADH bei einer optionalen Bedingung zur Expression der Enzymaktivität ausgeführt werden.
  • Die Reduktionsreaktion kann bei einer Reaktionstemperatur von 33 bis 37°C, vorzugsweise 36 bis 37°C, einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0, vorzugsweise einem pH-Wert von 6,5, in einer Coenzym-NADPH- oder -NADH-Konzentration von 0,1 bis 0,5 mM, vorzugsweise 0,2 bis 0,3 mM, durchgeführt werden. Die Substrate können am Ausgangspunkt zur Reaktion hinzugesetzt werden, jedoch ist es wünschenswert, das Substrat kontinuierlich oder nicht-kontinuierlich hinzuzusetzen, so dass die Konzentration an Substrat in der Reaktionsmischung nicht zu hoch wird.
  • Ebenfalls kann Erythritol erhalten werden, indem man die Zellen, in die die DNA, welche ein Erythrose-Reduktase-Protein codiert, eingeführt worden ist, auf D-Erythrose wirken lässt. In diesem Falle reduziert das Erythrose-Reduktase-Protein D-Erythrose unter Verwendung von intrazellulärem NADPH oder NADH. Das heißt, man muss kein NAD(P)H von außen zuführen.
  • Als Beispiel genommen kann Erythritol erhalten werden, indem die Zellen, in die die für Erythrose-Reduktase-Protein codierende DNA eingebracht worden ist, unter einer geeigneten Bedingung zum Wachstum der Zellen und zur Produktion von Erythritol in einem Medium kultiviert werden, welches in angemessener Weise eine Kohlenstoffquelle, gewählt aus Zuckern wie Glucose, Fructose, Saccharose und dergleichen, eine Stickstoffquelle, gewählt aus Hefeextrakten, Pepton und dergleichen, und anorganischen Salze, gewählt aus Phosphorsäuresalzen, Magnesiumsalzen, Calciumsalzen, etc., enthält, kultiviert werden.
  • Die rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ I, II und III der vorliegenden Erfindung besitzen eine Substratspezifität, welche äquivalent zu der von den berichtetermaßen bekannten Erythrose-Reduktasen ist und eine enzymatische Aktivität zur Herstellung von Zuckeralkohol besitzt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein neues Protein mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität bereitgestellt werden.
  • Die Expression von DNA, welche die Erythrose-Reduktasen vom Typ III, II oder I der vorliegenden Erfindung codiert, zum Beispiel durch Mikroorganismen, einschließlich Hefe, macht die Produktion der Erythrose-Reduktasen vom Typ III, II oder I im großen Maßstab einfach, unabhängig von der Produktivität der Mikroorganismen und dergleichen im Vergleich mit bekannten Verfahren, durch normales Kultivieren von Mikroorganismen.
  • Die rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ III, II oder I besitzen eine äquivalente Substratspezifität zu der von Erythrose-Reduktasen vom natürlichen Typ und behalten ebenfalls eine enzymatische Aktivität der Herstellung von Zuckeralkoholen bei.
  • Deshalb sind die Erythrose-Reduktasen vom Typ III, II oder I, welche unter Verwendung von DNA, die das Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, hergestellt werden, brauchbar bei der Herstellung von Erythritol im industriellen Maßstab.
  • Außerdem ist DNA, welche die Erythrose-Reduktasen vom Typ III, II oder I der vorliegenden Erfindung codiert, ebenfalls brauchbar bei verschiedenen Anwendungen, wie der Entwicklung von Mutantenenzymen mit hoher Erythritolproduktivität durch gentechnologische Techniken und Klonieren von Genen, welche verwandte Enzyme codieren.
  • BEISPIELE
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail mit Beispielen erläutert. Gleichwohl sollte die vorliegende Erfindung nicht auf diese beschränkt ausgelegt werden.
  • Beispiel 1
  • (1) Ernten und Reinigen von Erythrose-Reduktase vom Typ III vom Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42
  • Nach dem in H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56(6), 941–945, 1992, beschriebenen Verfahren erfolgte das Ernten und Reinigen von Erythrose-Reduktasen vom Typ III aus dem Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 (FERM BP-1430, unter dem alten Namen Aureobasidium-Stamm SN-G42; dieser Stamm ist unter dem Budapester Vertrag bei dem "National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt).
  • Zuerst wurde der Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 (FERM BP-1430) 72 Stunden lang im Glucosemedium (40% Glucose, 2% Hefeextrakte, 2 Liter) kultiviert.
  • Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 10000 × g 30 Minuten lang gesammelt, dann gefriergetrocknet, mit Aceton behandelt und danach unter Verwendung von MSK-Cell Homogenisator (hergestellt von B. Braun Japan) homogenisiert.
  • Als nächstes wurden die zerbrochenen Zellen bei 10000 × g 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen.
  • Der Überstand wurde anschließend mittels Ammoniumsulfatpräzipitation fraktioniert. Die Präzipitate zwischen 40 bis 70% Ammoniumsulfat, die Erythrose-Reduktase einschlossen, wurden mittels Membranfiltration konzentriert. Dann wurden die Präzipitate in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) gelöst. Nach der Entfernung von unlöslichen Materialien durch Zentrifugation wurde die Enzymfraktion gegen die oben beschriebene Pufferlösung bei 4°C 24 Stunden lang dialysiert.
  • Die dialysierte Probe wurde auf eine Säule von DEAE-Toyopearl 650S (1,4 × 20 cm) (hergestellt von Tosoh Corp.), die im Voraus mit 50 mM Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0) äquilibriert worden war, geladen, die im Voraus mit 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,0) äquilibiert worden war, geladen, und die Konzentration an Natriumchlorid wurde linear von 0 mM auf 100 mM erhöht, gefolgt vom Erhalten der Erythrose-Reduktase Aktivität enthaltenden Fraktionen.
  • Die aktiven Fraktionen wurden durch Ammoniumsulfat-Präzipitation kondensiert und auf eine zuvor mit 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,0) äquilibrierte AF-Blue Toyopearl 650 ml (1,4 × 20 cm)-Säule (hergestellt von Tosoh Corp.) aufgetragen, und die Natriumchloridkonzentration wurde schrittweise von 0 mM auf 200 mM erhöht. Darauf folgte das Abtrennen der Fraktionen, die Erythrose-Reduktase vom Typ I und II (nicht-adsorbierte Fraktionen) enthielten, und der Fraktionen, die Erythrose-Reduktase vom Typ III enthielten (adsorbierte Fraktionen).
  • Nach dem Sammeln und Konzentrieren dieser, wurden die Erythrose-Reduktase vom Typ III enthaltenden Fraktionen auf eine Säule von Butyl-Toyopearl 650S (11 × 20 cm) (hergestellt von Tosoh Corp.) geladen, eine Säule zur hydrophoben Chromatographie, die im Voraus mit 35% gesättigtem Ammoniumsulfat-10 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,0) äquilibiert worden war, und 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,0) wurde unter einem Konzentrationsgradienten an Ammoniumsulfat, der linear von 35% auf 20% absank, durchlaufen gelassen, um die Fraktionen mit Erythrose-Reduktase-Aktivität zu gewinnen.
  • Auf diese Weise wurde Erythrose-Reduktase vom Typ III gereinigt.
  • (2) Bestimmung einer partiellen Aminosäuresequenz von Erythrose-Reduktase vom Typ III
  • Eine Peptid-Kartierung der obenstehend gereinigten Erythrose-Reduktase vom Typ III wurde durchgeführt, um eine partielle Aminosäuresequenz zu bestimmen.
  • Die Erythrose-Reduktase vom Typ III wurde pyridylethyliert (H. Hirano: J. Protein Chem., 8, 115 (1989)) und mit Lysylendopeptidase (hergestellt von Roche) verdaut. Eine Auftrennung dieser Probe unter Verwendung einer ODS-80 Tm (hergestellt von Tosoh Corp.)-Säule zeigte 14 Peaks, wobei zwei davon bezüglich der Aminosäuresequenz unter Verwendung des Peptidsequenzers 477A (hergestellt von Perkin-Elmer) bestimmt wurden.
  • (3) Design eines in der PCR-Reaktion verwendeten Primers
  • Von der teilweise decodierten Aminosäuresequenz wurden jene Aminosäuresequenzen (siehe SEQ. ID Nr. 6 und 7 in der Sequenzauflistung), gewählt in bezug auf die Aminosäuresequenzen unter der aldo-keto-Reduktasefamilie, wurden als ein Sinn-Primer (siehe SEQ. ID Nr. 4 in der Sequenzauflistung) und als ein Anti-Sinn-Primer (siehe SEQ. ID Nr. 5 in der Sequenzauflistung) in der nachfolgend beschriebenen PCR-Reaktion verwendet.
  • (4) PCR vom cDNA-Fragment, welches Erythrose-Reduktase vom Typ III codiert
  • Als nächstes wurde zur Herstellung einer Sonde zur Verwendung beim Screenen und dergleichen, wie unten beschrieben, eine PCR durchgeführt.
  • Einzelsträngige cDNA wurde vom Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42, kultiviert während 3 Tagen in 40%igem Glucosemedium, durch die folgenden Prozeduren synthetisiert und als eine Matrize verwendet.
  • RNA wurde von der Kulturzelle unter Verwendung von TRIZOL (hergestellt von Gibco BRL) extrahiert, und mRNA wurde unter Verwendung eines DYNABEADS-mRNA-Reinigungskits (hergestellt von DYNAL) gereinigt.
  • Eine Reverse-Transkriptions-Reaktion wurde unter Verwendung der gereinigten mRNA als eine Matrize zur Synthese von cDNA durchgeführt.
  • Bei der Reaktion wurde Super ScriptTM-Reverse-Transkriptase (hergestellt von Gibco) als eine reverse Transkriptase und Oligo (dT)12–15-Primer (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) als ein Primer verwendet.
  • Die Zusammensetzung der Reverse-Transkription-Reaktions-Mischung war wie folgt:
    mRNA 1 μg
    dNTP 10 mM × 3 μl
    Primer 0,5 μg
  • Die RNA-Transkription wurde bei 42°C 1 Stunde lang durchgeführt.
  • Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen cDNA als eine Matrize, des Sinn-Primers (siehe SEQ. ID Nr. 4 in der Sequenzauflistung) und des Antisinn-Primers (siehe SEQ. ID Nr. 5 in der Sequenzauflistung) zur PCR, entworfen oben in (3), und Pfu-DNA-Polymerase (hergestellt von STRATAGENE) wurde eine PCR-Reaktion 25 Zyklen lang durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 94°C, 1 Minute – 40°C, 1 Minute – 72°C, 1 Minute, bestand.
  • Das Amplifikationsprodukt der PCR-Reaktion war ein 398 bp langes cDNA-Fragment. Das Fragment wurde an einen Vektor pBSSK+ ligiert, verdaut mit EcoR V, und weiterhin mit dem DH5α-Stamm transformiert. Es wurde analysiert, ob der Transformant die partielle Aminosäuresequenz des zuvor bestimmten Erythrose-Reduktase-Typ III-Proteins enthielt oder nicht.
  • Das erhaltene cDNA-Fragment wurde in der Folge als eines identifiziert, das eine partielle cDNA von Erythrose-Reduktase vom Typ III war. Dieses Fragment korrespondierte zur 184. bis 582., ausgehend vom N-Terminus der in der Seq. ID Nr. 1 der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz.
  • Dieses cDNA-Fragment wurde für die weitere cDNA-Isolierung als Sonde verwendet.
  • (5) Northern-Hybridisierung von Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42
  • Bei der Präparation einer cDNA-Bibliothek aus dem Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 wurde eine Northern-Hybridisierung durchgeführt, um zu untersuchen, wann die Mikroorganismen mRNA der Erythro-Reduktase vom Typ III exprimieren.
  • Der Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 wurde unter Schütteln bei den Bedingungen von 37°C und 220 Upm in einem 500 ml großen Kolben mit 30 ml 40% Glucose enthaltendem Medium für 24, 48, 72 oder 96 Stunden kultiviert.
  • Nach der Kultivierung wurde Gesamt-RNA aus allen Zellen unter Verwendung von TRIZOL (hergestellt von Gibco) extrahiert.
  • Die aus dem bereits vorher decodierten gereinigten Enzym hergestellte Sonde wurde nach der Markierung mit Digoxigenin-UTP unter Verwendung von DIG-RNA-Markierungskit (hergestellt von Roche) verwendet.
  • Extrahierte RNAs wurde elektrophoretisiert, dann auf Hybond-N-Membran geblottet. Eine Northern-Hybridisierung wurde mit der obigen RNA-markierten Sonde unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt.
  • Die 2 zeigt die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung. In 2 zeigt die Spur 1 die Ergebnisse bezüglich des Produktes einer 24-Stunden-Kultur, die Spur 2; 48 Stunden, Spur 3; 72 Stunden und Spur 4; 96 Stunden. Um die Längen von Fragmenten zu vergleichen, wurde die Mobilität einer RNA-Leiter auf der linken Seite aufgetragen.
  • Aus der 2 wurde gefunden, dass die Bande um etwa 1,0 kb am stärksten bei der 48-Stunden-Kultur war, und dass die Erythrose-Reduktase vom Typ III exprimiert wurde.
  • Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die 48-Stunden-Kultur vom Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 Erythrose-Reduktase vom Typ III am stärksten exprimierte. Dieses enthüllt, dass die aus mRNA hergestellte cDNA-Bibliothek zu diesem Zeitpunkt für die Genanalyse des oben beschriebenen Enzyms geeignet ist.
  • (6) Herstellung einer cDNA-Bibliothek vom Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42
  • Gemäß den obigen Ergebnissen in (5) wurde eine cDNA-Bibliothek aus mRNA zu dem Zeitpunkt hergestellt, als die Erythrose-Reduktase vom Typ 111 am meisten exprimiert wurde, und zwar durch die folgende Prozedur.
  • Trichosporonoides megachiliensis-Stamm SN-G42 wurde in 30 ml eines Mediums, das 40% Glucose enthielt, in einem 500 ml Kolben unter den Bedingungen von 37°C, 220 Upm und 48 Stunden kultiviert.
  • RNA wurde aus der Kultur unter Verwendung von TRIZOL (hergestellt von Gibco BRL) extrahiert, und mRNA wurde unter Verwendung von DYNABEADS mRNA-Reinigungskit (hergestellt von DYNAL) gereinigt.
  • Aus der mRNA wurde eine Bibliothek unter Verwendung des ZAP-Express-cDNA-Synthesekits (hergestellt von STRATAGENE) mit der Beschreibung des Kits hergestellt. Als erstes wurde eine Reverse-Transkriptions-Reaktion unter Verwendung von mRNA als eine Matrize durchgeführt, um cDNA zu synthetisieren.
  • Bei dieser Gelegenheit wurde die Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Reverse-Transkriptase (MMLV-RT, hergestellt von STRATAGENE) als eine reverse Transkriptase verwendet, und Linker-Primer wurde als ein Primer eingesetzt. Diese sind Reagenzien, welche in dem oben beschriebenen Kit enthalten sind.
  • Die Zusammensetzung der Reverse-Transkriptions-Reaktionsmischung war wie folgt.
    mRNA 5 μg
    dNTP 10 mM × 3 μl
    Primer 2,8 μg
  • Die erhaltene cDNA wurde; um sie zu verpacken; in einen ZAP-Express-Vektor unter Verwendung der EcoR I-Stelle und der Xho-I-Stelle eingeführt.
  • In dieser Weise wurde eine cDNA-Bibliothek vom Trichosporonoides megachiliensis-Stamm DN-G42 mit einem Titer von 2350000 pfu hergestellt.
  • (7) Plaque-Hybridisierung der cDNA-Bibliothek und Bestimmung der Basensequenz von DNA, die für Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III codiert
  • Als nächstes wurde gepackter rekombinanter Phage zu Escherichia coli XL1-Blue MRF' infiziert, und es wurde zugelassen, dass sich Plaques auf der Platte bilden. Dann wurde unter Verwendung der oben in (4) hergestellten Sonde eine Plaque-Hybridisierung unter den stringenten Bedingungen durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis der Plaque-Hybridisierung wurde der Zielklon isoliert und amplifiziert und danach wurde durch Einwirken eines Helfer-Phagen nur der Phagemid-Bereich in der λ-Phagen-DNA (einschließlich eines Inserts) gespalten und unter Bildung eines Plasmids zyklisiert. Hiermit wurde der Wirt Escherichia coli XLOLR infiziert, und es wurde darin amplifiziert.
  • Dann wurde ein Plasmid aus dem amplifizierten XLOLR erhalten, und es wurde eine DNA-Sequenzierung durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis der Analyse zeigte sich, dass eine in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebene Basensequenz in einer vollen Länge von 1119 bp vorlag. Die Translation der Basensequenz in eine Aminosäuresequenz) wurde ebenfalls in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung gezeigt.
  • Ferner wurde eine Restriktionsenzymkarte bezüglich der erhaltenen Basensequenz mittels einer herkömmlichen Weise hergestellt (3). Wie aus der 3 ersichtlich ist, besitzt die Basensequenz eine Ban I-Spaltstelle auf dem Abschnitt der Base 122, gezählt vom 5'-Ende, EcoR I-Spaltstellen an der Basenposition 847 und 1057 und eine BamH I-Spaltstelle auf der Basenposition 1093.
  • Das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III, welches aus der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Aminosäuresequenz bestand, stellte sich als eine neue Sequenz mit niedriger Homologie mit den bekannten Aminosäuresequenzen, wie dem früher bereits aufgeklärten Human-Aldose-Reduktase-Enzym und dem Hefe-gcy-Protein heraus.
  • Hieraus ergibt sich, dass die DNA, welche das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III der vorliegenden Erfindung codiert, die in der SEQ. ID Nr. 1 beschriebene Sequenz besitzt, so dass sich die Erythrose-Reduktase vom Typ III der vorliegenden Erfindung als eine DNA herausstellte, die eine Polypeptid mit einer neuen Aminosäuresequenz codiert.
  • (8) Expression von rekombinanter Erythrose-Reduktase vom Typ III unter Verwendung von Escherichia coli
  • Basierend auf der N-terminalen Seite der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz, mit Ausnahme des Initiationscodons (atg), wurde ein Primer hergestellt, so dass er eine BamH-I-Stelle besaß. Ebenfalls wurde basierend auf der C-terminalen Seite der gleichen Basensequenz ein anderer Primer synthetisiert, so dass er eine Xho-I-Stelle aufwies.
  • Unter Verwendung eines Plasmids als Matrize, das Erythrose-Reduktase vom Typ III enthielt, welches durch vorausgehendes Durchführen eines Screenens von der cDNA-Bibliothek erhalten worden war, wurde Vollängen-cDNA von Erythrose-Reduktase vom Typ III mit BamH-I- und Xho-I-Stellen auf den Enden mittels PCR unter Verwendung der oben beschriebenen Primer amplifiziert.
  • Die Bedingungen der PCR waren dergestalt, dass 200 ng Erythrose-Reduktase-cDNA vom Typ III enthaltendes Plasmid als eine Matrize verwendet wurden und Pfu-DNA-Polymerase (hergestellt von STRATAGENE) als ein Enzym verwendet wurde und eine PCR mit 12 Zyklen durchgeführt wurde.
  • Als ein PCR-Ergebnis wurde das Erythrose-Reduktase-Typ-III-Gen mit BamH I- und Xho I-Stellen amplifiziert. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde durch Spalten der BamH I- und Xho I-Stellen des Plasmids pRSET A (hergestellt von INVITROGEN) inkorporiert.
  • Das Plasmid pRSET A in einem Zustand, bei dem es das Erythrose-Reduktase-Gen vom Typ III inkorporiert enthielt, wurde in E. coli BL21 (DE3) pLysS (hergestellt von STRATAGENE) eingeführt, welches eine Zelle zur Expression ist, und E. coli wurde auf einem LB-Kulturmedium, das 50 μg/ml Ampicillin enthält, bei 25°C kultiviert, so dass es als ein Histidin-Tag-gebundenes Protein exprimiert werden konnte. Die Induktion der Expression wurde durch das Laktoseoperon durchgeführt, indem IPTG hinzugesetzt wurde, so dass es in einer Endkonzentration von 1 mM vorlag.
  • Zellen von E. coli wurden mittels Zentrifugation (2920 g, 15 Minuten) gesammelt, durch Ultraschallbehandlung (SONIFIER 250D, hergestellt von BRANSON) aufgebrochen, und eine Zentrifugation (26400 g, 15 Minuten) wurde erneut durchgeführt, um Überstand (rohe Enzymlösung) zu erhalten.
  • Die erhaltene rohe Enzymlösung wurde mittels Nickel-chelatisierter Agarose (B-PER 6 × His Spin-Reinigungskit, hergestellt von PIERCE) gereinigt, welches ein Affinitätsgel für ein mit Histidin Tag fusioniertes Protein ist.
  • Als nächstes wurde mittels einer Gelfiltrationseinheit PD-10 (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) der Puffer durch einen Enterokinase-Reaktionspuffer unter Verwendung der Gelfiltration ersetzt.
  • Nach der Reinigung wurde der Histidin-Tag-Abschnitt mittels Enterokinase (hergestellt von INVITROGEN) abgespalten. Danach wurde zur Entfernung von verunreinigenden Proteinen, Histidin-Tag und Enterokinase eine Reinigung mittels einer Ionenaustauschersäule durchgeführt, um rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III zu erhalten.
  • Beispiel 2
  • (1) Eine Plaque-Hybridisierung der cDNA-Bibliothek und Bestimmung der Basensequenz von DNA, die ein Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ II codiert
  • Bezüglich der cDNA-Bibliothek, die in Beispiel 1 (6) hergestellt wurde, wurde eine Sonde basierend auf der Vollängen-cDNA der Erythrose-Reduktase vom Typ III, erhalten oben in Beispiel 1, hergestellt, und eine Plaque-Hybridisierung wurde unter Verwendung dieser Sonde unter den stringenten Bedingungen durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis der Plaque-Hybridisierung wurde der Zielklon isoliert und amplifiziert, und danach wurde unter Mitwirkung des Helfer-Phagen nur der Phagemidabschnitt in der λ-Phagen-DNA (einschließlich eines Inserts) abgespalten und zur Bildung eines Plasmids zyklisiert. Mit diesem Plasmid wurde der Wirt E. coli XLOLR infiziert, und es wurde darin amplifiziert.
  • Anschließend wurde ein Plasmid aus diesem amplifizierten XLOLR erhalten, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis der Analyse wurde enthüllt, dass dies eine Basensequenz, die in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschrieben ist, in einer vollen Länge von 1077 bp ist. Die Translation der Basensequenz in Aminosäure(sequenz) wurde ebenfalls in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung gezeigt. Ferner wurde eine Restriktionsenzymkarte der erhaltenen Basensequenz mittels herkömmlicher Weise hergestellt (4). Wie aus der 4 ersichtlich ist, besitzt die Basensequenz Ban I-Spaltstellen an den Basenpositionen 61 und 943, gezählt vom 5'-Ende, Acc I-Spaltstellen an den Basenpositionen 148 und 520, Hind III-Spaltstellen an den Basenpositionen 238 und 563, eine Sal I-Spaltstelle auf der Basenposition 520 und eine EcoR I-Spaltstelle auf der Basenposition 847.
  • Hierdurch wurde enthüllt, dass die DNA, welche das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ II der vorliegenden Erfindung codiert, die in der SEQ. ID Nr. 2 beschriebene Sequenz aufweist, so dass das Erythrose-Reduktase-Typ II-Gen der vorliegenden Erfindung sich als eine DNA herausstellte, die ein Polypeptid mit einer neuen Aminosäuresequenz codiert.
  • (2) Expression von rekombinanter Erythrose-Reduktase vom Typ II unter Verwendung von E. coli
  • Basierend auf der N-terminalen Seite der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz, mit Ausnahme des Startcodons (atg), wurde ein Primer so hergestellt, dass er eine BamH I-Stelle aufwies. Ebenfalls wurde basierend auf der C-terminalen Seite der gleichen Basensequenz ein anderer Primer so synthetisiert, dass er eine Xho I-Stelle aufwies.
  • Unter Verwendung eines Plasmids, das Erythrose-Reduktase vom Typ II enthielt, als eine Matrize, welches erhalten worden war durch vorausgehendes Durchführen eines Screenens der cDNA-Bibliothek wurde Vollängen-cDNA von Erythrose-Reduktase vom Typ II mit BamH I- und Xho I-Stellen auf den Enden durch PCR unter Verwendung der oben beschriebenen Primer amplifiziert. Die Bedingungen der PCR waren die gleichen wie in Beispiel 1 (8) gezeigt.
  • Als ein Ergebnis der PCR wurde Erythrose-Reduktase-Typ II-Gen mit BamH I- und Xho I-Stellen amplifiziert. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde durch Spalten der BamH I- und Xho I-Stellen vom Plasmid pRSET A inkorporiert und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (8) gereinigt, wodurch rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ II erhalten wurde.
  • Beispiel 3
  • (1) Plaque-Hybridisierung von cDNA-Bibliothek und Bestimmung der Basensequenz von DNA, die ein Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ I codiert
  • Bezüglich der in Beispiel 1 (6) hergestellten cDNA-Bibliothek wurde eine Sonde basierend auf der Volllängen-cDNA von Erythrose-Reduktase vom Typ III, erhalten oben in Beispiel 1, hergestellt, und eine Plaque-Hybridisierung wurde unter Verwendung dieser Sonde unter den stringenten Bedingungen durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis der Plaque-Hybridisierung wurde der Zielklon isoliert und amplifiziert, und danach wurde durch Mitwirkung von Helfer-Phage nur der Phagemidabschnitt in der λ-Phagen-DNA (einschließlich eines Inserts) abgespalten und unter Bildung eines Plasmids zyklisiert. Mit Hilfe dieses Plasmids wurde der Wirt E. coli XLOLR infiziert, und es wurde darin amplifiziert.
  • Anschließend wurde ein Plasmid aus der amplifizierten XLOLR erhalten, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis der Analysen enthüllte sich, dass dies eine in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebene Basensequenz in einer vollständigen Länge von 1121 bp ist. Die Translation der Basensequenz zu der Aminosäure(sequenz) wurde ebenfalls in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung gezeigt.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine Basensequenz einer gesamten Länge von 1121 bp, gezeigt in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung, durch die DNA-Sequenzierung gefunden.
  • Ferner wurde eine Restriktionsenzym-Karte bezüglich der erhaltenen Basensequenz in herkömmlicher Weise hergestellt (5). Wie aus der 5 ersichtlich ist, besitzt die Basensequenz Ban I-Spaltstellen auf den Basenpositionen 61 und 943, gezählt vom 5'-Ende, Hind III-Spaltstellen auf den Basenpositionen 238 und 563, eine Acc I-Spaltstelle und eine Sal I-Spaltstelle auf der Basenposition 520 und eine EcoR I-Spaltstelle auf der Basenposition 847.
  • Hieraus enthüllte sich, dass die DNA, welche das Erythrose-Reduktase-Protein vom Typ III der vorliegenden Erfindung codiert, die in der SEQ. ID Nr. 3 beschriebene Sequenz besitzt, und somit stellte sich für das Erythrose-Reduktase-Typ I-Gen der vorliegenden Erfindung heraus, dass es eine DNA war, die ein Polypeptid mit einer neuen Aminosäuresequenz codiert.
  • (2) Expression von rekombinanter Erythrose-Reduktase vom Typ I unter Verwendung von E. coli
  • Basierend auf der N-terminalen Seite der in der SEC. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Basensequenz, mit Ausnahme des Startcodons (atg), wurde ein Primer so hergestellt, dass er eine BamH I-Stelle aufwies. Ebenfalls wurde basierend auf der C-terminalen Seite der gleichen Basensequenz ein anderer Primer so synthetisiert, dass er eine Xho I-Stelle aufwies.
  • Unter Verwendung eines Plasmids, das Erythrose-Reduktase vom Typ I enthielt, als eine Matrize, welche im Voraus durch die Durchführung eines Screenens aus der cDNA-Bibliothek erhalten worden war, wurde eine Vollängen-cDNA von Erythrose-Reduktase vom Typ I mit BamH I- und Xho I-Stellen auf den Enden mittels PCR unter Verwendung der oben beschriebenen Primer amplifiziert. Die Bedingungen der PCR waren die gleichen, wie jene, die in Beispiel 1 (8) gezeigt sind.
  • Als ein Ergebnis der PCR wurde Erythrose-Reduktase-Typ I-Gen mit BamH I- und Xho I-Stellen amplifiziert. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde eingebracht durch Spalten der BamH I- und Xho I-Stellen vom Plasmid pRSET A, und es wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (8) gereinigt, wodurch rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ I erhalten wurde.
  • Beispiel 4
  • Die folgenden Tests wurden bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ III, Typ II und Typ I, erhalten in den Beispielen 1 bis 3, durchgeführt.
  • (1) Vergleich der Substratspezifität
  • Die Substratspezifitäten der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ III, Typ II und Typ I wurden mit jenen der vorstehend angeführten Erythrosereduktase (natürlicher Typ: H. Ishizuka et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56(6), 941–945, 1992) verglichen.
  • In Gegenwart von 50 mM eines Phosphatpuffers bei einem pH-Wert von 6,5, 12 mM eines Substrates und 0,2 mM NADPH wurden 20 μl eines Enzyms wirken gelassen (1 ml insgesamt), und die Änderung mit der Zeit in der optischen Absorption bei 340 nm wurde bei 37°C 5 Minuten lang gemessen.
  • Mit einem Wert für die Reaktionsrate, bei der Erythrose als ein Substrat reduziert wird, von 100% sind relative Werte (%) der Reaktionsraten für die Reduktion verschiedener Ketosen und Aldosen in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00390001
  • Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, dass rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III der vorliegenden Erfindung das Vermögen der Reduktion von Substraten von bereits früher berichteter Erythrose-Reduktase des Typs III vom natürlichen Typ besitzt.
  • Ferner werden die Substratspezifitäten der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I und Typ II dadurch gekennzeichnet, dass sie eine niedrigere relative Aktivität bezüglich Dihydroxyaceton und p-Nitrobenzaldehyd als Typ III besitzen.
  • Aus dem Obenstehenden ist ersichtlich, dass das rekombinante Enzym, welches durch die Expression von DNA, die die Erythrose-Reduktase vom Typ III der vorliegenden Erfindung codiert, die gleiche Substratspezifität wie die natürlich auftretende Erythrose-Reduktase vom Typ III besitzt und eine Enzymaktivität der Erzeugung von Zuckeralkoholen aufweist.
  • Ferner ist es ebenfalls ersichtlich, dass die rekombinanten Enzyme, welche durch die Expression von DNA, die die Erythrose-Reduktasen vom Typ II und Typ I der vorliegenden Erfindung codiert, eine Enzymaktivität der Herstellung von Zuckeralkoholen wie Erythritol aufweisen.
  • (2) Western Blotting
  • Ein Western Blotting wurde bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ III, Typ II und Typ I durchgeführt.
  • Die Enzymlösung, welche jedes Enzym enthielt, wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und von dem Gel zu einer PVDF-Membran nach der Auftrennung überführt. Nachdem diese mit einem Maus-Antikörper gegen Erythrose-Reduktase vom Typ III als primärem Antikörper umgesetzt worden war, wurde der daran geknüpfte primäre Antikörper unter Verwendung eines mit HRP markierten Schaf-Anti-Maus-IgG-Antkörpers detektiert. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
  • In der 6 zeigt a das Ergebnis der SDS-PAGE bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase des vorliegenden Beispiels, und b zeigt das Ergebnis des Wester Blottings, durchgeführt durch Transferieren des obigen SDS-PAGE-Musters auf eine PVDF-Membran.
  • In a und b in der 6 zeigt die Spur 1 den Molekulargewichtsmarker (kDa), zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II und zeigt die Spur 4 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Wie es von der 6 ersichtlich ist, wurde eine Antikörperreaktion bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III deutlich nachgewiesen.
  • Bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ I und Typ II wurde eine Antikörperreaktion ebenfalls nachgewiesen, obgleich ihre Reaktivität gering war.
  • (3) SDS-PAGE
  • Bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ III, Typ II und Typ I wurde eine SDS-PAGE mit einem vollständig automatischen Elektrophoresesystem, genannt Phast-System (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) unter Verwendung eines Gels (Handelsname: Phast Gel (Gradient 8-25), Hersteller: Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
  • In der 7 zeigt a das Ergebnis der bereits früher berichteten Erythrose-Reduktase (natürlicher Typ: K. Tokuoka et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 38, 145–155), und b zeigt die Ergebnisse bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen der vorliegenden Erfindung.
  • In 7, ER 1, 2 und 3 in 7a werden die Ergebnisse bezüglich der Erythrose-Reduktase vom Typ I, II bzw. III vom natürlichen Typ gezeigt, und in b zeigt die Spur 1 den Molekulargewichtsmarker (kDa), zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II und zeigt die Spur 4 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Wie aus der 7b ersichtlich ist, wurde für alle der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ I, Typ II und Typ III eine Bande bei dem Abschnitt von etwa 37 kDa (37000 Da) bestätigt, was man aus jeder Aminosäuresequenz vorhersah. Dies war das gleiche Ergebnis wie jenes bezüglich der Erythrose-Reduktase vom natürlichen Typ (7a).
  • (4) Native-PAGE
  • Bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ III, Typ II und Typ I wurde eine Native-PAGE mit einem vollständig automatisierten Elektrophorese-System, genannt Phast-System (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech), unter Verwendung eines Gels durchgeführt (Handelsname: Phast Gel (Gradient 8-25), Hersteller: Amersham Pharmacia Biotech). Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
  • In der 8 zeigt a das Ergebnis bezüglich der bereits früher berichteten Erythrose-Reduktase (natürlicher Typ: K. Tokuoka et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 38, 145–155), und b zeigt die Ergebnisse bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen der vorliegenden Erfindung.
  • In der 8 zeigen ER 1, 2 und 3 in der 8a die Ergebnisse bezüglich der Erythrose-Reduktase vom Typ I, II bzw. III vom natürlichen Typ, und in b zeigt die Spur 1 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II und zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Aus 8b, wenn man sich auf die Ergebnisse bezieht, war das Muster der relativen Mobilität jedes rekombinanten Enzyms fast das gleiche wie die Daten, die bezüglich Erythrose-Reduktase vom natürlichen Typ erhalten wurden (8a).
  • Nebenbei sei gesagt, dass bei den gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ I und Typ II zwei Banden festgestellt wurden. Man nimmt an, dass die nicht hauptsächliche Bande einem Enzym entspricht, in welchem der Histidin-Tag nicht vollständig bei der Reinigung abgespalten worden war.
  • (5) IEF-PAGE (isoelektrische Fokussierung)
  • Bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen wurde eine IEF-PAGE mit einem vollständig automatisierten Elektrophorese-System, genannt Phast-System (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech), unter Verwendung eines Gels (Handelsname: Phast Gel (IEF pH 4–6,5), Hersteller: Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt.
  • Die Elektrophorese wurde unter Verwendung eines pH-Gradientengels durchgeführt, und die getrennten Proteine wurden gefärbt.
  • Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
  • In der 9 zeigt die Spur 1 das Markerprotein des isoelektrischen Punktes, zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ I, zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ II und zeigt die Spur 4 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III.
  • Aus der 9 konnte der isoelektrische Punkt jedes Enzyms aus der Mobilität einer Bande bestätigt werden. Das heißt, die gereinigte rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ I besaß einen pI von 4,7, die gereinigte rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ II besaß einen pI von 5,3, und die gereinigte rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III besaß einen pI von 5,8.
  • Nebenbei sei gesagt, dass die gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktasen vom Typ I und Typ II zwei Banden aufwiesen. Man nimmt an, dass die nicht hauptsächliche Bande einem Enzym entspricht, bei dem der Histidin-Tag nicht vollständig bei der Reinigung abgespalten worden war.
  • Aus den obigen Ergebnissen nimmt man an, dass die rekombinante Erythrose-Reduktase, die in dem vorliegenden Beispiel erhalten worden war, in fast dem gleichen Zustand exprimiert worden war, wie Erythrose-Reduktase vom natürlichen Typ.
  • Beispiel 5
  • Es wurde eine Expression der rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III unter Verwendung der Hefe S. cerevisiae versucht.
  • (1) Transformation
  • Die Erythrose-Reduktase Typ III-cDNA wurde an einen Plasmidvektor für S. cerevisiae, pYES2/NT (hergestellt von INVITROGEN), ligiert, wobei die cDNA erhalten wurde durch Spaltung mit BamH I und Xho I eines Proteinexpressionsvektors pRSET A für E. coli, verwendet zur Expression des Erythrose-Reduktase-Typ III-Gens in Beispiel 1 (8).
  • Der Plasmidvektor, an den die Erythrose-Reduktase vom Typ III ligiert worden war, wurde in E. coli DH5α transformiert, um eine Transformante mit erlangter Ampicillin-Resistenz zu erhalten.
  • Die transformierten E. coli-Zellen wurden bei 37°C unter Verwendung eines LB-Kulturmediums, enthaltend Ampicillin in einer Konzentration von 50 μg/ml, kultiviert, um den Plasmidvektor, an den die Erythrose-Reduktase-Typ III-cDNA ligiert worden war, zusammen mit E. coli zu amplifizieren. Der Plasmidvektor wurde aus diesem E. coli herausgenommen, und eine Reinigung wurde durchgeführt.
  • Durch das Lithiumacetat-Verfahren wurde ein Vektor, an den die Erythrose-Reduktase-cDNA vom Typ III ligiert worden war, in einen Uracil erfordernden S. cerevisiae INVSc1-Stamm (hergestellt von INVITROGEN) transformiert.
  • Da der Stamm, der das Erythrose-Reduktase-Gen vom Typ III erlangte, ein Synthesevermögen für Uracil bekommt, wurde der Stamm, welcher das Erythrose-Reduktase-Gen vom Typ III erlangte, durch Sammeln des Stammes gewählt, welcher auf einem minimalen Uracil-Mangel-Medium, beschrieben im Versuchsmanual für einen Plasmidvektor pYES2/NT, wachsen kann.
  • (2) Proteinexpression
  • Anschließend wurde eine Proteinexpression gemäß der Beschreibung des Versuchsmanuals für einen Plasmidvektor pYES2/NT, produziert von INVITROGEN, durchgeführt.
  • Es wurde eine Schüttelkultur des Stammes, der das früher erhaltene Erythrose-Reduktase-Gen vom Typ III erlangt hatte, 24 Stunden lang unter Verwendung von 15 ml eines Uracil-defizienten Minimal-Mediums, enthaltend 2% Glucose, unter den Bedingungen von 30°C und 220 Upm durchgeführt.
  • Nach der Kultivierung wurden die Stammzellen mittels Zentrifugation (1500 g, 5 Minuten, 4°C) gesammelt, und diese Zellen wurden erneut in 50 ml eines Uracil-defizienten Minimal-Mediums, enthaltend 2% Galactose und 1% Raffinose, suspendiert, und dann wurde eine Schüttelkultur unter den Bedingungen von 30°C und 220 Upm 48 Stunden lang durchgeführt. Dieses Kulturmedium wurde zentrifugiert (1500 g, 5 Minuten, 4°C), um die Zellen zu sammeln.
  • Zu etwa 2 g dieser Zellen wurden 2 g Glaskügelchen mit 0,5 mm Durchmesser hinzugefügt, und ein Schütteln wurde unter der Bedingung von 15 Sekunden × 10-fach mit einem Schüttel-Zellaufbrecher (B. Braun Meslungen AG), um die Zellen aufzubrechen, durchgeführt. Die Zellaufbruchlösung wurde einer Zentrifugation unter den Bedingungen von 12000 g, 15 Minuten und 4°C unterzogen, um einen Überstand als rohe Enzymlösung zu erhalten.
  • Die rohe Enzymlösung wurde mit Nickel-chelatisierter Agarose gemäß dem in Beispiel 1 (8) beschriebenen Verfahren behandelt, um rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III vom Inneren der Zelle zu reinigen.
  • (3) SDS-PAGE
  • Bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III, exprimiert in S. cerevisiae und erhalten in (2), wurde eine SDS-PAGE unter Verwendung eines Gels durchgeführt (PAGEL SPG 520L, hergestellt von ATTO CORPORATION).
  • Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. In der Figur zeigt die Spur 1 den Molekulargewichtsmarker (kDa), zeigt die Spur 2 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III, exprimiert in S. cerevisiae, und zeigt die Spur 3 das Ergebnis bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III, exprimiert in E. coli.
  • Wie aus der Spur 2 in 10 ersichtlich ist, wurde herausgefunden, dass die gereinigte rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III, exprimiert in S. cerevisiae, mit dem gleichen Molekulargewicht wie jenes der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase-Typ III, die in E. coli exprimiert worden war, und wie der Erythrose-Reduktase vom Typ III vom natürlichen Typ exprimiert werden konnte.
  • (5) Messung der Enzymaktivität
  • Bezüglich der gereinigten rekombinanten Erythrose-Reduktase vom Typ III, exprimiert in S. cerevisiae, und erhalten in (2), wurde deren Enzymaktivität bezüglich Erythrose als ein Substrat unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 (1) gemessen.
  • Als ein Ergebnis lag die spezifische Aktivität des Enzyms bei 19,3 Einheiten/mg, und somit wurde die Aktivität bestätigt.
  • Aus diesem Ergebnis wurde gefunden, dass die rekombinante Erythrose-Reduktase vom Typ III in S. cerevisiae in einem aktiven Zustand exprimiert werden konnte.
  • Sequenzauflistung
    Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001

Claims (26)

  1. Isoliertes Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung.
  2. Isolierte DNA, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung codiert.
  3. DNA wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei die DNA eine umfasst, die unten in (a) oder (b) gezeigt ist: (a) eine DNA, die eine Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide der Nummern 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, enthält, (b) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nummern 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer Sonde, die aus den Nukleotiden Nummern 1 bis 399 hergestellt ist, unter stringenter Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  4. DNA wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  5. DNA wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei die DNA eine DNA umfasst, die unten in (a) oder (b) gezeigt ist: (a) eine DNA, die eine Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide der Nummern 408 bis 1119 von der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, enthält, (b) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nummern 408 bis 1119 von der in der SEQ. ID Nr. 1 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer Sonde, die aus den Nukleotiden Nummern 408 bis 1119 hergestellt ist, unter stringenter Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  6. DNA wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60% durchgeführt wird.
  7. Zelle, zu der eine DNA wie in mindestens einem der Ansprüche 2 bis 6 in einer Weise transferiert wurde, so dass die DNA in der Lage ist, eine Erythrose-Reduktase vom Typ III, welche die DNA codiert, zu exprimieren.
  8. Verfahren zur Herstellung der Erythrose-Reduktase vom Typ III, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Zelle wie in Anspruch 7 beansprucht in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von Erythrose-Reduktase vom Typ III in einer Kulturflüssigkeit und Ernten der Erythrose-Reduktase vom Typ III aus der Kulturflüssigkeit.
  9. Isoliertes Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung.
  10. Isolierte DNA, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung codiert.
  11. DNA wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die DNA eine umfasst, die unten in (a) oder (b) gezeigt ist: (a) eine DNA, die eine Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide der Nummern 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, enthält, (b) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nummern 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer Sonde, die aus den Nukleotiden Nummern 1 bis 399 hergestellt ist, unter stringenter Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  12. DNA wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  13. DNA wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die DNA eine umfasst, die unten in (a) oder (b) gezeigt ist: (a) eine DNA, die eine Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide der Nummern 408 bis 1077 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, enthält, (b) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nummern 408 bis 1077 von der in der SEQ. ID Nr. 2 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer Sonde, die aus den Nukleotiden Nummern 408 bis 1077 hergestellt ist, unter stringenter Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  14. DNA wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
  15. Zelle, zu der eine DNA wie in mindestens einem der Ansprüche 10 bis 14 beansprucht, in einer Weise transferiert wurde, so dass die DNA zur Exprimierung einer Erythrose-Reduktase vom Typ II, welche die DNA codiert, in der Lage ist.
  16. Verfahren zur Herstellung von Erythrose-Reduktase vom Typ II, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Zelle wie in Anspruch 15 beansprucht in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von Erythrose-Reduktase vom Typ II in einer Kulturflüssigkeit und Ernten der Erythrose-Reduktase vom Typ II aus der Kulturflüssigkeit.
  17. Isoliertes Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung.
  18. Isolierte DNA, die für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung codiert.
  19. DNA wie in Anspruch 18 beansprucht, wobei die DNA eine umfasst, die unten in (a) oder (b) gezeigt ist: (a) eine DNA, die eine Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide der Nummern 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, enthält, (b) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nummern 1 bis 399 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer Sonde, die aus den Nukleotiden Nummern 1 bis 399 hergestellt ist, unter stringenter Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  20. DNA wie in Anspruch 19 beansprucht, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60% durchgeführt wird.
  21. DNA wie in Anspruch 18 beansprucht, wobei die DNA eine umfasst, die unten in (a) oder (b) gezeigt ist: (a) eine DNA, die eine Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide der Nummern 408 bis 1121 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, enthält, (b) eine DNA, die mit einer Basensequenz, umfassend mindestens die Nukleotide Nummern 408 bis 1121 von der in der SEQ. ID Nr. 3 in der Sequenzauflistung beschriebenen Nukleotidsequenz, oder einer Sonde, die aus den Nukleotiden Nummern 408 bis 1121 hergestellt ist, unter stringenter Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit Erythrose-Reduktase-Aktivität codiert.
  22. DNA wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, unter der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 2 × SSC mit 0,1% SDS entspricht, bei 60% durchgeführt wird.
  23. Zelle, zu der eine DNA wie in mindestens der Ansprüche 18 bis 22 beansprucht, in einer Weise transferiert wurde, so dass die DNA zur Exprimierung einer Erythrose-Reduktase vom Typ I, welche die DNA codiert, in der Lage ist.
  24. Verfahren zur Herstellung der Erythrose-Reduktase vom Typ I, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Zelle wie in Anspruch 23 beansprucht in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von Erythrose-Reduktase vom Typ I in einer Kulturflüssigkeit und Ernten der Erythrose-Reduktase vom Typ I aus der Kulturflüssigkeit,
  25. Verfahren zur Herstellung von Erythritol, umfassend die Schritte des Einwirkenlassens des Proteins mit einer Erythrose-Reduktase-Aktivität, wie in mindestens einem der Ansprüche 1, 9 oder 17 beansprucht, auf D-Erythrose und Ernten eines produzierten Erythritols.
  26. Verfahren zur Herstellung von Erythritol, umfassend die Schritte des Einwirkenlassens der Zelle, wie in mindestens einem der Ansprüche 7, 15 oder 23 beansprucht, auf D-Erythrose und Ernten eines erzeugten Erythritols.
DE60200426T 2001-01-09 2002-01-04 Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol Expired - Fee Related DE60200426T2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001001294 2001-01-09
JP2001001294 2001-01-09
JP2001384357A JP4004789B2 (ja) 2001-01-09 2001-12-18 エリスロース還元酵素、その遺伝子、並びに該遺伝子を導入した細胞
JP2001384357 2001-12-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60200426D1 DE60200426D1 (de) 2004-06-09
DE60200426T2 true DE60200426T2 (de) 2005-05-19

Family

ID=26607393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60200426T Expired - Fee Related DE60200426T2 (de) 2001-01-09 2002-01-04 Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1221478B1 (de)
JP (1) JP4004789B2 (de)
DE (1) DE60200426T2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060166315A1 (en) * 2002-12-26 2006-07-27 Masatoshi Murai Process for producing pnpase
EP2436772A1 (de) * 2010-09-30 2012-04-04 Annikki GmbH Verfahren zur Herstellung von Erythritol

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4939091A (en) * 1986-09-09 1990-07-03 Director Of National Food Research Institute, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries Novel auerobasidium sp. microorganisms, method for obtaining the same and method for preparing erythritol with the same

Also Published As

Publication number Publication date
EP1221478A3 (de) 2002-07-24
DE60200426D1 (de) 2004-06-09
EP1221478B1 (de) 2004-05-06
JP4004789B2 (ja) 2007-11-07
JP2002281986A (ja) 2002-10-02
EP1221478A2 (de) 2002-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69730514T2 (de) Amidase
DE69533634T2 (de) Geranylgeranyldiphosphate-Synthase und diese kodierende DNA
DE19610984A1 (de) Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen
DE69720335T2 (de) Recombinante Fructosyl-Aminosäure-Oxidase
DE69839381T2 (de) D-Sorbitoldehydrogenase Gen
EP0740706B1 (de) Herstellung von akariogenen zuckerersatzstoffen
WO2001044480A2 (de) Enzyme und gene für die herstellung von vanillin
DE19649655A1 (de) Syntheseenzyme für die Herstellung von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und Vanillinsäure und deren Verwendung
DE3942129C2 (de) Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Gen
DE3931716C2 (de) Rekombinante DNA, eine sie enthaltende Transformante und ein Verfahren zur Herstellung von wärmestabiler Glucosedehydrogenase und ihre Verwendung
DE60035801T2 (de) Bakterielle stämme von genus klebsiella und deren gen kodierend für isomaltulose synthase
DE60316424T2 (de) Beta-untereinheit von glucosedehydrogenase und diese kodierende dna
DE60200426T2 (de) Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol
EP0464832B1 (de) Klonierung der N-Methylhydantoinase
DE69935828T2 (de) Alkalische Ceramidase (E.C. 3.5.1.23) kodierendes Gen aus Pseudomonas aeruginosa
DE60105185T2 (de) 2,5-diketo-d-gluconsäure-reduktasen und deren anwendungen
DE60034318T2 (de) A-agarase und verfahren zur herstellung derselben
DE3750240T2 (de) Gen, das ein Insektizid-Protein kodiert, und Herstellung des Proteins durch Verwendung dieses Gens.
DE69920470T2 (de) Neuartiges gen und transformant, welcher dieses beinhaltet
DE60032630T2 (de) Gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reduktasegene aus arabidopsis
DE69923127T2 (de) Methanoldehydrogenase-Aktivator und dafür kodierendes Gen
DE102013104418B4 (de) Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol
EP1282715B1 (de) Verfahren zur mikrobiellen herstellung von difructoseanhydrid-iii, dafür einsetzbarer mikroorganismus sowie enzym mit inulase-ii-aktivität und dafür kodierende dna-sequenzen
EP0957171A2 (de) Rekombinante mikrobielle 3-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung
DE69015843T2 (de) Cytochrom-C-Gen aus einer Wasserstoffbakterie.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee