CN112533938A - 自组装成纳米颗粒的多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自组装成纳米颗粒的多肽。具体地，本发明涉及一种包括氨基酸序列I(SEQ ID NO:1)的多肽、编码所述多肽的核酸序列、包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒、包括所述纳米颗粒和一个或多个货物分子的复合物以及用于用所述复合物转染细胞的方法。
Description
本发明涉及自组装成纳米颗粒的多肽的领域。具体地，本发明涉及一种包括氨基酸序列I(SEQ ID NO:1)的多肽、编码所述多肽的核酸序列、包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒、包括所述纳米颗粒和一个或多个阴性货物分子的复合物以及用于用所述复合物转染细胞的方法。
背景技术
尽管寡核苷酸(ON)是一类具有许多潜在临床应用的分子药物，但是其次优的药代动力学特性已经严重阻碍了药物开发(Whitehead,K.A.等人《自然综述：药物发现(Nat.Rev.Drug Discov.)》2009,8,129-138)。具体地，因为ON是相当大的、高电的实体并且不会通过扩散进入细胞中，所以ON的细胞内递送仍是重大障碍(Lundin,K.E.等人寡核苷酸疗法：过去与现在(Oligonucleotide Therapies:The Past and the Present).《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》2015,26,475-485)。关于体内应用的另外的问题包含对存在于生物血清中的核酸酶的易感性，所述易感性导致快速降解以及尿排泄和不期望的脱靶效应以及细胞内和细胞外免疫应答的活化。
为了克服这些缺点，提出了使用寡核苷酸递送系统，如源自噬菌体P22的病毒样颗粒(VLP)(Qazi,S等人,《分子药剂学(Mol.Pharm.)》2016,13,1191-1196)或Q病毒样颗粒(VLP)功能纳米颗粒(Fang,P.Y.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2017,45,3519)。然而，携带期望的治疗货物的病毒样颗粒的生产是复杂的、昂贵的并且仍与安全问题相关。
尽管已经提出了各种各样的材料作为寡核苷酸递送载体，但是仍在寻求简单、有效、安全和无毒的递送方案(Whitehead,K.A.等人,消除障碍：siRNA递送的进展(Knockingdown barriers:advances in siRNA delivery).《自然综述：药物发现》2009,8,129-138)。最近，已经描述了能够自组装成高度有序和对称笼状纳米结构的计算机设计的蛋白质的开发(King,N.P.等人,《科学(Science)》,2012,336,1171-1174；US9,630,994B2)。此外，最近已经描述了此类自组装蛋白纳米笼的设计，所述自组装蛋白纳米笼是指引导其自身从人细胞释放到小囊泡内的包膜蛋白纳米笼(EPN)。在与N端p6Gag肽和C端PH结构域融合时支持EPN形成的设计的对称自组装支架之一被命名为O3-33(King等人,2012,前面引用的文献；J.Votteler等人,《自然(Nature)》,2016,540,292-295)。
发明内容
本发明提供了设计的和非天然存在的新型多肽，其不仅能够自组装成纳米颗粒，而且所述纳米颗粒还能够包封带负电的大分子(如具有高结合亲和力的寡核苷酸)并且体外以及体内递送所述大分子。已经进一步发现，本发明的优选纳米颗粒被哺乳动物细胞有效地吸收并且能够释放它们的货物以诱导例如RNA干扰和敲低基因表达。因此，设计的和非天然存在的新型多肽被工程化以产生允许货物递送(具体地，核酸递送)、同时最小化或避免了现有技术的递送载体的不令人期望的特性的纳米颗粒。
重要的是，本发明的纳米颗粒易于以高产率产生和纯化并且允许将任何大分子(具体地，任何寡核苷酸)体外包装到所述纳米颗粒中。此外，本发明的纳米颗粒因此提供了用于在细胞内递送所述多种货物(如治疗ON)的通用平台以例如调节基因表达以用于各种不同的应用，如基因干扰。因此，其有用性涵盖生物技术应用以及治疗应用。此外，本发明的纳米颗粒通常具有均匀尺寸，并且特别地是安全的且体内耐受性良好，并且进一步通常是可生物降解的。另外地，设计的和非天然存在的新型多肽通常且优选地可以通过重组表达容易地产生，所述重组表达是可扩展的、经济的并且允许基因修饰和翻译后(化学)修饰两者。对本发明的纳米颗粒的特性户进行的调整进一步允许纳米颗粒不仅进入细胞，而且有条件地释放细胞质内的货物以控制例如所描述的基因表达。
因此，发明人所开发的非天然存在的新型多肽自组装成能够包封和递送货物(优选地，带负电的大分子，如ON)的纳米颗粒。
因此，在第一方面，本发明提供了一种多肽，其包括由以下组成的氨基酸序列I：
MX13QAIGILELX1SIAAGMELGDAMLKSAX14VX15LLVSKTISX2GKFLLMLGGDIX8AIX9X12AIX10TGTX11QAGX3LLVDSLVLAX16IHPSVLPAIX17GX18NX19VX20X7X21QAVGIVETX4SVAACISAADX22AVX23GSX24VTLVRVHMAX5GIGGKCYMVVAGDVSDVALAVTVASSSAGAYGX6LVYASLIPX25PHX26AMWX27QMVX28GX29E(SEQ ID NO:1)，
其中X1到X29中的任何一个彼此独立地是氨基酸，条件是X1到X6中的至少3个彼此独立地是带正电的氨基酸，并且其中除SEQ ID NO:1中的X1到X29所表示的位置之外的位置处的任选地至多5个氨基酸由任何氨基酸交换。
在另外的方面，本发明提供了一种核酸序列，其编码本发明的多肽。
在另外的方面，本发明提供了一种纳米颗粒，其包括至少一种本发明的多肽。
在另外的方面，本发明提供了一种复合物，其包括本发明的纳米颗粒和一个或多个货物分子，其中所述一个或多个货物分子被包封在所述纳米颗粒中。
在另外的方面，本发明提供了一种用于转染细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的复合物接触的步骤。
在另外的方面，本发明提供了一种用于制造本发明的纳米颗粒的方法，所述方法包括使本发明的多肽自组装成所述纳米颗粒的步骤。
在另外的方面，本发明提供了一种用于制造本发明的复合物的方法，所述方法包括将本发明的纳米颗粒与一个或多个带负电的大分子混合的步骤。
在另外的方面，本发明涉及一种本发明的复合物用于转染细胞的用途。
附图说明
图1：(a)从4重和2重对称轴观察的OP笼的表面模型，其中一个三聚体以带形式示出。根据X射线衍射数据生成的模型。(b)一个三聚体的侧视图，其中精氨酸插入位置示出为黑色球体。(c)三聚体的内腔表面，其中精氨酸位置示出为黑色球体。(d)OP的负染色(negative transmission)透射电子显微照片(TEM)。
图2：(a)通过Atto488荧光可视化的在有OP的情况下带Atto488标记的ssDNA的电泳迁移率转变测定。(b)经过SEC纯化的OP:核酸复合物的吸光度光谱。(c)从添加OP后对Atto488-ssDNA货物进行荧光淬灭所得的kobs值对[OP]的绘图以确定kon。(d)通过添加未标记的竞争因子DNA诱导的从OP笼释放的Atto488-ssDNA的荧光恢复的绘图。
图3：(a)通过流式细胞术测定的在有或没有OP的情况下Atto488-DNA的细胞摄取(n＝3)。(b)用Atto488-DNA或OP:Atto488-DNA(OP与Atto488-ssDNA货物)处理的HeLa细胞的共聚焦荧光显微镜检查。Hoechst是指核染色。(c)对跨不同细胞系的细胞摄取进行的流式细胞术分析。七种不同细胞类型在用200nM的Atto488-DNA或OP:Atto488-DNA处理18小时后的中值荧光强度。从10,000个细胞获得中值荧光强度。MCF-7——乳腺癌，HepG2——肝癌，A431——皮肤癌，HT-29——结肠癌，CHO-K1——仓鼠卵巢(非癌性)，Vero——非洲绿猴肾(非癌性)。
图4：(a)通过流式细胞术测定的GFP敲低(n＝4)。OP:扰乱是指不会靶向GFP mRNA或任何其它内源序列的扰乱siRNA，并且无His6是指包装在没有His6标签的OP笼中的siRNA。(b)随时间推移对tRNA诱导的dsDNA货物从OP释放进行的天然AGE分析。通过Atto488荧光可视化。(c)对跨不同细胞系的细胞摄取进行的流式细胞术分析。七种不同细胞类型在用200nM的Atto488-DNA或OP:Atto488-DNA处理18小时后的中值荧光强度。从10,000个细胞获得中值荧光强度。
图5：静电势表面。对来自O3-33和OP的晶体结构的三聚体亚基进行的库伦表面比较，示出了内表面和外表面两者。
图6：SDS-PAGE。示出了来自粗制细胞裂解物的蛋白质和从Ni-NTA分离的产物两者。OP的较低迁移率是由于另外的带正电的氨基酸而不是分子量的差异。在尺寸排阻色谱法之后去除OP上方的微弱条带。用考马斯蓝使凝胶可视化。OP蛋白质在Ni-NTA后的典型产率为100mg/L的大肠杆菌培养物。
图7：O3-33和OP的SEC。对O3-33和本发明的带正电的笼状纳米颗粒OP进行的尺寸排阻色谱法。示出了来自Ni-NTA色谱法的粗制混合物和经过纯化的组装件的分析迹线两者。虚线对应于在260nm(核酸)处的吸光度，并且实线对应于在280nm(蛋白质)处的吸光度。基于TEM分析，OP(Ni-NTA)在12-14mL处的峰含有完全组装的笼的二聚体、定时器和更高阶聚集体，而不是替代性季组装件。OP(Ni-NTA)在22mL处的峰含有在大肠杆菌中的蛋白质表达期间装载的并且容易通过SEC去除的核酸片段。16mL处的主峰示出了蛋白质的收集到的并且经过进一步表征的经洗脱级分。OP的SEC具有代表性，并且OTR101到OTR503示出了大约16mL的相当的洗脱体积。
图8：O3-33和OP的DLS和AGE(a)原始(O3-33)和带正电的(OP)笼变体的动态光散射(DLS)。(b)天然琼脂糖凝胶电泳(AGE)(3％)；通道1：O3-33，通道2：OP，用考马斯蓝进行染色。给定SEC、DLS、TEM和X射线衍射数据，OP的迁移率与O3-33相比有所降低是由于正电增加而不是尺寸的改变。(c)OP变体的3％AGE，用考马斯蓝针对蛋白质进行染色。迁移率的差异是由于总电荷而不是尺寸的改变。拖尾是由所装载的大量蛋白质引起的，而不是由于笼的降解而引起的。通道1：O3-33。通道2：OTR101。通道3：OTR201。通道4：OTR202。通道5：OTR203。通道6：OTR301。通道7：OTR302。通道8：OTR401。通道9：OTR402。通道10：OTR501。通道11：OTR502。通道12：OTR503。通道13：OP。所有蛋白质具有相当的电泳迁移率；由于SEC和TEM两者均示出颗粒具有相同尺寸，因此带正电的精氨酸残基的数量的增加会引起轻微的偏差。总之，这些表征方法支持所有变体的结构与OP相同的假设。
图9：透射电子显微镜检查(TEM)图像。OP和O3-33的比例尺为100nm，并且OTR501的比例尺为200nm。获得OP和OTR101到OTR503的负染色透射电子显微镜检查图像。本文所示出的SEC表示OP和所有变体OTR101到OTR503。这些图像表明变体的衣壳和形态与OP一致的均匀分布。
图10：在有ssDNA的情况下O3-33和OP的EMSA。在OP或O3-33的当量增加的情况下带Atto488标记的ssDNA的电泳迁移率转变测定。通道1-7：Atto488-ssDNA+OP，通道8：Atto488-ssDNA；通道9-15：Atto488-ssDNA+O3-33。通过Atto488荧光使凝胶可视化。
图11：在有dsDNA和dsRNA的情况下OP的EMSA。在OP笼的摩尔当量增加的情况下(a)dsDNA和(b)dsRNA的电泳迁移率转变，两者长度均为21bp。游离核酸在0.5当量的OP处的微弱条带是由于电泳期间的非平衡条件而引起的，并且表示总核酸的一小部分。由于每个衣壳中有144个精氨酸残基，因此电荷中性将会在仅包封144个核苷酸后实现，这相当于每个衣壳3.6个双链体(21bp)。此处观察到的两个双链体的最大装载能力可以根据RNA-RNA电荷排斥、球形容器所施加的物理限制和对可用的精氨酸残基有助于有利的结合相互作用的需求来合理化。用GelRed针对核酸进行染色。
图12：核酸包封的SEC。空OP笼在与每笼5当量的ssDNA、dsDNA或dsRNA(长度均为21nt)一起温育后相较于OP的尺寸排阻色谱法。虚线对应于在260nm(核酸)处的吸光度，并且实线对应于在280nm(蛋白质)处的吸光度。没有观察到核酸介导的聚集。所有复合物表现出与空OP笼相同的保留体积，但是A260/A280比率增加，这指示寡核苷酸的内在化。
图13：动力学测量。用于测定ssDNA在OP笼中的1:1包封动力学的代表性数据集。如从在EMSA(图10)中所看到的条带强度明显的，通过OP包封Atto488-ssDNA会导致荧光团的淬灭，这用于此处所示出的时间分辨结合测定。Atto488荧光团在488nm处被激发并且发射在515nm处被测量。在每个实验(a-e)中，Atto488-ssDNA的浓度为10nM，并且在t＝0时添加的OP的浓度如绘图上所示出的。(f)在没有任何归一化的情况下比较这五个浓度点的单指数拟合(以a-e示出)。
图14：核酸酶测定。天然琼脂糖凝胶示出了(a)用所指示的核酸酶(Bzase＝Benzonase)处理的游离核酸(R＝dsRNA，ssD＝ssDNA并且dsD＝dsDNA)和(b)预先包装在OP笼中的、也用所指示的核酸酶处理的相同的核酸。通道M含有300nt ssRNA供参考。将样品与核酸酶在37℃下在PBS中一起温育18小时。对于DNA样品和带有DNA酶I的单链DNA，在Benzonase的情况下存在一些非完全消化(a，顶部凝胶通道8、11和12)。然而，包封的样品与完全消化的样品的比较清楚地揭示OP可以保护其货物免受较大核酸酶Benzonase和DNA酶I的损伤，而较小的RNA酶A能够进入笼并消化RNA货物。
图15：OP和Lipofectamine 2000以不同浓度在HeLa细胞中温育(a)24小时和(b)48小时后的细胞毒性。对照：PBS或1％Triton X-100表面活性剂(n＝3)。
图16：通过荧光显微镜检查对GFP敲低进行的定性评估。HeLa细胞中的GFP表达的敲低根据来自活细胞荧光显微镜检查的相对GFP含量来示出。在此看到的趋势与定量流式细胞术分析匹配良好(图4a)。样品名称示出在每个面板对上方，其中左边是明场并且右边是GFP荧光(LED激发在470nm处，发射滤光片535/50nm)。每个样品的siRNA浓度为100nM，并且图像在添加siRNA样品后46小时获得。比例尺为100μm。
图17：较高的DNA与OP比率下的动力学。在Atto488-DNA与OP的比率较高时，观察到与每个OP笼中两个ssDNA分子的装载一致的两种效应。首先，观察到淬灭增加，这从(a)-(c)中的端点明显。这最有可能是由于在OP的小腔中的有效浓度较高的荧光团的自淬灭。第二个效应是从单指数衰减到双指数衰减的转变，这揭示了两个不同的结合事件。针对(b)和(c)，单指数拟合示出为实线并且双指数拟合示出为虚线。
图18：无His6标签的OP的表征。(a)OP(通道1)和OP-无His6(通道2)的SDS-PAGE比较。(b)OP-无His6的SEC示出与OP类似的保留体积(16mL)。(c)OP-无His6的负染色TEM看起来与OP一致。(d)通道1：OP和通道2：OP-无His的天然AGE。用考马斯蓝针对蛋白质使凝胶可视化。(e)示出OP(通道2)与OP-无His6(通道3)的摩尔比为1:1时的siRNA包封的天然AGE。通道1是游离siRNA对照。用GelRed针对核酸进行可视化。(f)OP-无His6的SEC在与5当量的siRNA一起温育后表现出与空笼(16mL)相同的保留体积，但是A260/A280比率增加，这指示寡核苷酸的内在化。19-21mL处的峰对应于过量RNA。
图19：tRNA的包封。天然琼脂糖凝胶分析示出在存在1.2当量的OP笼的情况下tRNA的完全结合。通道1——tRNA，通道2——tRNA+OP。用GelRed进行染色。
图20：在有寡核苷酸的情况下O3-33的EMSA。相同的天然琼脂糖凝胶(a)用GelRed针对核酸进行染色并且(b)用考马斯蓝针对蛋白质进行染色。箭头：复合物(纳米颗粒加ssDNA)。在与两个当量的O3-33一起温育后对未标记的ssDNA、dsDNA和dsRNA进行分析。蛋白质笼和任何寡核苷酸之间没有相互作用。
图21：不同DNA序列的装载。相同的天然琼脂糖凝胶(3％天然AGE)(a)用GelRed针对DNA进行染色并且(b)用考马斯蓝针对蛋白质进行染色。下部箭头：ssDNA，上部箭头：复合物(纳米颗粒加ssDNA、dsDNA、dsRNA)。每个样品含有的ssDNA与衣壳的比率为2:1，其中寡核苷酸的范围为18-26nt，具有随机序列(下表2中所提供的)。通道1——18nt ssDNA1，通道2——26nt ssDNA，通道3——OP，通道4-12——OP+2当量的不同的ssDNA。
图22：血清稳定性。相同的天然琼脂糖凝胶(a)用GelRed针对RNA进行染色并且(b)用考马斯蓝针对蛋白质进行染色。下部箭头：dsRNA，上部箭头：复合物(纳米颗粒加dsRNA)，中间箭头：BSA。装载dsRNA的OP笼与血清蛋白之间没有明显的相互作用并且没有RNA货物的置换或降解。通道1——dsRNA，通道2——OP:dsRNA，通道3-7——与10％FBS在37℃下一起温育0.5、1、2、4和7小时后的OP:dsRNA，通道8——仅10％FBS。
图23：小角度X射线散射。(a)OP、OP:dsDNA和OP:dsRNA的一维散射曲线。实验数据示出为点，并且用于产生距离分布的拟合示出为灰线。(b)使用AUTOGNOM.2-3根据上述数据计算出的OP、OP:dsDNA和OP:dsRNA的对距离分布函数。虚线对应于从DLS实验获得的粒径(图8a)，某些距离处的拖尾大于14nm是由于单独的蛋白质笼之间的瞬时分子间相互作用。与寡核苷酸复合后，蛋白质笼的外径没有改变并且密度从空心球体状颗粒朝满充球体转变。两种现象均与OP的腔内的寡核苷酸的内在化一致。
图24：O3-33和OP的圆二色性光谱。实线是平均值，并且误差条示出了每种蛋白质的一式三份测量的标准偏差。
图25：对本发明的纳米颗粒和复合物的制备和利用的概述。
图26：通过电泳转变测定(EMSA)研究将ssDNA装载到纳米颗粒(NP)中。(a)通过UV透照器用Atto488吸光度使2％天然凝胶可视化。通道1：O3-33。通道2：OTR101。通道3：OTR201。通道4：OTR202。通道5：OTR203。通道6：OTR301。通道7：OTR302。通道8：OTR401。通道9：OTR402。通道10：OTR501。通道11：OTR502。通道12：OTR503。通道13：OP。通道14：Atto488-ssDNA。宽带是由DNA批次的杂质引起的。(b)用考马斯蓝使蛋白质可视化。
图27：ssDNA包封后的荧光淬灭。(a)在10nM Atto-488ssDNA中，所有变体在蛋白质浓度为50nM时的荧光衰减。这表明这种衰减的速度取决于精氨酸的数量和位置。(b)(a)中的慢变体的特写视图。此处，可以清楚地看到O3-33、OTR101、OTR201、OTR202和OTR203不结合ssDNA。
图28：对将dsDNA装载到纳米颗粒(NP)中进行的体外研究。(a)通过Atto-488吸光度针对hpDNA使天然AGE可视化。(b)在用考马斯蓝进行染色后将相同的凝胶用于蛋白质可视化。通道1：hpDNA。通道2：OTR301。通道3：OTR302。通道4：OTR401。通道5：OTR402。通道6：OTR501。通道7：OTR502。通道8：OTR503。通道9：OP。
图29：通过流式细胞术测定的GFP敲低(n＝3)。
图30：通过ELISA测定的小鼠的OP笼的免疫原性。如箭头所指示的，在来自用OP免疫的BALB/c小鼠的血清中测定OP特异性IgG1(a)、IgG2a(b)和IgG2b(c)抗体滴度。每个点是来自4只小鼠的平均IgG滴度。
图31：通过ELISA测定的小鼠的OP笼的免疫原性时程。如箭头所指示的，在来自用OP免疫的BALB/c小鼠的血清中测定OP特异性IgG1(a)、IgG2a(b)和IgG2b(c)抗体滴度。每个点是来自4只小鼠的平均IgG滴度。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
在本说明书全文以及随附权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或词语“包含(include)”和变化形式(如“包括/包含(comprises/includes)”或“包括/包含(comprising/including)”)应理解成暗示纳入要素、所述整数、步骤或要素、所述整数、步骤的组，但不排除任何其它要素、所述整数、步骤或任何其它要素、所述整数、步骤的组。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另外明确指明。
术语“约”或“大约”在与数值结合使用时意指涵盖在下限比所指示的数值小0-10％并且上限比所指示的数值大0-10％的范围内的数值。术语“约”或“大约”意指优选地±10％、更优选地±5％、再次更优选地±3％或最优选地±0％(分别参考给定数值)。在本发明的实施例中的每个实施例中，“约”可以被删除。本文所公开的值的所有范围应指并包含落入所述范围内的任何和所有值，包含限定所述范围的值。
在第一方面，本发明涉及一种多肽，其包括由以下组成的氨基酸序列I：
MX13QAIGILELX1SIAAGMELGDAMLKSAX14VX15LLVSKTISX2GKFLLMLGGDIX8AIX9X12AIX10TGTX11QAGX3LLVDSLVLAX16IHPSVLPAIX17GX18NX19VX20X7X21QAVGIVETX4SVAACISAADX22AVX23GSX24VTLVRVHMAX5GIGGKCYMVVAGDVSDVALAVTVASSSAGAYGX6LVYASLIPX25PHX26AMWX27QMVX28GX29E(SEQ ID NO:1)，
其中X1到X29中的任何一个彼此独立地是氨基酸，条件是X1到X6中的至少3个彼此独立地是带正电的氨基酸，并且其中除SEQ ID NO:1中的X1到X29所表示的位置之外的位置处的任选地至多5个氨基酸有由任何氨基酸交换。
在优选实施例中，所述多肽包括由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列I，其中X1到X29中的任何一个彼此独立地是氨基酸，条件是X1到X6中的至少3个彼此独立地是带正电的氨基酸。
如本文所使用的，术语“多肽”是指氨基酸的任何肽键连接的聚合物，而与尺寸、长度、二级和三级结构、亚基的数量或翻译后修饰无关。因此，术语“多肽”应理解为涵盖术语“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”、“氨基酸序列”。根据本发明的多肽可以是开放的线性肽链或环肽；可替代地或另外地，本发明的肽可以包含至少一个化学修饰，如脂化、糖基化和磷酸化。如本文所理解的，肽(尤其是本发明的肽)是分离的或优选地可以通过化学合成、RNA翻译和/或重组过程来产生。
如本文所使用的，术语“氨基酸”是指含有官能团胺(-NH2)和羧酸(-COOH)和其两性离子的有机化合物，通常且优选地，其还含有对每个氨基酸具有特异性的侧链。术语“氨基酸”通常且优选地包含天然存在的氨基酸，如蛋白原氨基酸(通过RNA翻译产生)、非蛋白原氨基酸(通过其它代谢机制(例如，翻译后修饰)产生)、标准或典型氨基酸(其由遗传密码的密码子直接编码)和非标准或非典型氨基酸(不是由遗传密码直接编码)。天然存在的氨基酸包含非真核和真核氨基酸。如本文所使用的，术语“氨基酸”还包含化学合成的非天然氨基酸。此外，所述术语涵盖任何比例的α-(α-)、β-(β-)、γ-(γ-)和δ-(δ-)等氨基酸及其混合物，以及(如果适用的话)任何比例(优选地，外消旋比例为1:1)的氨基酸的任何异构形式，即，其D-和L-立体异构体(可替代地，通过(R)和(S)命名法来解决)及其混合物。本发明中的氨基酸通常且优选地呈L-构型。术语“D-立体异构体”、“L-立体异构体”、“D-氨基酸”或“L-氨基酸”是指氨基酸的手性α碳。氨基酸可以包含修饰和/或附接的化合物和残基，例如用于肽合成的残基，如Boc、Fmoc或两者。
术语“Xn到Xm”和“Xn-m”在本文可互换使用以用于表示SEQ ID NO:1中的某些氨基酸位置。
任选地，除SEQ ID NO:1中的X1-29所表示的位置之外的位置处的至多5个氨基酸可以由任何氨基酸交换。在本文可互换使用的术语“氨基酸交换”或“由任何氨基酸交换”包含或优选地是指通过一个氨基酸的缺失或单个氨基酸被一个或多个氨基酸(添加)、更优选地被一个、两个或三个氨基酸取代的交换。最优选地，术语“氨基酸交换”是指单个氨基酸的缺失或单个氨基酸被一个、两个或三个氨基酸取代。在优选实施例中，所述氨基酸交换是取代。在另一个优选实施例中，所述氨基酸交换是保守氨基酸取代。
术语“保守取代”是将给定氨基酸改变成具有类似生化特性的不同氨基酸的氨基酸取代。保守取代包含并且优选地是指等排取代和其中氨基酸维持带电、极性、芳香族、脂肪族或疏水性质的取代。保守取代是指维持本发明的多肽自组装成纳米颗粒(优选地，本发明的笼状纳米颗粒)的能力的取代。
如本文所使用的，术语“带正电的”包含并且优选地是指具有带正电的基团的分子。更优选地，所述带正电的分子在中性或生理pH下具有带正电的基团。
在本发明的优选实施例中，除SEQ ID NO:1中的X1-29所表示的位置之外的位置处的任选地至多4个氨基酸、更优选地至多3个氨基酸、再次更优选地至多2个氨基酸、最优选地1个氨基酸由任何氨基酸交换。
在优选实施例中，所述多肽的长度为约500个氨基酸或更少、优选地约400个氨基酸或更少、更优选地300个氨基酸或更少、再次更优选地250个氨基酸或更少、再次更优选地200个氨基酸或更少、再次更优选188到230个氨基酸、最优选地192个氨基酸。
在另一个优选实施例中，所述多肽是分离的多肽。
在另一个优选实施例中，所述多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由SEQ IDNO:1组成。在另一个优选实施例中，所述多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由SEQ IDNO:1组成，其中除SEQ ID NO:1中的X1-29所表示的位置之外的位置处的任选地至多5个氨基酸由任何氨基酸交换。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸或精氨酸的保守取代。在另一个优选实施例中，所述X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸、硫代赖氨酸和组氨酸。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个更优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地是组氨酸、精氨酸或赖氨酸。在另一个更优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。在另一个更优选实施例中，所述X1到X6中的所述至少3个带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸。在另一个更优选实施例中，所述X1到X6中的所述至少3个带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸。在一个实施例中，所述带正电的氨基酸X1到X6中的每个是精氨酸。在一个实施例中，所述带正电的氨基酸X1到X6中的每个是赖氨酸。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸独立地是精氨酸或赖氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸是精氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸是赖氨酸。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3到9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸独立地是精氨酸或赖氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3到9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸是精氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3到9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸是赖氨酸。
X7是半胱氨酸、其保守取代或带正电的氨基酸。
在优选实施例中，半胱氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：甲硫氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。在优选实施例中，半胱氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。更优选地，半胱氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：高半胱氨酸、硒代半胱氨酸和丝氨酸。再次更优选地，半胱氨酸的所述保守取代是高半胱氨酸或硒代半胱氨酸。
在另一个优选实施例中，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸、精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸，高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。在另一个优选实施例中，所述X7选自精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸。在另一个另外的优选实施例中，所述X7选自精氨酸、赖氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸。
如果X7是半胱氨酸或半胱氨酸的保守取代，则其可以用于通过二硫化物形成将带正电的基团(例如，半胱胺、1-(3-巯基丙基)胍等)附加到本发明的多肽。
在一个实施例中，所述X1到X6中的所述至少3个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，并且所述X7选自精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、高半胱氨酸或半胱氨酸。
在由SEQ ID NO:1组成的氨基酸序列I中，所述氨基酸X1到X6中的至少3个彼此独立地是带正电的氨基酸。在优选实施例中，所述氨基酸X1到X6中的至少4个、更优选地至少5个、再次更优选地6个(即，每个)彼此独立地是带正电的氨基酸。
在优选实施例中，所述氨基酸X1到X6中的至少4个、优选地至少5个、更优选地6个(即，每个)彼此独立地是带正电的氨基酸，其中所述带正电的氨基酸是精氨酸或赖氨酸。在优选实施例中，所述氨基酸X1到X6中的至少4个、优选地至少5个、更优选地每个彼此独立地是带正电的氨基酸，其中所述带正电的氨基酸是精氨酸。在优选实施例中，所述氨基酸X1到X6中的至少4个、优选地至少5个、更优选地6个彼此独立地是带正电的氨基酸，其中所述带正电的氨基酸是赖氨酸。
在优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1到X3。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2和X4。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2和X5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2和X6。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X3和X4。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X3和X5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X3和X6。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X3、X4和X5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X3、X4和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X3、X4和X1。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X4、X5和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X4、X5和X1。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X4、X5和X2。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X5、X6和X1。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X5、X6和X2。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X5、X6和X3。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X3和X5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X3和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X4和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X4和X6。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2、X3和X4。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2、X3和X5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2、X3和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X3、X4和X5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X3、X4和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X3到X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X4、X5和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X4、X5和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X3、X5和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X3、X4和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2、X3、X4和X6。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1-5。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1-4和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1-3、X5和X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1、X2和X4到X6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1和X3-6。在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X2到X6。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1到X6，彼此独立地是带正电的氨基酸。
更优选地，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1到X6，或X4到X6，或X1、X2和X5，或X1、X2、X4和X5，或X1、X3、X4和X6，或X1和X4到X6，或X1到X3和X6，或X1到X5。更优选地，X1到X6中的彼此独立地是带正电的氨基酸的所述至少3个是X1到X6，或X4到X6，或X1、X2和X5，或X1、X2、X4和X5，或X1、X3、X4和X6，或X1和X4到X6，或X1到X3和X6，或X1到X5。
在优选实施例中，X4到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1、X2和X4彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1、X2、X4和X5彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1、X3、X4和X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1和X3到X6彼此独立地彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1-3、X5和X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1-5彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。在另一个优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3到9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中X1到X6中的每个独立地是精氨酸或赖氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3到9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中X1到X6中的每个是精氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3到9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中X1到X6中的每个是赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，并且X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸。
发明人发现在位置X8到X12处的氨基酸限定通过本发明的多肽进行的自组装形成的纳米颗粒的孔径。在位置X8到X12处的较大氨基酸减小孔径，而在这些位置处的较小氨基酸增加纳米颗粒的孔径。
因此，在优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中。在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得货物可以在无需分解的情况下在体外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在体内从所述纳米颗粒释放。在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中。在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，并且货物可以在无需分解的情况下在体外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在体内从所述纳米颗粒释放。在另一个优选实施例中，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，并且货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、谷氨酰胺；天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到所述纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到所述纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的6个孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到所述纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的6个孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的6个孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的6个孔，其中货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的6个孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，其中包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中所述孔径被选择成使得货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，其中包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中所述孔径被选择成使得货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，其中包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中所述孔径被选择成使得货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，其中包括至少一种本发明的多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的孔，其中所述孔径被选择成使得货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、谷氨酰胺；天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸；并且包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到所述纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到所述纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到所述纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，其中货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到所述纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到所述纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在另外的优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到所述多肽的C端或N端，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到所述多肽的C端或N端，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到所述多肽的C端或N端，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到所述多肽的C端或N端，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，并且在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括尺寸为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。在另外的优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到所述多肽的C端或N端，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并从所述纳米颗粒释放。在另外的优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到所述多肽的C端或N端，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸；X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸；X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺和谷氨酸酯，在本发明的多肽中的位置X8到X12处的所述氨基酸被选择成使得包括本发明的所述多肽中的6个多肽的纳米颗粒包括孔径为3-4nm的6个孔，并且货物可以在无需分解的情况下在细胞外装载到包括所述多肽的纳米颗粒中并在细胞外从所述纳米颗粒释放，更优选地到细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。更优选地，所述3个或更多个连续的组氨酸是3-9个his标签。
在优选实施例中，所述X8是甘氨酸或其保守取代。优选地，甘氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸。更优选地，甘氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸。在另外的优选实施例中，所述X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在优选实施例中，所述X8是甘氨酸。
在另一个优选实施例中，所述X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或其保守取代。优选地，谷氨酰胺的所述保守取代选自由以下组成的组：天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺。在另一个优选实施例中，所述X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺。
在另一个优选实施例中，所述X9和X12两者均是谷氨酰胺。在另一个优选实施例中，所述X9和X12两者均是天冬酰胺。在另一个优选实施例中，所述X9或X12是谷氨酰胺。在另一个优选实施例中，所述X9是谷氨酰胺。在另一个优选实施例中，所述X12是谷氨酰胺。
在另一个优选实施例中，所述X10是谷氨酸酯或其保守取代。优选地，谷氨酸酯的所述保守取代选自由以下组成的组：谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸。在另外的优选实施例中，所述X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯。在另一个另外的优选实施例中，所述X10是谷氨酸酯。
在另一个优选实施例中，所述X11选自由以下组成的组：丝氨酸或其保守取代。优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：半胱氨酸、甲硫氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。更优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：半胱氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。再次更优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。再次更优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸。
在另外的优选实施例中，所述X11选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸。在另一个另外的优选实施例中，所述X11是丝氨酸。
在优选实施例中，所述X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸；X9和X12彼此独立地选自由以下组成的组：谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺；X10选自由以下组成的组：谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基-天冬氨酸；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸。
在另外的优选实施例中，所述X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。
在另外的优选实施例中，所述X8是甘氨酸，X9和X12是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸。
在优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸。
在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸；谷氨酸酯、天冬氨酸酯；谷氨酰胺、天冬酰胺；丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。
在另外的优选实施例中，X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸酯。
在另一个优选实施例中，X1-6中的至少三个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。在另一个优选实施例中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，并且X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3-9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，并且X8、X9、X10、X11和X12中的每个独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸；谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸、n-甲基-天冬酰胺；谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基-丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸、3-甲基-天冬氨酸；丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6中的至少三个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3-9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6中的至少三个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3-9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸。在另一个优选实施例中，X1-6中的至少三个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X8为甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸。在另一个优选实施例中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，并且X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸。在另一个优选实施例中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，并且X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸。
在一个实施例中，所述X1-6中的至少3个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，所述X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸，并且所述多肽包括多组氨酸，所述多组氨酸是包括两个或更多个连续连接的组氨酸的氨基酸序列，优选地，所述多组氨酸是组氨酸(His)标签，更优选地His6标签。组氨酸标签在本文中定义为由两个或更多个连续连接的组氨酸组成的氨基酸序列(His标签)。His6标签(His6)在本文中定义为由6个连续连接的组氨酸组成的氨基酸序列。
在另一个优选实施例中，X1到X6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，所述X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸，并且所述多肽包括多组氨酸，所述多组氨酸是包括两个或更多个连续连接的组氨酸的氨基酸序列，优选地，所述多组氨酸是组氨酸(His)标签，更优选地His6标签。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中在序列I中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，并且X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸。在优选实施例中，包括本发明的所述多肽的所述纳米颗粒或所述复合物能够进行内体逃逸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中包括本发明的所述多肽的所述纳米颗粒或所述复合物能够进行内体逃逸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到C端或N端，并且包括本发明的所述多肽的所述纳米颗粒或所述复合物能够进行内体逃逸。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端；在序列I中，X1-6是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺，X10是谷氨酸酯，并且X11是丝氨酸，并且包括本发明的所述多肽的本发明的所述纳米颗粒或所述复合物能够进行内体逃逸。
当本发明的多肽通过自组装形成纳米颗粒时，氨基酸X13到X29暴露于纳米颗粒的外表面并且因此最易于耐受突变，同时仍保持自组装成笼状纳米颗粒的能力。
因此，在优选实施例中，暴露于纳米颗粒的外表面的氨基酸X13到X29是任何氨基酸。
在优选实施例中，X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸或其保守取代。优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：半胱氨酸、甲硫氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。更优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：半胱氨酸、高半胱氨酸、硒代半胱氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。再次更优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基-丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸、高丝氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、s-(2-羟乙基)-1-半胱氨酸、磷酸丝氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、苏氨酸和磷酸苏氨酸。再次更优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸。
在另一个优选实施例中，X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸。在另一个优选实施例中，X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸。
在另一个优选实施例中，X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或其保守取代。优选地，天冬酰胺的所述保守取代选自由以下组成的组：谷氨酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺。
在另一个优选实施例中，X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺。在另一个优选实施例中，X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺。
在另一个优选实施例中，X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬氨酸酯、谷氨酸酯或其保守取代。优选地，天冬氨酸酯或谷氨酸酯的所述保守取代选自由以下组成的组：2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸。
在另一个优选实施例中，X15和X20彼此独立地是天冬氨酸酯。在另一个优选实施例中，X26和X28彼此独立地是谷氨酸酯。在另一个优选实施例中，X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬氨酸酯或谷氨酸酯。在另一个优选实施例中，X15、X20、X26和X28彼此独立地选自由以下组成的组：谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸。
在另一个优选实施例中，X18和X29彼此独立地是亮氨酸或其保守取代。优选地，亮氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸。
在另一个优选实施例中，X18和X29彼此独立地是亮氨酸。在优选实施例中，所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在优选实施例中，所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸。
在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是带正电的氨基酸。
在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸、赖氨酸或其保守取代。优选地，精氨酸或亮氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：组氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。更优选地，精氨酸或亮氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是组氨酸、精氨酸或赖氨酸。在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸。在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是6赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X21、X22、X25和X27彼此独立地是精氨酸。在另一个优选实施例中，X23是赖氨酸。在另一个优选实施例中，X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸；X14、X16和X24彼此独立是天冬酰胺；X15和X20彼此独立地是天冬氨酸酯；X18和X29彼此独立地是亮氨酸；X26和X28彼此独立地是谷氨酸酯；X21、X22、X25和X27彼此独立地是精氨酸；并且X23是赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸；X14、X16和X24彼此独立是天冬氨酸酯或谷氨酸酯；X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺；所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X13、X17、和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸；
X14、X16和X24彼此独立地选自由以下组成的组：谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺；
X15、X20、X26和X28彼此独立地选自由以下组成的组：谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸；
X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸；并且
X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X8是甘氨酸或其保守取代，其中优选地，甘氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸；
X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或其保守取代，其中优选地，谷氨酰胺的所述保守取代选自由以下组成的组：天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺；
X10是谷氨酸酯或其保守取代，其中优选地，谷氨酸酯的所述保守取代选自由以下组成的组：天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸；并且
X11是丝氨酸或其保守取代，其中优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸；
更优选地，X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺，X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯，并且X11是丝氨酸。
在另一个优选实施例中，X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸或其保守取代，其中优选地，丝氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸；
X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺、谷氨酰胺或其保守取代，其中优选地，天冬酰胺或谷氨酰胺的所述保守取代选自由以下组成的组：β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺；
X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬氨酸酯、谷氨酸酯或其保守取代，其中优选地，天冬氨酸酯或谷氨酸酯的所述保守取代选自由以下组成的组：2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸；并且
X18和X29彼此独立地是亮氨酸或其保守取代，其中优选地，亮氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸；并且
X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸、赖氨酸或其保守取代，其中优选地，精氨酸或亮氨酸的所述保守取代选自由以下组成的组：组氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸；
X7是半胱氨酸、其保守取代或带正电的氨基酸；优选地，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸、硫代赖氨酸和丝氨酸；
X8是甘氨酸或其保守取代，所述保守取代选自由以下组成的组：丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸；
X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或其保守取代，所述保守取代选自由以下组成的组：天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺；
X10是谷氨酸酯或其保守取代，所述保守取代选自由以下组成的组：天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸；并且
X11是丝氨酸或其保守取代，所述保守取代选自由以下组成的组：高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸；
X13、X17、和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、4-羟基-1-苏氨酸、6-羟基-1-正亮氨酸、4,5-二羟基-异亮氨酸、3-羟基-1-缬氨酸、羟基正缬氨酸、2-氨基-5-羟基戊酸、别苏氨酸、3,3-二羟基丙氨酸、4-羟基-L-异亮氨酸、(2s,3r)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、β-羟基亮氨酸和别苏氨酸；
X14、X16和X24彼此独立地选自由以下组成的组：谷氨酰胺、天冬酰胺、β-羟基天冬酰胺、3-甲基-1-谷氨酰胺、(2s,4s)-2,5-二氨基-4-羟基-5-氧戊酸和n-甲基-天冬酰胺；
X15、X20、X26和X28彼此独立地选自由以下组成的组：谷氨酸酯、天冬氨酸酯、2s,4r-4-甲基谷氨酸、(3s)-3-甲基-1-谷氨酸、(3r)-3-甲基-1-谷氨酸、5-邻-甲基-谷氨酸、4-羟基-谷氨酸、6-羧基赖氨酸、β-羟基天冬氨酸、2-氨基丙二酸、3,3-二甲基天冬氨酸、2-氨基己二酸和3-甲基天冬氨酸；
X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、叔亮氨酸、高亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、二乙基丙氨酸、正亮氨酸和正缬氨酸；并且
X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸或赖氨酸，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺，X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯，X11、X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸，X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺，X15、X20、X26和X28彼此独立是天冬氨酸酯或谷氨酸酯，X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸，并且X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸或赖氨酸，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸，X8是甘氨酸，X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺，X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯，X11是丝氨酸，X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸，X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺，X15、X20、X26和X28彼此独立是天冬氨酸酯或谷氨酸酯，X18和X29彼此独立地是亮氨酸，并且X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1-6中的至少三个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；X18和X29彼此独立地是亮氨酸；X15和X20彼此独立地是天冬氨酸酯；X26和X28彼此独立地是谷氨酸酯；X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺；X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸；X21、X22、X25和X27彼此独立地是精氨酸；并且X23是赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1-6中的至少三个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸；X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺；X15、X20、X26和X28彼此独立是天冬氨酸酯或谷氨酸酯；所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1-6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸；X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺；X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬氨酸酯或谷氨酸酯；所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1-6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸；X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺；X15和X20彼此独立地是天冬氨酸酯；X18和X29彼此独立地是亮氨酸；X26和X28彼此独立地是谷氨酸酯；X21、X22、X25和X27彼此独立地是精氨酸；并且X23是赖氨酸。
在另一个优选实施例中，X1-6中的至少三个或至少四个彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；并且X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸；X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺；X15、X20、X26和X28彼此独立是天冬氨酸酯或谷氨酸酯；所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸，并且所述多肽包括多组氨酸，所述多组氨酸是包括两个或更多个连续连接的组氨酸的氨基酸序列，优选地，所述多组氨酸是组氨酸(His)标签，更优选地His6标签。
在另一个优选实施例中，X1-6彼此独立地是赖氨酸或精氨酸，X7选自精氨酸、赖氨酸或半胱氨酸，X8选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺或天冬酰胺；X10是谷氨酸酯或天冬氨酸酯；X11选自由以下组成的组：丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸；X13、X17和X19彼此独立地选自由以下组成的组：丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸；X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺或谷氨酰胺；X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬氨酸酯或谷氨酸酯；所述X18和X29彼此独立地选自由以下组成的组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸；X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸或赖氨酸，并且所述多肽包括多组氨酸，所述多组氨酸是包括两个或更多个连续连接的组氨酸的氨基酸序列，优选地，所述多组氨酸是组氨酸(His)标签，更优选地His6标签。
在优选实施例中，所述氨基酸序列I是选自由SEQ ID NO:2到5和SEQ ID NO:10到16组成的组的序列。在优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQID NO:2到5和SEQ ID NO:10到16组成的组。
在优选实施例中，所述氨基酸序列I是选自由SEQ ID NO:2到5和SEQ ID NO:10到16、37和38组成的组的序列。在优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:2到5和SEQ ID NO:10到16、37和38组成的组。
在优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:2。在优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:3。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:4。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:5。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:10。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:11。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:12。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:13。在优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:14。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:15。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQID NO:16。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:37。在另一个优选实施例中，所述氨基酸序列I是SEQ ID NO:38。
在优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:2组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ IDNO:3组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:4组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:5组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:10组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:11组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:12组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:13组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:14组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:15组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:16组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:37组成的组。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:38组成的组。在优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:3组成的组，其中本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。在另一个优选实施例中，本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:3组成的组，其中本发明的所述多肽包括由3-9个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括另外的标签(即，肽或非肽标签)、优选地肽标签(即，功能氨基酸序列)。在优选实施例中，所述标签定位于本发明的多肽的C端或N端。
在优选实施例中，所述标签是非肽标签，优选地聚乙二醇(PEG)。优选地，所述PEG通过氨基酸丝氨酸或半胱氨酸偶联到所述氨基酸序列1。偶联到本发明的多肽的PEG增加稳定性和免疫原性。
在另一个优选实施例中，所述标签选自由以下组成的组：多组氨酸、His标签(即，由两个或更多个连续连接的组氨酸组成的氨基酸序列)、降解标签、靶向标签、细胞渗透标签和内体逃逸标签。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括多组氨酸。在优选实施例中，所述多组氨酸是包括两个或更多个组氨酸的氨基酸序列。在优选实施例中，所述多组氨酸是包括两个或更多个连续连接的组氨酸的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述多组氨酸是包括3个或更多个连续连接的组氨酸的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述多组氨酸是包括3到9个连续连接的组氨酸的氨基酸序列。在另一个优选实施例中，所述多组氨酸是包括3个、6个或9个连续连接的组氨酸的氨基酸序列。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括由连续连接的组氨酸(His标签)组成的组氨酸标签(His标签)。优选地，所述His标签由3个或更多个连续的组氨酸组成。优选地，所述His标签由3到9个连续的组氨酸组成。优选地，所述His标签由3个、6个或9个连续的组氨酸组成。优选地，所述His标签由3个连续的组氨酸组成。优选地，所述His标签由9个连续的组氨酸组成。优选地，所述His标签由6个连续的组氨酸(即，His6标签)组成。在优选实施例中，所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。在优选实施例中，所述His6标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。优选地，所述His标签由3个或更多个连续的组氨酸组成并且附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。优选地，所述His标签由3到9个连续的组氨酸组成，并且所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。优选地，所述His标签由3到9个连续的组氨酸组成，并且所述His标签附接到氨基酸序列I的C端。优选地，所述His标签由3个、6个或9个连续的组氨酸组成，并且附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。优选地，所述His标签由3个连续的组氨酸(即，His3标签)组成，并且所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。优选地，所述His标签由9个连续的组氨酸(即，His9标签)组成，并且所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。
在一个优选实施例中，所述His标签(优选地，所述His6标签)包括卤化的(优选地，氟化的)组氨酸。在优选实施例中，所述His标签包括荧光团。在优选实施例中，本发明的所述多肽包括荧光团。
在优选实施例中，本发明的所述多肽包括降解标签。优选地，所述降解标签在哺乳动物细胞中起作用。在优选实施例中，所述降解标签是鸟氨酸脱羧酶(cODC)的C端序列(优选地，SEQ ID NO:17)或包括或由至少两个连续连接的泛素组成的(聚)泛素。在另一个优选实施例中，所述降解标签由SEQ ID NO:17(EFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV)的cODC组成。在另一个优选实施例中，所述降解标签包括至少两个连续连接的泛素。更优选地，所述降解标签由至少两个连续连接的泛素组成。
在优选实施例中，本发明的多肽包括靶向标签，所述靶向标签是肽靶向标签或非肽靶向标签。在Zhao等人(肿瘤靶向肽：分子成像和疗法的配体(Tumor-targetingPeptides:Ligands for Molecular Imaging and Therapy),《医药化学之抗癌药剂(Anticancer Agents Med Chem.)》2018,18(1):74-86)中提到优选肽靶向标签。优选地，所述靶向标签与癌症靶结合并且因此在本文中被称为癌症靶向标签。所述癌症靶包含在某些肿瘤细胞和肿瘤抗原中表达水平有所增加的受体。在优选实施例中，所述癌症靶向标签是与癌症靶结合的肽配体、拟肽或抗体。优选地，所述癌症靶向标签是叶酸。例如，叶酸可以通过肽键与本发明的多肽缀合。
在另外的实施例中，本发明的多肽包括内体逃逸肽或细胞穿透肽(CPP)。内体逃逸肽是例如二聚化二硫键连接的TAT或硫醇基。如本文所使用的，术语“细胞穿透肽”或CPP是指具有穿透质膜以将货物递送到细胞中的能力的一组肽。优选地，用于本发明的多肽中的所述CPP是亲水肽或阳离子肽。在另一个实施例中，所述CPP选自两亲肽、阴离子肽或疏水肽。多于1,600个CPP的数据库由Agrawal等人(Agrawal P、Bhalla S、Usmani SS、Singh S、CHaudhary K、Raghava GPS等人CPPsite 2.0：经过实验验证的细胞穿透肽的储库(CPPsite2.0:a repository of experimentally validated cell-penetrating peptides).《核酸研究》2016,44:D1098-D103)进行了描述。
在优选实施例中，本发明的多肽中包含的所述另外的标签通过可释放键(如可光解键)或通过可逆偶联连接。
本发明的所述多肽能够自组装成纳米颗粒，优选地笼状纳米颗粒。进一步地，SEQID NO:1的所述突变蛋白也能够自组装成纳米颗粒，优选地笼状纳米颗粒。
在另外的方面，本发明涉及编码根据本发明的多肽的核酸。
在另外的方面，本发明涉及包括至少一种根据本发明的多肽的纳米颗粒。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒的所述至少一种多肽中的每种多肽包括由至少3个连续连接的组氨酸组成的组氨酸标签，其中所述组氨酸标签中的每个组氨酸标签附接到所述至少一种多肽的C端或N端、优选地C端。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒的所述至少一种多肽中的每种多肽包括由至少3个连续连接的组氨酸组成的组氨酸标签，其中所述组氨酸标签中的每个组氨酸标签附接到所述至少一种多肽的C端或N端、优选地C端，其中所述纳米颗粒可在无需分解纳米颗粒的情况下装载和卸载货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒的所述至少一种多肽中的每种多肽包括由至少3个连续连接的组氨酸组成的组氨酸标签，其中所述组氨酸标签中的每个组氨酸标签附接到所述至少一种多肽的C端或N端、优选地C端，其中所述纳米颗粒可在无需分解纳米颗粒的情况下在体内和体外装载和卸载货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒的所述至少一种多肽中的每种多肽包括由至少3个连续连接的组氨酸组成的组氨酸标签，其中所述组氨酸标签中的每个组氨酸标签附接到所述至少一种多肽的C端或N端、优选地C端，其中所述纳米颗粒可在无需分解纳米颗粒的情况下在体外装载货物并在体内卸载货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒的所述至少一种多肽中的每种多肽包括由至少3个连续连接的组氨酸组成的组氨酸标签，其中所述组氨酸标签中的每个组氨酸标签附接到所述至少一种多肽的C端或N端、优选地C端，其中所述纳米颗粒能够内体逃逸并可在无需分解纳米颗粒的情况下装载和卸载货物。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒包括的本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO:3组成的组，其中本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中所述纳米颗粒可在无需分解所述纳米颗粒的情况下装载和卸载货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒包括的本发明的所述多肽由序列组成，所述序列选自由SEQID NO:3组成的组，其中本发明的所述多肽包括由3个或更多个连续的组氨酸组成的组氨酸标签(His标签)，其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，并且其中所述纳米颗粒可在无需分解所述纳米颗粒的情况下在体外装载货物并在体内卸载货物。在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒包含在组合物中，优选地在包括药学上可接受的载体的药物组合物中。
如本文所使用的，术语“纳米颗粒”是指能够包封分子的纳米尺寸范围(即，约1nm到约1000纳米)内的颗粒。所述纳米颗粒具有自组装以形成纳米颗粒的连接分子的规则排列的表面。
本发明的所述纳米颗粒具有带正电的腔。因此，其能够包封货物，如寡核苷酸(ON)。进一步地，所述纳米颗粒可以进入细胞并且有条件地在细胞内释放货物，优选地到细胞质中。因此，纳米颗粒可以例如用于在细胞内递送ON以便通过反义ON控制基因表达，以用于疫苗接种或免疫系统刺激。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够包封货物，优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA，并且能够将所述包封的货物递送到细胞。优选地，所述货物在细胞内递送。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够包封货物，优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA，并且能够在细胞内释放所述包封的货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够在细胞外包封货物，能够与所述包封的货物一起进入细胞，并且能够在细胞内释放所述货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够在细胞外包封货物，能够与所述包封的货物一起进入细胞，并且能够将所述货物释放到所述细胞的细胞质中。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够在体外包封货物，并且能够在体内(优选地，在细胞内)释放所述货物，更优选地到细胞质中。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够在体外包封货物，能够与所述包封的货物一起进入细胞，并且能够在体内(优选地，在细胞内)释放所述货物，更优选地到所述细胞的细胞质中。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒可在无需分解所述纳米颗粒的情况下装载和卸载货物。在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒可在无需分解所述纳米颗粒的情况下在细胞外装载货物并且在细胞内卸载。在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒允许在无需分解所述纳米颗粒的情况下装载和卸载货物。在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒允许在无需分解所述纳米颗粒的情况下在细胞外装载货物并在细胞内卸载所述货物。优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，最优选地siRNA。
在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒可在无需分解所述纳米颗粒的情况下在体内和体外装载货物并且在体内和体外卸载货物。在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒可在无需分解所述纳米颗粒的情况下在体外装载并在体内卸载。
在另外的实施例中，所述纳米颗粒宝包括至少一种亚基，其中所述亚基包括至少一种根据本发明的多肽。如本文所使用的，术语“亚基”是指组装并形成本发明的纳米颗粒的构建块。亚基包括至少一种本发明的多肽。优选地，所述亚基包括三种本发明的多肽，优选地恰好三种本发明的肽。更优选地，所述亚基由三种本发明的多肽组成。在另一个优选实施例中，所述亚基包括三个相同的本发明的肽，优选地恰好三个相同的本发明的肽。更优选地，所述亚基由本发明的三个相同的多肽组成。在另一个更优选实施例中，所述亚基包括或更优选地由三种本发明的多肽组成，并且所述亚基具有C3对称。
在优选实施例中，纳米颗粒恰好包括24种本发明的多肽。在优选实施例中，纳米颗粒恰好包括8个亚基。在另一个优选实施例中，纳米颗粒具有八面体的几何形状(八面体的点群对称)。在本发明的优选实施例中，纳米颗粒具有多个亚基(优选地，具有各自包括3种本发明的多肽的8个亚基)的季结构。
在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒包括中央腔(本文中也被称为腔、内部腔或内腔)。包括中心腔的所述纳米颗粒在本文中也被称为“笼状纳米颗粒”或“笼”。在优选实施例中，所述笼状纳米颗粒包括(i)外部支架和(ii)中央腔。优选地，所述外部支架围绕所述中心腔，即，组装在所述中心腔周围。所述腔可以是空的或其可以包含货物。
本发明的纳米颗粒具有带正电的内部。本发明的笼状纳米颗粒在腔表面上带正电。所述正电源自多个带正电的氨基酸，如精氨酸或赖氨酸。因此，本发明的纳米颗粒具有非常强的亲和力以包封带负电的大分子。
在优选实施例中，所述腔的直径为约6.5nm到约8nm。在优选实施例中，所述笼状纳米颗粒具有多孔结构，即，所述纳米颗粒包含孔。优选地，笼状纳米颗粒的外部支架包含连接到所述纳米颗粒的腔的孔。孔在本文中分别定义为纳米颗粒中的和纳米颗粒的外部支架中的开口或间隙。
纳米颗粒中货物的装载(或包封)和卸载(或释放)是通过孔进行的。术语装载或包封涉及货物到纳米颗粒(包含纳米颗粒的腔、支架和多孔结构)中的任何吸收。术语卸载(或释放)是指另一个货物部分或完全(优选地，完全)释放或置换货物。优选地，卸载是在竞争条件(即，要卸载的货物与要装载的另一个货物彼此竞争的条件)下发生的。
在优选实施例中，所述笼状纳米颗粒包括六个孔。优选地，所述笼状纳米颗粒包括连接到腔的六个孔。优选地，所述外部支架包含连接到纳米颗粒的腔的六个孔。
在另一个优选实施例中，所述孔的直径为约3nm到约4nm。在另一个优选实施例中，所述纳米颗粒包含直径为3-4nm的6个孔。
在另一个优选实施例中，所述纳米颗粒的外径为至多约50nm。在非常优选实施例中，所述纳米颗粒的外径为约13nm。
在另一个另外的优选实施例中，纳米颗粒包含直径为约3-4nm的6个孔，所述内部腔的直径为约8nm，并且所述纳米颗粒的外径为约13nm。
在优选实施例中，本发明的所述纳米颗粒能够在无需分解纳米颗粒的情况下包封和释放货物，优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA。
由于纳米颗粒的多聚体性质，用功能部分(例如，肽标签或化学基团，如PEG)修饰本发明的多肽提供这个功能部分在纳米颗粒表面上的多价展示。
在优选实施例中，纳米颗粒(尤其是笼状纳米颗粒)包括功能部分(在本文中也被称为部分)。优选地，所述部分定位于纳米颗粒的外表面上。更优选地，所述另外的部分附接到纳米颗粒，优选地附接到纳米颗粒的外表面。
在优选实施例中，所述部分通过共价或非共价键(优选地，通过共价键)附接到纳米颗粒或其外表面。共价键包含并且优选地是肽键或二硫键。
在另一个优选实施例中，附接到纳米颗粒的所述部分是本发明多肽的肽标签或非肽标签。
在另一个优选实施例中，所述部分选自由以下组成的组：多组氨酸、His标签(即，由两个或更多个连续连接的组氨酸组成的氨基酸序列)、降解标签、靶向标签、细胞渗透标签和内体逃逸标签。
优选地，所述靶向标签与癌症靶结合，即，所述靶向标签是癌症靶向标签。所述癌症靶包含在某些肿瘤细胞和肿瘤抗原中/上表达水平有所增加的受体。在优选实施例中，所述癌症靶向标签是与癌症靶结合的肽配体、拟肽或抗体。优选地，所述癌症靶向标签是叶酸。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在纳米颗粒的外表面上展示至少72个组氨酰基残基。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在纳米颗粒的外表面上展示至少72-216个组氨酰基残基。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在纳米颗粒的外表面上展示至少72个组氨酰基残基，并且其中所述组氨酰基残基附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端，其中所述纳米颗粒可在体内以及体外在无需分解的情况下装载和卸载货物。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在纳米颗粒的外表面上展示至少72个组氨酰基残基，并且其中所述组氨酰基残基附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在纳米颗粒的外表面上展示至少72-216个组氨酰基残基，并且其中所述组氨酰基残基附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在纳米颗粒的外表面上展示至少96个组氨酰基残基，优选地144个组氨酰基残基。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示3到50个(优选地，24个)富含组氨酸的氨基酸序列，其中所述富含组氨酸的氨基酸序列中的每个富含组氨酸的氨基酸序列独立地附接到本发明的多肽的N端或C端并且所述富含组氨酸的氨基酸序列的每个富含组氨酸的氨基酸序列包含至少5个(优选地，6个)组氨酰基残基。优选地，所述富含组氨酸的氨基酸序列的长度为30个氨基酸或更少、优选地25个氨基酸或更少、更优选地20个氨基酸或更少、再次更优选为15个氨基酸或更少、再次更优选地10个或更少、再次更优选地5或6个氨基酸。
在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示至少72个、优选地至少96个、更优选地至少120个、再次更优选地至少144个组氨酰基残基。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示约144个组氨酰基残基。
在更优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示24个His标签，其中所述His标签中的每个His标签由3个或更多个连续连接的组氨酸组成。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示24个His标签，其中所述His标签中的每个His标签由3-9个连续连接的组氨酸组成。在更优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示24个His标签，其中所述His标签中的每个His标签由3个或更多个连续连接的组氨酸组成，并且其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示24个His标签，其中所述His标签中的每个His标签由3-9个连续连接的组氨酸组成，并且其中所述His标签附接到氨基酸序列I的C端或N端、优选地C端。
在另一个优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示3到50个(优选地，24个)His6标签，其中所述His6标签中的每个His6标签由6个连续连接的组氨酸组成。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示3到50个(优选地，24个)包括His6标签(其在本文中定义为由6个连续连接的组氨酸(即，高六组氨酸)组成的序列)的氨基酸序列，其中包括序列的所述His6标签中的每个His6标签独立地附接到本发明的多肽的N端或C端。优选地，所述包括His6标签的序列的长度为30个氨基酸或更少、优选地25个或更少、更优选20个或更少、再次更优选地15个或更少、再次更优选地10个或更少。在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在其外表面上展示3到50个(优选地，24个)His6标签，其中所述His6标签中的每个His6标签独立地附接到本发明的多肽的N端或C端。
这些富含组氨酸的肽可能是由于内体逃逸特性而对于将靶细胞递送到细胞质至关重要。据报道，组氨酸残基可以在合成肽和一些病毒的内体逃逸中起重要作用。然而，使用多聚体蛋白质组装体来呈递功能性富含组氨酸的肽的多个拷贝尚未证实并表示细胞质递送蛋白质纳米颗粒的新方法。
在优选实施例中，本发明的纳米颗粒在产生后被基因修饰(用于肽的直接融合)或化学修饰。
本发明的纳米颗粒仅示出可忽略不计的细胞毒性。使用WST-8在24小时内测量HeLa细胞的体外细胞毒性以定量脱氢酶活性(参见下面的材料与方法、细胞毒性)。本发明的纳米颗粒将活力最大降低到约95％。在浓度从12μg/mL到193μg/mL的蛋白质(400nM的笼)中，活力降低约0％到约5％。相比之下，Lipofectamine 2000在相同的测定条件下以低19倍的质量浓度(10μg/mL)将细胞活力降低到约35-45％。
在另一方面，本发明涉及一种复合物，其包括本发明的纳米颗粒和一个或多个货物分子。
在优选实施例中，所述复合物包括本发明的笼状纳米颗粒和包封在笼状纳米颗粒的腔中的一个或多个货物分子。
在优选实施例中，本发明的所述复合物能够在生物体中诱导免疫应答。优选地，所述生物体是动物、更优选地哺乳动物、再次更优选地小鼠或人、最优选地人。
优选地，本发明的复合物的所述货物分子是大分子。在另外的优选实施例中，所述大分子是带负电的。
如本文所使用的，术语“带负电的”包含并且优选地是指具有带正负荷的基团的分子。更优选地，所述带负电的分子在中性或生理pH下具有带负电的基团。
由于源自精氨酸残基的本发明纳米颗粒的内部高度带正电，因此纳米颗粒具有强亲和力以包封带负电的大分子，如ON。用本发明的复合物处理细胞导致复合物的细胞内递送并释放其功能性带负电的大分子。因此，本发明的复合物能够进入细胞、内体逃逸并在细胞内释放带负电的大分子。例如，由于ON的细胞质递送和释放，包括ON的复合物提供期望的基因的选择性敲低。
本发明的复合物进一步能够进入细胞，并且其还能够在细胞内释放带负电的大分子(如ON)，优选地到细胞质。因此，本发明的复合物相对于带负电的大分子(如ON)有条件地稳定。笼的带正电的内部为带负电的大分子(如ON)的包封提供强大的驱动力，从而产生在室温下在标准缓冲液中稳定数周的复合物。
在存在高浓度的竞争性客体分子的情况下，包封是可逆的，而本发明的复合物在细胞外是稳定的。在存在高浓度的带负电的竞争因子(例如，如在细胞的细胞质中发现的核酸)的情况下，带负电的大分子(如ON)会逐渐释放并且能够执行其生物学功能。这种竞争因子诱导的带负电的大分子(如ON)的位置特异性释放的概念是独特的，并且有可能通过改变蛋白质笼内部中的精氨酸残基的数量和位置来进行修饰。因此，在优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够可逆地包封和释放货物。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够在无需分解纳米颗粒的情况下可逆地包封和释放货物。在另外的优选实施例中，本发明的纳米颗粒能够在无需分解纳米颗粒的情况下包封和释放货物。所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA。
在另外的实施例中，本发明的纳米颗粒能够在细胞外包封货物，优选地，所述货物是带负电的大分子，更优选地RNA，再次更优选地选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA，并且包封所述货物的所述纳米颗粒能够在细胞内释放所述货物。
在优选实施例中，所述一个或多个带负电的大分子中的每个带负电的大分子的直径为约3.5nm或更小。在另外的优选实施例中，所述一个或多个带负电的大分子中的每个带负电的大分子的直径为约2nm或更小。在优选实施例中，所述一个或多个带负电的大分子中的每个带负电的大分子的直径为约2nm并且长度为约8nm。优选地，所述大分子是单体的直链，优选地直径为约2nm并且长度为约8nm。
在优选实施例中，所述带负电的大分子是核酸或多肽。
在另一个优选实施例中，所述货物分子是寡核苷酸(ON)。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”是指包括通过核苷连接彼此连接的2个或更多个核苷酸的化合物。寡核苷酸是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸或其混合物，并且优选地，选自单链或双链的(a)未经修饰的(即，天然存在的)RNA或DNA、(b)经过修饰的RNA或DNA或(c)RNA或DNA模拟物，如锁定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。优选地，寡核苷酸选自由以下组成的组：(a)单链和双链DNA、(b)是单链区和双链区的混合物的DNA、(c)单链和双链RNA、(d)是单链区和双链区的混合物的RNA和(e)包括是单链或双链DNA和RNA或单链区和双链区的混合物的杂交分子。在另外的优选实施例中，在另外的实施例中，寡核苷酸是三链区和包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的更高级结构。在另外的实施例中，寡核苷酸是合成的、基因组的或重组的。在一个实施例中，寡核苷酸是指(a)含有至少一种经过修饰的核苷酸或至少一种核苷酸类似物的DNA或RNA或(b)具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。
如本文所使用的，术语“经过修饰的RNA”或“经过修饰的DNA”是指如上所定义的并且与天然存在的基于核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸相比具有至少一个经过修饰的核苷间键和/或至少一个糖修饰和/或至少一个碱基修饰的寡核苷酸。经过修饰的核苷间键指示在RNA和DNA中不是天然存在的磷酸二酯的经过修饰的版本的存在。本领域技术人员已知并且与本发明相容的核苷间键修饰的实例是并且具体地包含氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、H-膦酸酯、膦酸甲酯和硫代磷酸甲酯。糖修饰指示如天然存在于RNA和DNA中的核糖基部分的经过修饰的版本(即，呋喃糖基部分)的存在，如双环糖、四氢吡喃、2'-经过修饰的糖、3'-经过修饰的糖、4'-经过修饰的糖、5'-经过修饰的糖或4'-经过取代的糖。合适的糖修饰的实例是本领域技术人员已知的，并且包含但不限于2'-O-经过修饰的RNA核苷酸残基，如2'-O-烷基或2'-O-(经过取代的)烷基，例如2'-O-甲基、2'-O-(2-氰乙基)、2'-O-(2-甲氧基)乙基(2'-MOE)、2'-O-(2-硫代甲基)乙基、2'-O-(卤代烷氧基)甲基，例如2'-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2'-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)、2'-O-烷氧羰基，例如2'-O-[2-(甲氧羰基)乙基](MOCE)、2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基](MCE)、2'-O-[2-(N,N-二甲基氨基甲酰基)乙基](DMCE)，具体地2'-O-甲基修饰或2'-O-(2-甲氧基)乙基(2'-MOE)。另一个重要的修饰包含桥接或经过双环核酸(BNA)修饰的糖部分，如在例如锁核酸(LNA)、木糖-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt(2'-O,4'-C约束的乙基)LNA、cMOEt(2'-O,4'-C约束的甲氧基乙基)LNA、乙烯桥核酸(ENA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA(F-HNA)、吡喃糖基-RNA(p-RNA)、3'-脱氧吡喃糖基-DNA(p-DNA)中发现的；或其它经过修饰的糖部分，如吗啉代(PMO)、阳离子吗啉代(PMOPlus)或PMO-X，全部都是本领域技术人员已知的。如本文所使用的，术语“碱基修饰”是指RNA和/或DNA中天然存在的碱基(即，嘧啶或嘌呤碱基)的修饰。碱基修饰是本领域技术人员已知的，并且包含但不限于天然嘌呤和嘧啶碱基(例如，腺嘌呤，尿嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶)的经过修饰的版本，如次黄嘌呤、假尿嘧啶、假胸腺嘧啶、2-巯基嘧啶(例如，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶)、2,6-二氨基嘌呤、5-经过取代的嘧啶(例如，5-卤尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶)、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮杂嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂7-脱氮杂嘌呤或8-氮杂7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤。本发明还涵盖所述寡核苷酸包括多于一种相同或不同的核苷间键修饰、糖修饰和/或碱基修饰。因此，本发明中所指的寡核苷酸可以由上文所描述的核苷酸和其修饰的任何组合组成。
更优选地，所述一个或多个带负电的大分子是选自由以下组成的组的一个或多个寡核糖核苷酸：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA。进一步优选的是能够刺激细胞(优选地，树突状细胞)中的IFN-α产生的寡核苷酸。
在优选实施例中，所述一个或多个带负电的大分子是一个或多个ON，其中所述一个或多个ON的核苷酸的总数为约300或更少。在另一个优选实施例中，所述一个或多个ON的核苷酸的总数为约10到约300、优选地约20到约300、更优选地约40到约300、再次更优选地约50到约300、再次更优选地约100到约300、再次更优选地约200到约300。
在另一个优选实施例中，所述一个或多个ON的核苷酸的总数为约10到约300、优选地约10到约200、更优选地约10到约50、再次更优选地约10到约40、再次更优选地约10到约30。
在另一个优选实施例中，所述一个或多个ON的核苷酸的总数为约10到约300、优选地约20到约200、更优选地约40到约100。
在优选实施例中，所述一个或多个ON的核苷酸的总数为约300或更少，并且所述ON是RNA，优选地ssRNA。
在另外的优选实施例中，所述一个或多个ON是单链ON(ssON)，优选地ssRNA或ssDNA，其中所述ssON共同具有约40nts或更长、优选地约40到约300nts、更优选地约40到约200nts、再次更优选地约40到约100nts、再次更优选地约40nts的长度。在另一个优选实施例中，所述一个或多个ON是双链ON(dsON)，优选地dsRNA或dsDNA，其中所述dsON共同具有约40bps或更长、优选地约40到约300bps、更优选地约40到约200bps、再次更优选地约40到约100bps、再次更优选地约40bps的长度。
在优选实施例中，所述一个或多个大分子是一个或多个寡核苷酸，其中所述一个或多个寡核苷酸包封在所述纳米颗粒中并且不易于DNA酶水解。因此，在优选含义中，术语“包封的”指示处于包封状态的一个或多个寡核苷酸不易于DNA酶水解。更优选地，术语“包封的”指示处于包封状态的一个或多个寡核苷酸不易于DNA酶水解，其中DNA酶是DNA酶I或Benzonase。再次更优选地，术语“包封的”指示处于包封状态的一个或多个寡核苷酸不易于Benzonase水解。
所述带负电的大分子优选地通过非共价键包封在纳米颗粒内。优选地，所述非共价键是静电键。
纳米颗粒内可以包含其它任选的试剂，如佐剂。
在另外的优选实施例中，所述带负电的大分子是以缔合速率常数kon((6.6±0.6)×105M-1s-1)与纳米颗粒结合的ON(图2c)。通过测量荧光淬灭和荧光测定法测定结合动力学。将数据拟合成单指数衰减(以线性拟合相对于ON浓度绘制的速率常数(kobs))。
在另外的优选实施例中，所述带负电的大分子是以解离常数Kd((2.4±0.3)×10-10M)和解离速率常数koff((1.6±0.1)×10-4s-1)从纳米颗粒中解离的ON。为了测定解离速率，使用100倍过量的未标记的DNA诱导包封的Atto488-ssDNA货物缓慢释放(图2d)。将数据拟合成单指数衰减提供解离速率常数k off((1.6±0.1)×10-4s-1)。缔合速率常数和解离速率常数用于计算平衡解离常数Kd((2.4±0.3)×10-10M)。
在优选实施例中，复合物中包含的带负电的大分子是核酸(优选地，ON)，并且本发明的复合物的所述纳米颗粒能够保护所述核酸(优选地，所述ON)免受核酸酶降解。在优选实施例中，所述核酸酶的分子量为超过14kD、优选地超过20kD、更优选地超过30kD、再次更优选地超过40kD、再次更优选地超过50kD和再更优选地60kD或超过60kD。在优选实施例中，所述核酸酶的分子量为超过14kD。在优选实施例中，所述核酸酶的分子量为超过60kD或更多。
在优选实施例中，本发明的复合物或纳米颗粒与裸露的(即，游离的)Atto488-ssDNA的对照相比示出细胞摄取增加大约30倍。
在另外的方面，本发明提供了一种用于制造本发明的纳米颗粒的方法，所述方法包括使本发明的多肽自组装成所述纳米颗粒的步骤。
在优选实施例中，用于制造本发明的纳米颗粒的方法包括以下步骤：(i)产生本发明的多肽，并且(ii)使本发明的多肽自组装成所述纳米颗粒。用于制造本发明的纳米颗粒的多肽优选地通过重组表达来产生。在优选实施例中，所述多肽在细菌细胞中(优选地，在大肠杆菌细胞中)重组表达。表达后，本发明的多肽自组装成可以分离的定义明确的纳米颗粒。
在优选实施例中，用于制造纳米颗粒的方法进一步包括分离纳米颗粒的步骤。所述分离步骤优选地是亲和色谱法，更优选地是固定的金属亲和色谱法。在优选实施例中，所述分离步骤是使用包括镍、钴或铜的载体的亲和色谱法。最优选地，所述分离步骤是Ni-NTA亲和色谱法。
由于本发明的纳米颗粒的内部带正电，因此可能污染源自表达本发明的多肽的宿主细胞的核酸。这些不期望的货物可以以高离子强度去除以减弱静电相互作用，并且用RNA酶A去除以消化污染物RNA。
因此，在优选实施例中，用于制造纳米颗粒的方法进一步包括用高离子强度缓冲液和/或RNA酶处理纳米颗粒的步骤。在优选实施例中，所述高离子强度缓冲液的离子强度为0-2M。在另外的优选实施例中，用于制造本发明的纳米颗粒的所述方法包括以下步骤：(i)通过重组表达产生本发明的多肽，(ii)在离子强度为0-2M并且包括RNA酶和/或DNA酶的缓冲液中处理表所达的多肽，并且使本发明的多肽自组装成所述纳米颗粒。优选地，所述缓冲液的0-2M的所述高离子强度通过添加NaCl来调节。优选地，除RNA酶和/或DNA酶之外，所述高离子强度缓冲液还包括磷酸钠缓冲液、NaCl、咪唑和任选地溶菌酶。所述缓冲液包括例如约50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、约1000mM NaCl和补充有溶菌酶、DNA酶I和RNA酶A的咪唑。所述高离子强度缓冲液含有至少20mM咪唑。
在另外的方面，本发明提供了一种用于制造本发明的复合物的方法，所述方法包括将本发明的纳米颗粒与一个或多个带负电的大分子混合的步骤。在优选实施例中，所述混合步骤在水性缓冲液(优选地，在室温下)发生。
在另外的方面，本发明提供了一种用于转染细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的复合物接触的步骤。
如本文所使用的，术语“转染”是指将带负电的大分子、优选地核酸、更优选地ON引入到细胞中的过程。优选地，用于转染细胞的所述方法是体外过程。
在优选实施例中，所述细胞是真核细胞。更优选地，所述细胞是动物细胞，再次更优选地是哺乳动物细胞。
在另外的方面，本发明涉及一种本发明的复合物用于转染细胞的用途。
实例
实例1-材料和方法
材料和仪器
用于分子克隆的所有酶均购自新英格兰生物实验室(New England BioLabs)(美国)。所有合成寡核苷酸均购自Microsynth AG公司(瑞士)。质粒微量制备试剂盒和DNA纯化试剂盒购自Zymo研究公司(Zymo Research)(美国)。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自Fluorochem公司(英国)。溶菌酶购自PanReac Axon Lab AG公司(瑞士)。为了分离带His标签的蛋白质，使用来自Qiagen(德国)的Ni-NTA琼脂糖。DNA酶I来自罗氏公司(Roche)(瑞士)并且RNA酶A来自默克公司(Merck)(德国)。Benzonase购自默克密理博公司(Merck-Millipore)(美国)。GelRed购自Biotium公司(Biotium,Inc.)(美国)。质粒pET29b(+)-O3-332由David Baker教授友情提供。
使用NanoDrop 2000c分光光度计进行DNA和蛋白质定量，所述分光光度计来自赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific Inc.)(美国)。所有尺寸排阻色谱法均在NGCTM中压色谱系统上进行，所述系统来自伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)(美国)。在来自通用电器医疗集团(GE Healthcare)(美国)的PhastGel系统上运行并开发了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。琼脂糖凝胶电泳(AGE)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分别在
细胞GT和Mini-PROTEAN系统上进行，两者均来自伯乐实验室有限公司(美国)。使用来自佳能公司(Canon)(日本)的EOS 1100D捕获凝胶图像。在来自FEI公司(美国)的Morgagni 268上获得透射电子显微镜检查(TEM)图像。在来自尼康公司(Nikon)(日本)的Eclipse-Ti倒置显微镜上获得荧光显微镜检查图像。在来自徕卡公司(Leica)(德国)的SP8-AOBS上获得共聚焦荧光显微镜检查图像。在来自BD生物科学公司(BD Biosciences)(美国)的LSRFortessa上进行流式细胞术。
分子建模
原始O3-33组装件(PDB：3VCD)(King,N.P等人,《科学(Science)》2012,336,1171-1174)的X射线衍射数据用于选择突变成精氨酸的序列位置，所述序列位置在使用Dynameomics主链独立性旋转异构体文库(Scouras,A.D.等人,《蛋白质科学(ProteinSci.)》2011,20,341-352)时通过UCSF嵌合体(Pettersen,E.F.等人,《计算化学杂志(J.Comput.Chem.)》2004,25,1605-1612)。
分子克隆
OP的基因购自ATG:生物合成公司(ATG:biosynthetics)(德国)，并且作为质粒pGH-OP获得。将OP基因插入物从pGH-OP切除并使用XhoI和NdeI限制性位点克隆到载体pET29b(+)-O3-33载体中(King等人,2012,前面引用的文献)，从而替换O3-33基因并获得质粒pET29b(+)-OP。在紧邻His6标签上游的XhoI位点处通过在编码GS**的DNA盒中进行克隆来制备无His6标签的OP基因。通过由Microsynth AG公司(瑞士)进行的Sanger DNA测序来确认质粒序列。
蛋白质表达
蛋白质在用pET29b(+)-O3-33、pET29b(+)-OP或pET29b(+)-OP_无His6转化的大肠杆菌菌株BL21-Gold(DE3)表达。在37℃下，将细胞在含有硫酸卡那霉素(86μM)的LB培养基中生长，直到OD600达到0.6-0.8为止，并用IPTG(0.1mM)诱导蛋白质过表达。在25℃下培养约18小时后，通过在4℃下离心(5,000×g)15分钟收获细胞。将细胞沉淀物储存在-20℃下，直到纯化为止。
OP的细胞裂解、Ni-NTA和RNA去除
由于OP能够在大肠杆菌中表达期间装载小RNA分子，因此开发了经过优化的方案以分离出纯度良好的空笼。所述经过优化的方案包括使用高离子强度缓冲液来减弱与核酸的相互作用以及与RNA酶A的延长温育。将来自800mL的培养物的每个细胞沉淀物重悬于10mL的裂解缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、1000mM NaCl、20mM咪唑)中，补充溶菌酶(0.1mg/mL)、DNA酶I(10U/mL)、RNA酶A(5U/mL)和蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司(Sigma))，并在37℃下温育1.5小时。
在裂解、超声并在25℃下离心(10,000×g)25分钟后，将上清液装载到5mL的含Ni-NTA树脂的重力流动柱上并温育15分钟。在用含有20mM和40mM咪唑的裂解缓冲液多次洗涤后，将靶蛋白用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、300mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。通常，收集到10-20mL并补充2U/mL RNA酶A、5mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物，并在37℃下温育过夜，以消化未在Ni-NTA纯化期间去除的任何污染物大肠杆菌RNA。然后，准备将蛋白质用于SEC。此后，除非另有说明，否则蛋白质的储存和所有实验均在室温下进行。
O3-33的裂解和Ni-NTA
O3-33的分离按照与OP相同的步骤，但是条件不那么严格，因为核酸污染不是问题。对于裂解、超声和Ni-NTA，所使用的缓冲液具有较低的离子强度(50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)、300mM NaCl和20mM咪唑)。在用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、300mMNaCl、500mM咪唑)从Ni-NTA分离后，蛋白质准备好用于SEC。
尺寸排阻色谱法(SEC)
在SEC之前，使用Amicon Ultra-15离心过滤器单元(30k MWCO)(默克密理博公司，美国)将蛋白质样品交换到具有200mM NaCl和5mM EDTA的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中。这个过程还从OP去除一些RNA酶A和经过消化的核酸片段。然后，使用来自通用电器医疗集团(美国)的Superose 6增加10/300GL柱通过SEC在室温下以1.0毫升/分钟的流动速率分离完全组装的24聚体笼。O3-33笼和OP笼两者均用含有200mM NaCl和5mM EDTA的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)洗脱液在15-16mL时洗脱。将经过纯化的蛋白质在室温下储存在SEC洗脱缓冲液中。通过280nm处的吸光度定量蛋白质。另外地，根据A260/A280比率并且通过GelRed(其是敏感性核酸染剂)染色的天然琼脂糖凝胶验证所有RNA的去除。通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE验证蛋白质纯度。
蛋白质笼的一般表征
在Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液(40mM Tris-HCl、19mM乙酸、1mM EDTA，pH 8.3)中使用2％或3％(w/v)琼脂糖凝胶进行所有天然凝胶电泳。将凝胶与GelRed一起灌制以按照需要检测未标记的核酸，并用考马斯蓝染色以进行蛋白质可视化。在用于分析蛋白质的典型实验中，每通道装载含约100或200pmol的衣壳(相对于单体)的10μL缓冲液与另外的2μL的70％(v/v)甘油水溶液。将凝胶在100V下运行30分钟、用考马斯蓝染色以使蛋白质可视化，用Atto488荧光检测ON。
在与用于笼分离相同的条件下进行SEC分析。如先前所报道的，进行负染色的透射电子显微镜检查(TEM)(Beck,T.等人,《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》2015,54,937-940)。对于所有TEM实验，使用含3-5μM(单体)蛋白质样品的储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、200mM NaCl和5mM EDTA)。使用0.22μm过滤的含150-250μM(单体)样品的储存缓冲液在25℃下在Zetasizer Nano(马尔文仪器公司(Malvern Instruments)，英国)上进行DLS测量。
熔融温度
使用Protein Thermal ShiftTM染料试剂盒(赛默飞世尔科技公司，美国)在StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，美国)上获得熔融温度。在包含25mM Tris-HCl(pH 8.0)、200mM NaCl的缓冲液中以5、10和20μM一式三份地测量蛋白质。对所有数据进行平均以产生值。
表4：熔融温度
| 蛋白质 | Tm(℃) |
| O3 | 96.08±0.09 |
| O3+siRNA | 95.98±0.28 |
| OP | 94.42±0.33 |
| OP+siRNA | 95.80±0.63 |
表4示出了在存在和不存在两个当量的siRNA双链体的情况下，O3-33和OP蛋白质的熔融温度Tm。
蛋白质晶体学
使用Phoenix结晶机器人(Art Robbins Instruments)在Intelli-Plate R96-3LV中建立坐滴蒸汽扩散实验。在20℃下进行最初的结晶尝试。在20℃下，通过使用坐滴蒸汽扩散方法用3mg/mL的酶溶液在2M(NH4)2SO4和5％2-丙醇中获得孔衍射OP晶体。将晶体转移到具有20％(v/v)甘油作为冷冻保护剂的储库溶液中，并且然后在氮气流中在-173℃下进行闪速冷却。使用EIGER X 16M检测器在瑞士光源(Swiss Light Source，保罗谢勒研究所(Paul Scherrer Institute)，瑞士维利根)处的X06SA处收集X射线衍射数据集。使用
的波长进行数据收集。
OP的衍射数据使用XDS程序包(Kabsch W.,《晶体学学报D区—生物晶体学(ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.)》2010,66,125-132)。使用O3-33(PDB代码：3VCD)的结构作为搜索模型通过分子置换来确定初始阶段。分子置换用移相器(McCoy,A.J.等人,《应用晶体学期刊(J.Appl.Crystallogr.)》2007,40,658-674)。将结构用Coot(Emsley,P.等人，《晶体学学报D区—生物晶体学》2004,60,2126-2132)手动修改，并用PHENIX(Adams,P.D.等人,《晶体学学报D区—生物晶体学》2010,66,213-221)。表5中总结了最终的晶体数据和强度统计。
电泳迁移率转变测定(EMSA)
如上文所描述的，所有EMSA均在3％(w/v)琼脂糖凝胶上进行。对于带Atto488标记的ssDNA，每个样品使用10pmol的DNA(＝一个凝胶通道)，并在室温下与不同摩尔当量的蛋白质在总体积为10μL的PBS中一起温育。对于未标记的dsDNA和dsRNA，在相同的温育条件下，每个样品使用40pmol的双链体，并将凝胶与GelRed一起灌制以进行可视化。
货物装载能力
将纯OP蛋白质(1nmol)在室温下与5当量的ssDNA、dsDNA或dsRNA在200μL的SEC缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)、200mM NaCl和5mM EDTA)中一起温育过夜。将混合物通过SEC纯化，并获得吸光度光谱。使用a|e UV-Vis-IR软件对所有吸光度光谱针对光散射进行校正。使用由Porterfield和Zlotnick(Porterfield,J.Z.等人,《病毒学(Virology)》2010,407,281-288)描述的方程式根据280和260nm处的吸光度值测定蛋白质和核酸的浓度。
包封动力学
所有动力学测量均在室温下在PBS中进行。对于确定kon的每个实验，在515nm(激发，488nm)处测量带Atto488标记的DNA(10nM)的800μL溶液的荧光发射，并将这个值作为t＝0秒。接下来，添加小体积的浓缩OP溶液，使最终浓度为5-125nM，并以10秒的间隔监测随时间的发射下降。将发射对时间的每次测量拟合成单指数，从而为每种OP浓度提供kobs。然后，将这些kobs值相对于[OP]绘制，并根据线性拟合的斜率获得kon。由于每个笼中有一到两个客体DNA分子转变，所以低OP浓度(<25nM)下的kobs的值是不可靠的(图17)。因此，仅使用25-125nM范围内的kobs来确定kon，并将线性拟合的y轴截距固定成确定的koff值为1.6×10-4秒。
为了确定koff，将带Atto488标记的DNA(10nM)和OP(5nM)的800μL溶液温育，直到观察不到荧光的进一步改变。这提供了含有两个ssDNA分子的OP笼，当第二个DNA分子包封成1:1复合物的情况被去除时，这将koff测量简化成仅一个速率常数。由于OP:DNA复合物的稳定性高，因此使用过量的未标记的ssDNA来置换包封的Atto488-DNA并在其从蛋白质笼释放时恢复荧光。在添加1μM的未标记的ssDNA后，以60秒的间隔监测515nm处的荧光发射的改变，持续16小时。将数据拟合成单指数以生成koff。
核酸酶消化测定
通过在室温下在PBS中温育1小时来制备OP与ssDNA、dsDNA或dsRNA的复合物(1:1摩尔比)。还制备仅含有核酸的等效储备液。然后，将储备液分成等分试样，以为每个凝胶通道提供样品。每个样品在补充有MgCl2(2.5mM)、CaCl2(0.5mM)的总体积为10μL的PBS中含有24pmol的OP/核酸。对照样品保持原样，并向核酸酶样品补充0.2U的RNA酶A、DNA酶I或Benzonase。然后，在通过用GelRed染色并且然后用考马斯蓝染色的天然琼脂糖凝胶进行分析之前，将所有样品在37℃下温育18小时(图14)。
细胞培养
将HeLa细胞和A431细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基(高葡萄糖)中，将MCF-7细胞和Vero细胞维持在Iscove改良的Dulbecco培养基中，将HepG2和HT29维持在RPMI-1640培养基中，并将CHO维持在Ham's F-12K培养基中。在所有情况下，向培养基补充10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺，2mM GlutaMAX和1μg/mL庆大霉素。将细胞在5％CO2中在37℃下培养，并且通常每3天以1:4的比率分裂。以与HeLa细胞相同的方式维持HeLa-GFP细胞，并将0.1mM非必需氨基酸(NEAA)和10μg/mL杀稻瘟菌素(选择抗生素)添加到培养基。因为发现NEAA和杀稻瘟素在那些时间范围内没有影响，所以并未将它们添加到培养基。细胞毒性
根据制造商的指令使用来自西格玛公司的基于WST-8的细胞计数试剂盒8评估OP和Lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技公司，美国)的细胞毒性。将HeLa细胞在100μL的培养基中以每孔5,000个细胞的密度接种在96孔板中，并允许其在37℃和5％CO2下恢复24小时。通过在无菌PBS中进行连续稀释来制备OP(通过0.22μm膜过滤进行预灭菌)和Lipofectamine 2000样品。将总体积为10μL的样品添加到每个孔，以提供图15中所示出的最终浓度。作为阴性对照，每孔使用10μL的含10％Triton X-100的PBS。阳性对照仅是PBS。在将10μL的CKK-8试剂添加到每个孔之前，将细胞在5％CO2中在37℃下温育24小时或48小时。然后，在测量450nm处的吸光度之前，将板在37℃和5％CO2下温育4小时。将没有细胞的培养基中的CKK-8的吸光度用于背景减法，并将样品归一化成未经处理的细胞以提供图15中所示出的值。一式三份地测量样品。
通过流式细胞术的细胞摄取
将HeLa细胞在500μL的培养基中以每孔30,000个细胞的密度接种在24孔板中，并允许其在37℃和5％CO2下恢复24小时，以达到70-90％汇合。通过0.22μm膜过滤将OP蛋白质和Atto488-DNA两者灭菌，并在无菌PBS中制备储备液。对于每个孔，将20μL的含样品的PBS添加到200μL的培养基，以使Atto488-DNA的最终浓度为200nM。在用PBS洗涤并在37℃下进行4分钟的胰蛋白酶消化(0.05％胰蛋白酶-EDTA(赛默飞世尔科技公司，美国))前，将细胞在37℃下在5％CO2中温育24小时。在重悬于流式细胞术缓冲液(具有5％FBS和10μg/mL碘化丙锭的PBS)中之前，将细胞收集在冷培养基中，并用冷PBS洗涤两次。
通过共聚焦荧光显微镜检查的细胞摄取
将HeLa细胞以每孔15,000个细胞的密度接种在来自ibidi GmbH(德国)的带有ibiTreat表面的μ载玻片8孔隔室盖玻片中。在添加样品前，将细胞在37℃和5％CO2下在200μL的培养基中温育24小时。通过0.22μm膜过滤将OP蛋白质和Atto488-DNA两者灭菌，并在无菌PBS中制备储备液。对于每个孔，将10μL的含样品的PBS添加到100μL的培养基，以使Atto488-DNA的最终浓度为200nM。在用PBS洗涤并在37℃下用100μL的Hoechst 33342溶液(PBS含5μg/mL)进行核染色10分钟之前，将细胞在37℃下在5％C CO2 O2中温育24小时。然后，将细胞用PBS洗涤两次，并在37℃下在含5％FBS的PBS中进行显微镜检查。
GFP敲低
将HeLa-GFP细胞在500μL的培养基中以每孔30,000个细胞的密度接种在培养基中的24孔板中，并允许其在37℃和5％CO2下恢复24小时，以达到约70％汇合。在PBS中制备无菌蛋白质、RNA和Lipofectamine 2000样品。除Lipofectamine 2000对照之外，在添加300μL的全培养基之前，将所有样品(PBS含20μL)添加到200μL OptiMEM中的细胞，并在37℃和5％CO2下温育4小时。然后，将细胞在37℃和5％CO2下进一步温育，在样品添加与流式细胞术分析之间总共进行48小时。尽管在用于所有其它样品的条件下，Lipofectamine 2000的敲低效率改变可忽略不计，但是毒性是问题。因此，在不损害敲低效率的情况下，使用必要的最小量的Lipofectamine 2000，这使毒性最小。所述最小量被确定成每40pmol的siRNA 1μL的Lipofectamine 2000，这也是制造商推荐的最小量。然后，使用制造商推荐的方案，并在流式细胞术分析之前，将细胞在37℃和5％CO2下与siRNA脂质体(在PBS中预先制备的)在培养基中一起温育48小时。
在流式细胞术分析之前，直接在24孔板上进行荧光显微镜检查，以获得GFP表达水平的定向度量并评估细胞健康(图16)。然后，将细胞用PBS洗涤并胰蛋白酶化。在重悬于流式细胞术缓冲液(具有5％FBS和10μg/mL碘化丙锭的PBS)中之前，将细胞收集在冷培养基中，并用冷PBS洗涤两次。将未经处理的HeLa-GFP细胞(具有匹配的培养基和温育条件作为样品)用作阳性对照，将不表达GFP的HeLa细胞用作GFP荧光的阴性对照，以优化细胞仪设置。在许多情况下，用不同批次的蛋白质和siRNA至少一式三份地测量样品。
纯化没有His6标签的OP
如先前所报道的，使用硫酸铵沉淀(Beck,T.等人,《德国应用化学会刊(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》,2015,54,937-940)，但进行了修改，以优化对小RNA分子的去除。将来自800mL的培养物的每个细胞沉淀物重悬于10mL的缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、1000mM NaCl)中，补充溶菌酶(0.1mg/mL)、DNA酶I(10U/mL)、RNA酶A(5U/mL)和蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司)，并在37℃下温育1.5小时。裂解后，将悬浮液超声处理并离心(10,000×g，25℃，25分钟)。接下来，将上清液加热到65℃持续30分钟，并离心(10,000×g，4℃，25分钟)以沉淀变性的大肠杆菌蛋白质。将硫酸铵添加到上清液到其饱和浓度的70％，并将悬浮液离心(10,000×g，4℃，20分钟)。将蛋白质沉淀物重悬于20mL的缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、1000mM NaCl)中，并再次进行两次硫酸铵沉淀。最后，将沉淀出的蛋白质重悬于低盐缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、200mM NaCl)中，补充2U/mL RNA酶A、5mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物，并且然后在37℃下温育过夜，以消化任何污染物大肠杆菌RNA。然后，将蛋白质通过SEC纯化，这是在包含25mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH 5.5)、1000mM NaCl和250mM MgSO4的缓冲液中进行，以减弱任何其余的客体分子与蛋白质笼之间的相互作用。此后，将蛋白质在室温下储存在PBS缓冲液中。
通过tRNA进行的货物置换
首先，通过EMSA测定OP包封tRNA的能力(图17)。用20pmol的tRNA(来自德国的Fluka公司(Fluka)的小麦胚芽的转移RNA)在10μL的PBS中在有和没有OP(1.2摩尔当量)的情况下制备样品，并通过用GelRed染色的天然琼脂糖凝胶进行分析。基于HeLa细胞的平均体积、从单个细胞分离的RNA的质量以及总RNA(其是tRNA)的百分比来计算tRNA的细胞内浓度(Luby-Phelps,K.《国际细胞学评论(International Review of Cytology)》,编者：Walter,H.、Brooks,D.E.、Srere,P.A.,学术出版社(Academic Press):1999；第192卷,第189-221页；Lodish H,B.A.、Zipursky SL《分子细胞生物学(Molecular Cell Biology)》,第4版；W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman):纽约,2000)。这个估计未考虑细胞质、游离tRNA的相对级分或也可以被OP包封的其它分子内的分子拥挤的影响。对于置换测定，通过在室温下在PBS中温育1小时来制备OP与Atto488-DNA的双链体的复合物(1:1摩尔比)。然后，将储备液分成等分试样，以为每个凝胶通道提供样品。每个样品在总体积为10μL的PBS中含有10pmol的OP/核酸。接下来，在不同时间点处将2μL的浓缩tRNA储备液添加到样品，以使最终[tRNA]为26μM，并将样品在37℃下温育。然后，通过天然琼脂糖凝胶对样品进行分析，通过Atto488荧光使所述天然琼脂糖凝胶可视化(图4b)。
血清稳定性
通过在室温下在PBS中温育1小时来制备OP与siRNA的复合物(1:1摩尔比)。然后，将储备液分成等分试样，以为每个凝胶通道提供样品。每个样品在总体积为5μL的PBS中含有10pmol的OP/核酸。在不同的时间点处，将5μL的含20％胎牛血清的PBS添加到样品，并将所述样品在37℃下温育。然后，通过天然琼脂糖凝胶对样品进行分析，通过GelRed和考马斯蓝使所述天然琼脂糖凝胶可视化(图22)。
小角度X射线散射
在PETRA-III同步加速器的光束线P12(DESY，德国汉堡)处获得SAXS数据，其中X射线波长为1.24A。Pilatus 1M检测器被定位成距样品2m，以收集范围为0.028–6.7nm-1的散射矢量。在SAXS缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、200mM NaCl、5mM EDTA和10％甘油)中以不同浓度(0.5-5mg/mL蛋白质之间)测量样品，并将来自表现出最少聚集和噪声的样品的数据用于进一步分析。将所有样品针对SAXS缓冲液进行透析，以提供匹配良好的缓冲液空白。对于OP:dsDNA和OP:dsRNA，在针对SAXS缓冲液进行透析之前，将蛋白质笼与2当量的双链体一起温育过夜。使用PRIMUS16分析散射曲线，并使用AUTOGNOM计算对距离分布。
双链DNA的解离
为了验证hpDNA不会解离，从450nm到600nm，对800μL的含10nM Atto488-hpDNA溶液的PBS的荧光光谱进行测量。随后，将50nM OTR501添加到每个样品，并在记录另一个光谱之前，在600秒内跟踪荧光衰减。将相同的程序应用于dsDNA的10nM溶液(Atto-488ssDNA和Luc-g)、dsDNA与8M尿素的10nM溶液和Atto-488ssDNA和GFP-g的10nM溶液。
实例2-蛋白质和核酸序列
使用SIB生物信息学资源门户工具计算(http://web.expasy.org/protparam/)蛋白质在280nm处(ε280,M-1cm-1)的分子量(MW)、等电点(pI)和消光系数。
表1：多肽序列在280nm(ε280)处的其分子量(MW)和消光系数
SDS-PAGE和考马斯蓝可视化示出不同的迁移率，这是由于蛋白质OP和OTR101到OTR503的迁移率不同而引起的。这证明所有蛋白质都具有约20kDa的相同重量，并且所有变体具有适当纯度。
表2：寡核苷酸序列
分别地，大写字母表示脱氧，并且小写字母表示核糖核苷酸。A488是指在固相合成期间偶联的荧光团Atto488亚磷酰胺。
实例3-纳米颗粒的结构表征
作为起始支架，发明人选择O3-33，一种由Baker和其同事计算设计的自组装蛋白质笼(King,N.P.等人,具有原子水平准确度的自组装蛋白质纳米材料的计算设计(Computational Design of Self-Assembling Protein Nanomaterials with AtomicLevel Accuracy).《科学》2012,336,1171-1174)，其是非功能性蛋白质笼和没有在细胞内包封或递送大分子的能力的经简单计算设计的支架。
为了允许货物装载，发明人引入与O3-33的结合相互作用。用精氨酸替换氨基酸Thr11、Pro39、Glu66、Trp103、Phe130和Leu163以创建具有高度带正电的内部腔的O3-33变体(本文中被称为OP)(图1b、5)。OP蛋白质可以在大肠杆菌细胞中过表达，并通过Ni-NTA亲和色谱法通过C端His6标签进行分离(图6)。由于内部腔高度带正电，因此内源大肠杆菌RNA造成严重污染。然而，这些RNA污染很容易用高离子强度缓冲液去除以减弱静电相互作用，并用RNA酶A去除以消化污染物RNA(参加材料与方法、OP的细胞裂解、Ni-NTA和RNA去除)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)、动态光散射(DLS)和天然琼脂糖凝胶电泳(AGE)对OP形成期望的笼状四级结构(图1a)的能力进行评估(图7、8)。所有数据均与具有与O3-33笼相同的尺寸的组装件的形成一致。此外，通过TEM无法区分OP和O3-33(图1c、9)，并且X射线衍射证实在约8nm直径的腔中添加144个精氨酸对单体折叠和笼结构的影响可忽略不计(图1d)。每种单体的所有Cα原子的均方根偏差为
此外，通过SEC、AGE和TEM对OP变体OTR101到OTR503的表征示出所有OP变体的结构均与OP相同。
实例4-核酸货物装载
在所建立的空蛋白质笼具有结构完整性的情况下，在体外对核酸货物装载进行了研究。直径为2nm的DNA和RNA双链体能够穿过直径约3.5nm的孔，从而进行包封。电泳迁移率转变测定(EMSA)揭示亲本O3-33笼对Atto488-ssDNA(带21nt Atto488标记的单链(ss)DNA)的电泳迁移率没有影响(图10)。相比之下，观察到OP的蛋白质条带和DNA条带的共定位(图2a)。还对双链(ds)DNA和dsRNA与OP的结合进行了评估(图11)，从而提供类似于ssDNA的结果。在所有情况下，在添加0.5当量的OP后观察到寡核苷酸的近乎完全结合，这表明每个笼有两个客体。根据OP与ssDNA、dsDNA或dsRNA的经过SEC纯化的复合物的A260/A280比率证实这个化学计量(图2b和12，表3)。
表3：经过SEC纯化的OP:核酸复合物的吸光度和计算的每个笼的客体数量
| 样品 | A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>比率 | 每个笼的客体 |
| OP | 0.64 | -/- |
| OP:ssDNA | 1.21 | 2.05 |
| OP:dsDNA | 1.29 | 1.98 |
| OP:dsRNA | 1.40 | 1.97 |
实例5-结合动力学
将DNA缀合的荧光团Atto488的包封诱导的荧光淬灭用于通过荧光测定法测定结合动力学(图13)。缔合速率常数kon＝(6.6±0.6)×105M-1s-1(图2c)和解离速率常数koff＝(1.6±0.1)×10-4s-1(图2d)用于计算这个蛋白质-DNA复合物的解离常数Kd＝(2.4±0.3)x10-10M。这个Kd值比针对病毒中的RNA-蛋白质相互作用所报道的Kd值低两个数量级(10-8-10-7M)，并且在最紧密的结合转录因子范围内(10-15-10-10M)。必须注意的是，这种人工系统的关键区别在于缺乏序列特异性，这对于递送装置而言是有利的，因为其允许包装任何期望的核苷酸序列和保留负电的寡核苷酸化学修饰。
任何核酸递送系统的重要作用是保护其货物免受核酸酶降解。因此，进行了三种核酸酶的消化测定：DNA酶I(30kDa)、RNA酶A(14kDa)和benzonase50(60kDa)。AGE(图14)揭示来自较大酶的保护。只有RNA酶A能够进入笼并消化货物。这些核酸酶测定数据证实动力学研究，从而表明客体以可忽略不计的解离速率紧密结合在内腔中。
在具有许多核酸递送载体(如阳离子脂质和聚合物)的情况下，必须在转染效率与细胞毒性之间做出折衷。使用WST-8在24小时内测量HeLa细胞的体外细胞毒性以定量脱氢酶活性(图15，表6)。OP示出可忽略不计的毒性，至多400nM笼(193μg/mL蛋白质)。这些结果与在上文所描述的测定条件下以低19倍的质量浓度(10μg/mL)将细胞活力降低到35％-45％的通常使用的转染试剂Lipofectamine 2000(阳离子脂质)相比具有优势。
表6：不同浓度的OP和Lipofectamine 2000在HeLa细胞中的细胞毒性
| 样品 | 浓度(μg/mL) | 活力(％) |
| PBS | n/a | 100.0±0.8 |
| Triton | n/a | 7.4±0.2 |
| Lipofectamine | 0.6 | 98.1±8.7 |
| Lipofectamine | 1.3 | 91.2±1.4 |
| Lipofectamine | 2.5 | 76.8±8.1 |
| Lipofectamine | 5 | 51.0±5.9 |
| Lipofectamine | 10 | 34.2±0.9 |
| OP | 12 | 96.7±5.4 |
| OP | 24 | 99.0±10.9 |
| OP | 48 | 96.9±2.0 |
| OP | 96 | 94.6±3.2 |
| OP | 193 | 99.5±4.8 |
实例6-细胞摄取和货物释放
此外，使用流式细胞术和共聚焦荧光显微镜检查(CFM)以Atto488-ssDNA货物作为探针研究了本发明的纳米颗粒进入细胞并递送其核酸货物的能力。用包装在OP笼内的200nM的游离Atto488-ssDNA或Atto488-ssDNA处理七种不同的细胞系(包含HeLa细胞)，并通过流式细胞术测量细胞荧光。中值荧光强度的绘图示出了所测试的七种细胞系中的六种细胞中的OP笼的有效细胞摄取(图3a-c)。在HeLa细胞中，示出这些细胞的ssDNA的细胞摄取与背景相比提高几乎30倍，并递送到多于90％的HeLa细胞。观察到Vero细胞和HepG2细胞的作用甚至更大。为了证实这个发现，对用游离Atto488-ssDNA或Atto488-ssDNA装载的OP笼处理的细胞进行了CFM(图16)。用游离Atto488-DNA处理的细胞没有表现出明显荧光，而用OP:Atto488-DNA处理的细胞的细胞内荧光定位于许多强烈病灶中，从而证实了高摄取效率(图3b)。这些点状结构表明通常在这种尺寸范围内观察到的纳米颗粒的内吞作用。
实例7-基因表达的调节
可以在不需要另外的转染剂的情况下递送功能性核酸货物的非病毒递送系统的报道很少。在确认OP笼的细胞摄取较高的情况下，使用稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的HeLa细胞作为模型来测量蛋白质表达对笼递送siRNA和调节基因表达的能力进行测试。使用Lipofectamine2000作为阳性对照，将表达GFP的HeLa细胞用裸siRNA、OP包封的siRNA、空OP笼和装载有经过扰乱的序列siRNA的OP笼处理。为了测定基因敲低效率，通过荧光显微镜检查(图16)定性测量并通过流式细胞术(图4a)定量测量GFP荧光。用20pmol的OP包装的siRNA处理并温育48小时后，观察到GFP荧光降低约70％，功效在Lipofectamine2000的范围内。此外，由于OP的毒性显著降低，因此细胞活力相对于在这些测定中浓度为2.5μg/mL的商业试剂(图16)有所改善。装载有经过扰乱的序列siRNA的OP笼缺乏效果证实，表达水平不是由于抗病毒干扰素途径机制的诱导，而是靶mRNA特异性。
实例8-His6标签和高细胞溶质浓度的RNA有助于ON递送效率
成功诱导RNAi需要将siRNA递送到细胞质。因此，上文所提到的数据表明OP笼可以实现内体逃逸并释放其货物。不受任何理论的束缚，发明人提出了两种解释：
首先，由于质子海绵效应和质子化的组氨酸透化内体膜的能力，富含组氨酸的肽促进内体逃逸的能力已被充分证明。由于每个OP单体具有His6标签，因此完整的24聚体笼在其外部呈递总共144个组氨酰基残基。为了测试这是否影响siRNA递送，发明人产生了没有His6标签的OP的变体，并对其RNAi活性进行了测定(材料与方法、纯化没有His6标签的OP)。在相同的实验条件下，观察到GFP荧光仅降低约40％(图4a)，这指示His6标签确实有助于递送效率。
其次，货物分子在细胞质中的释放可以从图2d中所示出的动力学参数的角度得到解释。尽管OP-核酸复合物是稳定的，但是在存在高浓度的竞争性客体分子的情况下，包封是可逆的。因此，发明人期望tRNA的高细胞溶质浓度可以提供针对siRNA货物的位置特异性释放机制，从而将其释放用于RNAi诱导的基因敲低。这个假设在体外得到验证：将含有A488-dsDNA的OP笼在37℃下在PBS中用细胞内浓度的tRNA(26μM)处理，并观察到货物在6小时内的时间依赖性释放(图4b和19)。对于作用于细胞质中的mRNA的寡核苷酸，利用细胞溶质的物理化学特性为货物释放提供简单的解决方案。
相反，用10％胎牛血清进行的相同实验示出货物没有释放或降解(图22)。
实例9-纳米颗粒的蛋白质晶体学
表5：数据收集和细化统计
*一个晶体用于数据收集。*括号中的值针对最高分辨率壳。
实例10-OP和其变体OTR101到OTR503
单链DNA装载的体外研究
为了测试OP的不同变体OTR101到OTR503是否可以装载ssDNA，在电泳转变测定(EMSA)中研究了它们与ssDNA的相互作用。由此，预期将观察到结合变体的DNA条带和蛋白质条带的共定位，而ssDNA条带迁移率将不受非结合变体的影响。如图26中所看到的，观察到每个单体含有最少三个精氨酸突变的所有研究变体的这种共定位，而每个单体含有一个或两个精氨酸以及O3-33的所有研究变体未导致Atto488-ssDNA条带的任何转变。
变体与OP相比的结合动力学
研究了从EMSA获得的结果是否可以在荧光测定的框架内得到验证。如图27中所展示的，确实可以得出结论，具有两个或更少精氨酸的变体不结合ssDNA。此外，可以看出，对应于衣壳的淬灭作用的荧光的相对下降随静电贡献的增加而增加。
下表7中示出了每个单体具有三个或更多个精氨酸突变的所有变体与ssDNA结合的动力学参数。
表7：结合ssDNA的动力学参数汇总
双链DNA装载的体外研究
已经示出具有三个、四个或五个精氨酸的OP蛋白质变体能够装载ssDNA，尤其是因为双链siRNA与生物医学应用更为相关，所以dsDNA的装载能力将受到关注。对于所有dsDNA测量，使用在两条互补链之间含有四个核碱基的环区的发夹DNA(hpDNA)。选择hpDNA是为了避免dsDNA中的两条互补链的解离。
在开发基于荧光测定法的测定之前，通过EMSA对结合ssDNA的所有变体的货物装载进行了研究(图28)。发现变体OTR402、OTR501、OTR502、OTR503和OP结合hpDNA，而OTR301、OTR302和OTR401并非如此。因此，仅对ssDNA具有10-10M-1的最大结合亲和力的衣壳变体也可以结合dsDNA/hpDNA。
下表8中示出了每个单体具有5个或更多个精氨酸突变的所有变体与hpDNA结合的动力学参数。
表8：动力学参数汇总。缔合速率常数kon和解离速率常数koff用于确定解离常数Kd。
实例11-外部展示的富含组氨酸的肽的变化
已经示出在C端处每个单体蛋白质携带一个六组氨酸标签的OP笼有效逃避内体诱捕并且由此将其siRNA货物成功释放到细胞的细胞质以进行基因敲低。产生携带包含与C端融合的3个、6个或9个组氨酸的组氨酸标签的OP笼的变体，并参考含有6个组氨酸标签的OP笼对基因敲低活性进行测定。如图29所示出的，所有三种变体都示出将siRNA递送到哺乳动物细胞中并降低靶蛋白(在这种情况下为GFP)的表达水平的相同能力。另外地，通过测试变体OP-cODC的基因沉默活性对六组氨酸标签的位置的重要性进行研究。在六组氨酸标签后，OP-cODC含有38个氨基酸的C端附肢。如图29中所示出的，这消除了含有OP笼的siRNA的基因敲低能力，这可能是通过干扰六组氨酸标签的内体逃逸机制来实现的。
实例12-OP笼在小鼠中的免疫原性
两组四只BALB/c小鼠在第0天、第16天和第38天通过尾静脉注射接受1或10μg的含OP颗粒的PBS，并在第0天、第14天、第29天、第52天和第73天收集血液。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行对血清中的OP特异性IgG1、IgG2a和IgG2b的评估。简而言之，将两倍稀释系列的小鼠血清样品应用于经过OP涂覆的多孔免疫板(西格玛公司M9410)，然后通过针对不同IgG同种型(艾博抗公司(Abcam)ab97238/ab97243/ab97248)的生物素化抗鼠抗体进行检测。使用抗生蛋白链菌素-HRP(Biolegend公司(Biolegend)405210)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，Biolegend公司77247/77248)作为显色底物进行比色显影。在450nm处测量显色底物的光密度，并针对血清样品的稀释度进行绘制(图30)。选择1/2000稀释液用于比较每个时间点处的免疫应答(图31)。在所有注射后，确定升高的抗OP IgG滴度以及剂量依赖性应答(图31)。在第二次加强免疫后一个月的第72天，IgG滴度示出轻微的回缩。这项研究示出，OP颗粒诱导特异性免疫应答。
Claims (15)
1.一种多肽，其包括由以下组成的氨基酸序列I：
MX13QAIGILELX1SIAAGMELGDAMLKSAX14VX15LLVSKTISX2GKFLLMLGGDIX8AIX9X12AIX10TGTX11QAGX3LLVDSLVLAX16IHPSVLPAIX17GX18NX19VX20X7X21QAVGIVETX4SVAACISAADX22AVX23GSX24VTLVRVHMAX5GIGGKCYMVVAGDVSDVALAVTVASSSAGAYGX6LVYASLIPX25PHX26AMWX27QMVX28GX29E(SEQ IDNO:1)，
其中X1到X29中的任何一个彼此独立地是氨基酸，条件是X1到X6中的至少3个彼此独立地是带正电的氨基酸，并且其中除SEQ ID NO:1中的X1到X29所表示的位置之外的位置处的任选地至多5个氨基酸由任何氨基酸交换。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地选自由以下组成的组：精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸和硫代赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中X1到X6中的所述至少3个的所述带正电的氨基酸彼此独立地是精氨酸或赖氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中X1到X6中的至少4个是带正电的氨基酸，优选地X1到X6中的至少5个是带正电的氨基酸，更优选地X1到X6中的每一个是带正电的氨基酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中X7是半胱氨酸、其保守取代或带正电的氨基酸；优选地，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、精氨酸、5-甲基-精氨酸、c-γ-羟基精氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、2-氨基-3-胍基丙酸、刀豆氨酸、高精氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、(2s)-2,8-二氨基辛酸、鸟氨酸、硫代赖氨酸和丝氨酸；更优选地，X7选自由以下组成的组：高半胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中
X8是甘氨酸或其保守取代；
X9和X12彼此独立地是谷氨酰胺、天冬酰胺或其保守取代；
X10是谷氨酸酯、天冬氨酸酯或其保守取代；并且
X11是丝氨酸或其保守取代。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中
X13、X17和X19彼此独立地是丝氨酸或其保守取代；
X14、X16和X24彼此独立地是天冬酰胺、谷氨酰胺或其保守取代；
X15、X20、X26和X28彼此独立地是天冬氨酸酯、谷氨酸酯或其保守取代；
X18和X29彼此独立地是亮氨酸或其保守取代；并且
X21、X22、X23、X25和X27彼此独立地是精氨酸、赖氨酸或其保守取代。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列I是选自由SEQ IDNO:2到5和SEQ ID NO:10到16、37和38组成的组的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步包括组氨酸标签，其中所述组氨酸标签由至少两个连续连接的组氨酸组成(His标签)，优选地所述His标签由6个连续连接的组氨酸组成(His6标签)。
10.一种核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项所述的多肽。
11.一种纳米颗粒，其包括至少一种根据前述权利要求中任一项所述的多肽。
12.一种复合物，其包括根据权利要求11所述的纳米颗粒和一个或多个货物分子，其中所述一个或多个货物分子被包封在所述纳米颗粒中。
13.根据权利要求12所述的复合物，其中所述一个或多个货物分子是一个或多个寡核苷酸，优选地所述一个或多个寡核苷酸是选自由以下组成的组的RNA：反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和抗miRNA。
14.根据权利要求12或13所述的复合物，其中包封在所述纳米颗粒中的所述一个或多个寡核苷酸不易于DNA酶水解。
15.一种用于转染细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求12到14所述的复合物接触的步骤。
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