JP2022502081A - 遺伝子操作された微生物ならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、遺伝子操作された微生物ならびにそれを作製および使用する方法を提供する。本明細書に記載された該遺伝子操作された微生物は、表面提示を有することができ、治療薬（例えば、スポンジ）およびバイオセンサとして有用になり得る。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる２０１８年９月２０日出願の米国特許仮出願第６２／７３３，８９６号の優先権を主張するものである。

連邦政府の後援による研究または開発に関する表明
非適用

参照により組み入れられた材料
本開示の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む、コンピュータで読み取り可能な形態を含む。配列表の主題は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本開示は一般に、遺伝子操作された微生物に関する。

発明の概要
本開示の様々な態様の間に、遺伝子操作された微生物、ならびに結合剤の表面提示における使用のために、そして感知の用途のために該微生物を作製および使用する方法の提供がある。

本開示の態様は、遺伝子操作された微生物であって、該遺伝子操作された微生物の表面で提示された少なくとも１種の結合剤を含み、該結合剤が標的微生物への結合親和性を有する、遺伝子操作された微生物を提供する。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、アンカータンパク質を介して遺伝子操作された微生物に動作可能に連結されている。

幾つかの実施形態において、該アンカータンパク質は、細胞壁タンパク質アンカー領域である。

幾つかの実施形態において、該細胞壁タンパク質アンカー領域は、Ｆｌｏ１ｐアンカー領域である。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、膜貫通型タンパク質を含むステムを介して操作された微生物に動作可能に連結されている。

幾つかの実施形態において、該膜貫通型タンパク質は、Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）から選択される。

幾つかの実施形態において、該ステムは、該膜貫通型タンパク質に動作可能に連結された細胞壁タンパク質ドメインを含み、該細胞壁タンパク質ドメインは、該ステムを細胞外空間に延長することが可能である。

幾つかの実施形態において、該細胞壁タンパク質ドメインは、Ｍｉｄ２タンパク質（Ｍｉｄ２ｐ）である。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、第一の結合剤および第二の結合剤を含み、該第一の結合剤は、第一の標的微生物に結合することが可能であり、該第二の結合剤は、第二の標的微生物に結合することが可能であり、該第一の結合剤は、該第二の結合剤と異なる。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、サッカロマイセス属酵母である。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、サッカロマイセス・セレビシエ ｖａｒ．ブラウディ（Ｓ．ブラウディ）から選択される。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、病原性共生生物、片利共生微生物、または病原体である。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、バクテリア、真菌、ウイルス、または真核生物である。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、ノロウイルス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム属病原性共生生物、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンス、カンピロバクター・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、サルモネラ、Ｐ．エルギノーサ、Ｅ．コリ、またはｓｃＦｖ、受容体もしくは結合ドメインなどの結合剤により標的化され得る結合領域を有する任意の他の生物体からなる群から選択される。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、該標的微生物に特異的に結合する。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノボディ、それらの一本鎖断片、およびそれらの組み合わせからなる群の１つまたは複数を含む。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、標的微生物の細胞壁結合ドメインおよびエンドリシンの細胞壁結合ドメインからなる群の１つまたは複数を含む。

幾つかの実施形態において、該アンカータンパク質は、プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内に細胞壁タンパク質アンカー領域を含む。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、ノロウイルスであり、該結合剤は、ＣＬＭ−１である。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、クロストリジウム属病原性共生生物（Ｃ．ディフィシル／パーフリンゲンス）であり、該結合剤は、φＣＰ２６Ｆ（ＰｌｙＣＰ２６Ｆ）の細胞結合ドメインである。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、リステリア・モノサイトゲネスであり、該結合剤は、エンドリシンＰｌｙ５００の細胞結合ドメイン５００またはＰｌｙＰ３５の細胞壁結合ドメインである。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、ストレプトコッカス・ピオゲネスであり、該結合剤は、エンドリシンＰｌｙＣのＰｌｙＣ結合ドメインである。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）またはスタフィロコッカス・アウレウスであり、該結合剤は、ＬｙｓＧＨ１５Ｂ、またはエンドリシンＬｙｓＧＨ１５、ＬｙｓＳＡ９７もしくはＺＷ８８の細胞壁結合ドメインである。

幾つかの実施形態において、該標的微生物は、カンピロバクター・コリであり、該結合剤は、ｐｈｉＣｃｏＩＢＢ３５の細胞壁結合ドメインである。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、条件付きで切断可能なペプチドを介して膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されたトランス活性化因子を含む。

幾つかの実施形態において、該条件付きで切断可能なペプチドは、ユビキチナーゼの存在下で切断可能である。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含む。

幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。

幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、インタージェニック部位に組み込まれた提示単位に対応する。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、Ｓ．ブラウディであり、該インタージェニック部位は、Ｃｈｒ ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、またはそれらの組み合わせから選択される。

幾つかの実施形態において、第一のスプリットユビキチン断片が、膜貫通型タンパク質に動作可能に連結され；トランス活性化因子が、第二のスプリットユビキチン断片を介して該膜貫通型タンパク質に動作可能に連結され、第一のスプリットユビキチン断片と第二のスプリットユビキチン断片のとの物理的相互作用が、該トランス活性化因子を放出する。

幾つかの実施形態において、該第一のスプリットユビキチン断片は、膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されたユビキチンのＮ−末端３７アミノ酸残基を含み、該第二のスプリットユビキチン断片は、ユビキチンのＣ−末端４２アミノ酸残基を含む。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、レポータタンパク質の発現を開始することが可能なｓｃＲＮＡ結合モチーフおよび転写活性化因子を含む。

幾つかの実施形態において、該レポータタンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＢＦＰなどの蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼなどの発光タンパク質から選択される。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、転写活性化ドメインを含む。

幾つかの実施形態において、該転写活性化ドメインは、ＶＰ６４を含む。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、ＲＮＡステムループ認識ドメインを含み、該ＲＮＡステムループ認識ドメインは、細胞内酵素切断可能結合断片に融合されている。

幾つかの実施形態において、該ＲＮＡステムループ認識ドメインは、ＭＣＰ、ＰＣＰ、またはＣｏｍから選択される。

幾つかの実施形態において、該細胞内酵素切断可能結合断片は、ユビキチン断片である。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、レポータ遺伝子を含む。

幾つかの実施形態において、該レポータ遺伝子は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、発光タンパク質、またはそれらの組み合わせから選択される。

幾つかの実施形態において、該遺伝子操作された微生物は、哺乳動物の消化管内に定着しない微生物から選択される。

本開示の態様は、上述の遺伝子操作された微生物の任意の１種の遺伝子操作された微生物の治療有効量を投与することを含む、片利共生の、または病原性の消化管細菌の標的化された感知、検出、または殺傷の方法を提供する。

本開示の態様は、上述の遺伝子操作された微生物の任意の１種の遺伝子操作された微生物の治療有効量を投与することを含む、消化管疾患（例えば、ノロウイルスなどの感染性疾患）を処置する方法を提供する。

本開示の態様は、上述の遺伝子操作された微生物の任意の１種の遺伝子操作された微生物の治療有効量を接触させることを含む、片利共生消化管細菌を調節する方法を提供する。

本開示の態様は、遺伝子操作された微生物を構築する方法であって、
微生物を提供すること；提示カセットを提供すること；および該微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に該提示カセットを組み込むこと、を含み、該提示カセットが、結合剤の発現のための配列と；該結合剤を発現することが可能なプロモータと；ターミネータと；アンカーと；分泌シグナルペプチドと、を含む、方法を提供する。

幾つかの実施形態において、該アンカーは、構成型プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内に細胞壁タンパク質アンカー領域を含む。

幾つかの実施形態において、該アンカーは、サッカロマイセス属酵母に由来するＣｗｐ２ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｃｃｗ１２ｐまたはＦｌｏ１ｐから選択される。

幾つかの実施形態において、該アンカーは、Ｆｌｏ１ｐから選択される。

本開示の態様は、微生物を提供すること；提示カセットを提供すること；および該微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に該提示カセットを組み込むこと、を含み、該提示カセットが、結合剤の発現のための配列と；構成型プロモータと；ターミネータと；微生物細胞壁タンパク質の膜貫通型ドメインを含むステムと；分泌シグナルペプチドと；トランス活性化因子に動作可能に連結された細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチンの断片）と、を含む、遺伝子操作された微生物を構築する方法を提供する。

幾つかの実施形態において、微生物細胞壁タンパク質の該膜貫通型ドメインは、Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）から選択される。

幾つかの実施形態において、該提示カセットは、該ステムに動作可能に連結された細胞壁タンパク質ドメインをさらに含み、該細胞壁タンパク質ドメインは、該ステムを細胞外空間に延長することが可能である。

幾つかの実施形態において、該方法は、結合剤の第一の対および結合剤の第二の対と、第一のトランス活性化因子および第二のトランス活性化因子と、を含み、該結合剤の第一の対が、第一の標的微生物に結合することが可能であり、該結合剤の第二の対が、第二の標的微生物に結合することが可能であり、該結合剤の第一の対が、該結合剤の第二の対と異なり；該結合剤の第一の対が、第一の膜貫通型タンパク質を介して細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチン断片）の第一の対に動作可能に連結され、該第一の細胞内酵素切断結合断片の第一の対の一方が、第一のトランス活性化因子に動作可能に連結され；該第二の結合剤が、第二の膜貫通型タンパク質を介して細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対に動作可能に連結され、該第二の細胞内酵素切断可能結合断片の該第二の対の一方が、第二のトランス活性化因子に動作可能に連結され；該細胞内酵素切断可能結合断片の第一の対の一方と、該細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対の一方が、該Ｎ−末端領域内で同一の結合タンパク質を有するが、Ｃ−末端領域内では異なるトランス活性化因子を有し、標的微生物と物理的に相互作用すること、および該第一または該第二のトランス活性化因子を放出することが可能である。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノボディ、それらの一本鎖断片、およびそれらの組み合わせからなる群の１つまたは複数を含む。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、標的微生物の細胞壁結合ドメインおよびエンドリシンの細胞壁結合ドメインからなる群の１つまたは複数を含む。

幾つかの実施形態において、該結合剤は、ＣＬＭ−１；ＺＷ８８；φＣＰ２６Ｆ（ＰｌｙＣＰ２６Ｆ）の細胞結合ドメイン；エンドリシンＰｌｙ５００の細胞結合ドメイン５００；エンドリシンＰｌｙＣのＰｌｙＣ結合ドメイン；ＬｙｓＧＨ１５Ｂ、エンドリシンＬｙｓＧＨ１５もしくはＬｙｓＳＡ９７の細胞壁結合ドメイン；またはｐｈｉＣｃｏｌＢＢ３５の細胞壁結合ドメインから選択される。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、条件付きで切断可能なペプチドを介して膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されている。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９））を含む。

幾つかの実施形態において、該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、インタージェニック部位（例えば、Ｓ．ブラウディではＣｈｒ ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ）に組み込まれた提示単位に対応する。

幾つかの実施形態において、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９）およびスカフォールドＲＮＡは、トランス活性化因子を対応する合成プロモータに動員する。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、レポータ（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＢＦＰなどの蛍光タンパク質、発光タンパク質）または生体分子（例えば、抗体、酵素、抗菌性ペプチド）の発現を開始することが可能なｓｃＲＮＡ結合モチーフおよびトランス活性化因子を含む。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）を含む。

幾つかの実施形態において、該トランス活性化因子は、細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチン断片）に融合されたＲＮＡステムループ認識ドメイン（例えば、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ）を含む。

幾つかの実施形態において、該方法は、標的レポータタンパク質の転写を開始することを含む。

幾つかの実施形態において、該標的レポータタンパク質は、蛍光タンパク質および発光タンパク質から選択される。

幾つかの実施形態において、該標的レポータタンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ（ｍＣｈｅｒｒｙなど）、ＢＦＰ、ルシフェラーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

幾つかの実施形態において、該微生物は、Ｓ．ブラウディから選択され、該インタージェニック部位は、Ｃｈｒ ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶもしくはＸＶＩ、またはそれらの組み合わせから選択され、Ｃａｓ９の対応する誘導型ＲＮＡは、微生物のネイティブ転写を妨害することなく標的タンパク質の安定した発現をもたらす。

幾つかの実施形態において、標的タンパク質の安定した発現のためのフレームワークは、インデューサを必要としない。

幾つかの実施形態において、該方法は、遺伝子操作された微生物の強い構成型プロモータまたは弱いプロモータを含む。

幾つかの実施形態において、該強い構成型プロモータは、Ｓ．ブラウディのＴＤＨ３またはＣＣＷ１２プロモータから選択される。

幾つかの実施形態において、該弱いプロモータは、Ｓ．ブラウディのＷＳＣ１またはＦＡＵ１プロモータから選択される。

幾つかの実施形態において、該方法は、ターミネータを含む。

幾つかの実施形態において、該ターミネータは、Ｓ．ブラウディのＡＤＨ１またはＣＹＣ１ターミネータから選択される。

他の目的および特色は、一部が明白であり、一部が本明細書の以後に指摘されよう。

当業者は、以下に記載される図面が例示目的に過ぎないことを理解するであろう。図面は、本発明の技術範囲を限定する意図はない。

酵母表面提示のためのバックボーンカセット。 酵母バイオセンサの設計。 ｄＣａｓ９に基づく感知およびシグナル伝達のメカニズム。 スカフォールドＲＮＡに基づく人工トランス活性化因子の構造。 提示単位は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いて安全なインタージェニック部位（例えば、Ｓ．ブラウディの第ＶＩＩ染色体）に組み込まれる。 染色体組み込みの検証。 野生型Ｓ．ブラウディの免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡測定。 エンプティ表面提示カセットを担うＳ．ブラウディの免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡測定。 ＣＬＭ−１の表面提示カセットを担うＳ．ブラウディの免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡測定。 人工センサおよびシグナル伝達システムの構築、ならびに抗体／結合ドメインの表面提示の設計。 １つの標的ペプチドを提示するための単一キメラタンパク質の発現カセット。 ネズミノロウイルス（ＭＮｏＶ）（Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０１８ Ｍａｙ １４；９２（１１） Ａｔｏｍｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｕｒｉｎｅ Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ３００ｌｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘを適応させた図)。 糞便中の遺伝子操作されたＳ．ブラウディのインビボ安定性。 インビボでの遺伝子操作されたＳ．ブラウディのインビボ安定性。 消化管内でのＳ．ブラウディの安定性に及ぼす反復投与、片利共生微生物相の摂動（ストレプトマイシン）、および胃の中和の影響。 ＣＬＭ−１を提示するＳ．ブラウディとＭＮｏＶとの相互作用を測定するインビトロ結合アッセイ。 マウス消化管におけるＣＬＭ−１を提示する酵母とＭＮｏＶとの相互作用を測定するための試験計画。 ＣＲＩＳＰＲを基にしたゲノム編集ツール。 シグナル伝達／遺伝子転写の場合。 ゲノム（ＩＳ２）へのレポータカセットの組み込み。 強い構成型プロモータＰ_ＴＥＦ１、Ｐ_ＡＤＨ１の下でｄＣａｓ９、ｇＲＮＡ、およびトランス活性化因子を発現するためのプラスミド。 新しいＰ_{ＧＡＬｓｙｎ}プロモータおよび対応するｓｃＲＮＡ。 新しいレポータカセットの構築。 対応するｓｃＲＮＡおよびトランス活性化因子による合成プロモータの直交性誘導（例えば、表１参照）。 キメラセンサのバックボーンカセット。

発明の詳細な記載
本開示は、少なくとも一部が、遺伝子操作されたサッカロマイセス・ブラウディ（Ｓ．ブラウディ、Ｓｂ）が片利共生の、または病原性の消化管細菌の標的化された結合、感知、および／または殺傷に用いられ得る、という発見に基づく。

本明細書に記載された通り、本開示は、生体分子と、ＣＲＩＳＰＲシステムの先進の遺伝子ツールボックスと、を用いてＳ．ブラウディを遺伝子操作して、好適でない余分な遺伝子改変を最小限に抑え、合成のシグナル伝達および遺伝子転写メカニズムを可能にする方法を提供する。

本明細書に記載された通り、本開示は、標的微生物、詳細には片利共生微生物または病原体を含む腸内生物体と、またはそれらに対して特異的に相互作用する細胞表面提示生体分子を提供する。片利共生および病原性の微生物は、バクテリア、ウイルスまたは、真核生物であり得る。

本明細書に記載された通り、本開示は、宿主消化管内の標的微生物（例えば、病原体）に対するプロバイオティクス酵母サッカロマイセス・セレビシエ ｖａｒ．ブラウディ（Ｓ．ブラウディ）などの微生物の結合、感知、調整、および破壊能力を操作するために、生体分子の細胞表面提示を提供する。

本明細書に記載された通り、本開示は、消化管マイクロバイオームおよびヴァイロームの抗菌治療および診断などの臨床用途において、Ｓ．ブラウディなどの遺伝子操作された微生物を用いる方策を提供する。

サッカロマイセス・ブラウディおよびサッカロマイセス・セレビシエ（両者はほぼ同一である）をはじめとするサッカロマイセス属酵母のために本明細書に開示された遺伝子操作された酵母を作製するための方策は、ピキア・パストリスおよびハンセヌラ・ポリモルファなどの他の酵母に適用され得る − それらはプロバイオティクス酵母ではないが、一般に安全と認識され（ＧＲＡＳ）、しかしサッカロマイセス属として遺伝子検査することができない。

遺伝子操作された微生物
本明細書に記載された通り、微生物は、感知、検出および／または処置／破壊する（例えば、病原体を除去する）ように遺伝子操作され得る。

微生物を生体分子で遺伝子操作することが、ＣＲＩＳＰＲシステムの先進の遺伝子ツールボックスを用いて実施された。例えば本開示は、選択的に広範囲の感受性のある細菌体を認識する、または該細菌体と反応する、真菌バイオセンサを提供する。

該遺伝子操作された微生物は、細胞外結合剤（例えば、ｓｃＦｖなどの結合ドメイン、エンドリシンの細胞壁結合ドメイン、および受容体を有するペプチド）、細胞外アンカータンパク質（例えば、Ｍｉｄ２ｐ、ユビキチナーゼ、Ｆｌｏ４２８）、細胞内アンカータンパク質（例えば、Ｍｉｄ２ｐ、ユビキチナーゼ、Ｆｌｏ４２８）、転写システム（例えば、転写因子／トランス活性化因子）、または治療薬を含み得る。

開示されたＳ．ブラウディの用途を完遂するために、第ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶ、およびＸＶＩ染色体の新規なインタージェニック部位、ならびにＣａｓ９のための対応する誘導型ＲＮＡがそれぞれ、酵母のネイティブ転写を妨害することなく、標的タンパク質（例えば、ＣＬＭ−１）の安定した提示のために、選択および設計される。インデューサを必要としない結合剤／標的タンパク質の安定した発現のためのフレームワークが、Ｓ．ブラウディの生来の強い構成型プロモータ（ＴＤＨ３およびＣＣＷ１２プロモータ）または弱いプロモータ（例えば、ＷＳＣ１およびＦＡＵ１プロモータ）、およびターミネータ（例えば、ＡＤＨ１およびＣＹＣ１ターミネータ）を用いて構築された。アンカー領域は、キメラタンパク質として、結合剤／結合ドメインと共に発現され得る。

開示された技術の用途としては、「提示（スポンジ）」設計および「センサ」設計を挙げることができる。

ａ．Ｆｌｏ４２８（Ｆｌｏ１タンパク質のＣ−末端４２８ａａ残基）「アンカー」タンパク質は、提示設計に用いられた。Ｆｌｏ４２８の役割は、酵母表面の標的タンパク質の安定した簡単な提示である。
ｂ．突然変異体Ｗｃｓ１は、センサ設計のために「膜貫通型」タンパク質として用いられた。ｍｔＷｓｃ１の主要な役割は、「ステム」として細胞外刺激を細胞内シグナル伝達に接続させることである。本明細書に記載された通り、ｍｔＷｓｃ１は、Ｍｉｄ２タンパク質のＳ／Ｔリッチ領域を付加することにより伸長され得るが（Ｍｉｄ２タンパク質は、Ｆｌｏ１タンパク質と類似の細胞壁タンパク質の型である）、センサ設計の目的ではアンカーと見なされない。

提示設計のためのアンカータンパク質
該微生物は、微生物の膜上にアンカータンパク質を取り込むように遺伝子操作され得る。アンカータンパク質は、遺伝子操作された微生物の表面に結合剤を固定するのに適した任意のアンカータンパク質であり得る。

アンカータンパク質は、細胞壁タンパク質であり得る（例えば、実施例１参照）。例えばアンカータンパク質は、ペプチド（例えば、セリン／トレオニンリッチ領域を担う細胞壁タンパク質）であり得る。アンカータンパク質の例は、サッカロマイセス属酵母のＣｗｐ２ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｃｃｗ１２ｐまたはＦｌｏ１ｐであり得る。

例えばＦｌｏ１アンカー（Ｆｌｏ４２８）が、酵素の提示ツールとして主に代謝的遺伝子操作エリアで用いられてきたが、この目的で有用であることが発見された。そのため、標的タンパク質を細胞外で提示する簡単な単一キメラタンパク質が、Ｆｌｏ４２８を用いて構築され得る。

部分（例えば、センサ、結合剤）が、細胞外では微生物の表面で、または細胞内ではアンカータンパク質を介して細胞の内部で、付着され得る。例えば該アンカータンパク質は、細胞膜と標的、感知または治療性部分とを連結するリンカー基として作用し得る。

本明細書に記載された通り、該アンカー領域は、キメラタンパク質として結合ドメインと共に発現される。

センサ設計のためのステム
本開示は、該遺伝子操作された微生物系のバイオセンサ／検出物質用途における使用のためのステムを提供する。

本明細書に記載された通り、該酵母バイオセンサは、「アンカー」タンパク質領域を利用しない。感知メカニズムのためのキメラタンパク質は、表面提示設計において用いられるアンカー領域の代わりに、細胞質から細胞外空間まで位置を延ばした膜貫通型タンパク質である「ステム」を有する（例えば、図３参照）。該モジュールタンパク質は、提示設計（スポンジ）のためのアンカータンパク質と類似のＳ／Ｔリッチ領域を含むが、該センサモジュールのキメラタンパク質が、固定されないはずである。

例えば該ステムのＣ−末端は、細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチン断片）に融合されたＲＮＡステムループ認識ドメイン（例えば、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ）から選択され得る。

別の例として、該ステムは、突然変異体Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）分子（膜貫通型タンパク質）から選択され得る。Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）は、物理的ストレスと無関係にクラスター化され得ないため、好ましいステムである。野生型タンパク質は、自己クラスター化しているが、１つの点突然変異（Ｃ８Ａ）がこのタンパク質をクラスター化できないようにしていることが過去に示された。そのため、突然変異体Ｗｓｃ１ｐは、ステム部分に適していた（例えば、図２参照）。

該ステムは、細胞壁タンパク質ドメインまたはＭｉｄ２タンパク質（Ｍｉｄ２ｐ）などの伸長部分により延長され得る。

微生物
開示されたシステムは、微生物（例えば、真菌、酵母、バクテリア、プロバイオティクス（バクテリア、酵母））を利用して、生体分子または結合剤を提示する。

好ましい微生物は、消化管に定着せず、したがって容易に制御される。本明細書に開示された研究は、定着の不能性、先進の翻訳後修飾（バクテリアに比較して）、および酵母膜貫通型タンパク質の存在など、酵母の独特の特徴および能力を考慮して設計された。そのため好ましい微生物は、酵母である。例えば該酵母は、サッカロマイセス属の一種（例えば、Ｓ．ブラウディ）であり得る。

Ｓ．ブラウディは、ヒト消化管に定着することの不能性のため、標的微生物に吸収または接着し、結合された標的微生物と共に宿主の消化管を通過し、結果的に微生物の標的集団および感染の影響を減少させる、抗菌剤として作用するように遺伝子操作され得る。

本明細書に記載された通り、Ｓ．ブラウディのための表面提示システムは、接合因子アルファ分泌シグナルペプチドと、標的微生物に結合する生体分子と、強い構成型プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内の細胞壁タンパク質アンカー領域と、を組み合わせることにより構築され得る。

該微生物はまた、バクテリアであり得る。該バクテリアは、Ｅ．コリ（例えば、Ｅ．コリ ニッスル）であり得る、Ｅ．コリは、標的微生物を吸収またはそれに接着して、宿主と標的との相互作用を減少するように遺伝子設計され得るが、Ｅ．コリの定着能力により標的集団を減少させることができない。

結合剤／生体分子
生体分子（例えば、ｓｃＦｖなどの結合ドメイン、受容体、エンドリシンの細胞壁結合ドメインなどの細胞壁結合ドメイン、抗体または抗体機能性断片を有するペプチド）などの結合剤は、遺伝子操作された微生物の表面で提示され得る。そのため該遺伝子操作された微生物は、病原体への結合親和性を有するように設計され得る。

該結合剤または生体分子は、タンパク質、抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはナノボディであり得る。分泌シグナルペプチドと、細胞壁タンパク質アンカー領域と、標的微生物に対する結合または接着能力を呈するそれらの結合剤（例えば、強い構成型プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内の）との組み合わせ。

別の例として、該結合剤または生体分子は、エンドリシンの細胞壁結合ドメインまたは標的微生物に対する結合もしくは接着能力を呈することが可能な任意の結合ドメインであり得る。

該結合剤は、標的微生物（例えば、ノロウイルスなどの病原体）に結合する任意の薬剤であり得る。例えば該結合剤は、標的微生物結合ドメイン（例えば、ウイルスまたはバクテリア結合剤）を含み得る（例えば、図３参照）。該結合剤は、例えばノロウイルス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）をはじめとするスタフィロコッカス・アウレウス、Ｐ．エルギノーサ、または結合ドメインが利用可能な任意の他の細菌体などの病原体または他の疾患を標的化し得る。好ましい実施形態において、該標的微生物は、消化管の病原体である。

本明細書に記載された通り、該ｓｃＦｖｓ ＺＷ８８は、Ｓ．アウレウスへの結合親和性を有する微生物（例えば、Ｓ．ブラウディ）内で発現された。

本明細書に記載された通り、ノロウイルス受容体は、ノロウイルスへの結合親和性を有する微生物（例えば、Ｓ．ブラウディ）内で発現されて、ノロウイルスを除去するスポンジのように作用した。

例えば該結合剤は、エンドリシンの任意の細胞壁結合ドメインまたは任意の病原体の細胞壁結合ドメインであり得る。幾つかの実施形態において、該結合剤は、標的微生物の任意の結合ドメインから選択され得る。例えば該結合剤は、エンドリシンＰｌｙＣからのＰｌｙＣＢ（標的微生物がストレプトコッカス・ピオゲネスの場合）、ＣＬＭ−１（ノロウイルスの場合）、φＣＰ２６Ｆの細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）（クロストリジウム属の病原性共生生物の場合）、エンドリシンＰｌｙ５００からのＣＢＤ５００（リステリア・モノサイトゲネスの場合）、ＬｙｓＳＡ９７（Ｓ．アウレウス）、ＰｌｙＣＰ２６Ｆの細胞壁結合ドメイン（Ｃ．ディフィシル／パーフリンゲンス）、ＰｌｙＰ３５の細胞壁結合ドメイン（Ｌ．モノサイトゲネス）、エンドリシンＬｙｓＧＨ１５のＬｙｓＧＨ１５Ｂの細胞壁結合ドメイン（ＭＲＳＡ感染またはスタフィロコッカス・アウレウス感染の場合）、ｐｈｉＣｃｏＩＢＢ３５の細胞壁結合ドメイン（カンピロバクター・コリ）、またはそれらの組み合わせのうちの任意の１つであり得る。

例えば、リステリア・モノサイトゲネスに対して特異的溶解活性を呈するエンドリシンＰｌｙＰ３５の細胞壁結合ドメインの表面提示は、片利共生の消化管微生物相との望ましくない相互作用を最小限に抑えながらリステリア症を制御することが期待される。このアプローチは、他の病原性微生物の調節（例えば、リステリア・モノサイトゲネスとエンドリシンＰｌｙ５００からのＣＢＤ５００、ストレプトコッカス・ピオゲネスとエンドリシンＰｌｙＣからのＰｌｙＣＢ）だけでなく、片利共生の消化管微生物相の形状の効果的制御（例えば、φＣＰ２６ＦからのＣＢＤを用いたクロストリジウム属病原性共生生物の調節）にも及び得る。

キメラセンサの場合、一本鎖が、好ましい。そのため、１本より多くの鎖を有するナノボディまたは他の抗体形式は、キメラセンサ設計における結合剤として好ましい実施形態ではない。しかし非一本鎖ナノボディまたは他の抗体形式は、提示（スポンジ）設計に容易に取り込まれ得る。

標的微生物
本明細書に記載された通り、本開示は、標的微生物、例えば片利共生微生物および病原体などの腸内生物体と、または該生物体に対して特異的に相互作用する生体分子の細胞表面提示を提供する。片利共生および病原性の微生物は、バクテリア、ウイルス、または真核生物であり得る。

該遺伝子操作された微生物は、標的微生物に結合するように、または該微生物を標的化するように設計され得る。該遺伝子操作された微生物は、標的微生物を標的化する結合部分を含む結合剤を含み得る。

該標的微生物は、バクテリア、真菌、ウイルス、または真核生物であり得る。該標的微生物は、病原性共生生物、病原体、または片利共生生物であり得る。該標的微生物は、ノロウイルス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム属病原性共生生物、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンス、カンピロバクター・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、サルモネラ、Ｐ．エルギノーサ、またはＥ．コリであり得る。

この方法を利用して標的化され得る標的微生物の範囲に限定がないと、目下考えられる。そのため、特異的結合ドメインを有する任意の微生物が、標的化され得る。

特異的結合は、受容体へのリガンドの結合を指し得、１つのリガンドに対して１つより多くの特異的結合部位が存在することが可能になり得る。

人工センサ／シグナル伝達システムのためのレポータ
該遺伝子操作された微生物は、人工感知およびシグナル伝達における使用のためのレポータを取り込むように遺伝子操作され得る。

本明細書に記載された遺伝子操作された微生物は、レポータ（またはセンサ）を含み得る。該レポータは、ｐＨ、免疫受容体、またはレポータタンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＢＦＰ、発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ））を検出するセンサタンパク質であり得る。

例えば該遺伝子操作された微生物は、転写システムを含み得る。該転写システムは、トランス活性化因子を含み得、この場合、該人工センサは、物理的刺激を転写シグナルに変換し得る（例えば、図２参照）。

人工トランス活性化因子は、ｄＣａｓ９およびスカフォールドＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ、例えば図３、図４、図１５、表１参照）に基づいて設計され得る。例えばトランス活性化因子が、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）およびＲＮＡステムループ認識ドメイン（例えば、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ）を含み得る。

病原体の除去（例えば、スポンジ）
本明細書に記載された通り、本開示は、臨床目的で微生物（例えば、酵母）表面提示の新規用途を提供する。微生物（例えば、Ｓ．ブラウディなどのヒト消化管に定着しないプロバイオティクス）の表面が、指定された微生物（例えば、バクテリア、真菌、ウイルス）に特異的に結合する結合剤（例えば、生体分子）でコーティングされ得る。

本明細書に記載された遺伝子操作された微生物は、病原体を除去するスポンジとして作用し得る。例えば、非定着性酵母などの標的病原体を除去することが可能な微生物が、表面の病原体受容体（例えば、ノロウイルス受容体）を発現して病原体に結合し、それを対象から除去するように遺伝子操作され得る。

そのため、標的微生物（例えば、病原体）への結合剤（例えば、タンパク質）を提示する、開示された遺伝子操作された微生物（例えば、Ｓ．ブラウディ株）は、抗菌剤（例えば、抗ウイルスおよび抗バクテリア剤）として用いられて、使用が緻密に制御されなければならない抗生物質などの治療薬の代替手段を提供し得る。

バイオセンサ／検出物質
本開示はまた、インビボで広範囲の感知可能な標的微生物（例えば、細菌体）を選択的に認識してそれと反応する、遺伝子操作された微生物バイオセンサを構築する方法を提供する。遺伝子操作された微生物は、レポータを含み得る。

本明細書に記載された通り、該遺伝子操作された微生物は、感知の用途に用いられ得る。例えば機能性タンパク質の一部が、細胞内に（例えば、アンカーを介して膜タンパク質に）付着されて、反応を（例えば、転写応答を刺激するために）触媒することができる。

同じく本明細書に記載されるのは、検出に用いられ得る遺伝子操作された微生物である（例えば、図１７、図２０参照）。例えば、トランス活性化因子は、検出部分（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、発光タンパク質）のプロモータ領域に付着され得る。そのため、病原体（例えば、ノロウイルス）を感知した各遺伝子操作された微生物が、明るくなる。

同じく本明細書に記載されるのは、分泌シグナルペプチドと、標的微生物に対する結合タンパク質と、Ｓ．ブラウディ細胞壁タンパク質の膜貫通型ドメインと、ユビキチンの突然変異体Ｎ−末端部分またはトランス活性化因子（特異的プロモータ領域に結合する転写因子を発現する）に融合されたＣ−末端ユビキチン部分と、を組み合わせることにより構築された、選択された微生物（例えば、細菌、バクテリア、ウイルス）をＳ．ブラウディに認識させ、該微生物に対して反応させるキメラセンサ分子である（例えば、図３参照）。Ｎ−末端領域に同じ結合タンパク質を有するがＣ−末端領域に異なるユビキチンドメインを有する２つのキメラセンサ分子が、一組として一緒になって働き、標的物体（例えば、標的微生物）と物理的に相互作用して、トランス活性化因子を放出する。ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９）およびスカフォールドＲＮＡは、トランス活性化因子を対応する合成プロモータに動員し；それに応じてＲＦＰおよびＧＦＰなどのレポータタンパク質などの標的遺伝子の転写が、開始され得る（例えば、図３参照）。本明細書で提供されたキメラセンサ提示Ｓ．ブラウディは、その拡張可能性により、バクテリアまたは真菌の感知メカニズムを採用する従来のバイオセンサよりもかなり広範囲の検出可能微生物を有する。

幾つかの実施形態において、Ｃ−末端ユビキチンのみが、選択されたトランス活性化因子を有することになり、Ｎ−末端ユビキチンは、トランス活性化因子を用いずにステムに動作可能に連結されている。

消化管の健康を目的とする細菌バイオセンサとして、開示された遺伝子操作されたＳ．ブラウディは、自然界の非常に限定された既存の感知メカニズムに依存する従来のアプローチの限界を克服することができる。

分子の遺伝子操作
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義して、本発明の実践において当業者を誘導するために提供されている。他にことわりがなければ、用語は、関連の技術分野の当業者による従来の使用に従って理解されるべきである。

本明細書で用いられる用語「異種ＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」または「異種核酸」はそれぞれ、特有の宿主細胞に対して外来性の供給源から発する配列、または同じ供給源からの場合、その本来の形態から修飾されている配列を指す。したがって宿主細胞内の異種遺伝子は、特有の宿主細胞に対して内因性であるが、例えばＤＮＡシャフリングの使用を通して、修飾されている遺伝子を包含する。この用語はまた、天然由来ＤＮＡ配列の非天然由来の複数のコピーを包含する。したがってこの用語は、細胞に対して外来性もしくは異種であるＤＮＡセグメント、または細胞と相同的であるがエレメントが通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、発現されて外因性ポリペプチドをもたらす。「相同的」ＤＮＡ配列は、導入される宿主細胞に天然で関連するＤＮＡ配列である。

発現ベクター、発現構築物、プラスミド、または組換えＤＮＡ構築物は一般に、例えば宿主細胞内の、特有の核酸の転写または翻訳を可能にする一連の指定された核酸エレメントを用いて、組換え手段または直接的な化学合成などによりヒトの介入を介して生成された核酸を指すものと理解される。該発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。典型的には該発現ベクターは、転写されてプロモータに動作可能に連結された核酸を含み得る。

「プロモータ」は一般に、核酸の転写を指揮する核酸制御配列と理解される。誘導型プロモータは一般に、特有の刺激に応答して動作可能に連結された遺伝子の転写を媒介するプロモータとして理解される。プロモータは、ポリメラーゼＩＩ型プロモータ、ＴＡＴＡエレメントの場合など、転写の開始部位付近に必要な核酸配列を含み得る。プロモータは、転写の開始部位から数千もの多数の塩基対の位置に配置され得る遠位エンハンサまたはレプレッサエレメントを場合により含み得る。

本明細書で用いられる「転写可能な核酸分子」は、ＲＮＡ分子に転写されることが可能な任意の核酸分子を指す。翻訳され、それによりタンパク質産物として発現される機能的ｍＲＮＡ分子内に転写可能な核酸分子が転写されるような手法で、構築物を細胞内に導入するための方法は、公知である。構築物はまた、該当する特異的ＲＮＡ分子の翻訳を阻害するために、アンチセンスＲＮＡ分子を発現することが可能であるように構築されてもよい。本開示の実践のために、構築物および宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００６） Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０８７９６９７７１７； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０４７１２５０９２９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０８７９６９５７７３； Ｅｌｈａｉ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｏｌｋ， Ｃ． Ｐ． １９８８． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６７， ７４７−７５４参照）。

「転写開始部位」または「開始部位」は、転写配列の一部である最初のヌクレオチド周辺の位置であり、＋１位置としても定義される。この部位に関して、遺伝子およびその制御領域の全ての他の配列が、ナンバリングされ得る。下流の配列（即ち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）が、プラスと呼称され得、上流配列（大部分が５’方向の制御領域）が、マイナスと呼称される。

「動作可能に連結された」または「機能的に連結された」は、好ましくは一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列の関連を指す。例えば、調節ＤＮＡ配列が、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように（即ち、コード配列または機能的ＲＮＡが、プロモータの転写制御下にあるように）、それらの２つの配列が位置する場合に、該調節ＤＮＡ配列は、該コードするＤＮＡ配列「に動作可能に連結されている」または「に関連する」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で調節配列に動作可能に連結され得る。この２種の核酸分子は、単一の連続する核酸分子の一部であってもよく、隣接していてもよい。例えばプロモータが、細胞内の該当する遺伝子の転写を調節または媒介する場合、該プロモータは、該当する遺伝子に動作可能に連結されている。

「構築物」は一般に、１つまたは複数の核酸分子が動作可能に連結された核酸分子を含む、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な任意の供給源に由来するプラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製核酸分子、ファージ、または直鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸分子などの任意の組換え核酸分子として理解される。

本開示の構築物は、３’転写終結核酸分子に動作可能に連結された転写可能核酸分子に動作可能に連結されたプロモータを含有し得る。加えて構築物としては、例えば３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）からの、追加の調節核酸分子を挙げることができるが、これに限定されない。構築物としては、翻訳開始において重要な役割を担う可能性があり、発現構築物中の遺伝子成分でもあり得る、ｍＲＮＡ核酸分子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を挙げることができるが、これに限定されない。これらの付加的な上流および下流調節核酸分子は、プロモータ構築物上に存在する他のエレメントに関してネイティブまたは異種である供給源に由来してもよい。

用語「形質転換」は、遺伝的に安定した継承をもたらす、宿主細胞のゲノム内への核酸断片の移動を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と称され、トランスジェニック細胞を含む生物体は、「トランスジェニック生物体」と称される。

「形質転換された」、「トランスジェニック」および「組換え体」は、異種核酸分子が導入されたバクテリア、シアノバクテリア、動物または植物などの宿主細胞または生物体を指す。該核酸分子は、当該技術分野で一般に知られていて開示されている通り（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９； Ｉｎｎｉｓ １９９５； Ｇｅｌｆａｎｄ １９９５； Ｉｎｎｉｓ ＆ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９９）、ゲノム内に安定して組み込まれ得る。公知のＰＣＲ方法としては、プライマー対、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、変性プライマー、遺伝子特異性プライマー、ベクター特異性プライマー、部分的にミスマッチされたプライマー、および同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。用語「非形質転換の」は、形質転換工程を通していない通常の細胞を指す。

「野生型」は、任意の公知突然変異を有さない、天然に見出されるウイルスまたは生物体を指す。

上記の必要な同一性％を有し、発現されたタンパク質の必要な活性を保持する、ヌクレオチド変種およびそれらをコードしたポリペプチドの設計、生成、およびテストは、当該技術分野の技能の範囲内である。例えば突然変異体の指向性のある進化および迅速な単離は、非限定的にＬｉｎｋ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５（９）、 ６８０−６８８； Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅ ９７（１）、 １１９−１２３； Ｇｈａｄｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８（８） ４５５２−４５５７をはじめとする参考資料に記載された方法に従い得る。したがって当業者は、例えば本明細書に記載された参照配列と少なくとも９５〜９９％の同一性を有する、多数のヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド変種を生成することができ、それを当該技術分野で日常的な方法に従って所望の表現型についてスクリーニングすることができる。

ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性（％）は、候補配列および参照配列がアライメントされた時、参照配列に比較して候補配列でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一になるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセント値として理解される。同一性％を決定するために、配列がアライメントされ、必要ならば、ギャップが導入されて最大配列同一性％を実現する。同一性％を決定するための配列アライメント手順は、当業者に周知である。多くの場合、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公表されたコンピュータソフトウエアが、配列のアライメントに用いられる。当業者は、比較されている配列の全長にわたり最大アライメントを実現するのに必要な任意のアルゴリズムをはじめとするアライメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。配列が、アライメントされる場合、所与の配列Ｂへの、該配列Ｂとの、または該配列Ｂに対する所与の配列Ａの配列同一性％（代わりに、所与の配列Ｂへの、該配列Ｂとの、または該配列Ｂに対する特定の配列同一性％を有する、または含む所与の配列Ａと言葉で表すことができる）は、配列同一性％＝Ｘ／Ｙ１００（ここでＸは、ＡおよびＢの配列アライメントプログラムの、またはアルゴリズムのアライメントによる完全な一致として記録された残基数であり、Ｙは、Ｂにおける合計残基数である）として計算され得る。配列Ａの長さが、配列Ｂの長さと等しくない場合、ＢへのＡの配列同一性％は、ＡへのＢの配列同一性％と等しくならない。

一般に保存的置換は、必要となる活性が保持される限り、任意の位置で作製され得る。交換されるアミノ酸が元のアミノ酸と類似の特性を有する、いわゆる保存的置換、例えばＡｓｐによるＧｌｕ、ＡｓｎによるＧｌｎ、ＩｌｅによるＶａｌ、ＩｌｅによるＬｅｕ、およびＴｈｒによるＳｅｒの置換が、実施され得る。例えば類似の特性を有するアミノ酸は、脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；ヒドロキシルまたは硫黄／セレニウム含有アミノ酸（例えば、セリン、システミン、セレノシステミン、トレオニン、メチオニン）；環状アミノ酸（例えば、プロリン）；芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；塩基性アミノ酸（例えば、ヒスチジン、リシン、アルギニン）；または酸性およびそれらのアミド（例えば、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、グルタミン）であり得る。欠失は、直接結合によるアミノ酸の交換である。欠失のための位置としては、ポリペプチドの末端、および個々のタンパク質ドメインの間の連結が挙げられる。挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入、１つまたは複数のアミノ酸により形式通り（ｆｏｒｍａｌｌｙ）置換された直接結合である。アミノ酸配列は、例えば改善された活性または改変された調節、を有するポリペプチドを生成し得る、当該技術分野で公知のコンピュータシミュレーションプログラムの支援により調整され得る。この人工的に生成されたポリペプチド配列に基づき、そのような調整されたポリペプチドをコードした対応する核酸分子は、所望の宿主細胞の特異的コドン使用を利用してインビトロで合成され得る。

「高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、６×ＳＳＣ緩衝液（即ち、０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）中、６５℃でのハイブリダイゼーションとして定義される。これらの条件が与えることで、２つの配列間のＤＮＡデュプレックスの融解温度（Ｔ_ｍ）を計算することにより、所与の配列組がハイブリダイズするか否かについて、決定され得る。特有のデュプレックスが、６×ＳＳＣの塩条件で６５℃より低い融解温度を有する場合、２つの配列は、ハイブリダイズしない。その一方で、融解温度が、同様の塩条件で６５℃を超える場合、配列は、ハイブリダイズする。一般に、任意のハイブリダイズされたＤＮＡ：ＤＮＡ配列の融解温度は、以下の式を利用して決定され得る：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（分数Ｇ／Ｃ含量）−０．６３（％ホルミアミド）−（６００／ｌ）。さらに、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴ_ｍは、ヌクレオチド同一性の各１％低下により１〜１．５℃低下する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００６参照）。

宿主細胞は、当該技術分野で公知の種々の標準的技術を利用して形質転換され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００６） Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０８７９６９７７１７； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０４７１２５０９２９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０８７９６９５７７３； Ｅｌｈａｉ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｏｌｋ， Ｃ． Ｐ． １９８８． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６７， ７４７−７５４参照）。そのような技術としては、ウイルス感染、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、マイクロプロジェクタイルを介した送達、受容体を介した取り込み、細胞融合、電気穿孔および同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。該トランスフェクトされた細胞は、選択および増殖されて、宿主細胞ゲノム内に安定して組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供することができる。

宿主細胞に導入され得る例示的な核酸としては、例えば、別の種からのＤＮＡ配列もしくは遺伝子、または同じ種で発生する、もしくは同じ種に存在するが、遺伝子操作法によりレシピエント細胞に取り込まれる遺伝子もしくは配列が挙げられる。用語「外因性」はまた、形質転換される細胞の中に通常、存在しない遺伝子、またはおそらく単に形質転換しているＤＮＡセグメントもしくは遺伝子の中に見出されるような形態、構造などの中に存在しない遺伝子、または通常は存在し、天然の発現パターンと異なる手法で発現すること、例えば過剰発現することを望まれた遺伝子を指すものとする。したがっての用語「外因性」遺伝子またはＤＮＡは、類似の遺伝子が既にレシピエント細胞内に存在し得るか否かにかかわらず、そのような細胞に導入される任意の遺伝子またはＤＮＡセグメントを指すものとする。外因性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの型としては、細胞内に既に存在するＤＮＡ、同じ型の生物体の別の個体からのＤＮＡ、異なる生物体からのＤＮＡ、あるいは遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ配列または遺伝子の合成もしくは修飾バージョンをコードするＤＮＡ配列などの外部で生成されたＤＮＡを挙げることができる。

本明細書に記載されたアプローチに従って開発された宿主株は、当該技術分野で公知の多数の手段により評価され得る（例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ （２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ４１（１）、 ２０７−２３４； Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ， ｅｄ． （２００５） Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， ＩＳＢＮ−１０： ３５２７３１０３６３； Ｂａｎｅｙｘ （２００４） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０９５４５２３２５３参照）。

遺伝子を下方制御またはサイレンシングする方法は、当該技術分野で公知である。例えば発現されたタンパク質活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質アプタマー、ヌクレオチドアプタマー、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））を用いて下方制御または排除され得る（例えば、ハンマーヘッドリボザイムおよび小ヘアピンＲＮＡを記載しているＦａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｄｓ （２００６） Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １７３， ２８９−３０３Ｇ；デオキシリボヌクレオチド配列の標的化を記載しているＨｅｌｅｎｅ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０， ２７−３６； Ｍａｈｅｒ （１９９２） Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）： ８０７−１５；アプタマーを記載しているＬｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． １０， １−８；ＲＮＡｉを記載しているＲｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（３）， ３２６−３３０；ＲＮＡｉを記載しているＰｕｓｈｐａｒａｊ ａｎｄ Ｍｅｌｅｎｄｅｚ （２００６） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３３（５−６）， ５０４−５１０；ＲＮＡｉを記載しているＤｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ６７， １４７−１７３；ＲＮＡｉを記載しているＤｙｋｘｈｏｏｒｎ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ （２００５） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５６， ４０１−４２３参照）。ＲＮＡｉ分子は、種々の供給源から市販される（例えば、Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州、；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州所在；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。種々のアルゴリズムを用いた複数のｓｉＲＮＡ分子設計プログラムが、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｅｎｉｘ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ， Ａｍｂｉｏｎ； ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標） ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； ｓｈｉＲＮＡ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌｓ， Ｂｉｏｉｎｏｆｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ参照）。最適なｓｉＲＮＡ配列を定義することにおいて影響力のある特質としては、ｓｉＲＮＡの末端のＧ／Ｃ含量、ｓｉＲＮＡの特異的内部ドメインのＴｍ、ｓｉＲＮＡの長さ、ＣＤＳ（コード領域）内の標的配列の位置、および３’オーバーハングのヌクレオチド含量が挙げられる。

ゲノム編集
本明細書で記載された通り、表面提示は、ゲノム編集を利用して実施され得る。ゲノム編集の工程は、周知であり、例えばＡｌｄｉ ２０１８ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９（１９１１）を参照されたい。それゆえ本明細書で他に断りがある場合を除き、本開示の工程は、そのような工程に従って実行され得る。

例えばゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥＮ、またはＺＮＦを含み得る。

例として、クラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、哺乳動物細胞内の所望のゲノム部位を標的化するゲノム編集ツールのより新しい分類である。近年になり発表されたタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２０−ヌクレオチドＤＮＡ配列にハイブリダイズする合成誘導型ＲＮＡと複合体化すること、およびＣａｓ９により認識されたＮＧＧモチーフを直前に置くこと（したがって（Ｎ）_２０ＮＧＧは、ＤＮＡ配列を標的化すること）、によりゲノム部位に標的化されるＣａｓ９ヌクレアーゼを利用する。これが、ＮＧＧモチーフの３ヌクレオチド上流に二本鎖切断をもたらす。この二本鎖切断は、エラーを生じやすく対立遺伝子をノックアウトするフレームシフト突然変異に伝導する非相同末端結合、またはゲノム内の突然変異をノックインもしくは修正する、外因的に導入された二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ修復鋳型の使用により開拓され得る相同組換え修復のいずれかを推進する。したがって例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた、ゲノム編集は、病原体などの標的微生物を標的化する、または感知する治療用途に有用なツールであり得る。

例えば本明細書に記載された方法は、標的ポリヌクレオチド配列を、クラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返しに関連する（Ｃａｓ）タンパク質と接触させることを含む、細胞において標的ポリヌクレオチド配列を改変するための方法を含み得る。

配合
本明細書に記載された薬剤および組成物は、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．）、 ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， ＩＳＢＮ： ０７８１７４６７３６ （２００５）に記載される通り、１種または複数の医薬的に許容できる担体または賦形剤を用いて任意の従来の手法により配合され得る。そのような配合剤は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、精製形態であり得る治療有効量の本明細書に記載された生物活性剤を、適切な量の担体と共に含有することになる。

用語「配合」は、薬物をヒトなどの対象への投与に適した形態で調製することを指す。したがって「配合」は、希釈剤または担体をはじめとする医薬的に許容できる賦形剤を含み得る。

本明細書で用いられる用語「医薬的に許容できる」は、薬理学的活性の許容できない損失または許容できない有害副作用を誘起しない物質または成分を記載し得る。医薬的に許容できる原材料の例は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ２９）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＮＦ２４）、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｉｎｃ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ２００５（”ＵＳＰ／ＮＦ”）、またはより近年の編集物の中に研究論文を有するもの、ならびに連続で更新されるＦＤＡのＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈのオンラインデータベースで列挙された成分であり得る。ＵＳＰ／ＮＦ他の中に記載されていない他の有用な成分もまた、用いられてよい。

本明細書で用いられる用語「医薬的に許容できる賦形剤」は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗バクテリアおよび抗真菌剤、等張剤、または吸収遅延剤を包含し得る。医薬的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．）、 ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， ＩＳＢＮ： ０７８１７４６７３６ （２００５）参照）。任意の従来の媒体または薬剤が、有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物中でのそれの使用が、企図される。補助的有効成分もまた、該組成物中に取り込まれ得る。

「安定した」配合剤または組成物は、約０℃〜約６０℃の間などの簡便な温度で、少なくとも約１日間、少なくとも約１週間、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間などの商業的に合理性のある期間、貯蔵を可能にするのに充分な安定性を有する組成物を指し得る。

該配合剤は、投与様式を適合させなければならない。本開示での使用の薬剤は、非限定的に非経口、肺、経口、局所、皮内、腫瘍内、鼻内、吸入（例えば、エアロゾル中で）、埋め込み、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、眼科的、経皮、口腔、および直腸をはじめとする複数の経路を利用した対象への投与のための公知方法により配合され得る。個々の薬剤が、１種もしくは複数の追加の薬剤と併用で、または他の生物学的活性剤もしくは生物学的不活性剤と共に、投与されてもよい。そのような生物学的活性剤または不活性剤は、イオン、共有、ファンデルワールス、疎水性、親水性または他の物理学的力により、薬剤（複数可）と流体連通もしくは機械通信されていても、または該薬剤（複数可）に付着されていてもよい。

徐放性（または持続放出性）調製物が、薬剤（複数可）の活性を延長して、投与頻度を減少させるために配合されてもよい。徐放性調製物はまた、作用開始時間または薬剤の血中レベルなどの他の特徴を成し遂げ、結果的に副作用の出現に影響を及ぼすように使用され得る。制御放出性調製物は、所望の治療効果を生じる薬剤（複数可）の量を最初に放出し、薬剤の他の量を徐々に、そして連続して放出して、長期間にわたり治療効果のレベルを維持してもよい。体内で薬剤のほぼ一定レベルを維持するために、薬剤は、投与剤形から、体内から代謝または排泄される薬剤の量に置き換わる速度で放出され得る。薬剤の制御放出は、様々な誘導因子、例えばｐＨ変化、温度変化、酵素、水、または他の生理学的条件もしくは分子により刺激されてもよい。

本明細書に記載された薬剤または組成物はまた、以下にさらに記載される通り、他の治療モダリティと組み合わせて使用され得る。したがって本明細書に記載された治療薬に加え、疾患、障害、または病気の処置に有効であることが知られた他の治療薬を対象に提供してもよい。

治療方法
同じく提供されるのは、微生物／細菌感染を処置または予防するために、遺伝子操作された微生物の治療有効量の投与が必要な対象において疾患または微生物感染（例えば、ウイルス感染、病原性共生生物、病原性微生物への感染）を処置する工程である。

本明細書に記載された方法は、一般に必要とする対象において実施される。本明細書に記載された治療方法が必要な対象は、微生物感染を有する対象、該感染と診断された対象、該感染を有する疑いがある対象、または該感染を発症するリスクがある対象であり得る。処置の必要性の決定は、典型的には問題となる疾患または病気と一致した医療歴および健康診断により評定されよう。本明細書に記載された方法により処置され得る様々な病気の診断は、当該技術分野の技能の範囲内である。該対象は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、サル、ハムスター、モルモット、およびヒトなどの哺乳動物をはじめとする動物対象であり得る。例えば該対象は、ヒト対象であり得る。

一般に、遺伝子操作された微生物の安全かつ有効な量は、例えば望ましくない副作用を最小限に抑えながら、対象における所望の治療効果を誘起する量である。様々な実施形態において、本明細書に記載された遺伝子操作された微生物の有効量は、実質的に、微生物／細菌感染を阻害すること、微生物／細菌感染の進行を緩徐にすること、または微生物／細菌感染の発症を限定することが可能である。

本明細書に記載された方法によれば、投与は、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、眼科的、口腔、または直腸投与であり得る。

遺伝子操作された微生物の治療有効量は、本明細書に記載された処置において使用される場合、純粋な形態で用いられるか、またはそのような形態が存在する場合、医薬的に許容できる塩の形態で、医薬的に許容できる賦形剤と共に、もしくは該賦形剤を伴わずに、用いられ得る。例えば本開示の化合物は、任意の医療的処置に適用可能な合理的利益／リスク比で、微生物／細菌感染を処置または予防するのに充分な量で、投与され得る。

単一投与剤形を生成するために医薬的に許容できる担体と併用され得る本明細書に記載された組成物の量は、処置される宿主および固有の投与様式に応じて変動するであろう。必要な治療有効量は、個々の用量の複数の投与により達成され得るため、各投与剤形の個々の用量に含有される薬剤の単位量が、単独で治療有効量を構成する必要がないことは、当業者により認識されよう。

本明細書に記載された組成物の毒性および治療有効性は、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死となる用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療有効性がある用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的医薬手順により決定され得る。毒性の影響と治療効果との用量比が、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表され得る治療指数であり、治療指数が大きいほど最適であると、当該技術分野で一般に理解される。

任意の固有の対象にとっての特異的治療有効用量のレベルは、処置される障害および該障害の重症度；用いられる特異的化合物の活性；用いられる特異的組成物；対象の年齢、体重、一般的健康、性別および食事；投与時間；投与経路；用いられる組成物の排泄速度；処置期間；用いられる特異的化合物と併用で、または同時期に用いられる薬物；ならびに医薬の技術分野で周知される類似の因子をはじめとする種々の因子に依存するであろう（例えば、Ｋｏｄａ−Ｋｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ＩＳＢＮ ０７８１７４８４５３； Ｗｉｎｔｅｒ （２００３） Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ４^ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ＩＳＢＮ ０７８１７４１４７５； Ｓｈａｒｑｅｌ （２００４） Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａpｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， ＩＳＢＮ ００７１３７５５０３参照）。例えば、所望の治療効果を実現するのに必要となるレベルより低いレベルで該組成物の投与を開始して、所望の効果が実現されるまで投与量を徐々に増加させることは、当該技術分野の技能に十分含まれる。所望なら、有効な日用量が、投与の目的のために複数の用量に分割されてもよい。結果的に、単一用量の組成物は、日用量を作り上げるのにそのような量またはその約数を含有してもよい。しかし、本開示の化合物および組成物の合計日用量が、健全な医療判断の範囲内で担当医により決意されることは、理解されよう。

また、本明細書に記載された状態、疾患、障害、および病気、ならびにその他のそれぞれは、本明細書に記載された組成物および方法から利益を享受し得る。一般に状態、疾患、障害、または病気を処置することは、該状態、疾患、障害、または病気により苦しめられ得る、またはそれらの素因を有し得るが、まだそれらの臨床症状もしくは潜在的症状に見舞われていない、または提示していない哺乳動物において、臨床症状の出現を予防または遅延することを包含する。処置することはまた、該状態、疾患、障害、または病気を阻害すること、例えば該疾患、またはその少なくとも１つの臨床症状もしくは潜在的症状の発症を停止または低減することを包含し得る。さらに処置することは、該疾患を軽減すること、例えば該状態、疾患、障害もしくは病気、またはその臨床症状もしくは潜在的症状の少なくとも１つの回復を誘起することを包含し得る。処置される対象への利益は、統計学的に有意である、または少なくとも対象もしくは医師にとって認知できる、のいずれかであり得る。

遺伝子操作された微生物の投与は、単回のイベントとして、または処置のタイムコースにわたり、行われ得る。例えば遺伝子操作された微生物が、連日、週１回、週２回、または月１回、投与され得る。急性の病気の処置では、処置のタイムコースは通常、少なくとも数日であろう。特定の病気では、処置が数日から数週間に及び得る。例えば処置は、１週間、２週間、または３週間に及び得る。より慢性の病気では、処置が、数週間から数ヶ月または１年以上に及び得る。

本明細書に記載された方法に従う処置は、微生物／細菌感染のための従来の処置モダリティに先立って、それと並行して、またはその後に実施され得る。

遺伝子操作された微生物は、抗生物質、抗炎症剤または別の薬剤など、別の薬剤と同時に、または連続で投与され得る。例えば遺伝子操作された微生物は、抗生物質または抗炎症剤などの別の薬剤と同時に投与され得る。同時投与は、それぞれが遺伝子操作された微生物、抗生物質、抗炎症剤または別の薬剤の１種または複数を含有する、別の組成物の投与を通して行われ得る。同時投与は、遺伝子操作された微生物、抗生物質、抗炎症剤または別の薬剤のうちの２つ以上を含有する１つの組成物の投与を通して行われ得る。遺伝子操作された微生物は、抗生物質、抗炎症剤、または別の薬剤と連続で投与され得る。例えば遺伝子操作された微生物は、抗生物質、抗炎症剤、または別の薬剤の前または後に投与され得る。

投与
本明細書に記載された薬剤および組成物は、当業者に知られた種々の手段で本明細書に記載された方法に従って投与され得る。該薬剤および組成物は、外因性材料または内因性材料のいずれかとして治療に用いられ得る。外因性薬剤は、身体の外側で生成または製造されて、身体に投与されるものである。内因性薬剤は、体内への送達または体内の他の臓器への送達のために幾つかの型のデバイス（生物学的または他の）により身体の内側で生成または製造されるものである。

先に議論された通り、投与は、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、眼科的、口腔、または直腸投与であり得る。

本明細書に記載された薬剤および組成物は、当該技術分野で周知の種々の方法で投与され得る。投与は、例えば経口摂取、直接の注射（例えば、全身または定位）、該当する因子を分泌するように遺伝子操作された細胞の埋め込み、薬物放出性生物材料、ポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム、多層コーティング、マイクロ粒子、埋め込み可能なマトリクスデバイス、ミニ浸透圧ポンプ、埋め込み可能なポンプ、注射可能なゲルおよびハイドロゲル、リポソーム、ミセル（例えば、３０μｍまで）、ナノスフェア（例えば、１μｍ未満）、マイクロスフェア（例えば、１〜１００μｍ）、貯蔵デバイス、上記のもののいずれかの組み合わせ、または所望の放出プロファイルを様々な割合で提供する他の適した送達ビヒクルを伴う方法を包含し得る。薬剤または組成物の制御放出性送達の他の方法は、当業者に公知であり、本開示の範囲内である。

送達システムとしては、例えばインスリンまたは化学療法薬を特異的臓器または腫瘍に送達するために用いられるものと類似の手法で、該薬剤または組成物を投与するために用いられ得る輸液ポンプを挙げることができる。典型的にはそのようなシステムを利用して、薬剤または組成物が、選択された部位で制御された期間にわたり薬剤を放出する生分解性、生体適合性ポリマーインプラントと併用で投与され得る。ポリマー材料の例としては、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニル、ならびにそれらのコポリマーおよび組み合わせが挙げられる。加えて、制御放出性システムは、治療ターゲットの付近に配置され、したがって全身投与量の一部のみを必要とし得る。

薬剤は、種々の担体送達システム中にカプセル化されて、投与され得る。担体送達システムの例としては、マイクロスフェア、ハイドロゲル、ポリマーインプラント、スマートポリマー担体、およびリポソームが挙げられる（一般に、Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ， ｅｄｓ． （２００６） Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ＣＲＣ， ＩＳＢＮ−１０：０８４９３２５３３１参照）。分子または生体分子剤送達のための担体に基づくシステムは、細胞内送達を提供すること；生体分子／薬剤放出速度を適合させること；作用部位に到達する生体分子の割合を上昇させること；作用部位への薬物輸送を改善すること；他の薬剤もしくは賦形剤と共局在的に滞積させること；インビボでの薬剤の安定性を改善すること；クリアランスを低下させることにより作用部位での薬剤の滞留時間を長期化すること；非標的組織への薬剤の非特異的送達を減少させること；薬剤により誘起された刺激を減少させること；薬剤の高い初期用量による毒性を低下させること；薬剤の免疫原性を改変すること；投与頻度を減少させること：製品の風味を改善すること；または製品の貯蔵寿命を改善すること、が可能である。

分子生物学のプロトコルを利用した本明細書に記載された組成物および方法は、当該技術分野で公知の種々の標準的技術に従い得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００６） Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０８７９６９７７１７； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０４７１２５０９２９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０８７９６９５７７３； Ｅｌｈａｉ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｏｌｋ， Ｃ． Ｐ． １９８８． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６７， ７４７−７５４； Ｓｔｕｄｉｅｒ （２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ４１（１）， ２０７−２３４； Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ， ｅｄ． （２００５） Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， ＩＳＢＮ−１０： ３５２７３１０３６３； Ｂａｎｅｙｘ （２００４） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ， ＩＳＢＮ−１０： ０９５４５２３２５３参照）。

本明細書に記載された定義および方法は、本開示をより良好に定義するため、そして本開示の実践において当業者を誘導するために提供される。他に断りがなければ、用語は、関連の技術分野の当業者による従来の使用に従って理解されなければならない。

幾つかの実施形態において、本開示の特定の実施形態を記載および請求するために用いられる現在医療の量を表す数、分子量などの特性、反応条件その他は、用語「約」により幾つかの例で修飾されると理解されなければならない。幾つかの実施形態において、用語「約」は、値を決定するために用いられるデバイスまたは方法のための平均の標準偏差を値が含むことを示すために用いられる。幾つかの実施形態において、記載された説明および添付された特許請求の範囲に表された数値パラメータは、特有の実施形態により得られようと探索された所望の特性に応じて変動し得る近似である。幾つかの実施形態において、該数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸めの技術を適用することにより解釈されなければならない。本開示の幾つかの実施形態の広い適用範囲を表す数字範囲およびパラメータは近似であるが、具体的実施例に表された数値は、可能な限り精密に報告されている。本開示の幾つかの実施形態に存在する数値は、各検査測定で見出された標準偏差から必然的に生じた特定の誤差を含む場合がある。本明細書の値範囲の列挙は単に、その範囲に含まれる別々の各値を個別に参照する簡略的方法として働くものである。本明細書に他に示されない限り、各個別の値は、それが個別に本明細書に列挙されるかのように、本明細書に組み入れられる。

幾つかの実施形態において、特有の実施形態を説明する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の特定の文脈で）用いられる用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の参照は、他に具体的に断りがなければ、単数および複数の両方を対象とするものと解釈され得る。幾つかの実施形態において、特許請求の範囲を含む本明細書で用いられる用語「ｏｒ」は、他のものだけを参照することを明確に示さない限り、または他のものが互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために用いられる。

用語「含む」、「有する」および「包含する」は、制限のない連結動詞である。「含む」、「含むこと」、「有する」、「有すること」、「包含する」および「包含すること」などのこれらの動詞の１つまたは複数の任意の形態または時制もまた、制限がない。例えば、１つまたは複数のステップを「含む」、「有する」または「包含する」任意の方法は、それらの１つまたは複数のステップのみを保有することに限定されず、他の列挙されていないステップも対象にする可能性がある。同様に、１つまたは複数の特色を「含む」、「有する」または「包含する」任意の組成物またはデバイスは、それらの１つまたは複数の特色のみを保有することに限定されず、他の列挙されていない特色も対象にする可能性がある。

本明細書に記載された方法の全てが、本明細書に他に示されない限り、または他に文脈により明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書の特定の実施形態に関係して提供されたあらゆる例または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、本開示をより良好に示しているに過ぎず、他で請求された本開示の範囲への限定を提示しない。本明細書内の言語は、本開示の実践に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきでない。

本明細書に開示された本開示の代替的要素または実施形態の群分けは、限定と解釈されるべきでない。各群の構成員は、個別に、または本明細書で見出される群の他の構成物もしく他の要素との任意の組み合わせで、参照および請求され得る。群の１つまたは複数の構成物は、簡便性または特許性の理由から、群に含まれ得る、または群から排除され得る。任意のそのような包含または排除が行われる場合、本明細書は、添付の特許請求の範囲で用いられた全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たす、そのように改良された群を含むものと、ここでは判断される。

各個別の発行物、特許、特許出願、および他の参考資料が、全ての目的で全体として参照より組み入れられることを示すことを具体的かつ個別に示すのと同程度に、全本出願で引用された発行物、特許、特許出願、および他の参考資料の全てが、全ての目的で全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書の参考資料の引用は、それらが本開示の先行技術であることの承認と解釈されるべきでない。

本開示を詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲で定義された本開示の範囲を逸脱することなく、改良、変更および均等な実施形態が可能であることは、明白であろう。さらに、本開示の全ての実施例が、非限定的実施例として提供されていることが、認識されなければならない。

実施例
以下の非限定的実施例は、本開示をさらに例示するために提供されている。以下の実施例で開示された技術が、本開示の実践において本発明者らが機能を十分に見出したアプローチを表し、したがってその実践のための方式の実施例を構成すると判断され得ることは、当業者に認識されなければならない。しかし当業者は、本開示に照らして、開示された具体的実施形態で多くの変更がなされ得ること、そしてそれでも本開示の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを、認識すべきである。

実施例１：プロバイオティクス酵母の遺伝子操作された表面提示
以下の実施例は、プロバイオティクス酵母（例えば、サッカロマイセス・ブラウディ）の遺伝子操作を記載している。これらの遺伝子操作されたプロバイオティクス酵母は、病原体の除去に用いられ得る。この実施例は、抗体／結合ドメインの表面提示の構築、およびＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集ツール調製の設計を記載している。

結合ドメインの表面提示
ここでは、Ｓ．ブラウディのためのタンパク質提示システムの完成が示されている。提示システムは、Ｆｌｏ４２８アンカータンパク質に基づいて構築され、検証された。表面提示は、宿主消化管内で遺伝子操作されたＳ．ブラウディの安定性／寿命を変化させない。ＭＮｏＶ結合ドメインの表面提示は、ＭＮｏＶに向けられるＳ．ブラウディのインビトロ結合活性を増強した（約３倍）。

遺伝子操作されたＳ．ブラウディのＭＮｏＶ結合活性のインビボテストが、実施された。

ここで記載される、他の病原体結合ドメインのための提示は、I本明細書に記載されたものと同様の手法で作製され得る。

Ｓ．ブラウディのための表面提示システムの構築
ここでは、フロキュリン系が、用いられた。１つの標的ペプチド（例えば、ＣＬＭ−１）を提示するための単一キメラタンパク質の簡単なカセットが、構築された（例えば、図９参照）。

ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ３）プロモータが、用いられて、標的タンパク質の強い構成型発現を実証した。

接合因子αシグナル配列およびＦｌｏ４２８（Ｃ−末端４２８ａａアンカー領域）が、標的タンパク質の局在化に用いられた。

ＣＹＣ１（シトクロムＣ１）ターミネータが、用いられた。

Ｆｌｏ４２８を除き、全ての要素が、Ｓ．ブラウディのゲノムＤＮＡからクローニングされた。

概要
ここで実証された通り、ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲゲノム編集ツールは、Ｓ．ブラウディゲノムにおいて効率的なインタージェニック部位を標的化するために使用に成功し、合成転写システムが、ｄＣａｓ９に基づいて開発された。

実施例２：プロバイオティクス酵母の遺伝子操作−酵母バイオセンサ
以下の実施例は、真菌バイオセンサとしての使用のためのＳ．ブラウディ表面でのタンパク質提示を記載している。この実施例は、人工センサおよびシグナル伝達システムの構築、ならびにＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集ツール調製の設計を記載している。

ここでは、酵母バイオセンサは、「アンカー」タンパク質領域を使用しない。表面提示で用いられたアンカー領域の代わりに、感知メカニズムのためのキメラタンパク質が、細胞質から細胞外空間まで位置を延ばした膜貫通型タンパク質である「ステム」を有する（例えば、図３参照）。

ここでは、様々な結合タンパク質、および４種の構成型プロモータと２種の分泌シグナル配列との８種の組み合わせをテストするための、多重クローニング部位を有するＦｌｏ１ｐに基づく表面提示カセットのクローニングを含むＳ．ブラウディ表面でのタンパク質提示が、示される。

同じくここで記載されるのは、記載された５つのインタージェニック部位（Ｃｈｒ ＸＶＩ上の２つ）のための誘導型ＲＮＡ発現カセットの構築、結合剤（生体分子）とトランス活性化因子との様々な組み合わせをテストするための２つの多重クローニング部位を有するキメラセンサの発現カセットの構築、人工プロモータの制御下でのレポータとしての蛍光タンパク質ｙｅＲＦＰおよびｙｅＧＦＰの発現カセットの構築、ならびにｄＣａｓ９およびスカフォールドＲＮＡ発現カセットの構築を含む、真菌バイオセンサである。

人工センサおよびシグナル伝達システムの構築
合成転写システムが、構築および検証された。キメラセンサのバックボーンが、ネイティブ膜貫通型タンパク質に基づいて構築された。一組のキメラセンサ（合計８）が、第一の標的であるＳ．アウレウスのために構築された（ｓｃＦｖｓ、ＺＷ８８）。

野生型膜貫通型タンパク質が、ノックアウトされ、センサ分子の発現カセットが、導入された。

この実施例は、新しい細胞壁結合ドメインを用いた新しいキメラセンサの構築用に拡張され得る。

キメラセンサの組み合わせが、基本となるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いてインタージェニック部位ＩＳ２ｎ（ユビキチンのＮ−末端断片を有するセンサタンパク質の場合）およびＩＳ５ｎ（トランス活性化因子に融合されたユビキチンのＣ−末端断片を有するセンサタンパク質の場合）に組み込まれた。キメラセンサカセットのコード配列は、標的インタージェニック部位ＩＳ２ｎおよびＩＳ５ｎの上流および下流と同一の５０塩基対を含む２つの相同性領域に挟まれており、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集のためのドナーＤＮＡとしてＰＣＲ増幅された。該ドナーＤＮＡ断片と、ＩＳ２ｎおよびＩＳ５ｎ上にＣａｓ９エンドヌクレアーゼを配置する誘導型ＲＮＡの発現ベクターとがそれぞれ、Ｃａｓ９を発現するＳ．ブラウディ内に形質転換された（例えば、図５参照）。Ｃａｓ９によるＩＳ２ｎおよびＩＳ５ｎ上の二本鎖切断が、選択圧であり、それによってＩＳ２ｎおよびＩＳ５ｎを対象とする相同組換えを介したドナーＤＮＡの組み込みにより二本鎖切断から回収された疑いのない構築物を選択することが可能になる。

ここでは、キメラセンサが物理的刺激を転写シグナルに変換し得ることが、示される（例えば、図２参照）。バイオセンサの活性化は、サッカロマイセス属酵母の自然なユビキチナーゼ活性に基づく（例えば、図２参照）。

突然変異体Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）分子（膜貫通型タンパク質）は、物理的ストレスとは無関係にクラスター化され得ない。そのため突然変異体Ｗｓｃ１ｐは、ステム部分としての使用に適する。

人工トランス活性化因子の設計は、ｄＣａｓ９およびスカフォールドＲＮＡ上にある（例えば、図３、図４参照）。

材料
クローニング試薬：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
他の化学試薬：Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
オリゴヌクレオチド：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｓ．ブラウディ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ

プロバイオティクス酵母の遺伝子操作：キメラセンサ
プロバイオティクス酵母における合成バイオセンサの要件
キメラセンサは、拡張可能な標的範囲および直交性発現システムを有する。

このセンサ部分では、細胞外刺激が、細胞内シグナルに変換される。

結合剤は、抗体（ｓｃＦｖ他）、受容体、または細胞壁結合ドメインの機能的断片であり得る。ナノボディまたは１本より多くの鎖を有する他の抗体形式は、キメラセンサ設計における結合剤として採用されるのに適さない。しかしそれらは、提示（例えば、スポンジ）設計における使用に適する。

キメラセンサは、センサ部分および結合ドメインと共に、膜貫通型ドメインおよびシグナル分子を含む。

シグナル伝達／遺伝子転写（例えば、図１５参照）は、プロモータ、トランス活性化因子／転写因子、およびレポータを含んでいた。

ＣＲＩＳＰＲに基づくゲノム編集ツール（例えば、図１６参照）が、クローニングに用いられた。詳細にはＣａｓ９またはＣｐｆ１および誘導型ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。

合成プロモータおよびトランス活性化因子のテスト（例えば、図４、図１７参照）
レポータカセットが、ゲノム（ＩＳ１）に組み込まれた。スカフォールドＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）、トランス活性化因子、およびｄＣａｓ９のエピソーム発現が、実施された。

強い構成型プロモータ：Ｐ_ＴＥＦ１、Ｐ_ＡＤＨ１（例えば、図１８参照）が、用いられた。

新しいＰ_{ＧＡＬｓｙｎ}プロモータおよび対応するｓｃＲＮＡ（例えば、図１９参照）
新しいｓｃＲＮＡ標的配列の基準としては、自己相補性がないこと、Ｓ．ブラウディ（セレビシエ）ゲノムの中に同じ配列がないこと、適切な効率、およびｄＣａｓ９発現カセットとレポータ遺伝子とセンサ発現カセットとを含むセンサシステムの他のコンパートメント内に同じ配列がないこと、が挙げられた。Ｐ_{ＧＡＬｓｙｎ１}は、Ｐ_ＧＡＬ７の最初のｓｃＲＮＡ結合配列（２０塩基対）と最小プロモータ領域（３’末端から１６５塩基対）とを接続することにより設計された。他のプロモータでは、該最初のｓｃＲＮＡ結合配列が、ＦａｓｔＣｌｏｎｉｎｇ法（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を通して他のｓｃＲＮＡ結合配列により置き換えられた。

新しいＰ_{ＧＡＬｓｙｎ}プロモータおよび対応するｓｃＲＮＡのテスト
Ｐ_{ＧＡＬｓｙｎ}プロモータ、レポータ（ＧＦＰまたはＲＦＰ）、およびＴ_ｃｙｃ１を含む新しいレポータカセットが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集を介してＩＳ１ｎインタージェニック部位に組み込まれた。

物理的刺激を転写シグナルに変換するキメラセンサ（例えば、図２参照）
このセンサ部分では、細胞外刺激が、細胞内シグナルに変換された：結合ドメイン（例えば、機能的抗体断片（ｓｃＦｖ他）、受容体、エンドリシン細胞壁結合ドメイン他）、膜貫通型ドメイン、およびシグナル分子。

キメラセンサ部分では、物理的刺激が、サッカロマイセス属酵母の本来備わるユビキチナーゼ活性に基づいて転写シグナルに変換される。

野生型Ｗｓｃ１ｐ ｖｓ．突然変異体（Ｃ８Ａ）Ｗｓｃ１ｐ。この野生型タンパク質は、自己クラスター化するが、１つの点突然変異がこのタンパク質をクラスター（Ｃ８Ａ）にし得ないことが過去に示されている。したがって突然変異体Ｗｓｃ１ｐは、ステムに適していた（例えば、図２参照）。

物理的刺激を転写シグナルに変換するキメラセンサが、生成された。ｓｃＲＮＡおよびｄＣａｓ９による人工および直交性の発現（例えば、図３、図４参照）が、実証された。２つの異なるプロモータ転写因子の組み合わせが、用いられた（例えば、ＮＵｂＩ、ＮＵｂＧ）。多くの研究グループが、ｄＣａｓ９に転写活性化因子を付加して、標的遺伝子の調節転写（ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を制御した。

キメラセンサのクローニング（例えば、図２２参照）
コアが、局在化のために単一ペプチドで構築された：膜貫通型ドメイン（例えば、突然変異体Ｗｓｃ１ｐ）；結合ドメインおよびトランス活性化クローニングのためのＭＣＳ；プロモータおよびターミネータ（Ｐ_ＦＡＵ１はＳ．セレビシエにおいてＰ_ＷＳＣ１の５０％発現レベルを呈する）；結合ドメイン（ＺＷ８８（２０１７， Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、抗Ｓ．アウレウスｓｃＦｖ。

Ｎ−末端ユビキチン

（ＮＵｂＩまたはＮＵｂＧ（１９９４， Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ）（突然変異体、Ｉ１３Ｇ）およびＣ−末端ユビキチン−トランス活性化因子

（ＣＵｂ−ＭＣＰ−ＶＰ６４またはＣＵｂ−ＰＣＰ−ＶＰ６４）を含む、ユビキチン−トランス活性化因子が、構築された（例えば、図３参照）。ＮＵｂＧのＩ１３Ｇ突然変異は、物理的刺激と無関係にＮＵｂとＣＵｂとのネイティブ相互作用による潜在的ノイズシグナルを最小限に抑える。キメラセンサが、ゲノムに組み込まれた。

概要
ここで実証された通り、キメラセンサのコア構造が、開発された。

実施例３：標的ネズミノロウイルス（ＭＮｏＶ）
以下の実施例は、ノロウイルスを標的化する先に記載された酵母表面提示の使用を記載している。該遺伝子操作されたＳ．ブラウディがＣＬＭ−１を提示することが実証された。

フロキュリン系が、酵母表面提示のために用いられた（例えば、図１参照）。簡単な単一カセットが、１つの標的タンパク質を提示するために用いられた。グリセルアルデヒドー３-リン酸デヒドロゲナーゼ３（ＴＤＨ３）プロモータが、強い構成型発現に用いられた。接合因子αシグナル配列が、細胞表面での局在化に用いられた。用いられたアンカータンパク質は、Ｆｌｏ１ｐのアンカー領域であるレクチン様細胞壁タンパク質（Ｃ−末端４２８ａａ（１２８４ｂｐ）、Ｆｌｏ４２８）であった。シトクロムＣ１（ＣＹＣ１）ターミネータが、使用のために選択された。

Ｃａｓ９を基にしたＩＳ１ｎ部位への組み込みが、表面提示カセットをＳ．ブラウディの第ＸＶ染色体に組み込むために用いられた。ＣＬＭ−１提示単位発現カセットが、ＩＳ１ｎの上流および下流と同一の５０塩基対を含む２つの相同性領域に挟まれており、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集のためのドナーＤＮＡとしてＰＣＲ増幅された。該ドナーＤＮＡ断片と、ＩＳ１ｎ上にＣａｓ９エンドヌクレアーゼを配置する誘導型ＲＮＡの発現ベクターとが、Ｃａｓ９を発現するＳ．ブラウディ内に形質転換された（例えば、図５参照）。Ｃａｓ９によるＩＳ１ｎ上の二本鎖切断が、選択圧であり、それにより本発明者らは、ＩＳ１ｎを対象とする相同組換えを介したドナーＤＮＡの組み込みにより二本鎖切断から回収された疑いのない構築物を選択することが可能になった。この組み込みは、ＩＳ１ｎ部位を含む５００ｂｐ領域を増幅して（例えば、図６参照）配列決定するコロニーＰＣＲにより検証された。提示システムによるＣＬＭ−１の提示は、それぞれ一次および二次抗体としてのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ３Ｆ６（ハムスター、非市販）と、フルオロフォア６４７にコンジュゲートされた抗ハムスター抗体とを用い、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡測定を介して検証された（例えば、図７Ａ〜図７Ｆ参照）。

これは、消化管内のＭＮｏＶレベルに及ぼすＣＬＭ−１提示Ｓ．ブラウディ投与の影響を評定した最初のインビボ結合アッセイと考えられる。

Ｓ．ブラウディを投与されたマウスは、３日間のＳ．ブラウディ投与の後、より多量のＭＮｏＶを排出し、糞便中のＭＮｏＶ量は、８日以内に低くなった。その影響は、ＣＬＭ−１提示Ｓ．ブラウディを投与されたマウスで有意であった。

ノロウイルス
ノロウイルスは、急性胃腸炎の突発の主因である。ＭＮｏＶは、細胞培養で日常的に生育されることができ、実験用マウスに感染させることができ、ノロウイルスの複製および病原性のメカニズムを定義するためのシステムとして用いられてきた。

ＣＤ３００ｌｆ
ＣＭＲＦ３５様分子１（ＣＬＭ−１）が、ＭＮｏＶの標的タンパク質として用いられた。膜貫通型タンパク質が、単一ＩｇＶ様細胞外ドメインを含有する。モノクローナル抗体との反応性により同定されたＣＭＲＦ３５抗原は、単球、好中球、ならびに一部のＴおよびＢリンパ球上に存在する。

方法
エンドリシン遺伝子の３’末端領域の細胞壁結合ドメインが、終止コドンを用いずに増幅されて、ＣＬＭ−１提示カセット内のＣＬＭ−１をコードする遺伝子に置換された。新しい提示カセットもまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集を通してインタージェニック部位ＩＳ１ｎに組み込まれた。

ファージエンドリシンに由来する細胞壁結合ドメインを用いることによる適用範囲の拡張が、本明細書に記載された方法を利用して実施され得る。例えばＬｙｓＧＨ１５ＢおよびＬｙｓＳＡ９７（Ｓ．アウレウス）、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ（Ｃ．ディフィシル／パーフリンゲンス）、ならびにＰｌｙＰ３５（Ｌ．モノサイトゲネス）細胞壁結合ドメインのための提示カセットが、構築され得る。同様に、ｐｈｉＣｃｏｌＢＢ３５（カンピロバクター・コリ）の結合ドメインのクローニングが、本明細書に記載された他の細胞壁結合ドメインのためのクローニング方法と同じ手法で実施され得る。

免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡測定
標的タンパク質が、Ｓ．ブラウディ株の表面での提示に成功した（例えば、図７参照）。蛍光シグナルの環形状は、表面提示を表す。一次抗体は、ＣＬＭ−１タンパク質を直接標的化するＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ３Ｆ６（ハムスター、非市販）であった。二次抗体：６４７にコンジュゲートされた抗ハムスター抗体。

ＣＬＭ−１提示酵母とＭＮｏＶとの相互作用
インビトロ結合アッセイ（例えば、図１３参照）が、ここで実証される。

酵母細胞表面でのＭＮｏＶの定量で、Ｓ．ブラウディ（ｗ／ｔ）または遺伝子操作されたＳ．ブラウディ（ＣＬＭ−１提示）の６×１０^８ＣＦＵ、およびＭＮｏＶの１０^６プラーク形成単位（ＰＦＵ）を示した。

ＣＬＭ−１の表面提示は、Ｓ．ブラウディの結合能力を上昇させることが示された。ＣＬＭ−１とアンカータンパク質の間の追加的タグは、この相互作用に有意に影響を及ぼさなかった。

マウス消化管におけるＣＬＭ−１提示酵母とＭＮｏＶとの相互作用が、研究された（試験計画については、例えば図１４を参照されたい）。Ｓ．ブラウディを投与されたマウスは、３日間のＳ．ブラウディ投与の後、より多量のＭＮｏＶを排出し、糞便中のＭＮｏＶ量は、８日以内に低くなった。その影響は、ＣＬＭ−１提示Ｓ．ブラウディを投与されたマウスで有意であった。

実施例４：遺伝子操作されたＳ．ブラウディのインビボ安定性
この実施例では、マウス消化管におけるＳ．ブラウディの安定性および生存能力を決定した。Ｓ．ブラウディ細胞が中断の２日後にマウス消化管からほとんどクリアランスされたことが、示された。この実施例は、マウスモデルでの哺乳動物消化管におけるＳ．ブラウディの寿命／滞留を記載している。

Ｓ．ブラウディは、マウス消化管を非常に急速に通過した（例えば、図１１Ａ〜図１１Ｂ参照）。３×１０^８ＣＦＵの生存するＳ．ブラウディは、経口強制投与を介してマウスに投与された。有意な量のＳｂ細胞が、経口強制投与の１２時間後に糞便中で見出された（例えば、図１１Ａ参照）。Ｓ．ブラウディがマウス消化管に定着しないことが、見出された（例えば、図１１Ｂ参照）。

図１２は、反復投与、ストレプトマイシン、および胃の中和の影響を示している。野生型および遺伝子操作の両方のＳ．ブラウディ株が、中断後６日以内にクリアランスされることが示された。ストレプトマイシンおよび重炭酸ナトリウムは、Ｓ．ブラウディの生存能力を有意に変化させなかった。

Claims (73)

1. 遺伝子操作された微生物であって、
   前記遺伝子操作された微生物の表面で提示された少なくとも１種の結合剤を含み、前記結合剤が標的微生物への結合親和性を有する、
   遺伝子操作された微生物。
2. 前記結合剤が、アンカータンパク質を介して前記遺伝子操作された微生物に動作可能に連結されている、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
3. 前記アンカータンパク質が、細胞壁タンパク質アンカー領域である、請求項２に記載の遺伝子操作された微生物。
4. 前記細胞壁タンパク質アンカー領域が、Ｆｌｏ１ｐアンカー領域である、請求項３に記載の遺伝子操作された微生物。
5. 前記結合剤が、膜貫通型タンパク質を含むステムを介して、前記操作された微生物に動作可能に連結されている、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
6. 前記膜貫通型タンパク質が、Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）から選択される、請求項５に記載の遺伝子操作された微生物。
7. 前記ステムが、前記膜貫通型タンパク質に動作可能に連結された細胞壁タンパク質ドメインを含み、前記細胞壁タンパク質ドメインが、前記ステムを細胞外空間に延長することが可能である、請求項５に記載の遺伝子操作された微生物。
8. 前記細胞壁タンパク質ドメインが 、Ｍｉｄ２タンパク質（Ｍｉｄ２ｐ）である、請求項７に記載の遺伝子操作された微生物。
9. 第一の結合剤および第二の結合剤を含み、前記第一の結合剤が、第一の標的微生物に結合することが可能であり、前記第二の結合剤が、第二の標的微生物に結合することが可能であり、前記第一の結合剤が、前記第二の結合剤と異なる、請求項１のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
10. サッカロマイセス属酵母である、請求項１または２に記載の遺伝子操作された微生物。
11. サッカロマイセス・セレビシエ ｖａｒ．ブラウディ（Ｓ．ブラウディ）から選択される、請求項１０に記載の遺伝子操作された微生物。
12. 前記標的微生物が、病原性共生生物、片利共生微生物、または病原体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
13. 前記標的微生物が、バクテリア、真菌、ウイルス、または真核生物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
14. 前記標的微生物が、ノロウイルス、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム属病原性共生生物、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンゲンス、カンピロバクター・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、サルモネラ、Ｐ．エルギノーサ、Ｅ．コリ、またはｓｃＦｖ、受容体もしくは結合ドメインなどの結合剤により標的化され得る結合領域を有する任意の他の生物体からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
15. 前記結合剤が、前記標的微生物に特異的に結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
16. 前記結合剤が、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノボディ、それらの一本鎖断片、およびそれらの組み合わせからなる群の１つまたは複数を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
17. 前記結合剤が、標的微生物の細胞壁結合ドメインおよびエンドリシンの細胞壁結合ドメインからなる群の１つまたは複数を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
18. 前記アンカータンパク質が、プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内に細胞壁タンパク質アンカー領域を含む、請求項２に記載の遺伝子操作された微生物。
19. 前記標的微生物が、ノロウイルスであり、前記結合剤が、ＣＬＭ−１である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
20. 前記標的微生物が、クロストリジウム属病原性共生生物（Ｃ．ディフィシル／パーフリンゲンス）であり、前記結合剤が、φＣＰ２６Ｆ（ＰｌｙＣＰ２６Ｆ）の細胞結合ドメインである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
21. 前記標的微生物が、リステリア・モノサイトゲネスであり、前記結合剤が、エンドリシンＰｌｙ５００の細胞結合ドメイン５００またはＰｌｙＰ３５の細胞壁結合ドメインである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
22. 前記標的微生物が、ストレプトコッカス・ピオゲネスであり、前記結合剤が、エンドリシンＰｌｙＣのＰｌｙＣ結合ドメインである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
23. 前記標的微生物が、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）またはスタフィロコッカス・アウレウスであり、前記結合剤が、ＬｙｓＧＨ１５Ｂ、またはエンドリシンＬｙｓＧＨ１５、ＬｙｓＳＡ９７もしくはＺＷ８８の細胞壁結合ドメインである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
24. 前記標的微生物が、カンピロバクター・コリであり、前記結合剤が、ｐｈｉＣｃｏＩＢＢ３５の細胞壁結合ドメインである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
25. 条件付きで切断可能なペプチドを介して膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されたトランス活性化因子をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
26. 前記条件付きで切断可能なペプチドが、ユビキチナーゼの存在下で切断可能である、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
27. 前記トランス活性化因子が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含む、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
28. 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である、請求項２７に記載の遺伝子操作された微生物。
29. 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、インタージェニック部位に組み込まれた提示単位に対応する、請求項２７に記載の遺伝子操作された微生物。
30. 前記遺伝子操作された微生物が、Ｓ．ブラウディであり、前記インタージェニック部位が、Ｃｈｒ ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２９に記載の遺伝子操作された微生物。
31. 第一のスプリットユビキチン断片が、膜貫通型タンパク質に動作可能に連結され；
    トランス活性化因子が、第二のスプリットユビキチン断片を介して前記膜貫通型タンパク質に動作可能に連結され、
    前記第一のスプリットユビキチン断片と前記第二のスプリットユビキチン断片のとの物理的相互作用が、前記トランス活性化因子を放出する、
    請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
32. 前記第一のスプリットユビキチン断片が、膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されたユビキチンのＮ−末端３７アミノ酸残基を含み、
    前記第二のスプリットユビキチン断片が、ユビキチンのＣ−末端４２アミノ酸残基を含む、
    請求項３１に記載の遺伝子操作された微生物。
33. 前記トランス活性化因子が、レポータタンパク質の発現を開始することが可能なｓｃＲＮＡ結合モチーフおよび転写活性化因子を含む、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
34. 前記レポータタンパク質が、ＧＦＰ、ＲＦＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＢＦＰなどの蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼなどの発光タンパク質から選択される、請求項３３に記載の遺伝子操作された微生物。
35. 前記トランス活性化因子が、転写活性化ドメインを含む、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
36. 前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４を含む、請求項３５に記載の遺伝子操作された微生物。
37. 前記トランス活性化因子が、ＲＮＡステムループ認識ドメインを含み、前記ＲＮＡステムループ認識ドメインが、細胞内酵素切断可能結合断片に融合されている、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
38. 前記ＲＮＡステムループ認識ドメインが、ＭＣＰ、ＰＣＰ、またはＣｏｍから選択される、請求項３７に記載の遺伝子操作された微生物。
39. 前記細胞内酵素切断可能結合断片が、ユビキチン断片である、請求項３７に記載の遺伝子操作された微生物。
40. レポータ遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
41. 前記レポータ遺伝子が、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、発光タンパク質、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４０に記載の遺伝子操作された微生物。
42. 哺乳動物の消化管内に定着しない微生物から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
43. 請求項１〜４２のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物の治療有効量を投与することを含む、片利共生の、または病原性の消化管細菌の標的化された感知、検出、または殺傷の方法。
44. 請求項１〜４２のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物の治療有効量を投与することを含む、消化管疾患（例えば、ノロウイルスなどの感染性疾患）を処置する方法。
45. 請求項１〜４２のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物の治療有効量を接触させることを含む、片利共生消化管細菌を調節する方法。
46. 遺伝子操作された微生物を構築する方法であって、
    微生物を提供すること；
    提示カセットを提供すること；および
    前記微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に前記提示カセットを組み込むこと、
    を含み、
    前記提示カセットが、結合剤の発現のための配列と；前記結合剤を発現することが可能なプロモータと；ターミネータと；アンカーと；分泌シグナルペプチドと、を含む、
    方法。
47. 前記アンカーが、構成型プロモータおよびターミネータに挟まれた単一シストロン内に細胞壁タンパク質アンカー領域を含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記アンカーが、サッカロマイセス属酵母に由来するＣｗｐ２ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｃｃｗ１２ｐまたはＦｌｏ１ｐから選択される、請求項４６に記載の方法。
49. 前記アンカーが、Ｆｌｏ１ｐから選択される、請求項４６に記載の方法。
50. 微生物を提供すること；
    提示カセットを提供すること；および
    前記微生物のゲノムのインタージェニック部位の中に前記提示カセットを組み込むこと、
    を含み、
    前記提示カセットが、結合剤の発現のための配列と；構成型プロモータと；ターミネータと；微生物細胞壁タンパク質の膜貫通型ドメインを含むステムと；分泌シグナルペプチドと；トランス活性化因子に動作可能に連結された細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチンの断片）と、を含む、
    遺伝子操作された微生物を構築する方法。
51. 前記微生物細胞壁タンパク質の膜貫通型ドメインが、Ｗｓｃ１ｐ（Ｃ８Ａ）から選択される、請求項５０に記載の方法。
52. 前記提示カセットが、前記ステムに動作可能に連結された細胞壁タンパク質ドメインをさらに含み、前記細胞壁タンパク質ドメインが、前記ステムを細胞外空間に延長することが可能である、請求項５０に記載の方法。
53. 結合剤の第一の対および結合剤の第二の対と、
    第一のトランス活性化因子および第二のトランス活性化因子と、
    を含み、
    前記結合剤の第一の対が、第一の標的微生物に結合することが可能であり、前記結合剤の第二の対が、第二の標的微生物に結合することが可能であり、前記結合剤の第一の対が、前記結合剤の第二の対と異なり；
    前記結合剤の第一の対が、第一の膜貫通型タンパク質を介して細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチン断片）の第一の対に動作可能に連結され、前記第一の細胞内酵素切断結合断片の第一の対の一方が、前記第一のトランス活性化因子に動作可能に連結され；
    前記第二の結合剤が、第二の膜貫通型タンパク質を介して細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対に動作可能に連結され、前記第二の細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対の一方が、第二のトランス活性化因子に動作可能に連結され；
    前記細胞内酵素切断可能結合断片の第一の対の一方と、前記細胞内酵素切断可能結合断片の第二の対の一方が、Ｎ−末端領域内で同一の結合タンパク質を有するが、Ｃ−末端領域内では異なるトランス活性化因子を有し、標的微生物と物理的に相互作用すること、および前記第一または前記第二のトランス活性化因子を放出することが可能である、
    請求項５０に記載の方法。
54. 前記結合剤が、ペプチド、タンパク質、抗体、ナノボディ、それらの一本鎖断片、およびそれらの組み合わせからなる群の１つまたは複数を含む、請求項４６または５０のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記結合剤が、標的微生物の細胞壁結合ドメインおよびエンドリシンの細胞壁結合ドメインからなる群の１つまたは複数を含む、請求項４６または５０のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記結合剤が、ＣＬＭ−１；ＺＷ８８；φＣＰ２６Ｆ（ＰｌｙＣＰ２６Ｆ）の細胞結合ドメイン；エンドリシンＰｌｙ５００の細胞結合ドメイン５００；エンドリシンＰｌｙＣのＰｌｙＣ結合ドメイン；ＬｙｓＧＨ１５Ｂ、エンドリシンＬｙｓＧＨ１５もしくはＬｙｓＳＡ９７の細胞壁結合ドメイン；またはｐｈｉＣｃｏＩＢＢ３５の細胞壁結合ドメインから選択される、請求項４６、５０、または５３のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記トランス活性化因子が、条件付きで切断可能なペプチドを介して膜貫通型タンパク質に動作可能に連結されている、請求項５０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記トランス活性化因子が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素（例えば、ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９））を含む、請求項５０または５３のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、インタージェニック部位（例えば、Ｓ．ブラウディではＣｈｒ ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶ、ＸＶＩ）に組み込まれた提示単位に対応する、請求項５８に記載の方法。
60. ヌクレアーゼヌルＣａｓ９（ｄＣａｓ９）およびスカフォールドＲＮＡが、前記トランス活性化因子を対応する合成プロモータに動員する、請求項５０〜５９のいずれか１項に記載の方法。
61. 前記トランス活性化因子が、レポータ（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＢＦＰなどの蛍光タンパク質、発光タンパク質）または生体分子（例えば、抗体、酵素、抗菌性ペプチド）の発現を開始することが可能なｓｃＲＮＡ結合モチーフおよびトランス活性化因子を含む、請求項５０または５３のいずれか１項に記載の方法。
62. 前記トランス活性化因子が、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）を含む、請求項５０〜６０のいずれか１項に記載の方法。
63. 前記トランス活性化因子が、細胞内酵素切断可能結合断片（例えば、ユビキチン断片）に融合されたＲＮＡステムループ認識ドメイン（例えば、ＭＣＰ、ＰＣＰ、Ｃｏｍ）を含む、請求項５０または５３のいずれか１項に記載の方法。
64. 標的レポータタンパク質の転写を開始することを含む、請求項５０または５３のいずれか１項に記載の方法。
65. 前記標的レポータタンパク質が、蛍光タンパク質および発光タンパク質から選択される、請求項６４に記載の方法。
66. 前記標的レポータタンパク質が、ＧＦＰ、ＲＦＰ（ｍＣｈｅｒｒｙなど）、ＢＦＰ、ルシフェラーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
67. 前記微生物が、Ｓ．ブラウディから選択され、前記インタージェニック部位が、Ｃｈｒ ＶＩＩ、ＸＩＩ、ＸＶもしくはＸＶＩ、またはそれらの組み合わせから選択され、Ｃａｓ９の対応する誘導型ＲＮＡが、前記微生物のネイティブ転写を妨害することなく標的タンパク質の安定した発現をもたらす、請求項４６、５０、または５３のいずれか１項に記載の方法。
68. 標的タンパク質の安定した発現のためのフレームワークが、インデューサを必要としない、請求項４６または５０のいずれか１項に記載の方法。
69. 前記遺伝子操作された微生物の強い構成型プロモータまたは弱いプロモータを含む、請求項４６または５０のいずれか１項に記載の方法。
70. 前記強い構成型プロモータが、Ｓ．ブラウディのＴＤＨ３またはＣＣＷ１２プロモータから選択される、請求項６９に記載の方法。
71. 前記弱いプロモータが、Ｓ．ブラウディのＷＳＣ１またはＦＡＵ１プロモータから選択される、請求項６９に記載の方法。
72. ターミネータをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
73. 前記ターミネータが、Ｓ．ブラウディのＡＤＨ１またはＣＹＣ１ターミネータから選択される 、請求項７２に記載の方法。

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