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Die Erfindung betrifft ein für Cytochrom-C-552-Protein (im folgenden
einfach als C-552 bezeichnet) codierendes Gen, das aus dem hoch thermophilen und
obligat-autotrophen Wasserstoffbakterium Hydrogenobacter thermophilus abgeleitet
ist, und ein Verfahren zur Herstellung von C-552 unter Verwendung des Gens.
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Cytochrom-C tauscht rasch Elektronen mit Oxidoreduktasen, wie
Cytochromoxidasen und Cytochromreduktasen, aus. Diese Elektronenaustauschreaktionen beruhen
auf einer Oxidations-Reduktions-Reaktion des Häm-Eisens. In jüngster Zeit wurden
Versuche unternommen, diese Elektronen-Transfer-Reaktionen von Metallproteinen,
wie Cytochrom-C, anzuwenden und fortzuentwickeln (z. B. J. Romisch et al., Eur.
J. Biochem., 164, 111, 1987). Diese Untersuchungen zielen auf die Entwicklung
neuer Materialien, die biologische Materialien oder Elemente imitieren, nämlich
Biochips. Man erwartet, daß ein solcher Biochip neue Funktionen haben wird, die
von konventionellen Halbleiterelementen nicht erreicht werden könnten. Z. B.
würden Biochips nützlich bei der Herstellung einer katalytischen Elektrode mit
biomolekularen Funktionen sein. Z. Zt. sind Untersuchungen von
Elektronen-Transfer-Systemen, worin Elektronen durch Cytochrom-C-Moleküle übertragen werden, die
auf der Oberfläche einer Metallelektrode in Lösung angeordnet sind, in Gange
(H.A.O. Hill et al., J. Electroanal. Chem., 217, 141, 1987). Man glaubt, daß die
positive Ladung auf einem Lysinrest in der Nachbarschaft des Härn-Cs eine
wichtige Rolle bei diesem Elektronentransfer spielt (M.J. Eddowes, J. Am. Chem.
Soc., 101, 7113, 1979).
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Die Ergebnisse der Aminosäuresequenzanalyse legen nahe, daß C-552 eine
Anzahl von Lysinresten enthält, und daß viele dieser Lysinreste an der Oberfläche
des Moleküls angeordnet sind, da der isoelektrische Punkt von C-552 spezifisch
hoch ist im Vergleich zu anderen Proteinen (Y. Sanbongi et al., J. Bacteriol.,
171, 65, 1989). Diese Eigenschaften von C-552 ermöglichen einen effizienten
Elektronentransfer, welcher
C-552 als Elektrodenelement hoch geeignet macht. Ferner ist C-552 dahingehend
vorteilhaft, daß es in einer hohen Dichte auf der Oberfläche einer Elektrode
akkumuliert werden kann, da es das niedrigste Molekulargewicht unter den
Cytochroms-C so weit berichtet, hat. Ferner ist C-552 unter Erhitzen hoch stabil und
wird nicht bei 120ºC denaturiert, im Gegensatz zu anderen Cytochroms-C, die bei
ca. 80ºC denaturiert werden. Kein bekanntes Cytochrom-C mit Ausnahme von C-552
hat solche erwünschte Eigenschaften (Y. Sanbongi et al., J. Bacteriol., 171, 65,
1989).
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Pferde-Cytochrom-C ist effektiv bei der Linderung myokardialer Infarkt- und
cerebrovaskulärer Erkrankungen, wie cerebraler Blutung und verschiedenen, durch
Gewebesauerstoffmangel verursachten Symptomen, z. B. Carbonmonoxidvergiftung und
dyspnealen Lungenerkrankungen. Man erwartet, daß C-552, das ein niedrigeres
Molekulargewicht und einer höhere Stabilität hat, als ein solches Arzneimittel
effektiver sein kann.
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Man vermutet, daß der Expressionsspiegel von C-552, das ein in der
periplasmatischen Fraktion von Hydrogenobacter thermophilus-Zellen vorkommendes
Protein ist, bemerkenswert hoch ist (Y. Sanbongi et al., J. Bacteriol., 171, 65,
1989). Daher vermutet man, daß der Promotor, Terminator und das Signalpeptid,
die zusammen die Expression von C-552 kontrollieren, hoch effizient sind. Es
wird daher nützlich sein, wenn diese Strukturen entschlüsselt werden.
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C-552 ist ebenfalls nützlich bei der Senkung der Mutagenität von z. B.
Nahrungsprodukten. Es wurde berichtet, daß Nahrungsprodukte, insbesondere
Kaffeegetränke manchmal mutagen sind. Es wurde ebenfalls berichtet, daß eine solche
Mutagenität durch Zugabe einer Peroxidase zu den Nahrungsprodukten vermindert
werden kann (JP-PS 62945/1985). Alle bekannten Peroxidasen sind jedoch hinsichtlich
ihrer Hitzebeständigkeit ungenügend, und keine bekannte Peroxidase kann ihre
Aktivität bei einer so hohen Temperatur wie 80ºC oder darüber für einen Zeitraum
von über 24 Stunden aufrechterhalten. Daher treten Probleme bei der praktischen
Anwendung solcher bekannter Peroxidasen bei der Herstellung von Kaffeegetränken
auf.
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Andererseits weiß man, daß Cytochrom-C eine Peroxidaseaktivität besitzt.
Wie oben beschrieben, ist das erfindungsgemäße Cytochrom-C aus dem
Wasserstoffbakterium hoch stabil unter Erhitzung und kann seine Peroxidaseaktivität bei
einer hohen Temperatur für einen verlängerten Zeitraum aufrechterhalten. Es ist
daher außerordentlich nützlich, das erfindungsgemäße Cytochrom-C einzusetzen, um
die Mutagenität von Kaffeegetränken zu eliminieren.
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Man weiß, daß Wasserstoffperoxid cytotoxisch und carcinogen ist.
Erfindungsgemäßes Cytochrom-C kann zur Auflösung von Wasserstoffperoxid unter
strikteren Bedingungen und für einen längeren Zeitraum verwendet werden als im
Vergleich
zu einer konventionellen Peroxidase. Daher können die cytotoxischen und
carcinogenen Wirkungen von Wasserstoffperoxid eliminiert werden.
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Wie oben beschrieben ist C-552 ein Protein mit hervorragenden
Eigenschaften. Hydrogenobacter thermophilus jedoch, das ein obligat-autotrophes
Wasserstoff-verwertendes Bakterium ist, benötigt Kulturbedingungen bei ca. 70ºC unter
Einblasen einer Gasmischung, die Wasserstoff, Sauerstoff und Carbondioxid
enthält, in das Medium. Die Kulturtemperatur von ca. 70ºC erhöht die
Produktionskesten. Zusätzlich metabolisiert dieses Bakterium keine organischen Materialien,
erfordert jedoch Wasserstoff, welcher leicht entzündlich ist. Daher kann die
Kultur dieses Bakteriums im großen Maßstab gefährlich sein. Andererseits
ermöglicht die Expression von C-552 in einem Wirt, der leichter kultiviert werden
kann, die Produktion von nützlichem C-552 im großen Maßstab, falls das für C-552
kultivierende Gen erhalten werden könnte und durch DNA-rekombinante Techniken
aufbereitet wird. Wie oben beschrieben ist die Aminosäuresequenz von C-552
bereits bekannt. Es ist jedoch erforderlich, das C-552-Gen zu gewinnen und die
Nucleotidsequenz davon zu bestimmen, um die folgenden Probleme zu lösen.
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(1) Ein Cytochrom-C-Gen eines Procaryonten enthält eine Sequenz, die für
das Cytochrom-C-Protein codiert, als auch eine Codesequenz eines Signalpeptids,
das eine wichtige Rolle während der Biosynthese des Cytochrom-Cs spielt. Es ist
daher unmöglich, die Sequenz dieses Signalpeptids aufgrund der Aminosäuresequenz
von C-552 zu bestimmen. Es ist daher notwendig, die Nucleotidsequenz dieses Gens
zu entschlüsseln.
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(2) Die Ergebnisse einer Aminosäuresequenzanalyse eines Proteins enthält
oft Fehler. Daher kann die exakte Aminosäurestruktur nicht festgelegt werden,
bis die Nucleotidsequenz des C-552-Gens spezifiziert ist.
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(3) Obwohl die Nucleotidsequenz eines Gens in einigem Umfang aufgrund
der Aminosäuresequenz abgeschätzt werden kann, ist es unmöglich die exakte
Sequenz des Gens aufgrund der Codon-Degeneration zu bestimmen. Daher wird eine
synthetische DNA-Sequenz konsequenter Weise in vielen Fällen nicht effektiv
exprimiert.
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Die Erfindung stellt ein C-552-Gen, Plasmide die das Gen enthalten,
rekombinante, durch das Plasmid transformierte Wirtszellen und ein Verfahren zur
Herstellung von C-552 unter Verwendung der Wirtszellen zur Verfügung.
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C-552 wird in vivo zusammen mit einem Signalpeptid synthetisiert.
Erfindungsgemäß ist es möglich, das Protein in einem Wirt, wie Hefe, der für Kultur
in großem Maßstab geeignet ist, zu kultivieren, wobei das Signalpeptid
vorteilhaft eingesetzt werden kann. Man glaubt, daß C-552 in der Zelle in einem
signifikant hohen Spiegel exprimiert wird, und es ist daher sinnvoll, die Strukturen
des Promotor- und Terminatorregionen von C-552 zu bestimmen, die für die
Expression bei einem solch hohen Spiegel verantwortlich sind. Das Signalpeptid und der
Promotor sind dahingehend besonders charakteristisch, daß sie auch bei einer
hohen Temperatur normal funktionieren können. Sie sind daher geeignet z. B. bei
der Expression eines Proteins in einem Organismus, der bei einer hohen
Temperatur wächst.
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Die Aminosäuresequenzen von Cytochrom-C von Procaryonten sind weniger
homolog mit denen von Cytochromen-C aus Eucaryonten und hoch verschieden (Dickerson,
Scientific American, 242, 137, 1980). Man glaubt, daß die Bedingungen, unter
denen C-552, nämlich ein typisches Cytochrom-C von Procaryonten, exprimiert
wird, ebenfalls die Expression anderer procaryontischer Cytochroms-C erlauben.
Ein Beispiel solcher Cytochroms-C ist das Cytochrom-C3 eines
Sulfat-reduzierenden Bakteriums.
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Um diese Aufgaben wie oben beschrieben zu lösen, haben die Erfinder die
Klonierung und die Strukturanalyse des C-552-Gens und die Expression des Gens in
Hefe untersucht.
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Fig. 1 zeigt die Sequenzen synthetischer Sonden und Screenen des C-552-
Gens, wie auch der entsprechenden Aminosäuresequenz und der möglichen Codons.
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Fig. 2A-1 und Fig. 2A-2 zeigen zusammen die Nucleotidsequenz des C-552-
Gens einschließlich der Promotorsequenz, der Signalsequenz und der
Terminatorsequenz.
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Fig. 2B zeigt die Nucleotidsequenz der Promotorregion und
des C-552-Gens, worin die -35, -10 und SD-Sequenzen unterstrichen sind.
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Fig. 2C zeigt die Signalsequenz von C-552 und die dafür
codierende Nucleotidsequenz.
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Fig. 2D zeigt die Translationsregion von C-552 und die
dafür codierende Nucleotidsequenz.
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Fig. 2E zeigt die Nucleotidsequenz des Terminators von C-
552, worin ein Palindorm unterstrichen ist.
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Fig. 3 erläutert kurz die Herstellung von Plasmiden, die
bei der Expression von C-552 in Hefe eingesetzt werden.
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Fig. 4 ist eine grafische Darstellung des Wachstums von
Hefen, die C-552-Gen unter Verwendung von Milchsäure als Kohlenstoffquelle
exprimieren.
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Fig. 5 erläutert kurz die Herstellung von Plasmiden, die
bei der Expression von C-552 in Eschericha coli eingesetzt werden.
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Fig. 6A und 6B geben Photographien wieder, die die Ergebnisse des Nachweis
von in Hefe und E. coli exprimiertem C-552 unter Verwendung eines Anti-C-552-
Antikörpers zeigen.
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Fig. 7A und 7B zeigen das Apsorptionsspektrum von Cytochrom-C-552 vom
Wild-Typ und rekombinantes Cytochrom-C-552 in reduzierter Form.
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Fig. 8A, 8B und 8C zeigen die CD-Spektren von Cytochrom-C-552 vom Wild-
Typ, rekombinantes Cytochrom-C-552 und Pferde-Herz-Cytochrom-C.
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Die Erfinder haben das C-552-Gen durch rekombinante DNA-Techniken isoliert
und die Nucleotidsequenzen des Strukturgens, der Signalsequenz des Promotors und
des Terminators ermittelt.
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Demnach stellt die Erfindung eine für Hydrogenobacter thermophilus-C-552
codierende DNA-Sequenz, die Signalsequenz dafür, die Sequenzen für den Promotor
und den Terminator, Plasmide, die diese enthalten, und durch die Plasmide
transformierte Wirtszellen zur Verfügung.
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Die Einzelheiten der Sequenzen werden in obigen Figuren und in den
folgenden Ansprüchen wiedergegeben. Dort wo der Begriff "eine Sequenz wird im
wesentlichen durch die Formel wiedergegeben" in den Ansprüchen verwendet wird, so
bedeutet dies, daß sich die fragliche Sequenz von der spezifizierten Sequenz durch
eine oder mehrere Additionen, Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren
oder Nucleotiden, die manchmal in der Natur stattfinden, jedoch keinen
signifikanten Effekt auf den Phenotyp des Expressionsprodukt zeigen, unterscheidet.
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Das für das C-552-Protein-codierende Gen kann z. B. nach dem folgenden
Verfahren erhalten werden. Es wurden zwei Oligonucleotide auf Grundlage der
Nucleotidsequenz des Gens, die von der früher berichteten Aminosäuresequenz des
Proteins abgeleitet wurde, synthetisiert. Die so erhaltenen Oligonucleotide wurden
als Sonden beim anschließenden Klonen des C-552-Gens verwendet. Aus
Hydrogenobacter thermophilus-Zellen erhaltene chromosomale DNA wurde mit geeigneten
Restriktionsenzymen verdaut, einem Southern-Blotting unterzogen und anschließend
unter Verwendung der synthetischen Oligonucleotide hybridisiert. Als Ergebnis
der Hybridisierung zeigten die Sonden eine starke Hybridisierung mit einem DNA-
Fragment von 2,5 kb, das durch Verdau der chromosomalen DNA mit dem
Restriktionsenzym HindIII erhalten wurde. Dieses Fragment wurde gesammelt und in die
HindIII-Schnittstelle von pBR327 unter Transformation von Escherichia coli
subkloniert. Ein das Fragment-enthaltende Plasmid wurde aus den Transformanten
erhalten. Dieses Plasmid wurde mit den oben erwähnten Sonden auf die gleiche Weise
wie oben beschrieben hybridisiert. Es wurde eine Transformante erhalten, die
eine DNA enthielt, welche zur Hybridierung mit den Sonden fähig war.
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Diese Transformante hatte ein Plasmid, das die DNA von 2,5 kb enthielt, die
mit HindIII ausgeschnitten werden konnte. Behandlung dieses Plasmids mit
Restriktionsenzymen und anschließendes Southern-Blotting des verdauten Produktes
wurden wiederholt. Im Ergebnis hybridisierten die beiden synthetischen Sonden
mit einem DNA-Fragment von 1,1 kb, das von AccI und PstI getrennt wurde. Das
Fragment wurde zwischen PstI- und AccI-Schnittstellen des handelsüblichen, von
Takaro Shuzo erhältlichen Klonierungs-Plasmids pUC19, subkloniert. Das erhaltene
Plasmid wurde als Matrize verwendet und die Nucleotidsequenzen und die
Verwendung der synthetischen Nucleotide als Primer bestimmt. Auf diese Weise wurden
die Nucleotidsequenzen der codierenden Region, der Signalsequenz und der
Promotor- und Terminatorregionen von C-552 bestimmt (Fig. 2A bis 2E).
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Anschließend wurde die Expression von C-552 in Hefe untersucht. Eine SalI-
Schnittstelle wurde unmittelbar nach dem Abbruch-Codon (TAA bei 472 bis 474 in
Fig. 2A) des C-552-Gens durch site-specific Mutation hergestellt, um sie in
einen Vektor für die Expression einzuführen. Ferner wurde eine
EcoRI-Schnittstelle unmittelbar vor dem Start-codon (ATG bei 178 bis 180 in Fig. 2A) oder
gegebenenfalls eine EcoRI-Schnittstelle hergestellt und es wurde ein Start-Codon
ATG auf die gleiche Weise unmittelbar nach der Signalsequenz hergestellt (von A
bei 178 bis c bei 231 in Fig. 2A). Eine dieser so hergestellten beiden
DNA-Mutanten hatte eine codierende Region von C-552 zwischen den beiden
Restriktionsschnittstellen, die wie oben hergestellt wurden, während die andere die Region
zusammen mit der Signalsequenz enthielt. Dann wurden die aus diesen beiden DNAs
durch EcoRI- und SalI-Verdau isolierten DNA-Fragmente an einen Hefe-Expressions-
Vektor gebunden. Wenn die so erhaltenen Plasmide in einen Hefestamm XS-30-2BΔ
CYC1 eingeführt wurden, dem das Iso-1-Cytochrom-C-Gen CYC1 fehlt, und daher
nicht auch Milchsäure als Kohlenstoffquelle wachsen kann, konnte die mit einer
jeder dieser DNA-Mutanten transformierte Hefe auf Milchsäure als
Kohlenstoffquelle wachsen. Die Ergebnisse legen nahe, daß das C-552 anstelle des Iso-1-
Cytochrom-C-Elektronentransfersystems der Hefe funktionierte. In anderen Worten,
das C-552-tragende Häm-C wurde in der Hefe produziert. Es wurde nicht erwartet,
daß die Hefe C-552 exprimieren würde, da es ein procaryontisches Protein ist,
sich im Molekulargewicht unterscheidet, und nur geringe Homologie mit den
Aminosäuresequenzen zeigt. Man nimmt daher an, daß die Hefe nicht nur C-552,
sondern auch jedes Cytochrom-C von Procaryonten wie auch Eucaryonten, z. B.
Cytochrom-C3 und Cytochrom-C2 exprimieren kann.
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Andererseits konnte die für C-552 codierende DNA an einen E.
coli-Expressionsvektor gebunden werden und zur Transformation eines E. coli-Stammes
verwendet werden. Ein Klon, der die C-552-DNA enthielt, dem jedoch die Signalsequenz
fehlte, wurde unter den Transformanten gefunden, der C-552 exprimierte. Das
erhaltene rekominante C-552 war mit dem Wild-Typ C-552 von Hydrogenobacter
thermophilus hinsichtlich seiner hervorragenden Eigenschaften vergleichbar.
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Daher wird die von den Erfindern bestimmte Verwendung der Nucleotidsequenz
die Produktion rekombinanten C-552 oder Produktion von Proteinen unter
Hochtemperaturbedingungen unter Verwendung des Promotors ermöglichen. Ferner erlaubt
die Kultur der rekombinanten Hefe die Produktion einer quantitativen Menge von
C-552 mit hervorragenden Eigenschaften. Im folgenden wird die Erfindung in
Einzelheiten unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben. Sofern nicht anders
angegeben, wurde jedes Experiment gemäß den Maßnahmen wie in "Molecular Cloning"
(Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982) beschrieben, durchgeführt.
BEISPIEL 1: Klonieren des C-552-Gens von Hydrogenobacter thermophilus
(1) Synthese der Nucleotidsonden
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Oligonucleotide wurden aufgrund der 7. bis 15. Aminosäuresequenz (Gln-Lys-
Gly-Cys-Met-Ala-Cys-His-Asp-) in der Aminosäuresequenz von C-552, die bereits
bestimmt wurde, synthetisiert. Daher wurden zwei Gruppen von 17-mer
Oligonucleotiden, wie in Fig. 1 gezeigt, d. h., Sonde 1 (5'TGTATGGCNTGTCATGA3') und Sonde 2
(5'CAGAAGGGNTAGTATGGC3') auf einem DNA-Synthesizer System-1 (Beckman)
synthetisiert. N bedeutet eine Mischung von G, A, T und C. Die so erhaltenen Nucleotide
wurden nach dem von Beckman empfohlenen Verfahren gereinigt.
(2) Herstellung von chromosomaler DNA von Hydrogenobacter thermophilus
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Die chromosomale DNA von Hydrogenobacter thermophilus wurde auf die
folgende Weise hergestellt. 2 g Zellen aus einer Kultur wurden in 20 ml
STE-Pufferlösung (20 % Saccharose, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert, und es
wurden 80 mg Lysozym hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC 10 Minuten
gehalten. Anschließend wurde Proteinase K unter Einstellung einer Endkonzentration
von 50 ug/ml zugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten bei 37ºC belassen.
Anschließend wurden 10 % SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben,
und zusätzlich Proteinase K in einer Konzentration von 100 ug/ml. Die Mischung
wurde bei 37ºC 30 Minuten belassen. Ein zusätzlicher Anteil von 10 % SDS wurde
unter Einstellung einer Endkonzentration von 2 % zugegeben, und die Mischung
wurde 60 Minuten bei 50ºC gehalten.
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Zur so erhaltenen Mischung wurde eine äquivalente Menge von
Phenol/Chloroform (Maniatis, Molecular cloning) zugegeben, und die Mischung wurde
langsam gerührt und zentrifugiert und anschließend der Überstand gesammelt.
Diese Verfahren wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurden 2 Volumenanteile
Ethanol zugegeben, die Mischung wurde zentrifugiert und die präzipitierte DNA
wurde gesammelt.
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Die DNA wurde in 10 ml einer TE-Pufferlösung (10 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM
EDTA) suspendiert und RNase wurde unter Einstellung einer Endkonzentration von
20 ug/ml zugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC 30 Minuten gehalten und gegen
die TE-Pufferlösung dialysiert. Die so erhaltene chromosomale DNA-Lösung wurde
in den folgenden Tests verwendet.
(3) Southern-Hybridisierung
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Southern-Hybridisierung wurde nach üblicher Weise durchgeführt. Das oben
erhaltene chromosomale DNA-Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII
verdaut und auf Agarosegel elektrophoretisiert. Anschließend wurde das Gel auf eine
Nylonmembran-Hybond-N (Amersham) geblottet. Der Blot wurde dann mit der Sonde 1
oder 2, die mit {γ-³²P}ATP markiert war, hybridisiert. Die hybridisierte Membran
wurde dann auf einen Film unter Herstellung eines Autoradiogramms aufgelegt.
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Die Ergebnisse des Autoradiogramms legten nahe, daß beide Sonden spezifisch
mit einem Fragment von 2,5 kb hybridisierten. Auf diese Weise wurde gefunden,
daß das C-552-Gen in diesem DNA-Fragment vorlag.
(4) Subklonieren
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Eine Agarosegelfraktion, die das 2,5-kb-HindIII-Fragment enthielt, wurde
ausgeschnitten und die DNA hieraus in üblicher Weise gewonnen.
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Andererseits wurde pBR327, das weit verbreitet als Vektor für Escherichia
coli verwendet wird, mit HindIII verdaut, mit alkalischer Phosphotase auf
übliche Weise behandelt und anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert. Dieses
DNA-Fragment wurde an das obige 2,5-kb-DNA-Fragment mit einer Ligase nach
üblicher Weise unter Transformation des Escherichia coli HB101-Stammes geknüpft. Die
so erhaltenen 159 Transformanten wurden durch Kolonie-Hybridisierung unter
Verwendung der oben erwähnten Sonden gescreent. Auf diese Weise wurden 11 positive
Klone erhalten.
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Jeder dieser 11 positiven Klone wurde in einem Volumen von 2 ml kultiviert,
und Plasmid-DNA wurde auf übliche Weise extrahiert. Anschließend wurde diese DNA
mit HindIII verdaut und einer Southern-Hybridisierung unterworfen. Als Ergebnis
wurde ein Plasmid erhalten, das zur Hybridisierung mit den zwei Sonden in der
Lage war. Dieses Plasmid wurde als pT135 bezeichnet. Verdau von pT135 mit
geeigneten Restriktionsenzymen und Southern-Hybridisierung wurde wiederholt. Es wurde
gefunden, daß ein schließlich erhaltenes AccI-PstI-Fragment von 1,1 kb mit
beiden Sonden hybridisierte.
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Dieses DNA-Fragment wurde mit pUC19, das zuvor mit AccI und PstI verdaut
wurde, ligatisiert und zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet.
Das erhaltene Plasmid wurde als pUHTC135 bezeichnet.
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Das mit dem Plasmid transformierte Escherichia coli wurde Escherichia coli
SAM 1306 genannt. Es wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science and Technology als FERM p-10546 hinterlegt. Diese wurde in
einer Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag mit der Hinterlegungsnummer FERM BP
2748 am 1. Februar 1990 umgewandelt.
(5) Aufklärung der Nucleotidsequenz
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Das Plasmid pUHTC135 wurde auf übliche Weise vervielfältigt. Dann wurde das
doppelsträngige Dideoxysequenzverfahren unter Verwendung dieses Plasmids als
Matrize und Sonde 2 beim Screenen und dem reversen Primer angewandt (Takara
Shuzo, Japan) um die Nucleotidsequenz von C-552 zu bestimmen. Das
doppelsträngige Dideoxysequenzverfahren wird in Einzelheiten z. B. in "Zoku Seikagaku
Jikken Koza: Idenshi Kenkyu Ho I" (Takanami et al., Tokyo Kagaku Dojin)
beschrieben. Die so bestimmte Nucleotidsequenz (Fig. 2A) enthielt eine für das
Signalpeptid von C-552, die Promotorregion und die Terminatorreagion codierende
Region.
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Die codierende Region einschließlich der Signalregion codierte für 98
Aminosäuren im Bereich vom Start-Codon ATG (Fig. 2A, 178 bis 180), wo die
Translation beginnt, bis zum Abbruch-Codon TAA (Fig. 2A, 472 bis 474), wo die
Translation beendet wird. Die Aminosäuresequenz von C-552, die zuvor bekannt war,
startete von dem 19ten Asparagin (dargestellt durch N in Fig. 2A). Die Sequenz, die
diesem Asparagin folgt, stimmt komplett mit der Sequenz C-552 überein (Fig. 2D).
Die Aminosäuresequenz vom Aminoterminus bis zur 18ten Aminosäure war eine, die
nicht in C-552 enthalten ist. Berücksichtigt man, daß
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C-552 in der zellulären priplasmatischen Fraktion auftritt, so nimmt man
an, daß diese N-terminale Sequenz eine Signalpeptidfunktion ausübt zur
Transferierung von C-552 in die periplasmatische Fraktion (Fig. 2C). Es ist
kennzeichnend, daß die Translationsregion reich an GC ist.
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Die 5'-nicht-codierende Region enthielt Sequenzen entsprechend der
-35-Region, -10-Region und der SD-Region, die als Promotor für Procaryonten bekannt
sind. D. h., dieser Teil ist der Promotor von C-552 (Fig. 2B). Ferner enthielt
die 3'-nicht-codierende Region eine Palindromsequenz CAGCGGATTACATCTG, von der
man annimmt, daß sie der Terminator ist, der am Abbruch der Transkription von C-
552 (Fig. 2E) beteiligt ist.
BEISPIEL 2
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Das in Beispiel 1 erhaltene C-552-Gen wurde in Hefe exprimiert. JP-PS
37291/1989 gibt die Einzelheiten der Expression eines heterologen Cytochroms-C
in Hefe wieder. Die Expression von C-552 wurde nach einem ähnlichen Verfahren
durchgeführt. "Site-specific-Mutagenesis" wurde mit einem handelsüblich
erhältlichen
Mutagenese-Kit (BIO-RAD) durchgeführt. Das verwendete synthetische
Nucleotid wurde mit einem DNA-Synthesizer 390A (Applied Biosystems) hergestellt.
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Ein vom Plasmid pUHTC135 mit HindIII- und XbaI-Verdau abgetrenntes DNA-
Fragment von 1,1 kb wurde mit HindIII und XbaI verdautes Plasmid M13m19
ligatisiert und zur Transformation von Escherichia coli MV1190 verwendet. Eine
einzelsträngige DNA wurde aus der erhaltenen Transformante präpariert, die ein weißes
Plaque bildete. Ein synthetisches Nucleotid A249 (5'CGCCCCGTCGACTTACTTTAT3')
wurde mit der einzelsträngigen DNA gepaart und es wurde eine ortsspezifische
Mutation unter Verwendung eines von BIO-RAD Co., erhältlichen Mutagenese-Kits
induziert, wodurch eine SalI-Restriktionsschnittstelle in der 3'-Seite des
Abbruch-Codons des C-552-Gens gebildet wurde.
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Anschließend wurde eine Mutation unter Verwendung der synthetischen
Nucleotide A237 (5'TGTTCATTCATGAATTCGGCAAAG3') oder A238 (5'TCTTCATGAATTCTACCTC3') als
Primer unter Verwendung der einzelsträngigen DNA des Rekominanten M13-Phagen als
Matrize induziert. Die Mutation durch A237 zielte auf die Bereitstellung einer
EcoRI-Schnittstelle unmittelbar nach dem Signalpeptid von C-552 unter
gleichzeitiger Einfügung von ATG, d. h. einem Start-Codon. Die die Mutation tragende
rekombinante doppelsträngige M13 DNA wurde als M13-12 bezeichnet. Die Mutation
durch A238 zielt auf die Bereitstellung einer EcoRI-Schnittstelle unmittelbar
vor dem Start-Codon ATG von C-552. Die die Mutation tragende recombinante
doppelsträngige M13 DNA wurde als M13-11 bezeichnet. Die Sequenz des eingefügten
Teils einer jeden DNA wurde auf üblicher Weise bestimmt und es wurde bestätigte,
daß die erwartete Mutation aufgetreten war. Ferner wurde bestätigt, daß sich die
Sequenz des C-552-Gens nicht verändert hatte.
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pYHCC101 (JP-OS 37291/1989) ist ein Shuttle-Vektor zwischen der Hefe und
der Escherichia coli wie auch ein Expressionsvektor durch Hefe. Dieses Plasmid
wurde ursprünglich unter inländischen Bedingungen unter der Hinterlegungsnummer
FERM p-9475 hinterlegt, wobei die Hinterlegung anschließend in eine gemäß
Budapester Vertrag gemäß der Hinterlegungsnummer FERM BP-2767 am 23. Februar 1990
umgewandelt wurde. In diesem Plasmid wird ein humanes Cytochrom-C-Gen durch
Hefe-Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(GPD)-Promotor transkribiert. Das
folgende Verfahren wurde durchgeführt, um das C-552-Gen anstelle des humanen
Cytochrom-C-Gens einzuführen, um so die Transkription und Expression des C-552-
Gens in der Hefe zu ermöglichen. Die C-552-Gen-enthaltenden DNA-Fragmente, die
durch Verdau von M13-11 und M13-12 mit EcoRI und SalI erhalten wurden, wurden
jeweils mit einem DNA-Fragment von ca. 8 kb, erhalten durch Verdau von pYHCC101
mit EcoRI und SalI ligatisiert und in Escherichia coli HB101 transformiert. Die
so erhaltenen Plasmide wurden als pYHTC11 und pYHTC12 bezeichnet. Obwohl beide
Plasmide das C-552-Gen enthielten, enthielt das erste eine Signalsequenz im
Gegensatz zum letzteren. Fig. 3 beschreibt das Verfahren zur Herstellung dieser
Plasmide.
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Der Hefestamm XS-30-2BΔCYC1 (Matα, trp1, his3, ura3, leu2, cycl::LEU2)
wurde mit den obigen beiden Plasmiden transformiert. Anschließend wurde das
Wachstum einer Transformante unter Fähigkeit zur Tryptophansynthese im Vergleich
zu XS-30-2BΔCYC1 in einem YNEL-Medium (0,67 % Difco-Hefe-Stickstoffbase, 0,05 %
Difco-Hefe-Extrakt, 2 % Natriumlactat) das die notwendigen Nährstoffe enthielt
(Histidin, Uracil und Tryptophan, falls erforderlich) verglichen. D. h., es
wurde jeder Stamm in einem YNEL-Medium, worin Natriumlactat im YNEL-Medium durch
2 % Glukose ersetzt war, vorkultiviert und in das YNEL-Medium mit einer Dichte
von 1 % inokuliert, und es wurde das Wachstum und die Absorption bei 660 nm
überwacht. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Da dem XS-30-2BΔCYC1 das CYC1
fehlte, welches für Iso-1-Cytochrom-C, ein am Elektronentransfersytem
beteiligtes Protein, fehlte, konnte es keine Milchsäure verwerten (eine
nicht-fermentative Kohlenstoffquelle) und konnte daher im YNEL-Medium nicht wachsen. Die mit
pYHTC11 oder pYHTC12 transformierten Stämme verwerten jedoch Milchsäure und
wuchsen, wie in Fig. 4 gezeigt. Diese Fakten weisen darauf hin, daß C-552 (ein
heterologes Protein) in der Hefe exprimiert wurde und als Komponente des
Elektronentransfersystems funktionierte. Demnach kann C-552 aus Hefezellen durch
Kultur der rekombinanten Hefe erhalten werden.
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Anschließend wurden die Transformanten XS-30-2BΔCYC1 (pYHTCC11) und XS-30-
2BΔCYC1 (pYHTC12) kultiviert. Sie wurden in 400 ml Burkholder-Medium
(Burkholder, Am. J. Bot., 30, 206, 1943), enthaltend 2 % Glukose und 1,5 %
Natriumacatat als Kohlenstoffquellen, unter intensiven Rühren bei 30ºC kultiviert.
Zum Vergleich wurden unter denselben Bedingungen auch XS-30-2B und XS-30-2BΔCYC1
kultiviert. Nach Gewinnung der Zellen wurde jede Transformante in 2 ml Wasser
und 1 ml Ethylacetat nach einem Verfahren, berichtet von Sherman et al. (Sherman
et al., J. Biol. Chem., 243, 5446, 1968) suspendiert und bei Raumtemperatur über
Nacht geschüttelt. Die Suspension wurde anschließend zentrifugiert und die
wäßrige Phase gesammelt. Der Cytochromgehalt und der Proteingehalt dieser Fraktion
wurden bestimmt. Das Cytochrom-C wurde durch Messung des Absorptionsspektrums im
reduzierten Zustand mit einem Spektralphotometer (Hitachi 220A) und auf Basis
des molekularen Extrinktionskoeffizienten bei 550 nm (27/mM) bestimmt.
Andererseits wurde der Proteingehalt einem BCA-Protein-Bestimmungs-Kit (PIERCE)
gemessen. Der Cytochrom-C-Gehalt in der Probe von XS-30-2BΔCYC1 war 0,075 nmol/mg
Protein, während der mit pYHTC11 transformierte Stamm einen Gehalt von
0,48 nmol/mg Protein ergab, und der mit pYHTC12 transformierte Stamm ergab einen
Gehalt von 0,40 nmol/mg Protein. Da jede der aus pYHTC11 und pYHTC12 erhaltenen
Transformanten einen höheren Cytochrom-C-Gehalt zeigte, könnte C-552 hierin
exprimiert worden sein.
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Dann wurde ein Ethylacetatextrakt von einer jeden der obigen Proben einer
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen und anschließend wurde ein
Western-Blotting durchgeführt. Dann wurde die Expression von C-552 durch
Reaktion mit einem Antikörper gegen C-552 aus dem Wasserstoffbakterium geprüft.
Anschließend verfuhr man in üblicher Weise. Siehe z. B. Imahori et al. ("Hoku
Seikagaku Jikken Koza: Tanpakushitsu no Kagaku", Tokoy Kagaku Dojin, 1987). Es
wurde gefunden, daß der Extrakt aus der Transformante von pYHTC12 eine Bande
ergab, die mit Anti-C-552 reagierte. Das Molekulargewicht dieser Bande stimmte
mit dem vom Wild-Typ-C-552 überein.
BEISPIEL 3: Expression von Cytochrom-C-Gen in Escherichia coli
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Ein das C-552-Gen enthaltenes DNA-Fragment, erhalten durch Verdau von
pYHTC11 oder pYHTC12 mit EcoRI und SalI wurde mit einem handelsüblich
erhältlichen Expressionsvektor für Escherichia coli, pKK223-3 (Pharmacia) ligatisiert,
welcher mit EcoRI und SalI verdaut worden war. In den erhaltenen Plasmiden wurde
das C-552-Gen durch den Tac-Promotor von Escherichia coli kontrolliert. Fig. 5
illustriert die Konstruktion dieser Plasmide. Das Plasmid auf pYHTC11 wurde als
pKHC11 bezeichnet, während das aus pYHTC12 als pKHC12 bezeichnet wurde.
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Ferner wurde nach einem das C-552-Gen enthaltende Fragment aus
DNA-Fragmenten, die durch Verdau von pKHC12 mit BamHI und ScaI erhalten wurden, gescreent.
Dieses Fragment wurde in pUC118 (Takara Shuzo), verdaut mit BamHI und HincII,
ligatisiert. Das so gebildete Plasmid wurde als pUK812 bezeichnet. Bei der
Konstruktion dieser Plasmide, wurde JM109 als Escherichia coli-Wirt verwendet.
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2-ml-Kulturen einer jeder Transformanten JP109 (pKHC11), JM109 (pKKHC12)
und JM109 (pUK812) wurden in einem L-Medium hergestellt und anschließend wurde
1 ml Aliquot in 1,2 l eines Mediums enthaltend Nitrat (1 % Glukose, 0,08 %
Natriumnitrat, 50 mM Mononatriumcarbonat, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0,7 %
Monokaliumphosphat, 0,05 % Trinatriumcitrat, 0,1 % Ammoniumsulfat, 1 ug/ml Thiamin,
12 uM Ammoniummolybdat, 1 uM Selensäure, 12 mM Eisencitrat, 0,5 % Bactopepton,
pH 7,0) inokuliert, und stationär bei 37ºC 24 Stunden kultiviert. Während dieser
Kultur wurde, falls erforderlich, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoxid (IPTG) zur
Induktion der Expression in einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Nach
Abschluß der Kultur wurden die Zellen gesammelt und dem folgenden Verfahren
unterworfen.
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Die Zellen wurden homogenisiert und einer
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen, worauf sich Western-Blotting anschloß. C-552 auf dem Blot wurde
unter Verwendung von Anti-C-552-Antikörper nachgewiesen. Fig. 6 zeigt die
Ergebnisse. JM109 (pKHC12, +IPTG) zeigten von den geprüften Transformanten JM109,
JM109 (pKHC11, -IPTG), JM109 (pKHC11, +IPTG), JM109 (pKHC12, -IPTG) und JM109
(pKHC12, +IPTG) als einzige eine spezifische Bande an der gleichen Stelle wie
die des C-552 vom Wild-Typ. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das C-552-Protein
in Escherichia coli exprimiert wurde. Es wurde unerwartet festgestellt, daß die
Transformanten aus pKHC11, die das Gen einschließlich der codierenden Region für
das Signalpeptid von C-552 enthielten, nicht mit dem obigen Antikörper
reagierten, während die Transformanten aus pKHC12, die ein Gen ohne jedes Signalpeptid
enthielten, als einzige die Expression zeigten. Ferner wurden die Zellen von
JM109 (pKHC12, +IPTG) fraktioniert, und C-552 in den Zellen lokalisiert. C-552
wurde im Cytoplasma gefunden.
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Um den Expressionsspiegel von C-552 zu überprüfen, wurden die auf die obige
Weise kultivierten Zellen in einer French-Presse aufgebrochen, und die
Protein- und Cytochrom-C-Spiegel in der löslichen Fraktion gemessen. Der Gehalt an C-552
in JM109 (pKHC12, +IPTG) und JM109 (pUK812, +IPTG) belief sich auf ca. 0,4 % des
Gesamtproteingehalts.
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Das rekombinante C-552 wurde anschließend aus JM109 (pUK812, +IPTG) Zellen,
nach einem bekannten Verfahren (Y. Sanbongi et al., J. Bacteriol., 171, 65,
1989) isoliert.
BEISPIEL 4: Eigenschaften des rekombinanten Cytochroms-C-552
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Das Absorptionsspektrum, die Hitzestabilität und die enzymologischen
Eigenschaften des gereinigten C-552 stimmt mit denen vom Wild-Typ überein. Im
folgenden werden die Eigenschaften des gereinigten C-552 beschrieben.
EIGENSCHAFTEN VON REKOMBINANTEN CYTOCRHOM-C-552
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Fig. 7 zeigt den Vergleich der Absorptionsspektren des rekombinanten
Cytochrom-C-552 im reduzierten Zustand das so gereinigt wurde, mit dem des Wild-Typ-
Cytochrom-C-552. Wie aus Fig. 7 hervorgeht, stimmten die beiden
Absorptionsspektren miteinander überein. Man weiß sehr gut, daß das Absorptionsspektrum von
Cytochrom-C die höhere Struktur des Moleküls wiederspiegelt. Daher hatte das
rekombinante Cytochrom-C-552 die gleiche Struktur wie das Cytochrom-C-552 vom
Wild-Typ, obwohl das erstere einen Methioninrest in dem Aminoende trug.
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Ferner wurde der Zirkulardichoismus (DC) des rekombinanten Cytochrom-C-552
bestimmt, um seine Struktur zu bestimmen. Die Bestimmung des CDs ermöglicht die
Abschätzung der Sekonderstruktur eines Proteinmoleküls. Cytochrom-C-552 wurde in
10 mM KH&sub2;PO&sub4;-NaOH (pH 7,0) unter Einstellung einer Konzentration von 50 ug/ml
gelöst. Dann wurde das CD-Spektrum bei 210 bis 250 nm mit einem automatisch
aufzeichnenden Spektralpolarimeter JASCO Modell J-20 (Nippon Bunko, Japan)
gemessen.
Getrennt davon wurde in Teil der Cytochrom-C-Lösung in einem Autoklaven bei
120ºC für 10 Minuten behandelt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt.
Das CD-Spektrum dieser Lösung wurde ebenfalls aufgenommen. Fig. 8 zeigt die
Ergebnisse, wonach A das CD-Spektrum, aufgenommen vor dem Autokalvieren, während
das B das CD-Spektrum, aufgenommen nach dem Erhitzen, ist. Aus Fig. 8 geht
hervor, daß das rekombinante C-552 die gleiche Struktur wie das C-552 vom Wild-Typ
hat, und ferner daß weder das rekornbinante C-552 noch das Wild-Typ-C-552
irgendeiner Veränderung in der Struktur durch das Autoklavieren unterworfen ist.
D. h., daß durch das rekombinante Verfahren erhaltene C-552 hoch stabil beim
Erhitzen ist, welches aus industriellen Gesichtspunkten vorteilhaft ist. Im
Gegensatz hierzu zeigte Pferde-Cytochrom-C eine deutliche Veränderung des
CD-Spektrums nach dem Autoklavieren, was den Schluß nahelegte, daß es vollständig
denaturiert wurde.
BEISPIEL 5: Analyse der Aminosäuresequenz des rekombinanten Cytochrom-C
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Die Aminosäuresequenz im Aminoende des rekornbinanten C-552 wurde mit einem
Gasphasensequenzator analysiert (Applied Biosystems). Die folgende Sequenz wurde
ermittelt:
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Met-Asn-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Gln-Lys-Gly-.
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Diese Sequenz stimmte mit der Amino-terminalen Sequenz vom Wild-Typ-C-552
überein, mit Ausnahme, daß ein Methioninrest an das Aminoende angefügt wurde.
Das Vorliegen des Methioninrests zerstörte nicht die bevorzugten Eigenschaften
von C-552. Man nimmt daher an, daß das hierin beschriebene Verfahren die
ökonomische Produktion in großer Menge von rekombinanten C-552 ermöglicht. Auf den
hier verwendeten Promotor und Escherichia coli-Wirt wird nur auf die Beispiele
verwiesen, und die Expression kann unter Verwendung anderer Promotoren und Wirte
durchgeführt werden.
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Das Hydrogenobacter thermophilus C-552-Gen wurde kloniert und seine
Nucleotidsequenz aufgeklärt. Ferner wurde dieses Gen mit Expressionsvektoren von Hefe
verbunden und in Hefe-Wirte eingeführt, die Milchsäure nicht verwerten konnten.
Als Ergebnis wurde die Fähigkeit zur Verwertung von Milchsäure wieder
hergestellt, und der Gehalt an Cytochrom-C war erhöht. D. h. C-552 wurde in der Hefe
exprimiert. C-552 wurde ebenfalls in E. coli unter Verwendung von E.
coli-Expressionsvektor exprimiert. Das an diesen rekombinanten Mikroorganismen
produzierte rekombinante C-552 zeigte hervorragende Eigenschaften, die mit denen von
authentischem C-552 übereinstimmen. In ähnlicher Weise wird es möglich sein
rekombinantes C-552 von vielen anderen Wirts-Mikroorganismen herzustellen. Daher
kann eine große Menge von C-552 ohne Schwierigkeit durch DNA-rekombinante
Techniken erhalten werden. Zusätzlich kann die Hefe nicht nur Cytochrome-C von
Eucaryonten, sondern auch solche eines Procarytonen mit unterschiedlicher
Struktur exprimieren.
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Ferner wurden die Strukturen des Promotors, des Terminators und des
Signalpeptids, welche durch ihre Fähigkeit zur Funktion bei hoher Temperatur
charakterisiert sind, aufgeklärt.