CN107548401A - 用于细胞内递送分子的肽和纳米颗粒 - Google Patents

用于细胞内递送分子的肽和纳米颗粒 Download PDF

Info

Publication number
CN107548401A
CN107548401A CN201580076607.0A CN201580076607A CN107548401A CN 107548401 A CN107548401 A CN 107548401A CN 201580076607 A CN201580076607 A CN 201580076607A CN 107548401 A CN107548401 A CN 107548401A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano particle
cell
peptide
compound
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580076607.0A
Other languages
English (en)
Inventor
G·迪维塔
N·德赛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adigen Co Ltd
Aadigen LLC
Original Assignee
Adigen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adigen Co Ltd filed Critical Adigen Co Ltd
Publication of CN107548401A publication Critical patent/CN107548401A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

本发明涉及肽和含肽复合物/纳米颗粒，其对稳定和递送货物分子比如核酸是有用的。

Description

用于细胞内递送分子的肽和纳米颗粒
技术领域
本发明涉及肽和含肽复合物/纳米颗粒，其可用于稳定和递送货物分子(cargomolecule)比如核酸。
背景技术
虽然小分子在许多情况下依然是在临床中使用的主要药物，但是它们的治疗影响已经达到极限比如到达靶标的能力不足、缺乏特异性、需要高剂量——其导致毒性和严重的副作用。在过去十年内，为了规避小分子和基于基因的疗法的限制，我们已经在较大的治疗性分子比如蛋白质、肽和核酸——其对它们的靶标呈现高特异性但是不遵循五倍率法则(Lipinski’s rules)——的发现中见证了急剧的加速。这些分子的药物效力依然受限于它们差的体内稳定性和它们低的细胞中摄取。因此，“递送”已经成为治疗难题的核心部分(central piece)并且新的里程碑已经被建立以验证递送策略：(a)缺乏毒性、(b)低剂量下的体内效率、(c)易于处理用于治疗应用、(d)快速的内体释放、和(e)达到靶标的能力。虽然病毒性递送策略已经给基因和细胞疗法很大希望，但是它们的临床应用已经遭受副作用和毒性作用(Ibraheem et al.(2014)Int J Pharm 459,70-83)。研究主要集中于非病毒性策略的研发，并且已经提出了不同的方法，包括脂质、聚阳离子纳米颗粒和基于肽的制剂，但是这些技术中仅少数在体内有效并且已经达到临床水平(Yin et al.(2014)Nat RevGenet 15,541-555)。细胞穿透肽(CPP)是最有希望的非病毒性策略之一。虽然CPP的定义在不断地发展，但是它们通常被描述为衍生自蛋白质或嵌合序列的少于30个氨基酸的短肽。它们经常是两亲的并且具备净正电荷(Langel U(2007)Handbook of Cell-PenetratingPeptides(CRC Taylor&Francis,Boca Raton)；Heitz et al.(2009)Br J Pharmacol 157,195-206)。CPP能够穿透生物膜，引发多种生物分子跨越细胞膜进入细胞质的运动和改进它们的细胞内途径，从而促进与靶标的相互作用。CPP可以被细分为两个主要类别，第一种需要与货物的化学键并且第二种涉及形成稳定的非共价复合物。来自两种策略的CPP已经被报道有助于将许多货物(质粒DNA、寡核苷酸、siRNA、PNA、蛋白质、肽、脂质体、纳米颗粒…)递送入各种细胞类型和体内模型(Langel U(2007)Handbook of Cell-PenetratingPeptides(CRC Taylor&Francis,Boca Raton)；Heitz et al.(2009)Br J Pharmacol 157,195-206；Mickan et al.(2014)Curr Pharm Biotechnol 15,200-209；Shukla et al.(2014)Mol Pharm 11,3395-3408)。
蛋白转导结构域(PTD)的概念最初基于如下观察被提出：一些蛋白质，主要是转录因子，可以在细胞内穿梭并且从一个细胞穿梭至另一个(综述参见Langel U(2007)Handbook of Cell-Penetrating Peptides(CRC Taylor&Francis,Boca Raton)；Heitz etal.(2009)Br J Pharmacol 157,195-206)。第一次观察由Frankel和Pabo在1988年完成。他们显示HIV-1的转录-反式激活(Tat)蛋白可以进入细胞并且易位入细胞核。在1991年，Prochiantz的团队使用果蝇触角足同源域得出了相同的结论并且展现此结构域由神经细胞内化。这些工作是1994年发现第一个蛋白转导结构域的源头：源自命名为穿膜肽(Penetratin)的触角足的同源域的第三螺旋的16mer-肽。在1997年，Lebleu的团队鉴定了细胞摄取需要的Tat的最小序列，并且PTD的体内应用的第一个概念验证由Dowdy的团队报道用于递送小的肽和大的蛋白质(Gump JM,and Dowdy SF(2007)Trends Mol Med 13,443-448.)。在历史上，Langel的团队在1998年使用第一种嵌合肽载体Transportan——其衍生自神经肽甘丙肽的N-端片段，连接至蜂毒肽(wasp venom peptide)黄蜂毒素(mastoparan)——的设计介绍了细胞穿透肽(CPP)的概念。Transportan最初被报道为在培养的细胞和体内二者中提高PNA(肽核酸)的递送(Langel U(2007)Handbook of Cell-Penetrating Peptides(CRC Taylor&Francis,Boca Raton))。在1997年，Heitz和Divita的团队提出了新的策略，其使CPP参与具有它们的货物的稳定但是非共价复合物的形成(Morris et al.(1997)Nucleic Acids Res 25,2730-2736)。该策略首先基于由两个结构域构成的短肽载体(MPG)：亲水性(极性)结构域和疏水性(非极性)结构域。MPG被设计用于递送核酸。一级两亲的肽Pep-1然后被提议用于非共价递送蛋白质和肽(Morris et al.(2001)Nat Biotechnol 19,1173-1176)。然后，Wender的团队和Futaki的团队证明聚精氨酸序列(Arg8)足以驱使小分子和大分子进入细胞和体内(Nakase et al.(2004)Mol Ther10,1011-1022；Rothbard et al.(2004)J Am Chem Soc 126,9506-9507)。从那以后，衍生自天然或非天然序列的许多CPP已经被鉴定并且列表在不断地增加。肽已经源自单纯疱疹病毒的VP22蛋白，源自降钙素，源自抗菌肽或毒素肽，源自参与细胞周期调控的蛋白质，以及源自富含聚脯氨酸的肽(Heitz et al.(2009)Br J Pharmacol 157,195-206)。最近，已经描述了基于二级两亲的CPP的新的非共价策略。这些肽比如CADY和VEPEP-家族能够使用分子的不同侧上的亲水和疏水残基以螺旋形状自组装。WO2012/137150公开了VEPEP-6肽；US2010/0099626公开了CADY肽；并且WO2014/053880公开了VEPEP-9。
在本文引用的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容由此通过引用以其全部并入本文。
发明内容
本申请提供了对稳定和递送货物分子比如核酸有用的新类别的肽(ADGN肽)。在一方面，提供了非天然存在的肽，其包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ IDNO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，提供了非天然存在的肽，其包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽的长度是19或20个氨基酸。在一些实施方式中，肽的长度不大于50、45、40、35、30、25或20个氨基酸中的大约任一个。在一些实施方式中，肽的长度不小于50、100、200、300、400、500、1000或更多个氨基酸中的大约任一个。在一些实施方式中，肽包括L-氨基酸。在一些实施方式中，肽包括D-氨基酸。
在根据上面描述的任何肽的一些实施方式中，肽进一步包括共价连接至肽的N-端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、脂质(包括磷脂)、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，肽包括共价连接至其N-端的乙酰基。在一些实施方式中，肽进一步包括共价连接至肽的C-端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自半胱胺基团(cysteamidegroup)、半胱氨酸、硫醇、酰胺、次氨基三乙酸、羧基、直链或支链C1-C6烷基、伯胺与仲胺、栀子酸衍生物(osidic derivative)、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，肽包括共价连接至其C-端的半胱酰胺基团。在一些实施方式中，肽是“纯的”，即，不包含上面描述的任何其它部分。
在根据上面描述的任何肽的一些实施方式中，肽是订书型(stapled)。例如，在一些实施方式中，肽包括被三或六个残基分隔的两个残基之间的烃键(hydrocarbonlinkage)。在一些实施方式中，肽包括如下的氨基酸序列：
aa)KWRSSAGWRSWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:7)、
ab)KWRSSAGWRWRSLWRVRSWSR(SEQ ID NO:8)、
ac)KWRSAGWRSWRLWRVRSSWSR(SEQ ID NO:9)、
ba)KWRSSALYRSWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:10)、
bb)KWRSSALYRWRSLWRSRSWSR(SEQ ID NO:11)、
bc)KWRSALYRSWRLWRSRSSWSR(SEQ ID NO:12)、
bd)KWRSALYRWRSLWRSSRSWSR(SEQ ID NO:13)、
be)KWRSALYRWRLWRSSRSWSSR(SEQ ID NO:14)、
ca)KWRSSALYRWRSLWRSALYSR(SEQ ID NO:15)、
cb)KWRSSALYRSWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:16)、
cc)KWRSALYRWRSLWRSSALYSR(SEQ ID NO:17)、或
cd)KWRSALYRWRLWRSSALYSSR(SEQ ID NO:18)，
其中使用下标“S”标记的残基是由烃键连接的两个残基。
在根据上面描述的任一种肽的一些实施方式中，具有序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)的肽的部分形成单芯螺旋基序。在一些实施方式中，具有序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)的肽的部分形成螺旋结构，其中S或R残基在同侧上，并且W残基在另一侧上，其在螺旋的一侧上形成一片静电接触和在螺旋的另一侧上形成疏水接触。
在本发明的另一方面，提供了复合物，其包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)如上面描述的任一种ADGN肽和货物分子。在本申请的另一方面，提供了纳米颗粒，其包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)如上面描述的任一种ADGN肽和货物分子。在一些实施方式中，货物是带电的。在一些实施方式中，货物是不带电的。在一些实施方式中，货物是物理或化学修饰的。在一些实施方式中，货物是未修饰的。在一些实施方式中，货物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸选自siRNA、miRNA、反义RNA、DNA质粒、和其类似物。在一些实施方式中，核酸是寡核苷酸。在一些实施方式中，DNA质粒编码嵌合抗原受体，其包括与靶抗原特异性地结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，靶抗原选自CD19、CD20、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、BCMA、CD70、CD74、CD38、CD138、CD33、Lewis-Y、CD123、CD44v6和CS1。在一些实施方式中，核酸选自单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、和其衍生物。在一些实施方式中，核酸的长度是大约2至大约40个核苷酸。在一些实施方式中，核酸的长度是多至大约100个核苷酸。在一些实施方式中，核酸的长度大于大约100个核苷酸。在一些实施方式中，核酸包含至少一个修饰的键，比如硫代磷酸键或在包括2’-甲氧基、2’-氟和2’-O-甲氧基乙基的核糖环的2’位置处的修饰。
在根据上面描述的任何复合物或纳米颗粒的一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中货物分子与ADGN肽的摩尔比是大约1∶1至大约1∶80(包括例如大约1∶1至大约1∶5、大约1∶5至大约1∶10、大约1∶10至大约1∶15、大约1∶15至大约1∶20、大约1∶20至大约1∶25、大约1∶25至大约1∶30、大约1∶30至大约1∶35、大约1∶35至大约1∶40、大约1∶40至大约1∶45、大约1∶45至大约1∶50、大约1∶50至大约1∶55、大约1∶55至大约1∶60、大约1∶60至大约1∶65、大约1∶65至大约1∶70、大约1∶70至大约1∶75、和大约1∶75至大约1∶80中的大约任一种)。
在一些实施方式中，货物分子与装配分子(比如肽、蛋白质、抗体、脂质、磷脂、聚合物、适配体、纳米颗粒、脂质体、树状聚体、聚合物囊泡(polymerosome)、病毒载体和微团)复合以形成纳米颗粒的芯。在一些实施方式中，装配分子是如上面描述的任一种ADGN肽(例如纳米颗粒可以包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)含有ADGN肽和货物分子的芯)。在一些实施方式中，装配分子不是ADGN肽(例如，纳米颗粒可以包括含有货物分子和非ADGN肽的芯，其然后涂覆有ADGN肽)。在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括表层。在一些实施方式中，表层包括如上面描述的任一种ADGN肽。在一些实施方式中，表层包括不是ADGN肽的细胞穿透肽。在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括中间层。在一些实施方式中，中间层包括如上面描述的任一种ADGN肽。在一些实施方式中，中间层包括不是ADGN肽的细胞穿透肽。
在根据上面描述的任一种纳米颗粒的一些实施方式中，纳米颗粒包括在表面处的靶向部分。在一些实施方式中，靶向部分连接至肽(比如AGDN肽)。在一些实施方式中，肽共价连接至靶向部分。在一些实施方式中，靶向部分将纳米颗粒靶向至组织或特异性细胞。
在根据上面描述的任一种纳米颗粒的一些实施方式中，纳米颗粒的大小(直径)是大约10nm至大约300nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的大小(直径)是大约50nm至大约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的大小(直径)是大约80nm至大约140nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的大小(直径)不大于150nm、140nm、130nm、120nm、110nm或100nm中的大约任一种。
在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位的绝对值不大于大约50mV，包括例如不大于40mV、30mV、20mV、10mV、9mV、8mV、7mV、6mV或5mV中的大约任一种。在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位是大约-15至大约15mV，比如大约-5至大约10mV。
在根据上面描述的任一种纳米颗粒或复合物的一些实施方式中，纳米颗粒或复合物包括多种货物分子。在一些实施方式中，纳米颗粒或复合物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的货物分子(比如核酸)中的大约任一种。在一些实施方式中，货物具有相同的种类(例如，多种miRNA或siRNA)。在一些实施方式中，货物具有不同的种类。
在一些实施方式中，提供了组合物(比如药物组合物)，其包括上面描述的任一种纳米颗粒。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径是大约10nm至大约300nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径是大约50nm至大约200nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径是大约80nm至大约140nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径不大于150nm、140nm、130nm、120nm、110nm或100nm中的大约任一种。在一些实施方式中，组合物具有不大于0.1、0.2、0.3、0.4或0.5的多分散指数中的大约任一种。在一些实施方式中，组合物内的纳米颗粒包括相同的ADGN肽和货物分子。在一些实施方式中，组合物内的纳米颗粒包括不同的ADGN肽和/或货物分子。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物是纳米颗粒的液体悬浮液。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物被冷冻干燥。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物在室温下或在冷冻条件下稳定至少24小时、48小时、72小时、4天、10天、30天、60天、三个月、四个月、五个月、六个月、或更久中的大约任一种，例如没有沉淀、聚集、大小改变、和/或功效损失。
在本申请的另一方面，提供了药物组合物，其包括如上面描述的复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物被配制用于静脉内、瘤内、动脉内、外用、眼内、眼部、颅内、鞘内、囊内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服施用。在一些实施方式中，药学上可接受的载体包括糖或蛋白质。在一些实施方式中，糖选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和其组合，并且任选地以大约5％至大约20％的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方式中，蛋白质是白蛋白。在一些实施方式中，药物组合物被冷冻干燥。
在本申请的又另一方面，提供了制备如上面描述的纳米颗粒的方法，其包括a)使如上面描述的ADGN肽与货物分子组合以形成混合物，和b)培育混合物以形成纳米颗粒。
在本申请的另一方面，提供了稳定货物分子(比如核酸)的方法，其包括使货物分子与如上面描述的ADGN肽组合，从而稳定货物分子。在一些实施方式中，货物分子和ADGN肽形成如上面描述的复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，货物分子是核酸并且ADGN肽稳定核酸的超螺旋结构。在一些实施方式中，货物分子易于降解(例如在体外或体内通过血清组分或核酸酶)，并且ADGN肽保护货物分子免于降解。
在本申请的进一步方面，提供了治疗个体中的疾病的方法，其包括给个体施用有效量的如上面描述的药物组合物(例如，以复合物或纳米颗粒的形式)，所述药物组合物包括货物分子和ADGN肽。在一些实施方式中，疾病选自癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病。在一些实施方式中，疾病是癌症，比如实体瘤。
在一些实施方式中，药物组合物的施用导致调节一种或多种基因的表达。其表达可以通过本文描述的方法调节的合适的基因包括但不限于编码生长因子、细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子、激酶、转录因子或其它转录调谐子、蛋白质表达或修饰调节子、和凋亡或转移调节子的那些。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码生长因子或细胞因子，其包括但不限于EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α和wnt。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码生长因子或细胞因子，其包括但不限于EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α和wnt。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码细胞表面受体，其包括但不限于ER、PR、Her2、Her3、血管生成素受体、EGFR、FGFR、HGFR、HDGFR、IGFR、KGFR、MSFR、PDGFR、TGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、smoothened、patched、和CXCR4。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码信号传导分子或激酶，其包括但不限于KRAS、NRAS、RAF、MEK、MEKK、MAPK、MKK、ERK、JNK、JAK、PKA、PKC、PI3K、Akt、mTOR、Raptor、Rictor、MLST8、PRAS40、DEPTOR、MSIN1、S6激酶、PDK1、BRAF、FAK、Src、Fyn、Shc、GSK、IKK、PLK-1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、CDK活化激酶、ALK/Met、Syk、BTK、Bcr-Abl、RET、β-联蛋白、Mcl-1和PKN3。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码转录因子或其它转录调谐子，其包括但不限于ATF-2、Chop、c-Jun、c-Myc、DPC4、Elk-1、Ets1、Max、MEF2C、NFAT4、Sap1a、STAT、Tal、p53、CREB、Myc、NF-κB、HDAC、HIF-1α和RRM2。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码蛋白质表达或修饰调节子，其包括但不限于泛素连接酶、LMP2、LMP7、MECL-1和miRNA。在一些实施方式中，一种或多种基因中的至少一种编码凋亡或转移调节子，其包括但不限于XIAP、Bcl-2、骨桥蛋白、SPARC、MMP-2、MMP-9和uPAR。
在一些实施方式中，其中疾病是实体瘤，其表达被调节的基因可以编码在肿瘤发展和/或进展中涉及的蛋白质。在一些实施方式中，在肿瘤发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于IL-2、IL-12、干扰素-γ、GM-CSF、B7-1、胱天蛋白酶-9、p53、MUC-1、MDR-1、HLA-B7/β2-微球蛋白、Her2、Hsp27、胸苷激酶和MDA-7。
在一些实施方式中，其中疾病是血液学恶性肿瘤，其表达被调节的基因可以编码在血液学恶性肿瘤发展和/或进展中涉及的蛋白质。在一些实施方式中，在血液学恶性肿瘤发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于GLI1、CTNNB1、eIF5A、突变体DDX3X、己糖激酶II、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、ARK5、ALK、MUC1、HMGA2、HIF-1α、IRF1、RPN13、HDAC11、Rad51、Spry2、mir-146a、mir-146b、存活蛋白、MDM2、MCL1、CMYC、XBP1(剪接的和未剪接的)、SLAMF7、CS1、Erbb4、Cxcr4(沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)、Myc、Bcl2、Prdx1与Prdx2(伯基特淋巴瘤)、Bcl6、Idh1、Idh2、Smad、Ccnd2、细胞周期蛋白d1-2、B7-h1(pdl-1)和Pyk2。
在一些实施方式中，其中疾病是病毒性传染病，其表达被调节的基因可以编码在病毒性传染病发展和/或进展中涉及的蛋白质。在一些实施方式中，在病毒性传染病发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于RSV核壳体、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S,X、HBV保守序列、HIV Tat、HIV TAR RNA、人CCR5、miR-122、EBOV聚合酶L、VP24、VP40、GP/sGP、VP30、VP35、NPC1和TIM-1。
在一些实施方式中，其中疾病是遗传性疾病，其表达被调节的基因可以编码在遗传性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质。在一些实施方式中，在遗传性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于运甲状腺素蛋白、MDS1-EVI1、PRDM16、SETBP1、β-珠蛋白和LPL。
在一些实施方式中，其中疾病是老化或变性疾病，其表达被调节的基因可以编码在老化或变性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质。在一些实施方式中，在老化或变性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于角蛋白K6A、角蛋白K6B、角蛋白16、角蛋白17、p53、β-2肾上腺素能受体(ADRB2)、TRPV1、VEGF、VEGFR、HIF-1、HIF-1α和胱天蛋白酶-2。
在一些实施方式中，其中疾病是纤维化或炎性疾病，其表达被调节的基因可以编码在纤维化或炎性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质。在一些实施方式中，在纤维化或炎性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质选自SPARC、CTGF、TGFβ1、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、VEGF、血管紧张素II、TIMP、HSP47、血小板反应蛋白、CCN1、LOXL2、MMP2、MMP9、CCL2、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酸环化酶、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SOX9、抑制蛋白、PDCD4、PAI-1、NF-κB和PARP-1。
在根据上面描述的任一种治疗方法的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在本发明的另一方面，提供了将货物分子递送入细胞的方法，其包括使细胞与组合物(例如以如上面描述的复合物或纳米颗粒的形式)接触，所述组合物包括ADGN肽和货物分子。在一些实施方式中，细胞的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，货物分子是编码嵌合抗原受体的质粒，所述嵌合抗原受体包括与靶抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，靶抗原是癌症相关抗原。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括siRNA。在一些实施方式中，方法进一步包括使细胞与第二组合物(例如以如上面描述的复合物或纳米颗粒的形式)接触，所述第二组合物包括ADGN肽和siRNA。在一些实施方式中，siRNA特异性地靶向编码PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3或CTLA-4的RNA分子。
在一些实施方式中，根据上面描述的任何将货物分子递送入细胞的方法，货物分子是siRNA。
在本发明的另一方面，提供了治疗个体中的疾病的方法，其包括a)根据上面描述的任一种方法将分子递送入细胞，从而产生包括分子的修饰的细胞，其中修饰的细胞对治疗疾病是有用的；和b)将修饰的细胞施用至个体。在一些实施方式中，修饰的细胞经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用。在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，个体是人。
在本发明的又另一方面，提供了试剂盒，其包括组合物和制备如上面描述的复合物和/或纳米颗粒的说明，所述组合物包括如上面描述的任一种ADGN肽。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括组合物，其包括选自肽、蛋白质、抗体、脂质、磷脂、聚合物、适配体、纳米颗粒、脂质体、树状聚体、聚合物囊泡、病毒载体、和微团的装配分子。
附图说明
图1A显示在HeLa细胞中通过肽/siRNA颗粒体外递送GAPDH siRNA。每个实验组的从左至右的列分别对应于0nM、10nM、20nM、50nM、80nM、100nM、150nM和200nM的siRNA浓度。
图1B显示在Jurkat细胞中通过肽/siRNA颗粒体外递送GAPDH siRNA。每个实验组的从左至右的列分别对应于0nM、10nM、20nM、50nM、80nM、100nM、150nM和200nM的siRNA浓度。
图2显示在原代人成纤维细胞株中体外应用肽/SPARC siRNA复合物以刺激体外纤维化模型。
图3A通过MTT试验显示了ADGN肽和肽/siRNA复合物对Hela细胞的毒性评价。每个浓度的从左至右的列分别对应于对照、ADGN-100、ADGN-100/siRNA(1∶20)和ADGN-100/siRNA(1∶40)。
图3B通过亲环蛋白(cyclophin)mRNA水平显示了ADGN肽和肽/siRNA复合物对Hela和Jurkat细胞的毒性评价。5μM肽浓度下从上至下的线分别对应于ADGN-100/siRNA(1∶40)、对照、ADGN-100(1∶20)和ADGN-100。
图4显示通过静脉内施用ADGN肽/细胞周期蛋白B1siRNA复合物抑制HT-29肿瘤生长。51天处从上至下的线分别对应于对照siRNA、PBS、Cyc-B1(5μg)和CycB1(10μg)。
图5显示通过静脉内施用ADGN肽/细胞周期蛋白B1、ADGN肽/cdc20、或ADGN肽/细胞周期蛋白B1/cdc20siRNA复合物的组合抑制HT-29肿瘤生长。48天处从上至下的线分别对应于对照siRNA、PBS、Cdc20(5μg)、Cyc-B1(5μg)和Cyc-B1/Cdc20。
图6A显示了在单次静脉内注射ADGN-100/siRNA复合物之后，Alexa700-标记的siRNA生物分布在多种间隔下的体内成像。
图6B显示了在单次皮下注射ADGN-100/siRNA复合物之后，Alexa700-标记的siRNA生物分布在多种间隔下的体内成像。
图7A显示了在BALB/c小鼠中单次静脉内注射ADGN-100/siRNA复合物之后，Alexa700-标记的siRNA在多种间隔下的组织分布。
图7B显示了在HT-29荷瘤小鼠中单次静脉内注射ADGN-100/siRNA复合物之后，Alexa700-标记的siRNA在多种间隔下的组织分布。
图7C显示了在HT-29荷瘤小鼠中单次皮下注射ADGN-100/siRNA复合物之后，Alexa700-标记的siRNA在多种间隔下的组织分布。
图8A显示了静脉内或皮下注射ADGN-100/siRNA复合物后的相对因子VII活性；包括注射裸(naked)siRNA用于比较。
图8B显示了小鼠在所有处理组中的重量稳定性。
图9显示了在通过ADGN-100、VEPEP-9、lipofectamine、或无载体(游离质粒)介导的转染之后，萤光素酶报告分子在T细胞系中的表达。
图10显示了转染有与ADGN-100或VEPEP-9复合的YFP报告分子的293T和K562细胞系的流式细胞术分析。
图11显示了在通过ADGN-100介导的转染之后，293T或K562细胞中YFP报告分子随着时间的表达。
图12A显示了在通过ADGN-100介导的转染之后稳定地表达YFP报告分子的293T细胞的荧光显微镜检查。
图12B显示了在通过ADGN-100介导的转染之后稳定地表达YFP报告分子的293T细胞的流式细胞术分析。
图13显示了ADGN-100/抗-CD-19CAR载体复合物在20∶1和30∶1的摩尔比下的原代T细胞中的转染效率；结果归一化为未转染的细胞。
图14显示了使用7-AAD通过流式细胞术测定的原代T细胞在转染有ADGN-100/抗-CD-19CAR载体复合物之后的生存力；结果归一化为未转染的细胞。
图15显示了ADGN-100、CADY、VEPEP-6和VEPEP-9肽的三维结构模型，其显示了螺旋和芳香族与静电片(patch)的位置。
图16通过MTT试验显示了ADGN、CADY、VEPEP-6与VEPEP-9肽和肽/siRNA复合物对Hela细胞的毒性评价。20μM肽浓度下从上至下的线分别对应于ADGN-100/siRNA、CADY/siRNA、对照、VEPEP-6/siRNA、VEPEP-9/siRNA、ADGN-100、CADY、VEPEP-6、VEPEP-9。
图17显示了通过ADGN和VEPEP-6肽的miRNA递送的体外比较。
图18显示了通过ADGN、VEPEP-6和VEPEP-9肽的siRNA递送的体内比较。51天处从上至下的线分别对应于对照siRNA、PBS、VEPEP-9/Cyc-B1、VEPEP-6/Cyc-B1和ADGN/Cyc-B1。
具体实施方式
本申请提供了适于稳定和递送货物分子比如核酸的新型肽(在本文称为“ADGN肽”)。ADGN肽包括二级两亲的肽，其与任何先前已知的细胞穿透肽具有差的序列同一性。与先前已知的细胞穿透肽比如CADY和VEPEP-6——每个包含多个短螺旋基序——不同，ADGN肽包含单个核心螺旋基序。螺旋基序使一侧上的S或R残基和另一侧上的W残基暴露，形成与先前报道的那些显著不同的表面。显著地，由ADGN肽和货物分子形成的复合物(比如纳米颗粒)包含较低的净剩余正电荷(例如，接近中性)。进一步，虽然一般理解的是高的净剩余正电荷对细胞穿透是必需的，但是与先前已知的细胞穿透肽比较ADGN肽显示了改进的货物递送的功效。ADGN技术通过促进小的寡核苷酸比如siRNA或反义分子的基因递送和细胞摄取二者构成了T细胞工程的有效的非病毒递送系统。ADGN技术与病毒载体相比更不复杂，毒性更小并且易于使用。
因而，本申请在一方面提供了新型ADGN肽，其在下面更详细地进一步描述。
另一方面，提供了通过使用ADGN肽稳定货物分子的方法和递送货物分子的方法。
另一方面，提供了复合物或纳米颗粒，其包括ADGN肽和货物分子。
还提供了包括ADGN肽和货物分子的药物组合物(例如以复合物和纳米颗粒的形式)，和其治疗疾病的用途。
如本文使用的，除非另外指示，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指代物。
在本文提及“大约”值或参数包括(和描述)针对该值或参数自身的实施方式。例如，提及“大约X”的描述包括“X”的描述。
本发明的组合物和方法可以包括本文描述的发明的必需要素和限制，以及本文描述的或另外有用的任何额外的或任选的成分、组分或限制，或由其构成或基本上由其构成。
除非另外说明，根据常规用法使用技术术语。
本发明的肽
本发明提供了ADGN肽，其能够与多种货物分子比如小的寡核苷酸或质粒DNA形成稳定的复合物和纳米颗粒。
在一些实施方式中，提供了肽(例如非天然存在的肽)，其包括下列氨基酸序列：
X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中
X1是任意氨基酸或无，并且
X2-X8是任意氨基酸。
在一些实施方式中，具有序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)的肽的部分形成单个核心螺旋基序。在一些实施方式中，具有序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)的肽的部分形成螺旋结构，其中S或R残基在相同侧上，并且W残基在另一侧上，在螺旋的另一侧上形成静电接触和疏水接触的片。在一些实施方式中，肽相对于VEPEP-6或CADY细胞穿透肽具有降低的毒性。在一些实施方式中，肽的长度是19或20个氨基酸。在一些实施方式中，肽的长度不大于50、45、40、35、30、25或20个氨基酸中的大约任一种。在一些实施方式中，肽的长度不小于50、100、200、300、400、500、1000或更多个氨基酸中的大约任一种。在一些实施方式中，肽包括L-氨基酸。在一些实施方式中，肽包括D-氨基酸。
在一些实施方式中，肽包括下列氨基酸序列：
X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中
X1是βA、S或无，
X2是A或V，
X3是G或L，
X4是W或Y，
X5是V或S，
X6是R、V或A，
X7是S或L，并且
X8是W或Y。
在一些实施方式中，肽包括如下的氨基酸序列：
a)KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、
b)KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)、或
c)KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一些实施方式中，肽包括如下的氨基酸序列：
X1KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:5)，其中
X1是βA、S或无。
在一些实施方式中，肽具有选自如下的一种或多种特征：
a)一个或多个SR基序、
b)一个或多个W或Y残基、和
c)R残基。
在一些实施方式中，当在溶液中游离时，肽保持大部分是未折叠的。在一些实施方式中，肽能够在货物分子的存在下采取至少部分螺旋结构。在一些实施方式中，螺旋结构是螺旋，比如，但不限于α-螺旋。在一些实施方式中，肽贯穿大于大约50％(比如大于55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％和95％中的大约任一种)的其长度采取螺旋结构。在一些实施方式中，螺旋结构主要位于肽的核心基序，其中核心基序是氨基酸序列RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:6)，并且其中X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，肽包括单个螺旋基序。在一些实施方式中，单个螺旋基序在核心基序中。在一些实施方式中，螺旋结构被配置，以便S和R残基中的至少2个(比如至少3、4、5、6、7或8中的任一种)在螺旋结构的一侧上并且W残基中的至少1个(比如至少2、3、4或5中的任一种)在螺旋结构的相对侧上。在一些实施方式中，大多数S和R残基在螺旋结构的一侧上并且大多数W残基在螺旋结构的相对侧上。在一些实施方式中，所有S和R残基在螺旋结构的一侧上并且所有W残基在螺旋结构的相对侧上。在一些实施方式中，螺旋结构被配置，以便在螺旋结构的一侧上形成静电接触的片和在螺旋结构的另一侧上形成疏水接触的片。在一些实施方式中，肽在货物分子的存在下采取单个螺旋。
在一些实施方式中，肽——当复合至货物分子时——与复合至相同货物分子的先前描述的CPP(比如CADY或VEPEP-6)相比具有较低的净剩余正电荷。在一些实施方式中，肽——当复合至货物分子时——具有如下净剩余正电荷：小于大约80％(比如小于70％、60％、50％、40％、30％或20％中的大约任一种)的复合至相同货物分子的先前描述的CPP的净剩余正电荷。在一些实施方式中，先前描述的CPP是CADY或VEPEP-6。
表1：ADGN肽和先前描述的肽的序列
在一些实施方式中，ADGN肽进一步包括连接至肽的N-端的一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分共价连接至肽的N-端。在一些实施方式中，一个或多个部分选自乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，一个或多个部分是乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，肽包括连接至其N-端的乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，肽包括连接至其N-端的乙酰基。在一些实施方式中，肽包括连接至其N-端的硬脂酰基。在一些实施方式中，肽包括共价连接至其N-端的乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，肽包括共价连接至其N-端的乙酰基。在一些实施方式中，肽包括共价连接至其N-端的硬脂酰基。
在一些实施方式中，ADGN肽进一步包括连接至肽的C-端的一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分共价连接至肽的C-端。在一些实施方式中，一个或多个部分选自半胱酰胺基团、半胱氨酸、硫醇、酰胺、次氨基三乙酸、羧基、直链或支链C1-C6烷基、伯胺与仲胺、栀子酸衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，一个或多个部分是半胱酰胺基团。在一些实施方式中，肽包括连接至其C-端的半胱酰胺基团。在一些实施方式中，肽包括共价连接至其C-端的半胱酰胺基团。
在一些实施方式中，ADGN肽是订书型。如本文使用的“订书型”指的是肽中的两个残基之间的化学键。在一些实施方式中，ADGN肽是订书型，其包括肽的两个氨基酸之间的化学键。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸被3或6个氨基酸分隔。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸被3个氨基酸分隔。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸被6个氨基酸分隔。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸中的每个是R或S。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸中的每个是R。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸中的每个是S。在一些实施方式中，由化学键连接的两个氨基酸中的一个是R并且另一个是S。在一些实施方式中，化学键是烃键。
在一些实施方式中，ADGN肽是订书型并且包括如下的氨基酸序列：
aa)KWRSSAGWRSWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:7)、
ab)KWRSSAGWRWRSLWRVRSWSR(SEQ ID NO:8)、
ac)KWRSAGWRSWRLWRVRSSWSR(SEQ ID NO:9)、
ba)KWRSSALYRSWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:10)、
bb)KWRSSALYRWRSLWRSRSWSR(SEQ ID NO:11)、
bc)KWRSALYRSWRLWRSRSSWSR(SEQ ID NO:12)、
bd)KWRSALYRWRSLWRSSRSWSR(SEQ ID NO:13)、
be)KWRSALYRWRLWRSSRSWSSR(SEQ ID NO:14)、
ca)KWRSSALYRWRSLWRSALYSR(SEQ ID NO:15)、
cb)KWRSSALYRSWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:16)、
cc)KWRSALYRWRSLWRSSALYSR(SEQ ID NO:17)、或
cd)KWRSALYRWRLWRSSALYSSR(SEQ ID NO:18)，
并且其中使用下标“S”标记的残基是由烃键连接的两个残基。
复合物和纳米颗粒
在一些实施方式中，提供了复合物，其包括ADGN肽和货物分子。在一些实施方式中，复合物的平均大小(直径)在大约30nm和大约10微米中的任一种之间，包括例如大约50nm和大约1微米之间、大约50nm和大约400nm之间、大约100nm和大约300nm之间、和大约150nm和大约200nm之间。在一些实施方式中，复合物中肽与货物分子的摩尔比在大约100∶1和大约1∶50之间，包括例如大约50∶1和大约1∶20之间、大约20∶1和大约1∶10之间、和大约5∶1和大约1∶1之间。在一些实施方式中，复合物是基本上无毒的。在一些实施方式中，复合物包括多种货物分子。在一些实施方式中，复合物包括以预定比率存在的多种货物分子。在一些实施方式中，预定比率被选择以允许复合物在下面详细描述的任何方法中的最有效使用。
在一些实施方式中，复合物包括靶向部分。在一些实施方式中，靶向部分被连接至ADGN肽。在一些实施方式中，靶向部分被共价连接至ADGN肽。在一些实施方式中，靶向部分将复合物靶向至组织或特异性细胞类型。在一些实施方式中，组织是需要治疗的组织。在一些实施方式中，复合物包括靶向部分，其将复合物靶向至可以被复合物的货物分子治疗的组织或细胞。
在一些实施方式中，提供了纳米颗粒，其包括ADGN肽和货物分子。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均大小(直径)是大约10nm至大约300nm，包括例如大约50nm至大约200nm、大约60nm至大约180nm、大约80nm至大约140nm、和大约90nm至大约120nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中肽与货物分子的摩尔比在大约100∶1和大约1∶50之间，包括例如大约100∶1和大约1∶20之间、大约90∶1和大约1∶10之间、大约80∶1和大约1∶1之间、和大约40∶1和大约5∶1之间。在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位是大约-30mV至大约30mV，包括例如大约-25mV至大约25mV、大约-20mV至大约20mV、大约-15mV至大约15mV、大约-10mV至大约10mV、和大约-5mV至大约10mV。在一些实施方式中，纳米颗粒是基本上无毒的。在一些实施方式中，纳米颗粒包括多种货物分子。在一些实施方式中，纳米颗粒包括以预定比率存在的多种货物分子。在一些实施方式中，预定比率被选择以允许纳米颗粒在下面详细描述的任何方法中的最有效使用。
在一些实施方式中，纳米颗粒包括与装配分子复合的货物分子。货物分子和装配分子的复合物可以包括货物分子和装配分子之间的共价或非共价相互作用。在一些实施方式中，与装配分子复合的货物分子形成纳米颗粒的核心。在一些实施方式中，装配分子选自肽、蛋白质、抗体、脂质、磷脂、聚合物、适配体、纳米颗粒、脂质体、树状聚体、聚合物囊泡、病毒载体、和微团。在一些实施方式中，肽是细胞穿透肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽是如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽不是如上面描述的ADGN肽，并且包括但不限于基于PTD的肽、两亲的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽、Pep-1肽、和Pep-2肽。
在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括表层。在一些实施方式中，表层包括如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，表层包括不是如上面描述的ADGN肽的细胞穿透肽。在一些实施方式中，表层不包括肽。在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括纳米颗粒的核心和表层之间的中间层。在一些实施方式中，中间层包括如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，中间层包括不是如上面描述的ADGN肽的细胞穿透肽。在一些实施方式中，纳米颗粒包括其表面处的靶向部分。在一些实施方式中，靶向部分被连接至肽。在一些实施方式中，靶向部分被共价连接至肽。在一些实施方式中，靶向部分将纳米颗粒靶向至组织或特异性细胞类型。在一些实施方式中，组织是需要治疗的组织。在一些实施方式中，纳米颗粒包括其表面处的靶向部分，其将纳米颗粒靶向至可以被纳米颗粒的货物分子治疗的组织或细胞。
在一些实施方式中，提供了复合物，其包括货物分子(比如至少1、2、3、4、5或更多货物分子)和肽，其中肽包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，提供了复合物，其包括核酸分子(比如至少1、2、3、4、5或更多核酸分子)和肽，其中肽包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，提供了非天然存在的肽，其包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物中货物分子与肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。
在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括货物分子(比如至少1、2、3、4、5或更多货物分子)和肽，其中肽包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括核酸分子(比如至少1、2、3、4、5或更多核酸分子)和肽，其中肽包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，提供了非天然存在的肽，其包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒中货物分子与肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径不大于大约130nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的绝对ζ电位不大于大约10mV。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的多分散度不大于大约1.5。
在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括：a)核心，其包括货物分子(比如至少1、2、3、4、5或更多货物分子)和装配分子，其涂覆有b)肽，其中肽包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括核酸分子(比如至少1、2、3、4、5或更多核酸分子)和肽，其中肽包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，提供了非天然存在的肽，其包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒中货物分子与肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径不大于大约130nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的绝对ζ电位不大于大约10mV。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的多分散度不大于大约1.5。在一些实施方式中，装配分子是细胞穿透肽。
在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括：a)核心，其包括货物分子(比如至少1、2、3、4、5或更多货物分子)和装配分子，其涂覆有b)肽，其中肽包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括核酸分子(比如至少1、2、3、4、5或更多核酸分子)和肽，其中肽包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，提供了非天然存在的肽，其包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒中货物分子与肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径不大于大约150nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的绝对ζ电位不大于大约10mV。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的多分散度不大于大约1.5。在一些实施方式中，装配分子是细胞穿透肽(比如CADY或VEPEP-6)。在一些实施方式中，装配分子是包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)的肽，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。核心处的装配分子可以与涂层中的肽相同或不同。
在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括：a)核心，其包括货物分子(比如至少1、2、3、4、5或更多货物分子)和肽，其涂覆有b)表层，其中肽包括(包括例如基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，提供了包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括核酸分子(比如至少1、2、3、4、5或更多核酸分子)和肽，其中肽包括(包括基本上由如下构成或由如下构成)氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，提供了非天然存在的肽，其包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒中货物分子与肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的平均直径不大于大约130nm。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的绝对ζ电位不大于大约10mV。在一些实施方式中，组合物中纳米颗粒的多分散度不大于大约1.5。在一些实施方式中，表层包括细胞穿透肽(比如CADY或VEPEP-6)。
在一些实施方式中，如上面描述的复合物或纳米颗粒包括靶向部分，其中靶向部分是能够细胞-特异性靶向和/或细胞核靶向的配体。细胞膜表面受体和/或细胞表面标志物是可以以高亲和力和优选地以高特异性结合所述配体的分子或结构。所述细胞膜表面受体和/或细胞表面标志物优选地特异于特定的细胞，即它主要在一种类型的细胞而不是另一种类型的细胞中被发现(例如，半乳糖残基靶向肝细胞的表面上的脱唾液酸糖蛋白受体)。细胞膜表面受体促进细胞靶向和将配体(例如靶向部分)与附加的分子(例如本发明的复合物或纳米颗粒)内化入靶细胞。在文献中广泛地描述了可以在本发明的背景中使用的大量配体部分/配体结合配偶体。这样的配体部分能够给本发明的复合物或纳米颗粒赋予结合至在至少一种靶细胞的表面处定位的给定的结合配偶体分子或一类结合配偶体分子的能力。合适的结合配偶体分子非限制性地包括多肽，其选自细胞-特异性标志物、组织-特异性标志物、细胞受体、病毒抗原、抗原表位和肿瘤相关标志物。而且，结合配偶体分子可以包括一种或多种糖、脂质、糖脂或抗体分子或由其构成。根据本发明，配体部分可以是例如脂质、糖脂、激素、糖、聚合物(例如PEG、聚赖氨酸、PET)、寡核苷酸、维生素、抗原、凝集素的全部或部分、多肽——比如例如JTS1(WO 94/40958)——的全部或部分、抗体或其片段、或其组合。在一些实施方式中，在本发明中使用的配体部分是具有最小长度为7个氨基酸的肽或多肽。它是天然多肽或衍生自天然多肽的多肽。“衍生的”意思是包含(a)关于天然序列的一种或多种修饰(例如一种或多种残基的添加、缺失和/或置换)，(b)氨基酸类似物，其包括非天然存在的氨基酸，(c)置换的键，或(d)本领域已知的其它修饰。充当配体部分的多肽涵盖变体和通过融合多种起源的序列获得的嵌合多肽，比如例如人源化抗体，其组合小鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。此外，这样的多肽可以具有线性或环化结构(例如通过在两端处使多肽配体侧接半胱氨酸残基)。另外，通过置换或添加化学部分(例如糖基化、烷基化、乙酰化、酰胺化、磷酸化、添加巯基等)，用作配体部分的多肽可以包括其原始结构的修饰。本发明进一步考虑致使配体部分可检测的修饰。出于此目的，可以设计具有可检测的部分的修饰(即闪烁照相、放射或荧光部分、或染料标记等)。这样的可检测的标记可以通过任何常规技术附加至配体部分并且可以用于诊断目的(例如肿瘤细胞的成像)。在一些实施方式中，结合配偶体分子是抗原(例如靶细胞-特异性抗原、疾病-特异性抗原、在工程化靶细胞的表面上特异性表达的抗原)并且配体部分是抗体、其片段或最小识别单位(例如仍呈递抗原特异性的片段)，比如在免疫学手册(参见例如Immunology,第三版1993,Roitt,Brostoff和Male,ed Gambli,Mosby)中详细描述的那些。配体部分可以是单克隆抗体。结合许多这些抗原的许多单克隆抗体是已知的，并且使用与单克隆抗体技术有关的本领域已知的技术，可以制备大部分抗原的抗体。配体部分可以是抗体的一部分(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如，ScFv)。在一些实施方式中，配体部分选自抗体片段，而不是完整抗体。完整抗体的有效功能比如补体结合被去除。ScFv和dAb抗体片段可以表达为与一种或多种其它多肽的融合。最小识别单位可以源自Fv片段的互补决定区(CDR)中的一个或多个的序列。完整抗体和F(ab')2片段是“二价的”。“二价的”的意思是所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab、Fv、ScFv、dAb片段和最小识别单位是单价的，其仅具有一个抗原结合位点。在一些实施方式中，配体部分允许靶向至肿瘤细胞并且能够识别和结合至与肿瘤状态相关的分子，比如肿瘤-特异性抗原、在肿瘤细胞中差异表达或过表达的细胞蛋白或癌症相关波形蛋白(vim)的基因产物。肿瘤-特异性抗原的实例包括但不限于与乳腺癌相关的MUC-1(Hareuven i et al.,990,Eur.J.Biochem 189,475-486)、与乳腺癌和卵巢癌相关的由突变的BRCAl和BRCA2基因编码的产物(Miki et al,1994,Science 226,66-7 1；Fuireal et al,1994,Science 226,120-122；Wooster et al.,1995,Nature 378,789-792)、与结肠癌相关的APC(Poiakis,1995,Curr.Opin.Genet.Dev.5,66-71)、与前列腺癌相关的前列腺特异性抗原(PSA)(Stamey et al.,1987,New England J.Med.317,909)、与结肠癌相关的癌胚抗原(CEA)(Schrewe et al.,1990,Mol.Cell.Biol.10,2738-2748)、与黑色素瘤相关的酪胺酶(Vile et al,1993,Cancer Res.53,3860-3864)、在黑色素瘤细胞中高度表达的促黑素细胞激素(MSH)的受体、与乳腺癌和前列腺癌相关的ErbB-2(Harris etal.,1994,Gene Therapy 1,170-175)、和与肝癌相关的甲胎蛋白(Kanai et al.,1997,Cancer Res.57,46 1-465)。在一些实施方式中，配体部分是能够识别和结合至MUC-1抗原并且因而靶向MUC-1阳性肿瘤细胞的抗体的片段。在一些实施方式中，配体部分是识别MUC-1抗原的串联重复区的SM3单克隆抗体的scFv片段(Burshell et al.,1987,CancerRes.47,5476-5482；Girling et al.,1989,Int.J.Cancer 43,1072-1076；Dokurno etal.,1998,J.Mol.Biol.284,713-728)。在肿瘤细胞中差异表达或过表达的细胞蛋白的实例包括但不限于在一些淋巴肿瘤中过表达的白介素2(IL-2)的受体，在肺癌细胞、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤和胃肿瘤中过表达的GRP(胃泌素释放肽)(Michael et al.,1995,GeneTherapy 2,660-668)，TNF(肿瘤坏死因子)受体，表皮生长因子受体，Fas受体，CD40受体，CD30受体，CD27受体，OX-40，α-v整合素(Brooks et al,994,Science 264,569)和某些血管生成生长因子的受体(Hanahan,1997,Science 277,48)。基于这些指示，限定能够识别和结合至这样的蛋白质的适当的配体部分在本领域技术人员的范围内。为了说明，IL-2是结合至TL-2受体的合适的配体部分。在特异于纤维化和炎症的受体的情况下，这些包括在上面确认的并且是用于本发明组合物的合适靶标的TGFβ受体或腺苷受体。多发性骨髓瘤的细胞表面标志物包括但不限于CD56、CD40、FGFR3、CS1、CD138、IGF1R、VEGFR和CD38，并且是用于本发明组合物的合适靶标。结合至这些细胞表面标志物的合适的配体部分包括但不限于抗-CD56、抗-CD40、PRO-001、Chir-258、HuLuc63、抗-CD138-DM1、抗-IGF1R和贝伐单抗(bevacizumab)。
货物分子
在一些实施方式中，如上面描述的复合物或纳米颗粒的货物分子是核酸。在一些实施方式中，货物分子选自寡核苷酸，多核苷酸，单链或双链寡核苷酸与多核苷酸，反义寡核苷酸，多种形式的RNAi——其包括例如siRNA、shRNA等，微RNA(miRNA)，antagomir，核酶，适配体，质粒DNA等和其一种或多种的合适的组合。在一些实施方式中，货物分子是蛋白质，比如例如酶或抗体，或小分子。在一些实施方式中，纳米颗粒包括多种货物分子，其包括核酸与蛋白质或小分子的组合。在一些实施方式中，组合包括彼此共价连接的核酸与蛋白质或小分子。在一些实施方式中，组合包括彼此不共价连接的核酸与蛋白质或小分子。
如本文可交换地使用的“多核苷酸”或“核酸”指的是任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或通过DNA或RNA聚合酶可以并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，比如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如本文使用的术语“核酸”指的是以单链或双链形式包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物并且包括DNA和RNA。DNA可以是，例如，反义分子、质粒DNA、预浓缩的DNA、PCR产物、载体(PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些组的衍生物和组合的形式。RNA可以是siRNA、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、RNA、病毒RNA(vRNA)、和其组合的形式。核酸包括包含已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，其包括例如锁定核酸(LNA)、解锁核酸(unlocked nucleic acid)(UNA)和拉链核酸(zip nucleic acid)(ZNA)，其可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且其具有与参考核酸类似的结合性质。这样的类似物的实例非限制性地包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、和肽-核酸(PNA)。除非特别地限定，该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物——其具有与参考核酸类似的结合性质——的核酸。除非另外指示，具体的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP、和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子置换可以通过生成序列实现，其中一种或多种选择的(或所有)密码子的第三位被置换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基(Batzer e al.,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka et a.,j.Biol.Chern.,260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”包含糖——脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然类似物、和嘌呤与嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于修饰，所述修饰放置新的活性基团，比如，但不限于胺、醇、硫醇、羧化酶和卤代烷。如本文使用的，“寡核苷酸”通常指的是短的、一般合成的多核苷酸，其长度通常但不必然小于大约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。上面对多核苷酸的描述同等地和完全地适用于寡核苷酸。
在一些实施方式中，核酸是单链寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸是双链寡核苷酸。本文描述的核酸在反义寡核苷酸、RNAi、siRNA、shRNA、iRNA、antagomir的情况下可以是多至但不必然200个核苷酸的长度范围中的任一种，或在质粒DNA的情况下可以是多至1,000,000个碱基。
在一些实施方式中，核酸是干扰RNA，比如siRNA或shRNA。术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”指的是当干扰RNA在与靶基因或序列相同的细胞中时能够降低或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过调节降解或抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译)的单链RNA(例如，成熟的miRNA)或双链RNA(即，双链体RNA比如siRNA、aiRNA或miRNA前体)，因而，干扰RNA指的是与靶mRNA序列互补的单链RNA或通过两条互补链或通过一条自互补链形成的双链RNA。干扰RNA可以具有与靶基因或序列的基本或完全同一性，或可以包括错配区域(即，错配基序)。干扰RNA的序列可以对应于全长靶基因，或其子序列。干扰RNA包括“小-干扰RNA”或“siRNA”，例如，长度为大约15-60、15-50或5-40个(双链体)核苷酸，更通常地长度为大约15-30、15-25或19-25个(双链体)核苷酸，并且优选地是长度为大约20-24、21-22或21-23个(双链体)核苷酸的干扰RNA(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度是15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸，优选地大约20-24、21-22或21-23个核苷酸，并且双链siRNA的长度是大约15-60、15-50、15-40、5-30、5-25或19-25个碱基对，优选地大约8-22、9-20或19-21个碱基对)。siRNA双链体可以包括大约1至大约4个核苷酸或大约2至大约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。siRNA的实例非限制性地包括由两个分离的链分子装配的双链多核苷酸分子，其中一条链是有义链并且另一条是互补反义链；由单链分子装配的双链多核苷酸分子，其中有义和反义区通过基于核酸或非基于核酸的连接体被连接；具有发夹二级结构——其具有自互补的有义和反义区——的双链多核苷酸分子；和具有两个或更多个环结构和茎——其具有自互补的有义和反义区——的环状单链多核苷酸分子，其中环状多核苷酸可以被体内或体外加工以生成活性双链siRNA分子。优选地，siRNA是化学合成的。siRNA还可以通过使用大肠杆菌RNA酶III或切酶切割较长的dsRNA(例如，长度大于大约25个核苷酸的dsRNA)生成。这些酶将dsRNA加工为生物活性siRNA(参见，例如，Yang etal.,Proc Natl.Acad.Set.USA,99:9942-9947(2002)；Calegari et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14236(2002)；Byrom et al.,Ambion TeehNotes,10(l):4-6(2003)；Kawasaki et al.,Nucleic Acid Res.,3 1:981-987(2003)；Knight et al.,Science,293:2269-2271(2001)；and Robertson et al.,J.Biol.Chem.,243:82(1968))。优选地，dsRNA的长度是至少50个核苷酸至大约100、200、300、400或500个核苷酸。dsRNA的长度可以长达1000、1500、2000、5000个核苷酸或更长。dsRNA可以编码整个基因转录物或部分基因转录物。在某些情况下，siRNA可以被质粒(例如，转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列)编码。小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是制造紧密发夹弯(tight hairpinturn)——其可以用于经由RNA干扰沉默基因表达——的RNA的序列。shRNA发夹结构被细胞机器切割为siRNA，其然后被结合至RNA-诱导的沉默复合物(RISC)。此复合物结合至并且切割mRNA，其匹配结合至其的siRNA。干扰RNA的合适的长度是大约5至大约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，干扰RNA基本上互补(比如至少大约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更同一)于对应的靶基因。在一些实施方式中，干扰RNA被修饰，例如通过并入非天然存在的核苷酸。
在一些实施方式中，核酸是双链反义RNA。干扰RNA的合适的长度是大约5至大约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，干扰RNA基本上互补(比如至少大约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更多同一)于对应的靶基因。在一些实施方式中，反义RNA被修饰，例如通过并入非天然存在的核苷酸。
在一些实施方式中，核酸是干扰RNA，比如siRNA，其特异性地靶向编码在疾病比如癌症中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，疾病是癌症，比如实体瘤或血液学恶性肿瘤，并且干扰RNA靶向编码在癌症中涉及的蛋白质——比如在调控癌症的进展中涉及的蛋白质——的mRNA。
在一些实施方式中，核酸是干扰RNA，比如siRNA，其特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。
在一些实施方式中，核酸是miRNA。微RNA(简称miRNA)是在真核细胞中发现的短的核糖核酸(RNA)分子。微RNA分子与其它RNA比较具有非常少的核苷酸(平均22个)。miRNA是结合至靶标信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列的转录后调节子，其通常导致翻译阻遏或靶标降解和基因沉默。人基因组可以编码超过1000个miRNA，其可以靶向大约60％的哺乳动物基因并且在许多人细胞类型中丰富。miRNA的合适的长度是大约5至大约200个核苷酸，或0-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，miRNA基本上互补(比如至少大约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更多同一)于对应的靶基因。在一些实施方式中，反义RNA被修饰，例如通过并入非天然存在的核苷酸。
在一些实施方式中，核酸是质粒DNA或DNA片段(例如多至大约1000bp的长度的DNA片段)。此外，质粒DNA或DNA片段可以被超甲基化或去甲基化。在一些实施方式中，质粒DNA或DNA片段编码一种或多种基因，并且可以包含表达所述一种或多种基因必需的调控元件。在一些实施方式中，质粒DNA或DNA片段可以包括编码可选择的标志物的一种或多种基因，使得在适当的宿主细胞中维持质粒DNA或DNA片段。
在一些实施方式中，质粒DNA包括编码嵌合抗原受体(CAR)——其包括与靶抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域——的DNA序列。例如，在美国专利号8,822,647、美国专利申请公布号2015/0051266、WO 2014/127261和WO2014099671中描述了CAR，其公开内容通过引用以其全部具体地并入本文。在一些实施方式中，靶抗原是与癌细胞特异性相关联(比如由癌细胞表达)的抗原。例如，在一些实施方式中，质粒DNA包括编码CAR——其包括与癌症相关抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域——的DNA序列。在一些实施方式中，癌症相关抗原与实体瘤相关联。在一些实施方式中，癌症相关抗原与血液学恶性肿瘤比如B细胞恶性肿瘤或白血病相关联。在一些实施方式中，靶抗原包括，例如，CD19、CD20、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、BCMA、CD70、CD74、CD38、CD138、CD33、Lewis-Y、CD123、CD44v6和CS1。
因而，在一些实施方式中，质粒DNA包括编码CAR——其包括与癌症相关抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，所述癌症相关抗原与血液学恶性肿瘤相关联——的DNA序列。在一些实施方式中，血液学恶性肿瘤是B细胞恶性肿瘤，并且癌症相关抗原包括，例如，CD19、CD20、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27和HVEM。在一些实施方式中，血液学恶性肿瘤是白血病，比如急性髓性白血病，并且癌症相关抗原包括，例如，BCMA、CD70、CD74、CD38、CD138、CD33、Lewis-Y、CD123、CD44v6和CS1。
组合物
在一些实施方式中，提供了组合物，其包括如上面描述的复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，其包括如上面描述的复合物或纳米颗粒和药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物中复合物或纳米颗粒的浓度是大约1nM至大约100mM，包括例如大约10nM至大约50mM、大约25nM至大约25mM、大约50nM至大约10mM、大约100nM至大约1mM、大约500nM至大约750μM、大约750nM至大约500μM、大约1μM至大约250μM、大约10μM至大约200μM、和大约50μM至大约150μM。
如本文使用的术语“药学上可接受的稀释剂、赋形剂、和/或载体”意欲包括与施用至人或其它脊椎动物宿主相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂与抗真菌剂、等渗剂与吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂、和/或载体是被联邦管理机构、州政府、或其它管理机构批准的，或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物——包括人以及非人哺乳动物——的稀释剂、赋形剂、和/或载体。术语稀释剂、赋形剂、和/或“载体”指的是使用其施用药物组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂、或媒介。这样的药物稀释剂、赋形剂、和/或载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水、盐水溶液和水性葡萄糖与甘油溶液可以被采用作为液体稀释剂、赋形剂、和/或载体，特别地用于可注射的溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。组合物，如果需要，还可以包含微量的湿润剂、膨胀剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等的形式。合适的药物稀释剂、赋形剂、和/或载体的实例被描述在E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中。制剂应当适合施用模式。适当的稀释剂、赋形剂、和/或载体对本领域技术人员将是显而易见的并且将在很大程度上取决于施用途径。
在一些实施方式中，如上文描述的药物组合物被配制用于静脉内、瘤内、动脉内、外用、眼内、眼部、颅内、鞘内、囊内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服施用。
在一些实施方式中，发现适合治疗人或哺乳动物对象的本发明的药物组合物的剂量在0.001mg/kg-100mg/kg的货物分子的范围中。在一些实施方式中，剂量范围是0.1-20mg/kg。在一些实施方式中，剂量范围在0.5-10mg/kg的范围中。在一些实施方式中，给个体的药物组合物的施用方案在构成整个治疗的单次施用至每日施用的范围内。在一些实施方式中，施用是每3-30天一次。在一些实施方式中，施用是每4-7天一次。
在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包括如上面描述的复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体是糖或蛋白质。在一些实施方式中，糖选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和其组合，并且以大约5％至大约20％的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方式中，糖是蔗糖。在一些实施方式中，糖是葡萄糖。在一些实施方式中，糖是甘露醇。在一些实施方式中，蛋白质是白蛋白。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方式中，药物组合物被冷冻干燥。
制备方法
在一些实施方式中，提供了制备如上面描述的复合物或纳米颗粒的方法，其包括a)使包括如上面描述的ADGN肽的组合物与包括如上面描述的货物分子的组合物组合以形成混合物，和b)培育混合物以形成复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，包括ADGN肽的组合物是原液，其包括大约0.1mg/ml至大约10mg/ml——包括例如大约0.2mg/ml至大约5mg/ml、大约0.5mg/ml至大约2.5mg/ml、大约0.75mg/ml至大约1.5mg/ml、和大约1mg/ml——的浓度下的ADGN肽。在一些实施方式中，包括ADGN肽的原液被超声大约2min至大约20min，包括例如大约5min至大约15min、和大约10min。在一些实施方式中，货物分子是核酸，并且包括货物分子的组合物是包括核酸的原液。在一些实施方式中，核酸是如上面描述的寡核苷酸，并且包括核酸的原液包括大约1μM至大约20μM——包括例如大约2μM至大约15μM、大约3μM至大约10μM、大约4μM至大约8μM、和大约5μM——的浓度下的寡核苷酸。在一些实施方式中，包括寡核苷酸的原液在水中配制。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，包括寡核苷酸的原液在缓冲液中配制。在一些实施方式中，核酸是质粒，并且包括核酸的原液包括大约20μM至大约500μM——包括例如大约30μM至大约400μM、大约40μM至大约300μM、大约50μM至大约200μM、大约75μM至大约150μM、和大约100μM——的浓度下的质粒。在一些实施方式中，包括质粒的原液在水中配制。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，包括质粒的原液在缓冲液中配制。在一些实施方式中，缓冲液是本领域已知用于储存质粒的任何缓冲液，包括例如包括Tris和EDTA的缓冲液，其中Tris在大约10mM至大约100mM——包括例如大约20mM至大约80mM、大约30mM至大约70mM、大约40mM至大约60mM、和大约50mM——的浓度下，并且其中EDTA在大约0.1mM至大约1mM——包括例如大约0.2mM至大约0.8mM、大约0.3mM至大约0.7mM、大约0.4mM至大约0.6mM、和大约0.5mM——的浓度下。在一些实施方式中，方法包括使包括ADGN肽的原液和包括核酸的原液在水性介质中组合以形成混合物。在一些实施方式中，水性介质是水，包括例如蒸馏水。在一些实施方式中，水性介质是缓冲液，包括例如PBS、Tris、或本领域已知用于稳定核蛋白复合物的任何缓冲液。在一些实施方式中，混合物中ADGN肽与核酸的摩尔比是大约1∶5至大约80∶1，包括例如大约5∶1至大约40∶1，和1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1中的大约任一种。在一些实施方式中，混合物被培育以形成复合物或纳米颗粒，所述培育持续大约10min至60min，包括例如持续20min、30min、40min和50min中的大约任一种，在大约2℃至大约50℃，包括例如大约2℃至大约5℃、大约5℃至大约10℃、大约10℃至大约15℃、大约15℃至大约20℃、大约20℃至大约25℃、大约25℃至大约30℃、大约30℃至大约35℃、大约35℃至大约40℃、大约40℃至大约45℃、和大约45℃至大约50℃的温度下，从而产生包括复合物或纳米颗粒的原液。在一些实施方式中，包括复合物或纳米颗粒的原液在4℃下保持稳定至少大约三周，包括例如至少大约6周、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月中的任一种。在一些实施方式中，包括复合物或纳米颗粒的原液在载体的存在下被冷冻干燥。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以大约5％至大约20％——包括例如大约7.5％至大约17.5％、大约10％至大约15％、和大约12.5％——重量/体积存在于包括复合物或纳米颗粒的原液中。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，比如人血清白蛋白。
在一些实施方式中，提供了制备如上面描述的纳米颗粒——其包括核心和至少一个额外的层——的方法，其包括a)使包括如上面描述的装配分子的组合物与包括如上面描述的货物分子的组合物组合以形成第一混合物，b)培育第一混合物以形成纳米颗粒的核心，c)使b)的混合物与包括细胞穿透肽的组合物组合以形成第二混合物，和d)培育第二混合物以形成包括核心和至少一个额外的层的纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包括e)使包括纳米颗粒——其包括核心和至少一个额外的层——的组合物和包括细胞穿透肽的组合物组合以形成第三混合物，和f)培育第三混合物以形成纳米颗粒，其包括核心和至少两个额外的层。领会到方法可以被修改以形成包括增加数目的层的纳米颗粒。在一些实施方式中，装配分子是如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，装配分子不是如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽是如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽不是如上面描述的ADGN肽。在一些实施方式中，包括装配分子或细胞穿透肽的组合物是原液，其包括大约0.1mg/ml至大约10mg/ml——包括例如大约0.2mg/ml至大约5mg/ml、大约0.5mg/ml至大约2.5mg/ml、大约0.75mg/ml至大约1.5mg/ml、和大约1mg/ml——的浓度下的装配分子或细胞穿透肽。在一些实施方式中，包括装配分子或细胞穿透肽的原液被超声大约2min至大约20min，包括例如大约5min至大约15min、和大约10min。在一些实施方式中，货物分子是核酸，并且包括货物分子的组合物是包括核酸的原液。在一些实施方式中，核酸是如上面描述的寡核苷酸，并且包括核酸的原液包括大约1μM至大约20μM——包括例如大约2μM至大约15μM、大约3μM至大约10μM、大约4μM至大约8μM、和大约5μM——的浓度下的寡核苷酸。在一些实施方式中，包括寡核苷酸的原液在水中配制。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，包括寡核苷酸的原液在缓冲液中配制。在一些实施方式中，核酸是质粒，并且包括核酸的原液包括大约20μM至大约500μM——包括例如大约30μM至大约400μM、大约40μM至大约300μM、大约50μM至大约200μM、大约75μM至大约150μM、和大约100μM——的浓度的下的质粒。在一些实施方式中，包括质粒的原液在水中配制。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，包括质粒的原液在缓冲液中配制。在一些实施方式中，缓冲液是本领域已知用于储存质粒的任何缓冲液，包括例如包括Tris和EDTA的缓冲液，其中Tris在大约10mM至大约100mM——包括例如大约20mM至大约80mM、大约30mM至大约70mM、大约40mM至大约60mM、和大约50mM——的浓度下，并且其中EDTA在大约0.1mM至大约1mM——包括例如大约0.2mM至大约0.8mM、大约0.3mM至大约0.7mM、大约0.4mM至大约0.6mM、和大约0.5mM——的浓度下。在一些实施方式中，组合在水性介质中进行以形成混合物。在一些实施方式中，水性介质是水，包括例如蒸馏水。在一些实施方式中，水性介质是缓冲液，包括例如PBS、Tris、或本领域已知用于稳定核蛋白复合物的任何缓冲液。在一些实施方式中，混合物中细胞穿透肽与核酸的摩尔比是大约1∶5至大约80∶1，包括例如大约5∶1至大约40∶1，和1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1中的大约任一种。在一些实施方式中，混合物被培育以形成纳米颗粒，所述培育持续大约10min至60min，包括例如持续20min、30min、40min和50min中的大约任一种，在大约30℃至大约45℃，包括例如31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃和44℃中的任一种的温度下，从而产生包括纳米颗粒的原液。在一些实施方式中，包括纳米颗粒的原液在4℃下保持稳定至少大约三周。在一些实施方式中，包括纳米颗粒的原液在载体的存在下被冷冻干燥。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以大约5％至大约20％——包括例如大约7.5％至大约17.5％、大约10％至大约15％、和大约12.5％——重量/体积存在于包括复合物或纳米颗粒的原液中。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，比如人血清白蛋白。
在一些实施方式中，对于稳定的组合物，其包括本发明的复合物或纳米颗粒，复合物的平均直径的变化不超过大约10％，并且多分散指数的变化不超过大约10％。
使用方法
在一些实施方式中，提供了治疗个体中的疾病的方法，其包括给个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括如上面描述的复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包括对治疗疾病有用的一种或多种货物分子。在一些实施方式中，待治疗的疾病包括但不限于癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病。在一些实施方式中，药物组合物调节一种或多种基因的表达。在一些实施方式中，一种或多种基因编码蛋白质，其包括但不限于生长因子与细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子与激酶、转录因子与其它转录调谐子、蛋白质表达与修饰调节子、和凋亡与转移调节子。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括如上面描述的一种或多种额外的复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包括给个体施用有效量的一种或多种额外的药物组合物，其包括如上面描述的一种或多种额外的复合物或纳米颗粒。
本文使用的“调节”活性或表达意思是调控或改变基因或mRNA的状态或拷贝数或改变基因产物比如产生的蛋白质的量。在一些实施方式中，货物分子抑制靶基因的表达。在一些实施方式中，调节(比如抑制)在转录后水平下发生，在一些实施方式中，货物分子抑制基因或基因产物的表达至少0％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的大约任一种。在一些实施方式中，比如在质粒递送的情况下，货物分子可以增加基因或基因产物的表达至少10％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的大约任一种。
在上面描述的方法的一些实施方式中，一种或多种基因包括但不限于EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α、wnt、ER、PR、Her2、Her3、血管生成素受体、EGFR、FGFR、HGFR、HDGFR、IGFR、KGFR、MSFR、PDGFR、TGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、smoothened、patched、CXCR4、KRAS、NRAS、RAF、MEK、MEKK、MAPK、MKK、ERK、JNK、JAK、PKA、PKC、PI3K、Akt、mTOR、Raptor、Rictor、MLST8、PRAS40、DEPTOR、MSIN1、S6激酶、PDK1、BRAF、FAK、Src、Fyn、Shc、GSK、IKK、PLK-1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、CDK活化激酶、ALK/Met、Syk、BTK、Bcr-Abl、RET、β-联蛋白、Mcl-1、PKN、ATF-2、Chop、c-Jun、c-Myc、DPC4、Elk-1、Ets1、Max、MEF2C、NFAT4、Sap1a、STAT、Tal、p53、CREB、Myc、NF-κB、HDAC、HIF-1α、RRM2、泛素连接酶、LMP2、LMP7、MECL-1、XIAP、Bcl-2、骨桥蛋白、SPARC、MMP-2、MMP-9、uPAR、IL-2、IL-12、干扰素-γ、GM-CSF、B7-1、胱天蛋白酶-9、p53、MUC-1、MDR-1、HLA-B7/β2-微球蛋白、Her2、Hsp27、胸苷激酶、和MDA-7、GLI1、CTNNB1、eIF5A、突变体DDX3X、己糖激酶II、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、ARK5、ALK、MUC1、HMGA2、IRF1、RPN13、HDAC11、Rad51、Spry2、mir-146a、mir-146b、存活蛋白、MDM2、MCL1、CMYC、XBP1(剪接的和未剪接的)、SLAMF7、CS1、Erbb4、Cxcr4(沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)、Myc、Bcl2、Prdx1与Prdx2(伯基特淋巴瘤)、Bcl6、Idh1、Idh2、Smad、Ccnd2、细胞周期蛋白d1-2、B7-h1(pdl-1)、Pyk2、RSV核壳体、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S,X、HBV保守序列、HIV Tat、HIV TAR RNA、人CCR5、miR-122、EBOV聚合酶L、VP24、VP40、GP/sGP、VP30、VP35、NPC1、TIM-1、运甲状腺素蛋白、MDS1-EVI1、PRDM16、SETBP1、β-珠蛋白、LPL、角蛋白K6A、角蛋白K6B、角蛋白16、角蛋白17、p53、β-2肾上腺素能受体(ADRB2)、TRPV1、VEGF、VEGFR、HIF-1、胱天蛋白酶-2、SPARC、CTGF、TGFβ1、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、VEGF、血管紧张素II、TIMP、HSP47、血小板反应蛋白、CCN1、LOXL2、MMP2、MMP9、CCL2、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酸环化酶、Smad 3、Smad4、Smad 7、SOX9、抑制蛋白、PDCD4、PAI-1、NF-κB和PARP-1。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是实体瘤，并且药物组合物调节编码蛋白质的一种或多种基因的表达，所述蛋白质包括但不限于生长因子与细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子与激酶、转录因子与其它转录调谐子、蛋白质表达与修饰调节子、和凋亡与转移调节子。在一些实施方式中，生长因子或细胞因子包括但不限于EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α和wnt。在一些实施方式中，细胞表面受体包括但不限于ER、PR、Her2、Her3、血管生成素受体、EGFR、FGFR、HGFR、HDGFR、IGFR、KGFR、MSFR、PDGFR、TGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、smoothened、patched和CXCR4。在一些实施方式中，信号传导分子或激酶包括但不限于KRAS、NRAS、RAF、MEK、MEKK、MAPK、MKK、ERK、JNK、JAK、PKA、PKC、PI3K、Akt、mTOR、Raptor、Rictor、MLST8、PRAS40、DEPTOR、MSIN1、S6激酶、PDK1、BRAF、FAK、Src、Fyn、Shc、GSK、IKK、PLK-1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、CDK活化激酶、ALK/Met、Syk、BTK、Bcr-Abl、RET、β-联蛋白、Mcl-1和PKN3。在一些实施方式中，转录因子或其它转录调谐子包括但不限于ATF-2、Chop、c-Jun、c-Myc、DPC4、Elk-1、Ets1、Max、MEF2C、NFAT4、Sap1a、STAT、Tal、p53、CREB、Myc、NF-κB、HDAC、HIF-1α和RRM2。在一些实施方式中，蛋白质表达或修饰调节子包括但不限于泛素连接酶、LMP2、LMP7和MECL-1。在一些实施方式中，凋亡或转移调节子包括但不限于XIAP、Bcl-2、骨桥蛋白、SPARC、MMP-2、MMP-9、uPAR。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是实体瘤，并且药物组合物包括编码在肿瘤发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质的核酸。在一些实施方式中，在肿瘤发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质选自IL-2、IL-12、干扰素-γ、GM-CSF、B7-1、胱天蛋白酶-9、p53、MUC-1、MDR-1、HLA-B7/β2-微球蛋白、Her2、Hsp27、胸苷激酶和MDA-7。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是血液学恶性肿瘤，并且药物组合物调节一种或多种基因——其编码在血液学恶性肿瘤发展和/或进展中涉及的蛋白质——的表达。在一些实施方式中，在血液学恶性肿瘤发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于GLI1、CTNNB1、eIF5A、突变体DDX3X、己糖激酶II、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、ARK5、ALK、MUC1、HMGA2、IRF1、RPN13、HDAC11、Rad51、Spry2、mir-146a、mir-146b、存活蛋白、MDM2、MCL1、CMYC、XBP1(剪接的和未剪接的)、SLAMF7、CS1、Erbb4、Cxcr4(沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)、Myc、Bcl2、Prdx1与Prdx2(伯基特淋巴瘤)、Bcl6、Idh1、Idh2、Smad、Ccnd2、细胞周期蛋白d1-2、B7-h1(pdl-1)和Pyk2。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是病毒性传染病，并且药物组合物调节一种或多种基因——其编码在病毒性传染病发展和/或进展中涉及的蛋白质——的表达。在一些实施方式中，在病毒性传染病发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于RSV核壳体、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S,X、HBV保守序列、HIV Tat、HIV TARRNA、人CCR5、miR-122、EBOV聚合酶L、VP24、VP40、GP/sGP、VP30、VP35、NPC1和TIM-1。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是遗传性疾病，并且药物组合物调节一种或多种基因——其编码在遗传性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质——的表达。在一些实施方式中，在遗传性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于运甲状腺素蛋白、MDS1-EVI1、PRDM16、SETBP1、β-珠蛋白和LPL。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是老化或变性疾病，并且药物组合物调节一种或多种基因——其编码在老化或变性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质——的表达。在一些实施方式中，在老化或变性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质包括但不限于角蛋白K6A、角蛋白K6B、角蛋白16、角蛋白17、p53、β-2肾上腺素能受体(ADRB2)、TRPV1、VEGF、VEGFR、HIF-1和胱天蛋白酶-2。
在上面描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是纤维化或炎性疾病，并且药物组合物调节两种或更多种基因——其编码在纤维化或炎性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质——的表达。在一些实施方式中，在纤维化或炎性疾病发展和/或进展中涉及的蛋白质选自SPARC、CTGF、TGFβ1、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、VEGF、血管紧张素II、TIMP、HSP47、血小板反应蛋白、CCN1、LOXL2、MMP2、MMP9、CCL2、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酸环化酶、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SOX9、抑制蛋白、PDCD4、PAI-1、NF-κB和PARP-1。
在上面描述的方法的一些实施方式中，药物组合物调节在疾病中涉及的一种或多种miRNA的表达。在一些实施方式中，疾病包括但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、多囊性肝病与肾病、癌症、心血管疾病、心力衰竭、心肌肥厚、神经发育疾病、脆性X染色体综合征、雷特综合征、唐氏综合征、阿耳茨海默病、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症、炎性疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、和骨骼肌疾病。在一些实施方式中，一种或多种miRNA包括但不限于miR-122，miR-21，miR-155，miR-23，和miR-191，miR-205，miR-145，miR-10b，和miR-125b，miR-200a，miR-200c，和miR-141，miR-199a，miR-140，miR-145，和miR125b1，miR-205，miR155，miR 200a、200b、200c，miR-193a，193b，miR-let 7g，miR-21，miR-20a，miR-17-19家族，miR 31，miR 135，miR-181b，和miR 200c，miR-34，miR-let7，miR 143，miR 145，miR-133b，miR-126，Has-miR-191、199a，miR 155，miR-17-5p，miR-173p，miR-18a，miR-19a，miR-19b-1，miR-20a与miR-92a-1，miR-21，miR 150，miR-155，miR-15a，miR16，miR-29，miR143，miR-45，miR-30d，miR-let 7a，miR-181a，miR-1，miR-16，miR-27b，miR-30d，miR-126，miR-133，miR-143，let-7家族，miR-208，miR-23a，miR-23b，miR-24，miR-195，miR-199a，miR-214，miR-194，miR-192，miR-200c，miR-203，miR-106b-25，miR-15b、miR-16，has-mir-21与has-mir-205，miR-17-92，has-mir-126*，miR-let 7，hsa-let-7a-2，let-7f-1，miR-2 23，miR-26b，miR-221，miR-103-1，miR-185，miR-23b，miR-203，miR 17-5p，miR-23，miR-205，miR-29c，miR-26a，miR-30c，miR-30e-5p，miR-146b，miR-221，miR-222，miR-181b，miR-155，miR-224，miR-30d，miR-125b，miR-26a，miR-30a-5p，miR-23a，miR-23b，miR-24，miR-195，miR-199a，miR-214，miR-99a，let-7c，miR-125b-2，miR-155与miR-802，miR-9，miR-128a，miR-125b，miR-155，miR-146，miR-189，miR-61，miR-78，miR-21，miR-142-3p，miR 342，miR-299-3p，miR-198，miR-298，miR-196a，miR-17-5p，miR-409-3p，miR-141，miR-383，miR-112，miR-184，miR-203，mIR-132，miR-381，miR-382，miR-107，miR-103和miR-100。
在上面描述的方法的一些实施方式中，药物组合物通过静脉内、瘤内、动脉内、外用、眼内、眼部、颅内、鞘内、囊内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服施用中的任一种被施用至个体。
在上面描述的方法的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将分子递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述分子。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞是外周血来源的T细胞、中央记忆T细胞、脐带血来源的T细胞、或造血干细胞或其它前体细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，分子是如上面描述的货物分子。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、和小分子。在一些实施方式中，货物分子对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
因而，在一些实施方式中，提供了将核酸递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述核酸和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中核酸与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，核酸对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，核酸是RNA，比如siRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA，比如质粒DNA。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将siRNA递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述siRNA和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中siRNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，siRNA对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，将siRNA递送入细胞导致细胞中靶标的降低的表达。在一些实施方式中，靶标的表达降低至少大约30％(比如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更大中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，靶标的表达保持降低至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述质粒和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒和干扰RNA比如siRNA递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括质粒、干扰RNA、和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)并且复合物或纳米颗粒中干扰RNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。在一些实施方式中，干扰RNA是siRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒和干扰RNA比如siRNA递送入细胞的方法，其包括使细胞与如下接触：a)如上面描述的第一复合物或纳米颗粒，其中第一复合物或纳米颗粒包括质粒和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ IDNO:1)；和b)如上面描述的第二复合物或纳米颗粒，其中第二复合物或纳米颗粒包括干扰RNA和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ IDNO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)并且第二复合物或纳米颗粒中干扰RNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。在一些实施方式中，干扰RNA是siRNA。在一些实施方式中，第一和/或第二复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将多肽递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述多肽和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中多肽与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，多肽对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将小分子递送入细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述小分子和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中小分子与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，小分子对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将分子递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述分子和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中分子与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，分子是如上面描述的货物分子。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、和小分子。在一些实施方式中，货物分子对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将核酸递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述核酸和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中核酸与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，核酸对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，核酸是RNA，比如siRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA，比如质粒DNA。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将siRNA递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括siRNA和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中siRNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，siRNA对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，将siRNA递送入细胞导致细胞中靶标的降低的表达。在一些实施方式中，靶标的表达降低至少大约30％(比如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更大中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，靶标的表达保持降低至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述质粒和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子包括一种或多种干扰RNA，比如siRNA，其特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。
在一些实施方式中，提供了将质粒和干扰RNA比如siRNA递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括质粒、干扰RNA、和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)并且复合物或纳米颗粒中干扰RNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。在一些实施方式中，干扰RNA是siRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒和干扰RNA比如siRNA递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如下接触：a)如上面描述的第一复合物或纳米颗粒，其中第一复合物或纳米颗粒包括质粒和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ IDNO:1)；和b)如上面描述的第二复合物或纳米颗粒，其中第二复合物或纳米颗粒包括干扰RNA和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ IDNO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)并且第二复合物或纳米颗粒中干扰RNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。在一些实施方式中，干扰RNA是siRNA。在一些实施方式中，第一和/或第二复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将多肽递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括多肽和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中多肽与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，多肽对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将小分子递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述小分子和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中小分子与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，小分子对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将分子递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述分子和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中所述分子与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，分子是如上面描述的货物分子。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、和小分子。在一些实施方式中，货物分子对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将核酸递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括核酸和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中核酸与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，核酸对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，核酸是RNA，比如siRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA，比如质粒DNA。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将siRNA递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括siRNA和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中siRNA与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，siRNA对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，将siRNA递送入细胞导致细胞中靶标的降低的表达。在一些实施方式中，靶标的表达降低至少大约30％(比如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更大中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，靶标的表达保持降低至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括质粒和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒和干扰RNA比如siRNA递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括质粒、干扰RNA、和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)并且复合物或纳米颗粒中干扰RNA与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。在一些实施方式中，干扰RNA是siRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将质粒和干扰RNA比如siRNA递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如下接触：a)如上面描述的第一复合物或纳米颗粒，其中第一复合物或纳米颗粒包括质粒和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)；和b)如上面描述的第二复合物或纳米颗粒，其中第二复合物或纳米颗粒包括干扰RNA和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一复合物或纳米颗粒中质粒与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)并且第二复合物或纳米颗粒中干扰RNA与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与第一和第二复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的RNA分子，比如mRNA。在一些实施方式中，干扰RNA特异性地靶向编码消极共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，消极共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。在一些实施方式中，干扰RNA是siRNA。在一些实施方式中，第一和/或第二复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将多肽递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括多肽和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中多肽与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，多肽对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将小分子递送入T细胞的方法，其包括使细胞与如上面描述的复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包括所述小分子和VEPEP-9肽，所述VEPEP-9肽包括氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:25)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X13是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是L或无，X3是R或无，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或无，X12是A、R或无，并且X13是W或F，并且其中如果X3是无，则X2、X11和X12也是无。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包括LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:26)、LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:27)或RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中所述小分子与VEPEP-9肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体内实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体实施。在一些实施方式中，T细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外实施。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，比如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，比如个体的T细胞。在一些实施方式中，小分子对治疗疾病是有用的，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。
在一些实施方式中，提供了将分子递送入个体中的细胞的方法，其包括给个体施用包括如上面描述的复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括所述分子和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中所述分子与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由静脉内途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由皮下途径被施用至个体。在一些实施方式中，分子是如上面描述的货物分子。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、和小分子。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病或在发展疾病的风险下，并且货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将核酸递送入个体中的细胞的方法，其包括给个体施用包括如上面描述的复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括核酸和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中核酸与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由静脉内途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由皮下途径被施用至个体。在一些实施方式中，核酸是RNA，比如siRNA。在一些实施方式中，核酸是DNA，比如质粒DNA。在一些实施方式中，质粒编码治疗性产物或对治疗疾病有用的产物，比如本文描述的待治疗的疾病中的任一种(例如，癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病)。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病或在发展疾病的风险下，并且核酸对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将siRNA递送入个体中的细胞的方法，其包括给个体施用包括如上面描述的复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括siRNA和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中siRNA与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由静脉内途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由皮下途径被施用至个体。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病或在发展疾病的风险下，并且siRNA对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，将siRNA递送入细胞导致细胞中靶标的降低的表达。在一些实施方式中，靶标的表达降低至少大约30％(比如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更大中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，靶标的表达保持降低至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将质粒递送入个体中的细胞的方法，其包括给个体施用包括如上面描述的复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括质粒和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中质粒与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由静脉内途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由皮下途径被施用至个体。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病或在发展疾病的风险下，并且质粒编码对治疗疾病有用的产物。在一些实施方式中，质粒编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，CAR靶向与疾病相关联的抗原。例如，在一些实施方式中，疾病是癌症，并且CAR靶向癌症相关抗原。在一些实施方式中，将质粒递送入细胞导致由质粒编码的产物的表达。在一些实施方式中，由质粒编码的产物表达至少大约5天(比如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50天或更久中的大约任一种，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将多肽递送入个体中的细胞的方法，其包括给个体施用包括如上面描述的复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括多肽和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中多肽与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由静脉内途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由皮下途径被施用至个体。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病或在发展疾病的风险下，并且多肽对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供了将小分子递送入个体中的细胞的方法，其包括给个体施用包括如上面描述的复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包括所述小分子和ADGN肽，所述ADGN肽包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN肽包括KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ IDNO:3)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒中小分子与ADGN肽的摩尔比是大约1∶10至大约1∶40(比如大约1∶20或大约1∶40)。在一些实施方式中，组合物经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由静脉内途径被施用至个体。在一些实施方式中，组合物经由皮下途径被施用至个体。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，比如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，个体患有疾病或在发展疾病的风险下，并且小分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种额外的货物分子。在一些实施方式中，一种或多种额外的货物分子对治疗疾病是有用的。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在本申请的另一方面，提供了稳定货物分子(比如核酸)的方法，其包括使货物分子与如上面描述的ADGN肽组合，从而稳定货物分子。在一些实施方式中，货物分子和ADGN肽形成如上面描述的复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，货物分子是核酸并且ADGN肽稳定核酸的超螺旋结构。在一些实施方式中，货物分子易于降解(例如在体外或体内通过血清组分或核酸酶)，并且ADGN肽保护货物分子免于降解。
应理解任何本文描述的方法可以被组合。因而，例如，核酸和多肽可以通过如下被递送入细胞：将任何上面描述的将核酸递送入细胞的方法与任何上面描述的将多肽递送入细胞的方法组合。考虑的可能的组合包括任何本文描述的方法中的两种或更多种的组合。
试剂盒
本文还提供了对本文描述的方法有用的试剂盒、试剂、和制品。这样的试剂盒可以包含含有ADGN肽、装配分子和/或其它细胞穿透肽的瓶，其与包含货物分子的瓶分离。在患者治疗时，首先基于例如患者样品的基因表达分析或蛋白质组学或组织学分析确定将要治疗的是什么具体的病理学。在获得那些结果后，ADGN肽和任何任选的装配分子和/或细胞穿透肽相应地与适当的货物分子组合以产生复合物或纳米颗粒，其以可以被施用至患者用于有效的治疗。因而，在一些实施方式中，提供了试剂盒，其包括：1)ADGN肽，和任选地2)一种或多种货物分子(比如核酸，例如寡核苷酸)。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括装配分子和/或其它细胞穿透肽。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括用于测定基因表达谱的试剂。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括药学上可接受的载体。
本文描述的试剂盒可以进一步包括使用试剂盒的组分实践主题方法的说明(例如制造本文描述的药物组合物和/或使用药物组合物的说明)。实践主题方法的说明通常被记录在合适的记录介质上。例如，说明可以被印刷在基底上，比如纸或塑料等。正因如此，说明可以作为包装说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器的标签中或其组件中(即，与包装或分包装相关联)等。在一些实施方式中，说明作为在合适的计算机可读存储介质——例如，CD-ROM、磁盘等——上存在的电子存储数据文件存在。在又其它实施方式中，实际说明不存在于试剂盒中，但是提供了用于从远端来源获得说明的手段，例如，经由互联网。此实施方式的实例是试剂盒，其包括可以查看说明和/或可以下载说明的网址。就说明而言，用于获得说明的此手段被记录在合适的基底上。
试剂盒的多种组分可以在单独的容器中，其中容器可以被包含在单个外壳，例如，盒子内。
实施例
实施例1：材料和方法
ADGN肽
所有肽使用Fmoc化学试剂通过固相肽合成法合成。肽在N-端处包含β-丙氨酸、丝氨酸、或乙酰基以允许进一步的官能化，而不使用C-端半胱酰胺基团。肽在C-端处包含半胱酰胺或COOH基团。
发明结构
ADGN肽是二级两亲的肽；它们是高度万能的并且显示强的结构多态性。ADGN肽作为游离形式在溶液中是未折叠的并且在货物的存在下采取部分α螺旋构象。
寡核苷酸和siRNA
根据下列序列合成siRNA：
GAPDH有义5′-CAUCAUCCCUGCCUCUACUTT-3′(SEQ ID No:29)
GAPDH反义5′-AGUAGAGGCAGGGAUGAUGTT-3’(SEQ ID No:30)
Cyc-B1有义5’-GGCGAAGAUCAACAUGGCATT-3’(SEQ ID No:31)
Cyc-B1反义5’-UGCCAUGUUGAUCUUCGCCTT-3’(SEQ ID No:32)
Cyc-B3有义5’-GGUGAAGAUCAGCAUGGCATT-3’(SEQ ID No:33)
Cyc-B3反义5’-UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT-3’(SEQ ID No:34)
Cdc20有义5’-UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT-3’(SEQ ID No:35)
Cdc20反义5’-UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT-3’(SEQ ID No:36)
siF7有义5′-GCAAAGGCGUGCCAACUCATT-3’SEQ ID No:37)
siF7反义：5′-TGAGUUGGCACGCCUUUGCTT-3′(SEQ ID No:38)
质粒DNA
编码萤光素酶并且具有6.2Kb和3.8Kb的大小的质粒获得自New England BioLabs并且被重新克隆。编码YFP(6.3Kb)的质粒获得自Sigma(USA)并且被重新克隆。如先前描述的制备在CMV启动子的控制下编码CD19-特异性嵌合抗原受体的质粒，其包括连接至CD28和CD3z信号传导部分的CD19-特异性scFv。
ADGN肽/货物颗粒和复合物的制备
通过混合两亲的肽和质粒或siRNA制备肽/siRNA或肽/质粒纳米颗粒。两亲的肽的原液在蒸馏水中以1mg/mL被制备并且被超声10min。siRNA的原液在水中以5μM浓度被制备。质粒的原液在50mM Tris，0.5mM EDTA缓冲液中以100μM浓度被制备。使用在5∶1、10∶1或20∶1下的肽与质粒的最终摩尔比，通过在37℃下培育肽(400μM原液)与质粒(100μM原液)持续30min，在纯水中形成肽/质粒复合物或纳米颗粒。使用在10∶1、20∶1或40∶1下的肽与siRNA的最终摩尔比，通过在37℃下培育肽(400μM原液)与siRNA(5μM原液)持续30min，在水或合适的水性介质中形成肽/siRNA复合物或纳米颗粒。通过在PBS中连续稀释原液复合物获得较低浓度的ADGN-100/siRNA(20nM至0.125nM)，以便保持相同的肽/siRNA比。单独的siRNA或质粒和肽/质粒复合物在20℃和40℃下在PBS中储存5天以测试质粒的稳定性。
在储存和稳定性方面，在水中制备的颗粒的原液在4℃下保持稳定至少三周。颗粒可以被冷冻干燥用于长期储存；在该情况下，5至20％葡萄糖或甘露醇在冷冻干燥前被添加至颗粒溶液以在过程期间稳定颗粒。
基于肽的纳米颗粒的表征
每次测量在25℃下持续3min测定平均颗粒大小分布并且使用Zetasizer 4设备(Malvern Ltd)测量ζ电位。在4℃、20℃和40℃下的12/24/48小时培育后，在生理条件(0.9％NaCl)中跟踪ADGN-100/siRNA复合物的大小和多分散度。分析三种不同的肽/siRNA摩尔比(10∶1、20∶1和40∶1)。
细胞培养和肽-介导的货物递送
在37℃下在包含5％CO2的潮湿气氛中，贴壁HeLa细胞(来自American TypeCulture Collection[ATCC])在补充有2mM谷氨酰胺，1％抗生素(链霉素10,000μg/mL，青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。在转染前一天接种在35mm的平皿的总计150,000个细胞生长至60％汇合并且使用200μl的预制复合物进行覆盖，培育3-5min，然后添加400μl的DMEM。在37℃下的30min培育后，1mL的包含16％FCS的新鲜DMEM被添加，以便达到10％的最终FCS浓度，而不去除ADGN-100/货物复合物的覆盖物。细胞返回培养箱持续24或48小时。对于靶向GAPDH的siRNA，使用Quanitgen(Panomics Inc.)在转导之后24小时测定mRNA水平。报告的数据是3或4个不同实验的平均数。对于萤光素酶编码质粒，萤光素酶表达的水平在48小时后通过发光测定法被定量。
细胞毒性
在Hela和Jurkat细胞系上调查肽/siRNA复合物的毒性。在添加培养基以达到FCS的最终10％浓度之前，使用在1至50μM(500μM ADGN-100)范围内的、在20∶1或40∶1摩尔比下复合的增加浓度的肽或肽/siRNA培育在转染前一天接种在24孔板中的总计30,000个细胞持续30min。通过监测持家基因亲环蛋白mRNA水平(Quanitgen,Panomic Inc.)和通过比色MTT试验(德国Sigma)，在12或24小时之后测量细胞毒性反应。对于MTT试验，细胞培养基被去除并且替换为包含2.5mg/ml的MTT的PBS持续4小时。结果对应于3个独立实验的平均数。
小鼠肿瘤模型
无胸腺雌性裸小鼠(6-8周龄)在胁中皮下接种100μl PBS中的1×106个HT-29细胞。
对于siRNA处理：在肿瘤植入后两到三周，当肿瘤大小达到大约100mm3时，动物通过瘤内或静脉内注射进行处理，每3天，使用0.1ml的游离的Cyc-B1 siRNA或Cdc20 siRNA(50或100μg)、对照siRNA、Cyc-B3、Cyc-B1 siRNA(1、5、10μg)、Cdc20 siRNA(5μg)的溶液或在20∶1摩尔比下与ADGN肽复合的Cyc-B1和Cdc20 siRNA(每种5μg)的混合物。
实施例2：用于RNA分子递送的ADGN肽应用
实施例2.1：ADGN肽与货物形成稳定的纳米结构
在4℃、20℃和40℃下的12、24和48小时培育后，在生理条件(0.9％NaCl)中跟踪肽/siRNA复合物的大小和多分散度。分析三种不同的肽∶siRNA摩尔比：10∶1、20∶1和40∶1。
在20∶1或40∶1摩尔比下，ADGN肽与siRNA形成稳定的颗粒，其具有120nm的平均直径和0.3的多分散指数(PI)。颗粒在不同的温度下维持它们的大小分布(平均直径<130nm和多分散指数<0.31)并且随着时间保持稳定(参见表2-4)。在10∶1摩尔比下，颗粒大小随着时间增加。
通过ζ电位的ADGN-100/siRNA颗粒电荷的测量对于20∶1和40∶1摩尔比是类似的，平均值分别是6.0±0.8mV和5.1±1.0mV。10∶1摩尔比颗粒的平均ζ电位是15.4±0.6mV。
表2：肽/siRNA颗粒在20℃下的培育
表3：肽/siRNA颗粒在4℃下的培育
表4：肽/siRNA颗粒在40℃下的培育
实施例2.2：肽介导的siRNA递送
使用靶向GAPDH的siRNA(SEQ ID NO:30)，在Hela和Jurkat细胞二者中对ADGN肽/siRNA复合物进行siRNA递送评价。两种细胞系的siRNA转染在6孔板中进行。去除完全培养基并且使用PBS洗涤细胞。纳米颗粒的4×浓缩溶液在1×PBS中被稀释并且被立刻添加至细胞。在37℃下的10min培育后，细胞使用无血清(free)DMEM培养基进行覆盖并且在37℃下培育另外的30-60min。完全DMEM培养基然后被添加并且细胞在37℃下培育48小时，接着进行蛋白质印迹分析。
在10∶1、20∶1和40∶1摩尔比下分析肽/siRNA颗粒。使用在PBS中连续稀释的原液进行siRNA剂量反应，最终siRNA浓度在200nM至10nM的范围内。一式两份地进行实验。
对不同的培养细胞进行的剂量反应实验揭示肽介导的GAPDH siRNA的递送诱导GAPDH mRNA水平的稳健的下调(图1A和1B)。在使用20∶1和40∶1摩尔比复合物的两种细胞系中获得了GAPDH的显著沉默。在50nM siRNA浓度下观察到大于60％效率。
实施例2.3：ADGN肽与短ssRNA形成稳定的纳米结构
评价两种ssRNA：G1(9-Mer：3’-AGC AGC AGC-5’，SEQ ID NO:39)和G2(12-mer：3’-AGC AGC AGC AGC-5’，SEQ ID NO:40)。在4℃和20℃下的12和24小时培育后，在生理条件(0.9％NaCl)中跟踪肽/G1和肽/G2复合物的大小和多分散度。分析两种不同的肽∶siRNA摩尔比：10∶1和20∶1。
如表5中显示的，在10∶1或20∶1摩尔比下，ADGN肽与G1和G2形成稳定的颗粒，其具有135nm的平均直径和0.25的多分散指数。颗粒维持它们的大小分布(平均直径<130nm和多分散指数<0.3)并且随着时间保持稳定。
通过ζ电位的肽/G1和肽/G2颗粒电荷的测量对于10∶1和20∶1摩尔比是类似的，平均值分别是10.4±3.1和8.4±2.0mV。
表5：不同条件下的ADGN肽/ssRNA颗粒
实施例2.4：在原代人成纤维细胞株中体外应用肽/SPARC siRNA复合物以模拟体外纤维化模型
两种不同的SPARC siRNA(A和B)与如上面描述的ADGN肽复合。培养两组原代人成纤维细胞株(A和B)并且在40nM的浓度下使用两种不同的肽/SPARC siRNA复合物处理48小时。非靶标siRNA被用作阴性对照处理。通过实时RT-PCR检查Sparc表达。一式两份地进行实验(A1、A2与B1、B2，参见图2)。在两种成纤维细胞细胞系中，对于每种SPARC siRNA看到大于80％的SPARC敲落。
实施例3：ADGN肽和肽/siRNA复合物对Hela和Jurkat细胞的毒性评价
使用MTT试验和通过监测由quantigenTM technology(Affymetrix)测量的亲环蛋白mRNA的水平，评价在20∶1和40∶1摩尔比二者下的ADGN肽和ADGN肽/siRNA复合物的毒性。一式两份地进行实验。
数据在两种方法之间良好地关联，并且对于高至50μM的ADGN肽/siRNA复合物没有观察到毒性(图3A和3B)。在50μM下的游离肽的情况下，观察到大约20-30％的生存力或亲环蛋白mRNA水平的降低。
实施例4：ADGN肽/siRNA颗粒的体内应用
实施例4.1
ADGN肽/siRNA复合物被用于体内递送靶向细胞周期蛋白B1、GAPDH和Cdc20的siRNA。每三天注射ADGN肽/细胞周期蛋白B1 siRNA复合物在异种移植小鼠模型中预防结肠肿瘤生长。
无胸腺雌性裸小鼠(6-8周龄)在胁中皮下接种在100μl PBS中的1×106个PC3(前列腺癌)或HT-29(结肠癌)细胞。在肿瘤植入后两到三周，当肿瘤大小达到大约100mm3时，动物通过瘤内或静脉内注射进行处理，每3天，使用0.1ml的50或100μg游离的Cyc-B1 siRNA(SEQ ID NO:32)、对照siRNA、或5或10μg Cyc-B3(SEQ ID NO:34)的溶液或与ADGN肽复合的Cyc-B1 siRNA。在水中制备的颗粒的原液在4℃下保持稳定至少三周。颗粒可以被冷冻干燥用于长期储存；在该情况下，5至20％的葡萄糖或甘露醇在冷冻干燥前被添加至颗粒溶液以在过程期间稳定颗粒。在施用前，颗粒被稀释为生理条件(0.9％NaCl和5至20％甘露醇)。定期使用数显卡尺在二维中测量肿瘤直径并且肿瘤体积被计算为长度×宽度×高度×0.52。曲线显示了肿瘤大小在六只动物的组群中的平均值，并且没有观察到动物死亡和任何毒性迹象。实验根据国家规范进行并且由当地动物实验道德委员会批准。结果的统计显著性通过学生t检验计算并且p<0.05被认为是统计学上显著的。
在全身静脉内施用肽/细胞周期蛋白B1 siRNA颗粒之后，在第48天观察到HT-29肿瘤大小的显著减小，在5μg和10μg的siRNA的情况下分别为65％和90％抑制(图4)。这些结果，连同肽/错配的siRNA(10μg)或单独的肽载体缺乏抗肿瘤活性，强调了与细胞周期蛋白B1siRNA的全身递送相关联的生物应答的稳健性和特异性。
在每三天注射肽/siRNA复合物之后，在肽颗粒中组合细胞周期蛋白B1和Cdc20siRNA阻止异种移植小鼠模型中的结肠肿瘤生长。5μg(0.25mg/kg)的Cyc-B1 siRNA、Cdc20siRNA(SEQ ID NO:36)和肽/siRNA颗粒中5μg Cyc-B1/Cdc20 siRNA(每种0.125mg/kg)的混合物每三天静脉内注射入荷载异种移植肿瘤的小鼠。在第50天观察到HT-29肿瘤大小的显著减小，在5μg的cyc-B1 siRNA和Cdc20 siRNA的情况下分别为51％和38％抑制(图5)。对于肽/cyc-B1/cdc20 siRNA复合物观察到了94％的显著减小(图5)，这表明靶向这两种基因的协同或累加效应。这些结果在一起展现了与稳健的生物应答相关联的ADGN肽/siRNA颗粒体内递送siRNA的混合物的能力。
实施例4.2：ADGN-100/siRNA生物分布的体内成像
如先前描述的进行体内荧光成像(Rome et al.,Methods Mol.Biol.948:49-65,2013)。在20∶1摩尔比下使用复合物中Alexa700标记的siRNA与ADGN-100进行实验。对正常BALB/c和HT-29荷瘤小鼠评价药代动力学。小鼠静脉内(IV)或皮下(SC)施用单剂量的0.5mg/kg的Alexa700荧光标记的siRNA(200μl)，其或者是裸的或者与ADGN-100复合(n＝4只动物/组)。使用2％异氟烷麻醉的小鼠被装备有干涉滤光器的663nm发光二极管光照。如先前描述的，获取施用后前15分钟的影像并且每小时拍摄荧光图像持续5小时，并且然后在24小时后使用薄型背照式CCD冷却型照相机(Rome et al.,supra；Crombez et al.,Nucleic Acids Res.37(14):4559-4569,2009)。在12或24小时，小鼠被处死并且去除不同的器官用于Alexa荧光的定量。在1、2、5、10和24小时后进行全小鼠分析。在剂量开始后12和24小时从两种动物收集血液和组织样品(肝、脾、肾、肺、脑、心、皮肤、胰脏和淋巴结)。siRNA水平被量化为荧光单位/mg健康和荷瘤小鼠的组织。
使用全身静脉内和皮下施用二者评价基于ADGN-100的颗粒。动力学分析展现了在单一静脉内或皮下注射ADGN-100/siRNA颗粒2-3小时后在不同组织中的siRNA的水平达到峰值(图6)。ADGN-100/siRNA复合物的静脉内施用允许在肺、肾、脾、淋巴结、肝、胰脏和肌肉中的显著水平下和在心和脑中的较低水平下将siRNA递送至大部分分析组织(图7A)。静脉内施用也允许将siRNA显著地递送至肿瘤组织(图7B)。ADGN-100/siRNA复合物的皮下施用允许将siRNA显著地递送至肌肉、皮肤、脾脏和肝(图7C)。
实施例4.3：使因子VII沉默的siRNA的体内递送
对ADGN-100肽进行靶向内源性的、肝细胞-表达的凝血因子VII(FVII)——在肝中表达的靶标——的siRNA的体内递送的评价。ADGN-100/siRNA颗粒靶向肝并且导致有效的、完全可逆的基因沉默，而不在小鼠中诱导任何毒性或不利副作用。
在20∶1肽/siRNA摩尔比下使用未修饰的siRNA(siF7有义：5′-GCAAAGGCGUGCCAACUCATT-3′，SEQ ID NO:37；siF7反义：5′-TGAGUUGGCACGCCUUUGCTT-3′，SEQ ID NO:38)(Akincet al,2009Molecular Therapy(2009)17 5,872–879)和ADGN-100肽制备颗粒的原液。如先前描述的制备肽/siRNA颗粒。
在体内使用之前，首先在HepG2细胞(HepHB-8065)上体外评价ADGN-100/FVIIsiRNA颗粒的稳定性和功效。在4℃下2、24和48小时培育后和在4℃下1至4周储存后跟踪ADGN-100/siRNA复合物在生理条件(0.9％NaCl)中的大小和多分散度。20∶1摩尔比下的ADGN-100/FVIIsiRNA稳定超过4周时期，平均直径为130nm和多分散指数(PI)为0.31(表6)。在4℃下2和24小时培育后和在4℃下1至4周储存后监测FVII敲落(KD)的颗粒效率。FVII活性被归一化为未处理的细胞并且敲落结果对应于3个独立实验的平均值。具有ADGN-100的复合物中100nM的浓度下的FVII siRNA导致HepG2细胞中大约65％的FVII敲落。
表6：ADGN-100/FVIIsiRNA颗粒随着时间的稳定性和功效的评价
对于体内实验，颗粒被稀释入生理条件(0.9％NaCl和5至20％甘露醇)。经由静脉内(尾静脉)或皮下施用，使用单一注射3mg/kg(siRNA剂量)下的游离的siFVII siRNA或与ADGN肽复合的siFVII siRNA的0.1ml溶液处理BALB/c小鼠(6-8周龄)。研究包括4组小鼠：接受等渗葡萄糖的对照组(C，N＝2)；接受裸的因子VII siRNA的组(裸的，N＝2)；接受皮下注射的复合物的组(SQ，N＝3)；和接受静脉内注射的复合物的组(IV，N＝3)。
通过眼眶后出血收集施用后多个时间点的血清样品并且使用基于活性的显色测试试剂盒(BIOPHEN VII)定量相对于盐水对照处理的动物的水平的因子VII蛋白的血清水平。实验根据国家规范进行并且由当地动物实验道德委员会批准。
图8A显示了三个实验组的因子VII的相对平均活性水平，其被归一化为对照组。分别在注射后8天(静脉内注射)和注射后24天(皮下注射)测到85％和71％的最大敲落。对于裸siRNA的注射没有观察到FVII敲落，其指示FVII敲落是特异性的(图8A)。敲落动力学在施用途径之间的差异表明皮下注射的制剂在靶向肝前在淋巴系统中延迟。在单一注射siRNA后，观察到长达60天的敲落的延长的持续时间伴随FVII活性的可测量的减小。基因沉默是可逆的，对于静脉内和皮下注射分别在第35天和第45天开始反弹(图8A)。基因沉默被观察到，而不在小鼠中诱导任何毒性或副作用应答(图8B)。
在恢复正常的血清因子VII水平时，对应于注射后大约60天，动物被再次给药。这些结果强调了ADGN-100技术用于将siRNA全身皮下或静脉内递送至肝细胞的效力。ADGN-100构成了用于体内靶标验证的有用的方法并且对治疗性处理是有用的。
静脉内(IV)递送提供了用于快速敲落靶标的技术，而皮下(SQ)递送可以提供更长时期内的延长的作用。IV和SQ递送二者可以一起用于期望的靶标的最佳的或延长的敲落。基于期望的敲落概况选择合适长度周期(天、周、月)的IV、SQ或两种递送模式的重复递送。
实施例5：用于DNA和基因递送的ADGN肽应用
实施例5.1：ADGN肽稳定溶液中的DNA超螺旋结构。
在20℃下培育后没有观察到ADGN-100/质粒DNA的大小和多分散度的变化(表7)。使用标准技术，在琼脂糖凝胶电泳上，在培育1和4天后测量超螺旋质粒DNA(6.2Kb和3.8Kb)的百分数(表8和表9)。ADGN肽完全稳定所有测试条件中的质粒超螺旋结构。对于两种质粒观察到类似的结果。相比之下，脂质制剂与质粒的复合物在4、20或40℃下的4天储存后是不稳定的。
表7：在20℃下的12/24小时培育后，跟踪生理条件(0.9％NaCl)中ADGN-100/质粒DNA(6.2Kb)复合物的大小和多分散度。分析三种不同的肽/DNA摩尔比：10∶1、20∶1和40∶1。
表8：使用标准技术，在琼脂糖凝胶电泳上测量的1和4天储存后的超螺旋DNA质粒(6.2Kb)的百分数。
表9：使用标准技术，在琼脂糖凝胶电泳上测量的1和4天储存后的超螺旋DNA质粒(3.8Kb)的百分数。
实施例5.2：DNA/肽纳米颗粒对肝素处理的稳定性
在4℃、20℃和40℃下的1和4天培育后评价DNA/肽颗粒和对照对肝素处理的抗性。游离质粒和肽制剂或脂质制剂在32℃下使用肝素(5μg)处理1小时，然后在琼脂糖凝胶电泳上分析游离质粒的水平。肽/质粒颗粒与6.2Kb质粒在20∶1摩尔比下配制。如表10中显示的，在多种温度下的1和4天培育和随后的肝素处理之后，游离质粒的百分数对于肽/DNA复合物是低的。此结果展现了在肽/质粒颗粒中，质粒/肽相互作用主要涉及精氨酸残基，其允许不通过肝素处理解离的稳定的复合物。相比之下，质粒的脂质制剂在肝素处理下是不稳定的，其具有高百分数的释放的游离质粒(表10)。
表10：使用标准技术，在琼脂糖凝胶电泳上测量的1和4天储存和肝素处理后的游离质粒的百分数。
实施例5.3：ADGN肽/质粒DNA颗粒促进基因递送：
在20℃(表11)或40℃(表12)下储存肽/质粒纳米颗粒1和4天后，在Hela细胞上评价萤光素酶表达的效率。肽-介导的质粒递送效率比得上游离质粒或使用脂质制剂(lipofectamine 2000Invitrogen)。使用6.2和3.8Kb质粒获得结果。ADGN肽/质粒DNA颗粒促进基因递送，如由高萤光素酶表达证明的，而没有显著影响质粒大小。ADGN肽甚至在转染之前4天培育纳米颗粒后介导高萤光素酶表达。相比之下，纳米颗粒在20℃和40℃下储存4天后，脂质制剂用于介导基因递送和萤光素酶表达的效率显著降低。
表11：肽/质粒纳米颗粒在20℃下储存1和4天后，在Hela细胞上测量的48小时处的基因表达的效率：
表12：肽/质粒纳米颗粒在40℃下储存1和4天后，在Hela细胞上测量的48小时处的基因表达的效率：
实施例6：ADGN-100介导基因转移入T细胞
实施例6.1
使用表达萤光素酶的质粒，针对基因递送入T细胞——包括Jurkat、293T和K562细胞——评价ADGN-100(Ac-KWRSAGWRWRLWRVRSWSR-半胱酰胺；SEQ ID NO:2，残基1乙酰化，残基19共价连接至半胱酰胺)、VEPEP-6(Ac-LWRALWRLWRSLWRLLWKA-半胱酰胺；SEQ ID NO:20，残基1乙酰化，残基19共价连接至半胱酰胺)和VEPEP-9(Ac-LRWWLRWASRWFSRWAWWR-半胱酰胺，SEQ ID NO:26，残基1乙酰化，残基19共价连接至半胱酰胺)肽。为了研究稳定的基因递送，使用表达YFP并且包含对遗传霉素(G418)的阳性选择标志物的质粒。ADGN-100和VEPEP-9被发现允许T-细胞的有效转染，以及生成表达YFP的稳定转化的细胞系。
材料和方法
细胞系获得自ATCC：Jurkat，克隆E6-1(TIB-152TM)，293T/17[HEK 293T/17](CRL-11268)和K562(CCL243TM)。细胞在包含10％终浓度的胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中在75cm2烧瓶和6孔皿中培养。细胞每四天传代一次并且在转染之前24小时进行最新传代。ADGN-100、VEPEP-6和VEPEP-9肽的原液在蒸馏水中以2mg/mL制备并且在水浴超声波仪中超声10min，然后紧接着使用前进行稀释。原液质粒溶液在50mM Tris，0.5mM EDTA中以100μM浓度制备。
通过在37℃下在纯水中混合肽(400μM原液)和质粒(100μM原液)持续30min来制备纳米颗粒，在1ng或5ng质粒DNA的情况下，肽与质粒的最终摩尔比是10∶1或20∶1。复合物溶液然后在9000rpm下离心5min以去除任何沉淀并且紧接着转染之前在50％PBS溶液中进行稀释。编码萤光素酶(6.2Kb)和YFP(6.3Kb)的质粒分别获得自New England BioLabs(USA)和Sigma(USA)并且被重新克隆。
细胞在转染之前24小时最新传代。去除培养基并且细胞使用PBS洗涤两次。细胞使用0.2或0.4mL的质粒/肽溶液培育5min，然后添加0.4mL的无血清培养基。在30min后，添加1.2mL完全培养基并且血清水平被调节至10％。培养基在37℃下培育48小时，并且然后通过比色试验、FACS和荧光显微镜检查测定YFP或萤光素酶表达。
转染后四十八小时，细胞在包含如下几种G418浓度的完全生长培养基中培养：0、100、200、500、800或1000μg/ml。对于两周，包含药物的培养基每4天替换一次(或根据需要)。在第二周期间，选择存活细胞的“岛状物(island)”。然后评价选择的集落的报告分子表达。
ADGN-100介导不同T细胞系中的基因表达
在10∶1和20∶1摩尔比下使用1和5ng的质粒与不同肽的复合物，对于3种细胞系(Jurkat、293T和K562)评价YFP和萤光素酶表达的效率。通过比色试验监测萤光素酶表达(图9)和通过FACS监测GFP表达(表13，图10)。使用游离质粒、lipofectamine(基于脂质的递送系统，Invitrogen)或作为对照的游离肽一式三份地进行实验。
表13：如通过FACS监测的YFP阳性细胞的百分数
对于转染，使用1ng的游离质粒没有观察到YFP或萤光素酶表达和使用5ng的游离质粒观察到仅5至10％阳性细胞。使用1或5ng的质粒，在VEPEP-6-介导的转染的情况下，对于三种细胞系没有观察到YFP或萤光素酶表达。相比之下，在通过ADGN-100或VEPEP-9介导的转染后，对于三种细胞系观察到高效的基因表达。在20∶1肽与质粒比率下复合的5ng DNA的情况下，获得了最高水平的表达。转染效率取决于细胞系在65至85％之间变化。对于Jurkat和293T/K562细胞中的基因递送，ADGN-100分别比lipofectamine更高效2和5倍。
ADGN-100介导T细胞的稳定转染。
对于293T和K562T细胞二者，评价用于产生稳定的表达YFP的克隆的ADGN-100-介导的转染的效率。细胞转染有在20∶1摩尔比下与ADGN-100复合的5ng质粒。转染在完全培养基中(10％FCS)进行48小时，并且在多个时间点(2、5、7和14天)通过流式细胞术分析表达YFP的克隆持续2周。
如图11中显示的，ADGN-100-介导的转染效率对于K562和293T细胞二者是大约80％，并且YFP表达在转染后14天被稳定地维持，具有大于57％(293T)和65％(K562)YFP-阳性细胞。在转染后四十八小时，通过在包含不同浓度的G418的培养基中生长3周选择稳定的表达YFP的克隆并且通过FACS和显微镜检查进行分析。稳定表达YFP的293T细胞的几个个体克隆被选择并且在96-孔组织培养板中扩增至高汇合。所有选择的克隆表达高水平的YFP(图12A和12B)。
实施例6.2：T细胞中稳定的基因递送和抗-CD19-CAR-T细胞的产生
评价细胞工程和CAR-T细胞工程的ADGN-技术的效力。ADGN-100肽显示将抗-CD19CAR载体表达质粒高效地递送入从外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞并且产生稳定的抗-CD19CAR T细胞。
材料和方法
使用在3∶1(珠∶细胞)的比率下与抗-CD3/抗-CD28抗体结合的顺磁珠(DynabeadsClinExVivo CD3/CD28,Invitrogen)从外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞。T细胞转染有与编码CD19-特异性嵌合抗原受体(CAR)的质粒——其具有连接至CD28和CD3z信号传导部分的CD19-特异性scFv并且在CMV启动子的控制下——复合的ADGN-100颗粒。T细胞通过与2种比率(20∶1和30∶1)下的肽/质粒复合物一起培育48小时被转染。
在第4天，分析转染的细胞的水平，并且细胞被转移至新鲜的T细胞扩增培养基(补充有5％热灭活的人AB血清，1％Gluta-Max，300IU/mL IL-2的AIM V培养基)。在第12天，使用抗-CD3/抗-CD28磁珠与Dynal ClinExVIVO MPC磁体(Invitrogen)收集细胞，洗涤，并且通过流式细胞术分析生存力和抗-CD19表达。使用蛋白L试验通过流式细胞术评价T细胞上的抗-CD19CAR的表达。生物素化的蛋白L购自ThermoScientific，以50ng/μl的原液浓度在无菌水中重构，并且在4℃下储存。7-AAD(Sigma)被用于测定生存力。
结果
在20∶1和30∶1摩尔比的肽与质粒下，ADGN-100介导的抗-CD19CAR载体转染在从PBMC分离的T细胞中分别具有57％和63％效率(图13)。结果被归一化为未转染的细胞并且与使用游离质粒培育的T细胞进行比较。在20∶1和30∶1摩尔比的肽/质粒下，稳定表达分别在41％和48％的细胞中维持12天。平均生存力在所有条件中是大约80％或更高，其指示没有与ADGN-100转染相关联的细胞毒性(图14)。结果被归一化为未转染的细胞并且与使用游离质粒培育的T细胞进行比较。这些结果展现了用于转染的使用非病毒载体的ADGN-100技术可以被有效地用于产生靶标特异性T细胞用于基于免疫的疗法，比如采用肿瘤-靶向T细胞的抗癌疗法。
实施例7：ADGN-100与其它二级两亲的细胞穿透肽(CADY/VEPEP-6/VEPEP-9)的比 较
在ADGN-100肽和CADY、VEPEP-6或VEPEP-9肽之间共享19个残基中的仅4个。
二级结构比较
使用分子建模peplook-Zultim程序(Thomas A and Brasseur R.,2006,Prediction of peptide structure:how far are we？,Proteins.65,889-97)确定二级结构。所有四种肽在膜-模拟环境内采取二级两亲的螺旋构象，其暴露一侧上的Trp-基团，另一侧上的带电残基和又另一侧上的疏水残基(图15)。CADY和VEPEP-6采取相同的二级结构，其中螺旋基序在肽的核心、C-端和N-端(表14)。相比之下，ADGN-100和VEPEP-9肽包含单个核心螺旋基序，其在VEPEP-9中更长并且与Konate et al 2010(Biochemistry)，Crowletet al 2014(BBA)一致。
表14
h：螺旋基序
纳米颗粒大小比较
VEPEP-6、CADY和VEPEP-9与siRNA在摩尔比20∶1(肽∶siRNA)下形成纳米颗粒，其具有100-200nm之间范围内的大小和以150nm为中心的平均直径和带正电荷的表面(对于基于CADY、VEPEP-6和VEPEP-9的颗粒，ζ电位分别是40mV、25mV和17mV)。
ADGN-100肽形成较小的颗粒，平均直径<130nm和多分散指数<0.31。而且，ADGN-100/siRNA颗粒的电荷更接近中性，ζ电位为6.0±0.8mV。这是体内应用的主要优势。
毒性
对于高至50μM的ADGN-100/siRNA和CADY/siRNA复合物没有观察到毒性并且在50μM下游离的ADGN-100和CADY的情况下获得了30％毒性(图16)。在50μM下的复合(10％毒性)和游离形式(40％细胞死亡)二者中，VEPEP-6展示了比其它肽更大的毒性。对于VEPEP-9/siRNA复合物没有观察到毒性，并且与ADGN-100相比，VEPEP-9在50μM下以其游离形式展示了更大的毒性(40％细胞死亡)，其可以归因于VEPEP-9的更长的螺旋结构。
体外基因递送
VEPEP-6、VEPEP-9、CADY和ADGN肽与质粒DNA形成复合物。在4℃、20℃或40℃下1或4天培育后的肝素处理之后，通过下列质粒超螺旋结构的完整性和DNA/肽颗粒的稳定性二者，评价肽在稳定6.2Kb质粒DNA中的效率。使用脂质制剂(lipofectamine2000Invitrogen)的游离质粒和复合物被包括用于比较。对于肝素处理，5μg肝素与样品在32℃下一起培育1小时，接着进行琼脂糖凝胶电泳以解析游离质粒。如表15和16中显示的，VEPEP-9和ADGN-100肽在测试的所有条件中完全稳定质粒DNA。ADGN-100完全保护质粒DNA免于降解和肝素处理。在比较中，VEPEP-6和脂质制剂在4、20或40℃下的4天培育后稳定性差。
表15
表16
使用已经在20℃培育1或4天的肽/质粒纳米颗粒，通过测量递送后48小时的萤光素酶表达，在Hela细胞中评价肽-介导的质粒递送效率。在20℃下肽/质粒纳米颗粒储存1和4天后，在Hela细胞上测量基因表达在48小时处的效率。在测试的每种条件中，ADGN肽分别比VEPEP-6和CADY至少10和2倍更有效(表17)。ADGN和VEPEP-9肽展示了类似水平的质粒递送效率，比4天培育后在脂质制剂的情况下观察到的高大约100倍。
表17
体外细胞内递送
人miR-34a微RNA最近已经涉及癌症，具体地，其表达与TP53状态相关。ADGN-100或VEPEP-6肽/miRNA-34颗粒被用于使用MCF7乳腺癌细胞的抗增殖试验。单链miRNA-34(UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUG，SEQ ID NO:41)被添加至不含肽的培养的细胞或以20∶1的肽∶miRNA比率在与ADGN-100或VEPEP-6的肽/miRNA颗粒中。评价游离的miRNA-34(灰色条)、VEPEP-6/miRNA-34颗粒(白色条)、和ADGN-100/miRNA-34颗粒(黑色条)的剂量应答(图17)。ADGN-100极大地改进miRNA-34的抗增殖性质，其具有81nM的IC50。
体内细胞内递送
与ADGN、VEPEP-6或VEPEP-9复合的siRNA的颗粒被用于全身静脉内施用。ADGN肽颗粒、VEPEP-6颗粒或VEPEP-9颗粒中5或10μg(0.25mg/kg或0.5mg/kg)的Cyc B1siRNA每三天被静脉内注射入荷载异种移植HT-29肿瘤的小鼠。在使用0.25mg/kg siRNA第50天后观察到肿瘤大小的显著减小，对于ADGN和VEPEP-6颗粒分别具有61％和33％抑制(图18)。当使用0.5mg/kg的ADGN/siRNA和VEPEP-6/siRNA颗粒时，肿瘤进展在第50天分别减小87％和65％。相比之下，0.25mg/kg和0.5mg/kg下的VEPEP-9/siRNA颗粒分别减小肿瘤生长仅12％和38％。ADGN/siRNA颗粒分别比VEPEP-6和VEPEP-9颗粒2和9倍更高效。
序列表
SEQ ID NO:1，ADGN-100
X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR
SEQ ID NO:2，ADGN-100a
KWRSAGWRWRLWRVRSWSR
SEQ ID NO:3，ADGN-100b
KWRSALYRWRLWRSRSWSR
SEQ ID NO:4，ADGN-100c
KWRSALYRWRLWRSALYSR
SEQ ID NO:5，ADGN-100a1
X1KWRSAGWRWRLWRVRSWSR
SEQ ID NO:6，ADGN核心基序
RWRLWRX5X6X7X8SR
SEQ ID NO:7，ADGN-100aa
KWRSSAGWRSWRLWRVRSWSR
SEQ ID NO:8，ADGN-100ab
KWRSSAGWRWRSLWRVRSWSR
SEQ ID NO:9，ADGN-100ac
KWRSAGWRSWRLWRVRSSWSR
SEQ ID NO:10，ADGN-100ba
KWRSSALYRSWRLWRSRSWSR
SEQ ID NO:11，ADGN-100 bb
KWRSSALYRWRSLWRSRSWSR
SEQ ID NO:12，ADGN-100bc
KWRSALYRSWRLWRSRSSWSR
SEQ ID NO:13，ADGN-100bd
KWRSALYRWRSLWRSSRSWSR
SEQ ID NO:14，ADGN-100be
KWRSALYRWRLWRSSRSWSSR
SEQ ID NO:15，ADGN-100ca
KWRSSALYRWRSLWRSALYSR
SEQ ID NO:16，ADGN-100cb
KWRSSALYRSWRLWRSALYSR
SEQ ID NO:17，ADGN-100cc
KWRSALYRWRSLWRSSALYSR
SEQ ID NO:18，ADGN-100cd
KWRSALYRWRLWRSSALYSSR
SEQ ID NO:19，CADY
GLWRALWRLLRSLWRLLWKV
SEQ ID NO:20，VEPEP-6a
LWRALWRLWRSLWRLLWKA
SEQ ID NO:21，VEPEP-6b
LWRALWRLLRSLWRLWRKA
SEQ ID NO:22，VEPEP-6c
LWRALWRLWRSLWRLWRKA
SEQ ID NO:23，VEPEP-6d
LWRALWRLLRALWRLLWKA
SEQ ID NO:24，VEPEP-6e
LWRALWRLLRNLWRLLWKA
SEQ ID NO:25，VEPEP-9
X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R
SEQ ID NO:26，VEPEP-9a
LRWWLRWASRWFSRWAWWR
SEQ ID NO:27，VEPEP-9b
LRWWLRWASRWASRWAWFR
SEQ ID NO:28，VEPEP-9c
RWWLRWASRWALSWRWWR
SEQ ID NO:29，GAPDH有义
CAUCAUCCCUGCCUCUACUTT
SEQ ID NO:30，GAPDH反义
AGUAGAGGCAGGGAUGAUGTT
SEQ ID NO:31，Cyc-B1有义
GGCGAAGAUCAACAUGGCATT
SEQ ID NO:32，Cyc-B1反义
UGCCAUGUUGAUCUUCGCCTT
SEQ ID NO:33，Cyc-B3有义
GGUGAAGAUCAGCAUGGCATT
SEQ ID NO:34，Cyc-B3反义
UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT
SEQ ID NO:35，Cdc20有义
UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT
SEQ ID NO:36，Cdc20反义
UGCCAUGUCGAUCUUCACCTT
SEQ ID NO:37，siF7有义
GCAAAGGCGUGCCAACUCATT
SEQ ID NO:38，siF7反义
TGAGUUGGCACGCCUUUGCTT
SEQ ID NO:39，G1
CGACGACGA
SEQ ID NO:40，G2
CGACGACGACGA
SEQ ID NO:41，miR-34
UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUG

Claims (103)

1.非天然存在的肽，其包括氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:1)，其中X1是任意氨基酸或无，并且其中X2-X8是任意氨基酸。
2.权利要求1所述的肽，其中X1是βA、S或无，X2是A或V，X3是G或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，并且X8是W或Y。
3.权利要求2所述的肽，其中所述肽包括如下的氨基酸序列：
a)KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:2)、
b)KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:3)、或
c)KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:4)。
4.权利要求1-3中任一项所述的肽，其中所述肽的长度是19或20个氨基酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的肽，其中所述肽包括L-氨基酸。
6.权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽包括D-氨基酸。
7.权利要求1-4中任一项所述的肽，其进一步包括共价连接至所述肽的N-端的一个或多个部分，其中所述一个或多个部分选自乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。
8.权利要求5所述的肽，其中所述肽包括共价连接至其N-端的乙酰基。
9.权利要求1-6中任一项所述的肽，其进一步包括共价连接至所述肽的C-端的一个或多个部分，其中所述一个或多个部分选自半胱酰胺基团、半胱氨酸、硫醇、酰胺、次氨基三乙酸、羧基、直链或支链C1-C6烷基、伯胺与仲胺、栀子酸衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。
10.权利要求7所述的肽，其中所述肽包括共价连接至其C-端的半胱酰胺基团。
11.权利要求1-8中任一项所述的肽，其中所述肽包括被三或六个残基分隔的两个残基，其通过烃键连接。
12.权利要求9所述的肽，其中所述肽包括如下的氨基酸序列：
aa)KWRSSAGWRSWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:7)、
ab)KWRSSAGWRWRSLWRVRSWSR(SEQ ID NO:8)、
ac)KWRSAGWRSWRLWRVRSSWSR(SEQ ID NO:9)、
ba)KWRSSALYRSWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:10)、
bb)KWRSSALYRWRSLWRSRSWSR(SEQ ID NO:11)、
bc)KWRSALYRSWRLWRSRSSWSR(SEQ ID NO:12)、
bd)KWRSALYRWRSLWRSSRSWSR(SEQ ID NO:13)、
be)KWRSALYRWRLWRSSRSWSSR(SEQ ID NO:14)、
ca)KWRSSALYRWRSLWRSALYSR(SEQ ID NO:15)、
cb)KWRSSALYRSWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:16)、
cc)KWRSALYRWRSLWRSSALYSR(SEQ ID NO:17)、或
cd)KWRSALYRWRLWRSSALYSSR(SEQ ID NO:18)，
并且其中使用下标“S”标记的残基是由所述烃键连接的所述两个残基。
13.复合物，其包括权利要求1-10中任一项所述的肽和货物分子。
14.权利要求11所述的复合物，其中所述货物分子是核酸。
15.权利要求12所述的复合物，其中所述核酸选自siRNA、miRNA、DNA质粒、和其类似物。
16.权利要求12所述的复合物，其中所述核酸是寡核苷酸。
17.权利要求12-14中任一项所述的复合物，其中所述核酸选自单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、和其衍生物。
18.权利要求12-15中任一项所述的复合物，其中所述核酸的长度是大约2至大约40个核苷酸。
19.权利要求12-15中任一项所述的复合物，其中所述核酸的长度是多至大约100个核苷酸。
20.权利要求12-13和15中任一项所述的复合物，其中所述核酸的长度是大于大约100个核苷酸。
21.权利要求13所述的复合物，其中所述DNA质粒编码嵌合抗原受体，其包括与靶抗原特异性结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
22.权利要求19所述的复合物，其中所述靶抗原选自CD19、CD20、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、BCMA、CD70、CD74、CD38、CD138、CD33、Lewis-Y、CD123、CD44v6和CS1。
23.纳米颗粒，其包括权利要求1-10中任一项所述的肽和货物分子。
24.权利要求21所述的纳米颗粒，其中所述货物分子是核酸。
25.权利要求22所述的纳米颗粒，其中所述核酸选自siRNA、miRNA、DNA质粒、和其类似物。
26.权利要求22所述的纳米颗粒，其中所述核酸是寡核苷酸。
27.权利要求22-24中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸选自单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、和其衍生物。
28.权利要求22-25中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸的长度是大约2至大约40个核苷酸。
29.权利要求22-23中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸的长度是多至大约100个核苷酸。
30.权利要求22、23和25中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核酸的长度是大于大约100个核苷酸。
31.权利要求23所述的纳米颗粒，其中所述DNA质粒编码嵌合抗原受体，其包括与靶抗原特异性结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
32.权利要求29所述的纳米颗粒，其中所述靶抗原选自CD19、CD20、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM、BCMA、CD70、CD74、CD38、CD138、CD33、Lewis-Y、CD123、CD44v6和CS1。
33.权利要求21-30中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒中所述货物分子与所述肽的摩尔比是大约1∶1至大约1∶80。
34.权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒中所述货物分子与所述肽的摩尔比是大约1∶5至大约1∶40。
35.权利要求21-32中任一项所述的纳米颗粒，其中所述货物分子与装配分子复合以形成所述纳米颗粒的核心。
36.权利要求33所述的纳米颗粒，其中所述装配分子选自肽、蛋白质、抗体、脂质、磷脂、聚合物、适配体、纳米颗粒、脂质体、树状聚体、聚合物囊泡、病毒载体、和微团。
37.权利要求33所述的纳米颗粒，其中所述装配分子是权利要求1-10中任一项所述的肽。
38.权利要求33所述的纳米颗粒，其中所述装配分子不是权利要求1-10中任一项所述的肽。
39.权利要求21-36中任一项所述的纳米颗粒，其进一步包括表层。
40.权利要求37所述的纳米颗粒，其中所述表层包括权利要求1-10中任一项所述的肽。
41.权利要求37所述的纳米颗粒，其中所述表层包括细胞穿透肽，其不是权利要求1-10中任一项所述的肽。
42.权利要求37-39中任一项所述的纳米颗粒，其进一步包括中间层。
43.权利要求40所述的纳米颗粒，其中所述中间层包括权利要求1-10中任一项所述的肽。
44.权利要求40所述的纳米颗粒，其中所述中间层包括细胞穿透肽，其不是权利要求1-10中任一项所述的肽。
45.权利要求21-42中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括在表面的靶向部分。
46.权利要求43所述的纳米颗粒，其中所述靶向部分被连接至肽。
47.权利要求44所述的纳米颗粒，其中所述肽被共价连接至所述靶向部分。
48.权利要求43-45中任一项所述的纳米颗粒，其中所述靶向部分将所述纳米颗粒靶向至组织。
49.权利要求21-46中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括多种货物分子。
50.权利要求21-47中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径是大约10nm至大约300nm。
51.权利要求48所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径是大约50nm至大约200nm。
52.权利要求49所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均直径是大约80nm至大约140nm。
53.权利要求21-50中任一项所述的纳米颗粒，其中ζ电位的绝对值小于大约30mV。
54.权利要求51所述的纳米颗粒，其中ζ电位的绝对值小于大约10mV。
55.药物组合物，其包括权利要求11-20中任一项所述的复合物或权利要求21-52中任一项所述的纳米颗粒，和药学上可接受的载体。
56.权利要求53所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于静脉内、瘤内、动脉内、外用、眼内、眼部、颅内、鞘内、囊内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服施用。
57.权利要求53所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是糖或蛋白质。
58.权利要求55所述的药物组合物，其中所述糖选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和其组合，并且以大约5％至大约20％的浓度存在于所述药物组合物中。
59.权利要求55所述的药物组合物，其中所述蛋白质是白蛋白。
60.权利要求53-57中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被冷冻干燥。
61.制备权利要求21-52中任一项所述的纳米颗粒的方法，其包括：
a)使包括权利要求1-10中任一项所述的肽的组合物与包括所述货物分子的组合物组合以形成混合物；和
b)培育所述混合物以形成所述纳米颗粒。
62.治疗个体中的疾病的方法，其包括给所述个体施用有效量的权利要求53-57中任一项所述的药物组合物。
63.权利要求60所述的方法，其中所述疾病选自癌症、糖尿病、炎性疾病、纤维化、病毒性传染病、遗传性疾病、和老化与变性疾病。
64.权利要求61所述的方法，其中所述疾病是癌症。
65.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是实体瘤，并且其中所述药物组合物调节选自如下的一种或多种蛋白质的表达：生长因子与细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子与激酶、转录因子与其它转录调谐子、蛋白质表达与修饰调节子、和凋亡与转移调节子。
66.权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质中之一是选自EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α和wnt的生长因子或细胞因子。
67.权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质中之一是选自ER、PR、Her2、Her3、血管生成素受体、EGFR、FGFR、HGFR、HDGFR、IGFR、KGFR、MSFR、PDGFR、TGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、smoothened、patched和CXCR4的细胞表面受体。
68.权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质中之一是选自KRAS、NRAS、RAF、MEK、MEKK、MAPK、MKK、ERK、JNK、JAK、PKA、PKC、PI3K、Akt、mTOR、Raptor、Rictor、MLST8、PRAS40、DEPTOR、MSIN1、S6激酶、PDK1、BRAF、FAK、Src、Fyn、Shc、GSK、IKK、PLK-1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、CDK活化激酶、ALK/Met、Syk、BTK、Bcr-Abl、RET、β-联蛋白、Mcl-1和PKN3的信号传导分子或激酶。
69.权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质中之一是选自ATF-2、Chop、c-Jun、c-Myc、DPC4、Elk-1、Ets1、Max、MEF2C、NFAT4、Sap1a、STAT、Tal、p53、CREB、Myc、NF-κB、HDAC、HIF-1α和RRM2的转录因子或其它转录调谐子。
70.权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质中之一是选自泛素连接酶、LMP2、LMP7和MECL-1的蛋白质表达或修饰的调节子。
71.权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质中之一是选自XIAP、Bcl-2、骨桥蛋白、SPARC、MMP-2、MMP-9、uPAR的凋亡或转移的调节子。
72.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是实体瘤，并且其中所述药物组合物包括编码在肿瘤发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质的核酸。
73.权利要求70所述的方法，其中在肿瘤发展和/或进展中涉及的所述一种或多种蛋白质选自IL-2、IL-12、干扰素-γ、GM-CSF、B7-1、胱天蛋白酶-9、p53、MUC-1、MDR-1、HLA-B7/β2-微球蛋白、Her2、Hsp27、胸苷激酶和MDA-7。
74.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是血液学恶性肿瘤，其中所述药物组合物调节在血液学恶性肿瘤发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质的表达。
75.权利要求72所述的方法，其中在血液学恶性肿瘤发展和/或进展中涉及的所述一种或多种蛋白质选自GLI1、CTNNB1、eIF5A、突变体DDX3X、己糖激酶II、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、ARK5、ALK、MUC1、HMGA2、IRF1、RPN13、HDAC11、Rad51、Spry2、mir-146a、mir-146b、存活蛋白、MDM2、MCL1、CMYC、XBP1(剪接的和未剪接的)、SLAMF7、CS1、Erbb4、Cxcr4(沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)、Myc、Bcl2、Prdx1与Prdx2(伯基特淋巴瘤)、Bcl6、Idh1、Idh2、Smad、Ccnd2、细胞周期蛋白d1-2、B7-h1(pdl-1)和Pyk2。
76.权利要求61所述的方法，其中所述疾病是病毒性传染病，并且其中所述药物组合物调节在所述病毒性传染病发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质的表达。
77.权利要求74所述的方法，其中在所述病毒性传染病发展和/或进展中涉及的所述一种或多种蛋白质选自RSV核壳体、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S,X、HBV保守序列、HIVTat、HIV TAR RNA、人CCR5、miR-122、EBOV聚合酶L、VP24、VP40、GP/sGP、VP30、VP35、NPC1和TIM-1。
78.权利要求61所述的方法，其中所述疾病是遗传性疾病，并且其中所述药物组合物调节在所述遗传性疾病发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质的表达。
79.权利要求76所述的方法，其中在所述遗传性疾病发展和/或进展中涉及的所述一种或多种蛋白质选自运甲状腺素蛋白、MDS1-EVI1、PRDM16、SETBP1、β-珠蛋白和LPL。
80.权利要求61所述的方法，其中所述疾病是老化或变性疾病，并且其中所述药物组合物调节在所述老化或变性疾病发展和/或进展中涉及的一种或多种蛋白质的表达。
81.权利要求78所述的方法，其中在所述老化或变性疾病发展和/或进展中涉及的所述一种或多种蛋白质选自角蛋白K6A、角蛋白K6B、角蛋白16、角蛋白17、p53、β-2肾上腺素能受体(ADRB2)、TRPV1、VEGF、VEGFR、HIF-1和胱天蛋白酶-2。
82.权利要求61所述的方法，其中所述疾病是纤维化或炎性疾病，并且其中所述药物组合物调节在所述纤维化或炎性疾病发展和/或进展中涉及的两种或更多种蛋白质的表达。
83.权利要求80所述的方法，其中在所述纤维化或炎性疾病发展和/或进展中涉及的所述两种或更多种蛋白质选自SPARC、CTGF、TGFβ1、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、VEGF、血管紧张素II、TIMP、HSP47、血小板反应蛋白、CCN1、LOXL2、MMP2、MMP9、CCL2、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酸环化酶、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SOX9、抑制蛋白、PDCD4、PAI-1、NF-κB和PARP-1。
84.权利要求60-81中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
85.将分子递送入细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求11-20中任一项所述的复合物或权利要求21-52中任一项所述的纳米颗粒接触，其中所述复合物或纳米颗粒包括所述分子。
86.权利要求83所述的方法，其中所述细胞与所述纳米颗粒的接触在体内实施。
87.权利要求83所述的方法，其中所述细胞与所述纳米颗粒的接触离体实施。
88.权利要求83所述的方法，其中所述细胞与所述纳米颗粒的接触在体外实施。
89.权利要求83-86中任一项所述的方法，其中所述细胞是粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。
90.权利要求87所述的方法，其中所述细胞是T细胞。
91.权利要求87或88所述的方法，其中所述分子是编码嵌合抗原受体的质粒，所述嵌合抗原受体包括与靶抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。
92.权利要求89所述的方法，其中所述靶抗原是癌症相关抗原。
93.权利要求89或90所述的方法，其中所述复合物或纳米颗粒进一步包括siRNA。
94.权利要求89或90所述的方法，其进一步包括使所述细胞与权利要求11-20中任一项所述的复合物或权利要求21-52中任一项所述的纳米颗粒接触，其中所述复合物或纳米颗粒包括siRNA。
95.权利要求91或92所述的方法，其中所述siRNA特异性地靶向编码PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3或CTLA-4的RNA分子。
96.权利要求83-88中任一项所述的方法，其中所述分子是siRNA。
97.治疗个体中的疾病的方法，其包括：
a)根据权利要求83-94中任一项所述的方法将分子递送入细胞，从而产生包括所述分子的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞对治疗所述疾病是有用的；和
b)将所述修饰的细胞施用至所述个体。
98.权利要求95所述的方法，其中所述修饰的细胞经由静脉内、动脉内、腹膜内、囊内、皮下、鞘内、肺内、肌肉内、气管内、眼内、经皮、口服、或吸入途径被施用。
99.权利要求95或96所述的方法，其中所述疾病是癌症。
100.权利要求95-97中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
101.稳定核酸的方法，其包括：
a)使包括权利要求1-10中任一项所述的肽的组合物与包括所述核酸的组合物组合以形成混合物；和
b)培育所述混合物以形成包括所述核酸的复合物。
102.试剂盒，其包括含有权利要求1-10中任一项所述的肽的组合物和用于制备权利要求11-20中任一项所述的复合物和/或权利要求21-52中任一项所述的纳米颗粒的说明。
103.权利要求100所述的试剂盒，其进一步包括组合物，所述组合物包括选自肽、蛋白质、抗体、脂质、磷脂、聚合物、适配体、纳米颗粒、脂质体、树状聚体、聚合物囊泡、病毒载体、和微团的装配分子。
CN201580076607.0A 2014-12-24 2015-12-23 用于细胞内递送分子的肽和纳米颗粒 Pending CN107548401A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1403004 2014-12-24
FR14/03004 2014-12-24
PCT/EP2015/081197 WO2016102687A1 (en) 2014-12-24 2015-12-23 Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107548401A true CN107548401A (zh) 2018-01-05

Family

ID=55174604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580076607.0A Pending CN107548401A (zh) 2014-12-24 2015-12-23 用于细胞内递送分子的肽和纳米颗粒

Country Status (18)

Country Link
US (2) US10745440B2 (zh)
EP (2) EP3556768A1 (zh)
JP (1) JP6768664B2 (zh)
CN (1) CN107548401A (zh)
AU (1) AU2015370926B2 (zh)
CA (1) CA2971643C (zh)
CY (1) CY1121868T1 (zh)
DK (1) DK3237436T3 (zh)
ES (1) ES2743188T3 (zh)
HR (1) HRP20191400T1 (zh)
HU (1) HUE046054T2 (zh)
IL (1) IL252810B (zh)
LT (1) LT3237436T (zh)
MX (1) MX2017007919A (zh)
PL (1) PL3237436T3 (zh)
PT (1) PT3237436T (zh)
WO (1) WO2016102687A1 (zh)
ZA (1) ZA201704364B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108424437A (zh) * 2018-02-08 2018-08-21 青岛农业大学 一种递送分子及纳米颗粒、制备方法、用途
CN110540992A (zh) * 2019-08-21 2019-12-06 武汉泽智生物医药有限公司 增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用
CN112533938A (zh) * 2018-08-07 2021-03-19 苏黎世联邦理工学院 自组装成纳米颗粒的多肽
CN113563429A (zh) * 2021-07-19 2021-10-29 天津大学 一种基于烷基化多肽的核酸递送系统及制备方法与应用
CN114007654A (zh) * 2019-04-17 2022-02-01 阿迪根有限公司 用于分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014053880A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053879A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
PL3237436T3 (pl) 2014-12-24 2020-03-31 Aadigen, Llc Peptydy i nanocząsteczki do wewnątrzkomórkowego dostarczania cząsteczek
CN109689677B (zh) 2016-05-27 2023-11-10 阿迪根有限公司 用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
JP2020500031A (ja) * 2016-10-11 2020-01-09 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション ヒト化抗ｍｕｃ１＊抗体及び開裂酵素の使用
CN117305250A (zh) 2016-12-09 2023-12-29 昂克医疗有限公司 工程化天然杀伤细胞及其用途
CN111194351A (zh) * 2017-08-10 2020-05-22 阿迪根有限公司 用于细胞内递送病毒的肽和纳米颗粒
CN109557067B (zh) * 2017-09-26 2021-07-20 中国科学院烟台海岸带研究所 一种核—卫星结构金纳米颗粒及其制备方法
CA3079403A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of mrna
KR102146392B1 (ko) * 2019-06-11 2020-08-21 한림대학교 산학협력단 포스포글리세레이트 뮤테이즈 1 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
EP4185602A1 (en) 2020-07-24 2023-05-31 Aadigen, LLC Compositions and methods for treating viral infections
WO2023215549A1 (en) * 2022-05-05 2023-11-09 Case Western Reserve University Immunostimulatory nanoparticle

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014053629A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053622A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053624A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
CN104080480A (zh) * 2012-01-01 2014-10-01 奇比艾企业有限公司 用于选择性递送治疗剂和诊断剂的endo180靶向微粒

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08500681A (ja) 1992-08-25 1996-01-23 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング ペーパーホワイトｐｄｌｃシステム
US7514530B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centre National De La Recherche Scientifique Peptide carrier for delivering siRNA into mammalian cells
GB0513096D0 (en) 2005-06-28 2005-08-03 Strathclyde Treatment of microbial infections
WO2007069090A2 (en) 2005-12-06 2007-06-21 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US7579318B2 (en) 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
EP1795539B1 (en) 2005-12-06 2010-12-01 Centre National de la Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US7906484B2 (en) 2006-09-21 2011-03-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complex for transferring an anionic substance into a cell
CA2725227A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Asim Kumar Debnath Antiviral cell penetrating peptides
EP2331566B1 (en) 2008-08-26 2015-10-07 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
WO2012137036A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2013150338A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Centre National De La Recherche Scientifique Stapled cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US20150080320A1 (en) 2012-05-16 2015-03-19 Aadigen, Llc Multi-target modulation for treating fibrosis and inflammatory conditions
WO2014053881A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014099671A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
PT3613439T (pt) 2013-02-15 2021-05-12 Univ California Recetor de antigénio quimérico e métodos de utilização do mesmo
PL3237436T3 (pl) 2014-12-24 2020-03-31 Aadigen, Llc Peptydy i nanocząsteczki do wewnątrzkomórkowego dostarczania cząsteczek

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104080480A (zh) * 2012-01-01 2014-10-01 奇比艾企业有限公司 用于选择性递送治疗剂和诊断剂的endo180靶向微粒
WO2014053629A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053622A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053624A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAY C. MORRIS等: "A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
周洲等: "细胞穿透肽在肿瘤治疗中的研究进展", 《现代肿瘤医学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108424437A (zh) * 2018-02-08 2018-08-21 青岛农业大学 一种递送分子及纳米颗粒、制备方法、用途
CN112533938A (zh) * 2018-08-07 2021-03-19 苏黎世联邦理工学院 自组装成纳米颗粒的多肽
CN114007654A (zh) * 2019-04-17 2022-02-01 阿迪根有限公司 用于分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
CN110540992A (zh) * 2019-08-21 2019-12-06 武汉泽智生物医药有限公司 增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用
CN113563429A (zh) * 2021-07-19 2021-10-29 天津大学 一种基于烷基化多肽的核酸递送系统及制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3237436B1 (en) 2019-05-01
EP3556768A1 (en) 2019-10-23
PL3237436T3 (pl) 2020-03-31
US20210032290A1 (en) 2021-02-04
CA2971643C (en) 2024-03-12
DK3237436T3 (da) 2019-08-12
EP3237436A1 (en) 2017-11-01
CA2971643A1 (en) 2016-06-30
US10745440B2 (en) 2020-08-18
WO2016102687A1 (en) 2016-06-30
PT3237436T (pt) 2019-08-05
JP2018504896A (ja) 2018-02-22
HRP20191400T1 (hr) 2019-11-15
IL252810B (en) 2022-01-01
AU2015370926A1 (en) 2017-07-13
CY1121868T1 (el) 2020-10-14
HUE046054T2 (hu) 2020-01-28
LT3237436T (lt) 2019-09-25
US11713336B2 (en) 2023-08-01
AU2015370926B2 (en) 2020-07-02
US20190002499A1 (en) 2019-01-03
IL252810A0 (en) 2017-08-31
ES2743188T3 (es) 2020-02-18
ZA201704364B (en) 2019-09-25
MX2017007919A (es) 2018-04-13
JP6768664B2 (ja) 2020-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11713336B2 (en) Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of molecules
Forterre et al. A comprehensive review of cancer MicroRNA therapeutic delivery strategies
US12006508B2 (en) Methods and products for expressing proteins in cells
Qiu et al. Developing biodegradable lipid nanoparticles for intracellular mRNA delivery and genome editing
Kruspe et al. Aptamer-siRNA chimeras: discovery, progress, and future prospects
CN109689677B (zh) 用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
EP3535396A1 (en) Methods and compositions for enhancing gene editing
Xue et al. MicroRNA-targeted therapeutics for lung cancer treatment
Romano et al. microRNAs as novel therapeutics in cancer
JP2020537545A (ja) ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子
He et al. Multifunctional vector for delivery of genome editing plasmid targeting β-catenin to remodulate cancer cell properties
BR112020025824A2 (pt) composições e métodos para edição genômica por inserção de polinucleotídeos doadores
Liu et al. Peptide and aptamer decorated delivery system for targeting delivery of Cas9/sgRNA plasmid to mediate antitumor genome editing
Bestas et al. Splice-correction strategies for treatment of X-linked agammaglobulinemia
Asakiya et al. Current progress of miRNA-derivative nucleotide drugs: modifications, delivery systems, applications
Alden et al. Delivery of Therapeutic miR-148b Mimic via Poly (β Amino Ester) Polyplexes for Post-transcriptional Gene Regulation and Apoptosis of A549 Cells
JP5738862B2 (ja) 細胞への核酸導入方法および核酸複合体
US20190211317A1 (en) Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
Lessl et al. mCherry on Top: A Positive Read-Out Cellular Platform for Screening DMD Exon Skipping Xenopeptide–PMO Conjugates
Shaharyar et al. Vaccine Formulation Strategies and Challenges Involved in RNA Delivery for Modulating Biomarkers of Cardiovascular Diseases: A Race from Laboratory to Market
Pi RNA Nanotechnology for Next Generation Targeted Drug Delivery
Cultrara Applications of siRNA for Cancer Gene Therapy
AU2024202093A1 (en) Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of mrna
Kitani et al. Efficient In Vivo Delivery of Plasmids and Oligonucleotides Using Hemagglutinating Virus of Japan Envelope (HVJ‐E) Vector in Immunological Disease Models

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination