JP2020515572A - 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 - Google Patents
横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020515572A JP2020515572A JP2019553082A JP2019553082A JP2020515572A JP 2020515572 A JP2020515572 A JP 2020515572A JP 2019553082 A JP2019553082 A JP 2019553082A JP 2019553082 A JP2019553082 A JP 2019553082A JP 2020515572 A JP2020515572 A JP 2020515572A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- seq
- vector
- diaphragm
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
本発明は、遺伝子の横隔膜特異的発現を強化することができる核酸調節エレメント、これらの調節エレメントを用いる方法およびその使用に関する。本発明は、これらの調節エレメントを含む発現カセット、ベクターおよび医薬組成物をさらに包含する。本発明は、遺伝子療法、より詳細には横隔膜向け遺伝子療法または遺伝子編集を使用する適用のために、およびワクチン接種目的のために特に有益である。
横隔膜は、胸腔の最下部にわたって伸びるシート状の内部骨格筋である。横隔膜は心臓および肺を含有する胸腔を腹腔から分離し、呼吸において重要な機能を実行する:横隔膜が収縮するときに、胸腔の容量が増加して、空気を肺に吸入する。いかなる器官または筋肉とも同様に、横隔膜は障害および異常にさらされ、それらは多くの異なった形で起こり、損傷または病気が原因のこともある。その結果として、横隔膜機能不全は、潜在的に致命的な帰結を有する重度の呼吸系疾患をもたらす可能性がある。横隔膜の脱力および麻痺は、解剖学的異常領域によって分類することができる。横隔膜の麻痺および脱力は、原因によって片側性の場合もあれば両側性の場合もあり、一時的の場合もあれば恒久的の場合もある。
横隔膜(すなわち横隔膜:Dph)において転写レベルで遺伝子発現を増進する頑強な核酸調節エレメントを同定するために、本発明者らは、コンピュータによるアプローチ(図1を参照)に依存した。これは、以下のコンピュータのステップを必要とする:(1)横隔膜からの発現データに基づいて、高度および特異的に発現される横隔膜特異的遺伝子を同定した;(2)選択された遺伝子の転写開始部位(TSS)の上流の配列を抽出するために、公開データベース(ENSEMBL)を使用した。3)ヒトゲノムにおける転写開始部位を見つけるために、これらの配列をUCSCゲノムブラウザーデータベースに次に提示した。核酸調節エレメントと本明細書で規定される、対応する横隔膜核酸調節エレメントを抽出するために、以下の判定基準に基づいて配列を選択した:a)豊富なTFBS含有量、b)高いDNase過敏性またはクロマチンアクセス性(すなわち、ヒストン改変)に関連したエピジェネティックサイン、およびc)高度に発現された横隔膜特異的遺伝子に関連したTFBSの進化で保存されたクラスタ。
スクリーニングでは、横隔膜組織における発現を増加させる、遺伝子療法送達系、例えばベクター系、例えばAAVベクター系の中の導入遺伝子の発現を増加させることができる、89個の調節エレメントを同定した。これらのエレメントは、下の表3および4に示す。表3は、横隔膜および骨格筋における発現を増加させるために特に重要である横隔膜シス調節エレメント(本明細書で使用される名称「Dph−CRE」、「CRE」または「CRM」または「SH」は同じであり、互換性である)(Dph−CRE)を示し、表4は、横隔膜、骨格筋および心臓組織における発現を増加させるために特に重要である横隔膜CRE(Dph−CRE)を示す。これらのCREのうちの7つは、両群に存在する。
1)pAAVss−hDes1.4kb−MVM−hMTM1−SynthpA(無横隔膜CRE、無筋肉CRE Sk−SH4、Desmin1.4kbプロモーターだけがMTM1遺伝子発現+MTM1を促進する)(配列番号135)
2)pAAVss−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpA(無横隔膜CRE、無筋肉CRE Sk−SH4、+Des1.4kb+コドン最適化MTM1)(配列番号134)
3)pAAVss−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1−SynthpA(無横隔膜CRE、+筋肉CRE Sk−SH4+Des1.4kb+MTM1)(配列番号137)
4)pAAVss−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpA(無横隔膜CRE、+筋肉CRE Sk−SH4+Des1.4kb+コドン最適化MTM1)(配列番号136)
5)pAAVss−CRE64−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpA(筋肉CRE Sk−SH4と組み合わせた、最高に選択された横隔膜CRE64を含有する)(配列番号131)
6)pAAVss−SPc5−12GTRM−MVM−hGAA−SynthpA(無横隔膜CRE、無筋肉CRE、SPc5−12−GTRMプロモーターだけがGAA遺伝子発現を促進する)(配列番号139)
7)pAAVss−SPc5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpA(無横隔膜、無筋肉CRE CSk−SH5、+SPc5−12−GTRM+コドン最適化GAA)(配列番号138)
8)pAAVss−CSK−SH5−SPc5−12GTRM−MVM−hGAA−SynthpA(無横隔膜CRE、+筋肉CRE CSk−SH5+SPc5−12−GTRM+GAA)(配列番号133)
9)pAAVss−CSk−SH5−SPc−5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpA(無横隔膜CRE、+筋肉CRE CSK−SH5+SPc5−12−GTRM+コドン最適化GAA)(配列番号132)
10)pAAVss−CRE04−CSk−SH5−SPc−5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpA(筋肉CRE CSk−SH5と組み合わせた、最高に選択された横隔膜CRE04を含有する)(配列番号130)
本発明は、以下の態様をさらに提供する:
態様1:以下からなる群から選択される配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、横隔膜特異的遺伝子発現を強化するための核酸調節エレメント:配列番号1から89、これらの配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列。したがって、この態様は、横隔膜における遺伝子発現を強化するための、配列番号4によって規定される配列、これらの配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、前記配列の相補配列、またはその核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、600ヌクレオチドまたは550ヌクレオチドを有する核酸調節エレメント、あるいは、横隔膜特異的遺伝子発現を強化するためのその使用を好ましくは提供する。これらの実施形態のいずれか1つでは、配列番号4は配列番号1〜89のいずれか1つと置き換えることができる。
態様2:以下からなる群から選択される配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、横隔膜および骨格筋における遺伝子発現を強化するための態様1による核酸調節エレメント:配列番号1〜7および10〜65、82および83(表3のDph−CRE−1〜7、10〜65、82および83を参照)、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、あるいは、横隔膜および骨格筋における遺伝子発現を強化するためのその使用。前記態様の好ましい実施形態では、前記調節エレメントは、Dph−CRE64(配列番号64)またはDph−CRE02(配列番号2)またはDph−CRE21(配列番号21)である。
態様3:配列番号1〜7、10〜65、82および83(表3のDph−CRE1〜7、10〜65、82および83を参照)のいずれか1つによって規定される調節エレメントを同じく含む、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチドを有する、態様1または2による核酸調節エレメント。前記態様の好ましい実施形態では、前記調節エレメントは、Dph−CRE64(配列番号64)またはDph−CRE02(配列番号2)またはDph−CRE21(配列番号21)である。
態様4:以下からなる群から選択される配列の機能的断片を含む、横隔膜、骨格筋および心臓組織における遺伝子発現を強化するための態様1による核酸調節エレメント:配列番号1〜9、66〜81および84〜89(表4のDph−CRE1〜9、66〜81および84〜89)、または、これらの配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、または、横隔膜、骨格筋および心臓組織における遺伝子発現を強化するためのその使用。前記態様の好ましい実施形態では、前記調節エレメントは、Dph−CRE04(配列番号4)またはDph−CRE06(配列番号6)またはDph−CRE02(配列番号2)である。
態様5:配列番号1〜9、66〜81および84〜89(表4のDph−CRE1〜9、66〜81および84〜89を参照)のいずれか1つによって規定される調節エレメントを同じく含む、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、さらにより好ましくは600ヌクレオチド、例えば500ヌクレオチドを有する、態様1または4による核酸調節エレメント。前記態様の好ましい実施形態では、前記調節エレメントは、Dph−CRE04(配列番号4)またはDph−CRE06(配列番号6)またはDph−CRE02(配列番号2)である。
態様6:横隔膜、骨格筋および心臓組織における遺伝子発現を強化するための核酸調節エレメントであって、態様1〜3のいずれか1つにおいて規定される配列の相補配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、あるいは、態様1〜3のいずれか1つによる核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸調節エレメント。
態様7:横隔膜、骨格筋および心臓組織における遺伝子発現を強化するための核酸調節エレメントであって、態様1、4または5のいずれか1つにおいて規定される配列の相補配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、あるいは、態様1、4または5のいずれか1つによる核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸調節エレメント。
態様8:核酸発現カセットまたはベクターの中の、態様1〜3および6のいずれか1つによる核酸調節エレメントの使用であって、より詳細には横隔膜および骨格筋における前記核酸発現カセットまたはベクターの遺伝子発現を強化するための使用。
態様9:核酸発現カセットまたはベクターの中の、態様1、4、5および7のいずれか1つによる核酸調節エレメントの使用であって、より詳細には横隔膜、骨格筋および心臓組織における前記核酸発現カセットまたはベクターの遺伝子発現を強化するための使用。
態様10:プロモーターに作動可能に連結されている、少なくとも1つの、例えば1、2、3、4、5またはそれより多くの態様1〜7のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット。
態様11:核酸調節エレメントが、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、態様10による核酸発現カセット。
態様12:プロモーターが、横隔膜および骨格筋特異的プロモーター、例えば、表3に規定される遺伝子、すなわち、ACTA1、CKM、TPM2、MYL1、TNNC2、FHL1、TNNT1、TNNI2、MYLPF、TNNT3、MYH2、SLN、MYBPC1、ENO3、CA3、ATP2A1およびMYH1遺伝子のいずれか1つのプロモーターである;または、プロモーターが、横隔膜、骨格筋および心臓特異的プロモーター、例えば、表4に規定される遺伝子、すなわち、ACTA1、CKM、MYL2、MB、DES、TNNC1、TCAP、MYH7、ALDOAおよびTPM1遺伝子のいずれか1つのプロモーターである、態様10または11のいずれか1つによる核酸発現カセット。前記態様、特に態様2および3の好ましい実施形態では、プロモーターは、マウスまたはヒトデスミンプロモーター、より好ましく配列番号92によるヒト1.4kbデスミンプロモーターである。前記態様、特に態様4および5の好ましい実施形態では、プロモーターは、配列番号124によるSPc5−12プロモーターである。
態様13:導入遺伝子が治療的タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする、態様10〜12のいずれか1つによる核酸発現カセット。
態様14:導入遺伝子が、分泌可能なタンパク質または構造タンパク質、例えば、ミオチューブラリン(MTM、配列番号95)、酸性グルコシダーゼ(GAA、配列番号93)、フォリスタチン、ジストロフィン、サルコグリカンまたはジスフェルリンをコードする、態様9〜13のいずれか1つによる核酸発現カセット。前記態様の好ましい実施形態では、前記導入遺伝子は、MTMco(配列番号96)またはGAAco(配列番号94)などのようにコドン最適化される。
態様15:イントロン、好ましくはマウス微小ウイルス(MVM)イントロン(配列番号125)をさらに含む、態様9〜14のいずれか1つによる核酸発現カセット。
態様16:ポリアデニル化シグナル、好ましくは合成ポリA部位(配列番号127)またはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナルをさらに含む、態様9〜15のいずれか1つによる核酸発現カセット。
態様17:態様1〜7のいずれか1つによる核酸調節エレメントまたは態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセットを含むベクター。
態様18:ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、より好ましくはAAV9ベクターである、態様17によるベクター。
態様19:非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル、エピソームベクターまたはトランスポゾンをベースにしたベクター、例えば、PiggyBacをベースにしたベクターまたはSleeping Beautyをベースにしたベクターである、態様17によるベクター。
態様20:態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセットまたは態様17〜19のいずれか1つによるベクター、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
態様21:医薬品で使用するための、より好ましくは遺伝子療法で使用するための、態様1〜7のいずれか1つによる核酸調節エレメント、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物。
態様22:MTMの治療における使用のための、態様1〜3および6のいずれか1つによる核酸調節エレメント、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物。
態様23:ポンペ病の治療で使用するための、態様1、4、5および7のいずれか1つによる核酸調節エレメント、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物。
態様24:ワクチン、好ましくは予防的ワクチンとして使用するための、またはワクチン接種療法、好ましくは予防的ワクチン接種で使用するための、態様1〜7のいずれか1つによる核酸調節エレメント、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物。
態様25:横隔膜および骨格筋細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法、好ましくはin vitroまたはex vivoの方法であって:
− 態様1〜3および6のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含む、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセットまたは態様17〜19のいずれか1つによるベクターを細胞に導入すること;および
− 細胞において導入遺伝子産物を発現させること
を含む方法。
態様26:横隔膜、骨格筋および心臓の細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法、好ましくはin vitroまたはex vivoの方法であって:
− 態様1、4、5および7のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含む、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセットまたは態様17〜19のいずれか1つによるベクターを細胞に導入すること;および
− 細胞において導入遺伝子産物を発現させること、を含む方法。
態様27:それを必要とする対象への、態様1〜3および6のいずれか1つによる核酸調節エレメントを各々含む、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物の治療的有効量の投与を含む、MTMの治療方法。
態様28:それを必要とする対象への、態様1、4、5および7のいずれか1つによる核酸調節エレメントを各々含む、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物の治療的有効量の投与を含む、ポンペ病の治療方法。
態様29:筋ジストロフィー(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)/ベッカー筋ジストロフィー(BMD))、筋緊張性ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー(DM)、デュシェンヌジストロフィン症、サルコグリカン症、ミヨシミオパシー、フクヤマ型先天性筋ジストロフィー、ジスフェルリン症、神経筋疾患、運動ニューロン疾患(MND)、例えばシャルコー−マリー−トゥース病(CMT)、脊髄筋萎縮(SMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)、エメリー−ドライフス筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、先天性筋ジストロフィー、先天性ミオパシー、肢帯筋ジストロフィー、代謝ミオパシー、筋炎症性疾患、筋無力症、ミトコンドリアミオパシー、イオンチャネルの異常、核膜病、心筋症、心臓肥大、心不全、遠位型ミオパシー、心血管疾患、血友病AおよびBを含む血友病ならびに糖尿病、を含む群から選択される疾患または障害のいずれか1つを治療する方法であって、態様1〜7のいずれか1つによる核酸調節エレメントを各々含む、態様10〜16のいずれか1つによる核酸発現カセット、態様17〜19のいずれか1つによるベクターまたは態様20による医薬組成物の治療的有効量の投与を含む方法。
態様30。配列番号94に規定されるコドン最適化ヒトGAA遺伝子
態様31。遺伝子療法で使用するための、より詳細にはGAA発現の回復またはGAA発現の増加を必要とする疾患の治療で使用するためのコドン最適化ヒトGAA遺伝子。より好ましくは、前記疾患は、ポンペ病またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
態様32。配列番号96に規定されるコドン最適化ヒトMTM1遺伝子。
態様33。遺伝子療法で使用するための、より詳細にはMTM1発現の回復またはMTM発現の増加を必要とする疾患の治療で使用するためのコドン最適化ヒトMTM1遺伝子。より好ましくは、前記疾患は、MTM疾患またはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
態様34。態様30のコドン最適化ヒトGAA遺伝子を含むベクター。
態様35。態様32のコドン最適化ヒトMTM1遺伝子を含むベクター。
態様36。態様34または35によるベクターを含む医薬組成物。
態様37。態様30のコドン最適化ヒトGAA遺伝子を含む、態様1および4〜5のいずれか1つによるベクター。
態様38。態様32のコドン最適化ヒトMTM1遺伝子を含む、態様1〜3および5のいずれか1つによるベクター。
態様39。横隔膜、骨格筋および心臓の細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法、好ましくはin vitroまたはex vivoの方法であって:
− 最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、600ヌクレオチドまたは550ヌクレオチドを有する核酸調節エレメントを含み、配列番号4または配列番号64によって規定される配列、前記配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、前記配列の相補配列、あるいは前記核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、態様10〜16による核酸発現カセット、または態様17〜19のいずれか1つによるベクターを細胞に導入すること;および
− 細胞において導入遺伝子産物を発現させること
を含む方法。
本明細書で用いるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかに別途指示しない限り、単数形および複数形の両方を含む。
非限定的な例示的な骨格筋および/または横隔膜特異的プロモーターは、デスミンプロモーター、他の筋肉特異的プロモーター、例えば筋肉クレアチンキナーゼプロモーター(MCK)(Wang Bら、Gene Ther、2008)、アルファ−ミオシン重鎖(a−MHC)、ミオシン軽鎖(MLC−2)、心臓トロポニンC(cTnC)、ミオゲニンMYF4プロモーター(Pacak C.A.ら、Genet Vaccines Ther、2008)、ウイルスのプロモーター、例えばマウス幹細胞ウイルス(MSCV)プロモーター(Suga Tら、Plos One、2011)、および横隔膜核酸調節エレメントの下流にクローニングするために使用することができる全ての潜在的プロモーターである。本明細書に開示される調節エレメントは、それらの天然のプロモーターならびに別のプロモーターと共に核酸発現カセットにおいて使用することができる。好ましくは、本明細書に開示される核酸発現カセットは、横隔膜、心臓および/もしくは骨格筋特異性を増加させるために、ならびに/または他の組織における発現の漏出を回避するために、横隔膜、心臓および/または骨格筋特異的プロモーターを含む。そのようなプロモーターの例は、横隔膜および/または骨格筋特異的プロモーター、例えば、表3に規定される遺伝子、すなわち、ACTA1、CKM、TPM2、MYL1、TNNC2、FHL1、TNNT1、TNNI2、MYLPF、TNNT3、MYH2、SLN、MYBPC1、ENO3、CA3、ATP2A1およびMYH1遺伝子の1つのプロモーター;または、横隔膜、骨格筋および心臓特異的プロモーター、例えば、表4に規定される遺伝子、すなわち、ACTA1、CKM、MYL2、MB、DES、TNNC1、TCAP、MYH7、ALDOAおよびTPM1遺伝子のいずれか1つのプロモーターである。筋肉特異的プロモーターの非限定的な例には、デスミン(DES)プロモーター、合成SPc−5−12プロモーター(SPc5−12−GTRM)、アルファ−アクチン1プロモーター(ACTA1)、クレアチンキナーゼ、筋肉(CKM)プロモーター、4つと半分のLIMドメインタンパク質1(FHL1)プロモーター、アルファ2アクチニン(ACTN2)プロモーター、フィラミン−C(FLNC)プロモーター、筋形質/小胞体カルシウムATPアーゼ1(ATP2A1)プロモーター、トロポニンI 1型(TNNI1)プロモーター、ミオシン−1(MYH1)プロモーター、リン酸化可能な、骨格速筋ミオシン軽鎖(MYLPF)プロモーター、アルファ−3鎖トロポミオシン(TPM3)プロモーター、アンキリン反復ドメイン含有タンパク質2(ANKRD2)プロモーター、ミオシン重鎖(MHC)プロモーター、ミオシン軽鎖(MLC)プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、Liら(1999、Nat Biotechnol.17巻:241〜245)に記載される合成筋肉プロモーター、例えばSPc5−12プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、Wangら(2008、Gene Ther、15巻:1489〜1499)に記載される、MCKエンハンサーからMCK基本プロモーターまでの二重または三重タンデムからそれぞれなるdMCKプロモーターおよびtMCKプロモーターが含まれる。
ポリAテールの合成を誘導する任意のポリアデニル化シグナルが本明細書に記載される発現カセットにおいて有益であり、それらの例は当業者に周知である。例示的なポリアデニル化シグナルには、限定されずに、シミアンウイルス40(SV40)後期遺伝子に由来するポリA配列、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル、最小限のウサギ−グロビン(mRBG)遺伝子、およびLevittら(1989、Genes Dev3巻:1019〜1025)に記載される合成ポリA(SPA)部位が含まれる。
− 対象に、特に対象の横隔膜および/または骨格筋の組織または細胞に、本明細書に記載される核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物を導入するステップであって、核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、配列番号1〜7、10〜65、82および83(表3のDph−CRE1〜7、10〜65、82および83を参照)のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含むステップ;ならびに
− 対象、特に対象の横隔膜および/または骨格筋の組織または細胞において導入遺伝子産物の治療的有効量を発現させるステップ、
を含む方法も開示される。
− 対象に、特に対象の横隔膜、骨格筋および心臓の組織または細胞に、本明細書に記載される核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物を導入するステップであって、核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、配列番号1〜9、66〜81、および84〜89(表4のDph−CRE1〜9、66〜81、および84〜89を参照)のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含むステップ;ならびに
− 対象、特に対象の横隔膜、骨格筋および心臓の組織または細胞において導入遺伝子産物の治療的有効量を発現させるステップ
を含む方法も開示される。
− 対象に、特に対象の横隔膜および骨格筋の組織または細胞に、本明細書に記載される核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物を導入するステップであって、核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、配列番号1〜7、10〜65、82および83(表3のDph−CRE1〜7、10〜65、82および83を参照)のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含むステップ;ならびに
− 対象、特に対象の横隔膜および骨格筋の細胞または組織において導入遺伝子産物の免疫学的有効量を発現させるステップ
を含む方法も開示される。
− 対象に、特に対象の横隔膜、骨格筋および心臓の組織または細胞に、本明細書に記載される核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物を導入するステップであって、核酸発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、配列番号1〜9、66〜81、および84〜89(表4のDph−CRE1〜9、66〜81、および84〜89を参照)のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含むステップ;ならびに
− 対象、特に対象の横隔膜、骨格筋および心臓の細胞または組織において導入遺伝子産物の免疫学的有効量を発現させるステップ
を含む方法も開示される。
− 本明細書に開示される核酸発現カセットまたはベクターで前記細胞をトランスフェクトまたは形質導入させるステップであって、核酸発現カセットまたはベクターは、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、配列番号1〜7、10〜65、82および83(表3のDph−CRE1〜7、10〜65、82および83を参照)のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含むステップ;および
− 前記細胞において導入遺伝子産物を発現させるステップ
を含む方法がさらに開示される。
− 本明細書に開示される核酸発現カセットまたはベクターで前記細胞をトランスフェクトまたは形質導入させるステップであって、核酸発現カセットまたはベクターは、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、配列番号1〜9、66〜81、および84〜89(表4のDph−CRE1〜9、66〜81、および84〜89を参照)のいずれか1つによる核酸調節エレメントを含むステップ;および
− 前記細胞において導入遺伝子産物を発現させるステップ
を含む方法がさらに開示される。
実施例1:横隔膜特異的核酸調節エレメントの同定
高度に発現される横隔膜遺伝子を同定するために、ヒト横隔膜組織の遺伝子発現プロファイリングを、骨格筋、心臓、肝臓、脾臓および腎臓等の他の組織のそれと比較して調査した。各組織から抽出された全RNA試料を、民間から購入した(表1)。
実験手順
実施例3に記載されるプロトコールにより、筋肉特異的調節エレメントSk−SH4を含むAAVベクターを生成した。簡潔には、筋肉特異的調節エレメントSk−SH4を従来のオリゴヌクレオチド合成によって合成し、それぞれAAVsc−hDes1.4kb−MVM−Luc、AAVsc−hDes1.0kb−MVM−LucまたはAAVsc−mDes−MVM−LucのAAVベクター主鎖との関連で、ヒトデスミン1.4kbプロモーター(配列番号92)、ヒトデスミン1.0kbプロモーター(配列番号91)またはマウスのデスミンプロモーター(配列番号90)の上流にクローニングした。
光子シグナルとして定量化した異なるAAVベクターによって誘導されたルシフェラーゼ発現の比較は、マウスの異なる筋肉タイプ(二頭筋、横隔膜、腓腹筋、心臓、四頭筋、脛骨筋および三頭筋)において、Sk−SH4−mDESを含む発現カセットと比較して、Sk−SH4−hDES1.0kbまたはSk−SH4−hDES1.4kb、特にSk−SH4−hDES1.4kbを含む発現カセットがより高いルシフェラーゼ発現に導くことを示す(図4)。
実施例3:Dph−CREのin vivoでの検証
AAVベクター主鎖(例えば、pAAVSCまたはpAAVSS)におけるレポーター遺伝子の発現を促進するために、選択された上位の横隔膜特異的核酸調節エレメント(表3と4を参照)を、筋肉、横隔膜および必要に応じて心臓組織において活性であるプロモーター(例えば、マウスまたはヒトデスミンプロモーター(DES、より好ましくは配列番号90〜92にそれぞれ示すmDES、hDES1.0kbまたはhDES1,4kb)またはSPc5−12プロモーター(配列番号124))の上流にクローニングした。横隔膜において高度に発現される遺伝子の他のプロモーターを、使用することもできる。さらに、他の筋肉特異的プロモーター、例えば筋肉クレアチンキナーゼプロモーター(MCK)(Wang Bら、2008)、アルファ−ミオシン重鎖(a−MHC)、ミオシン軽鎖(MLC−2)または心臓トロポニンC(cTnC)、ミオゲニンMYF4プロモーター(Pacak C.A.ら;2008)またはウイルスのプロモーター、例えばマウス幹細胞ウイルス(MSCV)プロモーター(Suga Tら、Plos One 2011)の全ては、横隔膜核酸調節エレメントの下流にクローニングするために使用することができる潜在的プロモーターである。
− 表3からのDph−CREのためには:pAAVss−Sk−SH4−hDES1.4kb−MVM−ルシフェラーゼ−pA
− 表4からのDph−CREのためには:pAAVss−CSk−SH5−SPc5−12GTRM−MVM−ルシフェラーゼ−pA、
ここで、異なるDph−CREは、Sk−SH4またはCSk−SH5 CREの前または後にクローニングされる。
個々の器官データは、全身のデータを追認した。横隔膜組織では、Sk−SH4−hDes1.4kb発現カセットと組み合わせた横隔膜CREの群に関して、最も頑強である横隔膜CREは、以下の通りである:ヒトデスミン1.4kbプロモーターだけによって促進されるルシフェラーゼ発現と比較したとき、400〜600倍のルシフェラーゼ発現の増強につながるCRE02、CRE64、CRE60およびCRE21(hDes1.4kbに正規化、差の倍率は図5A左側のグラフの上の下段の数字で示す)。ルシフェラーゼ発現におけるこの400〜600倍の増加は、筋肉CRE(Sk−SH4)と組み合わせた横隔膜CREの寄与である。Sk−SH4−hDes1.4kbに正規化したとき、ルシフェラーゼ発現の最高10倍の増強をこれらの4つの頑強な横隔膜CREから検出することができる(差の倍率は図5A左側のグラフの上の上段の数字で示す)。この10倍の差は、この発現カセットから促進される個々の横隔膜CREの寄与である。
実施例4:治療的遺伝子GAAおよびMTM1のコドン最適化
実験手順
AAVプラスミド構築物の生成
遺伝子オプティマイザー(GeneArt、Life technologies、Germany)を使用して、ヒトアルファ−グルコシダーゼ(hGAA)遺伝子およびヒトミオチューブラリン1(hMTM1)遺伝子をコドン最適化した。
pAAVss−Sk−SH4−hDES1.4kb−MVM−hMTM1
pAAVss−Sk−SH4−hDES1.4kb−MVM−hMTM1co
pAAVss−CSk−SH5−SPc5−12−MVM−hGAA
pAAVss−CSk−SH5−SPc5−12−MVM−hGAAco
と命名された。
AAVベクターの生成および精製
AAVベクターの生成および精製は、実施例2に記載されている通りに実行した。
動物の研究
全ての動物の手順は、Free University of Brussels(VUB)(Brussels、Belgium)の施設動物倫理委員会の承認を得た。全てのマウスは、特定病原体除去条件に収容した。食物および水は、無制限に提供された。
hGAA(co)およびhMTM1(co)ELISA
全てのGAAおよびMTM1 ELISAについては、プロトコールは製造業者の説明書によって示されるように従う。両方のキット(MyBiosources)は、タンパク質抽出カクテルとしてPBSを必要とする。プロテアーゼ活性を抑制し、試料の品質を最大にするために、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Invitrogen、USA)を加える。
mRNA分析
qRT−PCRのために、30〜50mgの試料を冷凍保存から取り出した。20秒間の2サイクルでマトリックスD(MPBio)を使用して、試料をホモジナイズした。次に、RNAヌクレオスピン(Macherey−Nagel)を使用してRNAを抽出した。製造業者のプロトコールに従ってSuperScript III cDNA合成キット(Invitrogen、USA)を使用して、cDNAを合成した。次に、ABI 7700(Applied Biosystems、USA)での定量的qPCRによって、cDNAを増幅した。各遺伝子のプライマー配列は、下の表に掲載する。
標的 プライマー 配列 アンプリコンサイズ(bp) 配列番号
hGAA F TGCCCTCGCAGTATATCACAG 129 140
R GAGACCCGTAGAGGTTCGC 141
hGAAco F ACCCCTTCATGCCTCCTTAT 148 142
R TCCATGTAGTCCAGGTCGTT 143
hMTM1 F GTTTGAGATCCTCACGAGATACG 96 144
R GTCCATCCATCCACGTTAAACTT 145
hMTM1co F GGCAAGAGAAACAAGGACGA 150 146
R GGCATCGTCGGACTCATATC 147
結果
hGAA(co)発現
定量的RT−PCRを使用して、SPc−hGAAco、CSk−SH5−SPc−hGAAcoおよびCSk−SH5−SPc−hGAA構築物を注射したCB.17−SCIDマウスの横隔膜、腓腹筋および心臓におけるhGAAおよびhGAAco遺伝子の発現を調査した。結果は、CSk−SH5がCB.17−SCIDマウスの横隔膜、腓腹筋および心臓においてhGAAco mRNAの発現をそれぞれ16.9、9.8および14.2倍増加させることができることを示す(図6a)。さらに、図6bは、野生型hGAAと比較して、コドン最適化hGAA配列がCB.17−SCIDマウスの横隔膜、腓腹筋および心臓において翻訳効率をそれ自体向上させ、2倍を超える高いhGAAタンパク質発現をもたらすことを示す。
hMTM1(co)発現
定量的RT−PCRおよびELISAを使用して、hDES1.4kb−hMTM1co、Sk−SH4−hDES1.4kb−hMTM1coおよびSk−SH4−hDES1.4kb−hMTM1構築物を注射したCB.17−SCIDマウスの横隔膜および腓腹筋におけるhMTM1およびhMTM1co遺伝子の発現を調査した。結果は、Sk−SH4がCB.17−SCIDマウスの横隔膜および腓腹筋においてhMTM1co mRNAの発現をそれぞれ5.3および3.2倍増加させることができることを示す(図7A)。さらに、図7Bは、野生型hMTM1と比較して、コドン最適化hMTM1配列がCB.17−SCIDマウスの横隔膜および腓腹筋において翻訳効率を単独で向上させ、2〜4倍高いhMTM1タンパク質発現をもたらすことができることを示す。
実施例5:MTMおよびGSD II関連疾患のための潜在的臨床治験のためのMTMおよびGSD−IIのためのプロトタイプAAVベクター。
1)pAAVss−hDes1.4kb−MVM−hMTM1−SynthpA(横隔膜CREなし、筋肉CRE Sk−SH4なし、MTM1遺伝子発現を促進するDesmin1.4kbプロモーター+MTM1だけ)(配列番号135)
2)pAAVss−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpA(横隔膜CREなし、筋肉CRE Sk−SH4なし、+Des1.4kb+コドン最適化MTM1)(配列番号134)
3)pAAVss−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1−SynthpA(横隔膜CREなし、+筋肉CRE Sk−SH4+Des1.4kb+MTM1)(配列番号137)
4)pAAVss−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpA(横隔膜CREなし、+筋肉CRE Sk−SH4+Des1.4kb+コドン最適化MTM1)(配列番号136)
5)pAAVss−CRE64−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpA(筋肉CRE Sk−SH4と組み合わせた最良選択横隔膜CRE64を含有する)(配列番号131)
6)pAAVss−SPc5−12GTRM−MVM−hGAA−SynthpA(横隔膜CREなし、筋肉CREなし、GAA遺伝子発現を促進するSPc5−12−GTRMプロモーターだけ)(配列番号139)
7)pAAVss−SPc5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpA(横隔膜なし、筋肉CRE CSk−SH5なし、+SPc5−12−GTRM+コドン最適化GAA)(配列番号138)
8)pAAVss−CSk−SH5−SPc5−12GTRM−MVM−hGAA−SynthpA(横隔膜CREなし、+筋肉CRE CSk−SH5+SPc5−12−GTRM+GAA)(配列番号133)
9)pAAVss−CSk−SH5−SPc5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpA(横隔膜CREなし、+筋肉CRE CSk−SH5+SPc5−12−GTRM+コドン最適化GAA)(配列番号132)
10)pAAVss−CRE04−CSK−SH5−SPc−5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpA(筋肉CRE CSk−SH5と組み合わせた最良選択横隔膜CRE04を含有する)(配列番号130)
筋細管性ミオパシー(MTM)患者は心臓の問題を有さないので、この疾患の治療のために心臓を標的にすることは意図されていない。これのために、横隔膜および骨格筋組織においてMTM1遺伝子またはコドン最適化MTM1coを発現させるために、ヒトデスミン1,4kbプロモーターカセットによるSk−SH4CREをDia−CRE64と組み合わせて使用した。
実施例6:プロトタイプAAVベクターpAAVss−CRE04−CSk−SH5−SPc−5−12GTRM−MVM−hGAAco−SynthpAおよびpAAVss−CRE64−Sk−SH4−hDes1.4kb−MVM−hMTM1co−SynthpAのin vivo検証。
Claims (30)
- 横隔膜、骨格筋および心臓組織における遺伝子発現を強化するための、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、600ヌクレオチドまたは550ヌクレオチドを有する核酸調節エレメントの使用であって、前記核酸調節エレメントは、配列番号4によって規定される配列、前記配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、前記配列の相補配列、またはその核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、使用。
- プロモーターに作動可能に連結されている、少なくとも1つの、例えば1、2、3、4、5またはそれより多くの請求項1に記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセットであって、前記プロモーターが、SPc5−12、MYL2、MB、DES、TNNC1、TCAP、MYH7、ALDAおよびTPM1からなる群から選択される遺伝子のいずれか1つの横隔膜、心臓および/または骨格筋特異的プロモーターである、核酸発現カセット。
- 前記核酸調節エレメントが、プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項2に記載の核酸発現カセット。
- 前記プロモーターがSPc5−12である、請求項2または3に記載の核酸発現カセット。
- 前記導入遺伝子が治療的タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする、請求項2〜4のいずれか1項に記載の核酸発現カセット。
- 前記導入遺伝子が分泌可能なタンパク質または構造タンパク質、例えば、酸性グルコシダーゼ(GAA)、ミオチューブラリン(MTM1)、フォリスタチン、ジストロフィン、サルコグリカンまたはジスフェルリンをコードする、請求項2〜5のいずれか1項に記載の核酸発現カセット。
- 前記導入遺伝子が、配列番号93によって規定される酸性グルコシダーゼ(GAA)、より好ましくは配列番号94によって規定されるコドン最適化ヒト酸性グルコシダーゼ遺伝子(hGAAco)をコードする、請求項2〜6のいずれか1項に記載の核酸発現カセット。
- イントロン、好ましくはマウス微小ウイルス(MVM)イントロンをさらに含む、請求項2〜7のいずれか1項に記載の核酸発現カセット。
- ポリアデニル化シグナル、好ましくは合成ポリアデニル化シグナル(配列番号127)またはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項2〜8のいずれか1項に記載の核酸発現カセット。
- 請求項2〜9のいずれか1項に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
- ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、より好ましくはAAV9ベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル、エピソームベクターまたはトランスポゾンをベースにしたベクター、例えば、PiggyBacをベースにしたベクターまたはSleeping Beautyをベースにしたベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 前記核酸調節エレメントの前または後に心筋特異的CRE CSk−SH5(配列番号122)をさらに含む、請求項10または11に記載のベクター。
- 前記CRE−CSk−SH5調節エレメント、配列番号4によって規定される配列、前記配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、前記配列の相補配列、またはその核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、600ヌクレオチドまたは550ヌクレオチドを有する核酸調節エレメント、MVMイントロン、SPc5−12プロモーター、ヒトGAA導入遺伝子(配列番号93)またはそのコドン最適化変異体(配列番号94)、および合成ポリA部位(配列番号127)を含む、請求項10、11または13のいずれか1項に記載のベクター。
- 請求項2〜9のいずれか1項に記載の核酸発現カセットまたは請求項10〜14のいずれか1項に記載のベクター、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 医薬品で使用するための、請求項2〜9のいずれか1項に記載の核酸発現カセット、請求項10〜14のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物。
- ポンペ病の治療で使用するための、請求項2〜9のいずれか1項に記載の核酸発現カセット、請求項10〜14のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物。
- ワクチン、好ましくは予防的ワクチンとして使用するための、またはワクチン接種療法、好ましくは予防的ワクチン接種で使用するための、請求項2〜9のいずれか1項に記載の核酸発現カセット、請求項10〜14のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項15に記載の医薬組成物。
- 横隔膜、骨格筋および心臓の細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法、好ましくはin vitroまたはex vivoの方法であって、
− 請求項1に記載の核酸調節エレメントを含む、請求項2〜9のいずれか1項に記載の核酸発現カセットまたは請求項10〜14のいずれか1項に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ;および
− 前記細胞において前記導入遺伝子産物を発現させるステップ
を含む方法。 - 横隔膜、骨格筋および心臓組織における遺伝子発現を強化するための、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、600ヌクレオチドまたは550ヌクレオチドを有する核酸調節エレメントの使用であって、前記核酸調節エレメントは、配列番号64によって規定される配列、これらの配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、前記配列の相補配列、またはその核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、使用。
- 少なくとも1つの、例えば1、2、3、4、5またはそれより多くの請求項20に記載の核酸調節エレメント、およびイントロン、好ましくはマウス微小ウイルス(MVM)イントロンを含み;プロモーターおよび導入遺伝子に作動可能に連結されている核酸発現カセットであって;前記プロモーターがDES、好ましくはhDES1.4kbであり;前記導入遺伝子が、配列番号95によって規定されるミオチューブラリン(MTM1)、好ましくは配列番号96によって規定されるコドン最適化ヒトミオチューブラリン(hMTM1co)をコードする、核酸発現カセット。
- ポリアデニル化シグナル、好ましくは合成ポリアデニル化シグナル(配列番号127)またはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項21に記載の核酸発現カセット。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、好ましくはAAV9ベクターである、請求項21または22に記載の核酸発現カセットを含むベクター。
- 前記核酸調節エレメントの前または後に心筋特異的CRE Sk−SH4(配列番号121)をさらに含む、請求項23に記載のベクター。
- CRE−Sk−SH4調節エレメント、請求項20に記載のDph−CRE64核酸調節エレメント、MVMイントロン、DESプロモーター、ヒトMTM1導入遺伝子(配列番号95)またはそのコドン最適化変異体(配列番号96)、および合成ポリA部位(配列番号127)を含む、請求項23または24に記載のベクター。
- 請求項21または22に記載の核酸発現カセットまたは請求項23〜25のいずれか1項に記載のベクター、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 医薬品で使用するための、請求項21または22に記載の核酸発現カセット、請求項23〜25のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項26に記載の医薬組成物。
- 筋細管性ミオパシーの治療で使用するための、請求項21または22に記載の核酸発現カセット、請求項23〜25のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項26に記載の医薬組成物。
- ワクチン、好ましくは予防的ワクチンとして使用するための、またはワクチン接種療法、好ましくは予防的ワクチン接種で使用するための、請求項21または22に記載の核酸発現カセット、請求項23〜25のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項26に記載の医薬組成物。
- 横隔膜、骨格筋および心臓の細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法、好ましくはin vitroまたはex vivoの方法であって、
− 配列番号64によって規定される配列、前記配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、例えば、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する配列、前記配列の相補配列、またはその核酸調節エレメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、最大長1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは700ヌクレオチド、600ヌクレオチドまたは550ヌクレオチドを有する核酸調節エレメントを含む、請求項21または22に記載の核酸発現カセットまたは請求項23〜25のいずれか1項に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ;および
− 前記細胞において前記導入遺伝子産物を発現させるステップ
を含む方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023053227A JP2023093487A (ja) | 2017-03-27 | 2023-03-29 | 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17163080.9 | 2017-03-27 | ||
EP17163080 | 2017-03-27 | ||
PCT/EP2018/057753 WO2018178067A1 (en) | 2017-03-27 | 2018-03-27 | Diaphragm-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023053227A Division JP2023093487A (ja) | 2017-03-27 | 2023-03-29 | 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020515572A true JP2020515572A (ja) | 2020-05-28 |
Family
ID=58464207
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019553082A Pending JP2020515572A (ja) | 2017-03-27 | 2018-03-27 | 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 |
JP2023053227A Pending JP2023093487A (ja) | 2017-03-27 | 2023-03-29 | 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023053227A Pending JP2023093487A (ja) | 2017-03-27 | 2023-03-29 | 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11920149B2 (ja) |
EP (1) | EP3600445A1 (ja) |
JP (2) | JP2020515572A (ja) |
AU (1) | AU2018241847A1 (ja) |
CA (1) | CA3057899A1 (ja) |
WO (1) | WO2018178067A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020084161A1 (en) | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Vrije Universiteit Brussel | New tools for improving gene therapy and use thereof |
EP3952920A1 (en) * | 2019-04-08 | 2022-02-16 | Genethon | Hybrid promoters for muscle expression |
MX2021013365A (es) * | 2019-04-30 | 2022-01-26 | Univ Pennsylvania | Composiciones utiles para el tratamiento de la enfermedad de pompe. |
MX2022010085A (es) | 2020-02-18 | 2022-09-02 | Univ Brussel Vrije | Elementos y metodos de regulacion de acidos nucleicos especificos de musculo y uso de los mismos. |
EP4107259A1 (en) | 2020-02-18 | 2022-12-28 | Vrije Universiteit Brussel | Novel combination of nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof |
EP4179096A1 (en) * | 2020-07-10 | 2023-05-17 | Genethon | A novel muscle-specific promoter |
JP2024502257A (ja) | 2020-12-21 | 2024-01-18 | フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセル | 心筋細胞由来核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 |
AR126660A1 (es) | 2021-07-28 | 2023-11-01 | Univ Brussel Vrije | Mejorando la eficacia de la terapia génica dirigida a músculos |
CA3240616A1 (en) * | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Christopher Dean HERZOG | Troponin c (tnnc1) gene therapy using aav vector |
WO2023196862A1 (en) * | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Genzyme Corporation | Targeted gene therapy for dm-1 myotonic dystrophy |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007025269A2 (en) * | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Michigan State University | Transgenic mouse model and methods for treatment of neuro muscular disease by interfering with androgen-androgen receptor interaction in skeletal muscles |
JP2009519710A (ja) * | 2005-12-16 | 2009-05-21 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 遺伝子発現調節エレメントのハイスループットでの特徴付けのための機能性アレイ |
WO2015197869A1 (en) * | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Genethon | Efficient systemic treatment of dystrophic pathologies |
JP2017505126A (ja) * | 2014-01-21 | 2017-02-16 | フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセルVrije Universiteit Brussel | 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070161031A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-07-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements |
US20090018031A1 (en) * | 2006-12-07 | 2009-01-15 | Switchgear Genomics | Transcriptional regulatory elements of biological pathways tools, and methods |
WO2009071679A1 (en) | 2007-12-05 | 2009-06-11 | Vib Vzw | Novel aav vector and uses thereof |
CA2722238C (en) | 2008-04-22 | 2017-11-28 | Life Sciences Research Partners Vzw | Liver-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
AU2010311376B2 (en) | 2009-10-29 | 2014-07-03 | Life Sciences Research Partners Vzw | Cardiac-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
WO2014063753A1 (en) | 2012-10-26 | 2014-05-01 | Vrije Universiteit Brussel | Hyper-active factor ix vectors for liver-directed gene therapy of hemophilia 'b' and methods and use thereof |
DK2911687T3 (da) | 2012-10-26 | 2019-05-13 | Univ Brussel Vrije | Vektor til levermålrettet genterapi af hæmofili og fremgangsmåder og anvendelse deraf |
EP3194600B1 (en) * | 2014-07-26 | 2019-08-28 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy |
US11007280B2 (en) | 2015-03-17 | 2021-05-18 | Vrije Universiteit Brussel | Optimized liver-specific expression systems for FVIII and FIX |
-
2018
- 2018-03-27 AU AU2018241847A patent/AU2018241847A1/en active Pending
- 2018-03-27 JP JP2019553082A patent/JP2020515572A/ja active Pending
- 2018-03-27 US US16/498,690 patent/US11920149B2/en active Active
- 2018-03-27 CA CA3057899A patent/CA3057899A1/en active Pending
- 2018-03-27 EP EP18712621.4A patent/EP3600445A1/en active Pending
- 2018-03-27 WO PCT/EP2018/057753 patent/WO2018178067A1/en unknown
-
2023
- 2023-03-29 JP JP2023053227A patent/JP2023093487A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007025269A2 (en) * | 2005-08-25 | 2007-03-01 | Michigan State University | Transgenic mouse model and methods for treatment of neuro muscular disease by interfering with androgen-androgen receptor interaction in skeletal muscles |
JP2009519710A (ja) * | 2005-12-16 | 2009-05-21 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 遺伝子発現調節エレメントのハイスループットでの特徴付けのための機能性アレイ |
JP2017505126A (ja) * | 2014-01-21 | 2017-02-16 | フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセルVrije Universiteit Brussel | 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 |
WO2015197869A1 (en) * | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Genethon | Efficient systemic treatment of dystrophic pathologies |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018178067A1 (en) | 2018-10-04 |
US20200407749A1 (en) | 2020-12-31 |
AU2018241847A1 (en) | 2019-10-17 |
EP3600445A1 (en) | 2020-02-05 |
CA3057899A1 (en) | 2018-10-04 |
JP2023093487A (ja) | 2023-07-04 |
US11920149B2 (en) | 2024-03-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11975078B2 (en) | Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof | |
JP2020515572A (ja) | 横隔膜特異的核酸調節エレメントならびにその方法および使用 | |
ES2971872T3 (es) | Vector de clado F de virus adenoasociado (AAV) y usos para el mismo | |
CA2722238C (en) | Liver-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof | |
US20230174958A1 (en) | Crispr-inhibition for facioscapulohumeral muscular dystrophy | |
WO2023006890A1 (en) | Improving the efficacy of muscle-targeted gene therapy | |
JP2022505877A (ja) | 肝特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 | |
US20230226220A1 (en) | Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof | |
US20230089121A1 (en) | Novel combination of nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof | |
JP2024502257A (ja) | 心筋細胞由来核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 | |
JP2023513188A (ja) | 遺伝子の発現増加のためのmirna-485阻害剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210317 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220308 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220608 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220726 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20221129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230329 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20230329 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20230329 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230417 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20230418 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20230519 |