JP2002281986A

JP2002281986A - エリスロース還元酵素、その遺伝子、並びに該遺伝子を導入した細胞

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Publication number: JP2002281986A
Application number: JP2001384357A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Okura; 哲也大倉; Takafumi Harumi; 隆文春見; Eiji Asaba; 栄二浅羽
Original assignee: National Food Research Institute; Nikken Chemicals Co Ltd
Current assignee: National Food Research Institute; Nikken Chemicals Co Ltd
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: JP4004789B2; DE60200426T2; EP1221478B1; EP1221478A2; EP1221478A3; DE60200426D1

Abstract

(57)【要約】【課題】エリスリトールの効率的な製造方法、並びに
その生産菌を確立するために、エリスロース還元酵素II
I型、II型及びＩ型のポリペプチド、及び該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子の構造を解明し、これらの利用方
法を提供すること。【解決手段】エリスロース還元酵素活性を有するタン
パク質；該タンパク質をコードするＤＮＡ；該ＤＮＡが
コードするエリスロース還元酵素III型、II型又はＩ型
が発現可能な形態で導入された細胞並びに該エリスロー
ス還元酵素III型、II型又はＩ型、若しくは、該エリス
ロース還元酵素III型、II型又はＩ型が発現可能な形態
で導入された細胞をＤ−エリスロースに作用させ、生成
するエリスリトールを採取するエリスリトールの製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なエリスロー
ス還元酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコ
ードするＤＮＡ、エリスロース還元酵素活性を有するタ
ンパク質の製造法、及びエリスリトールの製造法に関す
る。エリスロース還元酵素は、エリスロースを還元して
エリスリトールを生成する反応を触媒する酵素である。
この酵素には、Native-PAGE上の移動度と等電点の相違
から、Ｉ型、II型、III型の３種類のアイソザイムが存
在する。

【０００２】

【従来の技術】エリスリトールは、低カロリーなのに甘
味度が高く、しかも非う蝕性を有することから、食品、
飲料の甘味料として多用されている。エリスリトールの
工業的規模の製造方法として、グルコース等の基質か
ら、トリコスポロノイデス（Trichosporonoides）属、
モニリエラ（Moniliella）属の微生物等のエリスリトー
ル生産菌をグルコース等の基質に作用させる方法が実用
化されている（特公平６−３０５９１号公報、同６−３
０５９２号公報、同４−１１１８９号公報、同４−６３
５号公報、特開平１０−９６号公報、同９−１５４５８
９号公報）。

【０００３】これらのエリスリトール生産菌のうち、ト
リコスポロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporon
oides megachiliensis）ＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４３０）によるエリスリトール生産には、エリ
スロース還元酵素Ｉ、II及びIII 型が関与していること
が報告されている（K. Tokuoka, et al., J. Gen. App
l. Microbiol., 38, 145-155 (1992)）。

【０００４】トリコスポロノイデス・メガチリエンシス
ＳＮ−Ｇ４２株によるグルコースからエリスリトール
までの代謝経路は図１に示す通りである。図示したよう
に、グルコースは、解糖（Glycolysis）によりグルコー
ス−６−リン酸（Glc-6-P）や、グリセルアルデヒド３
−リン酸まで分解された後、ペントースリン酸回路（Pe
ntose Phosphate Shunt）に入り、エリスロース−４−
リン酸（Erythrose-4-P）となる。

【０００５】このエリスロース−４−リン酸が脱リン酸
化されてＤ−エリスロース（D-Erythrose）が生じ、こ
のエリスロースが還元剤ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ
（以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈという。）による還元を受け
て、メソ−エリスリトール（meso-Erythritol）が生ず
る。エリスロース還元酵素Ｉ，IIおよびIII型はいずれ
も、かかる一連の反応のうち後者の還元反応（エリスロ
ースが、還元剤ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより、メソ−エリスリ
トールに還元される反応）を触媒する。

【０００６】しかし、エリスロース還元酵素Ｉ型、II型
及びIII型に関する報告は、酵素学的性質に限られてお
り、本酵素の遺伝的情報については従来解明されていな
かった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エリ
スリトールの効率的な製造方法、並びにその生産菌を確
立するために、エリスロース還元酵素活性を有するタン
パク質、及び該タンパク質をコードするＤＮＡの構造を
解明し、これらの利用方法を提供することにある。

【０００８】エリスロース還元酵素活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡを解読することができれば、酵
母等の細胞に組込む等の手段により大量の該酵素活性を
有するタンパク質が発現し、エリスリトールの大量生産
につながる可能性は勿論のこと、遺伝子工学的手法を用
いて高いエリスリトール生産性を有する変異体酵素の開
発、関連酵素をコードする遺伝子のクローニング等、様
々な用途において有用であるものと考えられる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために研究を重ねた結果、トリコスポロノイ
デス属の微生物が生産するエリスロース還元酵素活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を見出
すに至った。

【００１０】すなわち、本発明者らはまず、微生物から
酵素を取得・精製して、ペプチドマッピングによりトリ
コスポロノイデス属の微生物が生産する第１のエリスロ
ース還元酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を
部分的に解読し、これを基にしてプローブを作製した。
このプローブでエリスリトール生産菌のノーザンハイブ
リダイゼーションを行うことにより、エリスロース還元
酵素III型の発現量が多い時期を特定した。該酵素の発
現量が多い時期のｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。

【００１１】次いで、ｃＤＮＡライブラリーを前記プロ
ーブでスクリーニングし、第１のエリスロース還元酵素
活性を有するタンパク質のＤＮＡの塩基配列を解読し
た。

【００１２】また、本発明者らは、上記で得られた第１
のエリスロース還元酵素のｃＤＮＡ全長を基にしてプロ
ーブを作製し、前記ｃＤＮＡライブラリーを用い、前記
請求項３（ｂ）と請求項４、又は、請求項５（ｄ）と請
求項６に記載した条件でハイブリダイゼーションを行い
スクリーニングした結果、第２および第３のエリスロー
ス還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡの塩基配列
を解読した。

【００１３】さらに、これらスクリーニングしたｃＤＮ
Ａを用い、大腸菌発現ベクターに組込み、大腸菌菌体内
でヒスチジンタグ融合タンパク質として、エリスロース
還元酵素活性を有するタンパク質を発現させた。こうし
て得られた組換えタンパク質の活性、基質特異性等につ
いて調べた結果、天然型エリスロース還元酵素と同様の
基質特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活
性を有していることを確認した。また、栄養要求性の酵
母へプラスミドを導入しても、正確な発現が誘導される
ことを確認した。本発明はこのような知見に基づいて完
成されたものである。

【００１４】すなわち、請求項１記載の本発明は、下記
（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である。（Ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。請求項２記載の本発明は、前記（Ａ）又は（Ｂ）に示す
タンパク質をコードするＤＮＡである。請求項３記載の
本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請
求項２記載のＤＮＡである。（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮ
Ａ。（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列又は同塩基
配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００１５】請求項４記載の本発明は、ストリンジェン
トな条件が、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当す
る塩濃度で６０℃で洗浄が行なわれる条件である請求項
３記載のＤＮＡである。請求項５記載の本発明は、下記
（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項２記載のＤ
ＮＡである。（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｄ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列又は
同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。請求項６記載の本発明は、ストリンジェントな条件が、
０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６
０℃で洗浄が行なわれる条件である請求項５記載のＤＮ
Ａである。

【００１６】請求項７記載の本発明は、請求項２〜６の
いずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリ
スロース還元酵素III型が発現可能な形態で導入された
細胞である。請求項８記載の本発明は、請求項７記載の
細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素III型を培
養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロース還元
酵素III型を採取することを特徴とするエリスロース還
元酵素III型の製造法である。

【００１７】請求項９記載の本発明は、下記（Ｃ）又は
（Ｄ）に示すタンパク質である。（Ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。請求項１０記載の本発明は、前記（Ｃ）又は（Ｄ）に示
すタンパク質をコードするＤＮＡである。請求項１１記
載の本発明は、下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡであ
る請求項１０記載のＤＮＡである。（ｅ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮ
Ａ。（ｆ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列又は同塩基
配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００１８】請求項１２記載の本発明は、ストリンジェ
ントな条件が、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当
する塩濃度で６０℃で洗浄が行なわれる条件である請求
項１１記載のＤＮＡである。請求項１３記載の本発明
は、下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである請求項１
０記載のＤＮＡである。（ｇ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｈ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列又は
同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。請求項１４記載の本発明は、ストリンジェントな条件
が、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度
で６０℃で洗浄が行なわれる条件である請求項１３記載
のＤＮＡである。

【００１９】請求項１５記載の本発明は、請求項１０〜
１４のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードす
るエリスロース還元酵素II型が発現可能な形態で導入さ
れた細胞である。請求項１６記載の本発明は、請求項１
５記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素II
型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロー
ス還元酵素II型を採取することを特徴とするエリスロー
ス還元酵素II型の製造法である。

【００２０】請求項１７記載の本発明は、下記（Ｅ）又
は（Ｆ）に示すタンパク質である。（Ｅ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｆ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。請求項１８記載の本発明は、前記（Ｅ）又は（Ｆ）に示
すタンパク質をコードするＤＮＡである。請求項１９記
載の本発明は、下記（ｉ）又は（ｊ）に示すＤＮＡであ
る請求項１８記載のＤＮＡである。（ｉ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮ
Ａ。（ｊ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列又は同塩基
配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００２１】請求項２０記載の本発明は、ストリンジェ
ントな条件が、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当
する塩濃度で６０℃で洗浄が行なわれる条件である請求
項１９記載のＤＮＡである。請求項２１記載の本発明
は、下記（ｋ）又は（ｌ）に示すＤＮＡである請求項１
８記載のＤＮＡである。（ｋ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｌ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列又は
同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。請求項２２記載の本発明は、ストリンジェントな条件
が、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度
で６０℃で洗浄が行なわれる条件である請求項２１記載
のＤＮＡである。

【００２２】請求項２３記載の本発明は、請求項１８〜
２２のいずれかに記載のＤＮＡが、該ＤＮＡがコードす
るエリスロース還元酵素Ｉ型が発現可能な形態で導入さ
れた細胞である。請求項２４記載の本発明は、請求項２
３記載の細胞を培地で培養し、エリスロース還元酵素Ｉ
型を培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりエリスロー
ス還元酵素Ｉ型を採取することを特徴とするエリスロー
ス還元酵素Ｉ型の製造法である。

【００２３】請求項２５記載の本発明は、請求項１、９
及び１７のいずれかに記載のエリスロース還元酵素活性
を有するタンパク質をＤ−エリスロースに作用させ、生
成するエリスリトールを採取することを特徴とするエリ
スリトールの製造法である。請求項２６記載の本発明
は、請求項７、１５及び２３のいずれかに記載の細胞を
Ｄ−エリスロースに作用させ、生成するエリスリトール
を採取することを特徴とするエリスリトールの製造法で
ある。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質
は、エリスリトール生産菌であるトリコスポロノイデス
属に属する酵母に存在し、トリコスポロノイデス・メガ
チリエンシスは、その代表的な酵母である。

【００２５】まず、本発明の第１のエリスロース還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの取得に
ついて説明する。本発明の第１のエリスロース還元酵素
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば
本発明者らが確立したように、エリスリトール生産菌か
ら取得した酵素活性を有するタンパク質を精製して部分
的に解読したアミノ酸配列を基にしてプローブを作製し
た後、このプローブを用いて、前記菌のｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングを行うことにより、取得するこ
とができる。

【００２６】本発明者らは、まずスクリーニングのため
のプローブを得るべく、エリスリトール生産菌から常法
によりエリスロース還元酵素III型を取得し、精製した
後、該タンパク質のアミノ酸配列を部分的に解読した。
トリコスポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４
２株からエリスロース還元酵素III 型を取得し、精製す
るには、H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Bioc
hem., 56 (6), 941-945, 1992に記載の方法に従って行
えばよい。なお、この方法に限らず、遠心分離、透析、
種々のクロマトグラフィーを組み合わせた通常のタンパ
ク質の取得、精製方法によることができる。

【００２７】精製したエリスロース還元酵素III型のア
ミノ酸配列を部分的に解読するには、目的のタンパク質
を短いペプチドに酵素分解し、常法によりペプチドマッ
ピングを行い、単離されたアミノ酸配列を決定すること
により行うことができる。アミノ酸配列の決定は、エド
マン分解により行うことができ、自動アミノ酸シークエ
ンサーを用いると簡便に行うことができる。

【００２８】次に、本発明者らは部分的に解読したアミ
ノ酸配列から設計したプライマーを用いて、エリスリト
ール生産菌のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、
プローブを作成した。

【００２９】部分的に解読したアミノ酸配列からのプラ
イマーの設計は、常法によって行うことができる。例え
ば、アルド−ケト還元酵素ファミリーのアミノ酸配列を
参考にして、部分的に解読したアミノ酸配列の中からの
一部分（配列表の配列番号６および７参照）を選択し、
それぞれの配列からセンスプライマー及びアンチセンス
プライマー（配列表の配列番号４および５参照）を設計
することができる。

【００３０】エリスリトール生産菌のｃＤＮＡは、エリ
スリトール生産菌の培養物からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮ
Ａを調製して、このｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応に
より得ることができる。ＲＮＡの抽出にはTRIZOL（Gibc
o BRL社製）等を用いることが簡便である。また、ｍＲ
ＮＡの調製には、DYNABEADS mRNA Purification Kit（D
YNAL 社製）を用いると、簡便に行うことができる。

【００３１】こうして得られた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型と
して、予め設計しておいたセンスプライマー（配列表の
配列番号４参照）及びアンチセンスプライマー（配列表
の配列番号５参照）を用いて、ＰＣＲ反応により増幅さ
せる。このようにして、本発明者らは、ＰＣＲ増幅産物
として、長さ３９８ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを得る
ことができた。

【００３２】このＰＣＲ増幅産物をベクターにライゲー
ションし、形質転換した後、先に決定したエリスロース
還元酵素III型の部分アミノ酸配列を含んでいるか否か
を解析した。その結果、エリスロース還元酵素III型を
コードするＤＮＡの一部であることが確認されたので、
このｃＤＮＡフラグメントを、後述のプラークハイブリ
ダイゼーションにおいて、プローブとして用いることと
した。なお、このフラグメントは、配列表の配列番号１
記載の塩基配列のＮ末端から１８４〜５８２番目に相当
する。

【００３３】続いて、本発明者らはエリスリトール生産
菌のｃＤＮＡライブラリーを作製するに当たり、エリス
ロース還元酵素III型の発現量が多い時期について予め
検討することとした。

【００３４】エリスリトール還元酵素III型の発現量を
調べる方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション
等の方法がある。例えば、培養時間を変えて培養したト
リコスポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２
株からtotal ＲＮＡを抽出し、先に設計したプローブを
用いたノーザンハイブリダイゼーションを行う。その結
果、４８時間培養物（図２のレーン３）が、エリスロー
ス還元酵素III型の発現量が最も多いことが明らかとな
った。

【００３５】そこで、本発明者らは、エリスロース還元
酵素III型の発現量が最も多い時期のエリスリトール生
産菌のｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製するためには、エリスリトール生産菌の
培養物からＲＮＡを抽出してｍＲＮＡを精製し、これに
相補的な２本鎖ｃＤＮＡを合成して、ファージベクター
にアダプターを介して組込めばよい。ＲＮＡの抽出は、
TRIZOL（Gibco BRL 社製）等を用いることが簡便であ
る。また、ｍＲＮＡの調製には、DYNABEADS mRNA Purif
ication Kit（DYNAL 社製）を用いると簡便に行うこと
ができる。

【００３６】ｃＤＮＡライブラリーの作製は、岡山−Bu
rg法、グブラー−ホフマン（Gubler-Hoffman）法を採用
できるが、簡略な点から後者の方法が好ましい。実際に
は、ZAP Express cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社
製）を用い、キットの説明書に従いライブラリーを作成
する方法が簡便で好ましい。本キットで用いるZAP Expr
ess Vectorは、ｃＤＮＡライブラリー中では直鎖上のフ
ァージＤＮＡであるが、in vivo excisionによりカナマ
イシン耐性遺伝子を含んだ環状のプラスミド（ファージ
ミド）として取り出すことが可能である。

【００３７】本発明者らは、前記ｃＤＮＡライブラリー
について、先に得たプローブを用いてエリスロース還元
酵素III型をコードするＤＮＡをスクリーニングした。
スクリーニングは、ジゴキシゲニン標識したプローブに
よるプラークハイブリダイゼーションにより行うことが
できる。

【００３８】本発明者らは、スクリーニングの結果、プ
ローブに対し陽性を示したファージからプラスミドに変
換後、ＤＮＡシークエンスを解読した。例えばまず、ス
クリーニングにおいてプローブに対し陽性を示した数個
のプラークを単離し、ファージを増幅して、ファージＤ
ＮＡからIN VIVOにおいてインサートを含むファージミ
ド部分を切り出す。これを取り扱いを容易にすべくプラ
スミドの形に変換し、大腸菌に感染させてプラスミドを
増幅した後、このプラスミドについて、ＤＮＡシークエ
ンスを行う。本発明者らはＤＮＡシークエンスにより、
配列表の配列番号１に示す全長１１１９ｂｐの塩基配列
を見出した。本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸
配列も、併せて配列表の配列番号１に示した。該アミノ
酸配列は、部分的に解読したアミノ酸配列を含んでお
り、この配列を有するタンパク質がエリスロース還元酵
素III型タンパク質であった。

【００３９】また、エリスロース還元酵素III型タンパ
ク質をコードするＤＮＡの塩基配列の制限酵素地図を図
３に示す。図３からわかるように、５’末端から１２２
番目の塩基部分にBan I切断部位、８４７番目及び１０
５７番目の塩基部分にEcoR I切断部位、１０９３番目に
BamH I切断部位を有する。

【００４０】このエリスロース還元酵素III型タンパク
質のアミノ酸配列（配列表の配列番号１参照）は、先に
判明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタン
パク質のアミノ酸配列と比較して、相同性の低い新規な
アミノ酸配列である。このことから、本発明に係るエリ
スロース還元酵素III型タンパク質は、新規なアミノ酸
配列を有することが明らかとなった。

【００４１】次に、本発明の第２のエリスロース還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡについて
説明する。本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を
有するタンパク質については、以下の方法で取得するこ
とができる。すなわち、前記菌のエリスロース還元酵素
III型ｃＤＮＡ全長を基にして作製したプローブを用い
て、エリスロース生産菌のｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングを、前記請求項３（ｂ）と請求項４、又は、
請求項５（ｄ）と請求項６に記載した条件で行うことに
よって、本発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを取得することがで
きる。

【００４２】本発明者らは、本発明の第２のエリスロー
ス還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡとして、配
列表の配列番号２に示す全長１０７７ｂｐの塩基配列を
見出した。本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸配
列も、併せて配列表の配列番号２に示した。該アミノ酸
配列は部分的に解読したアミノ酸配列と一致するので、
この配列を有するタンパク質が、エリスロース還元酵素
II型タンパク質である。

【００４３】エリスロース還元酵素II型タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列の制限酵素地図を図４に示
す。図４からわかるように、５’末端から６１番目及び
９４３番目の塩基部分にBan I切断部位、１４８番目及
び５２０番目の塩基部分にAcc I切断部位、２３８番目
及び５６３番目の塩基部分にHind III切断部位、５２０
番目の塩基部分にSal I切断部位、８４７番目の塩基部
分にEcoR I切断部位を有する。

【００４４】このエリスロース還元酵素II型タンパク質
のアミノ酸配列（配列表の配列番号２参照）は、先に判
明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタンパ
ク質のアミノ酸配列と比較して、相同性の低い新規なア
ミノ酸配列である。このことから、本発明に係るエリス
ロース還元酵素II型タンパク質は、新規なアミノ酸配列
を有することが明らかとなった。

【００４５】さらに、本発明の第３のエリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの取得
について説明する。本発明の第３のエリスロース還元酵
素活性を有するタンパク質についても、基本的には、本
発明の第２のエリスロース還元酵素活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡについての上記方法と同様の方
法で取得することができる。すなわち、前記菌のエリス
ロース還元酵素III型ｃＤＮＡ全長を基にして作製した
プローブを用いて、前記菌のｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングを、前記請求項３（ｂ）と請求項４、又
は、請求項５（ｄ）と請求項６に記載した条件で行うこ
とによって、本発明の第３のエリスロース還元酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡを取得すること
ができる。

【００４６】本発明者らは、本発明の第３のエリスロー
ス還元酵素活性を有するタンパク質のＤＮＡとして、配
列表の配列番号３に示す全長１１２１ｂｐの塩基配列を
見出した。本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸配
列も、併せて配列表の配列番号３に示した。該アミノ酸
配列は部分的に解読したアミノ酸配列と一致するので、
この配列を有するタンパク質が、エリスロース還元酵素
Ｉ型タンパク質である。

【００４７】エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質をコ
ードするＤＮＡの塩基配列の制限酵素地図を図５に示
す。図５からわかるように、５’末端から６１番目及び
９４３番目の塩基部分にBan I切断部位、２３８番目及
び５６３番目の塩基部分にHindIII切断部位、５２０番
目の塩基部分にAcc I切断部位及びSal I切断部位、８４
７番目の塩基部分にEcoR I切断部位を有する。

【００４８】このエリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質
のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）は、先に判
明しているヒトアルドース還元酵素及び酵母gcyタンパ
ク質のアミノ酸配列と比較して、相同性の低い新規なア
ミノ酸配列である。このことから、本発明に係るエリス
ロース還元酵素Ｉ型タンパク質は、新規なアミノ酸配列
を有することが明らかとなった。

【００４９】本発明のエリスロース還元酵素活性を有す
るタンパク質は、エリスロース還元酵素活性が損なわれ
ない限り、配列表の配列番号１、２、又は３記載のアミ
ノ酸配列に対して、１若しくは複数の位置での１もしく
は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
を含むアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【００５０】このような、配列表の配列番号１、２、又
は３記載のアミノ酸配列に対して、１若しくは複数の位
置での１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
は、例えば部位特異的突然変異法（Methods in Enzymol
ogy, 100, pp. 448 (1983)）や、突然変異処理のほか、
生物の種あるいは菌株による差等の天然に生じる変異に
よっても取得することができる。また、遺伝子組換えに
関する実験マニュアル（Nucleic Acid Res. 10, pp. 64
87 (1982), Methods in Enzymol. 00, pp. 448 (198
3)）、ＰＣＲ法（Molecular Cloning 2nd Edt., Cold S
pring Harbor Laboratory Press (1989); PCR A Practi
al Approach IRL Press pp.200 (1991)）によっても取
得することができる。上記のような置換等を含むアミノ
酸配列が、エリスロース還元酵素活性を有することは、
該配列を含む遺伝子を適当な細胞で発現させ、発現産物
のエリスロース還元酵素活性を調べて確認することがで
きる。エリスロース還元酵素活性は、該酵素がエリスロ
ースを還元する際に補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使う
ことから（図１参照）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の変化を比
較することにより測定できる。

【００５１】本発明の第１のエリスロース還元酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配
列番号１に記載する塩基配列のうち、Ｎ末端側のＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ結合部位が存在していると予想される部分であ
る、塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡ
であることは勿論のこと、同塩基配列から調製されるプ
ローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡであってもよい。また、このＤＮＡ
は、配列表の配列番号１に記載する塩基配列のうち、Ｃ
末端側のエリスロース結合部位が存在していると予想さ
れる部分である、塩基番号４０８−１１１９からなる塩
基配列を有するＤＮＡであることは勿論、同塩基配列か
ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。

【００５２】ここでいうストリンジェントな条件とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通
常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である
６０℃で、０．１％ＳＤＳを含み２×ＳＳＣに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００５３】このような条件でハイブリダイズするＤＮ
Ａの中には、途中にストップコドンが発生したものや、
活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、
それらについて市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿
主で発現させて、発現産物のエリスロース還元酵素活性
を後述の方法で測定することによって容易に取り除くこ
とができる。

【００５４】本発明の第２のエリスロース還元酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配
列番号２に記載する塩基配列のうち、Ｎ末端側のＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ結合部位が存在していると予想される部分であ
る、塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡ
であることは勿論のこと、同塩基配列から調製されるプ
ローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡであってもよい。また、このＤＮＡ
は、配列表の配列番号２に記載する塩基配列のうち、Ｃ
末端側のエリスロース結合部位が存在していると予想さ
れる部分である、塩基番号４０８−１０７７からなる塩
基配列を有するＤＮＡであることは勿論、同塩基配列か
ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。

【００５５】ここでいうストリンジェントな条件も、明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通
常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である
６０℃で、０．１％ＳＤＳを含み２×ＳＳＣに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００５６】本発明の第３のエリスロース還元酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配
列番号３に記載する塩基配列のうち、Ｎ末端側のＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ結合部位が存在していると予想される部分であ
る、塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮＡ
であることは勿論のこと、同塩基配列から調製されるプ
ローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡであってもよい。また、このＤＮＡ
は、配列表の配列番号３に記載する塩基配列のうち、Ｃ
末端側のエリスロース結合部位が存在していると予想さ
れる部分である、塩基番号４０８−１１２１からなる塩
基配列を有するＤＮＡであることは勿論、同塩基配列か
ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつエリスロース還元酵素活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。

【００５７】ここでいうストリンジェントな条件も、明
確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通
常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である
６０℃で、０．１％ＳＤＳを含み２×ＳＳＣに相当する
塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００５８】エリスロース還元酵素Ｉ型、II型及びIII
型タンパク質をコードするＤＮＡは、それぞれエリスロ
ース還元酵素Ｉ型、II型、III型が発現可能な形態で細
胞に導入することができる。細胞への導入は、エリスロ
ース還元酵素Ｉ型、II型又はIII型タンパク質をコード
するＤＮＡの全長を、両端に制限酵素末端を持つプライ
マーでＰＣＲにより増幅させ、この増幅産物を、制限酵
素末端を利用して各種プラスミドに組込んだ形で導入す
ることによって行うことができる。

【００５９】ここで、細胞としては、大腸菌、酵母など
発現用細胞として通常用いられるものを使用することが
できる。プラスミドとしては、大量生産後の発現が容易
なプラスミドを選択することが望ましく、大腸菌へ導入
する場合、ヒスチジンタグ融合タンパク質、ＧＳＴ（グ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）−融合タンパク
質、チオレドキシン融合タンパク質などを用いることが
できる。発現誘導に際しては、プロモーターを本発明の
各ＤＮＡの５’側より上流に、ターミネーターを３’側
より下流に、それぞれ組込めばよい。このプロモータ
ー、ターミネーターとしては、発現用細胞内で機能する
ことが知られているものを用いる必要があり、詳細につ
いては、微生物学基礎講座８遺伝子工学、共立出版、
Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423
-488 (1992)等に記載されている。例えば大腸菌へプラ
スミドを導入する場合、ラクトースオペロンとlac Iを
用いたＩＰＴＧによる調節システムを用いると、正確な
発現が誘導される点で好ましい。なお、大腸菌の代わり
に栄養要求性の酵母であるS.cerevisiaeへプラスミドを
導入しても、ガラクトースにより正確な発現が誘導され
る。

【００６０】このように、エリスロース還元酵素活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞
を培養し、発現誘導を行って、十分に発現が誘導された
段階で細胞を収穫して、組換えタンパク質を取り出し、
精製することにより、本発明のエリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質を製造することができる。一例を
挙げると、第１のエリスロース還元酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を遠心分
離により収穫し、超音波処理で細胞を破砕し、得られる
組換えタンパク質を、ヒスチジンタグ融合タンパク質の
アフィニティーゲルで精製し、エンテロキナーゼでヒス
チジンタグ部分を切り離して、組換えエリスロース還元
酵素III型を製造することができる。第２のエリスロー
ス還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
が導入された細胞や、第３のエリスロース還元酵素活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが導入された細
胞からも、同様にエリスロース還元酵素II型、Ｉ型を製
造することができる。

【００６１】本発明のエリスロース還元酵素活性を有す
るタンパク質の酵素活性は、該酵素がエリスロースを還
元する際に補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使うことから
（図１参照）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量の変化を比較すること
により測定できる。

【００６２】次に、本発明によるエリスリトールの製造
方法について述べる。すなわち、本発明のエリスロース
還元酵素活性を有するタンパク質をＤ−エリスロースに
作用させることにより、エリスリトールを得ることがで
きる。本発明のエリスロース還元酵素タンパク質をＤ−
エリスロースに作用させる際には、該酵素反応溶液が、
基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を、酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒
に溶解して還元反応を行うことができる。還元反応は、
反応温度３３〜３７℃、好ましくは３６〜３７℃、ｐＨ
６．０〜７．０、好ましくはｐＨ６．５、補酵素ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈが０．１〜０．５ｍＭ、好ましくは０．２〜
０．３ｍＭで行うことができる。また、基質は反応開始
時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の
基質濃度が高くなり過ぎないように連続的、もしくは非
連続的に添加することが望ましい。

【００６３】また、エリスロース還元酵素タンパク質を
コードするＤＮＡが導入された細胞をＤ−エリスロース
に作用させることによっても、エリスリトールが得られ
る。この場合、エリスロース還元酵素タンパク質を直接
作用させる場合と比べて、補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を添加する必要がない点で好ましい。一例を挙げると、
エリスロース還元酵素タンパク質をコードするＤＮＡが
導入された細胞を、グルコース、フルクトース、シュク
ロース等の糖類から選択された炭素源、酵母エキス、ペ
プトン等から選択された窒素源、リン酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩等から選択された無機塩を適宜含む
培地を用いて、当該細胞の生育し、エリスリトールを生
産するのに適した条件で培養することにより、エリスリ
トールを得ることができる。

【００６４】本発明に係る組換えエリスロース還元酵素
Ｉ〜III型は、従来報告されているエリスロース還元酵
素と同等の基質特異性を有し、また糖アルコールを生産
する酵素活性を有するものである。

【００６５】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらにより制限されるものではない。実施例１（１）トリコスポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ
−Ｇ４２株からのエリスロース還元酵素III型の取得・
精製 H. Ishizuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56
(6), 941-945, 1992に記載の方法に従い、トリコスポ
ロノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥ
ＲＭＢＰ−１４３０）からエリスロース還元酵素III
型の取得・精製を行った。まず、トリコスポロノイデス
・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２株（ＦＥＲＭＢＰ−
１４３０）をグルコース培地（４０％グルコース，２
％酵母エキス，２Ｌ）で７２時間培養した。

【００６６】培養物を１０，０００×ｇ、３０分間遠心
分離して得た固形物を凍結乾燥し、アセトン処理を行っ
た後、MSK Cell homogenizer（B. Braun Japan社製）を
用いてホモジナイズした。次に、破砕された固形物を１
０，０００×ｇ、３０分間の条件で遠心分離を行い、細
胞の除かれた画分を得た。続いて、硫安沈殿により、こ
の画分の分画を行った。すなわち、硫酸アンモニウム４
０〜７０％におけるエリスロース還元酵素を含む沈殿を
採取し、遠心分離を行って集め５０ｍＭグリシン−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。不溶の物質を
遠心分離で除去した後、前記の緩衝液中で酵素溶液を４
℃で２４時間透析した。

【００６７】透析して得られる上清を、予め５０ｍＭ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）により平衡化
しておいたDEAE-Toyopearl 650S（１．４×２０ｃｍ）
（東ソー社製）のカラムに負荷し、塩化ナトリウムを０
ｍＭから１００ｍＭまで直線的に上昇させ、エリスロー
ス還元酵素を含む画分を回収した。

【００６８】活性画分を集めて硫安沈殿により濃縮し、
予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡
化しておいたAF-Blue Toyopearl 650ML（１．４×２０
ｃｍ）（東ソー社製）のカラムに負荷し、０ｍＭから２
００ｍＭまで段階的に塩化ナトリウムの濃度を上昇さ
せ、エリスロース還元酵素Ｉ型およびII型を含む画分
（非吸着画分）ならびにIII型を含む画分（吸着画分）
を回収した。

【００６９】エリスロース還元酵素III型を含む画分を
集めて濃縮後、さらに、予め３５％飽和硫酸アンモニウ
ム−１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡
化しておいた、疎水性クロマトグラフィー用カラムであ
るButyl-Toyopearl 650S（１１×２０ｃｍ）（東ソー社
製）に負荷し、硫酸アンモニウムの濃度を３５％から２
０％まで直線的に下降する濃度勾配下において１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を通液し、エリスロース
還元酵素活性を有する画分を回収した。こうして、エリ
スロース還元酵素III型を精製した。

【００７０】（２）エリスロース還元酵素III型の部分
的アミノ酸配列の決定上記で精製したエリスロース還元酵素III型について、
ペプチドマッピングを行い、部分的なアミノ酸配列を決
定した。エリスロース還元酵素III型を、ピリジルエチ
ル化（H. Hirano: J. Protein.Chem 8. 115 (1989)）
し、リジルエンドペプチダーゼ（Roche社製）を用いて
消化した。このサンプルをODS-80Tm（東ソー社製）カラ
ムで分離すると、１４個のピークが見られ、このうち２
つのピークについて、プロテインシークエンサー477A
（Perkin-Elmer社製）によりアミノ酸配列を決定した。

【００７１】（３）ＰＣＲ反応で用いるプライマーの設
計部分的に解読したアミノ酸配列のうち、アルド−ケト還
元酵素ファミリーに含まれるアミノ酸配列を参考にして
選択したアミノ酸配列から（配列表の配列番号６，７参
照）、後述のＰＣＲ反応でセンスプライマー（配列表の
配列番号４参照）及びアンチセンスプライマー（配列表
の配列番号５参照）として用いた。

【００７２】（４）エリスロース還元酵素III型をコー
ドするcDNAフラグメントのＰＣＲ次に、後述のスクリーニング等で用いるプローブを作製
するため、ＰＣＲを行った。４０％グルコース培地で
３日間培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシ
スＳＮ−Ｇ４２株から以下の手順で１本鎖ｃＤＮＡを
合成し、これを鋳型として用いた。培養物からTRIZOL
（Gibco BRL 社製）を用いてＲＮＡを抽出し、DYNABEAD
S mRNA Purification Kit（DYNAL 社製）を用いてｍＲ
ＮＡを精製した。

【００７３】精製したｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応
を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素としてSuper
Script^TM Reverse Transcriptase（Gibco 社製）を用
い、プライマーとしてOligo (dT)_12-15 primer（Amersh
am Pharmacia Biotech社製）を用いた。逆転写反応液の
組成は、以下の通りである。ｍＲＮＡ１μｇｄＮＴＰ１０ｍＭ×３μＬプライマー０．５μｇ

【００７４】こうして得られるｃＤＮＡを鋳型として、
上記（３）で設計したＰＣＲ用のセンスプライマー（配
列表の配列番号４参照）及びアンチセンスプライマー
（配列表の配列番号５参照）により、Pfu DNAポリメラ
ーゼ（STRATAGENE社製）を用いて、９４℃ １分−４０
℃ １分−７２℃ １分を１サイクルとして２５サイク
ルのＰＣＲ反応を行った。

【００７５】ＰＣＲ反応の増幅産物は、長さ３９８ｂｐ
のｃＤＮＡフラグメントであった。このフラグメント
を、EcoR Vで消化したベクターpBS SK+にライゲーショ
ンし、さらにＤＨ５α株で形質転換した。先に決定した
エリスロース還元酵素III型タンパク質の内部のアミノ
酸配列を含んでいるかどうかを解析した。その結果、得
られたｃＤＮＡフラグメントは、エリスロース還元酵素
III型の部分的なｃＤＮＡであることが確認された。こ
のフラグメントは、配列表の配列番号１記載の塩基配列
のＮ末端から１８４〜５８２番目に相当する。このｃＤ
ＮＡフラグメントを、プローブとして用いることとし
た。

【００７６】（５）トリコスポロノイデス・メガチリエ
ンシスＳＮ−Ｇ４２株のノーザンハイブリダイゼーシ
ョントリコスポロノイデス・メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４
２株のｃＤＮＡライブラリーを作製するにあたり、培養
何時間目の本菌からｍＲＮＡを抽出すべきかを検討する
ため、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。

【００７７】トリコスポロノイデス・メガチリエンシス
ＳＮ−Ｇ４２株を、２４時間、４８時間、７２時間ま
たは９６時間の各時間、５００ｍＬ容フラスコ中で、４
０％グルコースを含む培地３０ｍＬを用いて、３７℃、
２２０ｒｐｍの条件で撹拌培養した。培養後、TRIZOL
（Gibco BRL社製）を用いて、各培養物からtotal RNAを
抽出した。先に解読した精製酵素から作製したプローブ
は、DIG RNA Labeling kit（Roche社製）を用いてジゴ
キシゲニンで標識して用いた。１．５％アガロースゲ
ル（０．２Ｍホルムアルデヒド含有）を用い、アガロ
ースゲル電気泳動を利用し、ストリンジェントな条件で
ノーザンハイブリダイゼーションを行った。

【００７８】ノーザンハイブリダイゼーションの結果を
図２に示す。図２中、レーン１は２４時間培養物の結
果、レーン２は４８時間培養物の結果、レーン３は７２
時間培養物の結果、レーン４は９６時間培養物の培地の
結果を示した。また、フラグメントの長さを比較するた
めに、左端にRNA Ladderの移動度を印した。

【００７９】図２より、約１．０ｋｂの部分に検出され
ているバンドの濃度は、４８時間培養物が最も濃いこと
から、エリスロース還元酵素III型が発現していること
がわかる。この結果から、トリコスポロノイデス・メガ
チリエンシスＳＮ−Ｇ４２株の４８時間培養物が、エ
リスロース還元酵素III型の発現量が最も多いことが明
らかとなり、この時期のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ
ライブラリーが、前記酵素の遺伝子解析に適しているこ
とが判明した。

【００８０】（６）トリコスポロノイデス・メガチリエ
ンシスＳＮ−Ｇ４２株のｃＤＮＡライブラリーの作成上記（５）の結果に従い、エリスロース還元酵素III型
の発現量が多い時期のｍＲＮＡから、以下の手順でｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。トリコスポロノイデス・
メガチリエンシスＳＮ−Ｇ４２株を、前記した４０％
グルコースを含む培地３０ｍＬ中、３７℃、２２０ｒ
ｐｍ、４８時間の条件で、５００ｍＬ容フラスコ中で培
養した。培養物からTRIZOL（Gibco BRL社製）を用いて
ＲＮＡを抽出し、DYNABEADS mRNA Purification Kit（D
YNAL 社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。

【００８１】このｍＲＮＡから、ZAP Express cDNA Syn
thesis Kit（STRATAGENE社製）を用いて、キットの説明
書に従いライブラリーを作製した。まず、ｍＲＮＡを鋳
型とした逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。この
とき、逆転写酵素としてMoloney murine leukemia viru
s reverse transcriptase（ＭＭＬＶ−ＲＴ、STRATAGEN
E社製）を用い、またプライマーとしてlinker primerを
用いた。これらは、上記キットに含まれる試薬である。

【００８２】逆転写反応液の組成は、以下の通りであ
る。ｍＲＮＡ５μｇｄＮＴＰ１０ｍＭ×３μＬプライマー２．８μｇ

【００８３】得られたｃＤＮＡを、EcoR IサイトとXho
I サイトを利用してZAP Express Vectorに挿入し、パッ
ケージングした。このようにして、タイター（力価）
２，３５０，０００pfuのトリコスポロノイデス・メガ
チリエンシスＳＮ−Ｇ４２株のｃＤＮＡライブラリー
を作製した。

【００８４】（７）ｃＤＮＡライブラリーのプラークハ
イブリダイゼーション及び、エリスロース還元酵素III
型タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の決定次に、パッケージングした組換えファージを、大腸菌XL
1-Blue MRF´に感染させ、プレート上にプラーク（溶菌
班）を形成させた後、前記（４）で作製したプローブを
用い、ストリンジェントな条件でプラークハイブリダイ
ゼーションを行った。

【００８５】プラークハイブリダイゼーションの結果、
目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファー
ジの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部
分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラ
スミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染さ
せ増幅させた。次いで、この増幅させたXLOLRからプラ
スミドを取得して、ＤＮＡシークエンスを行った。解析
の結果、全長１１１９ｂｐの配列表の配列番号１記載の
塩基配列であることがわかった。この塩基配列をアミノ
酸に翻訳したものも配列表の配列番号１に併せて示し
た。

【００８６】また、得られた塩基配列について、常法に
より制限酵素地図を作成した（図３）。図３からわかる
ように、５’末端から１２２番目の塩基部分にBan I切
断部位、８４７番目及び１０５７番目の塩基部分にEcoR
I切断部位、１０９３番目にBamH I切断部位を有する。

【００８７】また、この配列表の配列番号１記載のアミ
ノ酸配列からなるエリスロース還元酵素III型タンパク
質は、先に判明しているヒトアルドース還元酵素及び酵
母gcyタンパク質等の既知のアミノ酸配列との相同性が
低い新規な配列であることがわかった。

【００８８】このことから、本発明のエリスロース還元
酵素III型タンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の
配列番号１記載の塩基配列を有し、本発明に係るエリス
ロース還元酵素III型は、新規なアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡであることが明らかと
なった。

【００８９】（８）大腸菌を用いた組換えエリスロース
還元酵素III型の発現配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、開始コドン
（ａｔｇ）を除いたＮ末端側の塩基配列を基にして、Ba
mH Iサイトを持つようにプライマーを作製した。また、
同配列のＣ末端側を基にしてXho Iサイトを持つように
もう一方のプライマーを合成した。先にｃＤＮＡライブ
ラリーからスクリーニングを行い取得した、エリスロー
ス還元酵素III型を含むプラスミドを鋳型として、前記
プライマーを用いたＰＣＲにより、末端にBamH I、Xho
Iサイトを持つエリスロース還元酵素III型のｃＤＮＡ全
長を増幅した。ＰＣＲの条件は、エリスロース還元酵素
III型ｃＤＮＡを含むプラスミド２００ｎｇをテンプ
レートとし、酵素としてPfu DNAポリメラーゼ（STRATAG
ENE社製）を用いて、１２サイクルで行った。

【００９０】ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持
つエリスロース還元酵素III型遺伝子が増幅された。こ
のＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET A（INVITROGEN
社製）のBamH I、Xho Iサイトを切断し、組込んだ。エ
リスロース還元酵素III型遺伝子を組み込んだ状態のプ
ラスミドpRSET Aを、発現用細胞である大腸菌BL21（DE
3）pLysS（STRATAGENE社製）に導入し、ヒスチジンタグ
結合タンパク質として発現させるべく、大腸菌を５０μ
ｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で２５℃で培養し
た。発現の誘導は、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう
添加して、ラクトースオペロンを介して行った。

【００９１】大腸菌を遠心分離（２，９２０×ｇ、１５
分間）により集菌し、超音波処理（SONIFIER 250D, BRA
NSON社）で破砕し、再び遠心分離（２６，４００×ｇ、
１５分間）を行って上清を分取した（粗酵素液）。得ら
れた粗酵素液を、ヒスチジンタグ融合タンパク質のアフ
ィニティーゲルであるNickel Chelated Agarose （B-PE
R 6×His Spin Purfication Kit, PIERCE社製）で精製
した。次に、ゲル濾過ユニットＰＤ−１０（Amersham
Pharmacia Biotech社製）を用いて、ゲル濾過によりbu
fferをenterokinase reaction bufferに置換した。精製
後、エンテロキナーゼ（INVITROGEN社製）でヒスチジン
タグ部分を切り離した。その後、夾雑蛋白、ヒスチジン
タグ、Enterokinaseを排除するため、イオン交換カラム
による精製を行い組換えエリスロース還元酵素III型を
取得した。

【００９２】実施例２（１）ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼ
ーション及び、エリスロース還元酵素II型タンパク質を
コードするＤＮＡの塩基配列の決定実施例１の（６）で作製したｃＤＮＡライブラリーにつ
いて、前記実施例１で得られたエリスロース還元酵素II
I型ｃＤＮＡ全長を基にしてプローブを作製し、ストリ
ンジェントな条件でプラークハイブリダイゼーションを
行った。

【００９３】プラークハイブリダイゼーションの結果、
目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファー
ジの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部
分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラ
スミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染さ
せ増幅させた。次いで、この増幅させたXLOLRからプラ
スミドを取得して、ＤＮＡシークエンスを行った。

【００９４】解析の結果、全長１０７７ｂｐの配列表の
配列番号２記載の塩基配列であることがわかった。この
塩基配列をアミノ酸に翻訳したものも配列表の配列番号
２に併せて示した。

【００９５】また、得られた塩基配列について、常法に
より制限酵素地図を作成した（図４）。図４からわかる
ように、５’末端から６１番目及び９４３番目の塩基部
分にBan I切断部位、１４８番目及び５２０番目の塩基
部分にAcc I切断部位、２３８番目及び５６３番目の塩
基部分にHind III切断部位、５２０番目の塩基部分にSa
l I切断部位、８４７番目の塩基部分にEcoR I切断部位
を有する。

【００９６】このことから、本発明のエリスロース還元
酵素II型タンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配
列番号２記載の塩基配列を有し、本発明に係るエリスロ
ース還元酵素II型遺伝子は、新規なアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡであることが明らか
となった。

【００９７】（２）大腸菌を用いた組換えエリスロース
還元酵素II型の発現配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、開始コドン
（ａｔｇ）を除いたＮ末端側の塩基配列を基にして、Ba
mH Iサイトを持つようにプライマーを作製した。また、
同配列のＣ末端側を基にしてXho Iサイトを持つように
もう一方のプライマーを合成した。先にｃＤＮＡライブ
ラリーからスクリーニングを行い取得した、エリスロー
ス還元酵素II型を含むプラスミドを鋳型として、前記プ
ライマーを用いたＰＣＲにより、末端にBamH I、Xho I
サイトを持つエリスロース還元酵素II型のｃＤＮＡ全長
を増幅した。ＰＣＲの条件は、実施例１（８）に示した
のと同様である。

【００９８】ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持
つエリスロース還元酵素II型遺伝子が増幅された。この
ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET AのBamH I、Xho I
サイトを切断し、組込んで、実施例１（８）と同様にし
て精製し、組換えエリスロース還元酵素II型を取得し
た。

【００９９】実施例３（１）ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼ
ーション及び、エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質を
コードするＤＮＡの塩基配列の決定実施例１の（６）で作製したｃＤＮＡライブラリーにつ
いて、前記実施例１で得られたエリスロース還元酵素II
I型ｃＤＮＡ全長を基にしてプローブを作製し、このプ
ローブを用いて、ストリンジェントな条件でプラークハ
イブリダイゼーションを行った。

【０１００】プラークハイブリダイゼーションの結果、
目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファー
ジの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部
分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラ
スミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染さ
せ増幅させた。次いで、この増幅させたXLOLRからプラ
スミドを取得して、ＤＮＡシークエンスを行った。

【０１０１】解析の結果、全長１１２１ｂｐの配列表の
配列番号３記載の塩基配列であることがわかった。この
塩基配列をアミノ酸に翻訳したものも配列表の配列番号
２に併せて示した。

【０１０２】本発明者らはＤＮＡシークエンスにより、
配列表の配列番号３に示す全長１１２１ｂｐの塩基配列
を見出した。また、得られた塩基配列について、常法に
より制限酵素地図を作成した（図５）。図５からわかる
ように、５’末端から６１番目及び９４３番目の塩基部
分にBan I切断部位、２３８番目及び５６３番目の塩基
部分にHind III切断部位、５２０番目の塩基部分にAcc
I切断部位及びSal I切断部位、８４７番目の塩基部分に
EcoR I切断部位を有する。

【０１０３】このことから、本発明のエリスロース還元
酵素Ｉ型タンパク質をコードするＤＮＡは、配列表の配
列番号３記載の塩基配列を有し、本発明に係るエリスロ
ース還元酵素Ｉ型遺伝子は、新規なアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡであることが明らか
となった。

【０１０４】（２）大腸菌を用いた組換えエリスロース
還元酵素Ｉ型の発現配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、開始コドン
（ａｔｇ）を除いたＮ末端側の塩基配列を基にして、Ba
mH Iサイトを持つようにプライマーを作製した。また、
同配列のＣ末端側を基にしてXho Iサイトを持つように
もう一方のプライマーを合成した。先にｃＤＮＡライブ
ラリーからスクリーニングを行い取得した、エリスロー
ス還元酵素Ｉ型を含むプラスミドを鋳型として、前記プ
ライマーを用いたＰＣＲにより、末端にBamH I、Xho I
サイトを持つエリスロース還元酵素Ｉ型のｃＤＮＡ全長
を増幅した。ＰＣＲの条件は、実施例１（８）に示した
のと同様である。

【０１０５】ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持
つエリスロース還元酵素Ｉ型遺伝子が増幅された。この
ＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET AのBamH I、Xho I
サイトを切断し、組込んで、実施例１（８）と同様にし
て精製し、組換えエリスロース還元酵素Ｉ型を取得し
た。

【０１０６】実施例４実施例１〜３で得られた精製組換えエリスロース還元酵
素III 型、II型及びＩ型について、以下の試験を行っ
た。（１）基質特異性の比較実施例１〜３で得られた精製組換えエリスロース還元酵
素III型、II型及びＩ型と、従来報告されているエリス
ロース還元酵素III型（天然型：H. Ishizuka,et al., B
iosci. Biotech. Biochem., 56 (6), 941-945, 1992 ）
との基質特異性の比較を行った。Phosphate buffer pH
6.5 ５０ｍＭ、基質１２ｍＭ、ＮＡＤＰＨ０．２ｍ
Ｍ存在下で酵素２０μＬを作用させ（total １ｍ
Ｌ）、３７℃で３４０ｎｍの吸光度変化を５分間に渡り
経時的に測定した。エリスロースを基質として還元する
反応速度を１００％として、様々な各種ケトースやアル
ドースを還元する反応速度の相対値（％）を第１表に示
した。

【０１０７】

【表１】第１表

【０１０８】第１表より、本発明の精製組換えエリスロ
ース還元酵素III型は、従来報告されている天然型のエ
リスロース還元酵素III型の基質を還元することが明ら
かである。また、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ
型、II型の基質特異性は、ジヒドロキシアセトン及びｐ
−ニトロベンズアルデヒドについて、III型よりも相対
活性が低いことが特徴であった。

【０１０９】以上より、本発明のエリスロース還元酵素
III型をコードするＤＮＡが発現して得られる組換え酵
素は、天然のエリスロース還元酵素III型と同様の基質
特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活性を
有していることが明らかである。また、本発明のエリス
ロース還元酵素II型及びＩ型をコードするＤＮＡが発現
して得られる組換え酵素も、Ｄ−エリスロースをはじめ
とする糖アルコールの生産に対する酵素活性を有してい
ることも明らかである。

【０１１０】（２）ウェスタンブロット精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型
について、ウェスタンブロットを行った。各酵素を含む
酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分離後、ゲル
からＰＶＤＦ膜に移行させた。これに、一次抗体として
の抗エリスロース還元酵素III型マウス抗体と反応させ
た後、ＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を
用いて、結合している一次抗体を検出した。結果を図６
に示す。

【０１１１】図６中、ａは、本実施例の精製組換えエリ
スロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、ｂ
は、同ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンをＰＶＤＦ膜に移行さ
せ、ウェスタンブロットを行った結果を示す。図６のａ
及びｂにおいて、レーンは分子量マーカー（ｋＤ
ａ）、レーンは精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型
の結果、レーンは精製組換えエリスロース還元酵素II
型の結果、レーンは精製組換えエリスロース還元酵素
III型の結果を示す。

【０１１２】図６から明らかなとおり、精製組換えエリ
スロース還元酵素III型については明らかに抗体反応が
検出された。精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型、II
型についても、反応性は低いものの抗体反応を確認する
ことができた。

【０１１３】（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型
について、ゲル（商品名：Phast Gel (Gradient 8-2
5)、製造元：アマシャムファルマシア社）を用いて、
Phast System 全自動電気泳動システム（アマシャム
ファルマシア社製）によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図７に示す。

【０１１４】図７中、ａは、従来報告されているエリス
ロース還元酵素（天然型：K. Tokuoka, et al., J. Ge
n. Appl. Microbiol., 38, 145-155）の結果を示し、ｂ
は、本実施例の精製組換えエリスロース還元酵素の結果
を示す。図７において、ａの電気泳動図下の１、２、３
は、それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ型、II型、
III型の結果を示し、ｂのレーンは分子量マーカー
（ｋＤａ）、レーンは精製組換えエリスロース還元酵
素Ｉ型の結果、レーンは精製組換えエリスロース還元
酵素II型の結果、レーンは精製組換えエリスロース還
元酵素III型の結果を示す。

【０１１５】図７ｂから明らかなとおり、精製組換えエ
リスロース還元酵素Ｉ型、II型、III型ともに、各アミ
ノ酸配列から予想される約３７ｋＤａ（３７，０００Ｄ
ａ）の部分にバンドが確認できた。これは、天然型のエ
リスロース還元酵素と同じ結果であった（図７ａ）。

【０１１６】（４）Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ精製組換えエリスロース還元酵素III型、II型及びＩ型
について、ゲル（商品名：Phast Gel (Gradient 8-2
5)、製造元：アマシャムファルマシア社）を用いて、
Phast System 全自動電気泳動システム（アマシャム
ファルマシア社製）によりＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行
った。結果を図８に示す。

【０１１７】図８中、ａは、従来報告されているエリス
ロース還元酵素（天然型：K. Tokuoka, et al., J. Ge
n. Appl. Microbiol., 38, 145-155）の結果を示し、ｂ
は、本実施例の精製エリスロース還元酵素の結果を示
す。図８において、ａの電気泳動図下の１、２、３は、
それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ型、II型、III
型の結果を示し、ｂのレーンは精製組換えエリスロー
ス還元酵素Ｉ型の結果、レーンは精製組換えエリスロ
ース還元酵素II型の結果、レーンは精製組換えエリス
ロース還元酵素III型の結果を示す。

【０１１８】図８ｂより、各組換え酵素の結果の移動度
の相対的なパターンを見ると、天然型エリスロース還元
酵素のデータ（図８ａ）とほぼ同じであった。なお、精
製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型及びII型ではバンド
が２本見られるが、メインでないバンドは精製時にヒス
チジンタグが完全に切断されなかった酵素ではないかと
考えられる。

【０１１９】（５）ＩＥＦ−ＰＡＧＥ（等電点電気泳
動）精製組換えエリスロース還元酵素についてゲル（商品
名：Phast Gel (IEF pH4-6.5)、製造元：アマシャム
ファルマシア社）を用いて、Phast System 全自動電気
泳動システム（アマシャムファルマシア社製）により
ＩＥＦ−ＰＡＧＥを行った。ｐＨグラジエントゲルで電
気泳動を行い、分離したタンパク質を染色した。結果を
図９に示す。図９において、レーンは等電点マーカー
タンパク質、レーンは精製組換えエリスロース還元酵
素Ｉ型の結果、レーンは精製組換えエリスロース還元
酵素II型の結果、レーンは精製組換えエリスロース還
元酵素III型の結果を示す。

【０１２０】図９より、バンドの移動度から、それぞれ
の酵素の等電点を確認できた。すなわち、精製組換えエ
リスロース還元酵素Ｉ型ではｐＩ４．７、精製組換えエ
リスロース還元酵素II型ではｐＩ５．３、精製組換えエ
リスロース還元酵素III型では、ｐＩ５．８であった。
なお、精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型及びII型で
はバンドが２本見られるが、メインでないバンドは精製
時にヒスチジンタグが完全に切断されなかった酵素では
ないかと考えられる。

【０１２１】以上の結果より、本実施例で取得した組換
えエリスロース還元酵素は、天然型エリスロース還元酵
素とほぼ同じ状態で発現できたものと考えられる。

【０１２２】実施例５酵母S. cerevisiaeを用いた組換えエリスロース還元酵
素III型の発現を試みた。（１）トランスフォーメーション実施例１（８）においてエリスロース還元酵素III型遺
伝子発現に用いた大腸菌用蛋白発現ベクターpRSET Aか
ら、BamH I及びXho Iにより切断したエリスロース還元
酵素III型ｃＤＮＡを、S. cerevisiae用プラスミドベク
ターpYES2/NT（INVITROGEN社製）に連結させた。

【０１２３】エリスロース還元酵素III型ｃＤＮＡを連
結させたプラスミドベクターを、大腸菌ＤＨ５αにトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリン耐性を獲得した
形質転換体を獲得した。この形質転換した大腸菌を、５
０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地を用
い、３７℃で培養することで、大腸菌とともにエリスロ
ース還元酵素III型ｃＤＮＡを連結させたプラスミドベ
クターを増幅させた。この大腸菌からプラスミドベクタ
ーを取りだして精製を行った。

【０１２４】酢酸リチウム法により、エリスロース還元
酵素III型ｃＤＮＡを連結させたベクターを、ウラシル
要求性のS. cerevisiae INVSc1株（INVITROGEN社製）に
トランスフォーメーションした。エリスロース還元酵素
III型遺伝子を獲得した菌株は、ウラシル合成能を獲得
するので、プラスミドベクターpYES2/NTの実験手引書に
記載されたウラシル欠損最小培地で生育する菌株を拾う
ことにより、エリスロース還元酵素III型遺伝子を獲得
した菌株を選抜した。

【０１２５】（２）タンパク質の発現以下、INVITROGEN社のプラスミドベクターpYES2/NTの実
験手引書の記載に準じて行った。先に得られたエリスロ
ース還元酵素III型遺伝子を獲得した菌株を、２％グル
コースを含むウラシル欠損最小培地１５ｍＬを用い、３
０℃、２２０ｒｐｍの条件で２４時間振とう培養した。

【０１２６】培養後、菌株を遠心分離（１，５００×
ｇ、５分間、４℃）により集菌し、この菌体を２％ガラ
クトース、１％ラフィノースを含むウラシル欠損最小培
地５０ｍＬに再懸濁し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で
４８時間振とう培養した。この培養液を遠心分離（１，
５００×ｇ、５分間、４℃）して、菌体を集菌した。

【０１２７】この菌体約２ｇに、０．５φｍｍのガラス
ビーズ２ｇを添加し、振とう菌体破砕機（B. Braun Mel
sungen AG）で１５秒×１０回の条件で振とうを行な
い、菌体破砕を行なった。この菌体破砕液を、１２，０
００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心分離を行い、上
清を粗酵素液とした。

【０１２８】この粗酵素液を、実施例１（８）記載の方
法に従い、Nickel Chelated Agaroseにより菌体内から
組換えエリスロース還元酵素III型を精製した。

【０１２９】（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２）で得られたS. cerevisiaeで発現させた精製組換
えエリスロース還元酵素III型について、ゲル（パジェ
ルＳＰＧ５２０Ｌ（アトー（株）製）を用いて、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図１０に示す。図中、
レーンは分子量マーカー（ｋＤａ）、レーンはS. c
erevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵
素III型、レーンは大腸菌で発現させた精製組換えエ
リスロース還元酵素III型の結果を示す。

【０１３０】図１０のレーンから明らかな通り、S. c
erevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵
素III型は、大腸菌で発現させた精製組換えエリスロー
ス還元酵素III型及び天然型エリスロース還元酵素III型
と等しい分子量で発現させることができた。

【０１３１】（５）酵素活性の測定（２）で得られたS. cerevisiaeで発現させた精製組換
えエリスロース還元酵素III型について、実施例４
（１）と同様の条件で、エリスロースを基質とした酵素
活性を測定した。その結果、比活性１９．３ｕｎｉｔｓ
／ｍｌで活性が確認された。したがって、活性のある状
態で組換えエリスロース還元酵素III型をS. cerevisiae
で発現させることができた。

【０１３２】

【発明の効果】本発明によれば、新規なエリスロース還
元酵素活性を有するタンパク質が提供される。酵母を含
む微生物に組込む等の手段により本発明のエリスロース
還元酵素III型、II型又はＩ型をコードするＤＮＡを発
現させれば、通常の微生物の培養による既知の方法と比
較して、該微生物の生産性等に左右されることなく、エ
リスロース還元酵素III型、II型又はＩ型の大量生産を
容易に行うことができる。このエリスロース還元酵素II
I型、II型及びＩ型は、天然型エリスロース還元酵素と
同等の基質特異性を有し、また糖アルコールを生産する
酵素活性を有している。よって、本発明に係る該酵素を
コードするＤＮＡを利用して生産されるエリスロース還
元酵素III型、II型及びＩ型は、エリスリトールの工業
的生産に有用である。

【０１３３】また、本発明のエリスロース還元酵素III
型、II型又はＩ型をコードするＤＮＡは、遺伝子工学的
手法による高いエリスリトール生産能を有する変異体酵
素の開発、関連酵素をコードする遺伝子のクローニング
等、様々な用途においても有用である。

【０１３４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute <120> エリスロース還元酵素、その遺伝子、並びに該遺伝子を導入した細胞 <130> P131238K <160> 7 <210> 1 <211> 1119 <212> DNA <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 1 atg tct tac aaa cag tac atc ccc ctg aac gac ggt aac aaa atc cct 48 Met Ser Tyr Lys Gln Tyr Ile Pro Leu Asn Asp Gly Asn Lys Ile Pro 1 5 10 15 gcc ctt gga ttt ggt act tgg caa gct gaa cct ggt caa gtg ggt gca 96 Ala Leu Gly Phe Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Gln Val Gly Ala 20 25 30 agt gtc aag aac gct gtc aag gct ggg tac cgt cat ttg gat ttg gcc 144 Ser Val Lys Asn Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala 35 40 45 aaa gtg tac caa aac caa tcg gaa att gga gta gca ctt cag gaa ctg 192 Lys Val Tyr Gln Asn Gln Ser Glu Ile Gly Val Ala Leu Gln Glu Leu 50 55 60 ttt gat caa ggt att gtt aaa cgg gaa gat ttg ttt att acg tcc aaa 240 Phe Asp Gln Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 gta tgg aat aac cgt cat gct cct gaa cat gtt gag cct gca ttg gac 288 Val Trp Asn Asn Arg His Ala Pro Glu His Val Glu Pro Ala Leu Asp 85 90 95 gaa aca ttg aaa gaa ctt gga ttg tcc tac ttg gat ttg tac ttg att 336 Glu Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile 100 105 110 cat tgg ccc gtt gcg ttc aag ttt act acg cct caa gaa cta ttc cct 384 His Trp Pro Val Ala Phe Lys Phe Thr Thr Pro Gln Glu Leu Phe Pro 115 120 125 act gag ccg gat aac aag gaa ttg gcc gcg att gat gat tca atc aag 432 Thr Glu Pro Asp Asn Lys Glu Leu Ala Ala Ile Asp Asp Ser Ile Lys 130 135 140 ttg gta gac act tgg aag gca gtt gta gca ctc aaa aaa acg ggt aag 480 Leu Val Asp Thr Trp Lys Ala Val Val Ala Leu Lys Lys Thr Gly Lys 145 150 155 160 acc aaa tcc gtt ggt gtg tcg aac ttc act acg gat ttg gta gac ttg 528 Thr Lys Ser Val Gly Val Ser Asn Phe Thr Thr Asp Leu Val Asp Leu 165 170 175 gtt gaa aaa gcg tcg ggg gaa cga ccg gcg gtc aat cag att gaa gca 576 Val Glu Lys Ala Ser Gly Glu Arg Pro Ala Val Asn Gln Ile Glu Ala 180 185 190 cac cca ttg tta caa cag gat gaa ttg gtt gct cat cac aag agt aaa 624 His Pro Leu Leu Gln Gln Asp Glu Leu Val Ala His His Lys Ser Lys 195 200 205 aac att gtg att act gcg tac agt cct ttg gga aac aat gtg agt ggg 672 Asn Ile Val Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Val Ser Gly 210 215 220 aaa cca cct ctg act caa aac cct ggg att gaa gca act gcg aaa cgg 720 Lys Pro Pro Leu Thr Gln Asn Pro Gly Ile Glu Ala Thr Ala Lys Arg 225 230 235 240 tta aat cat act cct gct gcg gtc ttg ctt gca tgg ggg att caa cgt 768 Leu Asn His Thr Pro Ala Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Ile Gln Arg 245 250 255 gga tac agt gta ttg gtc aag agt gtt aca cct tct cga att gag agc 816 Gly Tyr Ser Val Leu Val Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Glu Ser 260 265 270 aat tat gat cag att acc ctt tct cct gaa gaa ttc cag aag gtt acg 864 Asn Tyr Asp Gln Ile Thr Leu Ser Pro Glu Glu Phe Gln Lys Val Thr 275 280 285 gat ttg atc aag gaa tat ggc gaa agt cgc aac aat att ccg ttg aat 912 Asp Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Asn Ile Pro Leu Asn 290 295 300 tat aaa cct tca tgg ccc atc agt gtg ttt ggt aca tcg gat gaa gct 960 Tyr Lys Pro Ser Trp Pro Ile Ser Val Phe Gly Thr Ser Asp Glu Ala 305 310 315 320 aag gct act cat aag att aac acc aac ctt tga gttcagtttg ggaactattt 1013 Lys Ala Thr His Lys Ile Asn Thr Asn Leu Stop 325 330 aaagctgctt gctggtcaca ttattgtcag tacctaccat gaagaattca atattatttt 1073 acattgtcaa ccattacatg gatccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1119 <210> 2 <211> 1077 <212> DNA <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 2 atg tcc tac aac aag aac atc cct ctc aac gac ggt aac tcc att cct 48 Met Ser Tyr Asn Lys Asn Ile Pro Leu Asn Asp Gly Asn Ser Ile Pro 1 5 10 15 gct ctt ggg tac ggt acc tgg caa gca gaa cct ggt cag gtc ggt gaa 96 Ala Leu Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Gln Val Gly Glu 20 25 30 ggt gtc aag ctc gct gtt aag gct ggc tac cgt cat ttg gac ttg gcc 144 Gly Val Lys Leu Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala 35 40 45 aaa gta tac cag aac caa acc gag att ggc caa gct ctc aag gaa ctg 192 Lys Val Tyr Gln Asn Gln Thr Glu Ile Gly Gln Ala Leu Lys Glu Leu 50 55 60 ttt gat gag ggt gtt gtc aag cgt gag gac ctt ttc atc act tcc aag 240 Phe Asp Glu Gly Val Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 ctt tgg aac aac cgc cac gct cct gag cac gtt gag cct gcg ctc gac 288 Leu Trp Asn Asn Arg His Ala Pro Glu His Val Glu Pro Ala Leu Asp 85 90 95 gag act ctt aag gag ttg ggt cta tcc tat ttg gac ctg tac ttg att 336 Glu Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile 100 105 110 cac tgg cct gtt gct ttc aag ttc act act ccc gat gaa ctg ctt cct 384 His Trp Pro Val Ala Phe Lys Phe Thr Thr Pro Asp Glu Leu Leu Pro 115 120 125 gct gac cct acc aac aag gac ctt gcc tac att gac gat tcg gtc aaa 432 Ala Asp Pro Thr Asn Lys Asp Leu Ala Tyr Ile Asp Asp Ser Val Lys 130 135 140 ttg tcc gac acc tgg aag gcg gtc gtc gcc ctg aaa aag acg ggt aag 480 Leu Ser Asp Thr Trp Lys Ala Val Val Ala Leu Lys Lys Thr Gly Lys 145 150 155 160 acc aag tcg gtt ggt gtt tcg aac ttc agc act cgt ctg gtc gac ttg 528 Thr Lys Ser Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Thr Arg Leu Val Asp Leu 165 170 175 gtt gag gaa gct tcg ggc gaa cgt cct gcg gtt aac cag atc gaa gct 576 Val Glu Glu Ala Ser Gly Glu Arg Pro Ala Val Asn Gln Ile Glu Ala 180 185 190 cac ccc ttg ttg caa caa gac gag ttg gtt gct cac cat aag agc aag 624 His Pro Leu Leu Gln Gln Asp Glu Leu Val Ala His His Lys Ser Lys 195 200 205 aac att gtc atc act gct tac agt ccc ttg ggc aac aat gtc gct ggt 672 Asn Ile Val Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Val Ala Gly 210 215 220 aaa cca cct ctg act gag aat ccc ggt att gtg gat gct gct aag cgt 720 Lys Pro Pro Leu Thr Glu Asn Pro Gly Ile Val Asp Ala Ala Lys Arg 225 230 235 240 ctg aac cat act cct gct gct gtg ctc att gct tgg ggt att caa cgc 768 Leu Asn His Thr Pro Ala Ala Val Leu Ile Ala Trp Gly Ile Gln Arg 245 250 255 ggg tac agc gtc ttg gtc aag tca gtt aca ccc tca cgg att aag agt 816 Gly Tyr Ser Val Leu Val Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Lys Ser 260 265 270 aac ttt gaa cag atc act ctg tct gat gag gaa ttc caa cgg gtt acc 864 Asn Phe Glu Gln Ile Thr Leu Ser Asp Glu Glu Phe Gln Arg Val Thr 275 280 285 aac ctc atc aag gag tac ggt gag agc cgt aac aac gtt cct ttc aac 912 Asn Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Asn Val Pro Phe Asn 290 295 300 tac aag cct tcg tgg tct att gac gtc ttt ggt acc cag tac gag gct 960 Tyr Lys Pro Ser Trp Ser Ile Asp Val Phe Gly Thr Gln Tyr Glu Ala 305 310 315 320 aag gct acc cac aag att aac gct taa tgtgctctta tacaaaaagt 1007 Lys Ala Thr His Lys Ile Asn Ala Stop 325 cgtttgaacc tgtaatgtgt gaatgttatc ctcattgttg catcatctca tcaaaaaaaa 1067 aaaaaaaaaa 1077 <210> 3 <211> 1121 <212> DNA <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 3 atg tcc tac aac aag aac atc cct ctc aac gac ggt aac tcc atc cct 48 Met Ser Tyr Asn Lys Asn Ile Pro Leu Asn Asp Gly Asn Ser Ile Pro 1 5 10 15 gcc ctt ggc tac ggt acc tgg caa gca gaa cct ggt cag gtc ggt gaa 96 Ala Leu Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Gln Val Gly Glu 20 25 30 ggt gtc aag ctc gct gtc aaa gct ggc tac cgt cac ttg gac ttg gcc 144 Gly Val Lys Leu Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala 35 40 45 aaa gtt tac cag aac caa acc gag att ggc caa gct ctc aag gaa ctg 192 Lys Val Tyr Gln Asn Gln Thr Glu Ile Gly Gln Ala Leu Lys Glu Leu 50 55 60 ttt gat gag ggt gtt gtc aag cgt gag gac ctt ttc atc act tcc aag 240 Phe Asp Glu Gly Val Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 ctt tgg aac aac cgc cac gct cct gag cac gtt gag cct gcg ctc gac 288 Leu Trp Asn Asn Arg His Ala Pro Glu His Val Glu Pro Ala Leu Asp 85 90 95 gag act ctt aag gag ctg ggt cta tcc tat ctg gac ctg tac ttg att 336 Glu Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile 100 105 110 cac tgg cct gtt gct ttc aag ttc act act ccc gat gaa ttg ctc cct 384 His Trp Pro Val Ala Phe Lys Phe Thr Thr Pro Asp Glu Leu Leu Pro 115 120 125 gct gac cct acc aac aag gat ctt gcc tac gtt gac gat tcg gta aaa 432 Ala Asp Pro Thr Asn Lys Asp Leu Ala Tyr Val Asp Asp Ser Val Lys 130 135 140 ttg tcc gac acc tgg aag gcg gtc gtc gcc ctg aag aag acg ggt aag 480 Leu Ser Asp Thr Trp Lys Ala Val Val Ala Leu Lys Lys Thr Gly Lys 145 150 155 160 acc aag tcg gtt ggt gtt tcg aac ttc agc act cgt ctg gtc gac ttg 528 Thr Lys Ser Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Thr Arg Leu Val Asp Leu 165 170 175 gtt gag gaa gct tcg ggc gaa cgt cct gcg gta aac cag atc gaa gct 576 Val Glu Glu Ala Ser Gly Glu Arg Pro Ala Val Asn Gln Ile Glu Ala 180 185 190 cac ccc ttg ttg caa caa gac gag ttg gtt gct cac cat aag agc aag 624 His Pro Leu Leu Gln Gln Asp Glu Leu Val Ala His His Lys Ser Lys 195 200 205 aac att gtc atc act gct tac agt ccc ttg ggc aac aat gtc gct ggt 672 Asn Ile Val Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Val Ala Gly 210 215 220 aaa cca cct ctg act gag aac ccc ggt att gtg gat gct gct aag cgt 720 Lys Pro Pro Leu Thr Glu Asn Pro Gly Ile Val Asp Ala Ala Lys Arg 225 230 235 240 ttg aac cat act cct gct gct gtg ctc att gct tgg ggt att caa cgc 768 Leu Asn His Thr Pro Ala Ala Val Leu Ile Ala Trp Gly Ile Gln Arg 245 250 255 ggg tac agc gtc ttg gtc aag tca gtt aca ccc tca cgg atc aag agt 816 Gly Tyr Ser Val Leu Val Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Lys Ser 260 265 270 aac ttt gaa cag atc act ctg tct gat gag gaa ttc caa cgg gtt acc 864 Asn Phe Glu Gln Ile Thr Leu Ser Asp Glu Glu Phe Gln Arg Val Thr 275 280 285 aac ctc atc aag gag tac ggt gag agc cgt aac aac gtt cct ttc aat 912 Asn Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Asn Val Pro Phe Asn 290 295 300 tac aag cct tcg tgg tcc att gac gtc ttt ggt acc cag gac gag gct 960 Tyr Lys Pro Ser Trp Ser Ile Asp Val Phe Gly Thr Gln Asp Glu Ala 305 310 315 320 aag gct acc cac aag att aac gct taa tgtgctctta tacaaaaagt 1007 Lys Ala Thr His Lys Ile Asn Ala Stop 325 cgtttgaacc tgtaatgtgt gaatgttatc ctcattgttg catcgtctca tcaaaaaaaa 1067 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1121 <210> 4 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on erythrose reductase type III DNA sequ ence <220> <221> unsure <222> 9 <223> n=a or c or g or t <400> 4 cargarctnt tygaycaygg 20 <210> 5 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on erythrose reductase type III DNA sequ ence <220> <221> unsure <222> 3 <223> n=a or c or g or t <220> <221> unsure <222> 18 <223> n=a or c or g or t <400> 5 tgngcytcna tytgrttnac 20 <210> 6 <211> <212> PRT <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 6 Gln Glu Leu Phe Asp Gln Gly 1 5 <210> 7 <211> <212> PRT <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 7 Val Asn Gln Ile Glu Ala His 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】エリスリトール生産菌によるグルコースから
のエリスリトール生合成経路を示す。

【図２】ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示
す図である。

【符号の説明】

レーン１は２４時間培養物の結果を、レーン２は４８
時間培養物の結果を、レーン３は７２時間培養物の結果
を、レーン４は９６時間培養物の結果を示す。

【図３】エリスロース還元酵素III型タンパク質をコ
ードするＤＮＡの制限酵素地図である。

【符号の説明】

EcoR I、Ban I 、BamH Iはそれぞれ制限酵素を示し、
括弧内の数字は５’末端から数えた塩基数を示す。

【図４】エリスロース還元酵素II型タンパク質をコー
ドするＤＮＡの制限酵素地図である。

【符号の説明】

EcoR I、Ban I 、Acc I、Hind III、Sal Iはそれぞれ
制限酵素を示し、括弧内の数字は５’末端から数えた塩
基数を示す。

【図５】エリスロース還元酵素Ｉ型タンパク質をコー
ドするＤＮＡの制限酵素地図である。

【符号の説明】

【図６】エリスロース還元酵素のウェスタンブロット
の結果を示す図である。

【符号の説明】

ａは、組換えエリスロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果を示し、ｂは、組換えエリスロース還元酵素の
ウェスタンブロットの結果を示す。ａの電気泳動図下の
１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還元酵素Ｉ
型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーンは分子量
マーカー（ｋＤａ）、レーンは精製組換えエリスロー
ス還元酵素Ｉ型の結果、レーンは精製組換えエリスロ
ース還元酵素II型の結果、レーンは精製組換えエリス
ロース還元酵素III型の結果を示す。

【図７】エリスロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果を示す図である。

【符号の説明】

ａは、天然エリスロース還元酵素の結果を示し、ｂ
は、組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。ａの電
気泳動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロー
ス還元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレー
ンは分子量マーカー（ｋＤａ）、レーンは精製組換
えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーンは精製組
換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーンは精製
組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。

【図８】エリスロース還元酵素のＮａｔｉｖｅ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す図である。

【符号の説明】

ａは、天然エリスロース還元酵素の結果を示し、ｂ
は、組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。ａの電
気泳動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロー
ス還元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレー
ンは精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レ
ーンは精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、
レーンは精製組換えエリスロース還元酵素III型の結
果を示す。

【図９】エリスロース還元酵素のＩＥＦ−ＰＡＧＥの
結果を示す図である。

【符号の説明】

レーンは等電点マーカータンパク質、レーンは精
製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーンは
精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーン
は精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示
す。

【図１０】組換えエリスロース還元酵素III型のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【符号の説明】

レーンは分子量マーカー（ｋＤａ）、レーンはS.
cerevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元
酵素III型、レーンは大腸菌で発現させた精製組換え
エリスロース還元酵素III型の結果を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１月２４日（２００２．１．２
４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】本発明者らは、スクリーニングの結果、プ
ローブに対し陽性を示したファージからプラスミドに変
換後、ＤＮＡシークエンスを行った。例えばまず、スク
リーニングにおいてプローブに対し陽性を示した数個の
プラークを単離し、ファージを増幅して、ファージＤＮ
ＡからIN VIVOにおいてインサートを含むファージミド
部分を切り出す。これを取り扱いを容易にすべくプラス
ミドの形に変換し、大腸菌に感染させてプラスミドを増
幅した後、このプラスミドについて、ＤＮＡシークエン
スを行う。本発明者らはＤＮＡシークエンスにより、配
列表の配列番号１に示す全長１１１９ｂｐの塩基配列を
見出した。本塩基配列に基づいて決定されたアミノ酸配
列も、併せて配列表の配列番号１に示した。該アミノ酸
配列は、部分的に解読したアミノ酸配列を含んでおり、
この配列を有するタンパク質がエリスロース還元酵素II
I型タンパク質であった。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】エリスロース還元酵素Ｉ型、II型及びIII
型タンパク質をコードするＤＮＡは、それぞれエリスロ
ース還元酵素Ｉ型、II型、III型が発現可能な形態で細
胞に導入することができる。細胞への導入は、エリスロ
ース還元酵素Ｉ型、II型又はIII型タンパク質をコード
するＤＮＡの全長を、両端に制限酵素認識部位を持つプ
ライマーでＰＣＲにより増幅させ、この増幅産物を、制
限酵素認識部位を利用して各種プラスミドに組込んだ形
で行うことができる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】ここで、細胞としては、大腸菌、酵母など
発現用細胞として通常用いられるものを使用することが
できる。プラスミドとしては、大量発現が容易なプラス
ミドを選択することが望ましく、大腸菌へ導入する場
合、ヒスチジンタグ融合タンパク質、ＧＳＴ（グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質、チオ
レドキシン融合タンパク質などを用いることができる。
発現誘導に際しては、プロモーターを本発明の各ＤＮＡ
の５’側より上流に、ターミネーターを３’側より下流
に、それぞれ組込めばよい。このプロモーター、ターミ
ネーターとしては、発現用細胞内で機能することが知ら
れているものを用いる必要があり、詳細については、微
生物学基礎講座８遺伝子工学、共立出版、Adv. Bioch
em. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423-488 (199
2)等に記載されている。例えば大腸菌へプラスミドを導
入する場合、ラクトースオペロンとlac Iを用いたＩＰ
ＴＧによる調節システムを用いると、正確な発現が誘導
される点で好ましい。なお、大腸菌の代わりに栄養要求
性の酵母であるS.cerevisiaeへプラスミドを導入して
も、ガラクトースにより正確な発現が誘導される。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７１】（３）ＰＣＲ反応で用いるプライマーの設
計部分的に解読したアミノ酸配列のうち、アルド−ケト還
元酵素ファミリーに含まれるアミノ酸配列を参考にして
選択したアミノ酸配列（配列表の配列番号６，７参照）
から、センスプライマー（配列表の配列番号４参照）及
びアンチセンスプライマー（配列表の配列番号５参照）
を設計し、これを後述のＰＣＲ反応で用いた。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７２】（４）エリスロース還元酵素III型をコー
ドするｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ次に、後述のスクリーニング等で用いるプローブを作製
するため、ＰＣＲを行った。４０％グルコース培地で
３日間培養したトリコスポロノイデス・メガチリエンシ
スＳＮ−Ｇ４２株から以下の手順で１本鎖ｃＤＮＡを
合成し、これを鋳型として用いた。培養物からTRIZOL
（Gibco BRL 社製）を用いてＲＮＡを抽出し、DYNABEAD
S mRNA Purification Kit（DYNAL 社製）を用いてｍＲ
ＮＡを精製した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００８５】プラークハイブリダイゼーションの結果、
目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファー
ジの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部
分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラ
スミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染さ
せ増幅させた。次いで、このXLOLRからプラスミドを取
得して、ＤＮＡシークエンスを行った。解析の結果、全
長１１１９ｂｐの配列表の配列番号１記載の塩基配列で
あることがわかった。この塩基配列をアミノ酸に翻訳し
たものも配列表の配列番号１に併せて示した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９０】ＰＣＲの結果、BamH I、Xho Iサイトを持
つエリスロース還元酵素III型遺伝子が増幅された。こ
のＰＣＲ増幅産物を、プラスミドpRSET A（INVITROGEN
社製）のBamH I、Xho Iサイトを切断し、組込んだ。エ
リスロース還元酵素III型遺伝子を組み込んだ状態のプ
ラスミドpRSET Aを、発現用細胞である大腸菌BL21（DE
3）pLysS（STRATAGENE社製）に導入し、ヒスチジンタグ
融合タンパク質として発現させるべく、大腸菌を５０μ
ｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で２５℃で培養し
た。発現の誘導は、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう
添加して、ラクトースオペロンを介して行った。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００９３】プラークハイブリダイゼーションの結果、
目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファー
ジの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部
分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラ
スミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染さ
せ増幅させた。次いで、このXLOLRからプラスミドを取
得して、ＤＮＡシークエンスを行った。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１００

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１００】プラークハイブリダイゼーションの結果、
目的のクローンを単離し、増幅した後、ヘルパーファー
ジの作用により、λファージＤＮＡ中のファージミド部
分（インサートを含む）のみを切断し、環状化してプラ
スミドの状態にする。これを宿主大腸菌XLOLRに感染さ
せ増幅させた。次いで、このXLOLRからプラスミドを取
得して、ＤＮＡシークエンスを行った。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０１】解析の結果、全長１１２１ｂｐの配列表の
配列番号３記載の塩基配列であることがわかった。この
塩基配列をアミノ酸に翻訳したものも配列表の配列番号
３に併せて示した。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０９】以上より、本発明のエリスロース還元酵素
III型をコードするＤＮＡが発現して得られる組換え酵
素は、天然のエリスロース還元酵素III型と同様の基質
特異性を有し、また糖アルコールを生産する酵素活性を
有していることが明らかである。また、本発明のエリス
ロース還元酵素II型及びＩ型をコードするＤＮＡが発現
して得られる組換え酵素も、エリスリトールをはじめと
する糖アルコールを生産する酵素活性を有していること
も明らかである。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３１】（５）酵素活性の測定（２）で得られたS. cerevisiaeで発現させた精製組換
えエリスロース還元酵素III型について、実施例４
（１）と同様の条件で、エリスロースを基質とした酵素
活性を測定した。その結果、比活性１９．３ｕｎｉｔｓ
／ｍｇで活性が確認された。したがって、活性のある状
態で組換えエリスロース還元酵素III型をS. cerevisiae
で発現させることができた。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１３４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Food Research Institute <120> エリスロース還元酵素、その遺伝子、並びに該遺伝子を導入した細胞 <130> P131238K <160> 7 <210> 1 <211> 1119 <212> DNA <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 1 atg tct tac aaa cag tac atc ccc ctg aac gac ggt aac aaa atc cct 48 Met Ser Tyr Lys Gln Tyr Ile Pro Leu Asn Asp Gly Asn Lys Ile Pro 1 5 10 15 gcc ctt gga ttt ggt act tgg caa gct gaa cct ggt caa gtg ggt gca 96 Ala Leu Gly Phe Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Gln Val Gly Ala 20 25 30 agt gtc aag aac gct gtc aag gct ggg tac cgt cat ttg gat ttg gcc 144 Ser Val Lys Asn Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala 35 40 45 aaa gtg tac caa aac caa tcg gaa att gga gta gca ctt cag gaa ctg 192 Lys Val Tyr Gln Asn Gln Ser Glu Ile Gly Val Ala Leu Gln Glu Leu 50 55 60 ttt gat caa ggt att gtt aaa cgg gaa gat ttg ttt att acg tcc aaa 240 Phe Asp Gln Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 gta tgg aat aac cgt cat gct cct gaa cat gtt gag cct gca ttg gac 288 Val Trp Asn Asn Arg His Ala Pro Glu His Val Glu Pro Ala Leu Asp 85 90 95 gaa aca ttg aaa gaa ctt gga ttg tcc tac ttg gat ttg tac ttg att 336 Glu Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile 100 105 110 cat tgg ccc gtt gcg ttc aag ttt act acg cct caa gaa cta ttc cct 384 His Trp Pro Val Ala Phe Lys Phe Thr Thr Pro Gln Glu Leu Phe Pro 115 120 125 act gag ccg gat aac aag gaa ttg gcc gcg att gat gat tca atc aag 432 Thr Glu Pro Asp Asn Lys Glu Leu Ala Ala Ile Asp Asp Ser Ile Lys 130 135 140 ttg gta gac act tgg aag gca gtt gta gca ctc aaa aaa acg ggt aag 480 Leu Val Asp Thr Trp Lys Ala Val Val Ala Leu Lys Lys Thr Gly Lys 145 150 155 160 acc aaa tcc gtt ggt gtg tcg aac ttc act acg gat ttg gta gac ttg 528 Thr Lys Ser Val Gly Val Ser Asn Phe Thr Thr Asp Leu Val Asp Leu 165 170 175 gtt gaa aaa gcg tcg ggg gaa cga ccg gcg gtc aat cag att gaa gca 576 Val Glu Lys Ala Ser Gly Glu Arg Pro Ala Val Asn Gln Ile Glu Ala 180 185 190 cac cca ttg tta caa cag gat gaa ttg gtt gct cat cac aag agt aaa 624 His Pro Leu Leu Gln Gln Asp Glu Leu Val Ala His His Lys Ser Lys 195 200 205 aac att gtg att act gcg tac agt cct ttg gga aac aat gtg agt ggg 672 Asn Ile Val Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Val Ser Gly 210 215 220 aaa cca cct ctg act caa aac cct ggg att gaa gca act gcg aaa cgg 720 Lys Pro Pro Leu Thr Gln Asn Pro Gly Ile Glu Ala Thr Ala Lys Arg 225 230 235 240 tta aat cat act cct gct gcg gtc ttg ctt gca tgg ggg att caa cgt 768 Leu Asn His Thr Pro Ala Ala Val Leu Leu Ala Trp Gly Ile Gln Arg 245 250 255 gga tac agt gta ttg gtc aag agt gtt aca cct tct cga att gag agc 816 Gly Tyr Ser Val Leu Val Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Glu Ser 260 265 270 aat tat gat cag att acc ctt tct cct gaa gaa ttc cag aag gtt acg 864 Asn Tyr Asp Gln Ile Thr Leu Ser Pro Glu Glu Phe Gln Lys Val Thr 275 280 285 gat ttg atc aag gaa tat ggc gaa agt cgc aac aat att ccg ttg aat 912 Asp Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Asn Ile Pro Leu Asn 290 295 300 tat aaa cct tca tgg ccc atc agt gtg ttt ggt aca tcg gat gaa gct 960 Tyr Lys Pro Ser Trp Pro Ile Ser Val Phe Gly Thr Ser Asp Glu Ala 305 310 315 320 aag gct act cat aag att aac acc aac ctt tga gttcagtttg ggaactattt 1013 Lys Ala Thr His Lys Ile Asn Thr Asn Leu Stop 325 330 aaagctgctt gctggtcaca ttattgtcag tacctaccat gaagaattca atattatttt 1073 acattgtcaa ccattacatg gatccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1119 <210> 2 <211> 1077 <212> DNA <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 2 atg tcc tac aac aag aac atc cct ctc aac gac ggt aac tcc att cct 48 Met Ser Tyr Asn Lys Asn Ile Pro Leu Asn Asp Gly Asn Ser Ile Pro 1 5 10 15 gct ctt ggg tac ggt acc tgg caa gca gaa cct ggt cag gtc ggt gaa 96 Ala Leu Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Gln Val Gly Glu 20 25 30 ggt gtc aag ctc gct gtt aag gct ggc tac cgt cat ttg gac ttg gcc 144 Gly Val Lys Leu Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala 35 40 45 aaa gta tac cag aac caa acc gag att ggc caa gct ctc aag gaa ctg 192 Lys Val Tyr Gln Asn Gln Thr Glu Ile Gly Gln Ala Leu Lys Glu Leu 50 55 60 ttt gat gag ggt gtt gtc aag cgt gag gac ctt ttc atc act tcc aag 240 Phe Asp Glu Gly Val Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 ctt tgg aac aac cgc cac gct cct gag cac gtt gag cct gcg ctc gac 288 Leu Trp Asn Asn Arg His Ala Pro Glu His Val Glu Pro Ala Leu Asp 85 90 95 gag act ctt aag gag ttg ggt cta tcc tat ttg gac ctg tac ttg att 336 Glu Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile 100 105 110 cac tgg cct gtt gct ttc aag ttc act act ccc gat gaa ctg ctt cct 384 His Trp Pro Val Ala Phe Lys Phe Thr Thr Pro Asp Glu Leu Leu Pro 115 120 125 gct gac cct acc aac aag gac ctt gcc tac att gac gat tcg gtc aaa 432 Ala Asp Pro Thr Asn Lys Asp Leu Ala Tyr Ile Asp Asp Ser Val Lys 130 135 140 ttg tcc gac acc tgg aag gcg gtc gtc gcc ctg aaa aag acg ggt aag 480 Leu Ser Asp Thr Trp Lys Ala Val Val Ala Leu Lys Lys Thr Gly Lys 145 150 155 160 acc aag tcg gtt ggt gtt tcg aac ttc agc act cgt ctg gtc gac ttg 528 Thr Lys Ser Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Thr Arg Leu Val Asp Leu 165 170 175 gtt gag gaa gct tcg ggc gaa cgt cct gcg gtt aac cag atc gaa gct 576 Val Glu Glu Ala Ser Gly Glu Arg Pro Ala Val Asn Gln Ile Glu Ala 180 185 190 cac ccc ttg ttg caa caa gac gag ttg gtt gct cac cat aag agc aag 624 His Pro Leu Leu Gln Gln Asp Glu Leu Val Ala His His Lys Ser Lys 195 200 205 aac att gtc atc act gct tac agt ccc ttg ggc aac aat gtc gct ggt 672 Asn Ile Val Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Val Ala Gly 210 215 220 aaa cca cct ctg act gag aat ccc ggt att gtg gat gct gct aag cgt 720 Lys Pro Pro Leu Thr Glu Asn Pro Gly Ile Val Asp Ala Ala Lys Arg 225 230 235 240 ctg aac cat act cct gct gct gtg ctc att gct tgg ggt att caa cgc 768 Leu Asn His Thr Pro Ala Ala Val Leu Ile Ala Trp Gly Ile Gln Arg 245 250 255 ggg tac agc gtc ttg gtc aag tca gtt aca ccc tca cgg att aag agt 816 Gly Tyr Ser Val Leu Val Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Lys Ser 260 265 270 aac ttt gaa cag atc act ctg tct gat gag gaa ttc caa cgg gtt acc 864 Asn Phe Glu Gln Ile Thr Leu Ser Asp Glu Glu Phe Gln Arg Val Thr 275 280 285 aac ctc atc aag gag tac ggt gag agc cgt aac aac gtt cct ttc aac 912 Asn Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Asn Val Pro Phe Asn 290 295 300 tac aag cct tcg tgg tct att gac gtc ttt ggt acc cag tac gag gct 960 Tyr Lys Pro Ser Trp Ser Ile Asp Val Phe Gly Thr Gln Tyr Glu Ala 305 310 315 320 aag gct acc cac aag att aac gct taa tgtgctctta tacaaaaagt 1007 Lys Ala Thr His Lys Ile Asn Ala Stop 325 cgtttgaacc tgtaatgtgt gaatgttatc ctcattgttg catcatctca tcaaaaaaaa 1067 aaaaaaaaaa 1077 <210> 3 <211> 1121 <212> DNA <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 3 atg tcc tac aac aag aac atc cct ctc aac gac ggt aac tcc atc cct 48 Met Ser Tyr Asn Lys Asn Ile Pro Leu Asn Asp Gly Asn Ser Ile Pro 1 5 10 15 gcc ctt ggc tac ggt acc tgg caa gca gaa cct ggt cag gtc ggt gaa 96 Ala Leu Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Glu Pro Gly Gln Val Gly Glu 20 25 30 ggt gtc aag ctc gct gtc aaa gct ggc tac cgt cac ttg gac ttg gcc 144 Gly Val Lys Leu Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala 35 40 45 aaa gtt tac cag aac caa acc gag att ggc caa gct ctc aag gaa ctg 192 Lys Val Tyr Gln Asn Gln Thr Glu Ile Gly Gln Ala Leu Lys Glu Leu 50 55 60 ttt gat gag ggt gtt gtc aag cgt gag gac ctt ttc atc act tcc aag 240 Phe Asp Glu Gly Val Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 ctt tgg aac aac cgc cac gct cct gag cac gtt gag cct gcg ctc gac 288 Leu Trp Asn Asn Arg His Ala Pro Glu His Val Glu Pro Ala Leu Asp 85 90 95 gag act ctt aag gag ctg ggt cta tcc tat ctg gac ctg tac ttg att 336 Glu Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile 100 105 110 cac tgg cct gtt gct ttc aag ttc act act ccc gat gaa ttg ctc cct 384 His Trp Pro Val Ala Phe Lys Phe Thr Thr Pro Asp Glu Leu Leu Pro 115 120 125 gct gac cct acc aac aag gat ctt gcc tac gtt gac gat tcg gta aaa 432 Ala Asp Pro Thr Asn Lys Asp Leu Ala Tyr Val Asp Asp Ser Val Lys 130 135 140 ttg tcc gac acc tgg aag gcg gtc gtc gcc ctg aag aag acg ggt aag 480 Leu Ser Asp Thr Trp Lys Ala Val Val Ala Leu Lys Lys Thr Gly Lys 145 150 155 160 acc aag tcg gtt ggt gtt tcg aac ttc agc act cgt ctg gtc gac ttg 528 Thr Lys Ser Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Thr Arg Leu Val Asp Leu 165 170 175 gtt gag gaa gct tcg ggc gaa cgt cct gcg gta aac cag atc gaa gct 576 Val Glu Glu Ala Ser Gly Glu Arg Pro Ala Val Asn Gln Ile Glu Ala 180 185 190 cac ccc ttg ttg caa caa gac gag ttg gtt gct cac cat aag agc aag 624 His Pro Leu Leu Gln Gln Asp Glu Leu Val Ala His His Lys Ser Lys 195 200 205 aac att gtc atc act gct tac agt ccc ttg ggc aac aat gtc gct ggt 672 Asn Ile Val Ile Thr Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Val Ala Gly 210 215 220 aaa cca cct ctg act gag aac ccc ggt att gtg gat gct gct aag cgt 720 Lys Pro Pro Leu Thr Glu Asn Pro Gly Ile Val Asp Ala Ala Lys Arg 225 230 235 240 ttg aac cat act cct gct gct gtg ctc att gct tgg ggt att caa cgc 768 Leu Asn His Thr Pro Ala Ala Val Leu Ile Ala Trp Gly Ile Gln Arg 245 250 255 ggg tac agc gtc ttg gtc aag tca gtt aca ccc tca cgg atc aag agt 816 Gly Tyr Ser Val Leu Val Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Lys Ser 260 265 270 aac ttt gaa cag atc act ctg tct gat gag gaa ttc caa cgg gtt acc 864 Asn Phe Glu Gln Ile Thr Leu Ser Asp Glu Glu Phe Gln Arg Val Thr 275 280 285 aac ctc atc aag gag tac ggt gag agc cgt aac aac gtt cct ttc aat 912 Asn Leu Ile Lys Glu Tyr Gly Glu Ser Arg Asn Asn Val Pro Phe Asn 290 295 300 tac aag cct tcg tgg tcc att gac gtc ttt ggt acc cag gac gag gct 960 Tyr Lys Pro Ser Trp Ser Ile Asp Val Phe Gly Thr Gln Asp Glu Ala 305 310 315 320 aag gct acc cac aag att aac gct taa tgtgctctta tacaaaaagt 1007 Lys Ala Thr His Lys Ile Asn Ala Stop 325 cgtttgaacc tgtaatgtgt gaatgttatc ctcattgttg catcgtctca tcaaaaaaaa 1067 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1121 <210> 4 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on erythrose reductase type III DNA sequ ence <220> <221> unsure <222> 9 <223> n=a or c or g or t <400> 4 cargarctnt tygaycaygg 20 <210> 5 <211> <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on erythrose reductase type III DNA sequ ence <220> <221> unsure <222> 3 <223> n=a or c or g or t <220> <221> unsure <222> 18 <223> n=a or c or g or t <400> 5 tgngcytcna tytgrttnac 20 <210> 6 <211> <212> PRT <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 6 Gln Glu Leu Phe Asp Gln Gly 1 5 <210> 7 <211> <212> PRT <213> Trichosporonoides megachiliensis <400> 7 Val Asn Gln Ile Glu Ala His 1 5

【提出日】平成１４年１月２４日（２００２．１．２
４）

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【符号の説明】レーン１は２４時間培養物の結果を、レーン２は４８時
間培養物の結果を、レーン３は７２時間培養物の結果
を、レーン４は９６時間培養物の結果を示す。

【符号の説明】 EcoR I、Ban I 、BamH Iはそれぞれ制限酵素を示し、括
弧内の数字は５’末端から数えた塩基数を示す。

【符号の説明】 EcoR I、Ban I 、Acc I、Hind III、Sal Iはそれぞれ制
限酵素を示し、括弧内の数字は５’末端から数えた塩基
数を示す。

【符号の説明】ａは、組換えエリスロース還元酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示し、ｂは、同ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンをＰ
ＶＤＦ膜に移行させ、ウェスタンブロットを行った結果
を示す。レーンは分子量マーカー（ｋＤａ）、レーン
は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レー
ンは精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レ
ーンは精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果
を示す。

【符号の説明】ａは、天然エリスロース還元酵素の結果を示し、ｂは、
組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。ａの電気泳
動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還
元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーン
は分子量マーカー（ｋＤａ）、レーンは精製組換えエ
リスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーンは精製組換え
エリスロース還元酵素II型の結果、レーンは精製組換
えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。

【符号の説明】ａは、天然エリスロース還元酵素の結果を示し、ｂは、
組換えエリスロース還元酵素の結果を示す。ａの電気泳
動図下の１、２、３は、それぞれ天然型エリスロース還
元酵素Ｉ型、II型、III型の結果を示し、ｂのレーン
は精製組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーン
は精製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レー
ンは精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を
示す。

【符号の説明】レーンは等電点マーカータンパク質、レーンは精製
組換えエリスロース還元酵素Ｉ型の結果、レーンは精
製組換えエリスロース還元酵素II型の結果、レーンは
精製組換えエリスロース還元酵素III型の結果を示す。

【符号の説明】レーンは分子量マーカー（ｋＤａ）、レーンはS. c
erevisiaeで発現させた精製組換えエリスロース還元酵
素III型、レーンは大腸菌で発現させた精製組換えエ
リスロース還元酵素III型の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 7/18 5/00 Ａ (72)発明者浅羽栄二埼玉県大宮市北袋町１丁目346番地日研化学株式会社大宮研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA08 CA04 CA07 CA09 CA12 CA20 DA06 DA12 EA04 GA11 HA03 HA13 HA14 4B050 CC01 CC05 DD03 EE01 FF03E FF11E FF12E FF14E FF20C GG01 LL02 LL05 4B064 AC05 CA21 CB17 CC01 CD09 DA10 4B065 AA26X AA58X AA58Y AA80X AA87X AB01 AC14 BA02 BA25 BB01 BC03 BC26 BD01 BD14 BD15 BD45 CA28 CA41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
質。（Ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項２記載のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮ
Ａ。（ｂ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列又は同塩基
配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】ストリンジェントな条件が、０．１％Ｓ
ＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６０℃で洗浄
が行なわれる条件である請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであ
る請求項２記載のＤＮＡ。（ｃ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｄ）配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１１９からなる塩基配列又は
同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】ストリンジェントな条件が、０．１％Ｓ
ＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６０℃で洗浄
が行なわれる条件である請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項２〜６のいずれかに記載のＤＮＡ
が、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素III型
が発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項８】請求項７記載の細胞を培地で培養し、エ
リスロース還元酵素III型を培養物中に生成蓄積させ、
該培養物よりエリスロース還元酵素III型を採取するこ
とを特徴とするエリスロース還元酵素III型の製造法。
【請求項９】下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク
質。（Ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１０】下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク
質をコードするＤＮＡ。（Ｃ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｄ）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１１】下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡで
ある請求項１０記載のＤＮＡ。（ｅ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮ
Ａ。（ｆ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列又は同塩基
配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】ストリンジェントな条件が、０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６０℃で洗
浄が行なわれる条件である請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡで
ある請求項１０記載のＤＮＡ。（ｇ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｈ）配列表の配列番号２記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１０７７からなる塩基配列又は
同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】ストリンジェントな条件が、０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６０℃で洗
浄が行なわれる条件である請求項１３記載のＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１０〜１４のいずれかに記載の
ＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素
II型が発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項１６】請求項１５記載の細胞を培地で培養
し、エリスロース還元酵素II型を培養物中に生成蓄積さ
せ、該培養物よりエリスロース還元酵素II型を採取する
ことを特徴とするエリスロース還元酵素II型の製造法。
【請求項１７】下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク
質。（Ｅ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｆ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１８】下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク
質をコードするＤＮＡ。（Ｅ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有する
タンパク質。（Ｆ）配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、エリ
スロース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１９】下記（ｉ）又は（ｊ）に示すＤＮＡで
ある請求項１８記載のＤＮＡ。（ｉ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列を含むＤＮ
Ａ。（ｊ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１−３９９からなる塩基配列又は同塩基
配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２０】ストリンジェントな条件が、０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６０℃で洗
浄が行なわれる条件である請求項１９記載のＤＮＡ。
【請求項２１】下記（ｋ）又は（ｌ）に示すＤＮＡで
ある請求項１８記載のＤＮＡ。（ｋ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｌ）配列表の配列番号３記載の塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号４０８−１１２１からなる塩基配列又は
同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、エリスロース還元
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２２】ストリンジェントな条件が、０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに相当する塩濃度で６０℃で洗
浄が行なわれる条件である請求項２１記載のＤＮＡ。
【請求項２３】請求項１８〜２２のいずれかに記載の
ＤＮＡが、該ＤＮＡがコードするエリスロース還元酵素
Ｉ型が発現可能な形態で導入された細胞。
【請求項２４】請求項２３記載の細胞を培地で培養
し、エリスロース還元酵素Ｉ型を培養物中に生成蓄積さ
せ、該培養物よりエリスロース還元酵素Ｉ型を採取する
ことを特徴とするエリスロース還元酵素Ｉ型の製造法。
【請求項２５】請求項１、９及び１７のいずれかに記
載のエリスロース還元酵素活性を有するタンパク質をＤ
−エリスロースに作用させ、生成するエリスリトールを
採取することを特徴とするエリスリトールの製造法。
【請求項２６】請求項７、１５及び２３のいずれかに
記載の細胞をＤ−エリスロースに作用させ、生成するエ
リスリトールを採取することを特徴とするエリスリトー
ルの製造法。