JP2022502081A - 遺伝子操作された微生物ならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる2018年9月20日出願の米国特許仮出願第62/733,896号の優先権を主張するものである。
非適用
本開示の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列を含む、コンピュータで読み取り可能な形態を含む。配列表の主題は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は一般に、遺伝子操作された微生物に関する。
本開示の様々な態様の間に、遺伝子操作された微生物、ならびに結合剤の表面提示における使用のために、そして感知の用途のために該微生物を作製および使用する方法の提供がある。
微生物を提供すること;提示カセットを提供すること;および該微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に該提示カセットを組み込むこと、を含み、該提示カセットが、結合剤の発現のための配列と;該結合剤を発現することが可能なプロモータと;ターミネータと;アンカーと;分泌シグナルペプチドと、を含む、方法を提供する。
本開示は、少なくとも一部が、遺伝子操作されたサッカロマイセス・ブラウディ(S.ブラウディ、Sb)が片利共生の、または病原性の消化管細菌の標的化された結合、感知、および/または殺傷に用いられ得る、という発見に基づく。
本明細書に記載された通り、微生物は、感知、検出および/または処置/破壊する(例えば、病原体を除去する)ように遺伝子操作され得る。
b.突然変異体Wcs1は、センサ設計のために「膜貫通型」タンパク質として用いられた。mtWsc1の主要な役割は、「ステム」として細胞外刺激を細胞内シグナル伝達に接続させることである。本明細書に記載された通り、mtWsc1は、Mid2タンパク質のS/Tリッチ領域を付加することにより伸長され得るが(Mid2タンパク質は、Flo1タンパク質と類似の細胞壁タンパク質の型である)、センサ設計の目的ではアンカーと見なされない。
該微生物は、微生物の膜上にアンカータンパク質を取り込むように遺伝子操作され得る。アンカータンパク質は、遺伝子操作された微生物の表面に結合剤を固定するのに適した任意のアンカータンパク質であり得る。
本開示は、該遺伝子操作された微生物系のバイオセンサ/検出物質用途における使用のためのステムを提供する。
開示されたシステムは、微生物(例えば、真菌、酵母、バクテリア、プロバイオティクス(バクテリア、酵母))を利用して、生体分子または結合剤を提示する。
生体分子(例えば、scFvなどの結合ドメイン、受容体、エンドリシンの細胞壁結合ドメインなどの細胞壁結合ドメイン、抗体または抗体機能性断片を有するペプチド)などの結合剤は、遺伝子操作された微生物の表面で提示され得る。そのため該遺伝子操作された微生物は、病原体への結合親和性を有するように設計され得る。
本明細書に記載された通り、本開示は、標的微生物、例えば片利共生微生物および病原体などの腸内生物体と、または該生物体に対して特異的に相互作用する生体分子の細胞表面提示を提供する。片利共生および病原性の微生物は、バクテリア、ウイルス、または真核生物であり得る。
該遺伝子操作された微生物は、人工感知およびシグナル伝達における使用のためのレポータを取り込むように遺伝子操作され得る。
本明細書に記載された通り、本開示は、臨床目的で微生物(例えば、酵母)表面提示の新規用途を提供する。微生物(例えば、S.ブラウディなどのヒト消化管に定着しないプロバイオティクス)の表面が、指定された微生物(例えば、バクテリア、真菌、ウイルス)に特異的に結合する結合剤(例えば、生体分子)でコーティングされ得る。
本開示はまた、インビボで広範囲の感知可能な標的微生物(例えば、細菌体)を選択的に認識してそれと反応する、遺伝子操作された微生物バイオセンサを構築する方法を提供する。遺伝子操作された微生物は、レポータを含み得る。
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義して、本発明の実践において当業者を誘導するために提供されている。他にことわりがなければ、用語は、関連の技術分野の当業者による従来の使用に従って理解されるべきである。
本明細書で記載された通り、表面提示は、ゲノム編集を利用して実施され得る。ゲノム編集の工程は、周知であり、例えばAldi 2018 Nature Communications 9(1911)を参照されたい。それゆえ本明細書で他に断りがある場合を除き、本開示の工程は、そのような工程に従って実行され得る。
本明細書に記載された薬剤および組成物は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるRemington’s Pharmaceutical Sciences(A.R. Gennaro, Ed.)、 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)に記載される通り、1種または複数の医薬的に許容できる担体または賦形剤を用いて任意の従来の手法により配合され得る。そのような配合剤は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、精製形態であり得る治療有効量の本明細書に記載された生物活性剤を、適切な量の担体と共に含有することになる。
同じく提供されるのは、微生物/細菌感染を処置または予防するために、遺伝子操作された微生物の治療有効量の投与が必要な対象において疾患または微生物感染(例えば、ウイルス感染、病原性共生生物、病原性微生物への感染)を処置する工程である。
本明細書に記載された薬剤および組成物は、当業者に知られた種々の手段で本明細書に記載された方法に従って投与され得る。該薬剤および組成物は、外因性材料または内因性材料のいずれかとして治療に用いられ得る。外因性薬剤は、身体の外側で生成または製造されて、身体に投与されるものである。内因性薬剤は、体内への送達または体内の他の臓器への送達のために幾つかの型のデバイス(生物学的または他の)により身体の内側で生成または製造されるものである。
以下の非限定的実施例は、本開示をさらに例示するために提供されている。以下の実施例で開示された技術が、本開示の実践において本発明者らが機能を十分に見出したアプローチを表し、したがってその実践のための方式の実施例を構成すると判断され得ることは、当業者に認識されなければならない。しかし当業者は、本開示に照らして、開示された具体的実施形態で多くの変更がなされ得ること、そしてそれでも本開示の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを、認識すべきである。
以下の実施例は、プロバイオティクス酵母(例えば、サッカロマイセス・ブラウディ)の遺伝子操作を記載している。これらの遺伝子操作されたプロバイオティクス酵母は、病原体の除去に用いられ得る。この実施例は、抗体/結合ドメインの表面提示の構築、およびCRISPRに基づくゲノム編集ツール調製の設計を記載している。
ここでは、S.ブラウディのためのタンパク質提示システムの完成が示されている。提示システムは、Flo428アンカータンパク質に基づいて構築され、検証された。表面提示は、宿主消化管内で遺伝子操作されたS.ブラウディの安定性/寿命を変化させない。MNoV結合ドメインの表面提示は、MNoVに向けられるS.ブラウディのインビトロ結合活性を増強した(約3倍)。
ここでは、フロキュリン系が、用いられた。1つの標的ペプチド(例えば、CLM−1)を提示するための単一キメラタンパク質の簡単なカセットが、構築された(例えば、図9参照)。
ここで実証された通り、gRNAを含むCRISPRゲノム編集ツールは、S.ブラウディゲノムにおいて効率的なインタージェニック部位を標的化するために使用に成功し、合成転写システムが、dCas9に基づいて開発された。
以下の実施例は、真菌バイオセンサとしての使用のためのS.ブラウディ表面でのタンパク質提示を記載している。この実施例は、人工センサおよびシグナル伝達システムの構築、ならびにCRISPRに基づくゲノム編集ツール調製の設計を記載している。
合成転写システムが、構築および検証された。キメラセンサのバックボーンが、ネイティブ膜貫通型タンパク質に基づいて構築された。一組のキメラセンサ(合計8)が、第一の標的であるS.アウレウスのために構築された(scFvs、ZW88)。
クローニング試薬:New England Biolabs
他の化学試薬:Sigma−AldrichおよびThermoFisher
オリゴヌクレオチド:Integrated DNA technologies
S.ブラウディ:American Type Culture Collection
プロバイオティクス酵母における合成バイオセンサの要件
キメラセンサは、拡張可能な標的範囲および直交性発現システムを有する。
レポータカセットが、ゲノム(IS1)に組み込まれた。スカフォールドRNA(scRNA)、トランス活性化因子、およびdCas9のエピソーム発現が、実施された。
新しいscRNA標的配列の基準としては、自己相補性がないこと、S.ブラウディ(セレビシエ)ゲノムの中に同じ配列がないこと、適切な効率、およびdCas9発現カセットとレポータ遺伝子とセンサ発現カセットとを含むセンサシステムの他のコンパートメント内に同じ配列がないこと、が挙げられた。PGALsyn1は、PGAL7の最初のscRNA結合配列(20塩基対)と最小プロモータ領域(3’末端から165塩基対)とを接続することにより設計された。他のプロモータでは、該最初のscRNA結合配列が、FastCloning法(Li et al.,2011)を通して他のscRNA結合配列により置き換えられた。
PGALsynプロモータ、レポータ(GFPまたはRFP)、およびTcyc1を含む新しいレポータカセットが、CRISPR−Cas9ゲノム編集を介してIS1nインタージェニック部位に組み込まれた。
このセンサ部分では、細胞外刺激が、細胞内シグナルに変換された:結合ドメイン(例えば、機能的抗体断片(scFv他)、受容体、エンドリシン細胞壁結合ドメイン他)、膜貫通型ドメイン、およびシグナル分子。
コアが、局在化のために単一ペプチドで構築された:膜貫通型ドメイン(例えば、突然変異体Wsc1p);結合ドメインおよびトランス活性化クローニングのためのMCS;プロモータおよびターミネータ(PFAU1はS.セレビシエにおいてPWSC1の50%発現レベルを呈する);結合ドメイン(ZW88(2017, Wang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.)、抗S.アウレウスscFv。
ここで実証された通り、キメラセンサのコア構造が、開発された。
以下の実施例は、ノロウイルスを標的化する先に記載された酵母表面提示の使用を記載している。該遺伝子操作されたS.ブラウディがCLM−1を提示することが実証された。
ノロウイルスは、急性胃腸炎の突発の主因である。MNoVは、細胞培養で日常的に生育されることができ、実験用マウスに感染させることができ、ノロウイルスの複製および病原性のメカニズムを定義するためのシステムとして用いられてきた。
CMRF35様分子1(CLM−1)が、MNoVの標的タンパク質として用いられた。膜貫通型タンパク質が、単一IgV様細胞外ドメインを含有する。モノクローナル抗体との反応性により同定されたCMRF35抗原は、単球、好中球、ならびに一部のTおよびBリンパ球上に存在する。
エンドリシン遺伝子の3’末端領域の細胞壁結合ドメインが、終止コドンを用いずに増幅されて、CLM−1提示カセット内のCLM−1をコードする遺伝子に置換された。新しい提示カセットもまた、CRISPR−Cas9ゲノム編集を通してインタージェニック部位IS1nに組み込まれた。
標的タンパク質が、S.ブラウディ株の表面での提示に成功した(例えば、図7参照)。蛍光シグナルの環形状は、表面提示を表す。一次抗体は、CLM−1タンパク質を直接標的化するGenentech 3F6(ハムスター、非市販)であった。二次抗体:647にコンジュゲートされた抗ハムスター抗体。
インビトロ結合アッセイ(例えば、図13参照)が、ここで実証される。
この実施例では、マウス消化管におけるS.ブラウディの安定性および生存能力を決定した。S.ブラウディ細胞が中断の2日後にマウス消化管からほとんどクリアランスされたことが、示された。この実施例は、マウスモデルでの哺乳動物消化管におけるS.ブラウディの寿命/滞留を記載している。
Claims (73)
- 遺伝子操作された微生物であって、
前記遺伝子操作された微生物の表面で提示された少なくとも1種の結合剤を含み、前記結合剤が標的微生物への結合親和性を有する、
遺伝子操作された微生物。 - 前記結合剤が、アンカータンパク質を介して前記遺伝子操作された微生物に動作可能に連結されている、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記アンカータンパク質が、細胞壁タンパク質アンカー領域である、請求項2に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記細胞壁タンパク質アンカー領域が、Flo1pアンカー領域である、請求項3に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記結合剤が、膜貫通型タンパク質を含むステムを介して、前記操作された微生物に動作可能に連結されている、請求項1に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記膜貫通型タンパク質が、Wsc1p(C8A)から選択される、請求項5に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記ステムが、前記膜貫通型タンパク質に動作可能に連結された細胞壁タンパク質ドメインを含み、前記細胞壁タンパク質ドメインが、前記ステムを細胞外空間に延長することが可能である、請求項5に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記細胞壁タンパク質ドメインが 、Mid2タンパク質(Mid2p)である、請求項7に記載の遺伝子操作された微生物。
- 第一の結合剤および第二の結合剤を含み、前記第一の結合剤が、第一の標的微生物に結合することが可能であり、前記第二の結合剤が、第二の標的微生物に結合することが可能であり、前記第一の結合剤が、前記第二の結合剤と異なる、請求項1のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- サッカロマイセス属酵母である、請求項1または2に記載の遺伝子操作された微生物。
- サッカロマイセス・セレビシエ var.ブラウディ(S.ブラウディ)から選択される、請求項10に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、病原性共生生物、片利共生微生物、または病原体である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、バクテリア、真菌、ウイルス、または真核生物である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、ノロウイルス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム属病原性共生生物、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンス、カンピロバクター・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)、ストレプトコッカス・ピオゲネス、サルモネラ、P.エルギノーサ、E.コリ、またはscFv、受容体もしくは結合ドメインなどの結合剤により標的化され得る結合領域を有する任意の他の生物体からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記結合剤が、前記標的微生物に特異的に結合する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記結合剤が、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノボディ、それらの一本鎖断片、およびそれらの組み合わせからなる群の1つまたは複数を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記結合剤が、標的微生物の細胞壁結合ドメインおよびエンドリシンの細胞壁結合ドメインからなる群の1つまたは複数を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記アンカータンパク質が、プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内に細胞壁タンパク質アンカー領域を含む、請求項2に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、ノロウイルスであり、前記結合剤が、CLM−1である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、クロストリジウム属病原性共生生物(C.ディフィシル/パーフリンゲンス)であり、前記結合剤が、φCP26F(PlyCP26F)の細胞結合ドメインである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、リステリア・モノサイトゲネスであり、前記結合剤が、エンドリシンPly500の細胞結合ドメイン500またはPlyP35の細胞壁結合ドメインである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、ストレプトコッカス・ピオゲネスであり、前記結合剤が、エンドリシンPlyCのPlyC結合ドメインである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)またはスタフィロコッカス・アウレウスであり、前記結合剤が、LysGH15B、またはエンドリシンLysGH15、LysSA97もしくはZW88の細胞壁結合ドメインである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記標的微生物が、カンピロバクター・コリであり、前記結合剤が、phiCcoIBB35の細胞壁結合ドメインである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 条件付きで切断可能なペプチドを介して膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されたトランス活性化因子をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記条件付きで切断可能なペプチドが、ユビキチナーゼの存在下で切断可能である、請求項25に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記トランス活性化因子が、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素を含む、請求項25に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素が、ヌクレアーゼヌルCas9(dCas9)である、請求項27に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素が、インタージェニック部位に組み込まれた提示単位に対応する、請求項27に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記遺伝子操作された微生物が、S.ブラウディであり、前記インタージェニック部位が、Chr VII、XII、XV、XVI、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項29に記載の遺伝子操作された微生物。
- 第一のスプリットユビキチン断片が、膜貫通型タンパク質に動作可能に連結され;
トランス活性化因子が、第二のスプリットユビキチン断片を介して前記膜貫通型タンパク質に動作可能に連結され、
前記第一のスプリットユビキチン断片と前記第二のスプリットユビキチン断片のとの物理的相互作用が、前記トランス活性化因子を放出する、
請求項25に記載の遺伝子操作された微生物。 - 前記第一のスプリットユビキチン断片が、膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されたユビキチンのN−末端37アミノ酸残基を含み、
前記第二のスプリットユビキチン断片が、ユビキチンのC−末端42アミノ酸残基を含む、
請求項31に記載の遺伝子操作された微生物。 - 前記トランス活性化因子が、レポータタンパク質の発現を開始することが可能なscRNA結合モチーフおよび転写活性化因子を含む、請求項25に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記レポータタンパク質が、GFP、RFP(例えば、mCherry)、BFPなどの蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼなどの発光タンパク質から選択される、請求項33に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記トランス活性化因子が、転写活性化ドメインを含む、請求項25に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記転写活性化ドメインが、VP64を含む、請求項35に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記トランス活性化因子が、RNAステムループ認識ドメインを含み、前記RNAステムループ認識ドメインが、細胞内酵素切断可能結合断片に融合されている、請求項25に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記RNAステムループ認識ドメインが、MCP、PCP、またはComから選択される、請求項37に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記細胞内酵素切断可能結合断片が、ユビキチン断片である、請求項37に記載の遺伝子操作された微生物。
- レポータ遺伝子を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 前記レポータ遺伝子が、GFP、RFP、BFP、発光タンパク質、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項40に記載の遺伝子操作された微生物。
- 哺乳動物の消化管内に定着しない微生物から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物。
- 請求項1〜42のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物の治療有効量を投与することを含む、片利共生の、または病原性の消化管細菌の標的化された感知、検出、または殺傷の方法。
- 請求項1〜42のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物の治療有効量を投与することを含む、消化管疾患(例えば、ノロウイルスなどの感染性疾患)を処置する方法。
- 請求項1〜42のいずれか1項に記載の遺伝子操作された微生物の治療有効量を接触させることを含む、片利共生消化管細菌を調節する方法。
- 遺伝子操作された微生物を構築する方法であって、
微生物を提供すること;
提示カセットを提供すること;および
前記微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に前記提示カセットを組み込むこと、
を含み、
前記提示カセットが、結合剤の発現のための配列と;前記結合剤を発現することが可能なプロモータと;ターミネータと;アンカーと;分泌シグナルペプチドと、を含む、
方法。 - 前記アンカーが、構成型プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内に細胞壁タンパク質アンカー領域を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記アンカーが、サッカロマイセス属酵母に由来するCwp2p、Sed1p、Ccw12pまたはFlo1pから選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記アンカーが、Flo1pから選択される、請求項46に記載の方法。
- 微生物を提供すること;
提示カセットを提供すること;および
前記微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に前記提示カセットを組み込むこと、
を含み、
前記提示カセットが、結合剤の発現のための配列と;構成型プロモータと;ターミネータと;微生物細胞壁タンパク質の膜貫通型ドメインを含むステムと;分泌シグナルペプチドと;トランス活性化因子に動作可能に連結された細胞内酵素切断可能結合断片(例えば、ユビキチンの断片)と、を含む、
遺伝子操作された微生物を構築する方法。 - 前記微生物細胞壁タンパク質の膜貫通型ドメインが、Wsc1p(C8A)から選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記提示カセットが、前記ステムに動作可能に連結された細胞壁タンパク質ドメインをさらに含み、前記細胞壁タンパク質ドメインが、前記ステムを細胞外空間に延長することが可能である、請求項50に記載の方法。
- 結合剤の第一の対および結合剤の第二の対と、
第一のトランス活性化因子および第二のトランス活性化因子と、
を含み、
前記結合剤の第一の対が、第一の標的微生物に結合することが可能であり、前記結合剤の第二の対が、第二の標的微生物に結合することが可能であり、前記結合剤の第一の対が、前記結合剤の第二の対と異なり;
前記結合剤の第一の対が、第一の膜貫通型タンパク質を介して細胞内酵素切断可能結合断片(例えば、ユビキチン断片)の第一の対に動作可能に連結され、前記第一の細胞内酵素切断結合断片の第一の対の一方が、前記第一のトランス活性化因子に動作可能に連結され;
前記第二の結合剤が、第二の膜貫通型タンパク質を介して細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対に動作可能に連結され、前記第二の細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対の一方が、第二のトランス活性化因子に動作可能に連結され;
前記細胞内酵素切断可能結合断片の第一の対の一方と、前記細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対の一方が、N−末端領域内で同一の結合タンパク質を有するが、C−末端領域内では異なるトランス活性化因子を有し、標的微生物と物理的に相互作用すること、および前記第一または前記第二のトランス活性化因子を放出することが可能である、
請求項50に記載の方法。 - 前記結合剤が、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノボディ、それらの一本鎖断片、およびそれらの組み合わせからなる群の1つまたは複数を含む、請求項46または50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が、標的微生物の細胞壁結合ドメインおよびエンドリシンの細胞壁結合ドメインからなる群の1つまたは複数を含む、請求項46または50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が、CLM−1;ZW88;φCP26F(PlyCP26F)の細胞結合ドメイン;エンドリシンPly500の細胞結合ドメイン500;エンドリシンPlyCのPlyC結合ドメイン;LysGH15B、エンドリシンLysGH15もしくはLysSA97の細胞壁結合ドメイン;またはphiCcoIBB35の細胞壁結合ドメインから選択される、請求項46、50、または53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランス活性化因子が、条件付きで切断可能なペプチドを介して膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されている、請求項50〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランス活性化因子が、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素(例えば、ヌクレアーゼヌルCas9(dCas9))を含む、請求項50または53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素が、インタージェニック部位(例えば、S.ブラウディではChr VII、XII、XV、XVI)に組み込まれた提示単位に対応する、請求項58に記載の方法。
- ヌクレアーゼヌルCas9(dCas9)およびスカフォールドRNAが、前記トランス活性化因子を対応する合成プロモータに動員する、請求項50〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランス活性化因子が、レポータ(例えば、GFP、RFP(例えば、mCherry)、BFPなどの蛍光タンパク質、発光タンパク質)または生体分子(例えば、抗体、酵素、抗菌性ペプチド)の発現を開始することが可能なscRNA結合モチーフおよびトランス活性化因子を含む、請求項50または53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランス活性化因子が、転写活性化ドメイン(例えば、VP64)を含む、請求項50〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランス活性化因子が、細胞内酵素切断可能結合断片(例えば、ユビキチン断片)に融合されたRNAステムループ認識ドメイン(例えば、MCP、PCP、Com)を含む、請求項50または53のいずれか1項に記載の方法。
- 標的レポータタンパク質の転写を開始することを含む、請求項50または53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的レポータタンパク質が、蛍光タンパク質および発光タンパク質から選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記標的レポータタンパク質が、GFP、RFP(mCherryなど)、BFP、ルシフェラーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記微生物が、S.ブラウディから選択され、前記インタージェニック部位が、Chr VII、XII、XVもしくはXVI、またはそれらの組み合わせから選択され、Cas9の対応する誘導型RNAが、前記微生物のネイティブ転写を妨害することなく標的タンパク質の安定した発現をもたらす、請求項46、50、または53のいずれか1項に記載の方法。
- 標的タンパク質の安定した発現のためのフレームワークが、インデューサを必要としない、請求項46または50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子操作された微生物の強い構成型プロモータまたは弱いプロモータを含む、請求項46または50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記強い構成型プロモータが、S.ブラウディのTDH3またはCCW12プロモータから選択される、請求項69に記載の方法。
- 前記弱いプロモータが、S.ブラウディのWSC1またはFAU1プロモータから選択される、請求項69に記載の方法。
- ターミネータをさらに含む、請求項69に記載の方法。
- 前記ターミネータが、S.ブラウディのADH1またはCYC1ターミネータから選択される 、請求項72に記載の方法。
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