DE69635525T2

DE69635525T2 - Gentechnisch hergestellte hefestämme

Info

Publication number: DE69635525T2
Application number: DE69635525T
Authority: DE
Inventors: Aouatef Bellamine; Frederic Delorme; Alain Perret; Denis Pompon
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Aventis Pharma SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Aventis Pharma SA
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2016-09-14
Also published as: WO1997010344A1; FR2738840A1; ATE311465T1; JP4717967B2; CA2229328C; ES2252758T3; EP0876495A1; JPH11513241A; FR2738840B1; US6579693B1; EP0876495B1; DE69635525D1; US6117649A; SI0876495T1; DK0876495T3; CA2229328A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hefestämme, die eine Cytochrom P450-Aktivität exprimieren, und ihre Verwendung. Sie bezieht sich insbesondere auf Hefestämme, die in der Lage sind, ein System von humanen Cytochrom P450-Enzymen zu produzieren, und die für ihre Konstruktion verwendeten Plasmide.
Die Cytochrome P450 stellen eine Superfamilie von Membranenzymen dar. Es sind Monooxygenasen, die spezieller im Metabolismus der Xenobiotika und der Medikamente eine Rolle spielen.
Sie werden insbesondere verwendet bei:

– der in vitro Diagnostik der Bildung von toxischen oder mutagenen Metaboliten durch den humanen Lebermetabolismus von natürlichen oder künstlichen xenobiotischen Molekülen (Schadstoffe, Medikamente oder Zusätze). Diese Diagnostik ist für die Entwicklung von neuen pharmazeutischen Molekülen ausschlaggebend.
– der Identifikation und der Zerstörung von toxischen oder umweltbelastenden Molekülen und
– der Produktion von Metaboliten.

Weil sie gleichzeitig bei diesen Entgiftungsprozessen und diesen Toxizitätsphänomenen impliziert sind, wurden diese Proteine vielfach untersucht (Guenguerich, 1988).
Jedoch stießen diese Untersuchungen schnell auf Schwierigkeiten, wie die Untersuchung von individuellen Formen von Cytochromen P450. Um diesen Problemen abzuhelfen, wurden dann die heterologen Expressionssysteme entwickelt.
Die Verwendung der Säugetierzellen als Wirte für die heterologe Expression wurde seit 1986 entwickelt (Zuber et al., 1986). Diese Systeme haben den Vorteil, mit den Leberzellen (hauptsächliche Lokalisierung der Cytochrome P450) verwandt zu sein, aber sie leiden unglücklicherweise an niedrigen Expressionsniveaus.
Die prokaryotischen Wirte, wie die Bakterien, ermöglichen es freilich, große Mengen an korrekt gefaltetem Cytochrom P450 zu erhalten (Barnes et al., 1991), mit diesem Typ Wirten beobachtet man aber unumgängliche Veränderungen des von der DNA exprimierten 5'-terminalen Teils (Doehmer & Greim, 1992).
Dagegen ist die Wahl von eukaryotischen Wirten vom Typ Hefe ganz besonders vorteilhaft: dieser Organismus ermöglicht es, sich unter Bedingungen zu begeben, die denen der humanen Leberzellen nahe sind, und führt zu einem hohen Expressionsniveau an Proteinen. Außerdem besitzt die Hefe in endogener Form die ganze enzymatische Maschinerie, die für die Expression der Membranproteine vom Typ Cytochrom P450 und ihrer beteiligten Enzyme notwendig ist, so verfügt sie über ein Cytochrom b5 und über eine NADPH-Cytochrom P450-Reduktase, zwei Enzyme, deren Gegenwart für das Funktionieren von Cytochrom P450 notwendig ist.
Die Hefe bietet demzufolge eine vorteilhafte Lösung für die verschiedenen Probleme (Oeda K. et al., 1985; Pompon, 1988), da mit diesem Organismus:

– die exprimierten Proteine an ihrer N-terminalen Sequenz nicht modifiziert werden müssen (wie für die Expression in der Bakterie)
– man vernünftige Mengen an heterologem Cytochrom P450 für verschiedene biochemische und strukturelle Untersuchungen erhält,
– dort bereits ein System von beteiligten Enzymen existiert.

Unter den Hefen, die besonders für die Expression von heterologen Proteinen untersucht wurden, kann man insbesondere Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida und Saccharomyces anführen, von denen man die Struktur des Genoms gut kennt. Verschiedene Systeme für die Expression von Cytochrom P450 in Hefen wurden in der Literatur beschrieben.
In den so genannten Stämmen der ersten Generation wurden die Cytochrome P450 aus Plasmiden exprimiert und sie verwenden als Elektronendonatoren NADPH-Cytochrom P450-Reduktase und Cytochrom b5, die in der Hefe endogen sind (Pompon, 1988; Cullin & Pompon, 1988).
Eine erste Verbesserung dieses Systems gab Anlass zu so genannten Stämmen der zweiten Generation, worin die Cytochrom P450-Reduktase der Hefe überexprimiert (unter der Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors) und ein humanes Cytochrom b5 coexprimiert worden war (Patent WO93/02200 und Truan et al., 1993). Diese Stämme haben es so ermöglicht, enzymatische Aktivitäten des rekombinanten Cytochrom P450 zu erhalten, die je nach der Isoform 5- bis 60-mal stärker als in dem Ausgangsstamm waren.
Jedoch sind die existierenden Systeme nicht vollkommen zufrieden stellend: entweder ermöglichen sie es nicht, eine ausreichende Expression der Proteine zu erhalten, oder die erhaltenen Proteine sind dem humanen System nicht nahe genug.
Die vorliegende Erfindung hat genau zum Ziel, eine dritte Stammgeneration vorzuschlagen, die die zuvor angeführten Nachteile nicht aufweist. Die Anmelderin hat unerwarteterweise gezeigt, dass es möglich war, gleichzeitig die NADPH-Cytochrom P450-Reduktase und das Cytochrom b5 von Hefe durch ihre humanen Homologen zu ersetzen. Dies ist umso überraschender als die gleichzeitige Disruption dieser beiden Gene dafür bekannt war, bei der Hefe tödlich zu sein, und als es bis heute nicht möglich war, einen lebensfähigen Stamm mit den beiden deletierten Genen zu erhalten.
In den beanspruchten Stämmen wurden die Cytochrom P450-Reduktase und/oder das Cytochrom b5 der Hefe durch ihr humanes Homologe ersetzt. Dies ermöglicht sehr vorteilhaft die Schaffung eines Systems, das den Leberzellen sehr nahe ist, da das ganze Multienzymsystem dann von gleicher Art ist.
Dieses neue System ermöglicht es, die Wirkung der Art der Redoxpartner der exprimierten Cytochrome P450 sowie die Stöchiometrien zu untersuchen, die für Cytochrom P450-Aktivitäten notwendig sind, die mit denen, die in der Leber existieren, vergleichbar sind.
Der erste Gegenstand der Erfindung liegt demzufolge in einem genetisch veränderten Hefestamm, dadurch gekennzeichnet, dass:

1. die Gene, die für endogenes Cytochrom b5 und für endogene NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodieren, inaktiviert wurden,
2. er eine Nukleinsäure enthält, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert,
3. er eine Nukleinsäure enthält, die für humanes Cytochrom b5 kodiert.

Die Nukleinsäuren, die für die Integration der für humanes Cytochrom b5 und humane Reduktase kodierenden Gene in den Stamm verwendet werden, sind vorzugsweise cDNA. Die cDNA, die die Gesamtheit der für diese beiden Proteine kodierenden Sequenz enthalten, wurden isoliert und sequenziert (für die humane Reduktase siehe S. Yamano et al. Mol. Pharmacol. 1989 Band 36: 83–8, und für humanes Cytochrom b5 siehe M. Miyata et al. Pharmacol. Res. 1989 Band 21: 513–20).
Ganz genauso bevorzugt ist die gewählte Hefe Saccharomyces cerevisiae.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter inaktivierten Genen ein Gen, das unfähig gemacht wurde, für sein natürliches Protein zu kodieren. Die Unfähigkeit besagter Gene, für ihre natürlichen Proteine zu kodieren, kann sich entweder durch die Produktion eines wegen struktureller oder konformationeller Modifikationen inaktiven Proteins oder durch die Abwesenheit von Produktion oder durch die Produktion des natürlichen Proteins auf einem abgeschwächten Niveau äußern.
Die Inaktivierung der nativen Gene kann gemäß verschiedenen Verfahren erzielt werden:

– eine vollständige oder teilweise Deletion des Gens. Unter Deletion versteht man jede Suppression des betrachteten Gens. Es kann sich um einen Teil der Region, die für das Protein kodiert, und/oder um die ganze oder einen Teil der Promotorregion für die Transkription handeln,
– eine oder mehrere punktuelle Mutationen im Gen. Die Mutationen können durch eine Behandlung mit chemischen mutagenen Mitteln (wie Alkylierungsmittel, Bialkylierungsmittel und Interkalatoren) oder mit physikalischen mutagenen Mitteln (Röntgenstrahlen, g-Strahlung, Ultraviolett) oder durch gerichtete Mutagenese erzielt werden,
– eine mutationelle Insertion durch Einwirkung von Restriktionsenzymen, die den Leserahmen des Gens unterbrechen und es inaktivieren, und/oder
– eine Gendisruption, beispielsweise gemäß dem zuerst von Rothstein [Meth. Enzymol. (1983) 202] beschriebenen Protokoll. In diesem Fall wird die Gesamtheit der kodierenden Sequenz gestört, um durch homologe Rekombination das Ersetzen der Wildtypsequenz durch eine Sequenz, die für das entsprechende humane Protein kodiert, zu ermöglichen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet man bevorzugt das Verfahren der Gendisruption, wie im Folgenden beschrieben.
Für die Transformation der beanspruchten Stämme im Hinblick darauf, sie gemäß der Erfindung humane Enzyme exprimieren zu lassen, sind verschiedene Verfahren denkbar: einerseits kann man einen Wildtypstamm, bei dem eins der Gene inaktiviert wurde, durch ein Replikationsplasmid, das die für das entsprechende humane Protein kodierende Nukleinsäure enthält, transformieren. In diesem Fall ist die Nukleinsäure nicht in das Genom der Hefe integriert.
Andererseits kann man eine Nukleinsäure in Form einer cDNA, die die für das betreffende humane Protein kodierende Sequenz umfasst, in das Genom der Hefe integrieren. In diesem Fall kann die Integration entweder an einem bekannten Locus auf diesem Genom, der einem Markergen entspricht, das weder die Reproduktionseigenschaften der Hefe noch deren Überlebensfähigkeit beeinträchtigt, oder an dem Platz, der von dem inaktivierten nativen Gen besetzt wird, erfolgen.
Die für die Reduktase kodierende Nukleinsäure desgleichen wie die für Cytochrom b5 kodierende Nukleinsäure können also gemäß einem dieser Verfahren in den Stamm eingeführt werden.
Um die Stabilität des Stamms zu verbessern und sich in die günstigsten Bedingung zu begeben, wählt man gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die Ausführungsform, die darin besteht, die Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, und/oder die Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, in das Genom der Hefe zu integrieren, wobei eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, diese Nukleinsäuren anstelle und am Ort der endogenen Gene zu integrieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung integriert man das für humanes Cytochrom b5 kodierende Gen an einem intergenischen Ort für ein Markergen, insbesondere an dem intergenischen Ort SPL1/leu2.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt in einem Stamm, dadurch gekennzeichnet, dass die für humanes Cytochrom b5 kodierende Nukleinsäure in das Genom integriert ist.
Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung besteht darin, zwei Kopien von Cytochrom b5 in dem transformierten Stamm auftreten zu lassen.
Ein weiteres Problem, auf das die Anmelderin stieß, ist, dass die Expression der humanen Gene in der Hefe eine ausreichende Rate hat.
Dazu ist es vorteilhaft, dass diese Gene unter die Kontrolle eines Hefepromotors gestellt werden, der ermöglicht, dass diese exprimiert werden. Diese Hefepromotoren können entweder induzierbar oder konstitutiv sein. In der vorliegenden Anmeldung versteht man unter konstitutivem Promotor einen Promotor, dessen Expression unter Standardkulturbedingungen konstant ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung steht wenigstens eins der humanen Gene unter der Kontrolle eines konstitutiven Hefepromotors.
Dieser Promotor ist unter den bekannten Promotoren ausgewählt. Man kann beispielsweise die Promotoren der Gene des Isocytochrom C1 (CYC1), der Alkoholdehydrogenase (ADH1), des Transkriptionselongationsfaktors (TEF), der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (im Folgenden GAPDH) und der Hefe-Phosphoglycerat-Kinase (im Folgenden PGK) verwenden.
Bevorzugt ist der Promotor unter dem Promotor des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase, dem Promotor des Gens der Hefe-Phosphoglycerat-Kinase und dem endogenen Promotor von Hefe-Cytochrom b5 ausgewählt. Es muss erwähnt werden, dass bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung das für humanes Cytochrom b5 kodierende Gen unter Kontrolle des endogenen Promotors Yb5 steht.
Der induzierbare Promotor ist vorzugsweise ausgewählt unter den GAL10- und CYC1-GAL10-Promotoren.
Bis heute konnten keine haploiden Stämme erhalten werden, die die Merkmale, die uns interessieren, aufweisen, das heißt die Inaktivierungen der zuvor angeführten endogenen Gene und ihr Ersatz durch Nukleinsäuren, die für die entsprechenden humanen Gene kodieren. Man musste in diploider Form bleiben. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist es, mit haploiden Hefen arbeiten zu können, was eine bessere Stabilität und die Vermeidung der unerwünschten Rekombinationen ermöglicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Stämme demzufolge dadurch gekennzeichnet, dass sie haploid sind.
Die erfindungsgemäßen Stämme besitzen wenigstens eine Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom P450 kodiert. Besagte Nukleinsäure ist vorzugsweise auf einem Plasmid integriert. Die erfindungsgemäßen humanisierten Hefestämme können gemäß den üblichen Techniken durch ein beliebiges Expressionsplasmid von Cytochrom P450 transformiert werden, vorausgesetzt dass besagtes Plasmid an seinen Selektionsmarkern mit den entwickelten Hefestämmen kompatibel ist. Insbesondere können solche Plasmide erhalten werden, indem man die kodierende Region einer cDNA, die für ein beliebiges humanes Cytochrom P450 kodiert, fachgerecht in den Klonierungspolylinker des Plasmids pYeDP60 kloniert (siehe Materialien und Verfahren).
Das Cytochrom P450 kann insbesondere ausgewählt sein unter den humanen Cytochromen P450 1A1, 1A2, 1B1, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2E1, 3A4, 3A5. Die gemäß der vorliegenden Anmeldung humanisierten Stämme weisen, verglichen mit den Wildtyphefen und verglichen mit den zuvor für die Expression entwickelten rekombinanten Stämmen, unbestreitbare Vorteile auf.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht aus einem erfindungsgemäßen Hefestamm, in dem man außerdem die Monooxygenase-Aktivität eines humanen Cytochrom P450, getragen von einem Plasmid, dazu bringt, exprimiert zu werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die zusätzliche Kopie der zuvor beschriebenen Nukleinsäure, die für Cytochrom b5 kodiert, auf einem Plasmid erscheinen zu lassen und insbesondere auf demjenigen, das bereits eine Kopie der für Cytochrom P450 kodierenden Nukleinsäure enthält. Für den Erhalt einer optimalen Aktivität der P450 ist es nämlich besonders vorteilhaft, eine relative molare Stöchiometrie von wenigstens gleich 1/1 zwischen den Expressionsniveaus von humanem Cytochrom b5 und humanem P450 realisieren zu können. Die genomische Integration einer einzigen Kopie des Gens von Cytochrom b5 kann sich unter gewissen Umständen als nicht ausreichend erweisen im Hinblick auf das hohe Expressionsniveau von P450, wie es sich aus seiner Expression aus einem erfindungsgemäßen Multikopieplasmid ergibt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es so, die Wirksamkeit des Systems noch zu verbessern, indem die Konstruktion einer Reihe von Plasmiden beschrieben wird, die gleichzeitig eine Expressionskassette für das interessierende Cytochrom P450 und eine Expressionskassette für Cytochrom b5 tragen. Die besondere Struktur dieser Plasmide ermöglicht eine stabile Expression mit hohem Niveau und mit geeigneter Stöchiometrie zwischen den beiden Cytochromen. Diese Plasmide sind mit der Gesamtheit der in der Anmeldung beschriebenen Stämme kompatibel. Ihre Verwendung kann auch auf andere Stämme ausgeweitet werden.
Die vorliegende Erfindung hat zum bevorzugten Ziel, einen Hefestamm zu entwickeln, der allen zuvor beschriebenen Merkmalen entspricht. Mehrere Zwischenstufen, um dies zu erreichen, werden beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung geht man vorzugsweise von Stämmen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, aus und insbesondere:

– von dem Stamm W (ΔB), beschrieben von Truant al, dessen Gen, das für das Hefe-Cytochrom b5 (im Folgenden Yb5) kodiert, disruptiert wurde. Dazu konstruiert man einen Vektor mit dem Markergen HIS3, das an einer Restriktionsstelle des Gens von Cytochrom b5 integriert ist. Dieser Vektor wird verwendet, um einen diploiden HIS3-Stamm zu transformieren. Die Rekombinanten werden selektiert,
– von dem Stamm W (R), dessen Gen, das für Hefe-Reduktase kodiert, nicht inaktiviert wurde,
– und dem Stamm W (hR), der aus einem Stamm W (RΔ) durch Transformation mit den Vektor pUP81 (1) erhalten wird. In diesem Stamm wurde das inaktivierte Gen, das für die Hefe-Reduktase (im Folgenden YRED) kodiert, durch Insertion einer Kassette, die den induzierbaren Promotor und die für humane Reduktase (im Folgenden HRED) kodierende Sequenz enthält, ersetzt.

Diese Stämme werden gekreuzt, dann lässt man sie sporulieren und man selektiert die haploiden Stämme W (hR, ΔB), die für Yb5 und YRED deletiert sind und die die humane Reduktase unter Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors exprimieren.
Diesbezüglich besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung aus einem Stamm, der eine Nukleinsäure umfasst, die unter Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, und dessen Gene, die für Hefe-Cytochrom b5 und für Hefe-NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodieren, inaktiviert wurden (Stamm W (hR, ΔB)).
Ein weiterer bevorzugter Stamm gemäß der Erfindung besteht aus einem mit dem vorhergehenden identischen Stamm, bei dem der induzierbare GAL10-CYC1-Promotor durch den GAPDH-Promotor ersetzt wurde.
Dieses Ersetzen kann ausgeführt werden durch eine Transformation mit dem Plasmid pAB2 (4), konstruiert aus pUP81 (9), der eine cDNA enthält, die für HRED unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors von GAPDH kodiert. Die Transformanten werden gemäß dem in dem Patent WO94/01564 beschrieben Verfahren selektiert. Der erhaltene Stamm wird mit W (GhR, ΔB) bezeichnet. In diesem Stamm ist die Sequenz, die für die humane Reduktase kodiert, unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors von Hefe-GAPDH und Hefe-Cytochrom b5 und Hefe-YRED sind inaktiviert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht aus einem Stamm, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase steht.
Ein weiterer bevorzugter Stamm gemäß der Erfindung wird aus dem Stamm W (hR, ΔB) durch Transformation mit dem Vektor pAB3 (6 und 12), der die für humanes Cytochrom b5 kodierende Sequenz enthält, erhalten.
Man selektiert die Hefen, die diese integriert haben. Der so erhaltene Stamm wird W (hR, hb5) genannt. Dieser Stamm besitzt die beiden Sequenzen, die für die humanen Proteine kodieren.
Um einen besonders vorteilhaften Stamm gemäß der Erfindung zu konstruieren, transformiert man den Stamm W (GhR, ΔB) mit dem Plasmid pAB3 auf die gleiche Weise wie zuvor. Man erhält so einen Stamm W (GhR, hb5), der die Eigenschaften der beiden vorhergehenden hat, dass er nämlich das Gen exprimiert, das unter Kontrolle des Promotors der Hefe-GAPDH für die humane Reduktase kodiert, und dass er auch das Gen exprimieren kann, das unter Kontrolle des Hefe-pYb5-Promotors für humanes Cytochrom b5 kodiert.
Auf die ganz genauso bevorzugte Art und Weise hat die Anmelderin einen Stamm aus dem Stamm W (hR, ΔB) konstruiert. Dieser Stamm wird mit dem Plasmidvektor pAP1 (8 und 13) transformiert, der zuvor durch die Einwirkung eines Restriktionsenzyms linearisiert wurde. Man selektiert die Transformanten, die die Sequenz, die unter der Kontrolle des von pAP1 getragenen Hefe-PGK (Phosphoglycerat-Kinase)-Promotors für humanes Cytochrom b5 kodiert, an der intergenischen Stelle leu2/SPL1 des Hefe-Chromosoms integriert haben (14).
Dieser Stamm trägt in der Nomenklatur der Anmelderin den Namen W (hR, Lhb5). Er kann die Sequenz, die unter Kontrolle des Promotors pGAL10-CYC1 für die humane Reduktase kodiert, und die Sequenz, die unter der Kontrolle des Hefe-PGK-Promotors für Cytochrom b5 kodiert, exprimieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen Hefestamm, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens eine Nukleinsäure umfasst, die unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Phosphoglycerat-Kinase für humanes Cytochrom b5 kodiert.
Ganz besonders bevorzugt man den folgenden Stamm. Man geht entweder von dem Stamm W (GhR, ΔB) aus, den man mit dem linearisierten Vektor pAP1 transformiert. Man selektiert die Klone, die an der zuvor angeführten Chromosomenstelle leu2/SPL1 die Sequenz integriert haben, die unter der Kontrolle des Hefe-PGK-Promotors für humanes Cytochrom b5 kodiert.
Man erhält dann einen Stamm W (GhR, Lhb5), der die Sequenzen enthält, die unter Kontrolle von zwei konstitutiven Hefe-Promotoren für die beiden humanen Gene kodieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Stamm gleichzeitig hat:

– die Nukleinsäure, die unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert,
– und die Nukleinsäure, die unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Phosphoglycerat-Kinase für humanes Cytochrom b5 kodiert.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, von dem Stamm W (R) auszugehen und ihn mit dem Vektor pAP1 zu transformieren, nach Selektion erhält man einen Stamm W (R, Lhb5, Yb5).
Vorzugsweise geht man von dem Stamm W (hR) aus, den man auf die gleiche Art und Weise transformiert, nach Selektion erhält man einen Stamm W (hR, Lhb5, Yb5).
Die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruierten Stämme ermöglichen die Durchführung von Verfahren, die die Ermittlung der Toxizität der Metaboliten, die aus dem Abbau von neuen chemischen Molekülen durch das enzymatische System Cytochrom P450 stammen, zum Ziel haben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung der Toxizität einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass:

– besagte Verbindung mit einer erfindungsgemäßen Hefe oder mit einer Enzymzubereitung, die von einer solchen Hefe abgeleitet ist, zusammengebracht wird und man die erzeugten Metaboliten hinsichtlich ihrer Toxizität analysiert.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es zudem, einen Enzymkomplex zu haben, der demjenigen, der in den humanen Leberzellen existiert, sehr nahe ist. Dies bietet die Möglichkeit, in vitro unter guten Expressionsbedingungen für die humanen Enzyme zu arbeiten. So kann man bestimmen, welches die Metaboliten sind, die beim Menschen aus dem Abbau von neuen chemischen Verbindungen durch den Cytochrom P450-Komplex resultieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Bestimmung der humanen Metaboliten einer chemischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass:

– besagte Verbindung mit einer erfindungsgemäßen Hefe oder einer Enzymzubereitung, die von einer solchen Hefe abgeleitet ist, zusammengebracht wird und man die erzeugten Metaboliten identifiziert.

Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung und nicht als beschränkend betrachtet werden müssen, detaillierter beschrieben.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Plasmid pUP81.
2: Plasmid pPL100.
3: Plasmid pAB1.
4: Plasmid pAB2.
5: Plasmid pLIP1.
6: Plasmid pAB3.
7: Plasmid pCD26.
8: Plasmid pAP1.
9: Konstruktion von pAB2 aus pUP81.
10: Konstruktion des Stamms W (GhR, ΔB) mit pAB2.
11: Konstruktion der Kassette hb5.
12: Konstruktion von pAB3.
13: Konstruktion von pAP1.
14: Konstruktion des Stamms W (GhR, Lhb5).
15: Darstellung der Plasmide pYeDP60, pYeDP1/10/hb5 und pYeDP110.
16: Darstellung der Plasmide pAP2, pAP3, pVD1, pVD2, pVD3, pVD4.
17: Konstruktion und Struktur von pAP4.
18: Konstruktion von pVD1.
19: Konstruktion von pVD2.
20: Konstruktion von pVD3.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
1 – Medien:

siehe Tabelle 1 folgende Seite.

Das Sporulationsmedium wird so ergänzt, dass die verschiedenen Auxotrophien je nach Stamm komplementiert werden.

(1) Yeast Nitrogen Base (YNB) ohne Aminosäuren und ohne Ammonium stammt von GIBCO BRL. Ammoniumsulfat von MERCK. Deutscher Agar von ROH-STOFF GmbH. Adenin, L-Histidin und L-Tryptophan von SIGMA. L-Leucin und Uracil von CALBIOCHEM. D-Glucose, D-Galactose, Glycerin und wasserfreies Kaliumacetat von PROLABO. Bactopepton (B. pepton) und Hefeextrakt (YE) von DIFCO.

N3 wird mit einem Phosphatpuffer, der durch Auflösen von 89 g Na₂HPO₄, 272 g KH₂PO₄ und 1 g Specillin in 5 l Wasser erhalten wird, bei pH = 6,2 gepuffert.
Die flüssigen Medien haben die gleiche Zusammensetzung wie die Festmedien, außer dass sie keinen Agar enthalten.
Ringer: 0,9% NaCl in Wasser.
2 – Stämme:

– Hefe: S. cerevisiae; W (N): MAT a und a, leu2-3,112, his3-11, ade2-1, trp1-1, ura3-1. W (N) a bezeichnet W (N) Mat a und W (N) a bezeichnet W (N) Mat a. W (ΔB): MA T a und a, leu2-3,112, ade2-1, trp1-1, ura3-1, Yb5: HIS3. W (ΔB) a bezeichnet W (ΔB) Mat a und W (ΔB) a bezeichnet W (ΔB) Mat a. W (hR): MAT a und a, leu2-3,112, his3-11, ade2-1, trp1-1, YRED: [GAL10-CYC1 :: HRED]. W (hR) a bezeichnet W (hR) Mat a und W (hR) a bezeichnet W (hR) Mat a.
– Bakterie: E. coli DH5-1: supE44, hddR17, recA1, gyrA96, thi-1, relA1.

3 – Die Vektoren:

– Plasmid pUP81: die kodierende Region des Gens der humanen Cytochrom P450-Reduktase, die durch PCR mit den Primern N1 und N2 erhalten wird, wird mit BamHI und BglII geschnitten, dann in den Integrationsvektor DP110 an seine BamHI-Stelle, ATG auf die Seite des GAL10-CYC1-Promotors kloniert (Urban et al., 1993).

Primer N1: 5'-GCggatccATGGGAGACAGTCACGTGG-3' (SEQ ID NO: 1), die Basen 1 bis 2 bilden eine GC-Klammer, die Basen 3 bis 8 (kleine Buchstaben) entsprechen der eingefügten BamHI-Stelle, die Basen 9 bis 17 und 21 bis 27 sind jeweils homolog zu den Nukleotiden 1 bis 9 und 13 bis 19 der Sequenz des offenen Leserasters des Gens der humanen Reduktase, die Basen 18 bis 20 (fette Schriftzeichen) ermöglichen es, die Nukleotide TCC in Position 10 bis 12 ab ATG der kodierenden Sequenz der humanen Reduktase zu mutieren. Diese Mutation ermöglicht es, die Gabelstruktur der in den 20 ersten Basenpaaren transkribierten RNA, die für die Hemmung der Translation bei der Hefe verantwortlich ist, zu zerstören (Baim et al., 1988).
Primer N2: 5'-CGgaattcAGATCTAGCTCCACACGTCCAGG-3' (SEQ ID NO: 2), die Basen 1 bis 2 bilden eine GC-Klammer, die Basen 3 bis 8 (kleine Buchstaben) entsprechen der Stelle EcoRI, die Basen 9 bis 14 (unterstrichene Buchstaben) entsprechen der Stelle BglII, die Basen 14 bis 16 (fette Schriftzeichen) entsprechen dem Stop-Codon (komplementärer Zweig) und die Basen 13 bis 31 sind zu den Nukleotiden 2018 bis 2034 des offenen Leserasters des Gens für humane Reduktase komplementär.

– Plasmid pFL26 (Bonneaud et al., 1991).
– Plasmid pPL100: ADE2/pFL (Stotz & Linder). Das Hefegen ADE2 wurde modifiziert, um den Vektor pPL100 zu konstruieren. Die interne BglII-Stelle des Gens wird zerstört, indem man das Adenosin in Position 593 ab ATG zu Guanin mutiert. Diese Mutation verändert weder die Aminosäuresequenz noch die Proteinaktivität. Eine BglII-Stelle wird in die 5'-Region des Gens ADE2 in Position –373 ab dem Initiationscodon eingeführt. Das Gen besitzt eine BglII-Stelle in Position 1862 ab ATG. Das Fragment BglII mit 2241 bp wird in den Vektor pFL36 an die Stelle BglII kloniert (Bonneaud et al., 1991).
– "Bluescript"-Plasmid wird in dem Kit "pCR-Script^TM SK (+) Cloning Kit" (Stratagene) beschrieben.

4 – Kreuzung:
Die haploiden Stämme mit entgegengesetzten Zeichen (a oder a) werden getrennt in komplettem YPGA-Medium kultiviert. Die Zellen werden dann in Ringer auf etwa 10⁵ Zellen/ml verdünnt. Ein Gemisch von 500 ml von jeder der beiden Suspensionen von haploiden Zellen wird hergestellt. Aus dem Gemisch werden 50 ml Suspension auf festem YPGA-Medium ausgestrichen. Nach 8 h Wachstum werden die Zellen auf einem selektiven Medium, das nur die gleichzeitig in den beiden Eltern vorhandenen Auxotrophien komplementiert, subkloniert. Dies ermöglicht das Wachstum des aus der Kreuzung hervorgegangenen Diploids, aber nicht der Ursprungshaploide. Nach zwei Tagen Wachstum werden die diploiden Klone, die erscheinen, auf dem gleichen selektiven Medium ausgepflanzt.
5 – Sporulation:
Die diploiden Zellen werden auf einem festen Sporulationsmedium, das mit den Auxotrophiemarkern des Diploids komplementiert ist, ausgepflanzt. Nach 3 Tagen Sporulation werden die Sporen dissektiert.
6 – Dissektion der Sporen:
So genannte lose Dissektionstechnik:
Die Sporen werden in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen auf 5·10⁸ Zellen/ml in Wasser verdünnt, das Zymolyase 10.000 (Seikagaku Kogyo Co., Tokio, Japan) zu 100 mg/ml enthält, dann 30 min lang bei 28°C inkubiert. Ein Aliquot von 500 ml wird bei 10.000 rpm 1 min lang zentrifugiert. Der Zellbodensatz wird in 1 ml Wasser aufgenommen, zentrifugiert und in 100 ml Wasser wieder aufgenommen. Die Zellen werden 2 min lang mit dem Vortex gerührt. Das Röhrchen wird mit Wasser ausgespült, indem man es 2- bis 3-mal umdreht. Nach 5-mal Spülen haften die Sporen, die hydrophob sind, an den Wänden des Röhrchens, während die diploiden vegetativen Zellen in Suspension verbleiben und durch Spülen entfernt werden. Die Sporen werden dann in einer Lösung mit 0,01% (v/v) Nonidet P-40 (Sigma) resuspendiert. Das Detergenz wird nach Zentrifugieren entfernt. Die gereinigten Sporen werden in Ringer aufgenommen und auf selektivem Festmedium ausgestrichen.
Mikrodissektion:
Die Sporen werden in einer Lösung (mit 55% Glycerin) von Cytohelicase (Biosepra) zu 0,5 g/l 15 min lang bei 22°C inkubiert, dann auf einem Stück zuvor abgeschnittenem und auf ein Deckgläschen gelegtem Agar ausgestrichen. Das Deckgläschen wird dann umgekehrt auf eine Mikrodissektionskammer gelegt. Die vier Sporen, die in einer Tetrade enthalten sind, werden mit Hilfe des Mikro manipulators unter dem Mikroskop getrennt. Der Agar, der die so dissektierten Tetraden trägt, wird in eine Schale mit YPGalA-Komplettmedium gegeben.
7 – Klonierung des GAPDH-Promotors:
Amplifikation durch PCR:
Die DNA des Promotors des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase wurde durch die PCR-Technik kloniert aus 100 ng genomischer DNA von S. cerevisiae W (N), die gemäß dem beschriebenen Verfahren (Bellamine et al., 1994) hergestellt wurden, indem man als Primer 50 ng der Primer N3 (SEQ ID NO: 3) und N4 (SEQ ID NO: 4) (9) verwendet. Die Amplifikation erfolgt mit 2,5 U nativer Pfu DNA-Polymerase (Stratagene). Die Polymerisationsreaktion findet in 50 ml einer Lösung 20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, 10 mg/ml "Serumalbumin" ohne Nuklease und 200 mM von jeder der vier Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTP) statt. Die PCR-Bedingungen sind die folgenden:
Die Sequenzen der Primer sind:

– Primer N3: 5'-CCaagcttGAGTTTATCATTATCAATACTCG-3' (SEQ ID NO: 3), die beiden ersten Basen bilden eine GC-Klammer, die kleingeschriebenen Buchstaben entsprechen der Stelle HindIII, die Basen von 9 bis 31 sind zu den Nukleotiden –673 bis –650 der Sequenz des Promotors des GAPDH-Gens homolog.
– Primer N4: 5'-CggatccTATTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAGTTCTTGG-3' (SEQ ID NO: 4), die kleingeschriebenen Buchstaben entsprechen der Stelle BamHI, die Basen von 8 bis 42 sind zu den Nukleotiden –6 bis –48 komplementär.

Die Größe der amplifizierten DNA beträgt 691 bp.
26 ml Ammoniumacetat 7,5 M und 4 ml Wasser werden zu 50 ml PCR-Produkt hinzugefügt. Das Gemisch wird mit 80 ml Ethanol 10 min lang bei 22°C ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird bei 10.000 rpm 10 min lang zentrifugiert. Der Bodensatz wird mit Ethanol 70% (v/v) gewaschen, getrocknet und in 20 ml Wasser aufgenommen.
Ein Aliquot von 10 ng dieser DNA wird an die Stelle SrfI des Bluescript-Vektors des Kits "pCR-Script^TM SK (+) cloning kit" gemäß dem Empfehlungen des Verkäufers (Stratagene) kloniert. Die Klone werden durch PvuII-Restriktion selektiert. Diejenigen, die PvuII-Fragmente mit 2513 und 1139 bp ergeben, werden über 100 bp an der Schnittstelle zwischen der klonierten DNA und dem Bluescript-Vektor sequenziert mit dem Kit: Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit U. S. B. (Amersham). Diese Konstruktionen werden pAB1 genannt.
Klonierung des GAPDH-Promotors in den Integrationsvektor pUB81:
Der Klon pAB1 wird mit HindIII geschnitten. Dieser Schnitt erzeugt ein klebriges Ende, das mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (Biolabs) aufgefüllt wird. Der so linearisierte Vektor pAB1 (Fragment mit 3652 bp) wird dann an seinem 5'-Ende mit BamHI geschnitten, dann in den Vektor pUP81 zwischen die Stellen EcoRV und BamHI kloniert. Bei der Ligation passt sich die Stelle HindIII, deren Ende geglättet wurde, an die Stelle EcoRV, die ein glattes Ende hat, an, während die beiden BamHI-Half-sites des Fragments pGAPDH und des Integrationsvektors pUP81 sich untereinander verbinden. Die Stelle EcoRV wurde ausgewählt, um gleichzeitig das Gen URA3 (9) zu zerstören. Die Klone werden durch enzymatische Restriktion mit den Enzymen PstI und BamHI selektiert. Diejenigen, die DNA-Fragmente von 600 und 800 bp zusätzlich zu den Fragmenten 60, 104, 197, 385, 440 und 2564 bp (Fragmente, die in dem Vektor pUB81 existieren) ergeben, stellen die pUP81-Vektoren, die die DNA des GAPDH-Promotors enthalten, dar. Diese Konstruktion wird pAB2 genannt. Drei Klone, die das Plasmid pAB2 enthalten, werden durch Sequenzierung über 100 bp mit dem Primer N3 (SEQ ID NO: 3) ab dem 5'-Ende der DNA des Promotors des Gens GAPDH überprüft.
8 – Konstruktion der Kassette zur Integration von humanem Cytochrom b5 am Locus YCYB5:
Diese Konstruktion wurde in drei verschiedenen PCR gemacht.
In der ersten PCR (PCR 1) wurden die 353 bp des 3'-Endes des Promotors des Hefe-Cytochrom b5-Gens (Yb5) amplifiziert, indem die Primer N5 (SEQ ID NO: 5) und N6 (SEQ ID NO: 6) und genomische DNA von W (N)-Hefe verwendet wurden:

– Primer N5: 5'-ggatccGAGCGGGTAATAGCCTGGAGTTTCC-3' (Seq ID NO: 5) umfasst eine BamHI-Stelle ab seinem 5'-Ende (in kleinen Buchstaben). Dieser Primer ist von der Base 7 bis 31 homolog zu den Nukleotiden –331 bis –306 des offenen Leserasters des Promotors des Hefe-Cytochrom b5-Gens.
– Primer N6: 5'-ccgactgctctgccatGATTGTTTGATATTTTATGTTGTAGTTGATTG-3' (SEQ ID NO: 6) umfasst ab seinem 5'-Ende: Base 1 bis 16 die zu den 16 ersten Nukleotiden des 5'-Endes des offenen Leserasters des humanen Cytochrom b5-Gens komplementäre Sequenz (kleine Buchstaben), Base 17 bis 49 die zu den Nukleotiden –1 bis –32 des Promotors des Hefe-Cytochrom b5-Gens komplementäre Sequenz.

Das amplifizierte Fragment ist 375 bp groß.
In der zweiten PCR (PCR 2) wurden die 147 letzten bp des 5'-Teils des Terminators des Hefe-Cytochrom b5-Gens mit den Primern N7 (SEQ ID NO: 7) und N8 (SEQ ID NO: 8) amplifiziert:

– Primer N7: 5'-cctatacatggcagaggactgaATTCTTTTTCTTCCAGAATAGCCCACAC-3' (SEQ ID NO: 7) umfasst ab seinem 5'-Ende: Base 1 bis 22: zu den Nukleotiden 383 bis 403 des offenen Leserasters des humanen Cytochrom b5-Gens homologe Sequenz (kleine Buchstaben), Base 23 bis 50 die zu den Nukleotiden 1 bis 28 des Terminators ab dem Stopcodon homologe Sequenz.
– Primer N8: 5'-GGagatctGTGACATACTTCTATGCGATATAG-3' (SEQ ID NO: 8) umfasst von der Base 1 bis 2 eine GC-Klammer und eine BglII-Stelle von der Base 3 bis 8 (in kleinen Buchstaben). Dieser Primer ist von der Base 9 bis 32 zu den

Nukleotiden 1 bis 147 des offenen Leserasters des Terminators des Hefe-YCYB5-Gens ab dem Stopcodon komplementär.
Das amplifizierte Fragment ist 180 bp lang.
In den PCR 1 und 2 wird die genomische DNA der Hefe W (N) als Matrix verwendet.
In einer dritten PCR (PCR 3) werden 4 Primer verwendet:

– Zweihundert Nanogramm der Produkte der beiden ersten PCR (375 und 180 bp) werden als Primer und 100 ng DNA der kodierenden Region von humanem Cytochrom b5 als Matrix verwendet (11). Dies ermöglicht den Erhalt der Integrationskassette des humanen b5 (CIH), aber in geringer Menge.
– das Produkt dieser PCR wird dann mit den Primern N5 (SEQ ID NO: 5) und N8 (SEQ ID NO: 8) amplifiziert, dies ermöglichte den Erhalt der Integrationskassette in größerer Menge. Das Fusionsprodukt wird nach Amplifikation mit Pfu-Polymerase in Gegenwart von dNTP 0,2 mM 30 min lang bei 76°C behandelt. Das erhaltene Fragment ist 917 bp groß. Die Amplifikationen werden mit Taq-Polymerase (Appligène) vorgenommen.

Die verwendeten PCR-Programme sind die folgenden:
PCR 1 und PCR 2:
PCR 3:
Die so konstruierte Integrationskassette (CIH) wird in den Vektor pCRScript an die Stelle SfrI kloniert. Der erhaltene Klon pLIP1 wird durch Sequenzierung über 200 bp an den beiden Schnittstellen: des Promotors und des Terminators des Hefe-YCYB5-Gens und der kodierenden Region des humanen Cytochrom b5-Gens kontrolliert. Um die Rekombinationspunkte zu verlängern, damit die Integration der Integrationskassette des humanen b5 korrekt erfolgt, wurde eine neue Integrationskassette, die die kodierende Region des humanen Cytochrom b5-Gens und die Gesamtheit des Promotors und des Terminators des Hefe-YCYB5-Gens umfasst, aus dem Fragment BamHI/BglII mit 917 bp des Vektors pLIP1 konstruiert. Der Vektor YCYB5/YEP352, der die Gesamtheit des Hefegens YCYB5 enthält (Truan et al., 1994), wird an einer einzigen ClaI-Stelle geschnitten. Dieses linearisierte Fragment wird in den Stamm W (N)a mit dem Fragment BamHI/BglII mit 917 bp des Vektors pLIP1 cotransformiert. Da die Linearisierung des Vektors YCYB5/YEP352 an der kodierenden Region des Gens YCYB5 stattfindet, wird das Hefe-Cytochrom b5 durch humanes Cytochrom b5 infolge einer homologen Rekombination in der Hefe substituiert (12). Die Selektion der Rekombinanten erfolgt durch die Rezirkularisierung des Expressionsvektors (Bellamine et al., 1994). Der neue Vektor pAB3 wird aus der Hefe gewonnen, dann in der Bakterie E. coli gemäß dem beschriebenen Verfahren (Bellamine et al., 1994) amplifiziert.
9 – Konstruktion der Kassette zur Integration von humanem Cytochrom b5 am intergenischen Ort leu2DISPL1:
Eine Kassette, die es ermöglicht, das humane Cytochrom b5-Gen in der direkten Nähe des Gens LEU2 in der intergenischen Region mit 500 bp des Gens SPL1 zu integrieren, wurde in zwei Schritten konstruiert:

– Konstruktion des Vektors pCD26: ausgehend von dem Vektor pFL26 (Bonneaud et al., 1991), der gleichzeitig das Gen LEU2 und 500 bp des Gens SPL1 trägt, wurde eine NotI-Stelle in drei PCR eingeführt (13).

In der ersten PCR werden die 704 bp des 3'-Teils des Gens LEU2 amplifiziert, indem man die Primer N9 (SEQ ID NO: 9) und N10 (SEQ ID NO: 10) verwendet:

– Primer N9: 5'-TTGAAGGTTCAACATCAATTGATTG-3 (SEQ ID NO: 9) ist homolog zu den Nukleotiden 2190 bis 2214 des Vektors pFL26, der dem Ende des offenen Leserasters des Gens LEU2 entspricht (die Nummerierung am Vektor pFL26 erfolgt ab dem Nukleotid 1, das 417 bp vor der BamHI-Stelle liegt).
– Primer N10: 5'-GTGTGgcggccgcCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-3' (SEQ ID NO: 10) umfasst an seinem 5'-Ende fünf zu den Nukleotiden 2890 bis 2894 des Vektors pFL26 komplementäre Basen, eine NotI-Stelle von der Base 6 bis 13 und eine zu den Nukleotiden 2857 bis 2881 komplementäre Sequenz von der Base 14 bis 38.

In der zweiten PCR werden die 347 letzten bp des 3'-Teils des Gens SPL1 amplifiziert, indem man die Primer N11 (SEQ ID NO: 11) und N12 (SEQ ID NO: 12) verwendet:

– Primer N11: 5'-CAAGGAGgcggccgcCACACAAAAAGTTAGGTGT-3' (SEQ ID NO: 11) umfasst an seinem 5'-Ende sieben zu den Nukleotiden 2875 bis 2881 der Sequenz des Vektors pFL26 komplementäre Basen, eine NotI-Stelle von der Base 8 bis 15 und eine zu den Nukleotiden 2889 bis 2908 von pFL26 homologe Sequenz von der Base 16 bis 34.
– Primer N12: 5'-TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG-3' (SEQ ID NO: 12) ist zu den Nukleotiden 3198 bis 3222 des 3'-Endes des Strangs, der für das offene Leseraster des Gens SPL1 in dem Vektor pFl26 kodiert, komplementär.

In der dritten PCR werden 100 ng der beiden aus den zwei ersten PCR hervorgegangenen Fragmente (mit 20 bp Überlappung, die die NotI-Stelle enthalten) als Matrix und die Primer N9 und N12 als Primer verwendet. Die amplifizierten 1031 bp werden in den Vektor pFL26 an die Stellen NsiI und BstXI kloniert, um den Vektor pCD26 zu ergeben.
Die Amplifikationen werden mit Taq-Polymerase Appligène gemacht. Die beiden ersten PCR verwenden das gleiche Programm wie die PCR 1 und 2 des Abschnitts 8, die PCR 3 verwendet das folgende Programm: 30 Zyklen:

95°C 10 sec

60°C 5 sec

45°C 1 min

65°C 5 sec

74°C 2 min

– Konstruktion des Integrationsvektors pAP1: aus dem vorab konstruierten Plasmid pUP12 (Urban et al., 1990) wird die Kassette zur Expression von humanem Cytochrom b5 unter der Kontrolle des Promotors und des Terminators des Hefe-PGK (Phosphoglycerat-Kinase)-Gens mit einem Schnitt BamHI/HindIII gewonnen. Dieses Fragment mit 2400 bp wird mit Mung-Bean-Nuklease (Biolaps) an den Enden geglättet, dann in den an der Stelle NotI geschnittenen Vektor pCD26, dessen Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase geglättet wurden, kloniert (13). Die Klone, die Restriktionsfragmente PstI mit 5154 und 2904 bp ergeben, pAP1 genannt, werden für die Integration verwendet.

10 – Vektoren zur Transformation durch Cytochrom P450
Das Plasmid pYeDP60 ist ein Shuttle-Vektor (Bakterie, Hefe) mit 9265 bp, das die Replikationsursprünge ori E. coli und ori 2 μ, das Gen bla, das für die Ampicillin-Resistenz kodiert, die Gene URA3 und ADE 2, die auxotrophe Komplementationsmarker sind, einen GAL10-CYC1-Hybridpromotor, der in Gegenwart von Galactose induzierbar ist, und den Transkriptionsterminator des PGK Gens besitzt. Ein Polylinker, der unter anderem die Restriktionsstellen BamHI, KpnI, EcoRI umfasst, wird zwischen Promotor und Transkriptionsterminator zum Zweck der Klonierung einer cDNA, die exprimiert werden soll, inseriert.
Die Plasmide 1A1/V60 und 3A4/V60 entsprechen dem Vektor V60, in dem die kodierenden Regionen der cDNA, die für die humanen Cytochrome P450 1A1 beziehungsweise 3A4 kodieren, unter Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors und des PGK-Transkriptionsterminators inseriert wurden.
11 – Kulturmedium für die Transformation der Hefestämme.

YPGE-Medium

– Hefeextrakt 10 g/l

– Bacto-Pepton 10 g/l

– Glucose 5 g/l

– Ethanol 30 ml/l

SW6-Medium

– Hefe-Stickstoffbase (Difco) 7 g/l

– Glucose 20 g/l

– Casaminosäure (Difco) 1 g/l

– Tryptophan 20 mg/l

– Agar 15 g/l (nur für die Festmedien).

Für das entsprechende Galactose-Medium (SW5) wird die Glucose durch Galactose in der gleichen Konzentration ersetzt.
12 – Herstellungen der mikrosomalen Fraktionen.
12.1 Transformation.
Die Hefen werden durch die Plasmide 1A1/V60 oder 3A4/V60 gemäß dem Standardverfahren, das "Lithiumchlorid-Verfahren genannt wird, transformiert. Die Transformanten werden auf einem synthetischen glucosehaltigen Hefekulturmedium selektiert, das frei von Adenin und Uracil ist (SW6), dem die Nährstoffe zugesetzt werden, die notwendig sind, um die je nach dem verwendeten Stamm verbleibenden Auxotrophien zu komplementieren (siehe Genotyp der Stämme). Ein großer Teil der auf dem Glucosemedium selektierten primären Transformanten wächst nicht auf einem galactosehaltigen Minimalkulturmedium. Nur die Klone, die sich auf Galactose-Medium korrekt entwickeln, werden behalten.
12.2 Vorkultur:
Die selektierten Klone werden auf nicht induzierendem glucosehaltigem Minimalmedium, das für das Plasmid selektiv ist (im Allgemeinen SW6-Medium), ausgepflanzt, dann in 20 ml des gleichen flüssigen Mediums eine Nacht bei 28°C inkubiert.
12.3 Kultur:
250 ml YPGE-Medium werden mit der Vorkultur beimpft und unter Rühren bei 28°C bis zum Erhalt einer Zelldichte zwischen 8 und 9,6·10⁷ Zellen/ml inkubiert. Galactose wird dann in einer Konzentration von 20 g/l hinzugefügt und die Kultur wird die Nacht lang bei 28°C inkubiert, so dass eine Zelldichte von 2·10⁸ Zellen/ml erhalten wird. Die Gegenwart von Galactose ermöglicht die Induktion von Cytochrom P450 und der anderen von dem GAL10-CYC1-Promotor abhängenden Gene.
12.4 Fraktionierung der Zellen:
Die Zellen werden zentrifugiert und in Puffer TE pH 7,4 (Tris-HCl, 50 mM; EDTA 1 mM); KCl 0,1 M, gewaschen und in Puffer TE pH 7,4; Sorbitol 0,6 M resuspendiert. Um die Zellen aufzubrechen, werden Glasperlen hinzugefügt und die Röhrchen werden 5 min lang bei 4°C von unten nach oben heftig gerührt. Die folgenden Schritte werden bei 4°C ausgeführt. Die Suspension von aufgebrochenen Zellen wird gewonnen und die Perlen werden mehrere Male mit dem gleichen Puffer gewaschen. Um die Zelltrümmer, die Kerne sowie die mitochondriale Fraktion zu entfernen, wird zweimal zentrifugiert, 3 min bei 3500 rpm beziehungsweise 10 min bei 15 000 rpm. Um die Mikrosomen auszufällen, wird der Überstand in Gegenwart von NaCl (0,15 M fertig) und PEG 4000 (10% fertig) 15 min lang in Eis inkubiert. Nach Zentrifugieren von 10 min bei 10000 rpm wird der Mikrosomenbodensatz in Puffer TE pH 7,4; 20% Glycerin gewonnen. Die Mikrosomenzubereitung wird aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt.
13 – Bestimmung von Cytochrom P450
Die Konzentration an Cytochrom P450 in den mikrosomalen Fraktionen wird spektral bestimmt. Das zu bestimmende Cytochrom P450 wird in Puffer TE pH 7,4 verdünnt (etwa 1 mg mikrosomale Proteine pro ml) und mit einigen Körnchen Natriumdithionit reduziert. Nach Aufzeichnen der Basislinie (reduziertes Cytochrom P450 gegen reduziertes Cytochrom P450) werden einige CO-Bläschen in die Messküvette gegeben und das Differenzspektrum wird zwischen 400 und 500 nm gemessen. Das CO bildet mit dem reduzierten Eisen des Cytochrom P450 einen stabilen Komplex, dieser Komplex weist ein charakteristisches Absorptionsmaximum bei 450 nm auf. Der Absorptionskoeffizient_εM (450–490 nm) beträgt 91 mM^–1·cm^–1.
14 – Bestimmung der mikrosomalen Proteine
Die Bestimmung der Gesamtproteine wird mit dem Bestimmungs-Kit PIERCE-BCA unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen durchgeführt. Rinderserumalbumin wird als Standard verwendet.
15 – Katalytische Aktivitäten der Cytochrome P450
15.1 EROD-Aktivitätstests an Mikrosomen
Cytochrom P450 1A1 katalysiert die O-Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin. Das Reaktionsprodukt Resorufin (7-Hydroxyphenoxasin) fluoresziert bei 586 nm nach Anregung bei 530 nm. Die pro Zeiteinheit gebildete Menge an Resorufin entspricht der Akkumulationsgeschwindigkeit des Resorufins.
Das Inkubationsgemisch umfasst:

– 2 μl einer Mikrosomensuspension (zwischen 20 und 50 μg mikrosomale Proteine) in 1 ml Puffer TE pH 7,4, der NADPH 50 μM und 2,5 μM 7-Ethoxyresorufin enthält. Um die Wirkung von Kaninchen-Cytochrom b5 auf die katalytische Wirksamkeit zu bestimmen, werden die mikrosomalen Fraktionen zuvor in der Kälte in Gegenwart eines Überschusses an gereinigtem Cytochrom inkubiert.

15.2 THL-Aktivitätstest an Mikrosomen: 6β-Hydroxylierung von Testosteron
Testosteron ist ein Steroidhormon, das in Position 6β durch Cytochrom 3A4 hydroxyliert wird. Das Inkubationsmedium umfasst 100 μg mikrosomale Proteine in 0,25 ml Puffer Tris 50 mM, 1 mM EDTA pH 7,4 oder Natriumphosphat 50 mM pH 7,4, der NADPH 50 μM, Testosteron 80 μM (aus einer Mutterlösung 5 mM in Ethanol) in Abwesenheit oder in Gegenwart eines Überschusses von Cytochrom b5 enthält.
Die Inkubationen finden 10 min lang bei 28°C oder 37°C statt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 μl TFA 50% in Wasser gestoppt. Das Extraktionsverfahren ist das folgende:

– Zugabe von 500 μl Dichlormethan
– Rühren mit dem Vortex bei maximaler Geschwindigkeit 1 min lang
– Zentrifugieren 5 min lang bei 10 000 rpm
– Entfernen der oberen wässrigen Phase
– Verdampfen der organischen Phase unter Stickstoffstrom

Der trockene Rückstand wird mit 20 μl Methanol aufgenommen, dann werden 20 μl Wasser hinzugefügt. Die Hälfte wird in eine reversed phase-HPLC-Säule SPHERI-5RP-18,5 μm (100 × 2,1 mm) gespritzt, wobei man als Elutionsmittel Acetonitril mit 1 ml/min verwendet. Die Zusammensetzung an Acetonitril des Elutionsgradienten variiert von 10% (vol/vol) bei 0 min bis zu 60% bei 8 min. Die Detektion erfolgt bei 254 nm. Die Elutionszeiten betragen 6 min 20 s für β-Hydroxytestosteron und 8 min für Testosteron.
BEISPIELE
Beispiel Nr. 1: Konstruktion des Stamms W (hR, ΔB):
Der Stamm W (ΔB) a (der auf W0ABIF-Medium wächst) und der Stamm W (hR) a (der auf W0ADIF-Medium wächst) werden untereinander gekreuzt und das Diploid wird auf Glucose-W0AIF-Medium selektiert. Dieses Medium ist für jedes der Haploide letal und nicht für das Diploid W (hR/YR, Yb5/ΔYb5). Die diploiden Klone werden auf dem gleichen selektiven Medium subkloniert. Nach Sporulation werden die Tetraden entweder durch Mikrodissektion oder durch lose Dissektion dissektiert. Die auf YPGalA-Medium kultivierten Sporen werden dann auf verschiedene selektive Medien, die als Kohlenstoffquelle Galactose enthalten, ausgepflanzt, um die Auxotrophien der verschiedenen Sporen zu untersuchen. Die Hefeklone, die auf Galactose-Medium wachsen und die für Uracil und Histidin prototroph sind, entsprechen dem Stamm W (hR, ΔB). Diese Hefen wachsen nicht mehr, wenn man auf dem gleichen Medium Galactose durch Glucose ersetzt, weil unter diesen Bedingungen die humane Reduktase nicht exprimiert wird. Diese Stämme wachsen, da sie gleichzeitig einen Mangel an Reduktase und an Hefe-b5 (dessen Gen zerstört ist) aufweisen, nicht, weil der zweifache Mangel letal ist (Truan et al., 1994). Vier Klone werden im Folgenden berücksichtigt: Sp1 und Sp2, die durch Mikrodissektion erhalten wurden, und C1 und C2, die durch lose Dissektion erhalten wurden.
Beispiel Nr. 2: Konstruktion des Stamms W (GhR, ΔB):
Der mit NotI geschnittene Integrationsvektor des GAPDH-Promotors pAB2 wird verwendet, um den Stamm W (hR, ΔB) a zu transformieren. Der Vektor pPL100 wird als Cotransformationsmarker verwendet (10 bis 15 ng DNA des Vektors pPL100 auf 2 mg DNA des Vektors pAB2). Die Transformanten werden auf W0BDIF-Medium selektiert. Die Klone durchlaufen 3 Auslesereihen:

– Eine Selektion der Uracil-Auxotrophie: die Transformanten werden auf W0ABDIF-Medium ausgepflanzt, dann auf W0ADIF-Medium, um die Klone aufzuspüren, die in Abwesenheit von Uracil nicht wachsen. Der Verlust des Gens URA3 legt nahe, dass der Promotor GAPDH den Promotor GAL10-CYC1 ersetzt hat, weil die Integration des Promotors GAPDH an die Stelle des Promotors GAL10-CYC1 gleichzeitig das Gen URA3, das vor dem Promotor liegt, inaktiviert. 25% der Transformanten wachsen nicht in Abwesenheit von Uracil (10).
– Die zweite Selektion: um die Aktivität der unter der Kontrolle des GAPDH-Promotors exprimierten humanen Reduktase zu prüfen, wurde die Ketokonazol-Resistenz der Klone W (GhR, ΔB) bestimmt (Patent Nr. WO94/01564). Drei verschiedene Klone haben eine Ketokonazol-Resistenz von 20 mg/ml, während der Stamm W (hR), in dem die humane Reduktase unter der Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors exprimiert wird, eine Resistenz von 1 bis 5 mg/ml unter den gleichen Bedingungen aufweist.
– Dritte Selektion: um das Expressionsniveau der humanen Reduktase in dem Stamm W (GhR, ΔB) zu bestimmen, wird die Reduktion von Cytochrom c durch die in den mikrosomalen Fraktionen der drei untersuchten Klone enthaltene Reduktase gemessen (Truan et al., 1993). Je nach den Kulturbedingungen ist die Reduktion von Cytochrom c 1,5- bis 3-mal höher als bei dem Stamm W (hR).
– Atmungstest: die erhaltenen Klone werden auf festes N3-Medium ausgepflanzt, um ihren Atmungsphänotyp zu untersuchen. Die drei Klone wachsen nicht auf N3. Sie sind also Phänotyp atmungsnegativ. Um sie [atmungspositiv] zu machen, werden diese Klone mit einem Stamm vom Phänotyp atmungspositiv W (hR) a gekreuzt. Das erhaltene Diploid W (GhR/hR, ΔB/Yb5) wird auf W0AIF-Medium selektiert. Nach Sporulation und loser Dissektion wird die genomische DNA der Haploide präpariert, dann wird eine PCR, die die Primer N13 (SEQ ID NO: 13) und N14 (SEQ ID NO: 14) verwendet, an dieser DNA ausgeführt.
– Primer N13: 5'-CAGATCTGCATGCCTAAAGTTTACAGTTACC-3' (SEQ ID NO: 13), die Basen 1 bis 30 sind zu den 30 Nukleotiden des 5'-Endes des Leserasters des Hefegens YCYB5 homolog.
– Primer N14: 5'-CGGATTCTGCAGTTATTCGTTCAACAAATAATAAGCAACACC-3' (Seq ID NO: 14), die Basen 1 bis 42 sind zu den Nukleotiden 321 bis 363 des Strangs, der für Hefe-b5 kodiert, komplementär.

Unter sechs analysierten Klonen haben 3 Klone eine amplifizierte Bande mit 363 bp (die kodierende Region des Hefe-Cytochrom b5-Gens), die drei anderen Klone haben eine Bande mit 2063 bp, was der Summe der Größe des Gens HIS3 (1700 bp) und der Größe des offenen Leserasters von Hefe-b5 (363 bp) entspricht. Diese Klone werden auf festem W0ABIF-Medium subkloniert, um ihre Auxotrophie gegenüber Histidin zu untersuchen. Alle Klone wachsen in Abwesenheit von Histidin, während 50% von ihnen (diejenigen, die die amplifizierte Bande mit 363 bp haben) eigentlich auxotroph für Histidin sein sollten. Im ursprünglichen Stamm W (N) ist das Gen his3-11 mutiert. Bei der Konstruktion des Stamms W (ΔB) (Truan et al., 1993) wird die Zerstörung des Hefe-Gens YCYB5 durch Integration des Gens HIS3 in die kodierende Region von YCYB5 wahrscheinlich von einer zweiten Integration des Gens HIS3 an einem anderen Locus begleitet. Dies hätte zur Konstruktion eines Stammes (W (ΔB)) geführt, der zwei funktionelle Kopien des Gens HIS3 enthält. Die Segregation des Gens HIS3 wäre nicht mehr vom Typ 2/2. Dies könnte das erhaltene Ergebnis erklären. Zwei dieser Klone werden in der Folge berücksichtigt (B1 und B2).
Beispiel Nr. 3: Konstruktion des Stamms W (hR, hb5):
Die 4 Klone SP1, SP2, C1 und C2 werden in flüssigem YPGalA-Komplettmedium kultiviert und mit dem Fragment PvuII mit 2022 bp des Vektors pAB3 (12) transformiert. Die Transformanten werden auf YPGA-Medium ausgestrichen. Die Selektion der Integranten erfolgt auf die Fähigkeit von humanem Cytochrom b5, den Stamm W (hR, ΔB) auf glucosehaltigem Medium vor dem Absterben zu bewahren. Die Klone, die gewachsen sind, werden in Chargen zusammengefasst. Die genomische DNA von jeder Charge wird präpariert. Eine PCR, die die Primer N5 (SEQ ID NO: 5) und N15 (SEQ ID NO: 15) verwendet, wird ausgeführt (gleiche Bedingungen wie die PCR 1 und 2 des Abschnitts 8). Die Chargen, die eine amplifizierte Bande mit 758 bp ergeben, werden individuell durch PCR analysiert. Ein Klon, der die Expressionskassette von humanem Cytochrom b5 am Locus YCYB5 integriert hat, W (hR, hb5), wird aus dem Anfangsklon W (hR, ΔB) Sp1 erhalten.

– Primer N15: 5'-CCgaattcTGATCAGTCCTCTGCCATGTATAGG-3' (SEQ ID NO: 15), Basen 1 bis 2: GC-Klammer, die Basen 3 bis 8 entsprechen der Stelle EcoRI (kleine Buchstaben), die Basen 9 bis 14 entsprechen der Stelle BclI, die Basen 12 bis 14 entsprechen dem Stopcodon und die Basen 15 bis 33 sind zu den Nukleotiden 386 bis 405 des offenen Leserasters des Gens für humanes Cytochrom b5 komplementär.

Beispiel Nr. 4: Konstruktion des Stamms W (GhR, hb5):
Die Klone B1 und B2 werden in flüssigem YPGA-Komplettmedium kultiviert und mit dem Fragment PvuII mit 2022 bp des Vektors pAB3 sowie mit dem Vektor pPL100 als Cotransformationsmarker transformiert. Die Transformanten werden auf festem W0BDIF-Medium selektiert. Die Klone, die wachsen, werden anschließend in Chargen zusammengefasst und mit PCR analysiert, indem man die Primer N3 (SEQ ID NO: 3) und N13 (SEQ ID NO: 13) verwendet. Auf die gleiche Art und Weise wie im vorhergehenden Abschnitt werden die individuellen Klone durch PCR überprüft.
Beispiel Nr. 5: Konstruktion des Stamms W (hR, Lhb5):
Der Integrationsvektor pAP1 wird mit XbaI geschnitten. Die 4 Klone SP1, SP2, C1 und C2 werden mit diesem linearisierten Fragment transformiert. Die Transformanten werden auf YPGA-Medium ausgestrichen. Durch homologe Rekombination in der Hefe wird die Expressionskassette von humanem Cytochrom b5 unter der Abhängigkeit des Promotors und des Terminators des PGK-Gens an der intergenischen Stelle leu2/SPL1 integriert (14). Diese Rekombination ermöglicht es gleichzeitig, das inaktive Gen leu2-3 in dem Genom durch Wildtyp-LEU2, das von dem Vektor pAP1 getragen wird, zu ersetzen. Eine erste Selektion der Transformanten erfolgt auf die Restitution des Gens LEU2, das heißt die Prototrophie der Transformanten gegenüber Leucin (Selektionsmedium W0AI). Eine zweite Selektion erfolgt durch PCR an der genomischen DNA der Transformanten unter Verwendung der Primer N9 (SEQ ID NO: 9) und N16 (SEQ ID NO: 16) und den im Abschnitt 9 beschriebenen PCR-Bedingungen. Die Klone, die eine PCR-Bande mit 1495 bp aufweisen, haben die Expressionskassette von hb5 integriert.

– Primer N16: 5'-GCCCAGATCTATGGCAGAGCAGTCGGACG-3' (SEQ ID NO: 16) umfasst von der Base 1 bis 4 eine GC-Klammer-Sequenz, von der Base 5 bis 10 eine Stelle BglII und von der Base 11 bis 29 eine zu den Nukleotiden 1 bis 19 (ab ATG) des offenen Leserasters des Gens für humanes Cytochrom b5 homologe Sequenz.

Beispiel Nr. 6: Konstruktion des Stamms W (GhR, Lhb5):
Die Konstruktion dieses Stamms wird auf die gleiche Weise vorgenommen wie der Stamm W (hR, Lhb5), aber aus W (GhR, ΔB). Die Selektion der Transformanten wird direkt auf W0ABI-Medium gemacht, dann durch PCR-Analyse an der genomischen DNA.
Beispiel Nr. 7: Konstruktion des Stamms W (R, Lhb5, Yb5):
Der Stamm W (R) wird in flüssigem YGPA-Komplettmedium kultiviert und mit dem Vektor pAP1, der mit Xba1 linearisiert wurde, transformiert. Eine erste Selektion der Transformanten erfolgt auf die Restitution des Gens LEU2, das heißt die Prototrophie der Transformanten gegenüber Leucin (Selektionsmedium W0AI). Eine zweite Selektion erfolgt durch PCR an der genomischen DNA der Transformanten unter Verwendung der Primer N9 (SEQ ID NO: 9) und N16 (SEQ ID NO: 16) und den in Abschnitt 9 (Material und Verfahren) beschriebenen PCR-Bedingungen. Die Klone, die eine PCR-Bande mit 1495 bp aufweisen, haben die Expressionskassette von hb5 integriert. Dieser Stamm überexprimiert die Hefe-Reduktase in Gegenwart von Galactose und exprimiert humanes Cytochrom b5 unter der Kontrolle des PGK-Promotors. Die Expression von endogenem b5 bleibt im Vergleich mit dem normalen Stamm unverändert.
Beispiel Nr. 8: Konstruktion des Stamms W (hR, Lhb5, Yb5):
Die Konstruktion ist mit derjenigen des Stamms W (R, Lhb5, Yb5) identisch, aber man ersetzt den Stamm W (R) durch den Stamm W (hR).
Beispiel Nr. 9: Expressionsniveaus der Cytochrome P450 in den erfindungsgemäßen Hefestämmen.
Die Expressionsniveaus von zwei Cytochromen P450 in den verschiedenen Stämmen sind in den Tabellen II und III angegeben. Überraschenderweise ist das Expressionsniveau der Cytochrome P450 bei äquivalenten Kulturbedingungen in den humanisierten Stämmen signifikant erhöht. Man stellt fest, dass die Aktivität pro mg Protein gleichzeitig proportional zum Expressionsniveau und zum Turnover-Wert gesteigert ist. Tabelle II: Expression von humanem Cytochrom P450 1A1 in den humanisierten Hefe-Mikrosomen

^a Konzentration an Cytochrom P450 (spektrale Bestimmung) der Mikrosomensuspension.
^b Konzentration an Gesamtproteinen der Mikrosomenlösung.

Beispiel Nr. 10: Wirkung von Reduktase und Cytochrom b5 auf die enzymatischen Merkmale der produzierten Cytochrome P450 1A1 und 3A4 bei der Hefe.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die katalytische Wirksamkeit des Cytochrom P450 1A1 in dem haploiden Stamm W (R, LHb5), der Hefe-Reduktase überproduziert und humanes Cytochrom b5 produziert, optimal ist. Die Zugabe von Kaninchen-Cytochrom b5 erzeugt dennoch eine leichte zusätzliche Erhöhung der Aktivität, die einen Turnover von 27 pmol Metabolit/pmol Cytochrom P450 pro min erreicht.
Im Gegensatz zu den mit dem Cytochrom P450 1A1 erhaltenen Ergebnissen ist die katalytische Wirksamkeit des Cytochrom P450 3A4 vorzugsweise in den Hefestämmen gesteigert, die humane Reduktase exprimieren. Der Stamm W (GhR, hb5) zeigt eine optimale katalytische Wirksamkeit. Wie auch immer die Art und das Niveau der Reduktase sein mögen, die Gegenwart von für Cytochrom b5 kodierender cDNA in dem Genom der Stämme äußert sich durch eine Erhöhung der katalytischen Wirksamkeit (um einen Faktor 2 bis 20). Die Deletion des endogenen Gens für Cytochrom b5 zeigt sich als ein sehr günstiger Faktor besonders in Gegenwart von exprimiertem humanem b5. Die Expression von humaner Reduktase, die Zerstörung des endogenen Cytochrom b5 und die Expression von humanem b5 in dem gleichen haploiden Hefestamm stellt eine besonders günstige Gesamtheit für die Expression bestimmter humaner Cytochrome P450, insbesondere Cytochrom P450 3A4 dar.
Beispiel Nr. 11: Konstruktion von Plasmiden, die die Coexpression eines Cytochrom P450 und von humanem mikrosomalem Cytochrom b5 ermöglichen.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, die für die Optimierung der P450-Aktivität der erfindungsgemäßen Hefestämme verwendbar sind. Diese Plasmide ermöglichen die gleichzeitige Expression eines Cytochrom P450 und von humanem mikrosomalem Cytochrom b5. Alle Plasmide der Reihe umfassen die neuartige Gesamtheit der folgenden gemeinsamen Merkmale:

(i) Die P450-Expressionskassette ist vorzugsweise unter der Transkriptionskontrolle des induzierbaren GAL10-CYC1-Promotors.
(ii) Die Cytochrom b5-Expressionskassettte ist vorzugsweise unter der Transkriptionskontrolle von einem der drei folgenden Promotoren: GAL10-CYC1. GAPDH oder PGK.
(iii) Zwei Selektionsmarker sind vorhanden, von denen der eine vorzugsweise das Hefegen ADE2 ist.
(iv) Die beiden Expressionskassetten sind auf dem Plasmid auf der einen Seite durch den Hefereplikationsursprung, auf der anderen Seite durch den Marker ADE2 getrennt. In dem Fall, wo zwei identische Promotoren vom Typ GAL10-CYC1 für die Expression von b5 und P450 verwendet werden, haben diese Promotoren auf dem Plasmid umgekehrte Orientierungen (bezogen auf eine Rotation des Plasmids). Zwei verschiedene Transkriptionsterminatoren werden verwendet, vorzugsweise diejenigen der Hefegene PGK und P450 Reduktase. Die Gesamtheit dieser Eigenschaften hat den Erhalt von insbesondere in Bezug auf die Phänomene der homologen Rekombination stabilen Plasmide zum Ziel.

Die Plasmide der Reihe unterscheiden sich durch die Art des für die Expression von Cytochrom b5 verwendeten Promotors. Diese Eigenschaft ermöglicht es, die relativen Expressionsniveaus anzupassen und sie für verschiedene Kulturbedingungen oder Anwendungen zu optimieren.
Beispiel 11.1. Konstruktion des Plasmids pAP4, das die Expression eines P450 unter der Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors und von humanem b5 unter PGK-Promotor ermöglicht.
Der in der 15 beschriebene Vektor pYeDP1/10/Hb5 enthält das ORF (offenes Leseraster) von humanem Cytochrom b5, das sofort vor dem Initiationscodon durch eine BglII-Stelle und sofort nach dem STOP-Codon durch eine EcoRI-Stelle gesäumt ist, wobei die BglII-EcoRI-Kassette in den Expressionsvektor pYeDP1/10 eingefügt ist (Cullin und Pompon, Gene. 65 (1988) 203–217). Dieser Vektor wird von BamHI und HindIII verdaut. Das Fragment mit 2310 bp, das die Sequenzen des Promotors und des Terminators des PGK-Gens und die für humanes Cytochrom b5 kodierende Sequenz enthält, wird gewonnen, dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um die Enden zu glätten. Der Vektor pYeDP60 wird von dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut und das Fragment mit 5819 bp gewonnen. Dieses enthält die Replikationsursprünge für die Hefe und E. coli. Dieses Fragment wird an sich selbst rezirkularisiert und ergibt den Vektor pAP2. Dieser Vektor wird von PvuII verdaut und das Fragment mit 2310 bp, das aus dem Vektor pYeDP1/10/Hb5 hervorgegangen ist, wird dort eingebaut in der Orientierung, die den Vektor pAP3 ergibt, dessen Expressionskassette der 17 entspricht. Dieser Vektor wird BglI verdaut. Das Fragment mit 7012 bp wird gewonnen. Der Vektor pYeDP60 wird mit PvuII linearisiert und die Bande, die dem linearisierten Plasmid entspricht, wird gereinigt. Eine aus einem Klon des Stamms W (N) hervorgegangene Hefekultur wird mit dem linearen Plasmid und dem Fragment mit 7012 bp cotransformiert und für Uracil und Adenin prototrophe Klone werden selektiert. Durch homologe Rekombination in der Hefe wird die Cytochrom b5-Expressionskassette unter der Kontrolle des Promotors und des Terminators des Gens PGK an die Stelle PvuII des Vektors pYeDP60 substituiert und ergibt den endgültigen Vektor pAP4 (16 und 17). Die Plasmid-DNA, die dem Vektor pAP4 entspricht, wird aus der Hefe gewonnen und für die Transformation von E. coli verwendet (Amp^r). Nach Selektion, Amplifikation und Kontrolle der Plasmidstruktur durch Restriktion wird das ORF des interessierenden Cytochrom P450 in den Vektor pAP4 in den multiplen Klonierungsbereich, der zwischen dem Promotor GAL10-CYC1 und dem Terminator des Gens PGK liegt, inseriert. Das resultierende Plasmid wird verwendet, um durch Selektion von für Adenin und Uracil prototrophen Klonen den aufnehmenden Hefestamm, der vorzugsweise unter den in dem vorliegenden Patent beschriebenen ausgewählt ist, zu transformieren.
Beispiel 11.2. Konstruktion des Plasmids pVD2, das die Expression eines P450 unter der Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors und von humanem b5 unter GAPDH-Promotor ermöglicht.
Der Vektor pYeDP1/10/Hb5 wird von BglII und EcoRI verdaut, um die Bande, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, hervorzuholen. Die Bande mit 417 bp, die dem ORF von b5 entspricht, wird gereinigt, dann in von BamHI und EcoRI verdauten pAB2 kloniert. In dem erhaltenen Vektor wird dann die Stelle EcoRI durch Verdau mit EcoRI zerstört, dann Auffüllen der Stelle mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase, dann Rezirkulation durch die Ligase. Dieses Plasmid mit 4993 bp wird pVD1 genannt (16 und 18).
Die pVD1-Expressionskassette wird dann durch PCR unter Verwendung der Primer N17 (SEQ ID NO: 17) und N18 (SEQ ID NO: 18) als Primer amplifiziert. Die amplifizierte Bande hat 1753 bp. Die Primer sind konzipiert, um an die beiden Enden der Expressionskassette Rekombinationspunkte hinzuzufügen, die zu der Region, die um die einzige PvuII-Stelle von pYeDP60 herum liegt, homolog sind. Durch homologe Rekombination (siehe Beispiel 11.1 und 17) zwischen pYeDP60, das an der Stelle PvuII linearisiert und durch alkalische Phosphatase dephosphoryliert ist, und der durch PCR amplifizierten Expressionskassette wird dann der Vektor pVD2 gemäß den 16 und 19 erhalten. Nach Pendeln wird die Struktur des Vektors bei der Hefe (Cotransformation), dann E. coli (Selektion und Amplifikation) durch Verdau mit PstI und HindIII überprüft. Das gewünschte Plasmid, das eine Verdaubande mit 10994 bp aufweist, wird pVD2 genannt (19). Die verschiedenen Schnittstellen der Expressionskassette werden durch Sequenzierung mit Hilfe der Primer N19 (SEQ ID NO: 19) und N20 (SEQ ID NO: 20) überprüft.
Beispiel 1.3. Konstruktion des Plasmids pVD3, das die Expression eines P450 unter der Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors und von humanem b5 unter GAL10-CYC1-Promotor ermöglicht.
Wie in der vorhergehenden Konstruktion wird das ORF von humanem Cytochrom b5 aus pYeDP1/10/hb5 in Form von BglII-EcoRI-Fragment erhalten. Dieses ORF wird durch Ligation zwischen die Stellen BamHI und EcoRI des Plasmids pYeDP110, in 15 beschrieben, eingeführt, das einen Sequenzblock enthält, der besteht aus (i) Sequenzen, die direkt vor der Promotorregion des Gens für Hefe-P450-Reduktase liegen, (ii) dem Gen URA3, (iii) dem Promotor GAL10-CYC1, (iv) dem Transkriptionsterminator des Gens für Hefe-P450-Reduktase. Wie zuvor wird die Stelle EcoRI des Plasmids, das aus der Ligation resultiert, durch Schneiden – Auffüllen – Ligation zerstört, um ein Plasmid mit 5551 bp zu ergeben, das pVD3 genannt wird (20). Die Expressionskassette von humanem Cytochrom b5 unter dem GAL10-CYC1-Promotor wird dann durch PCR mit den Primern N17 und N18 auf gleiche Weise wie in Beispiel 12 amplifiziert. Die amplifizierte Bande mit 2365 bp wird gereinigt, dann wie zuvor durch homologe Rekombination an die Stelle der PvuII-Stelle von pYeDP60 eingeführt (gleich wie 19, indem man den Promotor GAPDH durch GAL10-CYC1 ersetzt). Die Art der Sequenzen der durch PCR eingeführten Rekombinationspunkte gibt eine inverse Orientierung der beiden GAL10-CYC1-Kassetten vor, die auf dem rekombinierten Plasmid vorhanden sind, wie in der Beschreibung der allgemeinen Struktur der Plasmide der Erfindung angegeben. Das Plasmid mit 11595 bp, pVD4 genannt und gemäß der 16, wird dann nach Pendeln Hefe – E. coli selektiert. Die Schnittstelle zwischen dem GAL10-CYC1-Promotor und dem Gen für Cytochrom b5 wird durch Sequenzierung mit dem Primer N21 (SE ID NO: 21) überprüft.
Nomenklatur der erhaltenen Stämme:

W (GhR, ΔB): MATa, leu2-3, 112, ade2-1, trp1-1, ura3-1.
W (hR, ΔB): MATa, leu2-3, 112, ade2-1, trp1-1.
W (hR, hb5): MATa, leu2-3, 112, ade2-1, trp1-1.
W (GhR, hb5): MATa, leu2-3, 112, ade2-1, trp1-1, ura3-1.
W (hR, Lhb5): MATa, ade2-1, trp1-1.
W (GhR, Lhb5): MATa, ade2-1, trp1-1, ura3-1.
W (R, Lhb5, Yb5)
W (hR, Lhb5, Yb5)

Sequenzen der verwendeten Primer:
Die ersten 42 Basen sind zu der Region zwischen den Basen 4069 und 4113 von pYeDP60 homolog. In Großbuchstaben, Basen 43–69, die Nukleotide des Primers sind zu der Region von pUB81 zwischen den Basen 5772 und 5799, die einer Region des Gens URA3 entsprechen, homolog.
Die ersten 43 Basen sind zu dem Komplementärstrang der Region von pYeDP60 zwischen den Basen 4114 und 4157 homolog. Die Basen 44 bis 71 sind zu der Region von pUB81 zwischen den Basen 2507 und 2538 homolog.
Dieser Primer ist zu der Region zwischen 4102 bis 4125 von pVD2 homolog, die dem Ende des offenen Leserasters des Gens URA3, das neben der Integrationskassette von humanem Cytochrom b5 unter dem Promotor GAPDH liegt, entspricht.
Dieser Primer für die Sequenzierung ist homolog zu dem Teil von pVD2 zwischen den Basen 4835 und 4860, der dem Ende des Promotors GAPDH entspricht.
Dieser Primer für die Sequenzierung ist homolog zu der Region des GAL10-CYC1-Promotors, die bei –120 bp von der Schnittstelle zwischen dem GAL10-CYC1-Promotor und dem ORF von humanem Cytochrom b5 liegt.
REFERENZEN:

– Baim, S. B. & Scherman, F. (1988) mRNA structures influencing translation in the yeast S. cerevisiae, Mol. Cell. Biol. 8, 1591–1601.
– Barnes, N. J. Arlotto M. P. & Waterman, M. R. (1991) Expression and enzymatic activity of recombinant cytochrome P450 17a-hydroxylase in Escherichia coli Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5597–5601.
– Bellamine, A. Gautier, J. C. Urban P. & Pompon D. (1994) Chimeras of the human cytochrome P450 1A family produced in yeast: Accumulation in microsomal membranes, enzyme kinetics and stability, Eur. J. Biochem. 225, 1005–1013.
– Bonneaud, N. Ozier-Kalogeropoulos, O. Li, G. Labrousse, M. Minvielle-Sebastia, L. & Lacroute, F. (1991) A family of low and high copy replicative, integrative and single strand S. cerevisiae/E. coli shuttle vectors, Yeast 7, 609–615.
– Cullin, C. & Pompon, D. (1988) Synthesis of functional mouse cytochrome P450 P1 and chimeric cytochrome P450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Gene (Amst.) 65, 203–217.
– Doehmer, J. & Greim, H. Cytochromes P450 in genetically engineered cell cultures: the gene technological approch in Cytochrome P450, Handbook of experimental pharmacology, 105; Eds. Schenkmann, J. B. & Greim, H. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1992), 3–13.
– Guengerich, F. P. (1988) Roles of cytochrome P450 enzymes in chemical carcinogenesis and cancer chemotherapy, Cancer Res. 48, 2946–2954.
– Oeda, K. Sakaki, T. & Ohkawa, H. (1985) Expression of rat liver cytochrome P-450MC cDNA in Saccharomyces cerevisiae, DNA 4, 203–210.
– Pompon, D. (1988) cDNA cloning and functional expression in yeast Saccharomyces cerevisiae of b-naphtoflavone-induced rabbit liver cytochromes P-450 LM4 and LM6, Eur. J. Biochem. 177, 285–293.
– Stotz, A. & Linder, P. (1990), The ADE2 gene from Saccharomyces cerevisiae: sequence and new vectors, Gene (Amst.) 95, 91–98.
– Truan, G. Cullin, C. Reisdorf, P. Urban, P. & Pompon, D. (1993) Enhanced in vivo monooxygenase activities of mammalian cytochrome P450s in engineered yeast cells producing high levels of NADPH-cytochrome P450 reductase and human cytochrome b5, Gene (Amst) 125, 49–55.
– Truan, G. Epinat, J. C. Rougeulle, C. Cullin, C. & Pompon, D. (1994) Cloning and charactherization of yeast cytochrome b5-encoding gene wich supresses ketokonazole hypersensivity in a NADPH-P-450 reductase-deficient strain, Gene (Amst.) 142, 123–127.
– Urban, P. Cullin, C. & Pompon, D. (1990) Maximizing the expression of mammalian cytochrome P-450 monooxygenase activities in yeast cells, Biochimie (Paris) 72, 463–472.
– Urban, P. Truan, G. Gautier, J. C. & Pompon, D. (1993) Xenobiotic metabolism in humanized yeast: engenieered yeast cells producing human NADPH-cytochrome P450 reductase, cytochrome b5, epoxide hydrolase and cytochrome P450s, Biochem Soc Transact 21, 1028–1033.
– Zuber, M. X. Simpson, E. R. & Waterman, M. R. (1986) Expression of bovine 17a-hydroxylase cytochrome P-450s cDNA in nonsteroidogenic (COS1) cells, Science 234, 1258–1261.
– Patent Nr. WO 93/02200: Souches de levure avec integration stable de gènes hétérologues.
– Patent Nr. WO 94/01564: Souche de levure permettant la co-expression d'une activité mono-oxygénase de cytochrome P450 de plante et d'une NADPH-cytochrome P450-réductaseendogène ou hétérologue et son utilisation à des fins de bioconversion.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Genetisch veränderter Hefestamm, dadurch gekennzeichnet, dass: 1. die Gene, die für endogenes Cytochrom b5 und für endogene Cytochrom P450-Reduktase kodieren, inaktiviert wurden, 2. er eine Nukleinsäure enthält, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, 3. er eine Nukleinsäure enthält, die für humanes Cytochrom b5 kodiert.
Stamm gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine cDNA ist.
Stamm gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der humanen cDNA unter Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Hefepromotors steht.
Stamm gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen konstitutiven Promotor handelt, der ausgewählt ist unter dem Promotor des Gens der Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase, dem Promotor des Gens der Phosphoglycerat-Kinase und dem endogenen Promotor von Cytochrom b5.
Stamm gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der induzierbare Promotor ausgewählt ist unter den GAL10- und CYC1-GAL10-Promotoren.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, in das Genom der Hefe integriert ist.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, in das Genom der Hefe integriert ist.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem wenigstens eine Nukleinsäure umfasst, die für ein humanes Cytochrom P450 kodiert.
Stamm gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom P450 kodiert, auf einem Plasmid integriert ist.
Stamm gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem eine zusätzliche Kopie der Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, auf besagtem Plasmid oder in das Genom integriert umfasst.
Stamm gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er haploid ist.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae ist.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm handelt, der eine Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, und eine Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, umfasst.
Stamm gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, dort unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase steht.
Stamm gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, dort unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Phosphoglycerat-Kinase steht.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom b5 kodiert, dort unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Phosphoglycerat-Kinase steht, und die Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, dort unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase steht.
Stamm gemäß den Ansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem wenigstens eine Nukleinsäure umfasst, die für ein humanes Cytochrom P450 kodiert.
Stamm gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humanes Cytochrom P450 kodiert, auf einem Plasmid integriert ist.
Genetisch veränderter Hefestamm, der eine Nukleinsäure umfasst, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, und dessen Gene, die für Hefe-Cytochrom b5 und Hefe-NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodieren, inaktiviert wurden.
Stamm gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, die für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, unter Kontrolle des Promotors des Gens der Hefe-Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase steht.
Verfahren zum Erhalt von Stämmen gemäß Anspruch 13 oder Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Hefestamm einsetzt, der eine Nukleinsäure umfasst, die unter Kontrolle des GAL10-CYC1-Promotors für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, und dessen Gene, die für Hefe-Cytochrom b5 und Hefe-NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodieren, inaktiviert wurden.
Verfahren zum Erhalt von Stämmen gemäß Anspruch 14 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Hefestamm einsetzt, der eine Nukleinsäure umfasst, die unter Kontrolle des Promotors der Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase für humane NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodiert, und dessen Gene, die für Hefe-Cytochrom b5 und Hefe-NADPH-Cytochrom P450-Reduktase kodieren, inaktiviert wurden.
Verfahren zur Ermittlung der Toxizität einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass: – besagte Verbindung mit einer Hefe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 oder einer Enzymzubereitung, die von einer solchen Hefe abgeleitet ist, zusammengebracht wird und – man die erzeugten Metaboliten hinsichtlich ihrer Toxizität analysiert.
Verfahren zur in vitro-Bestimmung der humanen Metaboliten einer chemischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass: – besagte Verbindung mit einer Hefe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 oder einer Enzymzubereitung, die von einer solchen Hefe abgeleitet ist, zusammengebracht wird und – man die erzeugten Metaboliten analysiert.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es die gleichzeitige Expression in der Hefe eines vorzugsweise humanen Cytochroms P450 und von humanem mikrosomalem Cytochrom b5 ermöglicht.
Plasmid gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass: (i) die P450-Expressionskassette bevorzugt den GAL10-CYC1-Promotor umfasst, (ii) die b5-Expressionskassette bevorzugt einen der GAL10-CYC1-, PGK- oder GAPDH-Promotoren umfasst und (iii) wenn der gleiche Promotor zweimal verwendet wird, die beiden Kopien auf dem Plasmid in umgekehrten Orientierungen vorhanden sind.
Plasmid gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Expressionskassetten auf dem Plasmid auf der einen Seite durch den Hefereplikationsursprung, auf der anderen Seite durch wenigstens einen Hefeselektionsmarker getrennt sind.
Hefestamm, der mit einem Plasmid gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27 transformiert ist.
Hefestamm gemäß Anspruch 28, der frei von endogenem Gen für mikrosomales Cytochrom b5 ist.