JP6768664B2 - 分子の細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子 - Google Patents

分子の細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子 Download PDF

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Description

本発明は、核酸などのカーゴ分子の安定化および送達に有用であるペプチドおよびペプチド含有複合体／ナノ粒子に関する。
小分子は、依然として、診療所で使用される主要薬物であるが、非常に多くの場合、それらの治療効果は、標的に到達する能力不足、特異性の欠如、毒性および大きな副作用につながる高用量の必要などの、限界に達している。過去１０年にわたって、小分子の限界および遺伝子治療の限界を回避するために、それらの標的に対して高い特異性を呈するがリピンスキーの法則に従わないタンパク質、ペプチドおよび核酸などのより大きい治療用分子の発見の劇的な加速が目撃されてきた。これらの分子の薬学的効力は、それらの不良なｉｎ ｖｉｖｏ安定性によって、および細胞内へのそれらの少ない取り込みによって、依然として制限されている。それ故、「送達」が治療パズルの主要ピースとなり、送達戦略を検証するために新たな道しるべ：（ａ）毒性の欠如、（ｂ）低用量でのｉｎ ｖｉｖｏ効率、（ｃ）治療応用のための取り扱いの容易さ、（ｄ）迅速なエンドソーム放出、および（ｅ）標的に到達する能力が確立されてきた。ウイルス性送達戦略は、遺伝子および細胞治療に大きな希望を与えてきたが、それらの臨床応用では、副作用および毒性作用が問題となっている（Ｉｂｒａｈｅｅｍら（２０１４年）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ４５９巻、７０〜８３頁）。主に非ウイルス性戦略の開発に研究の重点が置かれ、脂質、ポリカチオン性ナノ粒子およびペプチドベースの製剤を含む様々な方法が提案されてきたが、ｉｎ ｖｉｖｏで効率的であり、臨床現場に届いているのは、これらの技術のうちのほんの少数である（Ｙｉｎら（２０１４年）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １５巻、５４１〜５５５頁）。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、最も有望な非ウイルス性戦略の１つである。ＣＰＰの定義は絶えず進化し続けているが、ＣＰＰは、一般に、タンパク質にまたはキメラ配列に由来する、アミノ酸３０未満の短鎖ペプチドと説明される。ＣＰＰは、通常、両親媒性であり、正味正電荷を有する（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚら（２００９年）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７巻、１９５〜２０６頁）。ＣＰＰは、生体膜を透過すること、様々な生体分子の細胞膜経由での細胞質への移動を誘発すること、およびそれらの細胞内経路指定を向上させることができ、その結果、標的との相互作用を助けることができる。ＣＰＰを２つの主要クラスに細分することができ、第１のクラスは、カーゴとの化学結合を必要とし、第２のクラスは、安定した非共有結合性複合体の形成を伴う。両方の戦略からのＣＰＰが多種多様な細胞型およびｉｎ ｖｉｖｏモデルへの、広範なカーゴ（プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、ペプチド、リポソーム、ナノ粒子など。）の送達に有利であると報告されている（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；Ｈｅｉｔｚら（２００９年）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７巻、１９５〜２０６頁；Ｍｉｃｋａｎら（２０１４年）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５巻、２００〜２０９頁；Ｓｈｕｋｌａら（２０１４年）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １１巻、３３９５〜３４０８頁）。
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の概念は、そもそも、一部のタンパク質、主として転写因子が細胞内でおよびある細胞から別の細胞にシャトリングされうるという観察に基づいて提案された（総説については、Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）；
Ｈｅｉｔｚら（２００９年）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７巻、１９５〜２０６頁を参照されたい）。最初の観察は１９８８年にＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏによってなされた。彼らは、ＨＩＶ−１の転写トランス活性化（Ｔａｔ）タンパク質が細胞に進入し、核に移行することを証明した。１９９１年に、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚのグループは、ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメインで同じ結論に達し、このドメインが神経細胞により内在化されることを立証した。これらの研究の発端は、ペネトラチンと命名されたアンテナペディアのホメオドメインの第３ヘリックスに由来する１６ｍｅｒペプチドである、最初のタンパク質形質導入ドメインの１９９４年における発見にあった。１９９７年にはＬｅｂｌｅｕのグループが細胞内取り込みに必要とされるＴａｔの最小配列を同定し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＤの応用の最初の概念実証が小さいペプチドおよび大きいタンパク質の送達についてＤｏｗｄｙのグループによって報告された（Ｇｕｍｐ ＪＭ、およびＤｏｗｄｙ ＳＦ（２００７年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３巻、４４３〜４４８頁）。歴史的に、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の観念は、１９９８年にＬａｎｇｅｌのグループによって導入され、スズメバチ毒ペプチドであるマストパランに結合された、神経ペプチドガラニンのＮ末端断片に由来する、最初のキメラペプチド担体であるトランスポータンが設計された。トランスポータンは、培養細胞でもｉｎ ｖｉｖｏでもＰＮＡ（ペプチド核酸）の送達を向上させると当初は報告された（Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ））。１９９７年に、ＨｅｉｔｚおよびＤｉｖｉｔａのグループは、ＣＰＰをそれらのカーゴとの安定だが非共有結合性の複合体の形成に関与させる新たな戦略を提案した（Ｍｏｒｒｉｓら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻、２７３０〜２７３６頁）。この戦略は、最初、親水性（極性）ドメインと疎水性（非極性）ドメインの２つのドメインからなる短鎖ペプチド担体（ＭＰＧ）に基づいた。ＭＰＧは、核酸の送達用に設計された。次に、一次両親媒性ペプチドＰｅｐ−１が、タンパク質およびペプチドの非共有結合性送達のために提案された（Ｍｏｒｒｉｓら（２００１年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９巻、１１７３〜１１７６頁）。その後、ＷｅｎｄｅｒのグループおよびＦｕｔａｋｉのグループは、ポリアルギニン配列（Ａｒｇ８）が小および大分子を細胞におよびｉｎ ｖｉｖｏで送達するのに十分であることを立証した（Ｎａｋａｓｅら（２００４年）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０巻、１０１１〜１０２２頁；Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２００４年）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６巻
、９５０６〜９５０７頁）。それ以来、天然または非天然配列に由来する多くのＣＰＰが同定され、そのリストは絶えず増え続けている。単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質から、カルシトニンから、抗微生物性または毒素ペプチドから、細胞周期制御に関与するタンパク質から、およびポリプロリンリッチペプチドからペプチドが誘導された（Ｈｅｉｔｚら（２００９年）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７巻、１９５〜２０６頁）。より最近になって、二次両親媒性ＣＰＰに基づく新たな非共有結合性戦略が記載された。ＣＡＤＹおよびＶＥＰＥＰファミリーなどのこれらのペプチドは、親水性および疎水性残基を分子の異なる側面に有するヘリックス形に自己集合することができる。ＷＯ２０１２／１３７１５０はＶＥＰＥＰ−６ペプチドを開示しており、ＵＳ２０１０／００９９６２６はＣＡＤＹペプチドを開示しており、ＷＯ２０１４／０５３８８０はＶＥＰＥＰ−９を開示している。
本明細書において言及するすべての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、ここにそれら全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
国際公開第２０１２／１３７１５０号 米国特許出願公開第２０１０／００９９６２６号明細書 国際公開第２０１４／０５３８８０号
Ｉｂｒａｈｅｅｍら（２０１４年）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ４５９巻、７０〜８３頁 Ｙｉｎら（２０１４年）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １５巻、５４１〜５５５頁 Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＲＣ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ） Ｈｅｉｔｚら（２００９年）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７巻、１９５〜２０６頁 Ｍｉｃｋａｎら（２０１４年）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５巻、２００〜２０９頁 Ｓｈｕｋｌａら（２０１４年）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １１巻、３３９５〜３４０８頁 Ｇｕｍｐ ＪＭ、およびＤｏｗｄｙ ＳＦ（２００７年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３巻、４４３〜４４８頁 Ｍｏｒｒｉｓら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻、２７３０〜２７３６頁 Ｍｏｒｒｉｓら（２００１年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９巻、１１７３〜１１７６頁 Ｎａｋａｓｅら（２００４年）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０巻、１０１１〜１０２２頁 Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２００４年）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６巻、９５０６〜９５０７頁
本出願は、核酸などのカーゴ分子の安定化および送達に有用な新規クラスのペプチド（ＡＤＧＮペプチド）を提供する。一態様では、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが１９または２０アミノ酸である。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが約５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０アミノ酸のいずれか以下である。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが約５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００またはそれ超のアミノ酸のいずれか以上である。一部の実施形態では、ペプチドはＬ−アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドはＤ−アミノ酸を含む。
上記のペプチドのいずれかによる一部の実施形態では、ペプチドは、該ペプチドのＮ末端に共有結合している１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、脂質（リン脂質を含む）、ポリエチレングリコール、核局在シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、および標的化分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に共有結合で連結しているアセチル基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、該ペプチドのＣ末端に共有結合で連結している１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝型Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、一級または二級アミン、オシディック（ｏｓｉｄｉｃ）誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、および標的化分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＣ末端に共有結合しているシステアミド基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、「ニート」であり、すなわち、上記のいずれの他の部分も含有しない。
上記のペプチドのいずれかによる一部の実施形態では、ペプチドは、ステープル留めされている。例えば、一部の実施形態では、ペプチドは、３つまたは６つの残基によって隔てられている２つの残基間に炭化水素結合を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、
のアミノ酸配列を含む（配列中、下付文字「Ｓ」の付いている残基は、炭化水素結合によって結合されている２つの残基である）。
上記のペプチドのうちのいずれか１つのペプチドによる一部の実施形態では、配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を有するペプチドの部分は、単一コアヘリックスモチーフを形成する。一部の実施形態では、配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を有するペプチドの部分は、ヘリックス構造であって、ＳまたはＲ残基が同じ側面にあり、Ｗ残基が他の側面にあり、そのヘリックスの１つの側面の静電接触部および他の側面の疎水性接触部のパッチを形成する、ヘリックス構造を形成する。
本発明の別の態様では、上記のＡＤＧＮペプチドのうちのいずれか１つのペプチドとカーゴ分子とを含む（「から本質的になる」または「からなる」を包含する）複合体が提供される。本出願の別の態様では、上記のＡＤＧＮペプチドのうちのいずれか１つのペプチドとカーゴ分子とを含む（「から本質的になる」または「からなる」を包含する）ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、カーゴは、荷電している。一部の実施形態では、カーゴは、非荷電である。一部の実施形態では、カーゴは、物理的にまたは化学的に修飾されている。一部の実施形態では、カーゴは、未修飾である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、およびこれらの類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体をコードする。一部の実施形態では、標的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４ｖ６およびＣＳ１からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、長さが約２〜約４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸は、長さが約１００ヌクレオチドまでである。一部の実施形態では、核酸は、長さが約１００ヌクレオチドより長い。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも１つの修飾結合、例えば、ホスホロチオエート結合、または２’−メトキシ、２’−フルオロおよび２’−Ｏ−メトキシエチルを含むリボース環の２’位における修飾を含有する。
上記の複合体またはナノ粒子のいずれかによる一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のカーゴ分子のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１〜約１：８０（例えば、大体、約１：１〜約１：５、約１：５〜約１：１０、約１：１０〜約１：１５、約１：１５〜約１：２０、約１：２０〜約１：２５、約１：２５〜約１：３０、約１：３０〜約１：３５、約１：３５〜約１：４０、約１：４０〜約１：４５、約１：４５〜約１：５０、約１：５０〜約１：５５、約１：５５〜約１：６０、約１：６０〜約１：６５、約１：６５〜約１：７０、約１：７０〜約１：７５、および約１：７５〜約１：８０のいずれかを含む）である。
一部の実施形態では、カーゴ分子は、集合分子（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ウイルスベクター、およびミセル）と複合体化されて、ナノ粒子のコアを形成する。一部の実施形態では、集合分子は、上記のＡＤＧＮペプチドのうちのいずれか１つのペプチドである（例えば、ナノ粒子は、ＡＤＧＮペプチドとカーゴ分子とを含むコアを含む（「から本質的になる」または「からなる」を包含する）ことがある）。一部の実施形態では、集合分子は、ＡＤＧＮペプチドではない（例えば、ナノ粒子は、カーゴ分子と非ＡＤＧＮペプチドとを含むコアを含むことがあり、その場合、コアは、ＡＤＧＮペプチドで被覆されている）。一部の実施形態では、ナノ粒子は、表面層をさらに含む。一部の実施形態では、表面層は、上記のＡＤＧＮペプチドのうちのいずれか１つのペプチドを含む。一部の実施形態では、表面層は、ＡＤＧＮペプチドでない細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、中間層をさらに含む。一部の実施形態では、中間層は、上記のＡＤＧＮペプチドのうちのいずれか１つのペプチドを含む。一部の実施形態では、中間層は、ＡＤＧＮペプチドでない細胞透過性ペプチドを含む。
上記のナノ粒子のうちのいずれか１つのナノ粒子による一部の実施形態では、ナノ粒子は、表面に標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ペプチド（例えば、ＡＧＤＮペプチド）に結合している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化部分に共有結合している。一部の実施形態では、標的化部分は、ナノ粒子を組織または特定の細胞に標的化する。
上記のナノ粒子のうちのいずれか１つのナノ粒子による一部の実施形態では、ナノ粒子のサイズ（直径）は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子のサイズ（直径）は、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子のサイズ（直径）は、約８０ｎｍ〜約１４０ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子のサイズ（直径）は、約１５０ｎｍ、１４０ｎｍ、１３０ｎｍ、１２０ｎｍ、１１０ｎｍまたは１００ｎｍのいずれか１つ以下である。
一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位の絶対値は、約５０ｍＶ以下であり、例えば、約４０ｍＶ、３０ｍＶ、２０ｍＶ、１０ｍＶ、９ｍＶ、８ｍＶ、７ｍＶ、６ｍＶまたは５ｍＶのいずれか以下を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約−１５〜約１５ｍＶ、例えば、約−５〜約１０ｍＶである。
上記のナノ粒子または複合体のうちのいずれか１つのナノ粒子または複合体による一部の実施形態では、ナノ粒子または複合体は、複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子または複合体は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれかの異なるカーゴ分子（例えば、核酸）を含む。一部の実施形態では、カーゴは、同じ種類のもの（例えば、複数のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）である。一部の実施形態では、カーゴは、異なる種類のものである。
一部の実施形態では、上記のナノ粒子のうちのいずれか１つのナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約８０ｎｍ〜約１４０ｎｍである。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約１５０ｎｍ、１４０ｎｍ、１３０ｎｍ、１２０ｎｍ、１１０ｎｍまたは１００ｎｍのいずれか１つ以下である。一部の実施形態では、組成物は、約０．１、０．２、０．３、０．４または０．５のいずれか以下の多分散指数を有する。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子は、同じＡＤＧＮペプチドおよびカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子は、異なるＡＤＧＮペプチドおよび／またはカーゴ分子を含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の懸濁液である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、凍結乾燥される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、少なくとも約２４時間、４８時間、７２時間、４日、１０日、３０日、６０日、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月またはそれより長い期間のいずれかにわたって、室温で、または冷蔵条件下で、例えば、沈殿、凝集、サイズ変化および／または有効性の喪失なく、安定している。
本出願の別の態様では、上記の複合体またはナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、頭蓋内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、空洞内または経口投与用に製剤化される。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、糖またはタンパク質を含む。一部の実施形態では、糖は、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せからなる群から選択され、任意選択で、約５％〜約２０％の濃度で医薬組成物中に存在する。一部の実施形態では、タンパク質は、アルブミンである。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥される。
本出願のさらに別の態様では、上記のナノ粒子を調製する方法であって、ａ）上記のＡＤＧＮペプチドをカーゴ分子と併せて混合物を形成するステップ、およびｂ）混合物をインキュベートしてナノ粒子を形成するステップを含む方法が提供される。
本出願の別の態様では、カーゴ分子（例えば、核酸）を安定化する方法であって、カーゴ分子を上記のＡＤＧＮペプチドと併せることによってカーゴ分子を安定化するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、カーゴ分子およびＡＤＧＮペプチドは、上記の複合体またはナノ粒子を形成する。一部の実施形態では、カーゴ分子は核酸であり、ＡＤＧＮペプチドは、核酸のスーパーコイル構造を安定化する。一部の実施形態では、カーゴ分子は、（例えば、血清成分またはヌクレアーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで）分解されやすく、ＡＤＧＮペプチドは、カーゴ分子を分解から保護する。
本出願のさらなる態様では、個体の疾患を処置する方法であって、上記のカーゴ分子およびＡＤＧＮペプチドを（例えば、複合体またはナノ粒子の形態で）含む有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、疾患は、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患からなる群から選択される。一部の実施形態では、疾患は、がん、例えば固形腫瘍である。
一部の実施形態では、医薬組成物の投与は、１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する結果となる。本明細書に記載する方法によって発現を調節することができる好適な遺伝子としては、増殖因子、サイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子、キナーゼ、転写因子または転写の他の調節因子、タンパク質発現または修飾の制御因子、およびアポトーシスまたは転移の制御因子をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびｗｎｔを含むがこれらに限定されない、増殖因子またはサイトカインをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびｗｎｔを含むがこれらに限定されない、増殖因子またはサイトカインをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、アンジオポエチン受容体、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＨＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＧＦＲ、ＭＳＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体（ＦＺＤ−１〜１０）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰａｔｃｈｅｄおよびＣＸＣＲ４を含むがこれらに限定されない、細胞表面受容体をコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＭＡＰＫ、ＭＫＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＪＡＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＭＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０、ＤＥＰＴＯＲ、ＭＳＩＮ１、Ｓ６キナーゼ、ＰＤＫ１、ＢＲＡＦ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、ＧＳＫ、ＩＫＫ、ＰＬＫ−１、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ１〜１３）、ＣＤＫ活性化キナーゼ、ＡＬＫ／Ｍｅｔ、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＲＥＴ、β−カテニン、Ｍｃｌ−１およびＰＫＮ３を含むがこれらに限定されない、シグナル伝達分子またはキナーゼをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＴＦ−２、Ｃｈｏｐ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＰＣ４、Ｅｌｋ−１、Ｅｔｓ１、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＦＡＴ４、Ｓａｐ１ａ、ＳＴＡＴ、Ｔａｌ、ｐ５３、ＣＲＥＢ、Ｍｙｃ、ＮＦ−κＢ、ＨＤＡＣ、ＨＩＦ−１αおよびＲＲＭ２を含むがこれらに限定されない、転写因子または転写の他の調節因子をコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ユビキチンリガーゼ、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＭＥＣＬ−１およびｍｉＲＮＡを含むがこれらに限定されない、タンパク質発現または修飾の制御因子をコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびｕＰＡＲを含むがこれらに限定されない、アポトーシスまたは転移の制御因子をコードする。
一部の実施形態では、疾患が固形腫瘍である場合、発現が調節される遺伝子は、腫瘍形成および／または進行に関与するタンパク質をコードしうる。一部の実施形態では、腫瘍形成および／または進行に関与するタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、カスパーゼ−９、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ＭＤＲ−１、ＨＬＡ−Ｂ７／ベータ２−ミクログロブリン、Ｈｅｒ２、Ｈｓｐ２７、チミジンキナーゼおよびＭＤＡ−７を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、疾患が血液学的悪性腫瘍である場合、発現が調節される遺伝子は、血液学的悪性腫瘍の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードしうる。一部の実施形態では、血液学的悪性腫瘍の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ＧＬＩ１、ＣＴＮＮＢ１、ｅＩＦ５Ａ、変異型ＤＤＸ３Ｘ、ヘキソキナーゼＩＩ、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２、ＡＲＫ５、ＡＬＫ、ＭＵＣ１、ＨＭＧＡ２、ＨＩＦ−１アルファ、ＩＲＦ１、ＲＰＮ１３、ＨＤＡＣ１１、Ｒａｄ５１、Ｓｐｒｙ２、ｍｉｒ−１４６ａ、ｍｉｒ−１４６ｂ、サバイビン、ＭＤＭ２、ＭＣＬ１、ＣＭＹＣ、ＸＢＰ１（スプライス型および非スプライス型）、ＳＬＡＭＦ７、ＣＳ１、Ｅｒｂｂ４、Ｃｘｃｒ４（ワルデンストレームマクログロブリン血症）、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、Ｐｒｄｘ１およびＰｒｄｘ２（バーキットリンパ腫）、Ｂｃｌ６、Ｉｄｈ１、Ｉｄｈ２、Ｓｍａｄ、Ｃｃｎｄ２、サイクリンｄ１〜２、Ｂ７−ｈ１（ｐｄｌ−１）およびＰｙｋ２を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、疾患がウイルス感染症である場合、発現が調節される遺伝子は、ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードしうる。一部の実施形態では、ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ＲＳＶヌクレオカプシド、Ｐｒｅ−ｇｅｎ／Ｐｒｅ−Ｃ、Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ、Ｘ、ＨＢＶ保存配列、ＨＩＶ Ｔａｔ、ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡ、ヒトＣＣＲ５、ｍｉＲ−１２２、ＥＢＯＶポリメラーゼＬ、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＧＰ／ｓＧＰ、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＮＰＣ１およびＴＩＭ−１を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、疾患が遺伝性疾患である場合、発現が調節される遺伝子は、遺伝性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、トランスサイレチン、ＭＤＳ１−ＥＶＩ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＥＴＢＰ１、β−グロビンおよびＬＰＬを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、疾患が老齢または変性疾患である場合、発現が調節される遺伝子は、老齢または変性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードしうる。一部の実施形態では、老齢または変性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ケラチンＫ６Ａ、ケラチンＫ６Ｂ、ケラチン１６、ケラチン１７、ｐ５３、β−２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、ＴＲＰＶ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１アルファおよびカスパーゼ−２を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、疾患が線維性または炎症性疾患である場合、発現が調節される遺伝子は、線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードしうる。一部の実施形態では、線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ ３、Ｓｍａｄ ４、Ｓｍａｄ ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−κＢおよびＰＡＲＰ−１からなる群から選択される。
上記の処置方法のうちのいずれか１つの方法による一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
本発明の別の態様では、カーゴ分子を細胞に送達する方法であって、ＡＤＧＮペプチドおよびカーゴ分子を（例えば、上記の複合体またはナノ粒子の形態で）含む組成物と細胞を接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞の接触は、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞の接触は、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞の接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、細胞は、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードするプラスミドである。一部の実施形態では、標的抗原は、がん関連抗原である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ｓｉＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＤＧＮペプチドおよびｓｉＲＮＡを（例えば、上記の複合体またはナノ粒子の形態で）含む第２の組成物と細胞を接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３またはＣＴＬＡ−４をコードするＲＮＡ分子を特異的に標的とする。
一部の実施形態では、上記のカーゴ分子を細胞に送達する方法のいずれかによると、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡである。
本発明の別の態様では、個体の疾患を処置する方法であって、ａ）上記の方法のうちのいずれか１つの方法に従って分子を細胞に送達することによって、分子を含む改変細胞を産生するステップであって、改変細胞が疾患の処置に有用である、ステップ、およびｂ）改変細胞を個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、改変細胞は、静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与される。一部の実施形態では、疾患はがんである。一部の実施形態では、個体はヒトである。
本発明のさらに別の態様では、上記のＡＤＧＮペプチドのうちのいずれか１つのペプチドを含む組成物と、上記の複合体および／またはナノ粒子を調製するための説明書とを含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群から選択される集合分子を含む組成物をさらに含む。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
アミノ酸配列Ｘ １ ＫＷＲＳＸ ２ Ｘ ３ Ｘ ４ ＲＷＲＬＷＲＸ ５ Ｘ ６ Ｘ ７ Ｘ ８ ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ １ は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ ２ 〜Ｘ ８ は、任意のアミノ酸である）を含む、天然に存在しないペプチド。
（項目２）
Ｘ １ が、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ ２ が、ＡまたはＶであり、Ｘ ３ が、ＧまたはＬであり、Ｘ ４ が、ＷまたはＹであり、Ｘ ５ が、ＶまたはＳであり、Ｘ ６ が、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ ７ が、ＳまたはＬであり、Ｘ ８ が、ＷまたはＹである、項目１に記載のペプチド。
（項目３）

のアミノ酸配列を含む、項目２に記載のペプチド。
（項目４）
長さが１９または２０アミノ酸である、項目１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目５）
Ｌ−アミノ酸を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目６）
Ｄ−アミノ酸を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目５）
前記ペプチドのＮ末端に共有結合している１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、および標的化分子からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目６）
前記ペプチドは、そのＮ末端に共有結合しているアセチル基を含む、項目５に記載のペプチド。
（項目７）
前記ペプチドのＣ末端に共有結合している１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝型Ｃ １ 〜Ｃ ６ アルキル基、一級または二級アミン、オシディック誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、および標的化分子からなる群から選択される、項目１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目８）
前記ペプチドは、そのＣ末端に共有結合しているシステアミド基を含む、項目７に記載のペプチド。
（項目９）
炭化水素結合によって結合されている、３つまたは６つの残基によって隔てられている２つの残基を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
（項目１０）

のアミノ酸配列を含み、配列中、下付文字「Ｓ」の付いている残基が、前記炭化水素結合によって結合されている２つの残基である、項目９に記載のペプチド。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドとカーゴ分子とを含む複合体。
（項目１２）
前記カーゴ分子が核酸である、項目１１に記載の複合体。
（項目１３）
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目１２に記載の複合体。
（項目１４）
前記核酸がオリゴヌクレオチドである、項目１２に記載の複合体。
（項目１５）
前記核酸が、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１６）
前記核酸が、長さ約２〜約４０ヌクレオチドである、項目１２〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１７）
前記核酸が、長さ約１００ヌクレオチドまでである、項目１２〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１８）
前記核酸が、長さ約１００ヌクレオチドより長い、項目１２〜１３および１５のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１９）
前記ＤＮＡプラスミドが、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードする、項目１３に記載の複合体。
（項目２０）
前記標的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４ｖ６およびＣＳ１からなる群から選択される、項目１９に記載の複合体。
（項目２１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドとカーゴ分子とを含むナノ粒子。
（項目２２）
前記カーゴ分子が核酸である、項目２１に記載のナノ粒子。
（項目２３）
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目２２に記載のナノ粒子。
（項目２４）
前記核酸がオリゴヌクレオチドである、項目２２に記載のナノ粒子。
（項目２５）
前記核酸が、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目２２〜２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目２６）
前記核酸が、長さ約２〜約４０ヌクレオチドである、項目２２〜２５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目２７）
前記核酸が、長さ約１００ヌクレオチドまでである、項目２２〜２３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目２８）
前記核酸が、長さ約１００ヌクレオチドより長い、項目２２、２３および２５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目２９）
前記ＤＮＡプラスミドが、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードする、項目２３に記載のナノ粒子。
（項目３０）
前記標的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４ｖ６およびＣＳ１からなる群から選択される、項目２９に記載のナノ粒子。
（項目３１）
前記ナノ粒子中の前記カーゴ分子の前記ペプチドに対するモル比が、約１：１〜約１：８０である、項目２１〜３０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目３２）
前記ナノ粒子中の前記カーゴ分子の前記ペプチドに対するモル比が、約１：５〜約１：４０である、項目３１に記載のナノ粒子。
（項目３３）
前記カーゴ分子が、集合分子と複合体化されて前記ナノ粒子のコアを形成する、項目２１〜３２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目３４）
前記集合分子が、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群から選択される、項目３３に記載のナノ粒子。
（項目３５）
前記集合分子が、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドである、項目３３に記載のナノ粒子。
（項目３６）
前記集合分子が、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドでない、項目３３に記載のナノ粒子。
（項目３７）
表面層をさらに含む、項目２１〜３６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目３８）
前記表面層が、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドを含む、項目３７に記載のナノ粒子。
（項目３９）
前記表面層が、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドでない細胞透過性ペプチドを含む、項目３７に記載のナノ粒子。
（項目４０）
中間層をさらに含む、項目３７〜３９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目４１）
前記中間層が、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドを含む、項目４０に記載のナノ粒子。
（項目４２）
前記中間層が、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドでない細胞透過性ペプチドを含む、項目４０に記載のナノ粒子。
（項目４３）
表面に標的化部分を含む、項目２１〜４２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目４４）
前記標的化部分が、ペプチドに結合している、項目４３に記載のナノ粒子。
（項目４５）
前記ペプチドが、前記標的化部分に共有結合している、項目４４に記載のナノ粒子。
（項目４６）
前記標的化部分が、前記ナノ粒子を組織に標的化する、項目４３〜４５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目４７）
複数のカーゴ分子を含む、項目２１〜４６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目４８）
前記ナノ粒子の平均直径が、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである、項目２１〜４７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目４９）
前記ナノ粒子の前記平均直径が、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである、項目４８に記載のナノ粒子。
（項目５０）
前記ナノ粒子の前記平均直径が、約８０ｎｍ〜約１４０ｎｍである、項目４９に記載のナノ粒子。
（項目５１）
ゼータ電位の絶対値が約３０ｍＶ未満である、項目２１〜５０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
（項目５２）
前記ゼータ電位の前記絶対値が約１０ｍＶ未満である、項目５１に記載のナノ粒子。
（項目５３）
項目１１〜２０のいずれか一項に記載の複合体または項目２１〜５２のいずれか一項に記載のナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目５４）
静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、頭蓋内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、空洞内または経口投与用に製剤化される、項目５３に記載の医薬組成物。
（項目５５）
前記薬学的に許容される担体が、糖またはタンパク質である、項目５３に記載の医薬組成物。
（項目５６）
前記糖が、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せからなる群から選択され、約５％〜約２０％の濃度で前記医薬組成物中に存在する、項目５５に記載の医薬組成物。
（項目５７）
前記タンパク質がアルブミンである、項目５５に記載の医薬組成物。
（項目５８）
凍結乾燥される、項目５３〜５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５９）
項目２１〜５２のいずれか一項に記載のナノ粒子を調製する方法であって、
ａ）項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物を、前記カーゴ分子を含む組成物と併せて混合物を形成するステップ、および
ｂ）前記混合物をインキュベートして前記ナノ粒子を形成するステップ
を含む方法。
（項目６０）
個体の疾患を処置する方法であって、有効量の項目５３〜５７のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記個体に投与するステップを含む方法。
（項目６１）
前記疾患が、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記疾患が、がんである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記がんが、固形腫瘍であり、前記医薬組成物が、増殖因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および転写の他の調節因子、タンパク質発現および修飾の制御因子ならびにアポトーシスおよび転移の制御因子からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質の発現を調節する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記１つまたは複数のタンパク質のうちの１つが、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびｗｎｔからなる群から選択される増殖因子またはサイトカインである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記１つまたは複数のタンパク質のうちの１つが、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、アンジオポエチン受容体、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＨＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＧＦＲ、ＭＳＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体（ＦＺＤ−１〜１０）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＰａｔｃｈｅｄおよびＣＸＣＲ４からなる群から選択される細胞表面受容体である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記１つまたは複数のタンパク質のうちの１つが、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＭＡＰＫ、ＭＫＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＪＡＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＭＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０、ＤＥＰＴＯＲ、ＭＳＩＮ１、Ｓ６キナーゼ、ＰＤＫ１、ＢＲＡＦ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、ＧＳＫ、ＩＫＫ、ＰＬＫ−１、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ１〜１３）、ＣＤＫ活性化キナーゼ、ＡＬＫ／Ｍｅｔ、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＲＥＴ、β−カテニン、Ｍｃｌ−１およびＰＫＮ３からなる群から選択されるシグナル伝達分子またはキナーゼである、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記１つまたは複数のタンパク質のうちの１つが、ＡＴＦ−２、Ｃｈｏｐ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＰＣ４、Ｅｌｋ−１、Ｅｔｓ１、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＦＡＴ４、Ｓａｐ１ａ、ＳＴＡＴ、Ｔａｌ、ｐ５３、ＣＲＥＢ、Ｍｙｃ、ＮＦ−κＢ、ＨＤＡＣ、ＨＩＦ−１αおよびＲＲＭ２からなる群から選択される転写因子または転写の他の調節因子である、項目６３に記載の方法。
（項目６８）
前記１つまたは複数のタンパク質のうちの１つが、ユビキチンリガーゼ、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ−１からなる群から選択される、タンパク質発現または修飾の制御因子である、項目６３に記載の方法。
（項目６９）
前記１つまたは複数のタンパク質のうちの１つが、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡＲからなる群から選択される、アポトーシスまたは転移の制御因子である、項目６３に記載の方法。
（項目７０）
前記がんが、固形腫瘍であり、前記医薬組成物が、腫瘍形成および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸を含む、項目６２に記載の方法。
（項目７１）
腫瘍形成および／または進行に関与する前記１つまたは複数のタンパク質が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、カスパーゼ−９、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ＭＤＲ−１、ＨＬＡ−Ｂ７／ベータ２−ミクログロブリン、Ｈｅｒ２、Ｈｓｐ２７、チミジンキナーゼおよびＭＤＡ−７からなる群から選択される、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記がんが、血液学的悪性腫瘍であり、前記医薬組成物が、血液学的悪性腫瘍の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質の発現を調節する、項目６２に記載の方法。
（項目７３）
血液学的悪性腫瘍の発症および／または進行に関与する前記１つまたは複数のタンパク質が、ＧＬＩ１、ＣＴＮＮＢ１、ｅＩＦ５Ａ、変異型ＤＤＸ３Ｘ、ヘキソキナーゼＩＩ、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２、ＡＲＫ５、ＡＬＫ、ＭＵＣ１、ＨＭＧＡ２、ＩＲＦ１、ＲＰＮ１３、ＨＤＡＣ１１、Ｒａｄ５１、Ｓｐｒｙ２、ｍｉｒ−１４６ａ、ｍｉｒ−１４６ｂ、サバイビン、ＭＤＭ２、ＭＣＬ１、ＣＭＹＣ、ＸＢＰ１（スプライス型および非スプライス型）、ＳＬＡＭＦ７、ＣＳ１、Ｅｒｂｂ４、Ｃｘｃｒ４（ワルデンストレームマクログロブリン血症）、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、Ｐｒｄｘ１およびＰｒｄｘ２（バーキットリンパ腫）、Ｂｃｌ６、Ｉｄｈ１、Ｉｄｈ２、Ｓｍａｄ、Ｃｃｎｄ２、サイクリンｄ１〜２、Ｂ７−ｈ１（ｐｄｌ−１）およびＰｙｋ２からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記疾患が、ウイルス感染症であり、前記医薬組成物が、前記ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質の発現を調節する、項目６１に記載の方法。
（項目７５）
前記ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与する前記１つまたは複数のタンパク質が、ＲＳＶヌクレオカプシド、Ｐｒｅ−ｇｅｎ／Ｐｒｅ−Ｃ、Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ、Ｘ、ＨＢＶ保存配列、ＨＩＶ Ｔａｔ、ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡ、ヒトＣＣＲ５、ｍｉＲ−１２２、ＥＢＯＶポリメラーゼＬ、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＧＰ／ｓＧＰ、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＮＰＣ１およびＴＩＭ−１からなる群から選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記疾患が、遺伝性疾患であり、前記医薬組成物が、前記遺伝性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質の発現を調節する、項目６１に記載の方法。
（項目７７）
前記遺伝性疾患の発症および／または進行に関与する前記１つまたは複数のタンパク質が、トランスサイレチン、ＭＤＳ１−ＥＶＩ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＥＴＢＰ１、β−グロビンおよびＬＰＬからなる群から選択される、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記疾患が、老齢または変性疾患であり、前記医薬組成物が、前記老齢または変性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質の発現を調節する、項目６１に記載の方法。
（項目７９）
前記老齢または変性疾患の発症および／または進行に関与する前記１つまたは複数のタンパク質が、ケラチンＫ６Ａ、ケラチンＫ６Ｂ、ケラチン１６、ケラチン１７、ｐ５３、β−２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、ＴＲＰＶ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＩＦ−１およびカスパーゼ−２からなる群から選択される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記疾患が、線維性または炎症性疾患であり、前記医薬組成物が、前記線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与する２つまたはそれ超のタンパク質の発現を調節する、項目６１に記載の方法。
（項目８１）
前記線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与する前記２つまたはそれ超のタンパク質が、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ ３、Ｓｍａｄ ４、Ｓｍａｄ ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−κＢおよびＰＡＲＰ−１からなる群から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記個体がヒトである、項目６０〜８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
分子を細胞に送達する方法であって、前記細胞を項目１１〜２０のいずれか一項に記載の複合体または項目２１〜５２のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップを含み、前記複合体またはナノ粒子が前記分子を含む、方法。
（項目８４）
前記細胞の前記ナノ粒子との前記接触が、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記細胞の前記ナノ粒子との前記接触が、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、項目８３に記載の方法。
（項目８６）
前記細胞の前記ナノ粒子との前記接触が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、項目８３に記載の方法。
（項目８７）
前記細胞が、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、項目８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記細胞がＴ細胞である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記分子が、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードするプラスミドである、項目８７または８８に記載の方法。
（項目９０）
前記標的抗原が、がん関連抗原である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記複合体またはナノ粒子が、ｓｉＲＮＡをさらに含む、項目８９または９０に記載の方法。
（項目９２）
前記細胞を項目１１〜２０のいずれか一項に記載の複合体または項目２１〜５２のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップをさらに含み、前記複合体またはナノ粒子がｓｉＲＮＡを含む、項目８９または９０に記載の方法。
（項目９３）
前記ｓｉＲＮＡが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３またはＣＴＬＡ−４をコードするＲＮＡ分子を特異的に標的化する、項目９１または９２に記載の方法。
（項目９４）
前記分子がｓｉＲＮＡである、項目８３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
個体の疾患を処置する方法であって、
ａ）項目８３〜９４のいずれか一項に記載の方法に従って分子を細胞に送達することによって、前記分子を含む改変細胞を産生するステップであって、前記改変細胞が前記疾患の処置に有用である、ステップ、および
ｂ）前記改変細胞を前記個体に投与するステップ
を含む方法。
（項目９６）
前記改変細胞が、静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与される、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記疾患が、がんである、項目９５または９６に記載の方法。
（項目９８）
前記個体がヒトである、項目９５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
核酸を安定化する方法であって、
ａ）項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物を、前記核酸を含む組成物と併せて混合物を形成するステップ、および
ｂ）前記混合物をインキュベートして、前記核酸を含む複合体を形成するステップ
を含む方法。
（項目１００）
項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物と、項目１１〜２０のいずれか一項に記載の複合体および／または項目２１〜５２のいずれか一項に記載のナノ粒子を調製するための説明書とを含むキット。
（項目１０１）
ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群から選択される集合分子を含む組成物をさらに含む、項目１００に記載のキット。
図１Ａは、ペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子によるＨｅＬａ細胞内へのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ送達を示す図である。左から右へ各実験群についての柱は、それぞれ、０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭおよび２００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度に対応する。
図１Ｂは、ペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子によるＪｕｒｋａｔ細胞内へのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ送達を示す図である。左から右へ各実験群についての柱は、それぞれ、０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭおよび２００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度に対応する。
図２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ線維症モデルをシミュレートするための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代ヒト線維芽細胞株におけるペプチド／ＳＰＡＲＣ ｓｉＲＮＡ複合体の利用を示す図である。
図３Ａは、ＭＴＴアッセイによるＨｅｌａ細胞に対するＡＤＧＮペプチドおよびペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の毒性の評価を示す図である。左から右へ各濃度についての柱は、それぞれ、対照、ＡＤＧＮ−１００、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ（１：２０）、およびＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ（１：４０）に対応する。
図３Ｂは、シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｎ）ｍＲＮＡレベルによるＨｅｌａおよびＪｕｒｋａｔ細胞に対するＡＤＧＮペプチドおよびペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の毒性の評価を示す図である。上から下へ５μＭペプチド濃度の線は、それぞれ、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ（１：４０）、対照、ＡＤＧＮ−１００（１：２０）、およびＡＤＧＮ−１００に対応する。
図４は、ＡＤＧＮペプチド／サイクリンＢ１ ｓｉＲＮＡ複合体の静脈内投与によるＨＴ−２９腫瘍増殖の阻害を示す図である。上から下へ５１日での線は、それぞれ、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＢＳ、Ｃｙｃ−Ｂ１（５μｇ）、およびＣｙｃＢ１（１０μｇ）に対応する。
図５は、ＡＤＧＮペプチド／サイクリンＢ１、ＡＤＧＮペプチド／ｃｄｃ２０、または組合せＡＤＧＮペプチド／サイクリンＢ１／ｃｄｃ２０ ｓｉＲＮＡ複合体の静脈内投与による、ＨＴ−２９腫瘍増殖の阻害を示す図である。上から下へ４８日での線は、それぞれ、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＢＳ、Ｃｄｃ２０（５μｇ）、Ｃｙｃ−Ｂ１（５μｇ）、およびＣｙｃ−Ｂ１／Ｃｄｃ２０に対応する。
図６Ａは、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の単回静脈内注射後、様々な間隔でのＡｌｅｘａ７００標識ｓｉＲＮＡ生体内分布のｉｎ ｖｉｖｏイメージングを示す図である。
図６Ｂは、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の単回皮下注射後、様々な間隔でのＡｌｅｘａ７００標識ｓｉＲＮＡ生体内分布のｉｎ ｖｉｖｏイメージングを示す図である。
図７Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の単回静脈内注射後、様々な間隔でのＡｌｅｘａ７００標識ｓｉＲＮＡの組織内分布を示す図である。
図７Ｂは、ＨＴ−２９担腫瘍マウスにおけるＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の単回静脈内注射後、様々な間隔でのＡｌｅｘａ７００標識ｓｉＲＮＡの組織内分布を示す図である。
図７Ｃは、ＨＴ−２９担腫瘍マウスにおけるＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の単回皮下注射後、様々な間隔でのＡｌｅｘａ７００標識ｓｉＲＮＡの組織内分布を示す図である。
図８Ａは、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の静脈内または皮下注射後の相対第ＶＩＩ因子活性を示す図である。比較のためにネイキッドｓｉＲＮＡの注射を含めた。
図８Ｂは、すべての処置群のマウスについての体重の安定性を示す図である。
図９は、ＡＤＧＮ−１００、ＶＥＰＥＰ−９、リポフェクタミン、または担体なし（遊離プラスミド）によって媒介されたトランスフェクション後のＴ細胞株におけるルシフェラーゼレポーターの発現を示す図である。
図１０は、ＡＤＧＮ−１００またはＶＥＰＥＰ−９と複合体化しているＹＦＰレポーターをトランスフェクトした２９３ＴおよびＫ５６２細胞株のフローサイトメトリー分析を示す図である。
図１１は、ＡＤＧＮ−１００によって媒介されたトランスフェクション後の２９３ＴまたはＫ５６２細胞におけるＹＦＰレポーターの発現を経時的に示す図である。
図１２Ａは、ＡＤＧＮ−１００によって媒介されたトランスフェクション後にＹＦＰレポーターを安定的に発現する２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡観察を示す図である。
図１２Ｂは、ＡＤＧＮ−１００によって媒介されたトランスフェクション後にＹＦＰレポーターを安定的に発現する２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
図１３は、２０：１および３０：１のモル比でのＡＤＧＮ−１００／抗ＣＤ−１９ ＣＡＲベクター複合体の初代Ｔ細胞におけるトランスフェクション効率を示す図である。結果を非トランスフェクション細胞に対し正規化した。
図１４は、７−ＡＡＤを使用してフローサイトメトリーによってアッセイした、ＡＤＧＮ−１００／抗ＣＤ−１９ ＣＡＲベクター複合体をトランスフェクションした後の初代Ｔ細胞の生存率を示す図である。結果を非トランスフェクション細胞に対し正規化した。
図１５は、ヘリックス、ならびに芳香族パッチおよび静電パッチの位置を明らかにする、ＡＤＧＮ−１００、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ−６およびＶＥＰＥＰ−９ペプチドの３次元構造モデルを示す図である。
図１６は、ＭＴＴアッセイによるＨｅｌａ細胞に対するＡＤＧＮ、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ−６およびＶＥＰＥＰ−９ペプチドならびにペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の毒性の評価を示す図である。上から下へ２０μＭペプチド濃度の線は、それぞれ、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ、ＣＡＤＹ／ｓｉＲＮＡ、対照、ＶＥＰＥＰ−６／ｓｉＲＮＡ、ＶＥＰＥＰ−９／ｓｉＲＮＡ、ＡＤＧＮ−１００、ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ−６、ＶＥＰＥＰ−９に対応する。
図１７は、ＡＤＧＮおよびＶＥＰＥＰ−６ペプチドによるｍｉＲＮＡ送達のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較を示す図である。
図１８は、ＡＤＧＮ、ＶＥＰＥＰ−６およびＶＥＰＥＰ−９ペプチドによるｓｉＲＮＡ送達のｉｎ ｖｉｖｏでの比較を示す図である。上から下へ５１日での線は、それぞれ、対照ｓｉＲＮＡ、ＰＢＳ、ＶＥＰＥＰ−９／Ｃｙｃ−Ｂ１、ＶＥＰＥＰ−６／Ｃｙｃ−Ｂ１、およびＡＤＧＮ／Ｃｙｃ−Ｂ１に対応する。
発明の詳細な説明
本出願は、核酸などのカーゴ分子の安定化および送達に好適な新規ペプチド（本明細書では「ＡＤＧＮペプチド」と呼ぶ）を提供する。ＡＤＧＮペプチドは、いずれの既知の細胞透過性ペプチドとも配列相同性が低い、二次両親媒性ペプチドを含む。各々が複数の短いヘリックスモチーフを含有する、ＣＡＤＹおよびＶＥＰＥＰ−６などの既知の細胞透過性ペプチドとは異なり、ＡＤＧＮペプチドは、単一コアヘリックスモチーフを含有する。このヘリックスモチーフは、１つの側面にＳまたはＲ残基および他の側面にＷ残基を露出しており、以前に報告されたものとは有意に異なる表面を形成する。注目に値することとして、ＡＤＧＮペプチドとカーゴ分子で形成される複合体（例えば、ナノ粒子）は、より低い正味残基正電荷を含有する（例えば、中性に近い）。さらに、高い正味残基正電荷が細胞透過には必要であるという一般的理解にもかかわらず、ＡＤＧＮペプチドは、既知の細胞透過性ペプチドと比較してカーゴ送達の有効性の向上を示した。ＡＤＧＮ技術は、遺伝子送達と、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス分子などの小さいオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みの両方を促進することによって、Ｔ細胞工学のための強力な非ウイルス性送達システムを構成する。ＡＤＧＮ技術は、ウイルスベクターより複雑でなく、毒性が低く、使用が容易である。
したがって、本出願は、一態様では、より詳細に下でさらに説明する新規ＡＤＧＮペプチドを提供する。
別の態様では、ＡＤＧＮペプチドを使用することにより、カーゴ分子を安定化する方法およびカーゴ分子を送達する方法が提供される。
別の態様では、ＡＤＧＮペプチドとカーゴ分子とを含む複合体またはナノ粒子が提供される。
ＡＤＧＮペプチドとカーゴ分子とを（例えば、複合体およびナノ粒子の形態で）含む医薬組成物、および疾患を処置するためのそれらの使用も提供される。
本明細書において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指示がない限り、複数の言及対象を包含する。
本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に関する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本発明の組成物および方法は、本明細書に記載する本発明の本質的要素および制限はもちろん、本明細書に記載するまたは別様に有用なあらゆる追加のまたは任意選択の成分、構成要素、または制限を含んでもよく、これらからなっていてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよい。
別段の断り書きがない限り、専門用語を従来の用法に従って使用する。
本発明のペプチド
本発明は、小さいオリゴヌクレオチドまたはプラスミドＤＮＡなどの様々なカーゴ分子と安定した複合体およびナノ粒子を形成することができるＡＤＧＮペプチドを提供する。
一部の実施形態では、次のアミノ酸配列を含むペプチド（例えば、天然に存在しないペプチド）が提供される：
Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、
Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、
Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）。
一部の実施形態では、配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を有するペプチドの部分は、単一コアヘリックスモチーフを形成する。一部の実施形態では、配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を有するペプチドの部分は、ヘリックス構造であって、ＳまたはＲ残基が同じ側面にあり、Ｗ残基が他の側面にあり、静電接触部およびそのヘリックスの他の側面の疎水性接触部のパッチを形成する、ヘリックス構造を形成する。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ−６またはＣＡＤＹ細胞透過性ペプチドと比べて低減された毒性を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが１９または２０アミノ酸である。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが約５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０アミノ酸のいずれか以下である。一部の実施形態では、ペプチドは、長さが約５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００またはそれ超のアミノ酸のいずれか以上である。一部の実施形態では、ペプチドはＬ−アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドはＤ−アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、次のアミノ酸配列を含む：
Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、
Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、
Ｘ２は、ＡまたはＶであり、
Ｘ３は、ＧまたはＬであり、
Ｘ４は、ＷまたはＹであり、
Ｘ５は、ＶまたはＳであり、
Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、
Ｘ７は、ＳまたはＬであり、
Ｘ８は、ＷまたはＹである）。
一部の実施形態では、ペプチドは、
ａ）ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、
ｂ）ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、または
ｃ）ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、
Ｘ１ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５）
（配列中、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在しない）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、
ａ）１つまたは複数のＳＲモチーフ、
ｂ）１つまたは複数のＷまたはＹ残基、および
ｃ）Ｒ残基
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有する。
一部の実施形態では、ペプチドは、溶液中で遊離しているとき、大半が折り畳まれていない状態のままである。一部の実施形態では、ペプチドは、カーゴ分子の存在下で少なくとも部分的なヘリックス構造をとることができる。一部の実施形態では、ヘリックス構造は、ヘリックス、例えば、これに限定されないがα−ヘリックスである。一部の実施形態では、ペプチドは、その長さの約５０％超（例えば、約５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％のいずれか超）にわたってヘリックス構造をとる。一部の実施形態では、ヘリックス構造は、ペプチドのコアモチーフ内に主として位置し、コアモチーフは、アミノ酸配列ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号６）であり、配列中、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８はＷまたはＹである。一部の実施形態では、ペプチドは、単一ヘリックスモチーフを含む。一部の実施形態では、単一ヘリックスモチーフは、コアモチーフ内にある。一部の実施形態では、ヘリックス構造は、ＳおよびＲ残基のうちの少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６、７または８つのいずれか）がヘリックス構造の１つの側面にあり、Ｗ残基のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４または５つのいずれか）がそのヘリックス構造の反対側にあるように構成される。一部の実施形態では、ＳおよびＲ残基の大多数は、ヘリックス構造の１つの側面にあり、Ｗ残基の大多数は、そのヘリックス構造の反対側にある。一部の実施形態では、ＳおよびＲ残基のすべてがヘリックス構造の１つの側面にあり、Ｗ残基のすべてがそのヘリックス構造の反対側にある。一部の実施形態では、ヘリックス構造は、静電接触部のパッチがそのヘリックス構造の１つの側面に形成され、疎水性接触部のパッチがそのヘリックス構造の他の側面に形成されるように構成される。一部の実施形態では、ペプチドは、カーゴ分子の存在下で単一ヘリックスをとる。
一部の実施形態では、ペプチドは、カーゴ分子と複合体化された場合、同じカーゴ分子と複合体化された、以前に記載されたＣＰＰ（例えば、ＣＡＤＹまたはＶＥＰＥＰ−６）より低い正味残基正電荷を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、カーゴ分子と複合体化された場合、同じカーゴ分子と複合体化された、以前に記載されたＣＰＰの正味残基正電荷の約８０％未満（例えば、約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％のいずれか未満）の正味残基正電荷を有する。一部の実施形態では、以前に記載されたＣＰＰは、ＣＡＤＹまたはＶＥＰＥＰ−６である。
一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、該ペプチドのＮ末端に結合している１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ペプチドのＮ末端に共有結合している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、および標的化分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基である。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に結合しているアセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に結合しているアセチル基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に結合しているステアリル基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に共有結合しているアセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に共有結合しているアセチル基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＮ末端に共有結合しているステアリル基を含む。
一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、該ペプチドのＣ末端に結合している１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ペプチドのＣ末端に共有結合している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝型Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、一級または二級アミン、オシディック誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、および標的化分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基である。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＣ末端に結合しているシステアミド基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、そのＣ末端に共有結合しているシステアミド基を含む。
一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ステープル留めされている。本明細書において使用する「ステープル留めされている」は、ペプチド中の２残基間の化学結合を指す。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、該ペプチドの２アミノ酸間に化学結合を含む形で、ステープル留めされている。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸は、３または６つのアミノ酸によって隔てられている。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸は、３つのアミノ酸によって隔てられている。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸は、６つのアミノ酸によって隔てられている。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸の各々は、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸の各々は、Ｒである。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸の各々は、Ｓである。一部の実施形態では、化学結合によって結合している２つのアミノ酸の一方は、Ｒであり、他方はＳである。一部の実施形態では、化学結合は、炭化水素結合である。
一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ステープル留めされており、
のアミノ酸配列を含み、配列中、下付文字「Ｓ」の付いている残基は、炭化水素結合によって結合されている２つの残基である。
複合体およびナノ粒子
一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドとカーゴ分子とを含む複合体が提供される。一部の実施形態では、複合体の平均サイズ（直径）は、約３０ｎｍ〜約１０ミクロンのいずれかの間であり、例えば、約５０ｎｍ〜約１ミクロンの間、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍの間、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍの間、および約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍの間を含む。一部の実施形態では、複合体中のペプチドのカーゴ分子に対するモル比は、約１００：１〜約１：５０の間であり、例えば、約５０：１〜約１：２０の間、約２０：１〜約１：１０の間、および約５：１〜約１：１の間を含む。一部の実施形態では、複合体は、実質的に非毒性である。一部の実施形態では、複合体は、複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、複合体は、所定の比率で存在する、複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、所定の比率は、より詳細に下で説明する方法のいずれかにおける複合体の最も有効な使用を可能にするように選択される。
一部の実施形態では、複合体は、標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ＡＤＧＮペプチドに結合している。一部の実施形態では、標的化部分は、ＡＤＧＮペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、標的化部分は、複合体を組織または特定の細胞型に標的化する。一部の実施形態では、組織は、処置を必要とする組織である。一部の実施形態では、複合体は、該複合体のカーゴ分子によって処置することができる組織または細胞に該複合体を標的化する、標的化部分を含む。
一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドとカーゴ分子とを含むナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍであり、例えば、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、および約９０ｎｍ〜約１２０ｎｍを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子中のペプチドのカーゴ分子に対するモル比は、約１００：１〜約１：５０の間であり、例えば、約１００：１〜約１：２０の間、約９０：１〜約１：１０の間、約８０：１〜約１：１の間、および約４０：１〜約５：１を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約−３０ｍＶ〜約３０ｍＶであり、例えば、約−２５ｍＶ〜約２５ｍＶ、約−２０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約−１５ｍＶ〜約１５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約１０ｍＶ、および約−５ｍＶ〜約１０ｍＶを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、実質的に非毒性である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、所定の比率で存在する複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、所定の比率は、より詳細に下で説明する方法のいずれかにおけるナノ粒子の最も有効な使用を可能にするように選択される。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、集合分子と複合体化されたカーゴ分子を含む。カーゴ分子と集合分子の複合体は、カーゴ分子と集合分子の間に共有結合性または非共有結合性相互作用を含むことがある。一部の実施形態では、集合分子と複合体化されたカーゴ分子は、ナノ粒子のコアを形成する。一部の実施形態では、集合分子は、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、リン脂質、ポリマー、アプタマー、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマー、ポリメロソーム、ウイルスベクター、およびミセルからなる群から選択される。一部の実施形態では、ペプチドは、細胞透過性ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、上記のＡＤＧＮペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、上記のＡＤＧＮペプチドではなく、ＰＴＤベースのペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンベースのペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド、Ｐｅｐ−１ペプチド、およびＰｅｐ−２ペプチドを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、表面層をさらに含む。一部の実施形態では、表面層は、上記のＡＤＧＮペプチドを含む。一部の実施形態では、表面層は、上記のＡＤＧＮペプチドでない細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、表面層は、ペプチドを含まない。一部の実施形態では、ナノ粒子は、該ナノ粒子のコアと表面層との間に中間層をさらに含む。一部の実施形態では、中間層は、上記のＡＤＧＮペプチドを含む。一部の実施形態では、中間層は、上記のＡＤＧＮペプチドでない細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、その表面に標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ペプチドに結合している。一部の実施形態では、標的化部分は、ペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、標的化部分は、ナノ粒子を組織または特定の細胞型に標的化する。一部の実施形態では、組織は、処置を必要とする組織である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、その表面に、該ナノ粒子のカーゴ分子によって処置することができる組織または細胞に該ナノ粒子を標的化する標的化部分を含む。
一部の実施形態では、カーゴ分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超のカーゴ分子）とペプチドとを含む複合体であって、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（例えば「から本質的になる」または「からなる」を包含する）、複合体が提供される。一部の実施形態では、核酸分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超の核酸分子）とペプチドとを含む複合体であって、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（「から本質的になる」または「からなる」を包含する）、複合体が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、複合体中のカーゴ分子のペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。
一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、カーゴ分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超のカーゴ分子）およびペプチドを含み、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（例えば、「から本質的になる」または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、核酸分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超の核酸分子）およびペプチドを含み、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（「から本質的になる」、または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子中のカーゴ分子のペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の絶対ゼータ電位は、約１０ｍＶ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の多分散性は、約１．５以下である。
ナノ粒子が、カーゴ分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超のカーゴ分子）および集合分子を含むａ）コアを含み、コアが、ｂ）ペプチドで被覆されており、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（例えば、「から本質的になる」、または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、核酸分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超の核酸分子）およびペプチドを含み、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（「から本質的になる」、または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子中のカーゴ分子のペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の絶対ゼータ電位は、約１０ｍＶ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の多分散性は、約１．５以下である。一部の実施形態では、集合分子は、細胞透過性ペプチドである。
一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、ａ）カーゴ分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超のカーゴ分子）および集合分子を含むコアを含み、コアが、ｂ）ペプチドで被覆されており、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（例えば、「から本質的になる」、または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、核酸分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超の核酸分子）およびペプチドを含み、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（「から本質的になる」、または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子中のカーゴ分子のペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約１５０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の絶対ゼータ電位は、約１０ｍＶ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の多分散性は、約１．５以下である。一部の実施形態では、集合分子は、細胞透過性ペプチド（例えば、ＣＡＤＹまたはＶＥＰＥＰ−６）である。一部の実施形態では、集合分子は、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（例えば、「から本質的になる」または「からなる」を包含する）ペプチドである。コアにおける集合分子は、被覆層中のペプチドと同じであってもよく、または異なってもよい。
一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、ａ）カーゴ分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超のカーゴ分子）およびペプチドを含むコアを含み、コアが、ｂ）表面層で被覆されており、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（例えば、「から本質的になる」または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が、核酸分子（例えば、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ超の核酸分子）およびペプチドを含み、ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含む（「から本質的になる」、または「からなる」を包含する）、組成物が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む、天然に存在しないペプチドが提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子中のカーゴ分子のペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の絶対ゼータ電位は、約１０ｍＶ以下である。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の多分散性は、約１．５以下である。一部の実施形態では、表面層は、細胞透過性ペプチド（例えば、ＣＡＤＹまたはＶＥＰＥＰ−６）を含む。
一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子は標的化部分を含み、標的化部分は、細胞特異的および／または核標的化が可能なリガンドである。細胞膜表面受容体および／または細胞表面マーカーは、前記リガンドに高い親和性でおよび好ましくは高い特異性で結合することができる、分子または構造である。前記細胞膜表面受容体および／または細胞表面マーカーは、好ましくは、特定の細胞に特異的である、すなわち、別の型の細胞においてではなく１つの型の細胞において主として見いだされる（例えば、肝細胞の表面のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするガラクトシル残基）。細胞膜表面受容体は、リガンド（例えば、標的化部分）および結合分子（例えば、本発明の複合体またはナノ粒子）の細胞標的化および標的細胞への内在化を助ける。本発明に関して使用されうる多数のリガンド部分／リガンド結合パートナーは、文献に広く記載されている。そのようなリガンド部分は、所与の結合パートナー分子または少なくとも１つの標的細胞の表面に局在する結合パートナー分子のクラスと結合する能力を本発明の複合体またはナノ粒子に付与することができる。好適な結合パートナー分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープおよび腫瘍関連マーカーからなる群から選択されるポリペプチドを限定ではないが含む。結合パートナー分子は、さらに、１つまたは複数の糖、脂質、糖脂質または抗体分子からなることもあり、これらの分子を含むこともある。本発明によれば、リガンド部分は、例えば、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＴ）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチンのすべてもしくは一部、例えばＪＴＳ１（ＷＯ９４／４０９５８）などのポリペプチドのすべてもしくは一部、抗体もしくはその断片、またはそれらの組合せでありうる。一部の実施形態では、本発明において使用されるリガンド部分は、７アミノ酸の最小長を有するペプチドまたはポリペプチドである。リガンド部分は、ネイティブポリペプチドであるか、またはネイティブポリペプチドに由来するポリペプチドである。「由来する」は、（ａ）ネイティブ配列に対する１つもしくは複数の修飾（例えば、１つもしくは複数の残基の付加、欠失および／もしくは置換）、（ｂ）天然に存在しないアミノ酸を含む、アミノ酸類似体、（ｃ）置換されている結合、または（ｄ）当技術分野において公知の他の修飾を含有することを意味する。リガンド部分として役立つポリペプチドは、例えば、マウス抗体の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を併せ持つヒト化抗体などの、様々な起源の配列を融合させることによって得られるバリアントおよびキメラポリペプチドを包含する。加えて、そのようなポリペプチドは、（例えば、システイン残基がポリペプチドリガンドの両端に隣接することにより）直鎖状または環化構造を有することがある。加えて、リガンド部分として使用されているポリペプチドは、化学的部分の置換または付加によるその原構造の修飾（例えば、グリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基の付加など）を含むことがある。本発明は、リガンド部分を検出可能にさせる修飾をさらに企図している。このために、検出可能部分での修飾を想定することができる（すなわち、シンチグラフィック、放射性もしくは蛍光部分、または色素標識など）。そのような検出可能標識をいずれの従来の手法によってリガンド部分に結合させてもよく、診断目的（例えば、腫瘍細胞のイメージング）に使用してもよい。一部の実施形態では、結合パートナー分子は、抗原（例えば、標的細胞特異的抗原、疾患特異的抗原、工学的に操作された標的細胞の表面で特異的に発現される抗原）であり、リガンド部分は、抗体、その断片または最小認識単位（例えば、抗原特異性をなお提示する断片）、例えば、免疫学マニュアル（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、１９９３年、Ｒｏｉｔｔ、ＢｒｏｓｔｏｆｆおよびＭａｌｅ、編集Ｇａｍｂｌｉ、Ｍｏｓｂｙを参照されたい）に詳細に記載されているものである。リガンド部分は、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗原の多くに結合する多くのモノクローナル抗体が既に公知であり、モノクローナル抗体技術に関して当技術分野において公知の手法を使用して、ほとんどの抗原に対する抗体を調製することができる。リガンド部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）であってもよく、または合成抗体断片（例えば、ＳｃＦｖ）であってもよい。一部の実施形態では、リガンド部分は、全抗体ではなく、抗体断片の中から選択される。補体結合などの全抗体の有効な機能は除去される。ｓｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、１つまたは複数の他のポリペプチドとの融合体として発現されることがある。最小認識単位は、Ｆｖ断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数についての配列に由来することがある。全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ断片および最小認識単位は一価であり、抗原結合部位を１つしか有さない。一部の実施形態では、リガンド部分は、腫瘍細胞への標的化を可能にし、腫瘍特異的抗原、腫瘍細胞において差次的にもしくは過剰発現される細胞タンパク質、またはがん関連ウイルス（ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｍｓ）の遺伝子産物などの、腫瘍状態に関係する分子を認識することができ、そのような分子と結合することができる。腫瘍特異的抗原の例としては、乳がんに関係するＭＵＣ−１（Ｈａｒｅｕｖｅｎｉら、９９０、Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９巻、４７５〜４８６頁）、乳および卵巣がんに関連する変異ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子によってコードされている産物（Ｍｉｋｉら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６巻、６６〜７１頁；Ｆｕｉｒｅａｌら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６巻、１２０〜１２２頁；Ｗｏｏｓｔｅｒら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ ３７８巻、７８９〜７９２頁）、結腸がんに関係するＡＰＣ（Ｐｏｉａｋｉｓ、１９９５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５巻、６６〜７１頁）、前立腺がんに関係する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（Ｓｔａｍｅｙら、１９８７年、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ．３１７巻、９０９頁）、結腸がんに関係する癌胎児抗原（ＣＥＡ）（Ｓｃｈｒｅｗｅら、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０巻、２７３８〜２７４８頁）、黒色腫に関係するチロシナーゼ（Ｖｉｌｅら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３巻、３８６０〜３８６４頁）、黒色腫細胞において高度に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の受容体、乳および膵臓がんに関係するＥｒｂＢ−２（Ｈａｒｒｉｓら、１９９４年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １巻、１７０〜１７５頁）、ならびに肝臓がんに関係するアルファ−フェトプロテイン（Ｋａｎａｉら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７巻、４６１〜４６５頁）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リガンド部分は、ＭＵＣ−１抗原を認識すること、およびＭＵＣ−１抗原と結合すること、したがってＭＵＣ−１陽性腫瘍細胞を標的とすることができる抗体の断片である。一部の実施形態では、リガンド部分は、ＭＵＣ−１抗原のタンデムリピート領域を認識するＳＭ３モノクローナル抗体のｓｃＦｖ断片である（Ｂｕｒｓｈｅｌｌら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７巻、５４７６〜５４８２頁；Ｇｉｒｌｉｎｇら、１９８９年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４３巻、１０７２〜１０７６頁；Ｄｏｋｕｒｎｏら、１９９８年、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４巻、７１３〜７２８頁）。腫瘍細胞において差次的にまたは過剰発現される細胞タンパク質の例としては、一部のリンパ系腫瘍において過剰発現されるインターロイキン２（ＩＬ−２）の受容体、肺癌細胞、膵臓、前立腺および胃腫瘍において過剰発現されるＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９５年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２巻、６６０〜６６８頁）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体、上皮増殖因子受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ４０受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ２７受容体、ＯＸ−４０、α−ｖインテグリン（Ｂｒｏｏｋｓら、９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４巻、５６９頁）、およびある特定の血管新生増殖因子の受容体（Ｈａｎａｈａｎ、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７巻、４８頁）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの指標に基づいて、そのようなタンパク質を認識することおよびそのようなタンパク質と結合することができる適切なリガンド部分を定義することは、当業者の範囲内である。例を挙げて説明すると、ＩＬ−２は、ＴＬ−２受容体との結合に好適なリガンド部分である。線維症および炎症に特異的である受容体の場合、これらは、上に特定されており、本発明の組成物の好適な標的である、ＴＧＦベータ受容体またはアデノシン受容体を含む。多発性骨髄腫の細胞表面マーカーは、これらに限定されるものではないがＣＤ５６、ＣＤ４０、ＦＧＦＲ３、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲおよびＣＤ３８を含み、本発明の組成物の好適な標的である。これらの細胞表面マーカーと結合する好適なリガンド部分は、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４０、ＰＲＯ−００１、Ｃｈｉｒ−２５８、ＨｕＬｕｃ６３、抗ＣＤ１３８−ＤＭ１、抗ＩＧＦ１Ｒおよびベバシズマブを含むが、これらに限定されない。
カーゴ分子
一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は核酸である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一本鎖または二本鎖オリゴおよびポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、様々な形態のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを含む）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴｍｉｒ、リボザイム、アプタマー、プラスミドＤＮＡなど、およびこれらの１つまたは複数の好適な組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、例えば酵素もしくは抗体などのタンパク質、または小分子である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、核酸とタンパク質または小分子との組合せを含む複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、この組合せは、互いに共有結合している、核酸とタンパク質または小分子を含む。一部の実施形態では、この組合せは、互いに共有結合していない、核酸とタンパク質または小分子を含む。
本明細書において同義語として使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの、修飾ヌクレオチドを含みうる。本明細書において使用する用語「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態どちらかの少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め濃縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体および組合せの形態であってもよい。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびこれらの組合せの形態であってもよい。核酸は、合成であることもあり、天然に存在することもあり、天然に存在しないこともあり、基準核酸と同様の結合特性を有する、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含有する核酸（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）およびジップ核酸（ＺＮＡ）を含む）を含む。そのような類似体の例としては、限定ではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。特別な制限がない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示す配列ばかりでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって果すことができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．、２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基によって互いに結合している。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、これらは、プリンおよびピリミジンの天然化合物アデニン、チミジン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、ならびに天然類似体および合成誘導体をさらに含み、天然類似体および合成誘導体は、新たな反応性基、例えば、これらに限定されるものではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびハロゲン化アルキルを配置する修飾を、それに限定されないが含む。本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」は、長さが一般に、必ずではないが約２００ヌクレオチド未満である短鎖の一般に合成のポリヌクレオチドを一般に指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的でない。ポリヌクレオチドについての上の説明は、オリゴヌクレオチドに同等におよび完全に当てはまる。
一部の実施形態では、核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に記載する核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒの場合には必ずではないが２００ヌクレオチドまでまたはプラスミドＤＮＡの場合には１０００キロ塩基までの長さの範囲のいずれであってもよい。
一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの干渉ＲＮＡである。用語「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内にあるときに標的遺伝子または配列の発現を（例えば、干渉ＲＮＡ配列に相補的であるｍＲＮＡの分解の媒介または翻訳の阻害によって）低減または阻害することができる、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、もしくはプレｍｉＲＮＡ）を指し、したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的である一本鎖ＲＮＡ、または２本の相補鎖によってもしくは単一の自己相補鎖によって形成された二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子もしくは配列との実質的もしくは完全同一性を有することもあり、またはミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含むこともある。干渉ＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子に対応することもあり、またはその部分配列に対応することもある。干渉ＲＮＡは、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、長さが約１５〜６０、１５〜５０または５〜４０（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さが約１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチドの干渉ＲＮＡを含み、好ましくは、長さが約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチドである（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、長さが１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、または１９〜２５ヌクレオチド、好ましくは、長さが約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３ヌクレオチドであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが約１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、５〜３０、５〜２５または１９〜２５塩基対、好ましくは、長さが約８〜２２、９〜２０、または１９〜２１塩基対である）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜約４ヌクレオチドまたは約２〜約３ヌクレオチドの３’オーバーハング、および５’リン酸末端を含みうる。ｓｉＲＮＡの例は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方が相補アンチセンス鎖である、２本の別個の鎖状分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センス領域とアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合されている、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を持つ二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに２つまたはそれ超のループ構造と、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するステムとを持ち、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされて活性二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる環状一本鎖ポリヌクレオチド分子を、限定ではないが、含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学合成される。ｓｉＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＩＩＩまたはダイサーでのより長いｄｓＲＮＡ（例えば、長さが約２５ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡ）の切断によって生成することもできる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを生体活性ｓｉＲＮＡにプロセシングする（例えば、Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．ＵＳＡ、９９巻：９９４２〜９９４７頁（２００２年）；Ｃａｌｅｇａｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９巻：１４２３６頁（２００２年）；Ｂｙｒｏｍら、Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｅｈＮｏｔｅｓ、１０巻（１号）：４〜６頁（２００３年）；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３ １：９８１〜９８７頁（２００３年）；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻：２２６９〜２２７１頁（２００１年）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３巻：８２頁（１９６８年）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、長さが少なくとも５０ヌクレオチド〜約１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドである。ｄｓＲＮＡは、長さが１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチドもの長さであることがあり、またはそれより長いこともある。ｄｓＲＮＡは、全遺伝子転写産物または部分遺伝子転写産物をコードすることができる。ある特定の事例では、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされる（例えば、自動的に折り重なってヘアピンループを有する二重鎖になる配列として転写される）こともある。低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるきついヘアピンターンを生じさせるＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によって切断されてｓｉＲＮＡになり、その後、そのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、結合しているｓｉＲＮＡと適合するｍＲＮＡと結合し、そのｍＲＮＡを切断する。干渉ＲＮＡの好適な長さは、約５〜約２００ヌクレオチド、または１０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対、または１５〜３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、対応する標的遺伝子に実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ超同一）である。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
一部の実施形態では、核酸は、二本鎖アンチセンスＲＮＡである。干渉ＲＮＡの好適な長さは、約５〜約２００ヌクレオチド、または１０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対、または１５〜３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、対応する標的遺伝子に実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％。８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ超同一）である。一部の実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
一部の実施形態では、核酸は、がんなどの疾患に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、疾患は、がん、例えば固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍であり、干渉ＲＮＡは、がんに関与するタンパク質、例えばがんの進行の制御に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする。
一部の実施形態では、核酸は、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。
一部の実施形態では、核酸は、ｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略記される）は、真核細胞において見つけられる短鎖リボ核酸（ＲＮＡ）分子である。マイクロＲＮＡ分子は、他のＲＮＡと比較して非常に少ないヌクレオチド（平均２２個）を有する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）上の相補配列と結合して、通常は、転写抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす、転写後制御因子である。ヒトゲノムは、１０００を超えるｍｉＲＮＡをコードすることができ、これらのｍｉＲＮＡは、哺乳動物遺伝子の約６０％を標的とすることができ、多くのヒト細胞型に大量に存在する。ｍｉＲＮＡの好適な長さは、約５〜約２００ヌクレオチド、または０〜５０ヌクレオチドもしくは塩基対、または１５〜３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、対応する標的遺伝子に実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％。８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ超同一）である。一部の実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
一部の実施形態では、核酸は、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片（例えば、約１０００ｂｐまでの長さのＤＮＡ断片）である。加えて、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、高メチル化または低メチル化されていてもよい。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、１つまたは複数の遺伝子をコードし、前記１つまたは複数の遺伝子の発現に必要な制御要素を含有することがある。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片は、適切な宿主細胞におけるプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片の維持を可能にする選択可能マーカーをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むことがある。
一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列を含む。ＣＡＲは、例えば、米国特許第８，８２２，６４７号、米国特許出願公開第２０１５／００５１２６６号、ＷＯ２０１４／１２７２６１およびＷＯ２０１４０９９６７１に記載されており、これらの開示は、それら全体が参照によって本明細書に具体的に組み入れられている。一部の実施形態では、標的抗原は、がん細胞に特に関連する（例えば、がん細胞によって発現される）抗原である。例えば、一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、がん関連抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、がん関連抗原は、固形腫瘍に関連する。一部の実施形態では、がん関連抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍または白血病などの、血液学的悪性腫瘍に関連する。一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４ｖ６およびＣＳ１を含む。
したがって、一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、血液学的悪性腫瘍に関連するがん関連抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、血液学的悪性腫瘍は、Ｂ細胞悪性腫瘍であり、がん関連抗原は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７およびＨＶＥＭを含む。一部の実施形態では、血液学的悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病などの白血病であり、がん関連抗原は、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ３３、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４ｖ６およびＣＳ１を含む。
組成物
一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、組成物は、上記の複合体またはナノ粒子と、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体とを含む医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物中の複合体またはナノ粒子の濃度は、約１ｎＭ〜約１００ｍＭであり、例えば、約１０ｎＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｎＭ〜約２５ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１０ｍＭ、約１００ｎＭ〜約１ｍＭ、約５００ｎＭ〜約７５０μＭ、約７５０ｎＭ〜約５００μＭ、約１μＭ〜約２５０μＭ、約１０μＭ〜約２００μＭ、および約５０μＭ〜約１５０μＭを含む。
本明細書において使用する用語「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体」は、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図する。典型的に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体は、ヒトはもちろん非ヒト動物を含む動物における使用について、連邦の規制機関、州政府もしくは他の規制機関によって承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されている希釈剤、賦形剤および／または担体である。用語希釈剤、賦形剤および／または「担体」は、医薬組成物を投与するのに用いる希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬希釈剤、賦形剤および／または担体は、滅菌液、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成由来のものを含む）でありうる。水、食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を液体希釈剤、賦形剤および／または担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な医薬希釈剤および／または賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤、増量、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、徐放製剤などの形態をとることができる。好適な医薬希釈剤、賦形剤および／または担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによって「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与方法に適合しなければならない。適切な希釈剤、賦形剤および／または担体は、当業者には明らかであり、大部分が投与経路に依存することになる。
一部の実施形態では、上記の医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、頭蓋内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、空洞内または経口投与用に製剤化される。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置に好適であると判明した本発明の医薬組成物の投薬量は、カーゴ分子０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。一部の実施形態では、投薬量範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投薬量範囲は、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。一部の実施形態では、個体への医薬組成物の投与スケジュールは、全処置に相当する単回投与から連日投与に及ぶ。一部の実施形態では、投与は、３〜３０日に１回である。一部の実施形態では、投与は、４〜７日に１回である。
一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体が糖またはタンパク質である、医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、糖は、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せからなる群から選択され、約５％〜約２０％の濃度で医薬組成物中に存在する。一部の実施形態では、糖はスクロースである。一部の実施形態では、糖はグルコースである。一部の実施形態では、糖はマンニトールである。一部の実施形態では、タンパク質は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥される。
調製方法
一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子を調製する方法であって、ａ）上記のＡＤＧＮペプチドを含む組成物を、上記のカーゴ分子を含む組成物と併せて混合物を形成するステップ、およびｂ）混合物をインキュベートして複合体またはナノ粒子を形成するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドを含む組成物は、ＡＤＧＮペプチドを約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む保存溶液であり、例えば、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．７５ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、および約１ｍｇ／ｍｌを含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドを含む保存溶液を約２分〜約２０分間超音波処理し、例えば、約５分〜約１５分、および約１０分を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は核酸であり、カーゴ分子を含む組成物は、核酸を含む保存溶液である。一部の実施形態では、核酸は、上記のオリゴヌクレオチドであり、核酸を含む保存溶液は、オリゴヌクレオチドを約１μＭ〜約２０μＭの濃度で含み、例えば、約２μＭ〜約１５μＭ、約３μＭ〜約１０μＭ、約４μＭ〜約８μＭ、および約５μＭを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを含む保存溶液を水中で配合する。一部の実施形態では、水は、蒸留水である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを含む保存溶液を緩衝液中で配合する。一部の実施形態では、核酸はプラスミドであり、核酸を含む保存溶液は、プラスミドを約２０μＭ〜約５００μＭの濃度で含み、例えば、約３０μＭ〜約４００μＭ、約４０μＭ〜約３００μＭ、約５０μＭ〜約２００μＭ、約７５μＭ〜約１５０μＭ、および約１００μＭを含む。一部の実施形態では、プラスミドを含む保存溶液を水中で配合する。一部の実施形態では、水は、蒸留水である。一部の実施形態では、プラスミドを含む保存溶液を緩衝液中で配合する。一部の実施形態では、緩衝液は、プラスミドの保管に使用される当技術分野において公知の任意の緩衝液であり、例えば、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む緩衝液であって、Ｔｒｉｓが約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度（例えば、約２０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、および約５０ｍＭを含む）であり、ＥＤＴＡが約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度（例えば、約０．２ｍＭ〜約０．８ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約０．７ｍＭ、約０．４ｍＭ〜約０．６ｍＭ、および約０．５ｍＭを含む）である、緩衝液を含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＤＧＮペプチドを含む保存溶液と核酸を含む保存溶液とを水性媒体中で併せて混合物を形成するステップを含む。一部の実施形態では、水性媒体は、水であり、例えば蒸留水を含む。一部の実施形態では、水性媒体は、緩衝液であり、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、または核タンパク質複合体を安定化するための当技術分野において公知の任意の緩衝液を含む。一部の実施形態では、混合物中のＡＤＧＮペプチドの核酸に対するモル比は、約１：５〜約８０：１であり、例えば、約５：１〜約４０：１、ならびに約１：２、１：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１および５０：１のいずれかを含む。一部の実施形態では、混合物を約１０分〜６０分間（例えば約２０分、３０分、４０分および５０分間のいずれかを含む）、約２℃〜約５０℃の温度（例えば、約２℃〜約５℃、約５℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約４０℃、約４０℃〜約４５℃、および約４５℃〜約５０℃を含む）でインキュベートして複合体またはナノ粒子を形成することによって、複合体またはナノ粒子を含む保存溶液を得る。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子を含む保存溶液は、４℃で少なくとも約３週間にわたって（例えば、少なくとも約６週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、および６カ月のいずれかにわたって、を含む）、安定した状態を保つ。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子を含む保存溶液を担体の存在下で凍結乾燥させる。一部の実施形態では、担体は、例えばスクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せを含む糖であり、複合体またはナノ粒子を含む保存溶液中に約５％〜約２０％（例えば、約７．５％〜約１７．５％、約１０％〜約１５％、および約１２．５％を含む）、重量／体積、で存在する。一部の実施形態では、担体は、例えば、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンを含むタンパク質である。
一部の実施形態では、上記のコアと少なくとも１つのさらなる層とを含むナノ粒子を調製する方法であって、ａ）上記の集合分子を含む組成物を、上記のカーゴ分子を含む組成物を併せて、第１の混合物を形成するステップ、ｂ）第１の混合物をインキュベートしてナノ粒子のコアを形成するステップ、ｃ）ｂ）の混合物を、細胞透過性ペプチドを含む組成物と併せて、第２の混合物を形成するステップ、およびｄ）第２の混合物をインキュベートして、コアと少なくとも１つのさらなる層とを含むナノ粒子を形成するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ｅ）コアと少なくとも１つのさらなる層とを含むナノ粒子を含む組成物と、細胞透過性ペプチドを含む組成物とを併せて、第３の混合物を形成するステップ、およびｆ）第３の混合物をインキュベートして、コアと少なくとも２つのさらなる層とを含むナノ粒子を形成するステップをさらに含む。増加する数の層を含むナノ粒子の形成に方法を適合させることができることは理解されるはずである。一部の実施形態では、集合分子は、上記のＡＤＧＮペプチドである。一部の実施形態では、集合分子は、上記のＡＤＧＮペプチドでない。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、上記のＡＤＧＮペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、上記のＡＤＧＮペプチドでない。一部の実施形態では、集合分子または細胞透過性ペプチドを含む組成物は、集合分子または細胞透過性ペプチドを約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む保存溶液であり、例えば、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．７５ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、および約１ｍｇ／ｍｌを含む。一部の実施形態では、集合分子または細胞透過性ペプチドを含む保存溶液を約２分〜約２０分間超音波処理し、例えば、約５分〜約１５分、および約１０分を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は核酸であり、カーゴ分子を含む組成物は、核酸を含む保存溶液である。一部の実施形態では、核酸は、上記のオリゴヌクレオチドであり、核酸を含む保存溶液は、オリゴヌクレオチドを約１μＭ〜約２０μＭの濃度で含み、例えば、約２μＭ〜約１５μＭ、約３μＭ〜約１０μＭ、約４μＭ〜約８μＭ、および約５μＭを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを含む保存溶液を水中で配合する。一部の実施形態では、水は、蒸留水である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを含む保存溶液を緩衝液中で配合する。一部の実施形態では、核酸はプラスミドであり、核酸を含む保存溶液は、プラスミドを約２０μＭ〜約５００μＭの濃度で含み、例えば、約３０μＭ〜約４００μＭ、約４０μＭ〜約３００μＭ、約５０μＭ〜約２００μＭ、約７５μＭ〜約１５０μＭ、および約１００μＭを含む。一部の実施形態では、プラスミドを含む保存溶液を水中で配合する。一部の実施形態では、水は、蒸留水である。一部の実施形態では、プラスミドを含む保存溶液を緩衝液中で配合する。一部の実施形態では、緩衝液は、プラスミドの保管に使用される当技術分野において公知の任意の緩衝液であり、例えば、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む緩衝液であって、Ｔｒｉｓが約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度（例えば、約２０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、および約５０ｍＭを含む）であり、ＥＤＴＡが約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度（例えば、約０．２ｍＭ〜約０．８ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約０．７ｍＭ、約０．４ｍＭ〜約０．６ｍＭ、および約０．５ｍＭを含む）である、緩衝液を含む。一部の実施形態では、併せるステップを水性媒体中で行って、混合物を形成する。一部の実施形態では、水性媒体は、水であり、例えば蒸留水を含む。一部の実施形態では、水性媒体は、緩衝液であり、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、または核タンパク質複合体を安定化するための当技術分野において公知の任意の緩衝液を含む。一部の実施形態では、混合物中の細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：５〜約８０：１であり、例えば、約５：１〜約４０：１、ならびに約１：２、１：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１および５０：１のいずれかを含む。一部の実施形態では、混合物を約１０分〜６０分間（例えば、約２０分、３０分、４０分および５０分間のいずれかを含む）、約３０℃〜約４５℃の温度で（例えば、約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃および４４℃のいずれかで、を含む）インキュベートしてナノ粒子を形成することによって、ナノ粒子を含む保存溶液を得る。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む保存溶液は、４℃で少なくとも約３週間にわたって安定した状態を保つ。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む保存溶液を担体の存在下で凍結乾燥させる。一部の実施形態では、担体は、例えば、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せを含む糖であり、複合体またはナノ粒子を含む保存溶液中に約５％〜約２０％（例えば、約７．５〜約１７．５％、約１０％〜約１５％、および約１２．５％を含む）、重量／体積、で存在する。一部の実施形態では、担体は、例えば、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンを含むタンパク質である。
一部の実施形態では、本発明の複合体またはナノ粒子を含む安定した組成物について、複合体の平均直径は、約１０％より大きく変化せず、多分散指数は、約１０％より大きく変化しない。
使用方法
一部の実施形態では、個体の疾患を処置する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患の処置に有用な１つまたは複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、処置されることになる疾患は、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、増殖因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および転写の他の調節因子、タンパク質発現および修飾の制御因子、ならびにアポトーシスおよび転移の制御因子を含むがこれらに限定されない、タンパク質をコードする。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる上記の複合体またはナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数のさらなる上記の複合体またはナノ粒子を含む１つまたは複数のさらなる有効量の医薬組成物を個体に投与するステップをさらに含む。
本明細書において使用する活性または発現の「調節」は、遺伝子もしくはｍＲＮＡの状態もしくはコピー数を制御するもしくは変えること、または産生されるタンパク質などの遺伝子産物の量を変化させることを意味する。一部の実施形態では、カーゴ分子は、標的遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、調節（例えば、阻害）は、一部の実施形態では転写後レベルで起こり、カーゴ分子は、遺伝子または遺伝子産物の発現を、少なくとも約０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれか、阻害する。プラスミド送達の場合などの一部の実施形態では、カーゴ分子は、遺伝子または遺伝子産物の発現を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれか、増加させることがある。
上記の方法の一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ｗｎｔ、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、アンジオポエチン受容体、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＨＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＧＦＲ、ＭＳＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体（ＦＺＤ−１〜１０）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、Ｐａｔｃｈｅｄ、ＣＸＣＲ４、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＭＡＰＫ、ＭＫＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＪＡＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＭＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０、ＤＥＰＴＯＲ、ＭＳＩＮ１、Ｓ６キナーゼ、ＰＤＫ１、ＢＲＡＦ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、ＧＳＫ、ＩＫＫ、ＰＬＫ−１、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ１〜１３）、ＣＤＫ活性化キナーゼ、ＡＬＫ／Ｍｅｔ、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＲＥＴ、β−カテニン、Ｍｃｌ−１、ＰＫＮ、ＡＴＦ−２、Ｃｈｏｐ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＰＣ４、Ｅｌｋ−１、Ｅｔｓ１、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＦＡＴ４、Ｓａｐ１ａ、ＳＴＡＴ、Ｔａｌ、ｐ５３、ＣＲＥＢ、Ｍｙｃ、ＮＦ−κＢ、ＨＤＡＣ、ＨＩＦ−１α、ＲＲＭ２、ユビキチンリガーゼ、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＭＥＣＬ−１、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡＲ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、カスパーゼ−９、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ＭＤＲ−１、ＨＬＡ−Ｂ７／ベータ２−ミクログロブリン、Ｈｅｒ２、Ｈｓｐ２７、チミジンキナーゼ、およびＭＤＡ−７、ＧＬＩ１、ＣＴＮＮＢ１、ｅＩＦ５Ａ、変異型ＤＤＸ３Ｘ、ヘキソキナーゼＩＩ、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２、ＡＲＫ５、ＡＬＫ、ＭＵＣ１、ＨＭＧＡ２、ＩＲＦ１、ＲＰＮ１３、ＨＤＡＣ１１、Ｒａｄ５１、Ｓｐｒｙ２、ｍｉｒ−１４６ａ、ｍｉｒ−１４６ｂ、サバイビン、ＭＤＭ２、ＭＣＬ１、ＣＭＹＣ、ＸＢＰ１（スプライス型および非スプライス型）、ＳＬＡＭＦ７、ＣＳ１、Ｅｒｂｂ４、Ｃｘｃｒ４（ワルデンストレームマクログロブリン血症）、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、Ｐｒｄｘ１およびＰｒｄｘ２（バーキットリンパ腫）、Ｂｃｌ６、Ｉｄｈ１、Ｉｄｈ２、Ｓｍａｄ、Ｃｃｎｄ２、サイクリンｄ１〜２、Ｂ７−ｈ１（ｐｄｌ−１）、Ｐｙｋ２、ＲＳＶヌクレオカプシド、Ｐｒｅ−ｇｅｎ／Ｐｒｅ−Ｃ、Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ、Ｘ、ＨＢＶ保存配列、ＨＩＶ Ｔａｔ、ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡ、ヒトＣＣＲ５、ｍｉＲ−１２２、ＥＢＯＶポリメラーゼＬ、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＧＰ／ｓＧＰ、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＮＰＣ１、ＴＩＭ−１、トランスサイレチン、ＭＤＳ１−ＥＶＩ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＥＴＢＰ１、β−グロビン、ＬＰＬ、ケラチンＫ６Ａ、ケラチンＫ６Ｂ、ケラチン１６、ケラチン１７、ｐ５３、β−２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、ＴＲＰＶ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＩＦ−１、カスパーゼ−２、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ ３、Ｓｍａｄ ４、Ｓｍａｄ ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−κＢ、ならびにＰＡＲＰ−１を含むが、これらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患はがんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍であり、医薬組成物は、増殖因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および転写の他の調節因子、タンパク質発現および修飾の制御因子ならびにアポトーシスおよび転移の制御因子を含むがこれらに限定されないタンパク質をコードする、１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、増殖因子またはサイトカインは、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびｗｎｔを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、細胞表面受容体は、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、アンジオポエチン受容体、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＨＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＧＦＲ、ＭＳＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体（ＦＺＤ−１〜１０）、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ｐａｔｃｈｅｄおよびＣＸＣＲ４を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、シグナル伝達分子またはキナーゼは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＭＡＰＫ、ＭＫＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＪＡＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＭＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０、ＤＥＰＴＯＲ、ＭＳＩＮ１、Ｓ６キナーゼ、ＰＤＫ１、ＢＲＡＦ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、ＧＳＫ、ＩＫＫ、ＰＬＫ−１、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ１〜１３）、ＣＤＫ活性化キナーゼ、ＡＬＫ／Ｍｅｔ、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＲＥＴ、β−カテニン、Ｍｃｌ−１およびＰＫＮ３を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、転写因子または転写の他の調節因子は、ＡＴＦ−２、Ｃｈｏｐ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＰＣ４、Ｅｌｋ−１、Ｅｔｓ１、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＦＡＴ４、Ｓａｐ１ａ、ＳＴＡＴ、Ｔａｌ、ｐ５３、ＣＲＥＢ、Ｍｙｃ、ＮＦ−κＢ、ＨＤＡＣ、ＨＩＦ−１αおよびＲＲＭ２を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、タンパク質発現または修飾の制御因子は、ユビキチンリガーゼ、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ−１を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、アポトーシスまたは転移の制御因子は、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡＲを含むがこれらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患はがんであり、がんは固形腫瘍であり、医薬組成物は、腫瘍形成および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、腫瘍形成および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、インターフェロン−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、カスパーゼ−９、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ＭＤＲ−１、ＨＬＡ−Ｂ７／ベータ２−ミクログロブリン、Ｈｅｒ２、Ｈｓｐ２７、チミジンキナーゼおよびＭＤＡ−７からなる群から選択される。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患はがんであり、がんは血液学的悪性腫瘍であり、医薬組成物は、血液学的悪性腫瘍の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、血液学的悪性腫瘍の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ＧＬＩ１、ＣＴＮＮＢ１、ｅＩＦ５Ａ、変異型ＤＤＸ３Ｘ、ヘキソキナーゼＩＩ、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２、ＡＲＫ５、ＡＬＫ、ＭＵＣ１、ＨＭＧＡ２、ＩＲＦ１、ＲＰＮ１３、ＨＤＡＣ１１、Ｒａｄ５１、Ｓｐｒｙ２、ｍｉｒ−１４６ａ、ｍｉｒ−１４６ｂ、サバイビン、ＭＤＭ２、ＭＣＬ１、ＣＭＹＣ、ＸＢＰ１（スプライス型および非スプライス型）、ＳＬＡＭＦ７、ＣＳ１、Ｅｒｂｂ４、Ｃｘｃｒ４（ワルデンストレームマクログロブリン血症）、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、Ｐｒｄｘ１およびＰｒｄｘ２（バーキットリンパ腫）、Ｂｃｌ６、Ｉｄｈ１、Ｉｄｈ２、Ｓｍａｄ、Ｃｃｎｄ２、サイクリンｄ１〜２、Ｂ７−ｈ１（ｐｄｌ−１）およびＰｙｋ２を含むが、これらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患は、ウイルス感染性疾患であり、医薬組成物は、ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ＲＳＶヌクレオカプシド、Ｐｒｅ−ｇｅｎ／Ｐｒｅ−Ｃ、Ｐｒｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ、Ｘ、ＨＢＶ保存配列、ＨＩＶ Ｔａｔ、ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡ、ヒトＣＣＲ５、ｍｉＲ−１２２、ＥＢＯＶポリメラーゼＬ、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＧＰ／ｓＧＰ、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＮＰＣ１およびＴＩＭ−１を含むが、これらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患は、遺伝性疾患であり、医薬組成物は、遺伝性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、遺伝性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、トランスサイレチン、ＭＤＳ１−ＥＶＩ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＥＴＢＰ１、β−グロビンおよびＬＰＬを含むが、これらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患は、老齢または変性疾患であり、医薬組成物は、老齢または変性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、老齢または変性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ケラチンＫ６Ａ、ケラチンＫ６Ｂ、ケラチン１６、ケラチン１７、ｐ５３、β−２アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、ＴＲＰＶ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＩＦ−１およびカスパーゼ−２を含むが、これらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、処置されることになる疾患は、線維性または炎症性疾患であり、医薬組成物は、線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする２つまたはそれ超の遺伝子の発現を調節する。一部の実施形態では、線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質は、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ ３、Ｓｍａｄ ４、Ｓｍａｄ ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ−１、ＮＦ−κＢおよびＰＡＲＰ−１からなる群から選択される。
上記の方法の一部の実施形態では、医薬組成物は、疾患に関与する１つまたは複数のｍｉＲＮＡの発現を調節する。一部の実施形態では、疾患は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、多発性肝のう胞および多発性のう胞腎、がん、心血管疾患、心不全、心肥大、神経発達疾患、脆弱Ｘ症候群、レッテ症候群、ダウン症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、炎症性疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、ならびに骨格筋疾患を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２３、およびｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０ｂ、およびｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｃ、およびｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４５、およびｍｉＲ１２５ｂｌ、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ１５５、ｍｉＲ ２００ａ、２００ｂ、２００ｃ、ｍｉＲ−１９３ａ、１９３ｂ、ｍｉＲ−ｌｅｔ ７ｇ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１７−１９ファミリー、ｍｉＲ ３１、ｍｉＲ １３５、ｍｉＲ−１８１ｂ、およびｍｉＲ ２００ｃ、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−ｌｅｔ７、ｍｉＲ １４３、ｍｉＲ １４５、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６、Ｈａｓ−ｍｉＲ−１９１、１９９ａ、ｍｉＲ １５５、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ−１、ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ １５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ１４３、ｍｉＲ−４５、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−ｌｅｔ ７ａ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１４３、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１０６ｂ−２５、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｈａｓ−ｍｉｒ−２１およびｈａｓ−ｍｉｒ−２０５、ｍｉＲ−１７−９２、ｈａｓ−ｍｉｒ−１２６□、ｍｉＲ−ｌｅｔ ７、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−２３ ｂ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ １７−５ｐ、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−６１、ｍｉＲ−７８、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ ３４２、ｍｉＲ−２９９−３ｐ、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２９８、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−１１２、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−２０３、ｍＩＲ−１３２、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１０３、およびｍｉＲ−１００を含むが、これらに限定されない。
上記の方法の一部の実施形態では、医薬組成物を、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、頭蓋内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、空洞内または経口投与のいずれかによって個体に投与する。
上記の方法の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、分子を細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が分子を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、細胞は、末梢血由来Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、臍帯血由来Ｔ細胞、または造血幹細胞もしくは他の前駆細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、分子は、上記のカーゴ分子である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチドおよび小分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
したがって、一部の実施形態では、核酸を細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、核酸と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の核酸のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、核酸は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡである。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡを細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ｓｉＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のｓｉＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの細胞への送達は、細胞における標的の発現減少をもたらす。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む））減少される。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）減少したままである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドを細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドおよび干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡを細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、干渉ＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）であり、複合体またはナノ粒子中の干渉ＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドおよび干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡを細胞に送達する方法であって、ａ）プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、第１の上記複合体またはナノ粒子、およびｂ）干渉ＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、第２の上記複合体またはナノ粒子と、細胞を接触させるステップを含み、配列中、Ｘ１が任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８が任意のアミノ酸である、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）であり、第２の複合体またはナノ粒子中の干渉ＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、第１および／または第２の複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、ポリペプチドを細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ポリペプチドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のポリペプチドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、小分子を細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、小分子と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の小分子のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、小分子は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、分子をＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、分子と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の分子のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、分子は、上記のカーゴ分子である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチドおよび小分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれかの処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、核酸をＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、核酸と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の核酸のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、核酸は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡである。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ｓｉＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のｓｉＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの細胞への送達は、細胞における標的の発現減少をもたらす。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む））減少される。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）減少したままである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする１つまたは複数の干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。
一部の実施形態では、プラスミドおよび干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、干渉ＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）であり、複合体またはナノ粒子中の干渉ＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドおよび干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、ａ）プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、第１の上記複合体またはナノ粒子、およびｂ）干渉ＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、第２の上記複合体またはナノ粒子と、細胞を接触させるステップを含み、配列中、Ｘ１が任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８が任意のアミノ酸である、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）であり、第２の複合体またはナノ粒子中の干渉ＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、第１および／または第２の複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、ポリペプチドをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ポリペプチドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のポリペプチドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、小分子をＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、小分子と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の小分子のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、小分子は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、分子をＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、分子と、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の分子のＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、分子は、上記のカーゴ分子である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチドおよび小分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれかの処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、核酸をＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、核酸と、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の核酸のＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、核酸は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡである。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ｓｉＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のｓｉＲＮＡのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの細胞への送達は、細胞における標的の発現減少をもたらす。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む））減少される。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）減少したままである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドおよび干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、干渉ＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）であり、複合体またはナノ粒子中の干渉ＲＮＡのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子の接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の疾患の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、プラスミドおよび干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、ａ）プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、第１の上記の複合体またはナノ粒子、およびｂ）干渉ＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、第２の上記の複合体またはナノ粒子と、細胞を接触させるステップを含み、配列中、Ｘ１が任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３が任意のアミノ酸である、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）であり、第２の複合体またはナノ粒子中の干渉ＲＮＡのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子の接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と第１および第２の複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、免疫応答の負の制御に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を含む。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、第１および／または第２の複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、ポリペプチドをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ポリペプチドと、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のポリペプチドのＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、小分子をＴ細胞に送達する方法であって、細胞を上記の複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、小分子と、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号２５）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ１３は、任意のアミノ酸である）を含むＶＥＰＥＰ−９ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、Ｌであるか、存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、存在せず、Ｘ１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号２６）、ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号２７）またはＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の小分子のＶＥＰＥＰ−９ペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｅｘ ｖｉｖｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞と複合体またはナノ粒子との接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞株からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、小分子は、疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、分子を個体の細胞に送達する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、分子と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の分子のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に皮下経路によって投与する。一部の実施形態では、分子は、上記のカーゴ分子である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチドおよび小分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、カーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、核酸を個体の細胞に送達する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、核酸と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の核酸のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に皮下経路によって投与する。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡである。一部の実施形態では、プラスミドは、治療用産物、または疾患、例えば、本明細書に記載する処置されることになる疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患）の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、核酸は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡを個体の細胞に送達する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ｓｉＲＮＡと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のｓｉＲＮＡのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に皮下経路によって投与する。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、ｓｉＲＮＡは、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの細胞への送達は、細胞における標的の発現減少をもたらす。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約３０％（例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む））減少される。一部の実施形態では、標的の発現は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）減少したままである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、プラスミドを個体の細胞に送達する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、プラスミドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のプラスミドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に皮下経路によって投与する。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、プラスミドは、疾患の処置に有用な産物をコードする。一部の実施形態では、プラスミドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、ＣＡＲは、疾患に関連する抗原を標的とする。例えば、一部の実施形態では、疾患はがんであり、ＣＡＲは、がん関連抗原を標的とする。一部の実施形態では、プラスミドの細胞への送達は、プラスミドによってコードされている産物の発現をもたらす。一部の実施形態では、プラスミドによってコードされている産物は、少なくとも約５日にわたって（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日またはそれ超のいずれか（これらの値の間の任意の範囲を含む）にわたって）発現される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、ポリペプチドを個体の細胞に送達する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ポリペプチドと、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中のポリペプチドのＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に皮下経路によって投与する。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、ポリペプチドは、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、小分子を個体の細胞に送達する方法であって、上記の複合体またはナノ粒子を含む組成物を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、小分子と、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ８は、任意のアミノ酸である）を含むＡＤＧＮペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、ＧまたはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、Ｘ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮペプチドは、ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号２）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号３）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子中の小分子のＡＤＧＮペプチドに対するモル比は、約１：１０〜約１：４０（例えば、約１：２０または約１：４０）である。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内、動脈内、腹腔内、小胞内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口または吸入経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に静脈内経路によって投与する。一部の実施形態では、組成物を個体に皮下経路によって投与する。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、小分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のさらなるカーゴ分子は、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
本出願の別の態様では、カーゴ分子（例えば、核酸）を安定化する方法であって、カーゴ分子を上記のＡＤＧＮペプチドと併せることによってカーゴ分子を安定化するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、カーゴ分子およびＡＤＧＮペプチドは、上記の複合体またはナノ粒子を形成する。一部の実施形態では、カーゴ分子は核酸であり、ＡＤＧＮペプチドは、核酸のスーパーコイル構造を安定化する。一部の実施形態では、カーゴ分子は、（例えば、血清成分またはヌクレアーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで）分解されやすく、ＡＤＧＮペプチドは、カーゴ分子を分解から保護する。
本明細書に記載する方法のいずれかを組み合わせることができることは、理解されるはずである。したがって、例えば、核酸を細胞に送達するための上記の方法のいずれかを、ポリペプチドを細胞に送達するための上記の方法のいずれかと組み合わせることによって、核酸およびポリペプチドを細胞に送達することができる。企図される可能な組合せは、本明細書に記載する方法のいずれかの２つまたはそれ超の組合せを含む。
キット
本明細書に記載する方法に有用なキット、試薬および製造品も、本明細書において提供される。そのようなキットは、ＡＤＧＮペプチド、集合分子および／または他の細胞透過性ペプチドを収容するバイアルを、カーゴ分子を収容するバイアルとは別に含むことがある。患者処置時に、例えば、遺伝子発現分析または患者試料のプロテオミクスもしくは組織学的分析に基づいて、処置されることになる特定の病態が何であるかを先ず決定する。それらの結果を得たら、それに応じてＡＤＧＮペプチドならびにいずれかの任意選択の集合分子および／または細胞透過性ペプチドを適切なカーゴ分子と組み合わせて、有効な処置のために患者に投与することができる複合体またはナノ粒子を得る。したがって、一部の実施形態では、１）ＡＤＧＮペプチドと任意選択で２）１つまたは複数のカーゴ分子（例えば、核酸、例えばオリゴヌクレオチド）とを含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、集合分子および／または他の細胞透過性ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、遺伝子発現プロファイルを判定するための薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本明細書に記載するキットは、対象方法を実施するために該キットの構成要素を使用するための説明書（例えば、本明細書に記載する医薬組成物を製造するためのおよび／または医薬組成物の使用のための説明書）をさらに含むことがある。対象方法を実施するための説明書は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷されることがある。したがって、説明書は、キット内に添付文書として存在することもあり、キットの容器またはその構成要素の表示の中に存在する（すなわち、包装または分包に付随する）ことなどもある。一部の実施形態では、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなど）上に存在する電子保存データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキット内に存在せず、リモートソースから、例えばインターネット経由で、説明書を得る手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を見ることができるおよび／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録される。
キットの様々な構成要素は、別個の容器内に存在することがあり、その場合、それらの容器は、単一のハウジング、例えばボックス内に収容されていることがある。
（実施例１）
材料および方法
ＡＤＧＮペプチド
すべてのペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を使用する固相ペプチド合成によって合成した。ペプチドは、Ｃ末端システアミド基を使用することなくさらなる官能化を可能にするために、Ｎ末端にベータ−アラニン、セリンまたはアセチル基を含有した。ペプチドは、Ｃ末端にシステアミドまたはＣＯＯＨ基のどちらかを含有した。
本発明の構造
ＡＤＧＮペプチドは、二次両親媒性ペプチドであり、非常に用途が広く、強い構造多型性を示す。ＡＤＧＮペプチドは、溶液中では遊離形態として折り畳まれておらず、カーゴの存在下では部分的アルファヘリックス構造をとる。
オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡを以下の配列に従って合成した：
プラスミドＤＮＡ
ルシフェラーゼをコードし、６．２Ｋｂおよび３．８Ｋｂのサイズを有するプラスミドを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手し、リクローニングした。ＹＦＰをコードするプラスミド（６．３Ｋｂ）をＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から入手し、リクローニングした。ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体をコードするプラスミドであって、ＣＤ２８およびＣＤ３ｚシグナル伝達部分に結合しているＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを含むプラスミドを、以前に記載されたように調製した。
ＡＤＧＮペプチド／カーゴ粒子および複合体の調製
ペプチド／ｓｉＲＮＡまたはペプチド／プラスミドナノ粒子は、両親媒性ペプチドとプラスミドまたはｓｉＲＮＡとを混合することによって調製した。両親媒性ペプチドの保存溶液は、蒸留水中１ｍｇ／ｍＬで調製し、１０分間超音波処理した。ｓｉＲＮＡの保存溶液は、水中５μＭ濃度で調製した。プラスミドの保存溶液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中、１００μＭの濃度で調製した。ペプチド／プラスミド複合体またはナノ粒子は、純水中で、ペプチド（４００μＭ保存溶液）をプラスミド（１００μＭ保存溶液）とともに３０分間、３７℃で、５：１、１０：１または２０：１の最終ペプチド対プラスミドモル比でインキュベートすることによって形成した。ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体またはナノ粒子は、水または好適な水性媒体中で、ペプチド（４００μＭ保存溶液）をｓｉＲＮＡ（５μＭ保存溶液）とともに３０分間、３７℃で、１０：１、２０：１または４０：１の最終ペプチド対ｓｉＲＮＡモル比でインキュベートすることによって形成した。より低濃度のＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ〜０．１２５ｎＭ）は、ストック複合体をＰＢＳで同じペプチド／ｓｉＲＮＡ比を保つように系列希釈することによって得た。単独でのｓｉＲＮＡまたはプラスミド、およびペプチド／プラスミド複合体を、ＰＢＳ中で５日間、２０℃および４０℃で保管して、プラスミドの安定性を試験した。
保管および安定性に関しては、水で調製した粒子の保存溶液は、４℃で少なくとも３週間にわたって安定した状態を保った。長期保管のために粒子を凍結乾燥することができ、その場合、その過程中での粒子の安定化のために、凍結乾燥前に５〜２０％グルコースまたはマンニトールを粒子溶液に添加する。
ペプチドベースのナノ粒子の特性評価
平均粒径分布を２５℃で測定１回につき３分間判定し、ゼータ電位をＺｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した。生理条件（０．９％ＮａＣｌ）でのＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体のサイズおよび多分散性を、４℃、２０℃および４０℃での１２／２４／４８時間のインキュベーション後、追跡した。３つの異なるペプチド／ｓｉＲＮＡモル比（１０：１、２０：１および４０：１）を分析した。
細胞培養およびペプチド媒介カーゴ送達
接着ＨｅＬａ細胞（アメリカ合衆国細胞培養系統保存機関［ＡＴＣＣ］から）を、２ｍＭグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気で培養した。トランスフェクションの前日に３５ｍｍディッシュに播種した合計１５０，０００の細胞を集密度６０％まで増殖させ、予め作っておいた２００μｌの複合体を重層し、３〜５分間インキュベートし、その後、４００μｌのＤＭＥＭを添加した。３７℃での３０分のインキュベーション後、ＡＤＧＮ−１００／カーゴ複合体の重層を除去せずに、１６％ＦＣＳを含有する１ｍＬの新たなＤＭＥＭを、１０％最終ＦＣＳ濃度に至るように添加した。細胞を２４または４８時間、インキュベーターに戻した。ＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡについては、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して形質導入の２４時間後にｍＲＮＡレベルを判定した。報告するデータは、３または４回の異なる実験の平均である。ルシフェラーゼをコードするプラスミドについては、４８時間後にルミノメトリーによってルシフェラーゼ発現レベルを定量した。
細胞毒性
ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の毒性をＨｅｌａおよびＪｕｒｋａｔ細胞株で研究した。トランスフェクションの前日に２４ウェルプレートに播種した合計３０，０００の細胞を、１〜５０μＭ（５００μＭ ＡＤＧＮ−１００）の範囲の漸増濃度のペプチドまたはモル比２０：１もしくは４０：１で複合体化されたペプチド／ｓｉＲＮＡとともに３０分間インキュベートした後、最終１０％ＦＣＳ濃度に至るように培地を添加した。ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンｍＲＮＡレベルのモニタリング（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎ、Ｐａｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．）によって、および比色ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、細胞毒性応答を１２または２４時間後に測定した。ＭＴＴアッセイについては、細胞培養培地を除去し、４時間、２．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含有するＰＢＳで置換した。結果は、３回の別個の実験の平均に対応する。
マウス腫瘍モデル
胸腺欠損雌ヌードマウス（６〜８週齢）の側腹部に１００μｌ ＰＢＳ中の１×１０６ ＨＴ−２９細胞を皮下接種した。
ｓｉＲＮＡ処置について：腫瘍移植の２〜３週間後、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達したら、遊離Ｃｙｃ−Ｂ１ ｓｉＲＮＡもしくはＣｄｃ２０ ｓｉＲＮＡ（５０もしくは１００μｇ）、対照ｓｉＲＮＡ、Ｃｙｃ−Ｂ３、Ｃｙｃ−Ｂ１ ｓｉＲＮＡ（１、５、１０μｇ）、Ｃｄｃ２０ ｓｉＲＮＡ（５μｇ）、またはモル比２０：１でＡＤＧＮペプチドと複合体化されたＣｙｃ−Ｂ１およびＣｄｃ２０ ｓｉＲＮＡ（各５μｇ）のカクテルの、どちらかの０．１ｍｌの溶液での３日ごとの腫瘍内または静脈内注射によって、動物を処置した。
（実施例２）
ＲＮＡ分子送達のためのＡＤＧＮペプチド利用
実施例２．１：ＡＤＧＮペプチドはカーゴと安定したナノ構造を形成する
生理条件（０．９％ＮａＣｌ）でのペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体のサイズおよび多分散性を４℃、２０℃および４０℃での１２、２４および４８時間のインキュベーション後に追跡した。３つの異なるペプチド：ｓｉＲＮＡモル比を分析した：１０：１、２０：１、および４０：１。
モル比２０：１または４０：１で、ＡＤＧＮペプチドはｓｉＲＮＡと、１２０ｎｍの平均直径および０．３の多分散指数（ＰＩ）を有する安定した粒子を形成した。粒子は、それらのサイズ分布（平均直径＜１３０ｎｍ、および多分散指数＜０．３１）を維持し、異なる温度で長い期間にわたって安定した状態を保った（表２〜４を参照されたい）。モル比１０：１では、粒径が経時的に増加した。
ゼータ電位によるＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ粒子電荷の測定値は、モル比２０：１および４０：１について同様であり、平均値は、それぞれ６．０±０．８ｍＶおよび５．１±１．０ｍＶであった。モル比１０：１の粒子の平均ゼータ電位は、１５．４±０．６ｍＶであった。
実施例２．２：ペプチド媒介ｓｉＲＮＡ送達
ＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を、Ｈｅｌａ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞の両方において、ＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３０）を使用してｓｉＲＮＡ送達について評価した。両方の細胞株へのｓｉＲＮＡトランスフェクションを６ウェルプレートで行った。完全培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。４Ｘ濃度のナノ粒子溶液を１ＸＰＢＳで希釈し、直ちに細胞に添加した。３７℃で１０分のインキュベーション後、細胞に遊離ＤＭＥＭ培地を重層し、３７℃でさらに３０〜６０分間インキュベートした。その後、完全ＤＭＥＭ培地を添加し、細胞を４８時間、３７℃でインキュベートした後、ウエスタンブロット分析を行った。
モル比１０：１、２０：１および４０：１のペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子を分析した。最終ｓｉＲＮＡ濃度が２００ｎＭ〜１０ｎＭの範囲である、ＰＢＳ中の保存溶液の系列希釈を使用して、ｓｉＲＮＡ用量反応を行った。実験を２回ずつ行った。
異なる培養細胞で行った用量反応実験によって、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡのペプチド媒介送達はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの頑強な下方制御を誘導することが明らかになった（図１Ａおよび１Ｂ）。モル比２０：１および４０：１の複合体を用いて両方の細胞株においてＧＡＰＤＨの顕著なサイレンシングを達成した。６０％より高い効率が５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ濃度で観察された。
実施例２．３：ＡＤＧＮペプチドは短鎖ｓｓＲＮＡと安定したナノ構造を形成する
２つのｓｓＲＮＡを評価した：Ｇ１（９−Ｍｅｒ：３’−ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ−５’、配列番号３９）およびＧ２（１２−ｍｅｒ：３’−ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ−５’、配列番号４０）。４℃および２０℃での１２および２４時間のインキュベーション後、生理条件（０．９％ＮａＣｌ）でペプチド／Ｇ１およびペプチド／Ｇ２複合体のサイズおよび多分散性を追跡した。２つの異なるペプチド：ｓｉＲＮＡモル比を分析した：１０：１および２０：１。
表５に示すように、モル比１０：１または２０：１で、ＡＤＧＮペプチドはＧ１およびＧ２と、１３５ｎｍの平均直径および０．２５の多分散指数を有する安定した粒子を形成した。粒子は、それらのサイズ分布（平均直径＜１３０ｎｍ、および多分散指数＜０．３）を維持し、長い期間にわたって安定した状態を保った。
ゼータ電位によるペプチド／Ｇ１およびペプチド／Ｇ２粒子電荷の測定値は、モル比１０：１および２０：１について同様であり、平均値は、それぞれ１０．４±３．１および８．４±２．０ｍＶであった。
実施例２．４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ線維症モデルをシミュレートするための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代ヒト線維芽細胞株におけるペプチド／ＳＰＡＲＣ ｓｉＲＮＡ複合体の利用
２つの異なるＳＰＡＲＣ ｓｉＲＮＡ（ＡおよびＢ）を上で説明したようにＡＤＧＮペプチドと複合体化した。２セットの初代ヒト線維芽細胞株（ＡおよびＢ）を培養し、４０ｎＭの濃度の２つの異なるペプチド／ＳＰＡＲＣ ｓｉＲＮＡ複合体で４８時間処置した。非標的ｓｉＲＮＡを陰性対照処置として使用した。Ｓｐａｒｃ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調査した。実験を２回ずつ行った（Ａ１、Ａ２およびＢ１、Ｂ２、図２を参照されたい）。両方の線維芽細胞株においてＳＰＡＲＣの８０％より高いノックダウンが各ＳＰＡＲＣ ｓｉＲＮＡについて見られた。
（実施例３）
ＨｅｌａおよびＪｕｒｋａｔ細胞に対するＡＤＧＮペプチドおよびペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の毒性の評価
ＭＴＴアッセイを使用して、およびｑｕａｎｔｉｇｅｎ（商標）技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって測定したシクロフィリンｍＲＮＡのレベルのモニタリングによって、ＡＤＧＮペプチド、およびモル比２０：１と４０：１両方のＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体についての毒性を評価した。実験を２回ずつ行った。
データは２つの方法間でよく相関し、ＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体については５０μＭまで毒性が観察されなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。生存率またはシクロフィリンｍＲＮＡレベルの約２０〜３０％の低下が５０μＭの遊離ペプチドで観察された。
（実施例４）
ＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ利用
実施例４．１
サイクリンＢ１、ＧＡＰＤＨおよびＣｄｃ２０を標的とするｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に、ＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を使用した。ＡＤＧＮペプチド／サイクリンＢ１ ｓｉＲＮＡ複合体の３日ごとの注射は、異種移植マウスモデルにおける結腸腫瘍増殖を予防した。
胸腺欠損雌ヌードマウス（６〜８週齢）の側腹部に１００μｌ ＰＢＳ中の１×１０６ ＰＣ３（前立腺がん）またはＨＴ−２９（結腸がん）細胞を皮下接種した。腫瘍移植の２〜３週間後、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達したら、５０もしくは１００μｇ遊離Ｃｙｃ−Ｂ１ ｓｉＲＮＡ（配列番号３２）、対照ｓｉＲＮＡ、または５もしくは１０μｇ Ｃｙｃ−Ｂ３（配列番号３４）、またはＡＤＧＮペプチドと複合化したＣｙｃ−Ｂ１ ｓｉＲＮＡの０．１ｍｌの溶液での３日ごとの腫瘍内または静脈内注射によって、動物を処置した。粒子の保存溶液を水で調製し、この保存溶液は、４℃で少なくとも３週間にわたって安定であった。長期保管のために粒子を凍結乾燥することができ、その場合、その過程中での粒子の安定化のために、凍結乾燥前に５〜２０％グルコースまたはマンニトールを粒子溶液に添加する。投与前に、粒子を希釈して生理条件（０．９％ＮａＣｌおよび５〜２０％マンニトール）にした。デジタルカリパスを使用して二次元で定期的に腫瘍直径を測定し、腫瘍体積を長さ×幅×高さ×０．５２として算定した。曲線は、動物６匹のコホートにおける腫瘍サイズの平均値を示し、動物の死亡も、毒性のいかなる徴候も観察されなかった。実験は、国家の規則に従って行い、地方動物実験倫理委員会によって承認された。結果の統計的有意性をスチューデントｔ検定によって算定し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
ペプチド／サイクリンＢ１ ｓｉＲＮＡ粒子の全身静脈内投与後、ＨＴ−２９腫瘍サイズの有意な縮小が４８日目に観察され、５μｇおよび１０μｇのｓｉＲＮＡで、それぞれ、６５％および９０％の阻害があった（図４）。ペプチド／ミスマッチｓｉＲＮＡ（１０μｇ）のまたはペプチド担体単独の抗腫瘍活性の欠如とともに、これらの結果は、サイクリンＢ１ ｓｉＲＮＡの全身送達に伴う生物学的応答の頑強性および特異性を強く示している。
ペプチド粒子におけるサイクリンＢ１およびＣｄｃ２０ ｓｉＲＮＡの併用は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を３日ごとに注射すると、異種移植マウスモデルの結腸腫瘍増殖を予防する。ペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子中の、５μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のＣｙｃ−Ｂ１ ｓｉＲＮＡ、Ｃｄｃ２０ ｓｉＲＮＡ（配列番号３６）、および５μｇ Ｃｙｃ−Ｂ１／Ｃｄｃ２０ ｓｉＲＮＡの混合物（各々０．１２５ｍｇ／ｋｇ）を、異種移植腫瘍を有するマウスに、３日ごとに静脈内注射した。ＨＴ−２９腫瘍サイズの有意な縮小が５０日目に観察され、５μｇのｃｙｃ−Ｂ１ ｓｉＲＮＡおよびＣｄｃ２０ ｓｉＲＮＡで、それぞれ５１％および３８％の阻害があった（図５）。９４％の顕著な縮小がペプチド／ｃｙｃ−Ｂ１／ｃｄｃ２０ ｓｉＲＮＡ複合体について観察された（図５）。これは、これら２つの遺伝子を標的化する相乗的または相加的効果を示唆している。これらの結果は共に、頑強な生物学的応答を伴ったｓｉＲＮＡのカクテルをｉｎ ｖｉｖｏで送達するＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子の能力を実証した。
実施例４．２：ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ生体内分布のｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを以前に記載されたように行った（Ｒｏｍｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４８巻、４９〜６５頁、２０１３年）。Ａｌｅｘａ７００標識ｓｉＲＮＡをモル比２０：１でのＡＤＧＮ−１００との複合体で使用して、実験を行った。薬物動態を正常ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＴ−２９担腫瘍マウスで評価した。ネイキッド状態またはＡＤＧＮ−１００と複合体化した状態どちらか（ｎ＝４匹／群）の、０．５ｍｇ／ｋｇのＡｌｅｘａ７００蛍光標識ｓｉＲＮＡ（２００μｌ）の単回用量を、マウスに静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与した。２％イソフルランを使用して麻酔したマウスを、干渉フィルターを装備した６６３ｎｍ発光ダイオードによって照射した。投与後最初の１５分の映像を獲得し、以前に記載された（Ｒｏｍｅら、上掲、；Ｃｒｏｍｂｅｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７巻（１４号）４５５９〜４５６９頁、２００９年）ように裏面入射型ＣＣＤ冷却カメラを使用して５時間にわたって１時間ごとに、次いで２４時間後に、蛍光画像を撮影した。１２または２４時間時点でマウスを安楽死させ、様々な器官をＡｌｅｘａ蛍光定量のために除去した。全マウス分析を１、２、５、１０および２４時間後に行った。血液および組織試料（肝臓、脾臓、腎臓、肺、脳、心臓、皮膚、膵臓およびリンパ節）を２匹の動物から投与開始後１２および２４時間の時点で採取した。健常および担腫瘍マウスのｓｉＲＮＡレベルを、組織１ｍｇ当りの蛍光単位として定量した。
ＡＤＧＮ−１００ベースの粒子を、全身静脈内投与と全身皮下投与の両方を使用して評価した。動態解析は、様々な組織中のｓｉＲＮＡレベルが、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ粒子の単回静脈内または皮下注射後、２〜３時間経つとピークに達することを実証した（図６）。ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の静脈内投与によって、解析した組織の大部分へのｓｉＲＮＡの送達が、肺、腎臓、脾臓、リンパ節、肝臓、膵臓および筋肉に関しては有意なレベルで、ならびに心臓および脳に関してはより低いレベルで可能であった（図７Ａ）。静脈内投与によって腫瘍組織へのｓｉＲＮＡの有意な送達も可能であった（図７Ｂ）。ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体の皮下投与によって、筋肉、皮膚、脾臓および肝臓へのｓｉＲＮＡの有意な送達が可能であった（図７Ｃ）。
実施例４．３：ｓｉＲＮＡサイレンシング因子ＶＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ送達
ＡＤＧＮ−１００ペプチドを、ｓｉＲＮＡが標的とする内在性の、肝細胞によって発現される血液凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）（肝臓において発現される標的）のｉｎ ｖｉｖｏ送達について評価した。ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ粒子は、マウスにおいて毒性および有害副作用を一切誘導することなく、肝臓を標的とし、完全可逆性である強力な遺伝子サイレンシングをもたらした。
粒子の保存溶液は、水中で、未修飾ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦ７センス：５’−ＧＣＡＡＡＧＧＣＧＵＧＣＣＡＡＣＵＣＡＴＴ−３’、配列番号３７；ｓｉＦ７アンチセンス：５’−ＴＧＡＧＵＵＧＧＣＡＣＧＣＣＵＵＵＧＣＴＴ−３’、配列番号３８）（Ａｋｉｎｃら、２００９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９年）１７巻５号、８７２〜８７９頁）およびＡＤＧＮ−１００ペプチドを２０：１のペプチド／ｓｉＲＮＡモル比で使用して調製した。ペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子は、以前に記載された通り調製した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの使用前に、ＡＤＧＮ−１００／ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ粒子の安定性および有効性をｉｎ ｖｉｔｒｏでＨｅｐＧ２細胞（Ｈｅｐ Ｇ２−ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ−８０６５）に関して先ず評価した。生理条件（０．９％ＮａＣｌ）でのＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ複合体のサイズおよび多分散性を４℃での２、２４および４８時間のインキュベーション後ならびに４℃で１〜４週間の保管後に追跡した。モル比２０：１のＡＤＧＮ−１００／ＦＶＩＩｓｉＲＮＡは、１３０ｎｍの平均直径および０．３１の多分散指数（ＰＩ）で４週間の期間にわたって安定していた（表６）。ＦＶＩＩノックダウン（ＫＤ）についての粒子の効率を４℃での２および２４時間のインキュベーション後ならびに４℃で１〜４週間の保管後にモニターした。ＦＶＩＩ活性を未処置細胞に対し正規化した。ノックダウン結果は、３回の別個の実験の平均に相当する。ＡＤＧＮ−１００との複合体中の１００ｎＭ濃度のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡは、ＨｅｐＧ２細胞において約６５％のＦＶＩＩノックダウンをもたらした。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、粒子を希釈して生理条件（０．９％ＮａＣｌおよび５〜２０％マンニトール）にした。静脈内（尾静脈）または皮下投与による、遊離ｓｉＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡまたはＡＤＧＮペプチドと複合体化したｓｉＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡのどちらかの０．１ｍｌ溶液の３ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ用量）での単回注射で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を処置した。この研究は、４群のマウスを含んだ：等張グルコースを投与した対象群（Ｃ、Ｎ＝２）、ネイキッド第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを投与した群（ネイキッド、Ｎ＝２）、複合体の皮下注射を投与した群（ＳＱ、Ｎ＝３）、および複合体の静脈内注射を投与した群（ＩＶ、Ｎ＝３）。
投与後の様々な時点で後眼窩採血によって血清試料を採取し、活性ベース色素産生試験キット（ＢＩＯＰＨＥＮ ＶＩＩ）を使用して第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを食塩水対照処置動物のレベルと比較して定量した。実験は、国家の規則に従って行い、地方動物実験倫理委員会によって承認された。
図８Ａは、対象群に対し正規化した、３つの実験群についての第ＶＩＩ因子の相対平均活性レベルを示す。静脈内注射については注射８日後におよび皮下注射については注射２４日後に、それぞれ、８５％および７１％の最大ノックダウンが測定された。ネイキッドｓｉＲＮＡの注射についてはＦＶＩＩノックダウンが観察されなかった。これは、ＦＶＩＩノックダウンが特異的であることを示す（図８Ａ）。投与経路間のノックダウン動態の差は、皮下注射した製剤が肝臓への標的化前にリンパ系で足留めされることを示唆する。長いノックダウン期間が観察され、ｓｉＲＮＡの単回注射後６０日までＦＶＩＩ活性の測定可能な低下があった。この遺伝子サイレンシングは可逆的であり、静脈内および皮下注射についてそれぞれ３５日目および４５日目にはリバウンドが開始した（図８Ａ）。遺伝子サイレンシングは、マウスにおいていかなる毒性応答も副作用応答も誘導することなく観察された（図８Ｂ）。
注射後おおよそ６０日に相当する、正常血清第ＶＩＩ因子レベルが回復した時点で、動物に再投与した。これらの結果は、肝細胞へのｓｉＲＮＡの全身皮下または静脈内送達のためのＡＤＧＮ−１００技術の効力を強く示している。ＡＤＧＮ−１００は、有用なｉｎ ｖｉｖｏ標的検証法となり、治療的処置に有用である。
静脈内（ＩＶ）送達は、標的を迅速にノックダウンする手法を提供し、その一方で皮下（ＳＱ）送達は、より長い期間にわたって持続性作用をもたらすことができる。所望の標的の最適なまたは長期のノックダウンのためにＩＶ送達とＳＱ送達の両方を併用してもよい。好適な長さ（数日、数週間、数カ月）のサイクルでのＩＶの反復送達、ＳＱの反復送達、または両方の送達様式を、所望のノックダウンプロファイルに基づいて選択すべきである。
（実施例５）
ＤＮＡおよび遺伝子送達のためのＡＤＧＮペプチドの利用
実施例５．１：ＡＤＧＮペプチドは溶液中のＤＮＡスーパーコイル構造を安定化する
ＡＤＧＮ−１００／プラスミドＤＮＡのサイズおよび多分散性の変化は、２０℃でのインキュベーション後に観察されなかった（表７）。標準的な手法を使用するアガロースゲル電気泳動で、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ（６．２Ｋｂおよび３．８Ｋｂ）の百分率を１および４日のインキュベーション後に測定した（表８および表９）。ＡＤＧＮペプチドは、試験したすべての条件でプラスミドスーパーコイル構造を十分に安定化した。同様の結果が両方のプラスミドについて観察された。対照的に、液体製剤とプラスミドの複合体は、４、２０または４０℃での４日の保管後、不安定であった。
実施例５．２：ヘパリン処理に対するＤＮＡ／ペプチドナノ粒子の安定性
ヘパリン処理に対するＤＮＡ／ペプチド粒子および対照の抵抗性を４℃、２０℃および４０℃での１および４日のインキュベーション後に評価した。遊離プラスミドおよびペプチド−または脂質−製剤をヘパリン（５μｇ）で１時間、３２℃で処理し、その後、遊離プラスミドレベルをアガロースゲル電気泳動で分析した。ペプチド／プラスミド粒子を６．２Ｋｂプラスミドとのモル比２０：１で配合した。表１０に示すように、様々な温度での１および４日のインキュベーションおよびその後のヘパリン処理後のペプチド／ＤＮＡ複合体について、遊離プラスミドの百分率は低かった。この結果は、ペプチド／プラスミド粒子中のプラスミド／ペプチド相互作用には主としてアルギニン残基が関与し、ヘパリン処理によって解離されない安定した複合体が可能になったことを実証している。対照的に、プラスミドの脂質製剤は、ヘパリン処理下で不安定であり、放出された遊離プラスミドの百分率は高かった（表１０）。
実施例５．３：ＡＤＧＮペプチド／プラスミドＤＮＡ粒子は遺伝子送達を促進する：
２０℃（表１１）または４０℃（表１２）で１および４日間のペプチド／プラスミドナノ粒子の保管後にＨｅｌａ細胞でルシフェラーゼ発現効率を評価した。ペプチド媒介プラスミド送達効率を遊離プラスミドと、または脂質製剤（リポフェクタミン２０００ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、比較した。６．２および３．８Ｋｂプラスミドを用いて結果を得た。ＡＤＧＮペプチド／プラスミドＤＮＡ粒子は、プラスミドサイズの有意な影響のない高いルシフェラーゼ発現によって証明されるように、遺伝子送達を促進した。ＡＤＧＮペプチドは、トランスフェクション前のナノ粒子の４日のインキュベーション後でさえ、高いルシフェラーゼ発現を媒介した。対照的に、遺伝子送達およびルシフェラーゼ発現の媒介についての脂質製剤の効率は、２０℃および４０℃でのナノ粒子の４日の保管後、有意に低下した。
（実施例６）
Ｔ細胞へのＡＤＧＮ−１００媒介遺伝子移入
実施例６．１
ＡＤＧＮ−１００（Ａｃ−ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ−システアミド；配列番号２、残基１がアセチル化されており、残基１９がシステアミドに共有結合している）、ＶＥＰＥＰ−６（Ａｃ−ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ−システアミド；配列番号２０、残基１がアセチル化されており、残基１９がシステアミドに共有結合している）、およびＶＥＰＥＰ−９（Ａｃ−ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ−システアミド、配列番号２６、残基１がアセチル化されており、残基１９がシステアミドに共有結合している）ペプチドを、ルシフェラーゼを発現するプラスミドを使用してＪｕｒｋａｔ、２９３ＴおよびＫ５６２細胞をはじめとするＴ細胞への遺伝子送達について評価した。安定した遺伝子送達を研究するために、ＹＦＰを発現し、かつジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ）（Ｇ４１８）に対する陽性選択マーカーを含有するプラスミドを使用した。ＡＤＧＮ−１００およびＶＥＰＥＰ−９は、Ｔ細胞への強力なトランスフェクションはもちろん、ＹＦＰを発現する安定した形質転換細胞株の産生も可能にすることが判明した。
材料および方法
細胞株をＡＴＣＣから入手した：Ｊｕｒｋａｔ、クローンＥ６−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２（商標））、２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８）、およびＫ５６２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４３（商標））。７５ｃｍ２フラスコおよび６ウェルディッシュにおいて、最終濃度１０％までウシ胎児血清を含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）で細胞を培養した。細胞を４日ごとに継代させ、トランスフェクションの２４時間前に新たに継代させた。ＡＤＧＮ−１００、ＶＥＰＥＰ−６およびＶＥＰＥＰ−９ペプチドの保存溶液を蒸留水中２ｍｇ／ｍＬで調製し、１０分間、水浴超音波処理装置で超音波処理し、その後、使用直前に希釈した。プラスミド保存溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中１００μＭの濃度で調製した。
１ｎｇまたは５ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて１０：１または２０：１の最終ペプチド対プラスミドモル比で、ペプチド（４００μＭ保存溶液）とプラスミド（１００μＭ保存溶液）を純水中で３０分間、３７℃で混合することによって、ナノ粒子を調製した。その後、複合体溶液を５分間、９０００ｒｐｍで遠心分離して一切の沈殿を除去し、トランスフェクション直前に５０％ＰＢＳ溶液で希釈した。ルシフェラーゼ（６．２Ｋｂ）およびＹＦＰ（６．３Ｋｂ）をコードするプラスミドをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）からそれぞれ入手し、リクローニングした。
トランスフェクションの２４時間前に細胞を新たに継代させた。培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を５分間、０．２または０．４ｍＬのプラスミド／ペプチド溶液とともにインキュベートし、その後、０．４ｍＬの無血清培地を添加した。３０分後、１．２ｍＬの完全培地を添加し、血清レベルを１０％に調整した。培養物を３７℃で４８時間インキュベートし、その後、ＹＦＰまたはルシフェラーゼ発現を比色アッセイ、ＦＡＣＳ、および蛍光顕微鏡観察によって判定した。
トランスフェクションの４８時間後、数種のＧ４１８濃度：０、１００、２００、５００、８００または１０００μｇ／ｍｌを含有する完全増殖培地で細胞を培養した。２週間にわたって４日ごとに（または必要に応じて）薬物含有培地を置換した。第２週中に、生存細胞の「島」が選択された。その後、選択されたコロニーをレポーター発現について評価した。
様々なＴ細胞株におけるＡＤＧＮ−１００媒介遺伝子発現
様々なペプチドとのモル比１０：１および２０：１で、プラスミド複合体１および５ｎｇを使用して、３つの細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、２９３ＴおよびＫ５６２）についてのＹＦＰおよびルシフェラーゼ発現効率を評価した。ルシフェラーゼ発現を比色アッセイによってモニターし（図９）、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳによってモニターした（表１３、図１０）。遊離プラスミド、リポフェクタミン（脂質ベースの送達系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または対照としての遊離ペプチドのいずれかを使用して、実験を３回ずつ行った。
ＹＦＰ発現およびルシフェラーゼ発現は、トランスフェクションに、１ｎｇの遊離プラスミドを使用した場合全く観察されず、５ｎｇの遊離プラスミドを使用した場合５〜１０％の陽性細胞しか観察されなかった。１または５ｎｇどちらかのプラスミドを使用するＶＥＰＥＰ−６媒介トランスフェクションでは３つの細胞株についてＹＦＰ発現もルシフェラーゼ発現も観察されなかった。対照的に、ＡＤＧＮ−１００またはＶＥＰＥＰ−９のどちらかによって媒介されるトランスフェクション後には３つの細胞株について効率的な遺伝子発現が観察された。２０：１のペプチド対プラスミド比で複合体化したＤＮＡ ５ｎｇで、最高発現レベルが得られた。トランスフェクション効率は、細胞株に依存して６５〜８５％の間で様々であった。ＡＤＧＮ−１００は、Ｊｕｒｋａｔおよび２９３Ｔ／Ｋ５６２細胞における遺伝子送達についてリポフェクタミンよりそれぞれ２倍および５倍効率が高かった。
Ｔ細胞に対するＡＤＧＮ−１００媒介安定トランスフェクション。
安定したＹＦＰ発現クローンの産生についてのＡＤＧＮ−１００媒介トランスフェクションの効率を２９３Ｔ細胞とＫ５６２Ｔ細胞の両方について評価した。モル比２０：１でＡＤＧＮ−１００と複合体化したプラスミド５ｎｇを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションを完全培地（１０％ＦＣＳ）中で４８時間行い、ＹＦＰ発現クローンを２週間にわたって様々な時点（２、５、７および１４日）でフローサイトメトリーによって分析した。
図１１に示すように、ＡＤＧＮ−１００媒介トランスフェクションの効率は、Ｋ５６２細胞と２９３Ｔ細胞の両方について約８０％であり、ＹＦＰ発現は、トランスフェクション後１４日の時点で安定して維持され、５７％（２９３Ｔ）および６５％（Ｋ５６２）を超えるＹＦＰ陽性細胞があった。トランスフェクションの４８時間後、様々な濃度のＧ４１８を含有する培地で３週間増殖させることによって安定なＹＦＰ発現クローンを選択し、ＦＡＣＳおよび顕微鏡観察によって分析した。ＹＦＰを安定的に発現する２９３Ｔ細胞のいくつかの個々のクローンを選択し、９６ウェル組織培養プレートで高集密になるまで拡大増殖させた。選択されたすべてのクローンが高レベルのＹＦＰを発現した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
実施例６．２：Ｔ細胞における安定した遺伝子送達および抗ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生
細胞工学およびＣＡＲ−Ｔ細胞工学のためのＡＤＧＮ技術の効力を評価した。ＡＤＧＮ−１００ペプチドが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＴ細胞に抗ＣＤ１９ ＣＡＲベクター発現プラスミドを効率的に送達し、安定した抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を産生することが証明された。
材料および方法
常磁性ビーズに結合された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３：１（ビーズ：細胞）比で用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴ細胞を単離した。ＣＤ２８およびＣＤ３ｚシグナル伝達部分に結合しているＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを有するＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするプラスミドと複合体化したＡＤＧＮ−１００粒子を、ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｔ細胞にトランスフェクトした。Ｔ細胞を２つの比率（２０：１および３０：１）のペプチド／プラスミド複合体とともに４８時間インキュベートすることによって、トランスフェクトした。
４日目に、トランスフェクション細胞のレベルを分析し、細胞を新たなＴ細胞拡大増殖培地（５％熱不活化ヒトＡＢ血清、１％Ｇｌｕｔａ−Ｍａｘ、３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を補充した、ＡＩＭ Ｖ培地）に移した。１２日目に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８常磁性ビーズとＤｙｎａｌ ＣｌｉｎＥｘ ＶＩＶＯ ＭＰＣマグネット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を回収し、洗浄し、生存率および抗ＣＤ１９発現についてフローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞上での抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を、プロテインＬアッセイを使用してフローサイトメトリーによって評価した。ビオチン化プロテインＬをＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、滅菌水中、５０ｎｇ／μｌのストック濃度で復元し、４℃で保管した。７−ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ）を使用して生存率を判定した。
結果
ＡＤＧＮ−１００は、ＰＢＭＣから単離したＴ細胞への抗ＣＤ１９ ＣＡＲベクターのトランスフェクションを、２０：１および３０：１のペプチド対プラスミドモル比で、それぞれ５７％および６３％の効率で媒介した（図１３）。結果を非トランスフェクション細胞に対し正規化し、遊離プラスミドとともにインキュベートしたＴ細胞と比較した。安定した発現は、２０：１および３０：１のペプチド／プラスミドモル比で、それぞれ、細胞の４１％および４８％において１２日わたって維持された。平均生存率は、すべての条件でおおよそ８０％またはそれより高かった。これは、ＡＤＧＮ−１００トランスフェクションに関連する細胞毒性がなかったことを示す（図１４）。結果を非トランスフェクション細胞に対し正規化し、遊離プラスミドとともにインキュベートしたＴ細胞と比較した。これらの結果は、トランスフェクションに非ウイルスベクターを用いるＡＤＧＮ−１００技術を、腫瘍を標的とするＴ細胞を用いる抗がん治療などの免疫ベースの治療のための標的特異的Ｔ細胞の産生に有効に使用することができることを実証する。
（実施例７）
ＡＤＧＮ−１００と他の二次両親媒性細胞透過性ペプチド（ＣＡＤＹ／ＶＥＰＥＰ−６／ＶＥＰＥＰ−９）との比較
１９残基のうち４残基のみが、ＡＤＧＮ−１００ペプチドとＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ−６またはＶＥＰＥＰ−９ペプチド間で共有される。
二次構造の比較
分子モデリングｐｅｐｌｏｏｋ−Ｚｕｌｔｉｍプログラム（Ｔｈｏｍａｓ ＡおよびＢｒａｓｓｅｕｒ Ｒ．、２００６年、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ： ｈｏｗ ｆａｒ ａｒｅ ｗｅ？、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ６５巻、８８９〜９７頁）を使用して、二次構造を決定した。４つすべてのペプチドは、膜を模倣する環境の中で、１つの側面にＴｒｐ基、他の側面に荷電残基、およびさらに別の側面に疎水性残基を露出している、二次両親媒性ヘリックス構造をとる（図１５）。ＣＡＤＹおよびＶＥＰＥＰ−６は同じ二次構造をとり、ペプチドのコア、ＣおよびＮ末端にヘリックスモチーフがある（表１４）。対照的に、ＡＤＧＮ−１００およびＶＥＰＥＰ−９ペプチドは単一コアヘリックスモチーフを含有し、このモチーフは、ＶＥＰＥＰ−９におけるほうが長く、Ｋｏｎａｔｅら２０１０年（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｃｒｏｗｌｅｔら２０１４年（ＢＢＡ）と一致している。
ナノ粒子サイズ比較
ＶＥＰＥＰ−６、ＣＡＤＹおよびＶＥＰＥＰ−９は、モル比２０：１（ペプチド：ｓｉＲＮＡ）で、ｓｉＲＮＡとナノ粒子を形成し、該ナノ粒子は、１００〜２００ｎｍ間の範囲のサイズ、および１５０ｎｍを中心とする平均直径、および正荷電表面（ＣＡＤＹ、ＶＥＰＥＰ−６およびＶＥＰＥＰ−９ベースの粒子について、それぞれ、４０ｍＶ、２５ｍＶおよび１７ｍＶのゼータ電位）を有する。
ＡＤＧＮ−１００ペプチドは、平均直径が１３０ｎｍ未満であり、多分散指数が０．３１未満である、より小さい粒子を形成する。さらに、ＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡ粒子の電荷は中性に近く、ゼータ電位は６．０±０．８ｍＶである。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ利用にとって大きな利点である。
毒性
毒性は、５０μＭまでのＡＤＧＮ−１００／ｓｉＲＮＡおよびＣＡＤＹ／ｓｉＲＮＡ複合体については観察されず、５０μＭの遊離ＡＤＧＮ−１００およびＣＡＤＹで３０％毒性を得た（図１６）。ＶＥＰＥＰ−６は、５０μＭで、他のペプチドより高い毒性を、複合体化した形態（１０％毒性）でも、遊離形態（４０％細胞死）でも示す。ＶＥＰＥＰ−９／ｓｉＲＮＡ複合体について毒性は観察されなかった。ＡＤＧＮ−１００とは対照的に、ＶＥＰＥＰ−９は、５０μＭで、その遊離形態で、より高い毒性（４０％細胞死）を示し、これは、ＶＥＰＥＰ−９のより長いヘリックス構造に起因しうる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子送達
ＶＥＰＥＰ−６、ＶＥＰＥＰ−９、ＣＡＤＹおよびＡＤＧＮペプチドは、プラスミドＤＮＡと複合体を形成する。６．２ＫｂプラスミドＤＮＡの安定化に関するペプチドの効率を、４℃、２０℃または４０℃での１または４日のインキュベーション後に、ヘパリン処理後のプラスミドスーパーコイル構造の完全性とＤＮＡ／ペプチド粒子の安定性の両方を追跡することによって評価した。遊離プラスミド、および脂質製剤（リポフェクタミン２０００ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との複合体を、比較のために含めた。ヘパリン処理のために、５μｇヘパリンを試料とともに１時間、３２℃でインキュベートし、その後、アガロースゲル電気泳動を行って遊離プラスミドを分離した。表１５および１６に示すように、ＶＥＰＥＰ−９およびＡＤＧＮ−１００ペプチドは、試験したすべての条件でプラスミドＤＮＡを十分に安定化した。ＡＤＧＮ−１００は、プラスミドＤＮＡを分解およびヘパリン処理から十分に保護した。比較すると、ＶＥＰＥＰ−６および脂質製剤は、４、２０または４０℃での４日のインキュベーション後、安定性が低かった。
ペプチド媒介プラスミド送達の効率を、Ｈｅｌａ細胞において、２０℃で１または４日間インキュベートしたペプチド／プラスミドナノ粒子を使用して送達の４８時間後にルシフェラーゼ発現を測定することによって評価した。２０℃でのペプチド／プラスミドナノ粒子の１および４日の保管後にＨｅｌａ細胞で測定した、４８時間の時点での遺伝子発現効率。試験した各条件で、ＡＤＧＮペプチドは、ＶＥＰＥＰ−６およびＣＡＤＹよりそれぞれ少なくとも１０倍および２倍効力が高かった（表１７）。ＡＤＧＮおよびＶＥＰＥＰ−９ペプチドは、同様のプラスミド送達効率レベルを示し、このレベルは、４日のインキュベーション後に脂質製剤で観察されたものより約１００倍高かった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞内送達
ヒトｍｉＲ−３４ａマイクロＲＮＡは、最近、がんに関係づけられ、特にその発現がＴＰ５３状態に関連していた。ＭＣＦ７乳がん細胞を用いる抗増殖アッセイにおいてＡＤＧＮ−１００またはＶＥＰＥＰ−６ペプチド／ｍｉＲＮＡ−３４粒子を使用した。一本鎖ｍｉＲＮＡ−３４（ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＧＧＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧ、配列番号４１）をペプチドなしで、またはＡＤＧＮ−１００もしくはＶＥＰＥＰ−６のどちらかを２０：１のペプチド：ｍｉＲＮＡ比で有するペプチド／ｍｉＲＮＡ粒子で、培養細胞に添加した。遊離ｍｉＲＮＡ−３４（灰色棒）、ＶＥＰＥＰ−６／ｍｉＲＮＡ−３４粒子（白棒）、およびＡＤＧＮ−１００／ｍｉＲＮＡ−３４粒子（黒棒）の用量反応を評価した（図１７）。ＡＤＧＮ−１００は、８１ｎＭのＩＣ５０を有する、ｍｉＲＮＡ−３４の抗増殖特性を大いに向上させた。
ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内送達
ＡＤＧＮ、ＶＥＰＥＰ−６またはＶＥＰＥＰ−９のいずれかと複合体化したｓｉＲＮＡの粒子を全身静脈内投与に使用した。ＡＤＧＮペプチド粒子、ＶＥＰＥＰ−６粒子またはＶＥＰＥＰ−９粒子中のＣｙｃ Ｂ１ ｓｉＲＮＡ ５〜１０μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ）を、異種移植ＨＴ−２９腫瘍を有するマウスに３日ごとに静脈内注射した。０．２５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡを使用すると５０日目の後に腫瘍サイズの有意な縮小が観察され、ＡＤＧＮおよびＶＥＰＥＰ−６粒子についてそれぞれ６１％および３３％の阻害があった（図１８）。０．５ｍｇ／ｋｇのＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡおよびＶＥＰＥＰ−６／ｓｉＲＮＡ粒子を使用したとき、５０日目に、腫瘍進行がそれぞれ８７％および６５％低減された。対照的に、ＶＥＰＥＰ−９／ｓｉＲＮＡ粒子は、０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖をそれぞれ１２％および３８％しか低減させなかった。ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ粒子は、ＶＥＰＥＰ−６およびＶＥＰＥＰ−９粒子より、それぞれ、２倍および９倍効率が高かった。

Claims (24)

  1. アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号１）（配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、存在せず、Ｘ２〜Ｘ ４ は、任意のアミノ酸であり、Ｘ ５ はＶまたはＳであり、Ｘ ６ はＲ、ＶまたはＡであり、Ｘ ７ はＳまたはＬであり、Ｘ ８ はＷまたはＹである）を含む、天然に存在しないペプチド。
  2. Ｘ１が、βＡであるか、Ｓであるか、存在せず、Ｘ２が、ＡまたはＶであり、Ｘ３が、ＧまたはＬであり、Ｘ４が、ＷまたはＹである、請求項１に記載のペプチド。
  3. のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のペプチド。
  4. 長さが１９または２０アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 前記ペプチドは、そのＮ末端に共有結合しているアセチル基を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
  6. 前記ペプチドは、そのＣ末端に共有結合しているシステアミド基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
  7. 炭化水素結合によって結合されている、３つまたは６つの残基によって隔てられている２つの残基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
  8. のアミノ酸配列を含み、配列中、下付文字「Ｓ」の付いている残基が、前記炭化水素結合によって結合されている２つの残基である、請求項７に記載のペプチド。
  9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドとカーゴ分子とを含む複合体。
  10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドとカーゴ分子とを含むナノ粒子。
  11. 前記カーゴ分子が、
    ａ）核酸；
    ｂ）ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、もしくはこれらの類似体；
    ｃ）オリゴヌクレオチド；
    ｄ）一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、もしくはこれらの誘導体
    である、請求項９に記載の複合体または請求項１０に記載のナノ粒子。
  12. ａ）前記ナノ粒子中の前記カーゴ分子の前記ペプチドに対するモル比が、約１：１〜約１：８０である；
    ｂ）前記カーゴ分子が、集合分子と複合体化されて前記ナノ粒子のコアを形成する；
    ｃ）前記ナノ粒子が、表面層をさらに含む；
    ｄ）前記ナノ粒子が、表面に標的化部分を含む；
    ｅ）前記ナノ粒子の平均直径が、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである；および／または
    ｆ）ゼータ電位の絶対値が約３０ｍＶ未満である、
    請求項１０または請求項１１に記載のナノ粒子。
  13. 表面層と中間層とをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  14. 前記中間層が、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドを含む、請求項１３に記載のナノ粒子。
  15. 請求項９もしくは１１に記載の複合体または請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  16. ａ）前記医薬組成物が、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、頭蓋内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、空洞内または経口投与用に製剤化される；
    ｂ）前記薬学的に許容される担体が、糖またはタンパク質であり、任意選択で前記糖が、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せからなる群から選択され、約５％〜約２０％の濃度で前記医薬組成物中に存在する；および／もしくは前記タンパク質がアルブミンである；ならびに／または
    ｃ）前記医薬組成物が、凍結乾燥される
    請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を調製する方法であって、
    ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物を、前記カーゴ分子を含む組成物と併せて混合物を形成するステップ、および
    ｂ）前記混合物をインキュベートして前記ナノ粒子を形成するステップ
    を含む方法。
  18. 医薬品として使用するための、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  19. がん、糖尿病、炎症性疾患、線維症、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、ならびに老齢および変性疾患からなる群から選択される疾患の処置において使用するための、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  20. 分子を細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項９もしくは１１に記載の複合体または請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップを含み、前記複合体またはナノ粒子が前記分子を含み、前記細胞の前記複合体またはナノ粒子との前記接触が、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、方法。
  21. 前記細胞が、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項２０に記載の方法。
  22. ａ）前記分子が、標的抗原と特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードするプラスミドであり、任意選択で前記標的抗原が、がん関連抗原である、および／もしくはｉ）前記複合体もしくはナノ粒子がｓｉＲＮＡをさらに含む、もしくはｉｉ）前記方法が、前記細胞を請求項９もしくは１１に記載の複合体、または請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップをさらに含み、前記複合体またはナノ粒子がｓｉＲＮＡを含む；または
    ｂ）前記分子がｓｉＲＮＡである、
    請求項２１に記載の方法。
  23. 核酸を安定化する方法であって、
    ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物を、前記核酸を含む組成物と併せて混合物を形成するステップ、および
    ｂ）前記混合物をインキュベートして、前記核酸を含む複合体を形成するステップ
    を含む方法。
  24. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドを含む組成物と、請求項９もしくは１１に記載の複合体および／または請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を調製するための説明書とを含むキット。
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