CN110420331B

CN110420331B - Alkbh5抑制物在治疗病毒感染性疾病中的应用

Info

Publication number: CN110420331B
Application number: CN201910769938.2A
Authority: CN
Inventors: 刘洋; 曹雪涛
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-20
Also published as: CN110420331A

Abstract

本公开涉及去甲基化酶AlkB同系5(ALKBH5)抑制物在治疗病毒感染性疾病中的应用。具体而言，本公开涉及针对ALKBH5抑制物在制备用于治疗病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途，及其相应的药物组合物或药盒。本公开可用于抑制和治疗病毒感染，尤其可用于天然免疫功能异常对象，具有广泛的应用前景。

Description

ALKBH5抑制物在治疗病毒感染性疾病中的应用

技术领域

本公开属于生物技术和医学领域。具体而言，本公开涉及去甲基化酶AlkB同系5(AlkB homolog 5，RNA demethylase，ALKBH5)的抑制物在治疗病毒感染性疾病中的应用。

背景技术

病毒感染会引起多种疾病并威胁人类健康。研究病毒-宿主互作的机制有助于深入了解毒感染过程及其调控分子机理，并为预防与治疗病毒感染性疾病提供新的药物靶点。

天然免疫受体可以通过识别感染宿主细胞的病毒来活化下游信号通路中的激酶TBK1与转录因子IRF3等，由此诱导机体产生干扰素(Interferon，IFN)并激活抗病毒效应基因的表达以抵抗与清除病毒(Schneider WM等，Annual review of immunology,2014,32:513-545)。

尽管干扰素已被应用于临床上一些病毒感染性疾病的治疗，但该治疗策略存在一定的弊端。例如，干扰素治疗仅对特定类型的病毒感染性疾病有效，其有效率有待提高，也会因出现干扰素抗性而影响治疗效果。同时，干扰素治疗应用也会产生流感样综合征、脱发等副作用。此外，干扰素能够诱导自身免疫性疾病与炎症的发生(Kretschmer S等，CurrOpin Immunol,2017,49:96-102)。

因此，研究宿主如何通过天然免疫/干扰素应答之外的方式来影响病毒感染，并寻找经典抗病毒机制之外的调控因子，是当前面临的关键科学问题，对于临床治疗病毒感染性疾病有重要意义。

除了上述经典抗病毒免疫应答机制之外，表观修饰也能够通过多种作用方式参与调控病毒的感染。表观调控在病毒-宿主互作过程中扮演着重要的角色，可逆的表观修饰变化可以通过诱导或增强快速的表型变化来有利于病毒扩增或帮助宿主抵御病毒感染。多种类型的表观调控因子均能够以不同的机制参与调控宿主对病毒感染的应答过程。例如，DNA甲基转移酶Dnmt3a可以通过上调组蛋白去乙酰化酶HDAC9的表达来维持TBK1的乙酰化状态与酶活性，从而增强抗病毒天然免疫应答并提高IFN-I的产生(Li X等，Natureimmunology,2016,17(7):806-815)。

RNA修饰，尤其是哺乳动物mRNA上存在最普遍的一种称为m⁶A的修饰，是近年来表观调控领域的一个重要研究方向。mRNA上动态的m⁶A修饰改变是通过一些m⁶A甲基转移酶样3/14(Methyltransferase-like 3/14，METTL3/14)、去甲基化酶AlkB同系5(AlkB homolog5，RNA demethylase，ALKBH5)和脂肪量与肥胖相关蛋白(Fat mass and obesityassociated protein，FTO)，以及m⁶A特异性结合蛋白来对其进行转录后水平的组装、去除以及识别，从而实现对基因表达的调控(Roundtree IA等,Cell,2017,169(7):1187-1200)。相对于转录水平的调控，通过对mRNA转录后修饰水平的调控可以帮助宿主细胞更加快速地应对外部信号与环境刺激。m⁶A参与调控包括发育、免疫应答、肿瘤等多个生物学过程(FryeM等,Science,2018,361(6409):1346-1349)。然而，m⁶A RNA修饰相关酶在病毒感染中的作用还有待进一步研究。

RNA m⁶A去甲基化酶ALKBH5主要高表达于小鼠的睾丸与肺脏中，该基因的缺失会降低小鼠精子形成以及生殖能力(Zheng G等,Mol Cell,2013,49(1):18-29)，并报道与肿瘤的形成与预后相关(Zhang S等,Cancer Cell,2017,31(4):591-606；Cho SH等,AnnHepatobiliary Pancreat Surg.2018,22(4):305-309)。然而，ALKBH5在病毒感染过程中发挥怎样的作用，其是否通过调控天然免疫因子干扰素的产生来影响病毒的复制与感染等问题还有待深入探究。

目前，国内外尚无有关RNA m⁶A去甲基化酶ALKBH5在宿主应答病毒感染的调控机制与病毒相关性疾病中治疗应用方面的研究报道。而本领域迫切需要寻找到病毒感染性疾病治疗的潜在重要靶标分子，通过明确其与病毒感染性疾病的关联，以推广与加强该靶标分子在临床治疗中的应用。

发明内容

本公开的主要目的之一在于揭示ALKBH5与病毒感染之间的相关性，并提供采用ALKBH5抑制物来治疗病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的疾病和/或症状的应用、方法和产品。

在本公开的一个方面中，提供了ALKBH5抑制物在制备用于治疗对象中病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的疾病和/或征状的产品中的用途。

在本公开的一个方面中，提供了ALKBH5抑制物，其用于治疗对象中病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的疾病和/或征状。

在本公开的一个方面中，提供了治疗对象中病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的疾病和/或征状的方法，所述方法包括给予有需要的对象治疗有效量的ALKBH5抑制物。

在一些实施方式中，所述ALKBH5抑制物选自：针对ALKBH5蛋白、用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子或它们的前体的抑制物。

在一些实施方式中，所述ALKBH5抑制物选自：针对ALKBH5的抗体、siRNA(例如选自SEQ ID NO:1-8的siRNA)、miRNA、反义寡核苷酸、CRISPR/Cas9基因编辑产品(例如选自SEQID NO:11-12的sgRNA)、拮抗剂、阻断剂、抑制ALKBH5功能和/或酶活性的小分子化合物、下调ALKBH5基因或mRNA或蛋白表达水平的启动子元件、表达载体。

在一些实施方式中，ALKBH5抑制物选自：天然纯化的多肽或核酸分子、化学合成的产物、使用重组技术从原核或真核宿主中产生、使用杂交瘤技术产生。所述宿主选自：细菌、酵母、高等动物和哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，ALKBH5抑制物针对人ALKBH5。

在一些实施方式中，ALKBH5蛋白选自：

(a)具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的多肽；

(b)由选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、NCBI Gene ID:268420或NCBI Gene ID:54890的核酸分子表达的多肽；

(c)与(a)或(b)中多肽的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽；或

(d)(a)或(b)或(c)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽。

在一些实施方式中，用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子选自：

(i)选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、NCBI Gene ID:268420或NCBI Gene ID:54890的核酸分子；

(ii)在严格条件下与(i)限定的核酸分子杂交的核酸分子；

(iii)与(i)或(ii)所示的核酸分子核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽的核酸分子；

(iv)由(i)或(ii)或(iii)的核酸分子经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽的核酸分子。

在一些实施方式中，ALKBH5前体选自：经加工能产生如上所述的ALKBH5蛋白或核酸分子的多肽分子或核酸分子。

在一些实施方式中，感染为DNA病毒和/或RNA病毒感染，例如由选自下组的一种或多种病毒引起的感染：单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、脑心肌炎病毒、仙台病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、痘病毒、小DNA病毒、腺相关病毒。

在一些实施方式中，与病毒感染相关的疾病和/或征状为选自下组中的一种或多种：病毒感染引起的病理损伤；病毒感染后细胞因子(如干扰素)产生不足或过量；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭，例如所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠；病毒感染导致的慢性炎症性疾病(例如自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病)。

在一些实施方式中，所述对象为哺乳动物，例如人、宠物、家畜。

在一些是实施方式中，所述对象选自：天然免疫缺陷/受损的对象，和/或干扰素抗病毒感染治疗无效或效果不佳或易产生副作用的对象，例如患有自身免疫性疾病或易患自身免疫性疾病的对象，IFN功能不全或过激对象，例如患有炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病的对象。

在一些实施方式中，所述产品为药物组合物或药盒，例如其形式适于通过选自下组方式给予的药物组合物或药盒：口服、注射(例如直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药、瘤内给药。

在一些实施方式中，产品还包含用于预防和/或治疗病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的疾病和/或征状的其他物质，例如选自下组中的一种或多种：临床常用抗生素，包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素；临床常用抗病毒药物(三环胺类、焦磷酸类、蛋白酶抑制药、核苷类药物及干扰素、反义寡核苷酸类等)；临床常用免疫抑制剂(包括糖皮质激素、环磷酰胺、氯喹、环孢霉素A、雷公藤、中药制剂、抗TNF单克隆抗体)。

在本文的另一方面中，提供了一种药物组合物或药盒，其包含：

(A)治疗有效量的ALKBH5抑制物；

(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；

(C)可任选地，一种或多种预防或治疗病毒感染性疾病或与病毒感染相关的病症和/或征状的其它活性物质。

在一些实施方式中，所述ALKBH5抑制物以及其他物质如本公开上下文中所述。

在一些实施方式中，ALKBH5抑制物占在药物组合物或药盒总重量的0.001～99.9wt％。

在一些实施方式中，ALKBH5抑制物占在药物组合物或药盒总重量的1～95wt％，5～90wt％，10～80wt％，余量为药学上可接受的载体、其他活性物质或可能存在的其它添加剂等物质。

在一些实施方式中，在给予本公开的药物组合物或药盒之前、同时或之后，给予调控抗病毒感染的其它活性物质。所述其它活性物质具有预防或治疗与病毒感染相关的疾病、感染导致的损伤、感染导致的慢性炎症性疾病和/或其征状的活性。所述病毒感染为DNA病毒和/或RNA病毒感染，例如由选自下组的一种或多种病毒引起的感染：单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、脑心肌炎病毒、仙台病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、痘病毒、小DNA病毒、腺相关病毒。

在本公开的一个方面中，提供了一种筛选通过抑制ALKBH5来抗病毒感染的药物的方法，其包括：

(A)用候选物质处理被感染的细胞、组织或动物；

(B)检测所述细胞、组织或动物中ALKBH5的水平或活性；以及

(C)若所检测到的ALKBH5水平或活性低于候选物质处理前的ALKBH5水平或活性或低于正常对照中的ALKBH5水平或活性且所述细胞、组织或动物的病毒感染受到控制或被抑制，则表明所述候选物质可作为通过抑制ALKBH5来抗病毒感染的候选药物。

在一些实施方式中，所述ALKBH5水平为其DNA、mRNA或蛋白质水平。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本公开的发明构思和保护范围。本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本公开作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。图中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001，“****”表示P<0.0001，“NS”表示无显著性差异(双尾非成对学生t检验，Two-tailed unpaired Student’s t-test)。

图1：ALKBH5在小鼠巨噬细胞中促进病毒感染：

A：采用干扰RNA(siRNA)在小鼠巨噬细胞中敲低ALKBH5可抑制病毒复制；

B：CRISPR/Cas9敲除小鼠ALKBH5基因的single-guide RNA(sgRNA)设计与序列；

C：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小鼠免疫细胞ALKBH5前后以免疫印迹法检测ALKBH5的表达；

D：ALKBH5敲除(KO)的小鼠巨噬细胞相比对照细胞(WT)中病毒含量降低。

图2：ALKBH5基因敲除对病毒感染的小鼠存活率与体内病毒含量影响：

A：ALKBH5基因敲除提高病毒感染小鼠的存活率；

B：ALKBH5基因敲除降低小鼠体内的病毒滴度；

C：ALKBH5基因敲除减缓病毒感染引起的小鼠肺损伤。

图3：ALKBH5在小鼠体内促进不同类型RNA病毒与DNA病毒的复制。

图4：ALKBH5促进病毒复制的作用不依赖于干扰素应答：

A：ALKBH5敲除导致体外不同病毒感染所诱导的干扰素表达量下调；

B：ALKBH5敲除降低小鼠血清中不同RNA病毒与DNA病毒感染所诱导的干扰素产生。

图5：ALKBH5不影响VSV病毒RNA上的m⁶A修饰水平。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究发现：ALKBH5在体内与体外均具有广泛促进不同类型病毒感染与复制的作用，表明将ALKBH5蛋白及其相关基因产物作为控制病毒感染的有效治疗靶点的潜在临床应用价值。通过针对ALKBH5设计的小干扰RNA与CRISPR/Cas9基因编辑技术，或者ALKBH5和/或其基因的抑制剂与抗体来阻止ALKBH5表达或发挥功能，可以抑制病毒复制来保护机体免受病毒感染。同时，其它抑制ALKBH5功能、酶活性的小分子化合物的开发，以及下调ALKBH5基因、mRNA和蛋白表达水平的相关启动子元件、表达载体的制备也具有相当应用价值。

通过所展示的结果证明以ALKBH5作为药物靶点对于未来在临床上的病毒感染性疾病治疗应用潜力，尤其是对于天然免疫功能失调的病人具有非常大的指导意义。该策略的另一个优势在于，采用ALKBH5阻断法治疗可以避免造成干扰素的过量产生，以及避免天然免疫激活所引起的炎症性自身免疫性疾病。因此，靶向ALKBH5的方法具有较强的普适性与安全性。

据此，本公开涉及ALKBH5与病毒感染的相关性，及其抑制剂通过天然免疫非依赖性作用达到抗病毒效果的应用。具体而言，本公开涉及ALKBH5抑制物(例如针对ALKBH5蛋白、编码该蛋白质的核酸分子的抑制物，如针对ALKBH5的小干扰RNA与CRISPR/Cas9基因编辑产品、特异性抗体等)在制备用于预防和/或治疗感染性疾病和/或与感染相关的疾病和/或症状的产品中的用途，其相应的治疗方法、产品。本公开可用于预防和治疗病毒感染性相关疾病，具有广泛的应用前景。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本公开提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

ALKBH5蛋白(多肽)

如本文所用，术语“ALKBH5多肽”、“ALKBH5蛋白”可互换使用，是指RNA m⁶A去甲基化酶AlkB同系5(AlkB homolog 5，RNA demethylase)。该多肽在本领域中是已知的，例如其在小鼠[Mus musculus(house mouse)]中对应于NCBI Gene ID：268420，其氨基酸序列可如SEQ ID NO:20所示；其在人[Homo sapiens(human)]中对应于NCBI Gene ID：54890，其氨基酸序列可如SEQ ID NO:22所示。

本公开的ALKBH5蛋白可为(a)具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的多肽；(b)由选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、NCBI Gene ID:268420或NCBI Gene ID:54890的核酸分子表达的多肽；(c)与(a)或(b)中多肽的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽；或(d)由(a)或(b)或(c)的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽。同源多肽可通过例如本领域已知的数据库或比对软件获得。

本公开的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本公开中ALKBH5蛋白或多肽优选由人ALKBH5基因或其同源基因或家族基因编码。

本公开蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ALKBH5蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗ALKBH5蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子

如本文所用，术语“用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子”涵盖了术语“ALKBH5基因”、“ALKBH5编码序列”或“ALKBH5蛋白编码序列”、“编码ALKBH5蛋白/多肽的核酸分子”等，是指可由其获得本公开所述的ALKBH5蛋白或多肽的核酸分子。所述核酸分子可为例如基因组DNA序列(例如可参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000077.6？from＝60537683&to＝60558512&report＝genbank(小鼠，Mus musculus)或https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000017.11？from＝18183828&to＝18209954&report＝genbank(智人，Homo sapiens))、转录组mRNA序列或其前体或变体。

在本文中，用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子可选自：(i)SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、NCBI Gene ID:268420或NCBI Gene ID:54890的核酸分子；(ii)在严格条件下与(i)限定的核酸分子杂交的核酸分子；(iii)与(i)或(ii)所示的核酸分子核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽的核酸分子；(iv)由(i)或(ii)或(iii)的核酸分子经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽的核酸分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本公开的核酸分子优选获自人，或来自其它动物且与人ALKBH5基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它基因也在本公开考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

ALKBH5抑制物

如本文所用，术语“ALKBH5抑制物”是指可降低ALKBH5多肽或核酸分子或其前体的水平或活性的物质。可用于本公开中的抑制物包括但不限于，针对ALKBH5蛋白、用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子或它们的前体的抑制物。可用于本公开中的抑制物包括但不限于，针对ALKBH5的抗体、siRNA(例如选自SEQ ID NO:1-8的siRNA)、miRNA、反义寡核苷酸、CRISPR/Cas9基因编辑产品(例如选自SEQ ID NO:11-12的sgRNA)、拮抗剂、阻断剂、抑制ALKBH5功能和/或酶活性的小分子化合物、下调ALKBH5基因或mRNA或蛋白表达水平的启动子元件、表达载体。

本公开的抑制物可通过天然免疫非依赖性途径，有效阻断或抑制ALKBH5对多种类型病毒的复制、增殖和感染的促进作用，避免了因天然免疫依赖性治疗造成的干扰素过量产生以及因天然免疫激活所引起的炎症性自身免疫性疾病。因此，本公开的抑制物和方法具有较强的普适性与安全性。

天然免疫(或干扰素)非依赖性抗病毒方式

如背景部分中所述，在病毒感染过程中，天然免疫受体可以通过识别感染宿主细胞的病毒来活化下游信号通路中的激酶TBK1与转录因子IRF3等，由此促进机体产生干扰素(Interferon，IFN)以激活一系列干扰素诱导性基因的表达，从而抵抗与清除病毒。其中，I型干扰素(Type I IFN，包括IFN-α和IFN-β)是机体抵抗病毒感染的关键性天然免疫细胞因子，经典的抗病毒机制主要通过上调I型干扰素的表达。

然而依赖于干扰素的临床病毒感染性疾病治疗存在一定的弊端。例如，干扰素治疗仅对特定类型的病毒感染性疾病有效，其有效率有待提高；机体会因出现干扰素抗性而影响治疗效果；干扰素治疗应用也会产生流感样综合征、脱发等副作用；干扰素能够诱导自身免疫性疾病与炎症的发生(Kretschmer S等，Curr Opin Immunol,2017,49:96-102)。

因此，寻求天然免疫/干扰素应答非依赖性调控病毒感染的新靶标和方法对于临床治疗病毒感染性疾病有重要意义。

本公开中的具体试验显示敲低或敲除ALKBH5可以在细胞或小鼠体内广泛地抑制不同类型病毒感染与复制，并且这一过程同时伴随着I型干扰素表达量的降低。这证明了ALKBH5的敲低或缺失不通过促进干扰素表达这一经典的抗病毒天然免疫机制来抑制病毒感染，即ALKBH5促病毒感染的作用是天然免疫/干扰素应答非依赖的。这一发现为了解天然免疫非依赖的细胞防御方式和清除病原体机制提供了新的视角。

采用ALKBH5抑制物类似治疗病毒感染性疾病和/或其相关病症相较其他天然免疫或IFN依赖性药物具有突出的优势，从而具有巨大的应用潜力。这些优势可包括但不限于：

(1)在采用靶向抑制ALKBH5的策略进行抗病毒治疗时，并不会增强干扰素的产生，这可以避免由干扰素过量和/或天然免疫激活所引起的炎症性自身免疫性疾病的发生。由此使得相对于其它天然免疫或IFN依赖性药物，以ALKBH5为临床治疗的药物靶点具有较强安全性；

(2)ALKBH5抑制/阻断治疗法尤其适用于天然免疫功能受损/缺陷或干扰素治疗无效或效果不佳的对象。对于天然免疫功能受损/缺陷的对象，采用天然免疫或IFN依赖性药物进行治疗并不能有效激活下游抗病毒效应因子的表达，从而无法有效发挥抵抗与清除病毒的作用。而ALKBH5促进病毒感染的作用并不通过调控天然免疫与干扰素应答来实现，因此，靶向抑制ALKBH5的方法可以在天然免疫功能受损/缺陷或干扰素治疗无效/效果不佳的情况下依旧发挥抗病毒的作用，这对于防控与治疗毒感染性疾病的临床应用具有广泛性适用性与重要意义。

由此，本公开的ALKBH5抑制物尤为适用于具有天然免疫缺陷/受损和/或干扰素抗病毒感染治疗无效或效果不佳或易产生副作用的对象，如患有自身免疫性疾病或易患自身免疫性疾病的对象，如IFN功能不全或过激对象(如患有炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病的对象)。

产品及其应用

本公开还提供了一种产品，其可为药物、药物组合物或药盒，其中含有有效量的本公开的ALKBH5抑制物，以及药学上或免疫学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“活性成分”可互换使用，是指ALKBH5抑制物。

本公开的抑制物和产品可用于治疗病毒感染或与之相关的疾病和/或病症。感染为DNA病毒和/或RNA病毒感染，例如由选自下组的一种或多种病毒引起的感染：单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、脑心肌炎病毒、仙台病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、痘病毒、小DNA病毒、腺相关病毒。

本公开的抑制物和产品可用于治疗与病毒感染相关的疾病和/或征状为选自下组中的一种或多种：病毒感染引起的病理损伤；病毒感染后细胞因子(如干扰素)产生不足或过量；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭，例如所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠；病毒感染导致的慢性炎症性疾病(例如自身免疫性疾病如炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病)。

本公开的抑制物或产品可用于不同的对象，优选哺乳动物对象，例如人、宠物、家畜。并且，本公开的抑制物或产品在治疗具有天然免疫缺陷的对象时具有优势，如患有自身免疫性疾病或易患自身免疫性疾病的对象，如IFN功能不全或过激对象(如患有炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病的对象)。因此，本公开中还提供了ALBKH5抑制物或包含该抑制物的产品在治疗具有天然免疫缺陷的对象中的病毒感染性疾病和/或与之相关的疾病和/或病症中的应用。本公开中还提供了ALBKH5抑制物或包含该抑制物的产品在治疗具有IFN功能不全或过激的对象中的病毒感染性疾病和/或与之相关的疾病和/或病症中的应用。本公开中还提供了ALBKH5抑制物或包含该抑制物的产品在治疗患有自身免疫性疾病的对象中病毒感染性疾病和/或与之相关的疾病和/或病症中的应用。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本公开的产品中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量可为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本公开的产品制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本公开的另一些实施方式中，所述产品为单位剂型或多剂型，且其中活性物质的含量为0.001～2000mg/剂，0.01～1500mg/剂，0.1～1000mg/剂。在本公开的另一些实施方式中，每天施用1～6剂本公开的组合物，如1～3剂，或1剂。

应理解，所用抑制物的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本公开的产品可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可根据抑制物的种类采用但不限于：口服、注射(例如直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药、瘤内给药。

此外，本公开的产品中还可含有用于改善和治疗病毒感染性疾病的其它活性物质，所述的其它活性物质包括但不限于：临床常用抗生素，包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素；临床常用抗病毒药物(三环胺类、焦磷酸类、蛋白酶抑制药、核苷类药物及干扰素、反义寡核苷酸类等)；临床常用免疫抑制剂(包括糖皮质激素、环磷酰胺、氯喹、环孢霉素A、雷公藤、中药制剂、抗TNF单克隆抗体)。

并且，本公开的抑制物或产品相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于病毒感染性疾病的治疗。

药物筛选方法

本公开中还提供了筛选以ALKBH5为靶点的抗病毒感染候选药物的方法。

在一些实施方式中，筛选以ALKBH5为靶点的抗病毒感染候选药物的方法包括如下步骤：

(A)用候选物质处理被病毒感染的细胞、组织或动物，或用候选物质处理细胞、组织或动物后对所述细胞、组织或动物进行病毒感染；

(B)检测所述细胞、组织或动物中ALKBH5的水平或活性；以及

在一些实施方式中，所述方法还进一步包括检测在所述候选物质处理中或之后，被病毒感染的细胞、组织或动物中IFN水平的变化。若IFN水平无显著变化或显著降低，且病毒感染被控制或抑制，则表明所述候选物质的安全性较高，尤其是针对天然免疫失调或IFN功能不全或自身免疫性疾病对象而言的安全性较高。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本领域技术人员可对本公开做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本公开的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：ALKBH5在小鼠巨噬细胞中促进病毒感染

A：采用干扰RNA(siRNA)在小鼠巨噬细胞中敲低ALKBH5可抑制病毒复制

小鼠原代腹腔巨噬细胞分离自腹腔注射2ml的3％巯基乙酸盐(按照％为m/v比例，采用双蒸水溶解，之后进行高压灭菌处理)3天之后的C57BL/6小鼠(6-8周龄，雄性)，培养于含10％胎牛血清(FBS)的无内毒素的高糖DMEM培养基中。

将用于干扰小鼠ALKBH5基因的siRNA采用TransIT-siQUEST TransfectionReagent转染试剂(购自Mirus公司)按照操作说明分别转染到原代腹腔巨噬细胞中(12孔细胞培养板的转染参数：无血清培养基100μl，TransIT-siQUEST Transfection Reagent 3μl，25nM终浓度的siRNA 2.8μl)，48小时后，用VSV病毒(MOI＝1，购自ATCC)感染细胞8小时，提取RNA并进行逆转录，采用实时荧光定量PCR方法(qPCR)检测VSV病毒复制本的水平。

针对小鼠ALKBH5的siRNA购自GE-Dharmacon公司。具体siRNA序列如下表：

检测VSV病毒复制本的qPCR引物序列：

B：CRISPR/Cas9敲除小鼠ALKBH5基因的sgRNA设计与序列

针对小鼠ALKBH5基因的第1个外显子设计sgRNA靶向序列以用于敲除ALKBH5基因，sgRNA序列如下：

C：免疫印迹法检测利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小鼠免疫细胞ALKBH5前后的ALKBH5表达

合成sgRNA靶向序列并构建到pGL3-U6-sgRNA表达载体上。用JetPEI reagents转染试剂将含有sgRNA的质粒以及Cas9的质粒转染到RAW264.7细胞(购自ATCC)中。用含有2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)和3μg/ml杀稻瘟菌素(Blasticidin)的培养基培养和筛选1周。之后，挑选单克隆细胞株，并采用基因组测序和Western印迹法分别从基因组与蛋白质水平鉴定ALKBH5基因敲除情况。pGL3-U6-sgRNA表达载体与Cas9质粒购自Addgene公司；JetPEIreagents转染试剂购自Polyplus公司；嘌呤霉素与杀稻瘟菌素均购自Invivogen公司。

D：ALKBH5KO的小鼠巨噬细胞相比对照WT细胞中病毒含量降低：

采用融合表达GFP荧光蛋白的VSV病毒(GFP-VSV，购自Imanis life science公司)感染上述ALKBH5KO(敲除)与WT(野生型)细胞一定时间后，在荧光显微镜下测定病毒融合表达的GFP荧光强度，强度越强代表病毒含量越多。

结果与讨论

试验A-D的结果分别如图1中的A-D所示。结果表明：在小鼠巨噬细胞中干扰或敲除ALKBH5可极为显著地抑制VSV的复制与含量。

该结果证明：ALKBH5具有促进病毒复制的作用，通过小干扰RNA、CRISPR/Cas9基因编辑技术或抑制剂来阻止ALKBH5表达或发挥功能，可以抑制病毒(例如病毒复制)来保护机体免受病毒感染。

实施例2：ALKBH5基因敲除对病毒感染的小鼠存活率与体内病毒含量影响

ALKBH5基因敲除小鼠(ALKBH5KO)获自中国医学科学院基础医学研究所(Zheng G等,Mol Cell,2013,49(1):18-29)，并已与C57BL/6背景的小鼠杂交10代以上，保证其遗传背景为C57BL/6。取6到8周龄的健康同窝野生型及基因缺失型同性别小鼠进行试验，并按照5×10⁷PFU/g体重的比例通过静脉注射进行体内病毒感染，随后进行生存期、主要脏器的病毒滴度检测、肺脏组化检测相应试验。

通过对感染以上剂量病毒的小鼠的生存期进行观察与统计，得到小鼠的生存率(图2A)。另一组ALKBH5KO与同窝对照小鼠在感染以上剂量病毒18小时后，眼球取血，之后取出小鼠的肝脏、脾脏与肺脏并在无菌条件下进行研磨，采用TCID50法检测小鼠组织匀浆中病毒的滴度(图2B)，同时取一部分肺组织经过苏木精和伊红染色进行组化检测，观察小鼠的肺部损伤程度(图2C)。

结果显示：相比于同窝的野生型小鼠，ALKBH5缺失的小鼠在病毒感染后表现出升高的存活率(图2A)。与此相一致的是，ALKBH5基因敲除的小鼠体内主要脏器(肝脏、脾脏和肺脏)中的病毒滴度显著降低(图2B)，并伴随着肺部炎性细胞浸润的减少以及病理损伤程度的缓和(图2C)。

该结果证明：ALKBH5在小鼠体内同样具有促进病毒复制的作用，这对于临床试验的开展以及相关药物的研发具有重要参考价值。

实施例3：ALKBH5在小鼠体内促进不同类型RNA病毒与DNA病毒的复制

RNA病毒水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)以及DNA病毒疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)的来源以及使用方法均按照之前文献报道(Wang P等,Science,2017,358(6366):1051-1055；Liu S等,Nature immunology,2018,19(1):41-52)。取6到8周龄同性别的健康同窝野生型及ALKBH5基因缺失型小鼠进行试验，并通过静脉注射进行体内RNA病毒VSV(按照5×10⁷PFU/g体重的比例)或DNA病毒HSV-1(按照1×10⁷PFU/只小鼠)感染，18小时后，眼球取血，随后取出小鼠的肝脏、脾脏与肺脏或脑组织。Trizol法提取细胞中的RNA并进行逆转录，采用实时荧光定量PCR方法(qPCR)检测VSV与HSV-1病毒复制本的水平。

检测VSV病毒复制本的qPCR引物同上述实施例1，检测HSV-1的qPCR引物序列如下：

结果显示：相比于同窝的野生型小鼠，ALKBH5缺失的小鼠可以抑制不同类型RNA病毒与DNA病毒的复制。

该结果证明：ALKBH5在小鼠体内具有广泛促进不同类型RNA病毒与DNA病毒复制的作用，ALKBH5的效应具有广谱性，针对其设计的药物对不同类型病毒均具有适用性。

实施例4：ALKBH5促进病毒复制的作用不依赖于干扰素应答

A：ALKBH5敲除导致体外不同病毒感染所诱导的干扰素表达量下调

采用实施例1中的ALKBH5干扰RNA(siRNA)在小鼠巨噬细胞中敲低ALKBH5表达，之后采用VSV与HSV-1病毒感染8小时(购自ATCC；体外细胞感染条件同之前文献报道:Wang P等,Science,2017,358(6366):1051-1055；Liu S等,Nature immunology,2018,19(1):41-52)。提取细胞RNA并进行逆转录，qPCR检测抗病毒相关的I型干扰素(Type I Interferon)IFN-β与IFN-α4的mRNA表达水平(图4A左)。

ALKBH5KO与同窝小鼠腹腔注射3％巯基乙酸盐2ml(同前)，3天后从腹腔中取出小鼠原代腹腔巨噬细胞，采用RNA病毒脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)、仙台病毒(Sendai virus，SeV)或DNA病毒HSV-1病毒感染细胞8小时(以上病毒来源与感染条件同之前文献报道:Wang P等,Science,2017,358(6366):1051-1055；Liu S等,Natureimmunology,2018,19(1):41-52)，提取细胞RNA并进行逆转录，qPCR检测抗病毒相关主要基因IFN-β的mRNA表达水平(图4A右)。检测IFN-β与IFN-α4mRNA水平的qPCR引物序列如下：

B：ALKBH5敲除降低小鼠血清中不同RNA病毒与DNA病毒感染所诱导的干扰素产生

取6到8周龄的同性别健康同窝野生型及ALKBH5基因缺失型小鼠进行试验，并通过静脉注射分别进行体内RNA病毒VSV(按照5×10⁷PFU/g体重的比例)感染18小时(图4B左)，或DNA病毒HSV-1(按照1×10⁷PFU/小鼠用量)感染6小时(图4B右)，之后眼球取血。用ELISA试剂盒检测小鼠血清中的IFN-β与IFN-α蛋白水平。

结果与讨论

试验A和B的结果分别如图4A和4B所示。结果显示：相比于野生型对照，在不同类型的RNA病毒(VSV、EMCV、SeV)或DNA病毒(HSV-1)体外感染情况下，ALKBH5的敲低(图4A左)或敲除(图4A右)均会导致细胞中干扰素的表达水平下调；当采用RNA病毒(图4B左)或DNA病毒(图4B右)进行体内感染时，ALKBH5基因敲除的小鼠血清中I型干扰素(IFN-α和IFN-β)的蛋白含量也显著下降。换言之，ALKBH5缺陷或缺失能够使细胞样本或小鼠血清中的由不同类型RNA病毒与DNA病毒感染诱导的干扰素产生量均显著降低。

该结果证明：ALKBH5在小鼠体内外广泛促进不同类型RNA病毒与DNA病毒复制的作用并不通过抑制抗病毒效应因子干扰素的产生而实现。

结合实施例1-3的试验以及图1-图3中的试验结果可以证明：敲低或敲除ALKBH5均可以在细胞或小鼠体内广泛地抑制不同类型病毒感染与复制，并且这一过程同时伴随着I型干扰素表达量的降低。说明ALKBH5的敲低或缺失不通过促进干扰素表达这一经典的抗病毒天然免疫机制来抑制病毒感染，即ALKBH5促病毒感染的作用是天然免疫/干扰素应答非依赖的。这一发现为了解天然免疫非依赖的细胞防御方式和清除病原体机制提供了新的视角。

在采用靶向抑制ALKBH5的策略进行抗病毒治疗时，可以避免由于干扰素产生过多而导致自身免疫性疾病的发生，证明了以ALKBH5为临床治疗药物靶点具有较强安全性。

实施例5：ALKBH5不影响VSV病毒RNA上的m⁶A修饰水平

采用TRIzol法从RNA病毒VSV感染6小时的ALKBH5KO及野生腹腔巨噬细胞中提取总RNA。取大约500μg的总RNA用Dynabeads mRNA Purification Kit试剂盒(购自ThermoFisher Scientific公司)进行Poly(A)+mRNA纯化。之后依次进行RNA片段化、免疫沉淀含有m⁶A修饰的片段化RNA、测序文库构建，具体方法参考之前已发表文献(Dominissin D等,NatProtocol,2013,8(1):176-189)。

简单概括具体步骤为：纯化后的Poly(A)+mRNA被打断为大于100nt的长度，与m⁶A抗体(货号:202003,购自Synaptic System公司)或IgG抗体(阴性对照,购自CellSignaling Technology公司)在4℃孵育2小时，之后与Protein A beads(购自ThermoFisher Scientific公司)在4℃孵育2小时来进行免疫沉淀。富集到的m⁶A修饰的RNA通过m⁶Anucleotide竞争法结合乙醇沉淀进行纯化收集。对于m⁶A-seq(m⁶A测序)，Input RNA和m⁶A-IP纯化后的RNA采用TruSeq Stranded mRNA Library Preparation kit试剂盒(购自Illumina公司)构建测序文库，并用BioAnalyzer High Sensitivity DNA chip法进行定量和质检，以上均按照标准试验步骤进行操作。两个独立的生物学重复用于m⁶A-seq实验。

样品均在Illumine HiSeq4000平台上进行双端150bp的测序。样品保证在同一流动池的两条泳道中检测，并将来自于两条泳道的每个样品的数据合并后使用。每个样品获得至少4千万读出(reads)的数据量。在用Cutadapt(v1.15)去除多余的接头引物以及低质量的拷贝后，用Hisat2(v2.1.0)将Fastq文件比对到reference genome(mm10and VSV)。去除比对上tRNA与rRNA的拷贝后，每个样品获得大约3千万读出的有效可用拷贝数据量，用于下游数据分析。m⁶A peak calling的分析是按照已发表文献(Dominissin D等,NatProtocol,2013,8(1):176-189)的方法进行。

结果显示：通过对m⁶A-seq结果的分析，我们未观察到RNA m⁶A去甲基化酶ALKBH5缺失的细胞中VSV病毒RNA上m⁶A修饰水平有上调的情况，这一结果排除了ALKBH5通过调控病毒RNA上的m⁶A修饰来促进病毒复制的可能性。

该结果证明：ALKBH5不靶向调控/去除VSV RNA上的m⁶A修饰水平，即ALKBH5是通过影响病毒RNA上m⁶A修饰这一方式之外的其它调控机制来促进病毒感染。这证明采用ALKBH5抑制物在防御与治疗不同类型DNA病毒或RNA病毒引起的感染性疾病中具有广泛应用价值。

在本公开提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> ALKBH5抑制物在治疗病毒感染性疾病中的应用

<130> 196627 1CNCN

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gauuagaugc accgcgauu 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

aatcgcggtg catctaatc 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

guucaaguuu gcugcguau 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

atacgcagca aacttgaac 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagaacuauu ggcgcaaau 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

atttgcgcca atagttctc 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccuaugaguc cucggaaga 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcttccgagg actcatagg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acggcgtact tccagatgg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcggttcaa gatccaggt 19

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

tagggtcctc cgcggcggtc 20

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

acaggttccg acacccggat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ataccgacga tctgcgacct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttattgccgt catagcgcgg 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagctccaag aaaggacgaa c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggcagtgtaa ctcttctgca t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

actcagcaga ccttgaacct 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagtcttggc agcaagttga c 21

<210> 19

<211> 1188

<212> RNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 19

atggcggccg ccagcggcta caccgacctg cgggagaagc tcaagtccat gacgtcccgg 60

gacaactaca aggcgggcag tcgggaggcc gccgccgctg cggccgccgc cgtggctgcc 120

gctgccgctg ccgcggccgc cgctgagcct tacccggcgt ccgggaccac caagcggaaa 180

taccaggagg actcggaccc cgagcgcagc gactacgagg agcatcagtt gcagaaggag 240

gaagaggcgc gcaaggtgaa gagcggcatc cggcagatcc ggctcttcag tcaggatgag 300

tgctccaaga tcgaggcccg catcgatgag gtggtgtccc gcgccgagaa gggcctgtac 360

aacgagcaca cggtggaccg ggcccccctg cgcaacaagt acttcttcgg cgagggctac 420

acgtacgggg cccagctgca gaagcgcggg ccgggccagg agcgcctcta cccgccgggc 480

gacgtcgacg agatcccgga ctgggtgcat cagctggtga tccagaagct ggtggagcac 540

cgcgtcatcc ccgagggctt cgtcaacagc gcggtcatca acgactacca gcccggcggc 600

tgcatcgtgt cccacgttga ccccatccac atcttcgagc gccccatcgt gtccgtgtct 660

ttcttcagcg actcggcact ttgcttcggc tgcaagttcc agttcaagcc catccgggtg 720

tcggaacctg tgctttctct gccggtgcgc agggggagcg tgactgtgct cagtgggtat 780

gctgctgatg aaatcactca ctgcatacgg cctcaggaca ttaaggaacg ccgggcggtc 840

atcattctca ggaagacaag attagatgca ccgcgattgg aaacaaaatc cctgagcagc 900

tccacattgc cacccagcta tgcttcagat cgcctgtcag gaaacaccag agaccctgcg 960

ctgaaaccca aaaggtccca ccgcaaggca gaccctgatg ctgcccacag gccccggatc 1020

ctggaaatgg acaaagaaga aaaccggcgg tctgtgctcc tgcccacaca ccggcggagg 1080

gggagtttta gctctgagaa ctattggcgc aaatcctatg agtcctcgga agattgccca 1140

gaggcagcca gcagccccac ccgcaaggtg aagatgagga gacactga 1188

<210> 20

<211> 395

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 20

Met Ala Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Arg Glu Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Met Thr Ser Arg Asp Asn Tyr Lys Ala Gly Ser Arg Glu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

35 40 45

Glu Pro Tyr Pro Ala Ser Gly Thr Thr Lys Arg Lys Tyr Gln Glu Asp

50 55 60

Ser Asp Pro Glu Arg Ser Asp Tyr Glu Glu His Gln Leu Gln Lys Glu

65 70 75 80

Glu Glu Ala Arg Lys Val Lys Ser Gly Ile Arg Gln Ile Arg Leu Phe

85 90 95

Ser Gln Asp Glu Cys Ser Lys Ile Glu Ala Arg Ile Asp Glu Val Val

100 105 110

Ser Arg Ala Glu Lys Gly Leu Tyr Asn Glu His Thr Val Asp Arg Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Asn Lys Tyr Phe Phe Gly Glu Gly Tyr Thr Tyr Gly Ala

130 135 140

Gln Leu Gln Lys Arg Gly Pro Gly Gln Glu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly

145 150 155 160

Asp Val Asp Glu Ile Pro Asp Trp Val His Gln Leu Val Ile Gln Lys

165 170 175

Leu Val Glu His Arg Val Ile Pro Glu Gly Phe Val Asn Ser Ala Val

180 185 190

Ile Asn Asp Tyr Gln Pro Gly Gly Cys Ile Val Ser His Val Asp Pro

195 200 205

Ile His Ile Phe Glu Arg Pro Ile Val Ser Val Ser Phe Phe Ser Asp

210 215 220

Ser Ala Leu Cys Phe Gly Cys Lys Phe Gln Phe Lys Pro Ile Arg Val

225 230 235 240

Ser Glu Pro Val Leu Ser Leu Pro Val Arg Arg Gly Ser Val Thr Val

245 250 255

Leu Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Glu Ile Thr His Cys Ile Arg Pro Gln

260 265 270

Asp Ile Lys Glu Arg Arg Ala Val Ile Ile Leu Arg Lys Thr Arg Leu

275 280 285

Asp Ala Pro Arg Leu Glu Thr Lys Ser Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro

290 295 300

Pro Ser Tyr Ala Ser Asp Arg Leu Ser Gly Asn Thr Arg Asp Pro Ala

305 310 315 320

Leu Lys Pro Lys Arg Ser His Arg Lys Ala Asp Pro Asp Ala Ala His

325 330 335

Arg Pro Arg Ile Leu Glu Met Asp Lys Glu Glu Asn Arg Arg Ser Val

340 345 350

Leu Leu Pro Thr His Arg Arg Arg Gly Ser Phe Ser Ser Glu Asn Tyr

355 360 365

Trp Arg Lys Ser Tyr Glu Ser Ser Glu Asp Cys Pro Glu Ala Ala Ser

370 375 380

Ser Pro Thr Arg Lys Val Lys Met Arg Arg His

385 390 395

<210> 21

<211> 1185

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 21

atggcggccg ccagcggcta cacggacctg cgtgagaagc tcaagtccat gacgtcccgg 60

gacaactata aggcgggcag ccgggaggcc gccgccgctg ccgcagccgc cgtagccgcc 120

gcagccgcag ccgccgctgc cgccgaacct taccctgtgt ccggggccaa gcgcaagtat 180

caggaggact cggaccccga gcgcagcgac tatgaggagc agcagctgca gaaggaggag 240

gaggcgcgca aggtgaagag cggcatccgc cagatgcgcc tcttcagcca ggacgagtgc 300

gccaagatcg aggcccgcat tgacgaggtg gtgtcccgcg ctgagaaggg cctgtacaac 360

gagcacacgg tggaccgggc cccactgcgc aacaagtact tcttcggcga aggctacact 420

tacggcgccc agctgcagaa gcgcgggccc ggccaggagc gcctctaccc gccgggcgac 480

gtggacgaga tccccgagtg ggtgcaccag ctggtgatcc aaaagctggt ggagcaccgc 540

gtcatccccg agggcttcgt caacagcgcc gtcatcaacg actaccagcc cggcggctgc 600

atcgtgtctc acgtggaccc catccacatc ttcgagcgcc ccatcgtgtc cgtgtccttc 660

tttagcgact ctgcgctgtg cttcggctgc aagttccagt tcaagcctat tcgggtgtcg 720

gaaccagtgc tttccctgcc ggtgcgcagg ggaagcgtga ctgtgctcag tggatatgct 780

gctgatgaaa tcactcactg catacggcct caggacatca aggagcgccg agcagtcatc 840

atcctcagga agacaagatt agatgcaccc cggttggaaa caaagtccct gagcagctcc 900

gtgttaccac ccagctatgc ttcagatcgc ctgtcaggaa acaacaggga ccctgctctg 960

aaacccaagc ggtcccaccg caaggcagac cctgatgctg cccacaggcc acggatcctg 1020

gagatggaca aggaagagaa ccggcgctcg gtgctgctgc ccacacaccg gcggaggggt 1080

agcttcagct ctgagaacta ctggcgcaag tcatacgagt cctcagagga ctgctctgag 1140

gcagcaggca gccctgcccg aaaggtgaag atgcggcggc actga 1185

<210> 22

<211> 394

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 22

Met Ala Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Arg Glu Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Met Thr Ser Arg Asp Asn Tyr Lys Ala Gly Ser Arg Glu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

35 40 45

Glu Pro Tyr Pro Val Ser Gly Ala Lys Arg Lys Tyr Gln Glu Asp Ser

50 55 60

Asp Pro Glu Arg Ser Asp Tyr Glu Glu Gln Gln Leu Gln Lys Glu Glu

65 70 75 80

Glu Ala Arg Lys Val Lys Ser Gly Ile Arg Gln Met Arg Leu Phe Ser

85 90 95

Gln Asp Glu Cys Ala Lys Ile Glu Ala Arg Ile Asp Glu Val Val Ser

100 105 110

Arg Ala Glu Lys Gly Leu Tyr Asn Glu His Thr Val Asp Arg Ala Pro

115 120 125

Leu Arg Asn Lys Tyr Phe Phe Gly Glu Gly Tyr Thr Tyr Gly Ala Gln

130 135 140

Leu Gln Lys Arg Gly Pro Gly Gln Glu Arg Leu Tyr Pro Pro Gly Asp

145 150 155 160

Val Asp Glu Ile Pro Glu Trp Val His Gln Leu Val Ile Gln Lys Leu

165 170 175

Val Glu His Arg Val Ile Pro Glu Gly Phe Val Asn Ser Ala Val Ile

180 185 190

Asn Asp Tyr Gln Pro Gly Gly Cys Ile Val Ser His Val Asp Pro Ile

195 200 205

His Ile Phe Glu Arg Pro Ile Val Ser Val Ser Phe Phe Ser Asp Ser

210 215 220

Ala Leu Cys Phe Gly Cys Lys Phe Gln Phe Lys Pro Ile Arg Val Ser

225 230 235 240

Glu Pro Val Leu Ser Leu Pro Val Arg Arg Gly Ser Val Thr Val Leu

245 250 255

Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Glu Ile Thr His Cys Ile Arg Pro Gln Asp

260 265 270

Ile Lys Glu Arg Arg Ala Val Ile Ile Leu Arg Lys Thr Arg Leu Asp

275 280 285

Ala Pro Arg Leu Glu Thr Lys Ser Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Pro

290 295 300

Ser Tyr Ala Ser Asp Arg Leu Ser Gly Asn Asn Arg Asp Pro Ala Leu

305 310 315 320

Lys Pro Lys Arg Ser His Arg Lys Ala Asp Pro Asp Ala Ala His Arg

325 330 335

Pro Arg Ile Leu Glu Met Asp Lys Glu Glu Asn Arg Arg Ser Val Leu

340 345 350

Leu Pro Thr His Arg Arg Arg Gly Ser Phe Ser Ser Glu Asn Tyr Trp

355 360 365

Arg Lys Ser Tyr Glu Ser Ser Glu Asp Cys Ser Glu Ala Ala Gly Ser

370 375 380

Pro Ala Arg Lys Val Lys Met Arg Arg His

385 390

Claims

1.去甲基化酶AlkB同系5 (ALKBH5)抑制物在制备用于治疗对象中病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的症状的产品中的用途，其中，所述病毒为水泡性口炎病毒，所述ALKBH5抑制物选自：用于抑制ALKBH5的siRNA或CRISPR/Cas9基因编辑产品。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ALKBH5抑制物为：选自SEQ ID NO: 1-8的siRNA和包含选自SEQ ID NO: 11-12的sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑产品。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于抑制ALKBH5的siRNA或CRISPR/Cas9基因编辑产品是针对用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子的抑制物，其中，

所述ALKBH5蛋白选自：

(a) 具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的多肽；

(b) 由选自SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、NCBI Gene ID: 268420或NCBI Gene ID:54890的核酸分子表达的多肽；

(c) (a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽；和/或

所述用于产生ALKBH5蛋白的核酸分子选自：

(i) 选自SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、NCBI Gene ID: 268420或NCBI Gene ID:54890的核酸分子；

(ii) 在严格条件下与(i)限定的核酸分子杂交的核酸分子；

(iii) 由(i)或(ii)的核酸分子经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有促病毒复制和/或感染活性的蛋白质或多肽的核酸分子。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与病毒感染相关的症状为病毒感染引起的病理损伤。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与病毒感染相关的症状为器官的炎性损伤。

6.如权利要求1所述的用途，其中，所述对象为具有天然免疫缺陷/受损和/或干扰素抗病毒感染治疗无效或效果不佳或干扰素抗病毒感染治疗易产生副作用的哺乳动物对象。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述对象为患有自身免疫性疾病或易患自身免疫性疾病的对象。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述对象为IFN功能不全或过激对象。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述对象为患有炎症性肠病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎、结核病、慢性胃肠道疾病的对象。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品为药物组合物或药盒。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品为其形式适于通过选自下组方式给予的药物组合物或药盒：口服、注射、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、透皮给药、瘤内给药。

12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品的形式适于直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法。

13.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品还包含用于预防和/或治疗病毒感染性疾病和/或与病毒感染相关的症状的其他物质。

14.如权利要求13所述的用途，其中，所述其他物质为选自下组中的一种或多种：临床常用抗生素；临床常用抗病毒药物；临床常用免疫抑制剂。

15.如权利要求14所述的用途，其中，所述临床常用抗生素选自：β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素；

所述临床常用抗病毒药物选自：三环胺类、焦磷酸类、蛋白酶抑制药、核苷类药物及反义寡核苷酸类；

所述临床常用免疫抑制剂选自：糖皮质激素、环磷酰胺、氯喹、环孢霉素A、中药制剂、抗TNF单克隆抗体。

16.如权利要求14所述的用途，其中，所述临床常用免疫抑制剂为雷公藤。

17.如权利要求14所述的用途，其中，所述其他物质为青霉素类和头孢菌素类抗生素。

18.一种筛选通过抑制ALKBH5来抗病毒感染的候选药物的方法，所述病毒为水泡性口炎病毒，所述方法包括：

(A) 用候选物质处理被感染的细胞、组织或动物，或用候选物质处理细胞、组织或动物后对所述细胞、组织或动物进行病毒感染；

(B) 检测所述细胞、组织或动物中ALKBH5的水平或活性；以及

(C) 若所检测到的ALKBH5水平或活性低于候选物质处理前的ALKBH5水平或活性或低于正常对照中的ALKBH5水平或活性且所述细胞、组织或动物的病毒感染受到控制或被抑制，则表明所述候选物质可作为通过抑制ALKBH5来抗病毒感染的候选药物，

其中，所述方法不是疾病诊断或治疗方法。