CN112888712A - 工程化的微生物及其制造和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了工程化的微生物及其制造和使用方法。如本文所述的工程化的微生物可具有表面展示并且可用作治疗剂(例如，海绵)和生物传感器。

Description

工程化的微生物及其制造和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月20日提交的美国临时申请序列号62/733,896的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
不适用。
以引用的方式并入的材料
序列表是本公开的一部分，包括含有本发明的核苷酸和/或氨基酸序列的计算机可读形式。序列表的主题以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本公开总体上涉及工程化的微生物。
发明内容
在本公开的各个方面中提供工程化的微生物以及制备和使用所述工程化的微生物的方法，所述工程化的微生物用于结合剂的表面展示以及用于感测应用。
本公开的一个方面提供了一种工程化的微生物，所述工程化的微生物包含：在所述工程化的微生物的表面上展示的至少一种结合剂，其中所述结合剂对靶微生物具有结合亲和力。
在一些实施方案中，所述结合剂经由锚定蛋白可操作地连接至所述工程化的微生物。
在一些实施方案中，所述锚定蛋白是细胞壁蛋白锚定区。
在一些实施方案中，所述细胞壁蛋白锚定区是Flo1p锚定区。
在一些实施方案中，所述结合剂经由包含跨膜蛋白的茎可操作地连接至所述工程化的微生物。
在一些实施方案中，所述跨膜蛋白选自Wsc1p(C8A)。
在一些实施方案中，所述茎包含可操作地连接至所述跨膜蛋白的细胞壁蛋白结构域，其中所述细胞壁蛋白结构域能够使所述茎延伸至细胞外空间中。
在一些实施方案中，所述细胞壁蛋白结构域是Mid2蛋白(Mid2p)。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物包含第一结合剂和第二结合剂，其中所述第一结合剂能够结合至第一靶微生物并且所述第二结合剂能够结合至第二靶微生物，并且所述第一结合剂不同于所述第二结合剂。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物是酵母属酵母。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物选自酿酒酵母布拉氏变种(布拉氏酵母)。
在一些实施方案中，所述靶微生物是致病有机体(pathobiont)、共生微生物或病原体。
在一些实施方案中，所述靶微生物是细菌、真菌、病毒或真核生物。
在一些实施方案中，所述靶微生物选自由以下组成的组：诺如病毒、单核细胞增多性李斯特氏菌、梭菌致病有机体(Clostridium pathobionts)、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、大肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、酿脓链球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌或具有可被结合剂(如scFv、受体或结合结构域)靶向的结合区的任何其他生物实体。
在一些实施方案中，所述结合剂特异性地结合至所述靶微生物。
在一些实施方案中，所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：肽、蛋白质、抗体、纳米抗体、其单链片段以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：靶微生物的细胞壁结合结构域和内溶素的细胞壁结合结构域。
在一些实施方案中，所述锚定蛋白包括由启动子和终止子圈定(bracketed)的单顺反子中的细胞壁蛋白锚定区。
在一些实施方案中，所述靶微生物是诺如病毒，并且所述结合剂是CLM-1。
在一些实施方案中，所述靶微生物是梭菌致病有机体(艰难梭菌/产气荚膜梭菌)，并且所述结合剂是ΦCP26F(PlyCP26F)的细胞结合结构域。
在一些实施方案中，所述靶微生物是单核细胞增多性李斯特氏菌，并且所述结合剂是内溶素Ply500的细胞结合结构域500或PlyP35的细胞壁结合结构域。
在一些实施方案中，所述靶微生物是酿脓链球菌，并且所述结合剂是内溶素PlyC的PlyC结合结构域。
在一些实施方案中，所述靶微生物是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或金黄色葡萄球菌，并且所述结合剂是LysGH15B(其为内溶素LysGH15的细胞壁结合结构域)、LysSA97或ZW88。
在一些实施方案中，所述靶微生物是大肠弯曲杆菌，并且所述结合剂是phiCcoIBB35的细胞壁结合结构域。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物包含经由条件性可裂解肽可操作地连接至跨膜蛋白的反式激活因子。
在一些实施方案中，所述条件性可裂解肽在泛素酶(ubiquitinase)存在下是可裂解的。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含RNA引导的DNA核酸内切酶。
在一些实施方案中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶是无核酸酶的Cas9(dCas9)。
在一些实施方案中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶对应于整合到基因间位点中的展示单元。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物是布拉氏酵母，并且所述基因间位点选自Chr VII、XII、XV、XVI或它们的组合。
在一些实施方案中，第一分裂泛素片段可操作地连接至跨膜蛋白；反式激活因子经由第二分裂泛素片段可操作地连接至所述跨膜蛋白；并且所述第一分裂泛素片段与所述第二分裂泛素片段之间的物理相互作用释放所述反式激活因子。
在一些实施方案中，所述第一分裂泛素片段包含泛素的N末端37个氨基酸残基，可操作地连接至跨膜蛋白；并且所述第二分裂泛素片段包含泛素的C末端42个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含scRNA结合基序和能够起始报告蛋白的表达的转录激活因子。
在一些实施方案中，所述报告蛋白选自荧光蛋白如GFP、RFP(例如，mCherry)、BFP，或发光蛋白如荧光素酶。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含转录激活结构域。
在一些实施方案中，所述转录激活结构域包含VP64。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含RNA茎环识别结构域，并且所述RNA茎环识别结构域与细胞内酶可裂解结合片段融合。
在一些实施方案中，所述RNA茎环识别结构域选自MCP、PCP或Com。
在一些实施方案中，所述细胞内酶可裂解结合片段是泛素片段。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物包含报告基因。
在一些实施方案中，所述报告基因选自GFP、RFP、BFP、发光蛋白或它们的组合。
在一些实施方案中，所述工程化的微生物选自不会在哺乳动物肠道中定殖的微生物。
本公开的一个方面提供了一种靶向感测、检测或杀死共生或病原性肠道微生物的方法，所述方法包括施用治疗有效量的上述工程化的微生物中的任一者的工程化的微生物。
本公开的一个方面提供了治疗肠道疾病(例如，感染性疾病，如诺如病毒)的方法，所述方法包括施用治疗有效量的上述工程化的微生物中的任一者的工程化的微生物。
本公开的一个方面提供了一种调节共生肠道微生物群的方法，所述方法包括接触治疗有效量的上述工程化的微生物中的任一者的工程化的微生物。
本公开的一个方面提供了一种构建工程化的微生物的方法，所述方法包括：提供微生物；
提供展示盒；以及将所述展示盒整合到所述微生物基因组的基因间位点中；其中所述展示盒包含用于表达结合剂的序列；能够表达所述结合剂的启动子；终止子；锚；以及分泌信号肽。
在一些实施方案中，所述锚包括由组成型启动子和终止子圈定的单顺反子中的细胞壁蛋白锚定区。
在一些实施方案中，所述锚选自来自酵母属酵母的Cwp2p、Sed1p、Ccw12p或Flo1p。
在一些实施方案中，所述锚选自Flo1p。
本公开的一个方面提供了一种构建工程化的微生物的方法，所述方法包括：提供微生物；提供展示盒；以及将所述展示盒整合到所述微生物基因组的基因间位点中；其中所述展示盒包含用于表达结合剂的序列；组成型启动子；终止子；包含微生物细胞壁蛋白的跨膜结构域的茎；分泌信号肽；以及可操作地连接至反式激活因子的细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)。
在一些实施方案中，微生物细胞壁蛋白的跨膜结构域选自Wsc1p(C8A)。
在一些实施方案中，所述展示盒还包含可操作地连接至所述茎的细胞壁蛋白结构域，其中所述细胞壁蛋白结构域能够使所述茎延伸至细胞外空间中。
在一些实施方案中，所述方法包括第一对结合剂和第二对结合剂；以及第一反式激活因子和第二反式激活因子；其中所述第一对结合剂能够结合至第一靶微生物，并且所述第二对结合剂能够结合至第二靶微生物，并且所述第一对结合剂不同于所述第二对结合剂；所述第一对结合剂经由第一跨膜蛋白可操作地连接至第一对细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)，其中所述第一对第一细胞内酶可裂解结合片段中的一者可操作地连接至所述第一反式激活因子；所述第二结合剂经由第二跨膜蛋白可操作地连接至第二对细胞内酶可裂解结合片段，其中所述第二对第二细胞内酶可裂解结合片段中的一者可操作地连接至第二反式激活因子；并且所述第一对细胞内酶可裂解结合片段中的一者和所述第二对细胞内酶可裂解结合片段中的一者在N末端区域具有相同的结合蛋白，但在C末端区域具有不同的反式激活因子，从而能够与靶微生物物理地相互作用并释放所述第一或第二反式激活因子。
在一些实施方案中，所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：肽、蛋白质、抗体、纳米抗体、其单链片段以及它们的组合。
在一些实施方案中，所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：靶微生物的细胞壁结合结构域和内溶素的细胞壁结合结构域。
在一些实施方案中，所述结合剂选自CLM-1；ZW88；ΦCP26F(PlyCP26F)的细胞结合结构域；内溶素Ply500的细胞结合结构域500；内溶素PlyC的PlyC结合结构域；LysGH15B(其为内溶素LysGH15的细胞壁结合结构域)或LysSA97；或phiCcoIBB35的细胞壁结合结构域。
在一些实施方案中，所述反式激活因子经由条件性可裂解肽可操作地连接至跨膜蛋白。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含RNA引导的DNA核酸内切酶(例如，无核酸酶的Cas9(dCas9))。
在一些实施方案中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶对应于整合到基因间位点(例如，布拉氏酵母的Chr VII、XII、XV、XVI)中的展示单元。
在一些实施方案中，无核酸酶的Cas9(dCas9)和支架RNA将反式激活因子募集至相应的合成启动子。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含scRNA结合基序和能够起始报告基因(例如，荧光蛋白如GFP、RFP(例如，mCherry)、BFP，发光蛋白)或生物分子(例如，抗体、酶、抗微生物肽)的表达的反式激活因子。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含转录激活结构域(例如，VP64)。
在一些实施方案中，所述反式激活因子包含与细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)融合的RNA茎环识别结构域(例如，MCP、PCP、Com)。
在一些实施方案中，所述方法包括起始靶报告蛋白的转录。
在一些实施方案中，所述靶报告蛋白选自荧光蛋白和发光蛋白。
在一些实施方案中，所述靶报告蛋白选自由以下组成的组：GFP、RFP(如mCherry)、BFP、萤光素酶或它们的组合。
在一些实施方案中，所述微生物选自布拉氏酵母，并且所述基因间位点选自ChrVII、XII、XV或XVI或它们的组合；并且Cas9的相应引导RNA产生靶蛋白的稳定表达，而不会干扰微生物的天然转录。
在一些实施方案中，用于稳定表达靶蛋白的框架不需要诱导物。
在一些实施方案中，所述方法包括所述工程化的微生物的强组成型启动子或弱启动子。
在一些实施方案中，所述强组成型启动子选自布拉氏酵母的TDH3或CCW12启动子。
在一些实施方案中，所述弱启动子选自布拉氏酵母的WSC1或FAU1启动子。
在一些实施方案中，所述方法包括终止子。
在一些实施方案中，所述终止子选自布拉氏酵母的ADH1或CYC1终止子。
其它目标和特征将部分地是显而易见的并且将在下文中部分地指出。
附图说明
本领域的技术人员将理解以下所描述的附图仅是出于说明性目的。所述附图并非意图以任何方式限制本教导的范围。
图1.用于酵母表面展示的主链盒。
图2.酵母生物传感器的设计。
图3.基于dCas9的感测和信号传导机制。
图4.基于支架RNA的人工反式激活因子的结构。
图5.使用CRISPR-Cas9将展示单元整合到安全的基因间位点(例如，布拉氏酵母的染色体VII)中。
图6.染色体整合的验证。
图7A-图7B.布拉氏酵母(A)、携带空表面展示盒的布拉氏酵母(B)、携带CLM-1的表面展示盒的布拉氏酵母(C)的免疫荧光染色和共聚焦显微术。
图8.人工传感器和信号传导系统的构建设计以及抗体/结合结构域的表面展示。
图9.用于展示一种靶肽的单一嵌合蛋白的表达盒。
图10.鼠诺如病毒(MNoV)(图改编自J Virol.2018年5月14日14；92(11)鼠诺如病毒突出结构域和可溶性CD300lf受体复合物的原子结构)。
图11A-图11B.在粪便(A)和体内(B)中，工程化的布拉氏酵母的体内稳定性。
图12.多次施用、共生微生物群微扰(链霉素)和胃中和作用对肠道中的布拉氏酵母稳定性的影响。
图13.测量展示CLM-1的布拉氏酵母与MNoV之间的相互作用的体外结合测定。
图14.用于测量小鼠肠道中展示CLM-1的酵母与MNoV之间的相互作用的研究设计。
图15.基于CRISPR的基因组编辑工具。
图16.用于信号传递/基因转录。
图17.报告基因盒整合到基因组(IS2)中。
图18.用于在强组成型启动子PTEF1、PADH1下表达dCas9、gRNA和反式激活因子的质粒。
图19.新的PGALsyn启动子和相应的scRNA。
图20.新的报告基因盒的构建。
图21.相应的scRNA和反式激活因子对合成启动子的正交诱导(参见例如，表1)。
图22.嵌合传感器的主链盒。
具体实施方式
本公开至少部分地基于以下发现：工程化的布拉氏酵母(S.boulardii，Sb)可用于靶向结合、感测和/或杀死共生或病原性肠道微生物。
如本文所述，本公开提供了使用生物分子和CRISPR系统的高级遗传工具箱对布拉氏酵母进行工程化的方法，所述工程化使不利的额外遗传改变最小化并且使得能够合成信号传导和基因转录机制。
如本文所述，本公开提供了特异性地与靶微生物，特别是包括共生微生物或病原体的肠生物实体相互作用或针对所述靶微生物的生物分子的细胞表面展示。共生微生物和病原性微生物可以是细菌、病毒或真核生物。
如本文所述，本公开提供了生物分子的细胞表面展示，以便操纵微生物如益生菌酵母、酿酒酵母布拉氏变种(布拉氏酵母)针对宿主肠道中的靶微生物(例如病原体)的结合、感测、调节和破坏能力。
如本文所述，本公开提供了在临床应用如抗微生物疗法以及肠道微生物组和病毒组的诊断中使用工程化的微生物如布拉氏酵母的策略。
用于制备包括布拉氏酵母和酿酒酵母(两者几乎相同)的酵母属酵母的本文公开的工程化的酵母的策略可应用于其他酵母，如巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母—尽管不是益生菌酵母，但它们通常被认为是安全的(GRAS)，但在遗传学上不如酵母属适合。
工程化的微生物
如本文所述，可对微生物进行工程化以感测、检测和/或治疗/破坏(例如，除去病原体)。
使用生物分子对微生物进行工程化是使用CRISPR系统的先进遗传工具箱进行的。例如，本公开提供了真菌生物传感器，其中所述生物传感器选择性地识别多种可感测(sensible)微生物实体或与多种可感测微生物实体反应。
所述工程化的微生物可包含细胞外结合剂(例如，具有结合结构域的肽，如scFv、内溶素的细胞壁结合结构域和受体)、细胞外锚定蛋白(例如，Mid2p、泛素酶、Flo428)、细胞内锚定蛋白(例如，Mid2p、泛素酶、Flo428)、转录系统(例如，转录因子/反式激活因子)或治疗剂。
为了完成所公开的布拉氏酵母的应用，分别选择并设计了在染色体VII、XII、XV和XVI处的新的基因间位点以及Cas9的相应引导RNA，以稳定地展示靶蛋白(例如CLM-1)而不干扰酵母的天然转录。使用布拉氏酵母的固有的强组成型启动子(TDH3和CCW12启动子)或弱启动子(例如，WSC1和FAU1启动子)以及终止子(例如，ADH1和CYC1)构建稳定表达结合剂/靶蛋白而无需诱导物的框架。锚定区可与结合剂/结合结构域一起表达为嵌合蛋白。
所公开的技术的应用可包括“展示(海绵)”设计和“传感器”设计。
a.Flo428(Flo1蛋白的C末端428aa残基)“锚定”蛋白用于展示设计。Flo428的作用是在酵母表面上稳定且简单地展示靶蛋白。
b.突变体Wcs1用作传感器设计的“跨膜”蛋白。mtWsc1的主要作用是将细胞外刺激作为“茎”连接到细胞内信号传导中。如本文所述，可通过添加Mid2蛋白(Mid2蛋白是一种类型的细胞壁蛋白，类似于Flo1蛋白)的富含S/T的区域来使mtWsc1延伸，但是出于传感器设计的目的，它不被认为是锚。
用于展示设计的锚定蛋白
可对微生物进行工程化以在微生物的膜上并入锚定蛋白。锚定蛋白可以是适合将结合剂锚定在工程化的微生物表面上的任何锚定蛋白。
锚定蛋白可以是细胞壁蛋白(参见例如，实施例1)。例如，锚定蛋白可以是肽(例如，携带富含丝氨酸/苏氨酸的区域的细胞壁蛋白)。锚定蛋白的实例可以是酵母属酵母的Cwp2p、Sed1p、Ccw12p或Flo1p。
例如，Flo1锚(Flo428)主要在代谢工程化领域用作酶的展示工具，但被发现可用于此目的。如此，可使用Flo428构建在细胞外展示靶蛋白的简单的单一嵌合蛋白。
可经由锚定蛋白将部分(例如，传感器、结合剂)在细胞外附着在微生物表面上或在细胞内附着在细胞内。例如，锚定蛋白可充当连接基团以连接细胞膜和靶向、感测或治疗部分。
如本文所述，锚定区与结合结构域一起表达为嵌合蛋白。
用于传感器设计的茎
本公开提供了一种用于工程化的微生物系统的生物传感器/检测器应用中的茎。
如本文所述，酵母生物传感器不使用“锚定”蛋白区域。代替在表面展示设计中使用的锚定区，用于感测机制的嵌合蛋白具有“茎”，所述茎是跨膜蛋白，其位置从细胞质延伸至细胞外空间(参见，例如，图3)。尽管模块蛋白包含与用于展示设计(海绵)的锚定蛋白相似的富含S/T的区域，但传感器模块嵌合蛋白不应被锚定。
例如，茎的C末端可选自与细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)融合的RNA茎环识别结构域(例如，MCP、PCP、Com)。
作为另一个实例，茎可选自突变型Wsc1p(C8A)分子(跨膜蛋白)。Wsc1p(C8A)是优选的茎，因为无论物理应力如何，它都不能簇集。野生型蛋白为自簇集型，但先前已证明，单点突变(C8A)可使这种蛋白不簇集。如此，突变型Wsc1p适合于茎部分(参见例如，图2)。
茎可通过细胞壁蛋白结构域或延伸部分(如Mid2蛋白(Mid2p))延伸。
微生物
所公开的系统使用微生物(例如，真菌、酵母、细菌、益生菌(细菌、酵母))来展示生物分子或结合剂。
优选的微生物不定殖于肠道，并且因此易于控制。设计如本文所公开的研究，所述研究考虑酵母的独特特征和能力，如不能定殖、高级翻译后修饰(与细菌相比)和酵母跨膜蛋白的存在。因此，优选的微生物是酵母。例如，酵母可以是酵母属的物种(例如，布拉氏酵母)。
由于不能在人肠道中定殖，因此可对布拉氏酵母进行工程化以充当抗微生物剂，所述抗微生物剂吸收或粘附于靶微生物，与所结合的靶微生物一起穿过宿主肠道，从而减少所述微生物的靶群体和感染性影响。
如本文所述，可通过将交配因子α分泌信号肽、结合靶微生物的生物分子和细胞壁蛋白锚定区组合在由强组成型启动子和终止子圈定的单顺反子中来构建用于布拉氏酵母的表面展示系统。
微生物也可以是细菌。细菌可以是大肠杆菌(例如，尼氏大肠杆菌(E.coliNissle))。可对大肠杆菌进行工程化，以吸收或粘附至靶微生物，并减少宿主与靶标之间的相互作用，但由于大肠杆菌的定殖能力而不能减少靶群体。
结合剂/生物分子
结合剂如生物分子(例如具有结合结构域的肽，如scFv、受体、细胞壁结合结构域如内溶素的细胞壁结合结构域、抗体或抗体功能片段)可展示在工程化的微生物的表面上。如此，可将工程化的微生物设计为对病原体具有结合亲和力。
结合剂或生物分子可以是蛋白质、抗体、单链可变片段(scFv)或纳米抗体。分泌信号肽、细胞壁蛋白锚定区和结合剂(例如，在由强组成型启动子和终止子圈定的单顺反子中)的组合由此表现出针对靶微生物的结合或粘附能力。
作为另一个实例，结合剂或生物分子可以是内溶素的细胞壁结合结构域或能够表现出针对靶微生物的结合或粘附能力的任何结合结构域。
结合剂可以是与靶微生物(例如，病原体如诺如病毒)结合的任何剂。例如，结合剂可包含靶微生物结合结构域(例如，病毒或细菌结合剂)(参见，例如图3)。结合剂可靶向例如病原体或其他疾病，如诺如病毒、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、铜绿假单胞菌或其结合结构域可用的任何其他微生物实体。在一个优选的实施方案中，靶微生物是肠道病原体。
如本文所述，scFvs ZW88在对金黄色葡萄球菌具有结合亲和力的微生物(例如，布拉氏酵母)中表达。
如本文所述，诺如病毒受体在对诺如病毒具有结合亲和力的微生物(例如，布拉氏酵母)中表达，其作用类似于海绵以除去诺如病毒。
例如，结合剂可以是内溶素的任何细胞壁结合结构域或任何病原体的细胞壁结合结构域。在一些实施方案中，结合剂可选自靶微生物的任何结合结构域。例如，结合剂可以是来自内溶素PlyC的PlyCB(对于靶微生物酿脓链球菌)、CLM-1(对于诺如病毒)、ΦCP26F的细胞壁结合结构域(CBD)(对于梭菌致病有机体)、来自内溶素Ply500的CBD500(对于单核细胞增多性李斯特氏菌)、LysSA97(金黄色葡萄球菌)、PlyCP26F的细胞壁结合结构域(艰难梭菌/产气荚膜梭菌)、PlyP35的细胞壁结合结构域(单核细胞增多性李斯特氏菌)、内溶素LysGH15的LysGH15B的细胞壁结合结构域(对于MRSA感染或金黄色葡萄球菌感染)、phiCcoIBB35的细胞壁结合结构域(大肠弯曲杆菌)或它们的组合中的任一者。
例如，针对单核细胞增多性李斯特氏菌表现出特异性裂解活性的内溶素PlyP35的细胞壁结合结构域的表面展示预期控制李斯特菌病，与共生肠道微生物群的不良相互作用最小化。这种方法不仅可扩展到其他病原性微生物的调控(例如，单核细胞增多性李斯特氏菌和来自内溶素Ply500的CBD500，酿脓链球菌和来自内溶素PlyC的PlyCB)，而且扩展到对共生肠道微生物群的形状的有效控制(例如，使用来自ΦCP26F的CBD调控梭菌致病有机体)。
对于嵌合传感器，单链是优选的。如此，具有多于一条链的纳米抗体或其他抗体形式不是嵌合传感器设计中作为结合剂的优选实施方案。但是非单链纳米抗体或其他抗体形式可容易地并入到展示(海绵)设计中。
靶微生物
如本文所述，本公开提供了特异性地与靶微生物，例如诸如共生微生物和病原体的肠生物实体相互作用或针对所述靶微生物的生物分子的细胞表面展示。共生微生物和病原性微生物可以是细菌、病毒或真核生物。
可将工程化的微生物设计为结合至或靶向靶微生物。所述工程化的微生物可包含结合剂，所述结合剂包含靶向靶微生物的结合部分。
靶微生物可以是细菌、真菌、病毒或真核生物。靶微生物可以是致病有机体、病原体或共生共生体。靶微生物可以是诺如病毒、单核细胞增多性李斯特氏菌、梭菌致病有机体、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、大肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、酿脓链球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌或大肠杆菌。
目前认为，对使用这种方法可靶向的靶微生物的范围没有限制。如此，可靶向具有特异性结合结构域的任何微生物。
特异性结合可指配体与受体的结合，并且可能地是对于一种配体存在多于一个特异性结合位点。
用于人工传感器/信号传导系统的报告基因
可对工程化的微生物进行工程化，以并入用于人工感测和信号传导的报告基因。
本文所述的工程化的微生物可包含报告基因(或传感器)。报告基因可以是检测pH的传感蛋白、免疫受体或报告蛋白(例如，GFP、RFP(例如，mCherry)、BFP、发光蛋白(例如，荧光素酶))。
例如，工程化的微生物可包含转录系统。转录系统可包含反式激活因子，其中人工传感器可将物理刺激转换为转录信号(参见例如图2)。
可基于dCas9和支架RNA(scRNA，参见例如图3、图4、图15，表1)来设计人工反式激活因子。例如，反式激活因子可包含转录激活结构域(例如，VP64)和RNA茎环识别结构域(例如，MCP、PCP、Com)。
病原体去除(例如，海绵)
如本文所述，本公开提供了用于临床目的的微生物(例如酵母)表面展示的新型应用。可用特异性地结合至指定微生物(例如细菌、真菌、病毒)的结合剂(例如，生物分子)包被微生物(例如，不定殖于人肠道的益生菌，如布拉氏酵母)的表面。
目前描述的工程化的微生物可充当海绵以去除病原体。例如，可将能够去除靶病原体的微生物如非定殖酵母工程化为在其表面上表达病原体受体(例如，诺如病毒受体)以结合至所述病原体并将所述病原体从受试者体内除去。
如此，所公开的向靶微生物(例如，病原体)展示结合剂(例如，蛋白质)的工程化的微生物(例如，布拉氏酵母菌株)可用作抗微生物剂(例如，抗病毒剂和抗菌剂)，从而为治疗剂(如必须严格控制其使用的抗生素)提供替代物。
生物传感器/检测器
本公开还提供了一种构建工程化的微生物生物传感器的方法，所述生物传感器在体内选择性地识别多种可感测靶微生物(例如，微生物实体)并与多种可感测靶微生物反应。所述工程化的微生物可包含报告基因。
如本文所述，所述工程化的微生物可用于感测应用。例如，一部分功能性蛋白可在细胞内连接(例如，经由锚连接至膜蛋白)以催化反应(例如，以开启转录应答)。
本文还描述了可用于检测的工程化的微生物(参见例如，图17、图20)。例如，反式激活因子可连接至检测部分(例如，GFP、RFP、BFP、发光蛋白)的启动子区域。如此，感测到病原体(例如，诺如病毒)的每一种工程化的微生物将会变亮。
本文还描述了嵌合传感器分子(参见例如，图3)，所述嵌合传感器分子允许布拉氏酵母识别选定微生物(例如，微生物、细菌、病毒)并针对所述选定微生物发生反应，所述嵌合传感器分子通过组合分泌信号肽、针对靶微生物的结合蛋白、布拉氏酵母细胞壁蛋白的跨膜结构域以及与反式激活因子(表达与特异性启动子区域结合的转录因子)融合的泛素的突变型N末端片段或C末端泛素片段而构建。在N末端区域具有相同的结合蛋白、但在C末端区域具有不同的泛素结构域的两种嵌合传感器分子以一组的形式协同工作，与靶实体(例如靶微生物)物理地相互作用并释放反式激活因子。无核酸酶的Cas9(dCas9)和支架RNA将反式激活因子募集至相应的合成启动子；因此，可起始靶基因如报告蛋白(如RFP和GFP)的转录(参见例如，图3)。由于其可扩展性，与采用细菌或真菌感测机制的常规生物传感器相比，本文提供的展示嵌合传感器的布拉氏酵母具有更广泛范围的可检测微生物。
在一些实施方案中，仅C末端泛素将具有选定反式激活因子，并且N末端泛素在没有反式激活基因的情况下可操作地连接至茎。
作为靶向肠道健康的微生物生物传感器，所公开的工程化的布拉氏酵母能够克服常规方法的局限性，所述常规方法依赖于自然界中非常有限的现有感测机制。
分子工程化
提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导本发明的普通技术人员实践本发明。除非另外指出，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
如本文所用，术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”或“异源核酸”各自是指源自对特定宿主细胞而言外源来源的序列，或者如果来自相同来源，则从其原始形式修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞而言是内源性的但已通过例如使用DNA改组加以修饰的基因。所述术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，所述术语是指对细胞来说外源或异源、或与细胞同源但位于宿主细胞核酸中通常不存在元件的位置中的DNA区段。表达外源DNA区段以产生外源多肽。“同源”DNA序列是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的DNA序列。
表达载体、表达构建体、质粒或重组DNA构建体通常应理解为是指通过人为干涉产生的核酸，包括利用允许例如宿主细胞中特定核酸的转录或翻译的一系列指定核酸元件通过重组手段或直接化学合成来产生。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体可包含与启动子可操作地连接的待转录核酸。
“启动子”通常应被理解为指导核酸转录的核酸控制序列。诱导型启动子是响应于特定刺激而介导可操作连接的基因的转录的启动子。启动子可包含转录起始位点附近的必需核酸序列，在II型聚合酶启动子的情况下如TATA元件。启动子可任选地包含远端增强子或抑制子(repressor)元件，其可位于离转录起始位点远至数千碱基对的位置。
如本文所用，“可转录核酸分子”是指能够被转录成RNA分子的任何核酸分子。已知以使得可转录核酸分子转录成翻译并因此表达为蛋白质产物的功能性mRNA分子的方式将构建体引入细胞中的方法。为了抑制目标特定RNA分子的翻译，还可构建能够表达反义RNA分子的构建体。为了实践本公开，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocolsfrom Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)Short Protocols in MolecularBiology,第5版,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3d版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.和Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology 167,747-754)。
“转录起始位点”或“起始位点”是围绕作为转录序列的一部分的第一个核苷酸的位置，其也被定义为位置+1。相对于此位点，所述基因及其控制区域的所有其它序列都可被编号。下游序列(即3'方向上的另外的蛋白质编码序列)可被命名为正，而上游序列(大部分在5'方向上的控制区域)被命名为负。
“可操作地连接”或“功能性地连接”是指单一核酸片段上核酸序列的缔合，以使得一个核酸序列的功能受另一个的影响。例如，如果两个序列被定位为使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，所述编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制之下)，则调控DNA序列被称为与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“缔合”。编码序列可以有义取向或反义取向可操作地连接至调控序列。两个核酸分子可以是单一连续核酸分子的一部分，并且可以是邻近的。例如，如果启动子调控或介导细胞中目标基因的转录，则所述启动子可操作地连接至目标基因。
“构建体”通常被理解为源自任何来源的任何重组核酸分子如质粒、粘粒、病毒、自主复制核酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，能够进行基因组整合或自主复制，包括其中一个或多个核酸分子已被可操作连接的核酸分子。
本公开的构建体可含有可操作地连接至可转录核酸分子的启动子，所述可转录核酸分子可操作地连接至3'转录终止核酸分子。此外，构建体可包括但不限于来自例如3'非翻译区(3'UTR)的另外调控性核酸分子。构建体可包括但不限于mRNA核酸分子的5'非翻译区(5'UTR)，其可在翻译起始中起重要作用并且也可以是表达构建体中的遗传组分。这些另外的上游和下游调控性核酸分子可源自相对于启动子构建体上存在的其他元件为天然或异源的来源。
术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主细胞的基因组中，从而产生遗传上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基因”细胞，并且包含转基因细胞的生物体被称为“转基因生物体”。
“转化的”、“转基因的”和“重组的”是指其中引入了异源核酸分子的宿主细胞或生物体，如细菌、藻青菌、动物或植物。核酸分子可稳定地整合到基因组中，如本领域通常已知和所公开的(Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis和Gelfand 1999)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。术语“未转化的”是指尚未经历转化过程的正常细胞。
“野生型”是指在自然界发现的没有任何已知突变的病毒或生物体。
具有上述所需的百分比同一性并保留所表达蛋白质的所需活性的变体核苷酸及其编码的多肽的设计、产生和测试在本领域技术范围内。例如，突变体的定向进化和快速分离可根据参考文献中描述的方法，所述参考文献包括但不限于Link等人(2007)NatureReviews 5(9),680-688；Sanger等人(1991)Gene 97(1),119-123；Ghadessy等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(8)4552-4557。因此，本领域技术人员可产生与本文所述的参考序列具有例如至少95％-99％同一性的大量核苷酸和/或多肽变体，并根据本领域中常规的方法筛选所述变体的所需表型。
核苷酸和/或氨基酸序列同一性百分比(％)应理解为当比对两个序列时，候选序列中与参考序列相比与核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了确定同一性百分比，将序列进行比对，并且如果需要，引入空位以实现最大的序列同一性百分比。用于确定同一性百分比的序列比对程序是本领域技术人员众所周知的。通常使用诸如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件的公开可用的计算机软件来比对序列。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。当比对序列时，给定序列A与给定序列B、同给定序列B或相对于给定序列B(其可替代地表述为给定序列A，所述给定序列A具有或包含与给定序列B、同给定序列B或相对于给定序列B的一定百分比的序列同一性)的序列同一性百分比可计算为：序列同一性百分比＝X/Y100，其中X是由A和B的序列比对程序或算法评分为相同匹配的残基数，并且Y是B中的残基总数。如果序列A的长度不等于序列B的长度，则A与B的序列同一性百分比将不等于B与A的序列同一性百分比。
一般而言，可在任何位置进行保守取代，只要保留所需的活性即可。可进行所谓的保守交换，其中被替代的氨基酸具有与原始氨基酸相似的性质，例如，用Asp交换Glu，用Asn交换Gln，用Ile交换Val，用Ile交换Leu以及用Thr交换Ser。例如，具有相似性质的氨基酸可以是脂肪族氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)；含羟基或硫/硒的氨基酸(例如，丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；环状氨基酸(例如脯氨酸)；芳香族氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；碱性氨基酸(例如，组氨酸、赖氨酸、精氨酸)；或酸性氨基酸及其酰胺(例如，天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)。缺失是用直接键置换氨基酸。缺失的位置包括多肽的末端和单独蛋白质结构域之间的键联。插入是将氨基酸引入多肽链中，直接键在形式上被一个或多个氨基酸置换。氨基酸序列可在本领域已知的计算机模拟程序的帮助下进行调节，所述程序可产生具有例如改善的活性或改变的调控的多肽。基于这种人工产生的多肽序列，可使用所需宿主细胞的特定密码子用法在体外合成编码这种调节的多肽的相应核酸分子。
“高度严格杂交条件”被定义为在65℃下在6X SSC缓冲液(即，0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)中的杂交。鉴于这些条件，可通过计算两个序列之间DNA双链体的解链温度(Tm)来确定一组给定序列是否将杂交。如果在6X SSC的盐条件下特定双链体的解链温度低于65℃，则这两个序列将不会杂交。在另一方面，如果在相同的盐条件下解链温度高于65℃，则序列将杂交。一般而言，可使用以下公式来确定任何杂交的DNA:DNA序列的解链温度：Tm＝81.5℃+16.6(log10[Na+])+0.41(级分G/C含量)–0.63(甲酰胺％)–(600/l).。此外，核苷酸同一性每降低1％，DNA:DNA杂合体的Tm就降低1-1.5℃(参见例如，Sambrook和Russel，2006)。
可使用本领域已知的多种标准技术来转化宿主细胞(Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)Short Protocolsin Molecular Biology,第5版,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.和Wolk,C.P.1988.Methods inEnzymology 167,747-754)。此类技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的递送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔等。可选择转染的细胞并繁殖以提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含稳定地整合在宿主细胞基因组中的表达载体。
Figure BDA0003028273060000101
Figure BDA0003028273060000111
可引入宿主细胞的示例性核酸包括，例如，来自另一物种的DNA序列或基因，或甚至源自或存在于相同物种中、但通过遗传工程化方法并入受体细胞中的基因或序列。术语“外源”还意图指通常在所转化细胞中不存在的基因，或者可能根本不以如在转化DNA区段或基因中发现的形式、结构等存在的基因，通常以不同于自然表达模式的方式存在并且希望以不同于自然表达模式的方式表达(例如过表达)。因此，术语“外源”基因或DNA意图指引入受体细胞中的任何基因或DNA区段，而不管这种细胞中是否可能已经存在相似的基因。外源DNA中包含的DNA的类型可包括细胞中已经存在的DNA，来自相同类型的生物体的另一个个体的DNA，来自不同生物体的DNA，或外部产生的DNA，如含有基因的反义消息的DNA序列，或编码基因的合成或修饰型式的DNA序列。
可通过本领域已知的多种方式来评价根据本文所述的方法开发的宿主菌株(参见例如，Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen,编著(2005)Production of Recombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic ExpressionSystems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein ExpressionTechnologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
下调或沉默基因的方法是本领域已知的。例如，可使用反义寡核苷酸、蛋白质适体、核苷酸适体和RNA干扰(RNAi)(例如，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)下调或消除所表达蛋白质活性(参见例如，Fanning和Symonds(2006)Handb ExpPharmacol.173,289-303G，描述锤头状核酶和小发夹RNA；Helene,C.,等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36；Maher(1992)Bioassays 14(12):807-15，描述靶向脱氧核糖核苷酸序列；Lee等人(2006)Curr Opin Chem Biol.10,1-8，描述适体；Reynolds等人(2004)Nature Biotechnology 22(3),326–330，描述RNAi；Pushparaj和Melendez(2006)Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6),504-510，描述RNAi；Dillon等人(2005)Annual Review of Physiology 67,147-173，描述RNAi；Dykxhoorn和Lieberman(2005)Annual Review of Medicine 56,401-423，描述RNAi)。RNAi分子可从多种来源(例如，Ambion,TX；Sigma Aldrich,MO；Invitrogen)商购获得。使用多种算法的几种siRNA分子设计程序是本领域已知的(参见例如，Cenix算法，Ambion；BLOCK-iTTMRNAi Designer，Invitrogen；siRNA Whitehead Institute设计工具,Bioinofrmatics&Research Computing)。影响定义最佳siRNA序列的特征包括siRNA末端的G/C含量、siRNA的特定内部结构域的Tm、siRNA长度、靶序列在CDS(编码区域)内的位置以及3'突出端的核苷酸含量。
基因组编辑
如本文所述，可使用基因组编辑来进行表面展示。用于基因组编辑的方法是众所周知的；参见例如Aldi2018Nature Communications 9(1911)。因此，除非在本文中另外指出，否则本公开的方法可根据此类方法进行。
例如，基因组编辑可包括CRISPR/Cas9、CRISPR-Cpf1、TALEN或ZNF。
例如，成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统是靶向哺乳动物细胞中的所需基因组位点的一类新型基因组编辑工具。最近公布的II型CRISPR/Cas系统使用Cas9核酸酶，所述Cas9核酸酶通过与合成引导RNA复合而靶向基因组位点，所述合成引导RNA与20个核苷酸的DNA序列杂交并紧接在被Cas9识别的NGG基序(因此，(N)20NGG靶DNA序列)之前。这导致NGG基序上游的三个核苷酸的双链断裂。双链断裂引发非同源末端连接，其易错并且有利于敲除基因等位基因的移码突变；或同源定向修复，其可通过使用外源引入的双链或单链DNA修复模板以敲入或纠正基因组中的突变而利用。因此，例如使用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑可以是用于靶向或感测诸如病原体的靶微生物的治疗应用的有用工具。
例如，如本文所述的方法可包括用于改变细胞中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白接触。
制剂
本文所述的剂和组合物可通过任何常规方式使用一种或多种如在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro编),第21版，ISBN:0781746736(2005)中所述的药学上可接受的载体或赋形剂配制，所述文献以引用的方式整体并入本文。此类制剂将含有治疗有效量的可呈纯化形式的本文所述的生物活性剂以及合适量的载体以向受试者提供用于适当施用至受试者的形式。
术语“制剂”是指以适合于施用至受试者如人的形式制备药物。因此，“制剂”可包括药学上可接受的赋形剂，包括稀释剂或载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的”可描述不会引起药理活性的不可接受的损失或不可接受的不利副作用的物质或组分。药学上可接受的成分的实例可以是在美国药典(USP 29)和国家处方集(NF 24)，United States Pharmacopeial Convention,Inc,Rockville,Maryland,2005("USP/NF")或最新版本中具有专题论文的成分，以及不断更新的FDA非活性成分搜索在线数据库中列出的组分。也可使用USP/NF等中未描述的其他有用组分。
如本文中所用，术语“药学上可接受的赋形剂”可包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂。此类介质和剂用于药物活性物质的使用是本领域众所周知的(通常参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro,编著),第21版,ISBN:0781746736(2005))。除非任何常规的介质或剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗性组合物中的用途。补充性活性成分也可并入组合物中。
“稳定的”制剂或组合物可指具有足够稳定性以允许在商业上合理的时间段(如至少约一天、至少约一周、至少约一个月、至少约三个月、至少约六个月、至少约一年或至少约两年)内在方便的温度(如介于约0℃与约60℃之间)储存的组合物。
制剂应符合施用方式的要求。本公开使用的剂可通过已知方法配制以使用几种途径向受试者施用，所述途径包括但不限于肠胃外、经肺、口服、局部、皮内、肿瘤内、鼻内、吸入(例如，以气雾剂形式)、植入、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、经眼、经颊和直肠。单独的剂也可与一种或多种另外剂组合或与其它生物学活性或生物学惰性剂一起施用。此类生物学活性或惰性剂可与一种或多种剂流体或机械连通或通过离子、共价、范德瓦尔斯力、疏水、亲水或其它自然力附着至所述一种或多种剂。
可配制受控释放(或持续释放)制剂来扩展一种或多种剂的活性并且降低剂量频率。受控释放制剂还可被用于影响起效时间或其它特征(如所述剂的血液水平)，并且因此影响副作用的发生。可设计受控释放制剂以便初始释放产生所需治疗作用的量的一种或多种剂，并且逐渐且连续地释放其它量的所述剂以便在延长的时间段内保持治疗作用的水平。为了在体内保持近似恒定水平的剂，可从剂型以将替代从体内代谢和/或排出的剂的量的速率释放所述剂。可通过不同诱导物(例如，pH变化、温度变化、酶、水或其它生理条件或分子)刺激剂的受控释放。
本文所述的剂或组合物也可与其它治疗方式组合使用，如在下文进一步描述。因此，除了本文所述的疗法之外，还可向受试者提供已知有效治疗疾病、病症或疾患的其它疗法。
治疗方法
还提供了一种治疗需要施用治疗有效量的工程化的微生物以治疗或预防微生物/微生物(microorganism/microbial)感染的受试者的疾病或微生物感染(例如，病毒感染、致病有机体、病原性微生物感染)的方法。
本文所述的方法可对有需要的受试者进行。需要本文所述的治疗方法的受试者可以是患有、被诊断患有、疑似患有微生物感染或处于发展微生物感染的风险中的受试者。对于治疗需要的确定将通常通过符合讨论的疾病或疾患的经历和身体测验评估。可通过本文所述的方法治疗的多种贾环的诊断在本领域的技能之内。所述受试者可为动物受试者，包括哺乳动物，如马、奶牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、豚鼠和人。例如，所述受试者可为人受试者。
一般而言，安全且有效量的工程化的微生物是例如将在受试者中产生所需治疗作用、同时使不想要的副作用最小化的量。在各个实施方案中，有效量的本文所述的工程化的微生物可基本上抑制微生物/微生物感染，减慢微生物/微生物感染的进展或限制微生物/微生物感染的发展。
根据本文所述的方法，施用可为肠胃外、经肺、口服、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、经眼、经颊或直肠施用。
当在本文所述的治疗中使用时，治疗有效量的工程化的微生物可以纯形式采用，或在存在此类形式的情况下，可采用药学上可接受的盐形式且有或没有药学上可接受的赋形剂。例如，本公开的化合物可在适于任何医学治疗的合理益处/风险比下以足以治疗或预防微生物/微生物感染的量施用。
可与药学上可接受的载体结合来产生单剂型的本文所述的组合物的量将根据所治疗的宿主和特定施用模式而变化。本领域技术人员将理解，包含于各剂型的单独剂量中的剂的单位含量本身不需要构成治疗有效量，因为可通过施用多个单独剂量达到必需的治疗有效量。
本文所述的组合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定，从而确定LD50(对所述群体的50％致命的剂量)和ED50(在所述群体的50％中治疗有效的剂量)。在毒性作用与治疗作用之间的计量比为治疗指数，其可表示为比率LD50/ED50，其中在本领域中通常理解较大的治疗指数将是最佳的。
对于任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食；施用次数；施用途径；所采用的组合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及在医学领域中众所周知的类似因素(参见，例如Koda-Kimble等人(2004)Applied Therapeutics:The ClinicalUse of Drugs,Lippincott Williams&Wilkins,ISBN 0781748453；Winter(2003)BasicClinical Pharmacokinetics,第4版,Lippincott Williams&Wilkins,ISBN 0781741475；Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/Appleton&Lange,ISBN 0071375503)。例如，组合物的起始剂量水平低于需要实现所需的治疗作用并逐渐增加剂量直至实现所需作用为本领域技术人员熟知的。如果需要，则出于施用的目的，可将有效每日剂量分为多个剂量。因此，单剂量组合物可含有此类量或其约数以组成每日剂量。然而，应理解，本公开的化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。
此外，本文所述的病况、疾病、病症和疾患中的每一种以及其他都可受益于本文所述的组合物和方法。通常，治疗病况、疾病、病症或疾患包括阻止或延迟可罹患或易患所述病况、疾病、病症或疾患、但尚未经历或显示出其临床或亚临床症状的哺乳动物的临床症状的出现。治疗还可包括抑制所述病况、疾病、病症或疾患，例如中止或降低疾病或其至少一种临床或亚临床症状的发展。另外，治疗可包括减轻疾病，例如引起病况、疾病、病症或疾患或其至少一种临床或亚临床症状的消退。对待治疗的受试者的益处可以是统计上显著的或至少可被所述受试者或医师所感知。
工程化的微生物的施用可作为单一事件或在整个治疗时程上发生。例如，可每日、每周、每两周或每月施用工程化的微生物。对于急性疾患的治疗，治疗的时程通常将为至少数天。某些疾患可将治疗从数天延长至数周。例如，治疗可延长到一周、两周或三周。对于更慢性疾患，治疗可从数周延长到数月或甚至一年或更久。
根据本文所述的方法的治疗可在对于微生物/微生物感染的常规治疗方式之前、同时或之后进行。
工程化的微生物可与诸如抗生素、消炎剂或另一剂的另一剂同时或依次施用。例如，工程化的微生物可与诸如抗生素或消炎剂的另一剂同时施用。同时施用可通过施用单独的组合物而发生，各组合物含有工程化的微生物、抗生素、消炎剂或另一剂中的一者或多者。同时施用可通过施用含有工程化的微生物、抗生素、消炎剂或另一剂中的两者或更多者的一种组合物而发生。工程化的微生物可与抗生素、消炎剂或另一剂依次施用。例如，工程化的微生物可在施用抗生素、消炎剂或另一剂之前或之后施用。
施用
本文所述的剂和组合物可根据本文所述的方法以本领域已知的多种方式施用。所述剂和组合物可作为外源材料或作为内源材料治疗性地使用。外源性剂是在体外产生或制造并施用于体内的那些剂。内源性剂是通过某种类型的装置(生物或其它)在体内产生或制造以用于在体内递送或递送至体内的其他器官的那些剂。
如上文所论述，施用可为肠胃外、经肺、口服、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、经眼、经颊或直肠施用。
本文所述的剂和组合物可以本领域众所周知的多种方法施用。施用可包括例如涉及口服摄取、直接注射(例如全身或立体定向)、植入经工程化以分泌目标因子的细胞、释放药物的生物材料、聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、可植入基质装置、微型渗透泵、可植入泵、可注射凝胶和水凝胶、脂质体、胶束(例如，至多30μm)、纳米球(例如，小于1μm)、微球(例如1-100μm)、储库装置，上述任一者的组合或其他合适的提供不同比例的所需释放曲线的递送媒介物。受控释放递送剂或组合物的其它方法对于本领域技术人员将是已知的并且在本公开的范围内。
递送系统可包括例如输液泵，其可用来以类似于用于递送胰岛素或化学疗法到具体器官或肿瘤的方式施用剂或组合物。通常，使用这种系统，剂或组合物可与生物可降解、生物相容性聚合植入物组合施用，所述植入物在所选的部位在受控的时间段内释放所述剂。聚合材料的实例包括聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯及其共聚物和组合。另外，可将受控释放系统靠近治疗靶标放置，因此仅需要一小部分的全身性用量。
剂可在多种载体递送系统中封装和施用。载体递送系统的实例包括微球、水凝胶、聚合植入物、智能型聚合载体和脂质体(通常参见Uchegbu和Schatzlein编(2006)Polymersin Drug Delivery,CRC,ISBN-10:0849325331)。用于分子或生物分子剂递送的基于载体的系统可：提供细胞内递送；定制生物分子/剂释放速率；增加到达其作用部位的生物分子的比例；改进药物向其作用部位的转运；允许与其它剂或赋形剂共同局部沉积；改进试剂在体内的稳定性；通过降低清除率延长剂在其作用部位的驻留时间；减少剂向非靶组织的非特异性递送；减少由剂造成的刺激；减轻由于剂的高初始剂量造成的毒性；改变剂的免疫原性；减小给药频率、改进产品的味道；或改进产品的储存期限。
利用分子生物学方案的本文所述的组合物和方法可根据本领域已知的多种标准技术(参见例如，Sambrook和Russel(2006)Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology,第5版,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773；Elhai,J.和Wolk,C.P.1988.Methods in Enzymology 167,747-754；Studier(2005)Protein Expr Purif.41(1),207–234；Gellissen,编(2005)Production ofRecombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems,Wiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein Expression Technologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)。
提供本文所述的定义和方法来更好地限定本公开并引导本领域的普通技术人员实施本公开。除非另外指出，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
在一些实施方案中，用于描述和要求本公开的某些实施方案的表示成分、特性如分子量、反应条件等的量的数值在一些情况下应理解为被术语“约”修饰。在一些实施方案中，术语“约”用以指明值包括用以测定该值的装置或方法的平均值的标准偏差。在一些实施方案中，在书面描述和所附权利要求书中阐述的数值参数是可以根据由特定的实施方案设法获得的所需性质而变化的近似值。在一些实施方案中，应该根据报道告的有效数字的数量并且通过应用一般的舍入技术来解释数值参数。尽管阐述本公开的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值尽可能精确地报告。在本公开的一些实施方案中提供的数值可含有由在它们的相应试验测量中见到的标准偏差必然产生的某些误差。本文中对值范围的列举仅仅意图充当单独提及落入所述范围内的每个单独值的简易方法。除非本文另外指出，将每个单个值并入说明书，如同其在本文中被单独引用一样。
在一些实施方案中，除非另外具体地指出，否则在描述特定实施方案的情况下(特别是在某些下列权利要求的情况下)使用的术语“一个/种(a/an)”和“所述”及类似引用可解释为涵盖单数和复数。在一些实施方案中，除非明确地指明仅提及替代物或所述替代物是互相排斥的，否则在包括权利要求书的本文中使用的术语“或”用以指“和/或”。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式联系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有这一个或多个步骤并且还可包括其它未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一种或多种特征的任何组合物或装置不限于仅具有那一种或多种特征并且还可包括其它未列出的特征。
除非本文另外指明或上下文明显矛盾，否则可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法。使用相对于本文中的某些实施方案提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的目的仅仅是希望更好地阐明本公开，而不对另外要求的本公开的范围施加限制。在本说明书中的任何语言都不应该被视为指明对实践本公开必要的任何未要求的要素。
本文公开的本公开的供选要素或实施方案的分组不应解释为是限制性的。每个组的成员可单独地提及并要求保护，或以与所述组的其它成员或本文中出现的其它要素的任何组合形式提及并要求保护。出于便利性或可专利性的原因，一组的一个或多个成员可包括在一个组中或从一个组中删掉。当发生任何这种包括或删除时，本说明书在本文中应被视为含有所修改的组，因而符合所附权利要求书中使用的所有马库什(Markush)组的书面描述。
本申请中引用的所有公布、专利、专利申请以及其它参考文献出于所有目的以引用的方式整体并入本文，其程度如同每个单独的公布、专利、专利申请或其它参考文献出于所有目的具体且单独地指明以便以引用的方式整体并入本文一般。本文中的参考文献的引用不应该被解释为承认其为本公开的现有技术。
已经在本公开进行了详细描述，将显而易见的是，在不背离所附权利要求中所限定的本公开范围的情况下，修改、变化和等效实施方案是可能的。另外，应了解本公开中的所有实施例作为非限制性实施例提供。
实施例
提供以下非限制性实施例以进一步说明本公开。本领域的技术人员应了解在实施例中公开的技术随后表示由本发明人发现的，在本公开的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被视为构成本公开实践的模式的实施例。然而，根据本公开，本领域的技术人员应了解可在不脱离本公开的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1：益生菌酵母工程化-表面展示
以下实施例描述益生菌酵母(例如，布拉氏酵母)工程化。这些工程化的益生菌酵母可用于病原体去除。此实施例描述抗体/结合结构域的表面展示的构建设计和基于CRISPR的基因组编辑工具制备。
结合结构域的表面展示
在此示出布拉氏酵母的蛋白质展示系统的完成。基于Flo428锚定蛋白构建了展示系统并进行了验证。表面展示未改变宿主肠道中工程化的布拉氏酵母菌株的稳定性/寿命。MNoV结合结构域的表面展示增强了布拉氏酵母对MNoV的体外结合活性(约3倍)。
进行了工程化的布拉氏酵母的MNoV结合活性的体内测试。
如本文所述，可以与如本文所述的相同的方式进行其他病原体结合结构域的展示。
用于布拉氏酵母的表面展示系统的构建：
在此，使用了絮凝蛋白(flocculin)系统。构建了用于展示一种靶标肽(例如，CLM-1)的单一嵌合蛋白的简单盒(参见例如，图9)。
使用了TDH3(甘油醛3-磷酸脱氢酶3)启动子，证明了靶蛋白的组成型强表达。
交配因子α信号序列和Flo428(C末端428aa锚定区)用于靶蛋白的定位。
使用了CYC1(细胞色素C1)终止子。
除Flo428外，所有元件均从布拉氏酵母基因组DNA克隆。
总结
如在此所证明，CRISPR基因组编辑工具(包括gRNA)成功地用于靶向布拉氏基因组中的有效基因间位点，并且基于dCas9开发了合成转录系统。
实施例2：益生菌酵母工程化-酵母生物传感器
以下实施例描述用作真菌生物传感器的布拉氏酵母表面上的蛋白质展示。此实施例描述人工传感器和信号传导系统的构建设计以及基于CRISPR的基因组编辑工具制备。
在此，酵母生物传感器不使用“锚定”蛋白区域。代替在表面展示中使用的锚定区，用于感测机制的嵌合蛋白具有“茎”，所述茎是跨膜蛋白，其位置从细胞质延伸至细胞外空间(参见，例如，图3)。
在此，示出布拉氏酵母表面上的蛋白质展示，包括具有多个克隆位点的基于Flo1p的表面展示盒的克隆，以测试各种结合蛋白以及4种组成型启动子和2种分泌信号序列的8种组合。
本文还描述了真菌生物传感器，包括用于所描述的5个基因间位点(在Chr XVI上两个)的引导RNA表达盒的构建，具有用于测试结合剂(生物分子)与反式激活因子的各种组合的两个多克隆位点的嵌合传感器的表达盒的构建，在人工启动子控制下作为报告基因的荧光蛋白yeRFP和yeGFP的表达盒的构建，以及dCas9和支架RNA表达盒的构建。
人工传感器和信号传导系统的构建
构建并验证了合成转录系统。基于天然跨膜蛋白构建了嵌合传感器的主链。针对第一靶标金黄色葡萄球菌(scFv，ZW88)构建了一组嵌合传感器(总计8个)。
敲除野生型跨膜蛋白，并引入传感器分子的表达盒。
此实施例可扩展为使用新的细胞壁结合结构域构建新的嵌合传感器。
使用基于CRISPR-Cas9的方法，将嵌合传感器组整合到基因间位点IS2n(对于具有泛素的N末端片段的传感蛋白)和IS5n(对于具有融合到反式激活因子中的泛素的C末端片段的传感蛋白)中。嵌合传感器盒的编码序列用两个同源区域圈定，所述同源区域包含与靶基因间位点IS2n和IS5n的上游和下游相同的50个碱基对，并PCR扩增为供体DNA以用于CRISPR-Cas9基因组编辑。将供体DNA片段和使Cas9核酸内切酶分别定位于IS2n和IS5n上的引导RNA的表达载体转化到表达Cas9的布拉氏酵母中(参见例如图5)。Cas9对IS2n和IS5n的双链断裂是选择压力，因此将有可能选择通过经由覆盖IS2n和IS5n的同源重组整合供体DNA而从双链断裂中恢复的阳性构建体。
在此示出嵌合传感器可将物理刺激转换为转录信号(参见例如，图2)。生物传感器激活是基于酵母属酵母的先天泛素酶活性(参见例如，图2)。
无论物理应力如何，突变型Wsc1p(C8A)分子(跨膜蛋白)都不能簇集。如此，突变型Wsc1p适合用作茎部分。
人工反式激活因子设计是在dCas9和支架RNA上(参见例如图3，图4)。
材料
克隆试剂：New England Biolabs
其他化学试剂：Sigma-Aldrich和ThermoFisher
寡核苷酸：整合DNA技术
布拉氏酵母：美国典型培养物保藏中心
益生菌酵母工程化：嵌合传感器
益生菌酵母中合成生物传感器的要求
嵌合传感器具有可扩展的靶标范围和正交表达系统。
对于传感器部分，将细胞外刺激转换成细胞内信号。
结合剂可以是抗体的功能性片段(scFv等)、受体或细胞壁结合结构域。具有多于一条链的纳米抗体或其他抗体形式不适合用作嵌合传感器设计中的结合剂。但是它们适合用于展示(例如海绵)设计中。
与传感器部分和结合结构域一起，嵌合传感器包含跨膜结构域和信号分子。
信号传递/基因转录(参见例如图15)包括启动子、反式激活因子/转录因子和报告基因。
基于CRISPR的基因组编辑工具(参见例如，图16)用于克隆。特别地，Cas9或Cpf1和引导RNA(gRNA)。
测试合成启动子和反式激活因子(参见例如，图4、图17)
报告基因盒被整合到基因组(IS1)中。进行支架RNA(scRNA)、反式激活因子和dCas9的游离表达。
强组成型启动子：使用了PTEF1、PADH1(参见例如，图18)。
新的PGALsyn启动子和相应的scRNA(参见例如，图19)
新的scRNA靶向序列的标准包括：无自身互补性，布拉氏酵母(酿酒酵母)基因组中没有相同序列，合宜的效率以及在传感器系统的其他区室(包括dCas9表达盒，报告基因和传感器表达盒)中没有相同的序列。通过连接第一scRNA结合序列(20个碱基对)和PGAL7的最小启动子区域(从3'端起165个碱基对)来设计PGALsyn1。对于其他启动子，第一scRNA结合序列通过FastCloning方法(Li等人，2011)被其他scRNA结合序列取代。
测试新的PGALsyn启动子和相应的scRNA
经由CRISPR-Cas9基因组编辑，将包含PGALsyn启动子、报告基因(GFP或RFP)和TCYC1的新报告基因盒整合到IS1n基因间位点中。
表1.用于这一实验的菌株。
Figure BDA0003028273060000171
嵌合传感器将物理刺激转换为转录信号(参见例如，图2)。
对于传感器部分，将细胞外刺激物转换为细胞内信号：结合结构域(例如，功能性抗体片段(scFv等)、受体、内溶素细胞壁结合结构域等)、跨膜结构域和信号分子。
对于嵌合传感器部分，基于酵母属酵母的先天泛素酶活性，将物理刺激转换为转录信号。
野生型Wsc1p对比突变型(C8A)Wsc1p。野生型蛋白为自簇集型，但先前已证明，单点突变可使这种蛋白不簇集(C8A)。因此，突变型Wsc1p适合于茎(参见例如，图2)。
产生了将物理刺激转换为转录信号的嵌合传感器。证明了通过scRNA和dCas9进行人工和正交表达(参见例如，图3、图4)。使用了两种不同的启动子-转录因子组(例如，NUbI、NUbG)。许多研究组在dCas9处添加了反式激活因子，以控制靶基因的转录。
嵌合传感器的克隆(参见例如，图22)
用以下构建核心：用于定位的信号肽；跨膜结构域(例如，突变型Wsc1p)；用于结合结构域和反式激活因子克隆的MCS；启动子和终止子(PFAU1在酿酒酵母中表现出PWSC1的50％表达水平)；结合结构域(ZW88(2017,Wang等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.)，抗金黄色葡萄球菌scFv。
构建了泛素-反式激活因子(参见例如，图3)，其包括N末端泛素
Figure BDA0003028273060000172
(NUbI或NUbG(1994,Johnsson等人,PNAS)(突变体，I13G)和C末端泛素反式激活因子
Figure BDA0003028273060000173
(CUb-MCP-VP64或CUb-PCP-VP64)。不管物理刺激，NUbG的I13G突变通过NUb与CUb之间的天然相互作用使潜在噪声信号最小化。将嵌合传感器整合到基因组中。
表2.为测试传感器系统(ZW88)而制备的组。
Figure BDA0003028273060000181
总结
如此处所示，开发了嵌合传感器的核心结构。
实施例3：靶标-鼠诺如病毒(MNOV)
以下实施例描述上述酵母表面展示靶向诺如病毒的用途。证明了工程化的布拉氏酵母展示了CLM-1。
絮凝蛋白系统用于酵母表面展示(参见例如，图1)。简单的单一盒用于展示一种靶蛋白。甘油醛3-磷酸脱氢酶3(TDH3)启动子用于组成型强表达。交配因子α信号序列用于在细胞表面上定位。所使用的锚定蛋白是Flo1p的锚定区，Flo1p是凝集素样细胞壁蛋白(C末端428aa(1284bp)，Flo428)。选择使用细胞色素C1(CYC1)终止子。
使用基于Cas9的整合到IS1n位点中来将表面展示盒整合到布拉氏酵母的XV染色体中。CLM-1展示单元表达盒用两个同源区域圈定，所述同源区域包含与IS1n的上游和下游相同的50个碱基对，并PCR扩增为供体DNA以用于CRISPR-Cas9基因组编辑。将供体DNA片段和使Cas9核酸内切酶定位于IS1n上的引导RNA的表达载体转化到表达Cas9的布拉氏酵母中(参见例如，图5)。Cas9对IS1n的双链断裂是选择压力，因此能够选择通过经由覆盖IS1n的同源重组整合供体DNA而从双链断裂中恢复的阳性构建体。通过菌落PCR扩增包括IS1n位点的500bp区域(参见例如，图6)和测序来验证整合。展示系统对CLM-1的展示经由免疫荧光染色和共聚焦显微术验证，分别使用与荧光团647缀合的Genentech 3F6(仓鼠，非商业)和抗仓鼠抗体作为第一抗体和第二抗体(参见例如，图7A-图7F)。
据信这是首次体内结合测定，其评估了施用展示CLM-1的布拉氏酵母对肠道中MNOV水平的影响。
施用布拉氏酵母3天后，施用了布拉氏酵母的小鼠脱落了较高量的MNoV，并且它们粪便中的MNoV量在8天内变得更低。在施用了展示CLM-1的布拉氏酵母的小鼠中，所述作用是显著的。
诺如病毒
诺如病毒是急性肠胃炎爆发的主要原因。MNoV可在细胞培养中常规生长，可感染实验室小鼠，并且已被用作定义诺如病毒复制和发病机理的系统。
CD300lf
CMRF35样分子1(CLM-1)被用作MNoV的靶蛋白。跨膜蛋白含有单个IgV样细胞外结构域。CMRF35抗原是通过与单克隆抗体的反应性而鉴定的，存在于单核细胞、嗜中性粒细胞以及一些T淋巴细胞和B淋巴细胞上。
方法
内溶素基因3'端区域的细胞壁结合结构域在无终止密码子的情况下扩增，并在展示CLM-1的表达盒中取代了编码CLM-1的基因。新的展示盒也通过CRISPR-Cas9基因组编辑整合到基因间位点IS1n中。
通过使用衍生自噬菌体内溶素的细胞壁结合结构域来扩展应用范围可使用本文所述的方法进行。例如，可构建用于LysGH15B和LysSA97(金黄色葡萄球菌)、PlyCP26F(艰难梭菌/产气荚膜梭菌)和PlyP35(单核细胞增多性李斯特氏菌)细胞壁结合结构域的展示盒。类似地，可以与本文所述的用于其他细胞壁结合结构域的克隆方法相同的方式进行phiCcoIBB35(大肠弯曲杆菌)的结合结构域的克隆。
免疫荧光染色和共聚焦显微术
靶蛋白成功地展示在布拉氏酵母菌株的表面上(参见例如，图7)。荧光信号的环形状代表表面展示。第一抗体是直接靶向CLM-1蛋白的Genentech 3F6(仓鼠，非商业)。第二抗体：与647缀合的抗仓鼠抗体。
展示CLM-1的酵母与MNoV之间的相互作用
体外结合测定(参见例如，图13在本文中说明)。
酵母细胞表面上MNoV的定量显示6*108CFU的布拉氏酵母或工程化的布拉氏酵母(展示CLM-1)和106噬斑形成单位(PFU)的MNoV。
结果显示，CLM-1的表面展示增加布拉氏酵母的结合能力。CLM-1与锚定蛋白之间的另外标签不会显著影响相互作用。
研究了展示CLM-1的酵母与小鼠肠道中的MNoV之间的相互作用(关于研究设计，参见例如，图14)。施用布拉氏酵母3天后，施用了布拉氏酵母的小鼠脱落了较高量的MNoV，并且它们粪便中的MNoV量在8天内变得更低。在施用了展示CLM-1的布拉氏酵母的小鼠中，所述作用是显著的。
实施例4：工程化的布拉氏酵母的体内稳定性
此实施例测定了布拉氏酵母在小鼠肠道中的稳定性和存活力。结果显示，停药后2天，布拉氏酵母细胞几乎已从小鼠肠道中清除。此实施例描述小鼠模型中布拉氏酵母在哺乳动物肠道中的寿命/寄居。
布拉氏酵母非常快速地穿过小鼠肠道(参见例如图图11A-图11B)。经由口服管饲向小鼠施用3x 108CFU活布拉氏酵母。管饲12小时后在粪便中发现了大量的Sb细胞(参见例如，图11A)。发现布拉氏酵母未在小鼠肠道中定殖(参见例如，图11B)。
图12示出多次施用、链霉素和胃中和作用的影响。结果显示，在停药后的6天内，野生型和工程化的布拉氏酵母菌株均被清除。链霉素和碳酸氢钠并未显著改变布拉氏酵母的存活力。
序列表
<110> 丹塔斯·古普塔Dantas, Gautam
Kwak, Suryang
维京·赫伯特(Virgin, Herbert)
<120> 工程化的微生物及其制造和使用方法
<130> 018742-WO_PCT
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)
<400> 1
ttggcaacta ctctcaaagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)
<400> 2
gtaaggaatt atgttcgccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)
<400> 3
gttgtcaatt gccacagagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)
<400> 4
gggaaagttt gaaaatgtgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)
<400> 5
tcctctacaa cccaatgagg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)
<400> 6
gtagggagct actacaaagt 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PtetO PAM/scRNA结合序列
<400> 7
gggatagtca ctatctcttt tca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PGALsyn1 PAM/scRNA结合序列
<400> 8
atctgtcgac agtgcgatac agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PGALsyn2 PAM/scRNA结合序列
<400> 9
cgcgaactcg agaccgaagg ggg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PGALsyn3 PAM/scRNA结合序列
<400> 10
ttaggtgcta cgtcacgagc tgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PGALsyn4 PAM/scRNA结合序列
<400> 11
ttcaacgcgt tcacgtgtgg tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PGALsyn5 PAM/scRNA结合序列
<400> 12
tctctatcac tgatagggag cgg 23

Claims (73)

1.一种工程化的微生物，所述工程化的微生物包含：
在所述工程化的微生物的表面上展示的至少一种结合剂，其中所述结合剂对靶微生物具有结合亲和力。
2.如权利要求1所述的工程化的微生物，其中所述结合剂经由锚定蛋白可操作地连接至所述工程化的微生物。
3.如权利要求2所述的工程化的微生物，其中所述锚定蛋白是细胞壁蛋白锚定区。
4.如权利要求3所述的工程化的微生物，其中所述细胞壁蛋白锚定区是Flo1p锚定区。
5.如权利要求1所述的工程化的微生物，其中所述结合剂经由包含跨膜蛋白的茎可操作地连接至所述工程化的微生物。
6.如权利要求5所述的工程化的微生物，其中所述跨膜蛋白选自Wsc1p(C8A)。
7.如权利要求5所述的工程化的微生物，其中所述茎包含可操作地连接至所述跨膜蛋白的细胞壁蛋白结构域，其中所述细胞壁蛋白结构域能够使所述茎延伸至细胞外空间中。
8.如权利要求7所述的工程化的微生物，其中所述细胞壁蛋白结构域是Mid2蛋白(Mid2p)。
9.如权利要求1中任一项所述的工程化的微生物，所述工程化的微生物包含第一结合剂和第二结合剂，其中所述第一结合剂能够结合至第一靶微生物并且所述第二结合剂能够结合至第二靶微生物，并且所述第一结合剂不同于所述第二结合剂。
10.如权利要求1或2所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物是酵母属酵母。
11.如权利要求10所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物选自酿酒酵母布拉氏变种(布拉氏酵母)。
12.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是致病有机体、共生微生物或病原体。
13.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是细菌、真菌、病毒或真核生物。
14.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物选自由以下组成的组：诺如病毒、单核细胞增多性李斯特氏菌、梭菌致病有机体、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、大肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、酿脓链球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌或具有可被诸如scFv、受体或结合结构域的结合剂靶向的结合区的任何其他生物实体。
15.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述结合剂特异性地结合至所述靶微生物。
16.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：肽、蛋白质、抗体、纳米抗体、其单链片段以及它们的组合。
17.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：靶微生物的细胞壁结合结构域和内溶素的细胞壁结合结构域。
18.如权利要求2所述的工程化的微生物，其中所述锚定蛋白包括由启动子和终止子圈定的单顺反子中的细胞壁蛋白锚定区。
19.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是诺如病毒，并且所述结合剂是CLM-1。
20.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是梭菌致病有机体(艰难梭菌/产气荚膜梭菌)，并且所述结合剂是ΦCP26F(PlyCP26F)的细胞结合结构域。
21.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是单核细胞增多性李斯特氏菌，并且所述结合剂是内溶素Ply500的细胞结合结构域500或PlyP35的细胞壁结合结构域。
22.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是酿脓链球菌，并且所述结合剂是内溶素PlyC的PlyC结合结构域。
23.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述靶微生物是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或金黄色葡萄球菌，并且所述结合剂是LysGH15B，其为内溶素LysGH15的细胞壁结合结构域；LysSA97；或ZW88。
24.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，所述靶微生物是大肠弯曲杆菌，并且所述结合剂是phiCcoIBB35的细胞壁结合结构域。
25.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，所述工程化的微生物还包含经由条件性可裂解肽可操作地连接至跨膜蛋白的反式激活因子。
26.如权利要求25所述的工程化的微生物，其中所述条件性可裂解肽在泛素酶存在下是可裂解的。
27.如权利要求25所述的工程化的微生物，其中所述反式激活因子包含RNA引导的DNA核酸内切酶。
28.如权利要求27所述的工程化的微生物，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶是无核酸酶的Cas9(dCas9)。
29.如权利要求27所述的工程化的微生物，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶对应于整合到基因间位点中的展示单元。
30.如权利要求29所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物是布拉氏酵母，并且所述基因间位点选自Chr VII、XII、XV、XVI或它们的组合。
31.如权利要求25所述的工程化的微生物，其中
第一分裂泛素片段可操作地连接至跨膜蛋白；
反式激活因子经由第二分裂泛素片段可操作地连接至所述跨膜蛋白；并且
所述第一分裂泛素片段与所述第二分裂泛素片段之间的物理相互作用释放所述反式激活因子。
32.如权利要求31所述的工程化的微生物，其中
所述第一分裂泛素片段包含泛素的N末端37个氨基酸残基，可操作地连接至跨膜蛋白；并且
所述第二分裂泛素片段包含泛素的C末端42个氨基酸残基。
33.如权利要求25所述的工程化的微生物，其中所述反式激活因子包含scRNA结合基序和能够起始报告蛋白的表达的转录激活因子。
34.如权利要求33所述的工程化的微生物，其中所述报告蛋白选自荧光蛋白如GFP、RFP(例如，mCherry)、BFP，或发光蛋白如荧光素酶。
35.如权利要求25所述的工程化的微生物，其中所述反式激活因子包含转录激活结构域。
36.如权利要求35所述的工程化的微生物，其中所述转录激活结构域包含VP64。
37.如权利要求25所述的工程化的微生物，其中所述反式激活因子包含RNA茎环识别结构域，并且所述RNA茎环识别结构域与细胞内酶可裂解结合片段融合。
38.如权利要求37所述的工程化的微生物，其中所述RNA茎环识别结构域选自MCP、PCP或Com。
39.如权利要求37所述的工程化的微生物，其中所述细胞内酶可裂解结合片段是泛素片段。
40.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物包含报告基因。
41.如权利要求40所述的工程化的微生物，其中所述报告基因选自GFP、RFP、BFP、发光蛋白或它们的组合。
42.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的微生物，其中所述工程化的微生物选自不会在哺乳动物肠道中定殖的微生物。
43.一种靶向感测、检测或杀死共生或病原性肠道微生物的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求1至42中任一项所述的工程化的微生物。
44.一种治疗肠道疾病(例如，感染性疾病，如诺如病毒)的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如权利要求1至42中任一项所述的工程化的微生物。
45.一种调节共生肠道微生物群的方法，所述方法包括接触治疗有效量的如权利要求1至42中任一项所述的工程化的微生物。
46.一种构建工程化的微生物的方法，所述方法包括：
提供微生物；
提供展示盒；以及
将所述展示盒整合到所述微生物基因组的基因间位点中；
其中，
所述展示盒包含用于表达结合剂的序列；能够表达所述结合剂的启动子；终止子；锚；以及分泌信号肽。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述锚包括由组成型启动子和终止子圈定的单顺反子中的细胞壁蛋白锚定区。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述锚选自来自酵母属酵母的Cwp2p、Sed1p、Ccw12p或Flo1p。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述锚选自Flo1p。
50.一种构建工程化的微生物的方法，所述方法包括：
提供微生物；
提供展示盒；以及
将所述展示盒整合到所述微生物基因组的基因间位点中；
其中，
所述展示盒包含用于表达结合剂的序列；组成型启动子；终止子；包含微生物细胞壁蛋白的跨膜结构域的茎；分泌信号肽；以及可操作地连接至反式激活因子的细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述微生物细胞壁蛋白的跨膜结构域选自Wsc1p(C8A)。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述展示盒还包含可操作地连接至所述茎的细胞壁蛋白结构域，其中所述细胞壁蛋白结构域能够使所述茎延伸至细胞外空间中。
53.如权利要求50所述的方法，所述方法包括：
第一对结合剂和第二对结合剂；以及
第一反式激活因子和第二反式激活因子；其中
所述第一对结合剂能够结合至第一靶微生物并且所述第二对结合剂能够结合至第二靶微生物，并且所述第一对结合剂不同于所述第二对结合剂；
所述第一对结合剂经由第一跨膜蛋白可操作地连接至第一对细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)，其中所述第一对第一细胞内酶可裂解结合片段中的一者可操作地连接至所述第一反式激活因子；
所述第二结合剂经由第二跨膜蛋白可操作地连接至第二对细胞内酶可裂解结合片段，其中所述第二对第二细胞内酶可裂解结合片段中的一者可操作地连接至第二反式激活因子；并且
所述第一对细胞内酶可裂解结合片段中的一者和所述第二对细胞内酶可裂解结合片段中的一者在N末端区域具有相同的结合蛋白，但在C末端区域具有不同的反式激活因子，从而能够与靶微生物物理地相互作用并释放所述第一反式激活因子或所述第二反式激活因子。
54.如权利要求46或50中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：肽、蛋白质、抗体、纳米抗体、其单链片段以及它们的组合。
55.如权利要求46或50中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括由以下组成的组中的一者或多者：靶微生物的细胞壁结合结构域和内溶素的细胞壁结合结构域。
56.如权利要求46、50或53中任一项所述的方法，其中所述结合剂选自CLM-1；ZW88；ΦCP26F(PlyCP26F)的细胞结合结构域；内溶素Ply500的细胞结合结构域500；内溶素PlyC的PlyC结合结构域；LysGH15B，其为内溶素LysGH15的细胞壁结合结构域，或LysSA97；或phiCcoIBB35的细胞壁结合结构域。
57.如权利要求50至56中任一项所述的方法，其中所述反式激活因子经由条件性可裂解肽可操作地连接至跨膜蛋白。
58.如权利要求50或53中任一项所述的方法，其中所述反式激活因子包含RNA引导的DNA核酸内切酶(例如，无核酸酶的Cas9(dCas9))。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶对应于整合到基因间位点(例如，布拉氏酵母的Chr VII、XII、XV、XVI)中的展示单元。
60.如权利要求50至59中任一项所述的方法，其中无核酸酶的Cas9(dCas9)和支架RNA将所述反式激活因子募集至相应的合成启动子。
61.如权利要求50或53中任一项所述的方法，其中所述反式激活因子包含scRNA结合基序和能够起始报告基因(例如，荧光蛋白如GFP、RFP(例如，mCherry)、BFP，发光蛋白)或生物分子(例如，抗体、酶、抗微生物肽)的表达的反式激活因子。
62.如权利要求50至60中任一项所述的方法，其中所述反式激活因子包含转录激活结构域(例如，VP64)。
63.如权利要求50或53中任一项所述的方法，其中所述反式激活因子包含与细胞内酶可裂解结合片段(例如，泛素片段)融合的RNA茎环识别结构域(例如，MCP、PCP、Com)。
64.如权利要求50或53中任一项所述的方法，所述方法包括起始靶报告蛋白的转录。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述靶报告蛋白选自荧光蛋白和发光蛋白。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述靶报告蛋白选自由以下组成的组：GFP、RFP(如mCherry)、BFP、荧光素酶或它们的组合。
67.如权利要求46、50或53中任一项所述的方法，其中所述微生物选自布拉氏酵母，并且所述基因间位点选自Chr VII、XII、XV或XVI或它们的组合；并且Cas9的相应引导RNA产生靶蛋白的稳定表达，而不会干扰所述微生物的天然转录。
68.如权利要求46或50中任一项所述的方法，其中用于稳定表达靶蛋白的框架不需要诱导物。
69.如权利要求46或50中任一项所述的方法，所述方法包括所述工程化的微生物的强组成型启动子或弱启动子。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述强组成型启动子选自布拉氏酵母的TDH3或CCW12启动子。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述弱启动子选自布拉氏酵母的WSC1或FAU1启动子。
72.如权利要求69所述的方法，所述方法还包括终止子。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述终止子选自布拉氏酵母的ADH1或CYC1终止子。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462676B (zh) * 2021-05-26 2023-04-18 百葵锐(天津)生物科技有限公司 一种在细胞表面展示裂解酶的方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1454258A (zh) * 2000-07-26 2003-11-05 韩国生命工学研究院 来源于酵母的新型细胞壁锚定蛋白及其基因和使用其的细胞表面表达系统
US20040170970A1 (en) * 2000-08-04 2004-09-02 Alexander Varshavsky Split- ubiquitin based reporter systems and methods of their use
US20110150907A1 (en) * 2008-04-04 2011-06-23 Farallone Holdings Bv Methods and materials for gastrointestinal delivery of pathogen/toxin binding agents
US20120171188A1 (en) * 2008-08-19 2012-07-05 Hyglos Invest Gmbh Artificial Peptidoglycan Lysing Enzymes and Peptidoglycan Binding Proteins

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2738840B1 (fr) * 1995-09-19 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Souches de levures genetiquement modifiees
ATE434040T1 (de) * 2001-10-01 2009-07-15 Dyax Corp Mehrkettige eukaryontische display-vektoren und deren verwendungen
EP2097452A1 (en) * 2006-12-14 2009-09-09 Actogenix N.V. Delivery of binding molecules to induce immunomodulation
EP2629094A1 (en) * 2007-01-24 2013-08-21 Carnegie Mellon University Optical biosensors
KR102227975B1 (ko) * 2014-07-24 2021-03-15 삼성전자주식회사 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법
WO2016077249A1 (en) * 2014-11-10 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for expressing polypeptides on the surface of cells
US11466075B2 (en) * 2015-10-13 2022-10-11 University Of Maryland, Baltimore Yeast-based immunotherapy against clostridium difficile infection

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1454258A (zh) * 2000-07-26 2003-11-05 韩国生命工学研究院 来源于酵母的新型细胞壁锚定蛋白及其基因和使用其的细胞表面表达系统
US20040170970A1 (en) * 2000-08-04 2004-09-02 Alexander Varshavsky Split- ubiquitin based reporter systems and methods of their use
US20110150907A1 (en) * 2008-04-04 2011-06-23 Farallone Holdings Bv Methods and materials for gastrointestinal delivery of pathogen/toxin binding agents
US20120171188A1 (en) * 2008-08-19 2012-07-05 Hyglos Invest Gmbh Artificial Peptidoglycan Lysing Enzymes and Peptidoglycan Binding Proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIETMAR DIRNBERGER等: "A Small-Molecule–Protein Interaction System with Split-Ubiquitin as Sensor", CHEMBIOCHEM, vol. 7, pages 936 - 942, XP055868911, DOI: 10.1002/cbic.200500544 *
VORAWIT ANANPHONGMANEE等: "Yeast Surface Display of Two Proteins Previously Shown to Be Protective Against White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Shrimp", PLOS ONE, vol. 10, no. 6, pages 1 - 14 *

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