CN115820640B - 一种抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA及其应用，其正义链的序列为5’‑GGUGUAAGUUCCAGUUCAA‑3’，反义链的序列为5’‑UUGAACUGGAACUUACACC‑3’。同时，本发明还公开了含有编码特异性抑制鸡ALKBH5基因表达的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本发明的siRNA通过特异性抑制鸡ALKBH5基因表达来鉴定基因功能，可应用于优质鸡的遗传育种，有助于揭示鸡骨骼肌生长发育和肌纤维类型形成的调控机制，对提升我国家禽产品的市场竞争力也具有重要意义。

Description

一种抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于siRNA技术领域，具体涉及一种通过抑制鸡去甲基化酶ALKBH5基因表达的siRNA及其应用。

背景技术

研究表明，真核生物中的RNA修饰对RNA功能和遗传信息多样性等方面起到重要作用。m⁶A是mRNA中最丰富的修饰，参与RNA的剪接、转录、加工、出核转运、翻译、降解，对胚胎发育、脂肪生成、肌肉发育和疾病等生物学过程具有重要作用。

ALKBH5是继肥胖量与肥胖相关蛋白(FTO)之后被发现的第二个RNA m⁶A去甲基化酶。不同于FTO的去甲基化机制，ALKBH5可直接催化RNA m⁶A甲基化腺苷去除甲基，而不产生中间产物。在小鼠中敲除ALKBH5后会导致睾丸萎缩，精子形成障碍和数量下降，引起不育。另外，ALKBH5在脑缺血再灌注损伤中起着至关重要的作用。近几年研究发现，ALKBH5与结肠癌、胃癌等多种肿瘤的发生发展相关，ALKBH5极有可能成为参与肿瘤诊断以及治疗的新靶点。

在鸡上，丁浩等(2021)研究发现，鸡骨骼肌RNA m⁶A甲基化水平与去甲基化酶基因ALKBH5 mRNA表达水平呈显著负相关，推测ALKBH5可能通过调控RNA m⁶A水平影响鸡的骨骼肌发育。本课题组束婧婷等(2022)研究发现，随着鸡成肌细胞的分化，鸡骨骼肌分离的成肌细胞中RNA m⁶A水平逐渐上升；METTL3等RNA m⁶A甲基化转移酶的表达与肌纤维类型组成呈显著的相关性；推测，RNA m⁶A对鸡肌纤维类型组成、维持及成肌细胞分化具有一定的调控作用。

然而目前为止，在鸡上，还未有ALKBH5分子调控机制的阐述。因此，借助siRNA技术开展ALKBH5基因功能研究显得十分迫切。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供了靶向鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA及其应用。

第一方面，本发明提供了一种抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链的序列为5’-GGUGUAAGUUCCAGUUCAA-3’(SEQ NO.1)，反义链的序列为5’-UUGAACUGGAACUUACACC-3’(SEQ NO.2)。

进一步地，所述正义链和反义链的3’端还添加有两个垂悬碱基dT。

第二方面，本发明提供了所述的siRNA在制备抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5表达的试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供了含有编码本发明第一方面所述的靶向鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明还提供了本发明第一方面所述的siRNA、本发明第二方面所述的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌在鉴定鸡去甲基化酶基因ALKBH5功能中的应用。

本发明相对于现有技术而言，提供了一种能够靶向鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA，将其转入鸡成肌细胞后可以有效降低鸡去甲基化酶基因ALKBH5的表达，抑制效率达到50％以上。本发明的siRNA通过特异性敲降鸡去甲基化酶基因ALKBH5的表达来鉴定基因功能，借助siRNA技术开展ALKBH5基因功能研究，有助于揭示鸡骨骼肌生长发育和肌纤维类型形成的调控机制，不仅对提升我国家禽产品的市场竞争力具有重要意义，而且对于揭示人类骨骼肌代谢功能异常引起的肌肉相关疾病的分子机理也具有很好的借鉴价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是不同siRNA在原代成肌细胞增殖期和分化期干扰鸡ALKBH5基因表达的效率，其中，**表示干扰组与NC对照组相比，差异极显著(P<0.01)；

图2是Western blot检测siRNA1在原代成肌细胞分化期干扰鸡ALKBH5基因表达的效率，其中，**表示干扰组与NC对照组相比，差异极显著(P<0.01)；

图3是CCK-8检测鸡成肌细胞中ALKBH5基因表达敲低后对细胞增殖的影响，同一时间点干扰组与NC对照组比较，*表示差异显著(P<0.05)；

图4是CCL检测鸡成肌细胞中ALKBH5基因表达敲低后对细胞增殖的影响，同一时间点干扰组与NC对照组比较，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；

图5是实时荧光定量PCR检测鸡成肌细胞中ALKBH5基因表达敲低后对细胞增殖分化相关基因表达的影响，其中，**表示干扰组与NC对照组相比，差异极显著(P<0.01)；

图6是Western blot检测鸡成肌细胞中ALKBH5基因表达敲低后对快肌肌纤维类型标志基因MyHC_fast蛋白表达的影响，其中**表示干扰组与NC对照组相比，差异极显著(P<0.01)；

图7是鸡ALKBH5基因表达敲低后MeRIP-seq和mRNA-seq差异共表达基因的KEGG富集分析；

图8是ALKBH5基因在鸡和其它物种中的同源性比较。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中如无特别说明，均为常规方法，所用的试剂均为市售试剂。

实施例1靶向鸡ALKBH5基因siRNA最佳序列筛选

1.1 siRNA设计

根据NCBI在线数据库，获得鸡ALKBH5基因mRNA序列信息(登录号：NM_001257201.3)，采用优化的siCatchTM siRNA设计软件，设计3对靶向鸡ALKBH5基因CDS区的siRNA。设计时从靶基因起始密码子AUG下游100bp的核苷酸开始搜寻理想的siRNA，避开外显子与外显子的交界区域。为了增强siRNA双链复合体的稳定性，在每对siRNA的正义链和反义链3’端添加2个垂悬碱基dT，由广州锐博生物科技有限公司合成。设计获得的3对siRNA的序列如表1所示，3对siRNA靶向的序列如表2所示，靶点分别起始于1054、673、937。

表13对siRNA的序列

表23对siRNA的靶向序列

siRNA	靶向序列(5’-3’)	起始位点	序列编号
				ALKBH5 siRNA1	GGTGTAAGTTCCAGTTCAA	1054	SEQ ID NO.7
ALKBH5 siRNA2	AGATCGAAGCTCGCATTGA	673	SEQ ID NO.8
				ALKBH5 siRNA3	CCGTGATCAACGACTATCA	937	SEQ ID NO.9

1.2 siRNA转染原代鸡成肌细胞

从动物组织中分离提取的原代细胞保持了细胞在体内许多重要生物学特征和功能，因此原代细胞不仅被广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，而且在生物医药领域更具有不可替代性的作用。但相对于细胞系，原代细胞难培养、外源基因转染效率低。本实施例以从11胚龄鸡胚腿肌分离提取的原代鸡成肌细胞为转染细胞，分别在细胞增殖期和分化期转染siRNA。

(1)增殖期转染

将分离提取的原代鸡成肌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种24孔培养板，培养过夜后，在细胞处于增殖期时，借助转染试剂Lipofectamine 3000将3对靶向鸡ALKBH5基因的siRNA转染和阴性对照siRNA NC分别转染入鸡成肌细胞，每组设4个重复孔，转染浓度为100n mol/L。

(2)分化期转染

将分离提取的原代鸡成肌细胞以3×10⁵个细胞/孔的密度接种24孔培养板，待细胞密度生长至70-90％时，用含有5％马血清的培养基替代含有20％胎牛血清的培养基，诱导细胞分化，培养1d后，借助转染试剂Lipofectamine3000将3对靶向鸡ALKBH5基因的siRNA转染和阴性对照siRNA NC分别转染入鸡成肌细胞，每组设4个重复孔，转染浓度为100nmol/L。

1.3 RNA提取和cDNA制备

转染48h后，每孔用PBS清洗2次，选择南京诺唯赞生物科技股份有限公司提取细胞总RNA的试剂RNA isolater Total RNA Extraction Reagent收集和提取转染细胞的总RNA。核酸定量仪测定RNA浓度。按照南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScriptⅢRTSuperMix for qPCR说明书进行cDNA合成。

1.4实时荧光定量PCR检测siRNA干扰效率

选择南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂采用SYBR GreenΙ法进行实时荧光定量PCR检测siRNA特异性干扰鸡ALKBH5基因表达的效率。实时荧光定量PCR反应的体系如表3所示。每个样品设置3个重复。

表3实时荧光定量PCR反应的体系

检测鸡ALKBH5基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-TCGTTCTTCAGCGATTCGGC-3’(SEQ ID NO.10)

下游引物：5’-TCGGCTGCGTATCCACTGAG-3’(SEQ ID NO.11)

检测鸡内参ACTB基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-TGCTGTGTTCCCATCTATCG-3’(SEQ ID NO.12)

下游引物：5’-TTGGTGACAATACCGTGTTCA-3’(SEQ ID NO.13)

3对siRNA特异性干扰鸡ALKBH5基因表达的效率结果见图1。由图1可见，3对siRNA对增殖期、分化期鸡原代细胞中ALKBH5基因表达的抑制效率，均是siRNA1干扰效率最好，与NC对照组相比，siRNA1的抑制效率均达50％以上，极显著(P<0.01)抑制鸡成肌细胞中鸡ALKBH5基因的表达，后续实验选择siRNA1用于研究鸡ALKBH5基因功能。siRNA1的正义链为SEQ ID NO.1所示的碱基序列5’-GGUGUAAGUUCCAGUUCAA-3’，所述siRNA的反义链为SEQ IDNO.2所示的碱基序列5’-UUGAACUGGAACUUACACC-3’，正义链和反义链的3’端还添加有两个垂悬碱基dT。

1.5 Western blot检测siRNA干扰效率

转染72h后，每孔用PBS清洗2次，选择赛默飞RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定提取的蛋白浓度后，分别用ALKBH5(Proteintech,16837-1-AP,1:5000)和β-Actin(ERWAN,ER001,1:10000)作一抗和羊抗兔IgG(Invitrogen,A32732,1:5000)和羊抗鼠IgG(Invitrogen,A32723,1:5000)作二抗进行Western blot实验。检测结果见图2，siRNA干扰组与NC对照组相比，差异极显著。

实施例2 ALKBH5基因敲低表达后对细胞增殖的影响

选择南京诺唯赞生物科技股份有限公司的细胞增殖检测试剂CCK-8 CellCounting Kit(CCK-8)和Cell Counting-Lite 2.0Luminescent Cell Viability Assay(CCL)检测鸡成肌细胞中ALKBH5基因敲低表达后对细胞增殖能力的影响，CCK-8检测结果见图3，CCL检测结果见图4。由图3和图4可见，在转染siRNA1后36h，ALKBH5基因敲低表达组的细胞增殖能力显著高于对照组；转染siRNA1后48h，ALKBH5基因敲低表达组的细胞增殖能力极显著高于对照组；提示，ALKBH5有抑制鸡成肌细胞增殖的作用。

实施例3 ALKBH5基因敲低表达后对细胞增殖、分化相关基因表达的影响

参考实施例1中1.4实时荧光定量PCR法检测鸡ALKBH5基因敲低表达后对鸡成肌细胞增殖相关基因Pax7和分化相关基因MyoD1表达的影响，结果见图5。由图5可见，鸡成肌细胞中ALKBH5基因敲低表达后，显著促进Pax7和MyoD1基因的表达。

检测鸡Pax7基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-TCAGCAACCGACGAGCAAG-3’(SEQ ID NO.14)

下游引物：5’-ATGGTGGATGGTGGCAAGG-3’(SEQ ID NO.15)

检测鸡内参MyoD1基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-CAACGCCATCCGCTACAT-3’(SEQ ID NO.16)

下游引物：5’-GTCGAGGCTGGAAACAAC-3’(SEQ ID NO.17)

实施例4 ALKBH5基因敲低表达后对快肌肌纤维类型标志基因MyHC蛋白表达的影响

参考实施例1中1.5Western blot方法，用鼠抗鸡快肌MyHC蛋白抗体(DSHB,S58,1:200)作一抗，检测鸡ALKBH5基因敲低表达后对鸡快肌肌纤维类型标志基因MyHC蛋白表达的影响，结果见图6。由图6可见，鸡成肌细胞中ALKBH5基因敲低表达后，显著促进快肌肌纤维类型标志基因MyHC蛋白的表达。

实施例5鸡ALKBH5基因敲低表达后MeRIP-seq和RNA-seq筛选差异共表达基因的功能分析

用MeRIP-seq和RNA-seq法筛选鸡ALKBH5基因敲低表达后m⁶A水平上调表达的差异共表达基因，P<0.05为筛选标准，结果共筛到191个差异共表达基因。对差异的共表达基因进行功能分析，以P<0.05为筛选标准，结果共显著富集到13个信号通路，见图7。由图7可见，与肌肉发育相关的TGF-beta、mTOR等信号通路被显著富集。

实施例6鸡ALKBH5基因的mRNA序列与其它物种ALKBH5基因mRNA序列同源性分析

在NCBI中，将鸡ALKBH5基因mRNA序列与人、小鼠、鸭及鹅物种中ALKBH5基因mRNA序列进行同源性分析，结果见图8所示，鸡ALKBH5基因mRNA序列与人ALKBH5基因mRNA序列同源性为79.51％，与小鼠ALKBH5基因mRNA序列同源性仅为77.66％，与鸭ALKBH5基因mRNA序列同源性为82.52％，与鹅ALKBH5基因mRNA序列同源性为87.71％。可见，鸡ALKBH5基因mRNA序列与其他物种中的ALKBH5基因mRNA序列同源性并不高，本发明的siRNA序列大小只有19bp，在针对鸡ALKBH5基因mRNA选择靶向位点以及siRNA涉及过程中，上述物种的ALKBH5基因mRNA序列并没有参考价值。

Claims (4)

1. 一种抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链的序列为5’-GGUGUAAGUUCCAGUUCAA-3’（SEQ NO.1），反义链的序列为5’-UUGAACUGGAACUUACACC-3’（SEQ NO.2），所述正义链和反义链的3’端还添加有两个垂悬碱基dT。

2.权利要求1所述的siRNA在制备抑制鸡去甲基化酶基因ALKBH5表达的试剂盒中的应用。

3.含有编码权利要求1所述的靶向鸡去甲基化酶基因ALKBH5的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求1所述的siRNA、权利要求3所述的重组表达载体或转基因细胞系或重组菌在鉴定鸡去甲基化酶基因ALKBH5功能中的应用。